Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурный анализ ДНК цианофага LPP-3 и цианобактерии PLECTONEMA BORYANUM

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Структурный анализ ДНК цианофага LPP-3 и цианобактерии PLECTONEMA BORYANUM"

НАЦЮНАЛЬНА АКАДЕМШ НАУК УКРАхНИ 1НСТИТУТ М1КР0БЮЛ0Ш I В1РУС0Л0Г1! ím. Д. К. ЗАБОЛОТНОГО

РГб ОД

\ 5 ДЕК 1396 ш правах рукопису

СИРЧ1Н СЕРИЙ ОЛЕКСАНДРОВИЧ

СТРУКТУРНИЙ AHAJII3 ДНК Ц1АНОФАГА LPP-3 ТА Ц1АНОБАКТЕР1í PLECTONEMA BORYANUM

03.00.06 - в!русолог1я

АВТОРЕФЕРАТ дисертац!i на здобуття наукового етупеня кандидата 61олог1чних наук

Ки1в - 1996 р.

Дисертац1ею с рукопис.

Робота виконана у в1ддШ BipyciB водоростей 1нетитуту м1кроб1ологН i в1русологН im. Д. К Заболотного HAH Укра1ни

Науковий кер!вник: доктор б!олог!чних наук, професор МЕНДЖУЛ МИХАЙЛО 1ВАН0ВИЧ

Оф1ц1йн1 опоненти: доктор б!олог!чних наук,професор, академ!к АТН Укра1ни К1ШКО ЯРОСЛАВ ГРИГОРОВИЧ

доктор б1олог!чних наук МАЛЮГА СТАН1СЛАВ СТАН1СЛАВ0ВИЧ

Пров1дна установа: Нац1ональний ун1верситет iM. Тараса Шевченка

Захист дисертацН в1дбудетьоя " 2С р. 0 - ю "

год. на зас1Данн! спец1ал1зовано£ вчено! ради Д. 01.81.01 по захисту докторських дисертац1й 1нституту м!кроб1олог11 i Bipy-сологИ HAH Укра1ни за адресою: м. Ки1в, вул. Заболотного Д54.

3 дисертац!ею можна ознайомитись в б1бл1отец1 1нституту. Автореферат роз!слано "¿^ р.

Вчений секретар cneuiajiiaoBZHoi ради кандидат б!ол. наук

Л. М. Пур1ш

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальн1сть проблема обумовлена як науково-теоретич-ним, так i пракгичним значениям вивчення системи цханофаг-ц1анобактер1я (Proctor et al. ,1990,Waterbary et al.,1994).

В той же час сукупн!сть i посл!довн1сть молекулярних npoueeiB, як! супроводжують 1нфекц1ю ц!анофаг1в в клхтинах ц1анобактер!й, залишаються ще мало вхдомими. Тому початковий пер!од 1нфекц11 е найб!льш ц1кавим та вручним для вивчення функц!онування системи цханофаг-цхадобактерхя, оскхльки йому притаман! швидк! к1льк1сн! i як!сн! зм!ни фхз1олого-б2ох1-м!чних та молекулярно-бiологiчних npoueeiB.

При цьому найб1лыа важливий iHTepec полягае в дослужены: механ!зм1в зберегкення структурно-функц!онально1 ц!лостност1 в1русного геному на протязх тривалого часу ран-Hix етап!в хнфекцх!. В1домо, що вс! дослхджен! ц!анобактерН мають системи рестрикцН-модиф1кац11 II типу, але в!домоет! щодо цих систем у Plectonema boryanum. досить обмеженх.

Рестрикции! бар'ери ц!анобактер1й, у багатьох випадках, перешкоджають ефективному процесу клонування ген!в як при дослхдженн! механ!ам1в регуляцИ ц1анофагово! 1нфекц11 шляхом транеформацП ц1анобактер1й, гак i при конструюванн! рекомбхнантних штам1в-продуцентiв (Mozer et al. ,1993). 3 iH-гого боку, практична в!дсутн1сть молекулярно-б1олог1чних досл!джень ДНК ц1анофаМв не дае можливост! п!д1йти до вивчення механ!зм1в подолання рестрикц!йних бар'ергв господаря.

Приймаючи до уваги теоретичну i практичну значимость вшдезгаданих проблем, доцишним було досл1дити деякг аспекти взаемодН в1рулентного щанофага LPP-3 з кл1тинами нитчастох ц1анобактерН Plectonem богуапит При вивченн! дано! проб-леми ми виходили з таких полояень: по-перше, щанобактерН P. boryanum притаманна висока компетентность ; по-друге, щанофаг LPP-3 мае невелик1 розм1ри геному, в1дносно просту структурну орган ¡защю BipiOHiB i пор1вняно короткий, Biдносно 1нших ц!анофаг1в, л1тичний цикл розвитку; по-трете, репродукц1Я даного щанофага не л!штуеться в¡ком культури

щанобактери, що в^дкривае широк! можливосп використання iiiei системи ц1анофаг-ц!анобактер1я для досл1дясення механ!з-MiB регуляцН процес!в цтанофагово! шфекцН i для розробки принципово нових еколоПчно безпечних фогобЮтехнолог1Й.

Мета та завдання роботи. Робота присвячена вивченню систем рестрикц11-модиф!кацН ц±анобакгер!1 P.boryanum i способов захиету в!д них ДНК ц!анофага LPP-3 шляхом досл!д-ження структурно-функц!ональних особливостей будови 1х ДНК. Для досягнення iiiei мети були поставлен! так! задачи

- провести рестриктйний анал1з ДНК Щанофага LPP-3 та ц1анобактер11 P. boryanunr,

- ¿дентифшувати та визначити bmict модиф!кованих основ в досл!дкуваних ДНК;

- виявиги i визначити спещфгчнгстъ систем рестрикц:!-модиф!кацН кл1тин P. boryanunr,

- визначити шляхи захиегу Щанофага LPP-3 в!д систем рестрикцН-модиф1кацН господаря;

- побудувати ф1зичну карту ДНК Щанофага LPP-3;

- !дентиф1кувати область paHHix ген1в ДНК гцанофага LPP-3, здхйснити тонке картування i клонування ii фрагменпв.

