Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика умеренных цианофатов N-серий

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Характеристика умеренных цианофатов N-серий"

АКАДЕМИЯ НАУК-РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН . ИНСТИТУТ ШКРОШОЖЖИИ

На правах рукописи

АХМЕДОМ ДО10РАМ УСМАНОЕНА

ХАРАКТЕРИСТИКА УМЕРЕННЫХ ЩЩЖГОВ Л - СЕРИЙ

(03-00.07 - микробиология • 03.00.06 - вирусология)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени ■ кандидата биологических наук

Тншкент - 1992

Работа выполнена в лаборатории коллекции микроорганизмов и вирусологии Института микробиологии АН'РУз и в лаборатории генно-клеточноинженерной биотехнологии Института биоорганической химии им.А.С.Садыкова АН РУз.

Научный руководитель: доктор.биологических наук

• МУРДДОВ М.М.

Научный консультант: доктор биологических наук ШТОК Д.А'.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

МЕЦЩУЛ М.И".

доктор биологических наук, профессор АСКАРОМ С.А.

Ведущая организация - Институт микробиологии и вирусологии

АН Республики Казахстан

, о — г '"1

Защита состоится " /*•■■ " -¿{Иры с- 1992г. в"у

■часов на заседании специализированного совета Д 015.02.01

■ при Институте микробиология' АН РУз по адресу: 700128,' Таш- •

Кбнт-128,;ул.Абдуляа Кодирий, 76.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии АН РУЗ. :

Автореферат разослан " 3" 1992г.

Ученый секретарь спец.совета, "

кандидат биол.наук С.М.ХОДЕИБАЕВА

ОНШ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

. Актуальность проблема. Изучение цианофагов является важной в теоретическом и прикладном отношении до ряду причин. Во-первых, пианобактерпи занимают своеобразное положение в системе нивой природы: будучи истинными прокариотами, они в. то Ее зреет обладает1 фотосинтетическим аппаратом, характерным для . растений. Фот оас симилягшя одноуглеродного соединения (СС^) включает ряд уникальных физиологических и биохимических процессов, которые определяет1 биотехнологический потенциал шанобая-терий. Современная зароэдащаяся фотобиотехнология, основывающаяся на промыпленнскбиологическом производстве фототрофнкх микроорганизмов, призвана решть ряд важнейших проблем: продовольственную, энергетическую, охрану окружающей среды н другие.

В этой связи наметилась реальная перспектива использования цианобактерий как источника биомассы и наиболее детевых объектов для осугкэствления микробиологического синтеза, вклвчая и гзннуо инзенерип. С этой точки зрения особое значение могут иметь циа-нофаги цианобактерий как векторы и как регуляторы синтеза широкого спектра биологически активных веществ, в том числе компоненты ферментного комплекса нитрогеназн, восстгкавливащей молекулярный азот у азотфкксируащях цианобактеркь.

В связи со слабой изученность^ лизогенной конверсии у цианобактерий (и. ген ома цианофагов исследования з данном направлении представляются актуальными. '

Рель а.задачи исследований. Цельв настоящей работы было сравнительное изучение свойств умеренных цианофагов и особенности их взаимодействия с клетками хозяев. Для достижения доставленной цели необходимо было:

1) выделить из различных водоемов цнаяо^гз нитчатых цианобактерий и изучить их распространенность з природе;

2) исследовать основные биологические, серологические свойства цианофагов, чувствительность вирпонов п их резистентность к некоторым физико-химическим факторам;

3) изучить некоторые механизмы получения устойчивых

" г " вариантов цианобактеркй воздействием цианофагов к - сер;::";;

4) исследовать геном умеренных цианофагов с помощь© фер- • ментов эндонуклеаз рестриктазы;

5) выяснить участие генома умеренных цианофагов в виде профага в процессе азотфиксации в клетке азотфиксирую-пдах цианобактерий (лизогепная конверсия азотфиксации).

Натчная новизна. Основиым вкладом в цианофагию представляется обнаружение четырех новшс видов цианофагов ( и - ЗТ, Н - 4Т, К - 6Т, N - 7Т), лпзогенизирующие представителей нитчатих цианобактерий рода Коз1:ос ,отличающихся от известных цианофагов со ряду свойств и имеющих широкое распространение в природе.

