Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Цианофаги и плазмиды нитчатой цианобактерии Nostoc Linckia и одноклеточной - Synechococcus elongatus

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Цианофаги и плазмиды нитчатой цианобактерии Nostoc Linckia и одноклеточной - Synechococcus elongatus"

о од

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

На правах рукописи

ТУЙЧИЕВ Искандар Умаралиевич

УДК 578.561, 811.817

ЦИАНОФАГИ И ПЛАЗМИДЫ НИТЧАТОЙ ЦИАНОБАКТЕРИИ N08100 1Л1ЧСК1А И ОДНОКЛЕТОЧНОЙ — 8У^СНОСОССи8 ЕШ^АТ^

Специальность: 03.00.07 — микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ташкент — 1994

Работа выполнена в лаборатории вирусологии Института микробиологии Академии наук Республики Узбекистан

Научный руководитель: Доктор биологических наук

Официальные оппоненты: академик АН РУз, доктор

Ведущая организация: Институт генетики АН РУз

Защита диссертации состоится « <26 .» _199^_г.

в « » часов на заседании Специализированного совета

Д. 015.02.21 по присуждению ученой степени доктора наук при Институте микробиологии Академии наук Республики Узбекистан по адресу: 700128, г. Ташкент 128, ул. А. Коди-рий, 7-Б. фале: (ЗГ/Л.) 4/?/£9

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии Академии наук Республики Узбекистан.

Автореферат разослан «. Ж- » а-<7/? р г л л 199_^1г.

Ученый секретарь Специализированного совета доктор биологических наук,

М. Мурадов

биологических наук М. И. Мавлани

кандидат биологических наук Т. Ю. Юсупов

профессор

Ж. С. САФИЯЗОВ

ОБЩАЯ Ш>ЛКТЕГИСТИКЛ РАБОТ»

АктуаiHtocTb томи. В последнее время удаляется большое внимание изучению ципнофагов и плазмид у раоннх видов цианобакторий (LauR.JI., Паглии 3.И., t?80; Frlcilbcrg D.t et.al., 1979; Saiienran R.S., et.nl., 19G3; Adolf K.W.. Ilasclkorn R., 1971, 1972,1973; Громов B.D., 1976; Козьяков C.A.. 1977; Худьякоп И.А. ,1901; М.зиджул М.И. и лр., I9S5; Мурадов М. и др. ,1991 ). Установлено, что ЩИ цианофагов се-pint HP-IT п клетках ципнобактприи Not;toi: ир. Й39 п сидо профога участвует в кодировании ^орметпого комплекса нитрогонозы, ответе 1'лрнгого за .зг-тг^пкеапию этой культурой (Мурадов М.и др.,T9ÎKI).

С открытием ципнофагов появилась возможность исследовать СЛОКННЙ МОЛекуЛЯрНО-бИОЛОГИЧеСКИе МОЛПННЛМЫ взаимодействия вируса и клетки n системе шпнофаг- цианабактерия, которая в ряде случаев мм»вт нокотсро" трепмукеотго перед традиционной в молекулярной биологии экспериментальной моделью фаг-бпктерия. Основное достоинство дппней системы в том, что, благодаря низкой скорости генерац:гл цнанобактерий и сравнительно большой продолжительности всех этапов репродукции цианофпгов, создается условия, яесЗхолпш" для более точного и детального изучения различных аспектов вирусиндущгрованных процессов и вирусного'морфогенеза.

Креме того, цианобактершт входят в уникальную группу прокариот, способных к оксигеннпмг фотосинтезу по Ttmy вис-тих растений, что делает систему цианофаг-цнанобактерия весьма перспективной и удобной моделью вирусной инфекции в Фотссиптесирустглх организмах. Изучение цианофагов и плазмид во многих откспенпях представляет исключительный научный интерес для общей вирусологии к микробиологии в целом, в особенности для понимания путай эволюции вирусов и успешной разработки генетического анализа цишюбактерий»

Особое значение имеют цианофаги и плазмиды с точки зрения их практического применения, поскольку ДНК цианофагов и плазмид или их фрагменты могут бить с успехс.м использованы при клонировании генов в генно-интенериой биотехнологии, что открывает широкие возможности конструирования штаммов пиано-бактерий, способных образовывать сямые различные продукты.