Наукова новизна та практична цднн!сть роботи. У процесс виконання роботи одержан! HOBi результати, HKi дозволяють розширити уявлення про paHHi етапи ц!анофагово! шфекцИ i створюють передумови для використання елемент1в геному ц1ано-фапв для розробки HOBiTHix фотоб1отехнолопй. Вперше побудо-вана ф1зична карта ДНК шанофага, виявлена специф!чн!сть мо-дифхкацтх i доведено !снування контрселекшя геному щанофага LPP-3. Встановлеш механ^зми аахисту ДНК LPP-3 в!д рест-рикцН в KJiiтинах P.boryanum. В результат! проведених досл1джень розроблена методика м!чення л!н!йних РНК in vitro за допомогою терм!нально! трансферази, яка вперше використана для одергкання в!русспециф1чних мРНК- зондов. Використання цього методу дозволило 1дентиф1кувати область paHHix генхв на ДНК Шанофага LPP-3.

öcHQBHl положения, що зиноеяться на захист.

1. Геном танофага LPP-3 являе собою дволанцюгову молекулу ДНК dqbmipom 42,5±1,5 т. п. о. , яка не тстить híkíb та мае вгдкрит! некомплементарш kíhuí.

2. ДНК щанобактерН P. boryanum крш kehohiчних мютить двi М0диф1К0ван1 оенови: И-6-меткладен1н - 4,5% i 5-метилци-тозкн -1,2%.

3. ДНК шанофага LPP-3 Kpiw канон1чних основ мютить тиьки 5-метшщитозин в Ki ль кос tí 0,8 % в CïïC(A/T)GG

посл1довностях.

4. Клиини шанобактерН Р. boryanum. мають системи рест-рикЩ1-модиф1кац1í dam- i dem- подобного типу.

5. Захист геному цтнофага LPP-3 В1д рестрикщ! в кл1ткнах Р. boryanum, зд1йскккться двома шляхами: метилюванням цитозину в другому полоя»нн1 CC(A/T)SQ поел i довностей та контреелекщею за GQ(C/G)CC посл1добностями.

Апробация роботи. Результата дксертац!йно1 роботи до-повiдались на VI Укра:Ёнському 6íoxímí4kom7 з'хзд! (Khíb., 1992), на I установчому (VÎÎI) г'ísni Укра!нського м1кр0б10Л0Г2ЧН0Г0 товариства ( Одеса,1993), на м1жнародн1Й конференпд! з проблем Ф1тов1русолог11 (Ялта,1994), на заседаниях Вчено! ради та шрр1чних конкурсах экспериментальных po6íT Гкституту м1кр0б20Л0Г11 í в1русолог11 HAH Укра1ки.

Оеосисгий внесок автора. Робота виконана автором особисто.

Публ1кац11. За темою дисертац!! опубликовано 9 роб it.

Структура та обсяг роботи. Дисертащя складаеться \г вступу, огляду Л1тературк, опису матер1ал1В та метод:в досл1джень, результат i в та íx обговорення, bhchobkíb та списку л!гератури (158 дяерел, з них 123 на шоземних мо-вах). Роботу викладено на 137 етор!нках машинописного тексту, ичюстровано 20 рисунками та 5 таблицями.

MATEPIAM ТА МЕТОДИ Д0СЛ1ДЖЕНЬ

Об'ектом досл1джень була чиста лШ1я Шанофагу LPP-3, а також аксенична культура ЩанобактерН Plectonema Ьогуашт вот, штам CALU 465. Щанобактерио Р. Ьогуапшъ- вирощували на средовищ! аптоджеральда в 3 л колбах Ерленмейера при t- 26-28° С, освИгленШ 3000 лк та безперервшй аерадН пов1Трям з С02 .Для одерзкання ДНК щанобактерИ Р. Ьогуашт, використовували модифшован! методи (Adams, 1988 та Sölden, 1987). Довжини рестриктйних фрагмент i в ДНК вираховували за допомогою комп' шерно! програми, складенох на 6a3i лшй-ного алгоритму (Southern,1975 ). Теоретично оч!кувана К1ль-KicTb cañTiB в ДНК LPP-3 визначалася за Upholt et al. (1977) . Для Пдрол18у ДНК фтористоводневою кислотою використовували модифтований метод Catania et al. (1987). Г1дрол1а ДНК проводили 35 % HF на протяз! 2 годин при 80°С. Розпод1л продукт iв xiMi4Horo пдрол1эу ДНК i стаядартних основ проводили на хро-матограф1чн1й установи HPLC "System GOLD" Beckman (США), колонка С18 RPC у зворотн1й фаз i: водна - 25мМ КН2РСЧ , органична Мзопропанол з Л1н1йним град1енгом 95-5 Вид^лення РНК з 1нф1ксваних юитин ц!анобактер1й проводили за методом Smith & Сагг, 1977. Рад^оагсгивне М1чення ДНК по З'-Шнцям зд1йенюва-ли за допомогою фрагмента Кленова ДНК-пол1мерази I Е. col i,ДНК ш^мерази Т4 та терм1нально! дезоксинуклеотид1Лтрансферази, м1ченими [<¿32P] дНТФ з питомою активнЮтю 3000 Ки/мМоль. 5'-к1нцеве Mi4eHHH ДНК проводили за допомогою шшнуклео-тидкшази Т4 в реакщí обману з [у 32 PI АТФ ( питома ' акт. 4000 Ки/мМоль) в присутност! АДФ ( Sambrook et al. , 1989, Ausubelet al.,1990). РНК-зонди для гибридизацН отримували míченням тотальних npenapaTiB ц!анобактер1ально1 РНК пол1-нуклеотидк1назою Т4 та терм1нальною трансферазою в буферк 200 иМ какодилату катню, 1 мМ СоС12,1 мМ ДТТ, pH 7,2.