К числу научных фактов, имеющих.общебиологическую значимость, относятся обнаружение неизвестных ранее мелких сферических цианофагов с аналогом отростка и очень маленьким геномом.

Установлена локализация активны* - генов в последовательностях ДНК цианофагов N -серий.

Существенное значение в области вданофагии является определение морфологии и размера вирионов, установление типа нуклеиновых кислот, содержание П1-пар и их-молекулярная масса, опреде-. лена локализация генов в последовательностях.генома цианофагов, изучены чувствительность и резистентность вирионов к некоторым физико-химическим факторам, определены специфичность и параметры логического цикла цианофагов. . .'

Получены устойчивые культуры рода Коз-Ьос воздействием умеренных цианофагов и выяснен механизм устойчивости.

Совокупность данных обоснований мозно классифицировать кав левее перспективное направление в области вирусоэ'мЕкр-оорганиэ-моз в целом и цианофагла в частности. Эти солозе'яия а выносятся на сфвддальную заздту.

Практическая ценность. Полученные данные могут быть' поло-гена в основу тахсоноша цианофагов - обшрноЗ группы новых вирусов шкрооргаяазаэв. . '

Умеренные щанофаги разнообразные по своим биологическим I физико-химическим свойствам рекомендуется как модели для мо-1екулярно-биологических исследований.

Наряду с этим использование и*Г -содержащих ДЕХ геномных пиеренных цианофагов для получения азотфиксирукщих вариантов щанобактерий.

Выделенные умеренные цианофаги и их ДНК переданы в Инсти-:ут биоорганической химии им. А.С. Садакова АН РУз для картиро-1ания генома и возможности использования их как векторов в ген-[о-ияяенерных исследованиях.

Дппобация работы. Материалы диссертации докладывались на [ Всесоюзной конференции "Вирусы микроорганизмов и растений" Ташкент, 1985); Всесоюзной конференции "Молекулярные и генетические механизмы взаимбдействия микроорганизмов' с растеняя?.з" Пущино, 1959), а также на научных сейш арах Института микробио-югии АН РУз (Ташкент, 1988, 1989 и др.).

Публикация результатов исследования. Основные положения ■иссертационной работы опубликованы в 5 печатных работах.

Структура п объем работы. Диссертационная работа состоит :з введения, обзора литературы (I глава), экспериментальной :асти (3 главы), заключения, выводов и списка литературы, бялэ-:шощего 117 наименований, из которых 58 на иностранном языке.

Работа изложена на 134 страницах машинописного текста, ллюстрирована 22 таблицами, 25 рисунками и фотографиями.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава I. Некоторые характеристики цианофагов

3 литературном обзоре излагаются данные о выделении, расп-остранешюсти цианофагов, биологические и физико-химические войства цианофагов, образовании устойчизых форл шшнобактерий . определенным цаанофагам и его некоторый механизм.

Глава 2. Материалы и методы .исследований

Б работе использовали чистые линии цианофагов .к -ЗТ, п - 4Т, н -6Т, N - 7Т, выделенные из различных водоемов республики Узбекистана.

В качестве основных тестовых культур использовали цкано-бактерии Hostoc muscc.rum — В 29, Nostoc punctiforme (Kuetz) Hariot Je 33, Nostoc sp. JJ 38, полученные ИЗ КОЛ-лекцил Биологического института JНУ, и Nostoo linckia В 18, полученные из коллекции Института ботаники АН РУз.

Цианобактерии выращивали в стерильных условиях на средах Фитцдаеральда ( Zenhder, Gorham , I960) или "С" (Сагг, Witton, IS73) с автоматическим обогащением воздуха, углекислотой (5-7fa) при температуре 25-27°С и освещенности 800-1200 лк.

Для обнаружения цианофагов применяли метод обогащения проб несколькими видами цианобактерий с предварительной их проверкой на отсутствие перекрестного заражения.

Для титрования, описания морфологии негативных колоний, получения клонированных линий, установления .параметров литичес-кого цикла цианофагов с клеткой хозяина, постановки реакции нейтрализации их ик&екционности гомо- к гетерологичкыми сыворотками применяли общепринятые методики (Адаме, 1951; Габрилович, 1963)Антивирусные сивороткп готовили двумя циклами иммунизации кроликов с применением адъюванта Фрейнда в качестве биостюфяа-тора.