Гнюхромосомшо гепотачоекно элг.моиты-фш'Н и шмамидо .орошо изучены на модельном обтекто молекулярной биологии -у Е. coll, а также бактерий других видов , и родов. У фотосинтезнругщих бактерий, в особенности цианобактерий, изучений этого вопроса находится в начальном этапе.

В сьязи с малоизученностьм циакофагов, илазмидного состава цианобакторий и наличием ограниченных сведений об особенностях их ДНК, исследования в указанных ' направлениях представляются актуальными с точки зрения их использования в гопш-гашэнерних манипуляциях при создании удобных для клонирования элементов.

Цель и задачи. Учитывая сказанное тшшо, целью настоящей работы яЬилось ъыдпланиа и сравнительное иаучония свойств цианофагов и плаьмидного состава цианобактерий родов Noatoc и Synechococcuo, а также некоторих аспектов взаимодействия их с клетками хозяев.

Для достижения указанных цгэлей поставлены следующие задачи:

1. Выделить и идентифицировать циа.чофзги, лизируидие культуры цианобактерий из- родов Ifoatoc и Synechococcuo изучить их распространении. и свзош1ую периодичность;

2. Изучить влияние1 условий выращипаши на развитие цианофа . гов и цианобакторий;

3. Определить влияние некоторых физико-химических. факторов на исследуемые цнанофаги;

4. Изучить структурные особенности ДНК цианофагов и плазмид цианобактерий.

Научная новизна. Выделены и идентифицировав два -новых цианофага И 5Т и S-9T, лизирующие цианобвктзрии из • родов соответственно Ifoatoc liriicla --.№59 и Synechococcys elonga-tus - й5й. Показано их широкое paсиространенио в водоемах Республики Узбекистан. Отмечена сезонность в величине титра цианофагов.

К чис-jiy имеющих общебиологическую значимость фактов относятся обнаружение неизвестных ранее крупных цианофэгов с длинащдо отростками, а также плазмид цианобактерий.

Определение* морфологии и размера вирионов, установление типа нуклеиновых кислот, содержания суммы ГЦ-rtap в ДНК и их

молпкулярчсП мпссу, тучшшп чувствительности и резистентности тарпонов к иекоторт фпскко-хи'-'ичоским фпкторлм, определенно параметров литичоского никла mmijo'foron кмоот существенна гчгачошьэ для их идоти^ясэшпи Изучотшэ циопофпги и штзмюш цпанобакторий помогут выявить естествстше пути передачи гаюв у этих групп фототрофшх

ПрОКПСИОТ.

Прчт'чтипессэп ценность. Получ^инца дптпто могуть Ршъ ПОЛОГО!!!! в основу таксономии шшп^чгов - ссяирпой группн новых вирусов.

Впцолешше циацофзги я пля-мпдн, отгачляздссп по с vorn (5яодогич?ским• и фпзнко-лмпесгим стюйстппм. роксмендувтся использовать в качестве модоли для чолвкуллрно-Сио.пэги'ткйх пссло ловзштй• Ц'.кчп-флгомю и плэзшдныо ДНК цппноСактериЯ »«ото использовать при кояструкрог.зт'.и тктерпой спетое» для клонирования генов t'îpt-minnjro комплекса mnporeiwH, а такта ряда биологически активных веществ. Изучечшнп «тюПкторш! могуть Сыть попользованы как экологически чистив бксудоброния.

АпрсСацшт ряЗотн. Мятерияли диссертации долоетны на 17 Республккпнской нпучда-теоротпчесчой кон>зрэнц:ш молодях учестх и специалистов - &чпфобкологрв • (Тгашепт, IS89), V кон^гешуш cucixnriiatoB Республик Центральной 'Азии (Ташкент, IP9I ), 17 Псоротюй конференции "Микрсоргоштз'.к в сольском хозяйстве " (Пусошэ, 1992), II К.сн1«ре!зд»и биохгг.-ииов Узбекистана (Тгл'кепт, IP93).

Публикации. П" материалам лиссертощш снублрковзно 5 печатник работ.

Структура h сбьем диссертации. Диссертация состоят та вгеления, обзора литературы, экспериментальной части, результатов я пх обсуждения, заключения, глводов,- списка ислользопалчоП -литературн, рклг'пакжего i утяанменоп-шшй, из KoTopTjx 77 - m рч^сгргшгах лгунах. Работа изложена на j 2" страницах MWürorotnioro текста, иллюстрирована 12 таблппскл, 2G рисункам:; и Фотографиями.