Метилазну активнють екстракт!в та частково очищених ферментних npenapaTiB Р. Ьогуапит визначали за методом (Smith, 1992) використовуючи S-аденозил-Ь-Сметил 3Ш метионш ( пит. акт. 15 Ки/мМоль). Для ДНК-ДНК та ДНК-РНК пбридизацН вико-

ристовували метод блот-пбридизацИ за Саузерном. Предпбри-дизац1ю 1 пбридизащю з пробою проводили у розчин! без формам ду при 68° С на прогяз1 16-20 год. Ф1льтри екслозували на рентген1вський пл1вц1 РМ-1 чи £-тах "АтегзЬат" при -70°С. Статистичну обробку даних проводили методом дисперс!йного анал1зу в пакет! ЗЬаЪдгаПсБ (БТЗС,Канада)

РЕЗУЛЬТАТИ ТА IX ОБГОВОРЕННЯ

Рестрикщйний анал1з ДНК шанофага ЬРР-З 1 шанобактерН

Р. Ьогуапит

В ход! рестрикщйного анал!зу використано б!льш шж 60 ендонуклеаз рестрикцН, як1 вп!знають тетра-, пента- ! гек-сапад!ндромн1 нуклеотидн! послиовностьа також рестриктази, що г1дрол!зують ДНК за непал!ндромними ! дек1лькома сайтами Встановлено, шр велика к1льк!сть рестриктаз, як! вШзнають гексапал!ндромн! нуклеотидн! посл!довност1, не г!дрол!зують ДНК Шанофага ЬРР-З, а деяк! рестриктази мають к!льк1сть сайтов, щр эначно в!дхиляеться в1д теоретично оч!кувано1 ( табл. 1 ).

Особливо привертае увагу значне в!дхилення теоретично оч1кувано! к!лькоси сайт!в рестрикцН в!д !х експеримен-тально одержано! к^лькост! для деяких рестриктаз. Так, рест-риктаза ВзиШ, що вшзнае на ДНК тетрануклеотидну пал!ндром-ну посл!довн!сть (ЗСзСС, пдрол1зуе ДНК ЬРР-З лише за одним сайтом, в той час як при повн!й рандом1зац!1 та враховуючи (ЗС-склад В1русно1 ДНК можна було б оч!кувати наявн!сть при-близно 200 сайт1в. Рестриктази СГг131 ! Есо471 з сайтами вШзнавання БбШС та йв(А/Т)СС мають по 7 сайт!в зам!сть 192 ! 94 теоретично оч!куваних, В1ДП0В!ДН0.

Для пошуку модиф!кованих основ в склад! ДНК Шанофага ЬРР-З ! щанабагсгерИ Р. Ьогуапит. використовували найб1лып чутливий метод - НРЬС продуктов х!М!чного Пдрол1зу ДНК. ДНК ЬРР-З ! Р. Ьогуапит. пдролзували хлорною та фтористоводневою кислотою. НР викорисговували для запоб!гання дезам!нування метильованного цитозину.

Таблиця 1

ПДР0Л13 ДНК Ц1АН0ФАГА LPP-3 РЕСТРИКТАЗАМИ:

1) з гексапалшдромними сайтами вшзнавання

Назва Сайт KiJlb- Назва Сайт KiJib-

рестрик- вшзна- KiCTb рестрик- вшзна- KiCTb

тази вання сайтiв тази вання сайтíв

6 GC Есо521 CGGCCG О Sma I CCCGGG 0

Ehe I GGCGCC 3 Bspl20I GGGCCC 0

Alw44I GTGCAC 3 Mlu I ACGCGT 15

ВалШ GGATCC О Neo I CCATGG 2

Bsp68I TCGCGA 3 Рае I GCATGC 4

4 GC Eco47I11 AGCGCT 14 Pst I CTGCAG 0

Eco72I CACGTG 15 Pvu CGATCG 1

Ecol47I AGGCCT 1 PvuII CAGCTG 0

Ecll36I GAGCTC О Sal I GTCGAC 0

Kpn I GGTACC 11 Xho I CTCGAG 0

Kpn2I TCCGGA 2

Bel I TGATCA 8 Eco255I TASCTA 20

Bgl II AGATCT 10 HindiII AAGCTT 20

2 GC Bspll9I TTCGAA 1 1ФМ1031 ATGCAT 0

Bsul5I ATCGAT 10 Nde I CATATG 0

EcoRI GAATTC 0 Xba I TCTAGA 12

Eco32I GATATC 16 Ecol05I AGTACT • 20

О GC Dra I TTTAAA 0 Ssp I AATATT 0

2) з тетра-, пентапалиндромними та оншими сайтами

Alu I AGCT >30 Cfrl3I GGNCC 7

BsuRI GGCC 1 Eco47I GG(A/T)CC 7

Bsp50I CGCG >30 Ben I CC( C/G) GG >30

Csp6I GATC >60 Mva I CC(A/T)GG >60

Hin6I GCGC >30 Bbv I GCAGC( N) 8/12 >60

Msp I CCGG >20 Alw26I GTCTC(N)1/5 >20

SauSA GATC >20

Taq I TCGA >50 Not I GCGGCC6C 0

Cfr I PyGGCCPu 0 Eco88I CPuCGPyG 10

CfrlOI PuCCGGPy >20 Eco91I GGTNACC 0

Eco24I GPuGCPyC 14 Ecol30I CCPuPuGG >20

Eco31I GGTCTC(N) 1/5 0 Hinc II GTPyPuAC >30

Sdu I GDGCHC >20 Xho II PuGATCPy >20

Pu = A, G i Py - T,C D = A,G або T H « T,C i або A

Результата сканування niKiB i подальший комп'ютерний анализ НСЮ^ - пдрол1зат1в дозволив iдентиф!кувати т1льки канонi4Hi основи i наявнють N-6-mA в ДНК Р.Ьогуашт. При хроматограф!! пдрол!зат!в, отриманих за допомогою фтористо-водневох кислоти (мал. 1). як очшувалось з результат!в рестрикц!йного анал!зу, були виявлен! 4iTKi шки 5-метил-цитозину. Комп'ютерний анал1з проф!лю елюцН HF- i НСЮ^ -г1дрол1зат1в, зроблений "System GOLD" Beckman, дозволив !дентиф!кувати 1 шдрахувати к!льк!сть основ в досл1джених ДНК Встановлено, що, кр!м канон!чних основ, ДНК щанобак-терИ Р. Ьогуапит мюгить дв! модифтоЕан! основи: 5-метилци-тозин в концентрат! 1,23 Z та 4,5 % И-б-метиладешну. ДНК LPP-3 мстить лише 0,8 % 5-метилцитозину i не м!стить в своему склад! N-6-метиладен шу.