Цвакофаги концентрировали по Тихоненко (19о6)ь Меидйулу и др. (1972) на полизтиленгликолэ (ЮГ) с мол. массой 15, 20, . -40 эдальтон или по Toaonoto el.all (1970) на ПЭГе с мол. массой 6 кдальтон п очищали равновесны:.! градиентом CcCL иди дважды линейным градиентом сахарозы. ДНК из даакофагов вцделяла до-тергонт-йонольным методом Миллера (1975) с некоторый; модификациями. ДНК из клеток культуры - по Karuur (I9GI), Степень очистки контролировали но оптическим седкмектациояным свойствам препаратов. Препараты ДКХ для электронной микроскопии готовили согласно Klainschnidt and Zahn (1959). Контрастировали сплавом платины с палладием (3:1).

Равновесное центрифугирование нативных препаратов ДНК в градиенте CsCL проводили согласно Менделю с соавт. (1970). Плавучую плотность определяла по отношению к репервой ДНК фагаЛ Молекулярную массу ДНК даанофагов расчитывали по уравнению Eigner а. Doty (1965),

Для рестрикционного анализа ДНК даанофагов в основном использовали ферменты Всо н v и Hind Ш ■ - производство Виль-■ нюсского ШО "Фермент". Расщепление ДНК осуществляли'согласнь рекомендации изготовителя. Электрофорез циаяофаговых ДНК проводили в 1% агарозном геле в триеб.оратном буфере, pH 8,3 (Маниа-тио л др., 1984; Дэвис и др., 1984). Гели скрашивали раствором этидия бромистого и фотографировали в УФгСвете (254 нм) на пленку "Микрат- 300". Размеры фрагментов ДНК определяли относительно маркеров ДНК фага Л обработанной эвдонуклеазой Hind щ (Минтер и Сили, 1987).

Для определения наличия ДНК цианофага последовательностей, гомологичных структурным генам нитрогеназного комплекса к. pneumoniae в качестве зовдэ использовали ДНК плазмидн р8 А 30, сконструированной на основе векторной плазмиды рАСУС 184 и Есов I фрагмента (5,2 т.п.н.) хромосомной ДНК К. pneumoniae, вклотащего гены nif Н , nif Д, nif К, которые получены из Института молекулярной- биологии и генетики АН Украины.

• Суммарные ДЩ гибридизировали на фильтре Hybond ■ ■ , мече-ние препаратов ДНК проводила-по методу Ригби с соавтХ1984)с использованием в качестве предшественника нуклеотидов ( -dctp (Ташкент).

Для электронно-микроскопического исследования структуры вирионов использовали"дырчатые коллоидные пленки. Препараты контрастировали 1,5-2,0^ раствором уранилацетата и просматривали в микроскопа JEM -7 при ускоряющем напряжении 80 кв.

Для изучения интенсивности азотфиксации у цианобактерий использовала ацетиленовый метод (Schollhorn, Buiris , I96S).

Глава 3. Характеристики цианофагов н -серий

Из различных проб воды, собранных в Ташкентской области. .Республика Узбекистан, выделены умеренные цианофаги н - ЗТ, Я'-4Т,н -6Т, к -7Т,"лизируище нитчатые цианобактерии рода Яог'Ьос.

Сдеп-гЕичность тшансхнагов. При изучении спектра литического действия умеренных цианофагов испытано 51 культура, относящаяся к 13 родам 20 ввдам нитчатых, гетероцистных и одноклеточных циа-нобактерий. В отношении этих культур цианофаги тлели различный диапазон литического действия.

Цпанофаг я - ЗТ, оказался полифагом, обладающим широким спектром литического действия. Ш 51 испытанной культуры к циа-нсфагу чувствительными оказалось 7 культур и.ипсМа $ 18, Я. иизсогищ $ 25, 29, 32, N. рипе-иГогпе $ 33, Яоз1:ос ер. № 38,39. "

Цианофаг и - 4Т и и - 7Т строго специфичны, н -4Т лизиру-ет и лизогенизирует вегетативные клетки только одного штамма Я. рипо«Гогпе й 33, тогда как Я - 7Т активен против куль туры ЯозСос Ипс.Ма й 18.