Краткое содержаний работы Глава I. Циыюфпги шпчатих и одноклеточшз ¡ринсозг.терий

В о&юро ' литературы налагаются дшашо из выдолошш,

(йсщюотршюшш цнлнофагоб, о йцакогк'шских i! фузико- хш4и-

•иишх сьоастьях цианодогоь, 1фашд0»ш «лазмюшнй состав р^злпчния. видов цишюоактс.рий, евздения о молекулярной массе ДНК, а также об их различных биологических Функциях.

Гласа 2. Материалы .и истода исследований

В работе использовали чистив линии цианофагов N - М и Б - 9Т, виделотше из различных водаомов Роппуолики Узбьнис-тан. В качества ооноешх тостовик культур использовали циа-коОактерии НозЮс ПпоМа . Зупеспососсиз е1оп^йШз -£68, получошшо ИЗ к0лл0к1цш ЛЗООрЭТОрИИ вирусологии Института микробиологии АН-ГУз.

ЦишюОпктории пирашиьыш в сторидишх условиях на среде "С" (СаггК.А., ИМиоп Б.А., 1973) с автоматическим обогащением воздухом и углекислотой (5-7*) при 25-27 °с >и осбоцбиностн 600.-1200 лк. '

Для обнаружения цианофпгов , в пробах води, взятых из различных водоемов Республики УзЗокистан, их фильтраты добавляли к активно растущим культурам цианобактврнЯ. По просветлению культуры, а в дальнейшем по образованию на газонных культурах негативных колоний судили о наличии цианофзга б той или шюЯ~ культуре, цианобактерии.

Для титрования, получения лпьатр- , описания морфологии колоний, селекции чистых линий пианофэдчэв, определения литичеекого действия, научения влияния некоторых фиаико -химических факторов на шфекционность цианофагов применяли общепринятые метода (Адаме Т., 1'96Х; ГольдфарО Д.И., 1961; Габрилович С.Т., 1968; Миллер А.К., 1975). рН - стабильность циаиофагов определяли по КаШ К. и СЬагегоЗео н. (ЮТ).

Циапофрги концентрировали па А.С.'Пцоненко (1968) и М.К. Мевдкулу и др.(1972) полиэтиленгликолеад (ПЗГ) с мол. массой 15, 20, 40 кд или по УатаюПо К.Н. ей а1.(19Т0) на ПЭГ с мол. массой 6 гсД и очищали равновесный градиентом ОзП1 шш

дпаяцк ликойкым грздаштш сахчрозч. . ДШ из ттано^агоп ПЫДОЛЯЛП ДОТОрга1Т-феИОЛЪНЫМ МЕТОДОМ (Маниотие Т., I9P4) с некоторыми модиТикацнями. Хромосомная и плаачпдная ДИК из клеток культур»! цианобактерии вадплялч по Marrar -I. (1961 ). Степень очистеи контролпровшго по оптическим спсЯствяч прспарптоп. Препараты ДНК для олоктрсшюй микрсстттгк готовили согласно Kleinschnildt Л. and Zalin R.K. (1959). Контрастировали сплавом плчтипн с палдагиом.

Для электрошшо - мскрпскгатчспкого исследования структуры этрпоиоп wcvnm псвлди дярчитш1 жшодвоыде плепки. Проплати КЭЯТрПСТШ'ОППЛП 1,5-Я,ОТ- ура'Л'.-апеТЛТЛ и просматривали г едчср^скот- > J]"4 -7 при. ускорт~отк нчигя^тж ео кП. Тсрппеспу» денатурации дик n i х ss'j и o,i X ss¡;

ОС'УЛРСПГ-ЛЯЛК Ш> p^VWCTpî'pyrn» M -P!ïrpC}OTO».-«Tpfi "*1>г.,»КТ.'!П" О npncrmrofi 11"-*3, ч ссл'5Р";м!;:т оум-ч ГЦ- пар ДНК цилпофагов расстилали ne f'nmtr J. к ;">ty '1 ■-<,'_').

гп'л'спосно" чонтр'г'УГИро'nuw !П5 ¡4 U"X ïrr^n.ip^TOB дни !!;■.,-"¡CMf-4'ОП К нл:]",'::д frolicr'mv^r;-;« t; rj;-^лг."!!'!'^ СсО! 1ГрОГПДИЛИ cc'vncüo Мтгкмп M. о г'пгт. (г:-70). ИГ'кучуп плотность всох г. **.n«viywsnt шив пр®пяратоп Д'г; спрд^ляли по откохптго к ДНК Фага А..