Вивчення наяЕност i сайтспециф;чного метилювання

3 метою виявлення сайтспециф1чного метилювання ДНК LPP-3 та ДНК Р. Ьогуапит Пдрол!зували рестриктазами-!зошизо-мерами, як! вп!знають однаков1 пал1ндромн! посл!довност!,але по-р!зному реагують на метилювання залипшв цитозину та аде-Hi ну в цих посл1довностях. Для виявлення метильованого цитозину в сайт! CCGG викорисговували рестриктази Mspl i Hpall.

Пор!внюючи електрофоретичн! проф!л1 продукт!в рест-рикцийного г!дрол1ву ДНК козкною рестриктазою можна встанови-ти наявшсгь метилювання цитозину у другому положение посл1 довност! CCGG. Сшвпадання рестрикт!в говорить про В1дсутн!сть метилювання, а менша fx к1льк1сть або повна в!дсутн1сть при г1дрол!з1 Hpall св^дчить про часткове або повне метилювання CmCGG сайту. Електрофоретичний розпод!л продукт1в пдролдзу ДНК LPP-3 га P.&oryanum цими рестрикта-зами мае !дентичний характер, що вказуе на в^сутшсть метилювання по внутрипньому цитозину в CCGS- послi довностях. В той же час смд зазначити, що обидв1 ДНК мають велику к! лькють CCGG- посл!довностей.

1нша пара рестриктаз Mval та Apyl вшзнають один i той же сайт CC(A/T)GG. Mval г!дрол1зуе ДНК незалежно Bifl наяв-

254 JPLC-GOLD standard bases

0.35

0.10

0.05

0.00

5 30 15 20 25

254 U>LC-GOU) IPP-3 Dfl

: п - s 1

1 A

0.15

254 HPLC-GOLD P.boruann D«

0.10

0.05

0.00

Час елюцН, хв

Мал. 1 Хроматограф!я стандартних основ (1) 1

продукт!в xiMi4Horo гхдрол^зу фтористоводневою кислотою ДНК щанофага LPP-3 (2) та щанобактерИ Р. богуапиш (3) на установЩ HPLC "System GOLD" Beckman.

HocTi в сайт! рестрикцИ 5-метилцитозину, a Apyl- т1льки у випадку метилювання цитозину в другому положеныl i при в1дсутност! метилювання в першому. Майже в ycix CC(A/T)GG-посл!довностях досл!джуваних ДНК цитозин в другому положенн! метильований. Таким чином, б1льш1сть CCAGG- i CCTGG-посл!довностей в ДНК цих об'екпв юнують у виглядi CmC(A/T) GG. Для визначення наявносп мегильованого аден1ну вико-ристовували рестриктази Sau3A, Mbol та Dpnl, як1 вшзнають посл1довн1сть GATC. Рестриктаза БаиЗА може пдрол1зувати ДНК по GmATC, але не за GATmC- посл!довностями. Рестриктаза Mbol, навпаки, здатна вшзнавати GATmC, але не GmATC сайти. Ендонуклеаза Dpnl г!дрол±зуе ДНК Т1льки по метильованих nocaiдовностях ( GmATC сайти). Встановлено, що практично вс! GATC сайти ДНК Р. Ьогуапит- метильоваш по аденшу, а в ДНК LPP-3 Ц1 посл!довност1 неметильовань

При вивчешп систем рестрикдИ-модиф1кацН Р. Ьогуапит досл!джено метилтрансферазну агсгивнють И кл!тин. Г1дрол1-зати кл!тин Р. Ьогуапит очищали хроматограф!чно на колонках з ДЕАЕ-сефадексом, а також методом 1зоелектрофокусування в борат- полю льн!й систем!. В одержаних фракщях досл1джувала-ли наявнють i специф!чн1сть Д1 £ метилтрансфераз. 3 Ц1ею метою використовували субсграти в piзною специф1чн1стю метилювання. Активн1сть проб з метилазною актившстю дор1внювала: 3850 ± 800 iMn/XB/MKT при використанн1 ДНК фага лямбда, вид!леного з dam+, dcm+ господаря в той час як на ДНК фага лямбда з мутантного по системам метилювання господаря ак-THBHicTb дор1внгавала 15200 ± 1200 !мп/хв /мкг, а на ДНК еритродит1в курчат вона сягала 29950 ± 2050 iMn/хв/мкг.

Визначення типу метилтрансферазно! активност! показало, що як i для б1лыпост! метилаз II типу, прояв активностi за-лежить Т1льки Bifl наявност1 молекул SAM i практично не зале-жить в!д присутностi в реакц!йн1й еумш! йон1В Mg++i молекул АТФ. Де cвiдчить про те, щр Р. Ьогуапит. мютить сайтспе-циф!чн1 метилази II типу. Як вже зазначалося ран!ше, анал1а даних, одержаних за допомогою хроматограф!i пдрол!зат!в ДНК Р. Ьогуапит та рестрикцН ендонуклеазами, чугливими до метилювання, дозволив встановити, що метильований цитозин

"мютиться-'в ДНК в CmC(A/T)GG посл1довностях, . а метильований 'аден1"н -в GmATC- посл1довностях. Враховуючи наявшсть- у Р. Ьаг'уатт. метилазно! активносп з под1бною епециф1чн1стю "йожна зробити висновок про те, що ц:.й ц1анобактерН прита-■MäHi еистеми -;рестрикцН-модиф1кацН :3;. специф!чн1стю, под1бною до dam i dem систем Е. col i.