Другие представители цианобактерий, в том числе 5 видов из рода ЯозЪос и 7 штаммов вида Я. тизсогиа использованные в качестзе тест-культуры,.не лизировались и не' лизогекизирова-лись цианофагом. .

Диапазон литического действия цаанофага В - 6Т распрост раняется на две культуры:Иоз'Ьос ср. Ге 33 н.Яов'Ьос зр» . Л 39. . /'"■

На основании проведенных исследований можно говорить о строгой видовой специфичности выделенных цианофагов.

МорФология негативных''колоний. Умеренные цианофаги к -ЗТ, н - 61, я -7Т, лизирующае нитчатые вданобактерии рода Нов^с ■ образует мутные негативные колонии со вторичным ростом округло! формы, с ровными краями, что является первыми признаками, показывающими об умеренности цианофагов. Однако они отличаются ср-> кои появления негативных колоний, размерами, форма:.ш а времена:

а

прекращения формирования.

Установлены характерные отличия в динамика развития негативных колоний, Формирование негативных колоний н - 6Т останавливается уае на 10 день посева при первых признаках старения культур цианобактерий (табл. I). Цианофаг н - ЗТ формирует негативные колонии на 15 день выращивания до 35 ш в диаметре. Ш рост прекращается лишь при окончательном пожелтении газона циадобгктерий и практически полном высыхании верхнего слоя' агара, когда диффузия в нем вирионов затруднена. Такое увеличение негативных колоний характерно только отдельным цианофагагА в отличие от бактерио- и актинофагоа.• .'....

Серологическая хаоактеристака. Для установления' степени серологического родства между' умеренными цианофагаш и- ЗТ, и -4Т, я - 6Т,: и ~7Т использовала высокочувствительный метод перекрестной нейтрализации гомо- а гетерологичннми сыворотками.

Показано, что даанофаг и - 4Т не реагирует-с сывороткой, специфичной к цианофагу н - ЗТ. Константа скорости инактивации пианофага гомологичной сывороткой 580 мин~*. В своэ очередь ща-нофаг ' я - ТЕ на реагирует с сыворотками■ специфичными цианофагу Я - ЗТ, Г- 41, Я -6Т. Константа скорости инактиванда шаиофага Я - 7Т гомологичной сывороткой составляет 480 мин я - 6Т

соответственно - 300 мин""^. .....

- Исхода из этого. молно заключить, что цианофаги сералога-ческа не родственны медду собой, поскольку гетерологичныыя скво-ротками не инактивируются. ' - . ........

Распространенность шаноФагов в 1ТОиоод,е. Для изучения распространенности умеренных цианофагов было проанализировано более 500 образцов водн» собранных из различных водоемов Ташкентской «власти РУз. Нужно отметить, что щаанофаги обнаруживаются практически во всех обследованных образцах, так еоли 11 - 4Т обнарузотается в 22% образцах воды, то цаанофаг Я - 71 обнаруживается в 40? пробах воды, что свидетельствует о широкой распространенности цаано-фагоа в природа.

Содерзание'цианофагов Я-сараи по сезонам года э весенне-летнее время обнаруживается а большом ксшгшства. Ссвньв их зала-чэство резко падаат.

Некоторые характеристики цианофагов н -оорий

Таблица I

Цианофаги:Время про:Диаметр не:Диаметр :явления ггативных :голов-:негативных колоний :кп. в нм ¡колоний :на 10-й : : (чао) :день поое-: . : :ва (мм)

Дшша от-:__Декаметры литичеокого цикла _ ^

роотка в :Констаита :Латентны!:Полный лй;Средни! нм :скорости ад:период :тический :выход ви-••оорбции (чао) :цикл (чао)рконов на х 10 : : :клетку . .

н -зт 18-20 • 20-26 28,6 - 8,8 12 29 400-450

к - 4Т 35-40 20-22 62- 2 180 4,4 II 14 200

к - 6Т 20-24 16-18 25,6 - 7.6 16 24 300

N - 7Т 21-26 20-25 40-2 14,5-1,5 6,4 19 30 250

»

ш »

До полученным данным по экологии щанофагоз, следует отметить, что чувствительные к циан оратаи виды цианобактерий никогда не представлены в водоемах в доминирующем количестве. Это объясняется тем, что мезду цианофагами и цианобактериями устанавливается экологическое равновесие.в природе.