КясяотниЯ и Япрмо.чтпкр-'ка пиролиз ДШ а определение иугоу-отпчлого состт-я оеуячегаяяг:« по Р.-лм^чу Е.Хч (IP64). Малеггулярчуи массу ЛИК циэнофагев и ляйр'зд циаяэбякторкп рассчитывали по уравнению rigr.^r Е. и Po>,;- .V.(I9f?5).

Для РПСТ1!'ГКПИСИ!!ОГО анализа ДЗС Ц"£ШОфаГСВ и плаггад

цианобпктеряп в ссягтотом исполкаовалтт Одяквктн - рсстргостазн Hind ТТ1 и Ram ИТ произвол тс а рлльдасского ,Ш0 "Фермент". Рас.таплеште ДНК осуществляли согласно рекомендациям изготовителя. Э.пектроферез всех рядов ясследуошх препаратов /ПК проводили в t? агароапем геле в тряс-ацетатном буфере, pH 8,3 (Маниатис Т. и др., 1984). Гол» скрашивали раствором »тидия бромистого и фотографировали в УФ ■ свете (254 им), кспо.'неуя плойку ""икрат - 300". Размеры фрагментов ДНК определяли относительно маркеров ДНК фага. X, обработанной эядонуглог.аой Hind III (Минтер С. и Силп Н., 1987)/

Глава 3. Наделение и некоторые аарзктор^ешки цшшофигов

ДЛЯ BCGCTOpOíiiíui'O НЗуЧвНИИ - СВОЙСТВ .ЩШЮфаГОЗ и их взаимодействия с культурой хозяина нами- шделенй цканофаги из различных водоемов Республики Узбекистан:.

Согласно традиции", " .выделенные" щшно>$агв, лпзирундие культуры Nostoc ;linckia-Jfâ9 и Synechococcua tlongatuc i¿58, обозначены как-Н-5Т « S--91'..- ' "

Обозначенный нами циано^аг " N-5T обладает' широким споктром ЛИТИЧОСКОГО действия. Из- 2В ИШШТМППИ . культур чуствителмшмик ' циаио^йгу оказались 4 культуры; Uodtoc llnckla-jfâ, ' 059, Лоз toc sp-Jt¿8l, tlostoc тизсопиыйСМ. При титровании упомянутого цианофага на -газонах N. llr.ekla-A>3, ítootoa sp-Jtóai И N. • TCuaoorum- .ЖЗСМ образование негативных КОЛОНИЯ • розко УЫОИЫЬВЛОСЬ. lío - видимому, пврвччехвшшв культуры продуцируют экдонуклеазы, гидролизуицие ДНК исследуемого цианофага. После размножении на индикаторной культуре--К. llnckla -•J259 титр частиц щшнофага Г1-ЭТ в I . мл лизата достигает Б,?, х ю9. Поэтому - в посладуидих опытах для репродукции . цианофага щ использовали именно- afy культуру. Кроме того," она .отличается от .остальных ' большей скоростью роста в;гадкой среде и .более быстрым образованном газона на чашках Потри при-.посева 'двуслойным1 методом. При определенных условиях-'. выраиишация (температура 26-й7°с,' освещенность 900-.1000 ж у негативные -колонии цианофага H-ST диаметром 2-3 ш на газоне культуры Ii. IJnokia - JiöO в читке Петри образуются через 32-34 ч, а на 10 сутки инкубации их диаметр достигает 9-10 мы. На .газоне N. llnckía - Jíй, lloatoc ар '-- jeei й N.. muacorum -№304 пегатиышо колонии поу^.гыытся чероз 38, 42, 47 ч, соответственно, а диаметр их па Ги сутки на превышает 3,ü - 4,1 мм. Увеличение их размера прекращается с того времени, когда происходит пш.олтешш газона чуствителыюй культур и и высыханий • ьерхнзго' сдоя агара.', Такое увеличение размера негативных колоний характерно; только отдельным цианофагам в' отличие от бактерио • - и актинофагов.. Резкое уцолцчошкз размера негативных коло1шй цианофагов. обнарушиш Ц. Мурадов и. сотр. (1990), работая с - умеренными щшнофагамц- MP~.1T;' - серии.