Шляхи захисту ДНК LPP-3 в!д рестрикцМ в P.boryanum

Пор1вйяння kíльKocTi метильованих C¡nC(A/T)GG посл1дов-ностей з загальною илькостю 5-метилцитозину-в-досл1джуваних ДНК св!дчить про те, що практично весь метильований цитозин зосереджений в цих сайтах. 1дентичн1сть pecTpjiKTiB, одержа-них в результат! пдрол1зу ДНК LPP-3 рестриктазами Cfrl3I (GGNCC) i Avail (GG(A/T)CC) евгдчить ( з загальноприйнятими методами визначення специф1чност! рестриктаз) про те, що "CfrlSI пдрол1зуе ДНК LPP-3 по сайтах Avail. У цьому випадку посл1довност! GG(C/G)CC повшш бути або метильован! по ос--танньому цитозику, або ел1м1нован1 з ДНК

У випадку метилювання yi посл1Довкост1 мали б виглядати як GG(C/G)CmC(А/Т)GG,тобто, перекриватися Apyl сайтом. Але дя посл1довн1сть mí стить GGCC сайт рестрикгази BsuRI, який би 1нг1бувався метилюванням. До того ж, за допомогою метод1в подвайних nepeBapíB вдалось встановити, що ушкальний сайт BsuRI е частиною розширено! посл1довност1 AGGCCT, що Пдро-л!зуеться 1Кшою рестриктазою Ecoí47í. Отже е лиетави ствердкуваги про в!дсутн1сть в ДНК LPP-3 тхшдовностей GG(C/G)СС. 0ск1льки ДНК Р. Ьогуапшп ефективно пдрол1зуеться рестриктазою BsuRI, причиною цього явиша може бути захист в1д власних В1русспециф1чних нуклеаз, hkí з'являються на paHHix этапах 1нфекц11 .

Спроби вид!лення ендонуклеази рестрикц!х з 1Штин Р.Ьогуапит разними хроматограф!чними методами (КМ-целлюлоза, ДЕАЕ-сефадекс,¿зоелектрофокусування) виявилися невдалими з причин неможливост! зв!льненя bíд домшок неспециф1чних нуклеаз. ДНК LPP-3 г!дрол!зували рестриктазами з розширенням GATC-сайту: BamHI -сайт Шэнавання GGATCC, Bell - TGATCA,

Bglll - AGATCT , Pvul - CGATCG та Xholl - (A/G)GATC( Т/ C). ВсГрестрштази, окр1м Ban«I, пдрол1зували ДНК LPP-3 на pisHy кивнуть фрагмент!в. Щ дан! дають можливость припус-тити,- що Р. Ьогуапит повинна мати рестиктазу саме з таким ■ сайтом впознавання - GGATCC. ТЧльки в дьому випадку ДНК LPP-3 не буде поддано рестрикцИ при онфекцН Р. Ьогуапит.

Ф13ИЧНЕ КАРТУВАННЯ ДНК Ц1АН0ФАГА LPP-3 •• .

Наявшсть peajicieHTHocTi ДНК шанофага LPP-3 до дН рiз'них ендонуклеаз рестрикцИ значно ускладнило процес фозичного картування його геному у зв'язку з нер1вноморним розпод1лом колькост! сайтов рестрикцИ для використаних рестриктаз. При скришнз1 рестриктаз, придатних для цолей ф!зичного картування, було використано б!льше 60 р!эних фер-менпв. Т1льки три рестриктази - BsuRI, Ecol47I, Bspll9I та Pvul мають унокально сайти, ДВ1 - Ncol та Крп21 по 2 сайти, та дв! - Alw44I i Ehel по 3 сайти рестрикцИ ( таб.2 ). Розмори кожного фрагмента виэначали в результат! не менш Н1Ж трьох експерименгов.

Таблиця 2

Po3Mip фрагментов ДНК ( т.п. о.) щанофага LPP-3, одержаних в результато пдролизу рестригсгазами, hki використовувались для ф1зичного картування

Назва Н а з в а р е с три к т а 3

фрагменту BspllQI BsuRI Есо1471 Ehel Крп21 Ncol Pvul Alw44I

А 38,4 33,5 33,5 29,9 26,6 28,9 33,5 24,0

В 4,1 9,0 9,0 8,2 9,5 8,0 9,0 7,2

С 3,6 6,4 5,6 6,5

D 0,8 4,8

Сума 42,5 42,5 42,5 42,5 42,5 42,5 42,5 42,5

У б!льш складних випадках докалхзаш! caüTiB рестрикцИ використовували п!дх!д, який базуеться на знакоджен! к1нце-вих фрагментiв для рестриктаз з б1лып Н1Ж одним сайтом рест-рикцИ. ДНК LPP-3 Miтили по к!нцях, г!дрол1зували двома чи трьома рестриктазами 1 автографували гель. Цей метод дав можливють в1дразу розпод1 лити на KapTi клнцев1 фрагменти i значно П1двищити ефективнють рестрикид йного картування. Для створення фдзично! карти ДНК танофага LPP-3 використовували ко№1'ютерн1 программ картування сайт!в рестрикцН. Застосу-вання комп'ютерних програм картування дозволило створити власну базу даних i використовувати вже дослхджен! фрагменти як автомаркери. Карта ДНК LPP-3 СЫал. 2) являе собою схему в1дносно£ локал!зац!1 14 сайт!в рестрикцН восьми рестриктаз - Alw44I, Bspll9I, BsuRI, Ecol47I, Ebel, Ncol, Kpn2I та Pvul (сайт рестриктази BsuRI e частиною поол1довност1 Ecol47I).

Природа к!нц!в ДНК щанофаг1в не вивчалася,тому важливе значения мало визначення типу KiHUiB ДНК LPP-3. Той факт, що ДНК LPP-3 ефективно мниться по 3'- i 5' -К1нцям за допомогою фрагмента Кленова, пол1нуклеотидт нази Т4 та терм1нально! трансферази, однозначно св!дчить про те, що ДНК LPP-3 мае BiflKpHTi KiHui. Для визначення наявноси виступаючих нуклео-тидхв на одному з юнщв ДНК ицанофага LPP-3 використовували метод, який базусться на пор!вняльному анализ1 ефективноет! включения Mi тки полшуклеотидктазою Т4 в 5'- KiHUi та тер-м!нальною трансферазою в 3'- к!нщ ДНК LPP-3 i фага лямбда Як видно з табл. 3 пол!нуклеотидк1наза, яка проявляе найвищу активн!сть при м!ченнх виступаючих 5'- к!нц1в, ефективн!ше м1тить ДНК фага лямбда. Вхдомо, що терм!нальна трансфераза проявляе найбхльшу специф!чн1сть до виступаючих 3'- к1нщв ДНК при використанн i какодилатного буферу з йонами Mg++ та дАТФ i втрачае специфхчнхсть до типу к1нц!в в тому ж буфер! з йонами Со++ та м1ченим дЦТФ. При використанн! реакц!йно! сум1шх йонами Со++ ефективн!сть м!чення ДНК вазначенних об'ектхв практично не в±дрхзняеться. В той же час, при вико-ристанн1 йонхв Mg++ спостер±гаеться значне зростання ефек-тивност! м!чення ДНК LPP-3 у порiвнянн! з ДНК фага лямбда.