Получение лизогекннх устойчивых к шаноФагам я -серий " г " вариантов.цганобзктетай. При вврапщвагии чувствительных культур цианобактерий Коб-Ьос шизсогиш & 29, Nostoc рипе^£огие . • # 33, Яов^ос вр. Л 38 иИое-Ьос linclri.fi й 18 со' специфическими цианофагами наблюдается лизис цианобактерий, просветлением культуральной жидкости. Однако, лизис происходит основной массой клеток цианобактерий, единичные клетки сохраняются и при-рассевах дат- начало устойчивым к вданофагам клонн.

При посеве инфицированных цианофагом культур цианобактерий на твердых средах в чашках Петри на 11-12 день после посева в зоне лизиса появляются вторичные клоны» Из этих клонов путем рассевов и отбора получены мутанты культуры цианобактерий, устойчивые к гиазафагам я - серий (табл. 2).

•• Таблица 2 .....

Получение лизогенизированных фагоустойчивых " т " форм цианобактерий .воздействием умеренных цианофагов я - серий

Культуры цианобактерий

Каким циано:Кся-во виде- :Кол-во лизо-фагом воз- :ленных клонов:генизирован-. действовали:из вторичного:ных фагоуо-: роста - :тойчивых кло-: : нов

Яоа^с шивсогии £1 29 Я - ЗТ 50

Яов'Ьое рип<^1:Согае Я 35 Я - 4Т 40

ЯовЪос вр. Я 38 Я - 6Т • 50

Яоз-Ьос Нпск1а 3 -18 Я - 7Т 45

4 3

Примечание: контролем служат испытанные на ллзогвнность 40 клонов., выделанные после рассевов культуры цианобактершз без воздействия цианофагов. В зтад опыте не удалось получить 'лизогенные варианты цианобактерий.

п -

Результаты испытания на лизогекшо всех устойчивых циано-фагам клонов показали, что при их культивировании в обычных условиях при. 29°С на в одном случае не обнаруживается появление свободного вириона цианофага в культураяьной жидкости, лн-зирущей исходные чувствительные культуры цианобактерий. Циано-фаг не обнаружен при выращивания культур разного возраста. Однако, установлено, что при культивировании фагоустойчивых му-' тантов, после воздействия высокой температуры (41-42°С) в те-' чение часа, у определенных клонов (3-5 клонов из 40-50 испытан-' ных на лизогению) появляются вирионя цианофагов в культуральной яидкоста лизирующей исходные чувствительные культуры цианобактерий соответственно. •

Это дает основание заключить, что при воздействии цианофагов н - серии, на чувствительные культуры большая часть'клеток в популяции лизируется, а другая незначительная часть,(7,5-11,1$) лизогенизируется, становится лизогенной и устойчивой к гианофа-гам Я-серий.

. Способность ваделенаых цианофагов лизогенизировать определенную часть клеток хозяина еще раз доказывает их умеренность.

Глава 4. Рестринэд.оннкй анализ ДНК цианофагов

Выделенные умеренные цианофага н - серий, кроме: фенотиси-ческих характеристик, включающих морфологические, физиологические, серологические и биохимические, идентифицированы такаеи рестрикционным анализом их ДНК. ,

Рестриктазы - специфические эндонуклеаз'ы, разрезающие ио-лекулы ДНК цианофагов строго определенных последовательностей нухдеотидоз для которых известны сайты рестрикции; При расщеплении молекулы ДНК рестриктазами на фрагменты, число и размер характерен для кавдой ДНК (генома) (Матвиенко Н.И., 1979). -

К ферыентам Pst Г,- Sna I, Е со В I, Е со® У, Sind щ, Bas X оказались чувствительными ДНК опытных цианофагов. Она гидролизовали молекулы ДНК цианофагов на различные фрагменты. Использованные в опытах ферменты М spl, В зРГ, flal I не действовали на ДНК цианофагов. Четкая картина фрагментации ДНК наб-