Я Ш1 g Bsp119I

Еч

| BsuRI о,

I Ehe!

о.

л Ncol я

I Крп21 Pvul

О 8500 2?000 25500 34000 42500

Розм1р генома, п. о. Мал. 2 Ф1зична карта ДНК Щанофага LPP-3 (сайт BsuRI=Ecol47I)

И

Мал. 3 Залежнють ефективност! м!чення РНК терм1нальною трансферазою В1д аначень pH буферу i типу використаних Д2валентних кат1онiв.

Позначення - какодилатний буфер з: Со++ - 1 тМ СоС12 (молярне сп1вв1дношення к!лькост1 3'-к1нц1в РНК. до к1лькост1 [32РЗ гСТР 1 : 10 ); Mg++ - 10 шМ MgCl2 ; Мп++ - 10 шМ МпС12 С С32 РЗ гАТР 1 : 100 )

С 1 А \ в

в А

А I в

-D В с А

А В с

с В А

в А

. Таблиця 3

Ефектившсть шчення (%) 3'- 1 5'-кшЩв ДНК щанофага ЬРР-З та фага лямбда поло нуклеотидк!назою Т4 1 терм1нальною транс-феразою

Джерело ДНК Псшнуклеотид-К1наза [у 32РЗ АТФ Термо нальна трансфераза

Mg++ [ос 32 рз дАТФ Со++ Ы 32 р] дЦТФ

ЬРР-З lambda 2,0 ± 0,5 11,2 ± 0,8 29,5 ±2,5 6,2 ± 1,2 16,3 ± 1,5 15,5 ± 1,5

Для визначення комплементарност1 протилежних к1нд1в ДНК ЬРР-З проведен! досл!ди по в!джигу та по л!гуванню за допо-могою л1гази Т4 нативних молекул генома з наступним пдрол1-зом рестриктазами. На в1дм1ну в!д контрольних зразкхв ДНК фага лямбда, н! в1джиг, н! л!гування ДНК ЬРР-З не призводи-ть до зм1н у характер! електрофоретичного розшдолу рестрик-Шйних фрагментов. Таким чином, вищевкаэан! методи не вия-вили комплементарност! конщв ДНК ц!анофага ЬРР-З.

Оск!льки при Г1Дрол131 ДНК ЬРР-З, яка була м!чена в на-тивному сташ ДНК-поломеразою I, спастерогаеться включения м1тки тольки в два к!нцевих фрагменти, зроблено припущення про в1дсутн!егь в цоанофагов1й ДНК однониткових структур типу н1к1в. Для перев1рки цього припущення ДНК ЬРР-З 1нкубува-ли з нуклеазою 31 в умовах, як! максимально знижують ен-донуклеазну .активность. По сля проведения електрофорезу оброблених нуклеазою 31 препарат!в ДНК не виявлено ноякох додаткових фрагментов, шр св1дчить про в1дсугн1сть в ДНК ЬРР-З ншв.

ТОНКЕ КАРТУВАННЯ РАННЬО! 0БЛАСТ1 ГЕНОМУ Ц1АНОФАГА ЬРР-З

Для одентифокац!г ресгрикцойних фрагмент¿в ДНК цоанофа-га ЬРР-З, як! мостять ранню область ген!в, викорисговували

метод ДНК-РНК пбридизацН. 3 метою визначення часу появи В!русспециф1чних транскриптiв РНК переносили на н!троцелю-лозн1 ф1льтри i пбридизували в1русною ДНК, м1ченою й1К-транслящею. За результатами Нозерн-блоту та дот-пбри-дизацН встановлено, що В1русспециф1чн1 мРНК з'являються в тотальному препарат! вше на 15 хвилиш п1сля заражения, але В1дчутний пбридизащйний сигнал був одержаний при викорис-танн! препараив РНК, видхлених з 1Нф1кованих кл1тин Р. Вогуапит через 30 хв пюля ix заражения щанофагом LPP-3.

Основною метою роботи було визначення за допомогою в!русспециф1ЧН0Г0 мРНК-зонду фрагмент1в ранньо! обласп геному LPP-3 шляхом Нозерн-блоту. Для дього важливо було одер-жати препарати РНК з максимально високою питомою активна cm На жаль, вс! в!дом! методи М14ення прокарЮтичних мРНК мають сутгев! недолтки. Тому була дослужена момив1сть викорие-тання для м!чення РНК KpiM пол1нуклеотидк1нази Т4, i TepMi-нально! трансферази. PaHime було показано, що терм1нальна трансфераза здатна утворювати рибонуклеотидн1 шшмери на 3'-к1нцях ол1гонуклеотид1в, однак цей метод не використову-вався для М1чення РНК (Vu,1976). В досл!дах по визначенню оптимальних умов реакцН пол!меризацИ вивчали вплив концентраций р1зних дивалентних кат!он1в, м1чених попередник1в i pR Показано, що найвжвдй р1вень включения м!тки в РНК фага MS2 спостер!гасться при використанн! 200 Ш какодилатного буферу, рН 7,2 з 1 мМ СоС12 (Мал. 3). Вшрацьований метод застосували для м1чення вгрусспециф1чних мРНК in vitro , як1 в подальшому використовували як зонди в експериментах по 1дентиф1кац11 облает! ранн!х reHiB в ДНК LPP-3.