лэдается при использовании Е со H У и H ind И. Так как фермент H ind щ является мелко расщепляющей рестриктазой и,фракционировании фрагментов было очень сложно учитывать я использовать для сравнительного анализа. Поэт о:,ту чаще в -своих опытах использовали фермент Е со НУ а его взошизомер Е со H 32. Размеры образующихся фрагментов зависят от. типа использованного фермента. Фермент Eco кI гидролизует молекулу ДНК цианофага N - 4Т только на два крупных фрагмента. Молекулярные массы разделившихся фрагментов определяли с использованием мзркерных фрагментов известной молекулярной гласеы, а именно фрагмента ДНК фага А , расщепленного H ind Ш. *

Картина распределения сайтов рестрикции по молекуле ДНК у каждого цианофага индивидуальна, она может слукить для идентификации цианофага (табл.3).

Электрофоретическая подвижность фрагментов линейно зани-сат от логариф1ла их молекулярной массы. То есть, измеряя расстояния, яа которые перемещались фрагменты от старта и при сложении размеров полученных фрагментов определяли их молекулярную массу (табл. 4). „ '

На основании проведенных исследований mosho заключить, что сравнительный рестрикционный анализ мояет быть использован для характеристика и.идентификации геномов цаанофагоз.,Зги характеристики, явились основой для дальнейших работ по молекулярной биологии цаанофагов. ........

тей гомологичных структурным генам нптрогеназы ( Н.Д.К) -

При заражении умеренными цпаяофагама.^ -серий чувствительных я ним культур пианобактерий родаНовЪос. большая часть клеток в популяциях цианобактерий лизируется, другая незначительная часть клеток лизогенизируется, становится устойчивой к опытным хканофагам. Лизогенизпрованнне варианты культуры рода Hostoc хорошо растут в безазотистой среде "С" и образуют темно-зеленый пигмент» тогда как культуры, потерявшие профаги (нелпзогеннке) растут только в азотсодержащей среда "С" и образуют светло-зеленый пигмент.

Таблица 3

Число сайтов рестрикции при действии специфических эедонуклеаз на ДНК цианофагов н -серий

Нргаленование:______ЗийЛй йа^та.в_пр;л_де.йатвии федм&нтоа___________

■цианофагов : : : : :

. Ваш И1 : В.ч?1 «Н1п<1Щ МеР! гЕсоМ.'ЕооИУ :Рв« :РаиЗЛ1:Зтп1 :3а11

К - ЗТ 0 0 10 2 3 6 0 3 0 0 1

н - 4Т О 0 21 0 8 II 3 4 2 0 ы СО

Н - 6Т 0 24 0 0 8 2 - 0 0 1

н - 7Г 4 — И 0 II 7 3 — 2. 0

Примечание: Цифры обозначают количество сайтов, имеющихся в ДЕК цианофагов, О - сайтов не имеет, - "не иоследоввни.

Таблица 4

Молекулярные массы фрагментов одинарного гидролиза ДНК цианофагоз рестриктазой Есон У

Порядковый

номер Фрагмента

_______Щз_а_к_о_й_а_г_и_______

N -зт : н - 4Т : N -бт : и -тт

I 7,51 12,7 9,7 - 17,0

2 •4,75 7,5 4,5 ■ 7,7

3 1,79 3;6 2,6 3,9

4 1,24 2,7 2,2 3,0

5 0,92 1,5 2,0 2,3

' 6 0,62 1,4 1,9 1.7

7 1.2 1.7 1,6

8 1,0 1.5

9 0,9

10 0,8 -

II 0,7

г =16,83 т.я. 0.2 =34,0 т.п.0.2. =26,2т.; 1.0. Г =37,

Это натолкнуло пас на ¡.щель о возмоаностп участия генома цианофага в виде профага в клетко 5оз<;ое з процессе азотфлк-оацаи, те есть образование в лязегенизнровашшх клетках ферментного комплекса нитрогеназы.

Сравнительное изучение азотфиксирующей способности продуцирования (ацетпленредуктазн) лязогенной культуры рода ноз^е и ее вариантам, потерявшими лрофаги показали, что эариантн культуры потерявале профагя но обладали способностью продуцировать ферментного комплекса нитрогеназы, тогда как лпзогенизиро-вакные варианты культур рода Ко^ос обладают способностью восстанавливать анетклен до этилена, то есть продуцируют фермент нитрогеназы.

Для обнаружения Nif - генов в последовательностях ДНК цкакофагов и лазогенизированных этими цианофагаш клеток, вдано-бактерий использовали метод дот-гибридизации с меченным (^Р) зондом.

В качестве зонда использовали ДНК плазмидн pS А 30, сконструированной на основе векторной'плазмиды рАСУС 184 и ЕсоН I фрагмента (6,2 т.п.о.) хромосомной ДНК К. pneumoniae , включающего гены Nif н, Nif Д, Nif к.

Меченную (32Р) ДНК зонда гибрадизовали с суммарными ДКК шанофагов Я -серий, с ДНК культуры Nostoo 3 0 ДКК ее " г " клона. Результаты точечной дот-гибридизации показали, что ДНК, выделенные из вирионов цианофага и ДНК из " г " клона гибридазировалзсь с ДНК зондом, тогда как ДНК, выделенная из исходной культуры (не содержащей в клетке профаг) не проявила гомологии с меченной ДНК - зондом.

На основании этого можно сделать вывод, что в геномах исследованных умеренных лпзогеназируззщих цианофагов N -серий присутствуют последовательности, гомологичные по крайней мере I из 3 структурных генов янтрогеназы.

ВЫВОДЫ

1. Зыдедены и впервые охарактеризованы четыре умеренных цианофага н - ЗТ, я - 4?, ц -6Т, ц-7Т, отличающиеся рядом таксономических признаков. По строению вирионов выделенные цканофаги подразделяется на:

а) цианофага с аналогом отростка и - 31, я -6Т;

б) цианофаги q длинным отростком к - 4Т;

в) цваяофаг с коротким отростком К - 7Г;

2. Цианофага отличазтся по всем параметрам литического цикла - константе скорости адсорбции, латентному периоду, св*-риоду лизиса и выходу вирионов на клетку.

3. Молекула ДНК цианофага Я -зт линейна, имеет открытые концы, средняя контурная длина их составляет 8,5^-0,17 мкм. Средняя величина молекулярной массы ДНК цпанофагов Я - ЗТ,

N - 4Т, 'Я - 6Т, S -7Т равна 16,8; 34,0; 26,2 и 37,2 т.п.о. оответствекнои -

4. Сравнительны:! рестрикционныи анализ ДНК исследованных лановагоз показал, что они отличаются как по электрофоретичес-ой подвиглости фрагментов в агарозном геле, так и по холичест-у самих фрагментов, что является, убедительным доводом в пользу .вдовой специфичности этих цяанофагов.

5. Методом дот-гибридизации с использованием в качестве онда ДЩ плазмяды р S А 30, сконструированной на основе векторла шшзкиды рАСУС 184 и Есо я I фрагмента (5,2 т.п.о.) хромо-омной ДНК К. pneumoniae , включающего гены nif ' Н,Д Д, 'бнарухенн опоеделенные nif гены в последовательностях ДНК лаяофагов N -серий и лизогенизированных'этики ппаноФагаыл летках цианобактерлй, что подтверждает лизогеннуя конверсию зотфиксации у этой культуры. '

По теме диссертагпи опубликованы следутсша "работы с соавторами

. Каталог культур' микроорганизмов, поддерживаемых а учреждениях УзССР, Ташкент, "Фан". - 1986. - С.68-70. !. Распространение и сезонная периодичность цианофагоз в водоемах Узбекской ССР к некоторым культурам цианобактерий // Сб.ст.-.Бактерии, водоросли, грибы (Экология, физиология, биохимия). -Талкент, "Фая", ГЭ87. - С.49-59. I. Цианофага нитчатых и гетероцистных циаяобактерий, выделенных в Узбекистана.// Сб.ст.: Биология, биотехнология микроорганизмов. - Таикенг "Зан". - IS89. - С.3-13. t. Вцделокие и некоторая характеристика нового умеренного цианофага 'f -31, лизирущего культуру рода nostoc /Дзб.бзол. зурн. ,IS89. - J3. - C.9-II.. 5. Особенности нового умеренного гванофата л -4Т специфичного

ДЛЯ цианобактерий Hoatoe punctiforas (Suets) Hariot. -!s33// ■ Узб.бпол.^урн. -'1992 - .'S I. - С.12-15.