Иаралельно з одержанням М1чених РНК зд!йснювали перенесения Hind III-, Kpnl- та Xbal- фрагмент!в BipycHOi ДНК на штроцелюлози! фзльтри для подалыдо1 пбридизаШ! з м!ченими мРНК. Виб1р саме цих рестриктаз зумовлений тим, що серед ендонуклеаз, як! пдрол!зують ДНК LPP-3, т!льки HindiII, Kpnl та Xbal мають сайти в п0Л1Л!нкер1 pUC!9 - вектору який передбачався використати для клонування фрагмент!в paHHboi облаетi reHiB. За допомогою paHHix вiрусних мРНК методом блот-пбридизацН встановлено, що B-Kpnl фрагмент мютить

область раншх гешв ДНК щанофага LPP-3. PosMip виявленого фрагмента складае 10 т. п.о. i займае майже чверть BipycHoro геному. Щ даш були отриман1, на наш погляд, завдяки вико-ристанню оригшального методу м1чення мРНК за допомогою терм1нально! трансферази. Незважаючи на те, шр сумарн! пре-парати РНК, Mi4eHi терм1нальною трансферазою, мали меншу питому активнють в nopiBHHHHi з препаратами м1ченими полшук-леотидкшааого (в середньому 5,5 х 107 im/хв/мкг i 1,2 х 10® iMn/XB/MKr в!дпов1дно),б!льш Ч1ТК1 автографи були отриманх при використанн1 nepmoi is них.

3 метою визначення локал!защ! B-Kpnl фрагменту на ф1зичн1й KapTi ДНК LPP-3 проводили сшльний пдрол1з рест-риктазою Kpnl з рестриктазами,як1 мають сайти вшзнавання на протилежних йнцях геному: NcoI,Bspll9I i Kpn2I. Встановле-но, що рестриктази Bspll9I i Kpn2I мають сайти рестрикцН на В-Kpnl фрагментi ДНК LPP-3,a рестриктаза Ncol його не Пдро-л!зуе. Таким чином була встановлена реальна ор!ентащя ф!зично! карти ДНК щанофага LPP-3.

Шсля Пдрол1зу BipycHoro генома, М1ченого по юнцях в нативному стан! рестриктазою HindiII, 4iTKO !дентиф!куються два к!нцев! фрагмента розм!ром 2,8 i 0,77 т.п. о. хх рестрик-щйний анал!з та Нбридизащя з 10 т. п. о. В-Kpnl-фрагментом дозволили встановити, що саме 2,8 т.п. о. Hindlll-фрагмент належить до ранньох облает! ДНК LPP-3. Цей фрагмент вид!ля-ли з легкоплавко! агарози i г!дрол1зували рестриктазою Sau3A. Дан! експерименти разом в результатами клонування дозволили провести тонке картування 2,8 т.п. о. Hind Ill-фрагмента ДНК LPP-3 по рестриктаз! Sau3A (Мал. 4).

Клонування фрагментов ранньоз облает! ДНК LPP-3

Проведено клонування окремих фрагментов област1 paHHix ген!в ДНК LPP-3 в вектор pUC19. Для цього використовували 2,8 т. п. о. Hindlll-фрагмент ДНК LPP-3 i продукти його Sau3A riдрол!зу. В результатi експеримент!в не вдалося заклонувати KiHiieBi Hindlll чи HindIII/Sau3A фрагменти геному, що .також cBiдчить про наявнють в ДНК LPP-3 виступаючих к!нщв. В той

же час були отримаШ клони, що мютять два Sau3A - фрагменти ранньо! облает! ДНК LPP-3 розм1ром 700 п. о. ! 350 п. о. кло-нован! за BamHI та за BamHI/HindiII сайтами pUC19 (мал. 5).

Ehel

Hindi II Bspll9I

Kpn2I

Ehel Kpnl

Sau3A

Alw44I

Pvul

I-h

0 1

6

10

Довжна геному, т. п. о. Мал. 4 Ф!зична карта ранньо! облает! ДНК щанофага LPP-3

Оск!льки в экспериментах по клонуванню використовували штами E.coli, дефщитн! по системам рестрикцН-модиф^кацН, або TaKi, що не мали метилаз GSmCC-типу, неабиякий интерес представляла перев!рка припущення щодо елхм1нац11 з ц!ано-фагового геному CC(C/G)GG- посл!довностей. 3 метою доказу хенування контселекцН плазм!ди з фрагментами ДНК LPP-3 Пдрол!зували рестриктазою BsuRI i анал1зували електрофоре-тично. У випадку коли резистентн1сть ДНК LPP-3 до дН рест-риктази BsuRI була би обумовлена метилюванням GGCC посл1дов-HOCTi повинен спостер1гатися пдрол1з клонованих фрагмент!в (близько 200 теоретично очтуваних сайтов на геном LPP-3). У раз! !снування контрселекшi б1лышсть клонованих фрагмент!в не ПОВИНН! Г!ДрОЛ1зуваТИСЯ KpiM одного, що мютить ун!кадьний сайт BsuRI. Як видно з мал. 6. , клонован! фрагменти ДНК LPP-3 не шддаються гддрол1зу рестриктазою BsuRI, тобто не мають GGCC- шхшдовностей, що е ще одним вашшвим доказом наявност: контрселекц!i ц1анофагово! ДНК за CC(C/G)GG mxuii-довностями.

Мал. 5 Електрофорез в 1,5 % агарозному гелх продукт1в г!дрол±зу плазм!д а фрагментами ДНК д!анофага LPP-3

Позначэння: 1,4- ДНК LPP-3/Sau3A; 5 - pUC19/ßarrHI; 6 - pUC19; реком5!кактн1 плазм!ди г!дрол!зован! BamHI: з фрагментами posMipoM 700 п.о. (2) 1 350 п.0.(3); 7- маркер ДНК фага Я /Styl

Мал. 6 Електрофорез в 1,0 Z агарозному гел! продуктiB г!дрол!зу рекомб!нантних ялазмхд (2-6) з клонованими Hindi II-фрагментами ДНК цханофага LPP-3 рестриктазою НаеШ 1 - маркер - ДНК фагаЯ/ Hindlll

ВИСНОВКИ

1. ДНК щанофага LPP-3 являе собою дволанцюгову молекулу ДНК розм1ром 42,5±1,5 т. п. о. , яка не мстить HiKiB та мае В1дкрит1 некомплементарш К1НЦ1.

2. ДНК щанобактерИ Р.Ьогуапит взноситься до слабко виралоэного АТ-типу ( 48 % ГЦ-пар) i, кр!м канотчних мютить дв1 модиф!кован1 основи: М-б-метиладешн - 4,5% i 5-метилди-тозин -1,2%. ДНК Щанофага LPP-3, на BiflMiHy Bifl ДНК Р.Ьогуапит, в вноситься до слабко вираженого ГЦ-типу ( 54 % ГЦ-пар) i, KpiM каношчних основ, мютить Т1льки 5-метил-ЦИТ03ИН В ЩЛЬКОСТ1 0,8 % .

3. Кл1тини щанобактерИ Р. Ьогуапит мають системи рест-рикцН-модифокацН dam- i dem- под!бного типу.

4. Захист геному щанофага LPP-3 В1д реетрикщх в клиинах Р. Ьогуапит-здИлскюеться двома шляхами: метилюванням CmC(A/T)GQ посл1довностей та контрселекщею за GG(C/G)CC i, можливо, GGATCC посл1довностями.

5. Вперше для щанофапв побудована ф1зична карта ДНК LPP-3, яка являе собою повну схему локшизацН 14 сайтхв рестрикЩх для 8 рестриктаз: Alw44I, Bspll9I, BsuRI, Ecol47I, EheI, Kpn2I, Ncol, Pvul.

6. Для отримання радюактивних мРНК-зондов з високою питомою активнютю вперше розроблений i використаний ефективний метод м1чення В1русспециф1чних мРНК in vitro за допомогою термшально! трансферази.

7. Методом блот-шбридизащ! з в1русними мРНК 1дентиф1-кована область ранних гешв ДНК Щанофага LPP-3 розм1р якох складае 10 т. п. о. Створена ix тонка карта i зд^йснено клонування фрагмент!в ранньо£ облает! ДБН LPP-3 в вектор pUC19. Передбачаеться, що рання область ДНК щанофага LPP-3 мютить ген, який кодуе сайтспециф!чну ендонуклеазу з сайтом вшзнавання СС(C/G)GG, яка на раннхх етапах хнекц1х викликае дег-радаЩю кл1тинно! ДНК.

Список po6ít, опубл!кованих за мвтер£алами дисертацП

1. Менджул М. И., Сырчин С. А., Аверкиев А. А., Бусахина И. Е Сравнение различных методов выделения цианофага LPP-3 и его ДНК // Микробиол. журн. - 1992. -54, N2. - С. 70-74.

2. Мендзкул М. И., Сырчин С. А., Ребентиш Б. А., Аверкиев А. А., Бусахина И. В. Резистентность ДНК цианофага LPP-3 к действию различных зндонуклеаз рестрикции // Микробиол. журн. -1993. -55, N4. -С. 47-53.

3. Менджул М. И., Сырчин С. А., Аверкиев А. А. , Ребентиш Б. А. Способы защиты ДНК цианофага LPP-3 от систем рестрикции-модификации циаяобакгерии Plectoneiria Ьогуапит. // Биополимеры и клетка - 1993.-9, N5.-С. 56-61.

4. Нестерова Н. Е , Каликиченко Т. С., Мельник А. И., Сырчин С. А. Деградация генома цианобактерий при репродукции циада-фагов AS-1L, S-8K, LPP-3 и А-1 // Микробиол. журн. -1991. - 53, N 3. - С. 43-49.

5. Нестерова Е Е ,Менджул М. И. .Калиниченко Т. С. .Сырчин С. А. Роль укороченного пути и блока синтеза de novo пуринов и пиримидинов в обеспечении трифоефатами синтеза ДНК цианофагов S-8K, LPP-3 и А-1 //Микробиол. журн. -1991. -53, N 4. - С. 73-80.

6. Сырчин С.А., Калиниченко Т.С. Мечение мРНК in vitro с помощью терминальной трансферазы /Матер1али I устан. (VI i I) з'1зду УМГ,0деоа,1993//М1кроб1ол. дурн. -1994. -56,N 5.-С. 65.

7. Сирчин С. О., Менджул М. I. Сайт-специф1чне меишовання ДНК ц!анофагу LPP-3 та ц!анобактерН Р. Ьогуапит. //Тез. VI Укр. 6íoxím. з' 1зду, Khíb: Видавництво УСГА, 1992.- ч. 3. -С. 47.

8. Mendzhul М. I., Syrchin S.A., MelnikA.A. , Rebentish В. А. Restriction/mod if i cation systems in Nostoc and Plectomm //Cyanonews. (Ed. Jeff Elhai)Miami Int. Uni. -1991. -7,N2. -P. 3.

9. Mendzhul M. I, Syrchin S.A., Kalinichenko T.S. Investigation of structure-functional characteristics of cyanophage LPP-3 DNA /In: Proc. of Inter. Conf. Fundamental and Applied Probiens in Phytovirology, Yalta,-1994. -P. 10.

АННОТАЦИЯ

Сырчин С. А. Структурный анализ ДНК цианофага LPP-3 и цианобактерии Plectonem èoryanutn

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.06 - вирусология, Институт микробиологии и вирусологии НАН Украины, Киев, 1996.

Защищается диссертация, по материалам которой опубликовано 9 научных работ. Бри использовании различных методических подходов получены новые данные, которые расширяют представления о механизмах взаимодействия цианофагов с клетками цианобактерий: изучены структурно-функциональные особенности их ДНК, установлена специфичность систем рестрикции-модификации Р. Ьогуашт и способы защиты от них ДНК LPP-3. Впервые построена физическая карта ДНК цианофага. Идентифицированы и клонированы фрагменты области ранних генов цианофага LPP-3.

BRIEF INFORMATION

Syrchin S.A. Structural analysis of DNA of cyanophage LPP-3 and cyanobacteria Plectonem boryanum.

Thesis for obtaining scientific degree of Candidate of biological sciences in speciality 03.00.06 - virology, Zabolotny Institute of microbiology and virology of National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev, 1996.

Thesis is defended on the basis of 9 scientific works published on its materials. Different methodical approaches were used to obtain new data which extend knowledge about the mechanisms of interaction of cyanophages with cyanobacterial cells: structural-functional peculiarities of their DNA have been studied. Specifity of P. boryanum restriction-modification systems and the ways of defence against its of LPP-3 DNA have been characterised. First physical map of cyanophages DNA has been constructed.

Ключов! слова: цханофаг, ц1анобактер1я, системи рестрикцН-модифхкацН, модиф1кац±я, контрселегаЦя, ф!зична карта, ранн! гени.