лизирукштмл культуру* №эз1ос ор.- «39. Пра :>том розмяр НОГ'ЗТИВШ'Х КОЛОНИЙ ДОХОДИТ до о1}—10 ММ Ч'фС?" 10 дней С0ВМРСТН"ГО пирлтигпяия цтно^эп и тотлпоежгрряп. Ииянофлг Н-5Т ПО рчпдорям чпгт1ш рчзко <угл1п.1?тся от шрнофпгов, ОПИСЧ'ПШХ в литврмгуро. Чпстини того ЦИШЮфлГП МНОГОТ'Г'НПШЙ капсид (иостигр'ппшП ПЛ пл.тгости!, дилмптр гранями <'?, им, дгина огросткп ПО им.

Изучая одиночный цикл рпепгпм нттф-чгч и -5Т п «лотках гоганобчктлрпп '!. 11 пек!а -1-59 мы установили, что адсорбции ппапофпгп происходит н пр?дпллх ?,5-п,5 ч., а лэтрнтнпй период длится до ТО ч. Нччиная с 19-20 ч. я.чро-тоот титр цпт!с>Ти)гп, пг'лч пт'аиПоя к 3-} ч. инг.'.'бчмчи, Риход иссл^д'.тчлл о цкш!.»Гяг<1 гостчпляст ?80 ЯГО вирююп из одну ИНфНЦИрОГПННПу.'О ГЛ'-Чку (рис.!).

Гремя, истркшее с цемента заражения, чае

Рис Л. Кривая ситочного никла развития ннанофзга Н-5Т в клетках Н.11пск1а-Л59

Прнмртшго: I! - Количество цнэчофага на одну инфицированную клетку,

Ъ - Латентный пэр-иод, Хр - Период лизисэ,-Ц - Рч.тод цианофага. Утлтивая пго пнггиггальчне отличия от описанных штонофя-гев, п том чпел? от ционофпгов П-1, И-2, Н-ЗТ и N-41, разви-

ващихсн и клетках пианобакгсрии различного вида из рода Noatoe, ми обозначили згот цианофаг как N-5T. .

Цианофаг S-УГ по нашим датам- оказался специфичным и ли— зироввл исключительно только одну культуру Senechococcus elongatus Naag- J¡68, из иппользовашшх в качество тест-культур 26 штаммов иитчатих и одноклеточных цианоЗактврий, относящихся к 14 родам и 12 видам.

Исследуя морГюлопш негативных колоний на газоне индикаторной культуры S. elongatua -Jtó'8 ми убедились, что цианофаг S-9T образует негативные колонии правильной формы с четкими кралми. При определенных условиях выращивания (температура 30 - 32°0, освещенность 1600-2000 лк) такие колоши циана!ara S-'jT возникают через 33-34 ч. Формирование негативных колоний цланофага прекращается уже на б-V-e сутки инкубации, они прозрачные, диаметр их не превышает 3-4 мм на 10-е сутки инкубации. Возможно, что в процессе роста S.elongatua -.tóa выделяет вещества, инактивирущив репродукцию данного цианофага.

По морфологии вириони S- 9Т существенно отличаются от цианофагов S - серии, • описанных ранео. Они Kuanh шестигранную головку ш плоскости, диаметр между гранями ей нм и обладает длшншм но сокращающимся отростком длиной 126 нм и шириной 14 нм. . •

Далее, нами изучен одиночны?) цикл развития цианофага S-9T в клетках цианобактерий S. elongatua -Ж:-8. Выяснилось, что адсорбция протекает за короткое время и в пределах 1,5-2,6 ч., аатем идет латентней период, который длится 21-22 часов, а с 24 ~2Ь часа начинается нарас.ашш титра цпавофага, завершающийся к 22-33 часам инкубации.. Выход цц^ысфага составляет 170-200 частиц на одну инфицированную клетку (рис.2). .Принимая во внимание ого значительные отличия от описанных ранее цианофагов, в том числа от цианофагов S- серии, разшьмцихся у рода Бупес1,.иссдсш, этот цианозу нами обозначен как Я -ЭТ.

Врег,<л,истекшие с момента заражения, час Рис.2. Кривая одиночного цикла развития циапофага Б-9Т в платках

Прммечан'.'е: Н - Количество цианофлго на одну инФишфованн.ую клетку,

- Латентный пер;:од, X - Период лизиса, ^ - Выход цианофйгь.

Распространение нияпофагоа в природе

Для изучения характера распространения цканефагов в природе нами проанализировано более 400 образцов вод!», отобрании* из различных водоемов Ташкентской области. Нужно отметить, что шюнофпги обнаруживаются практически во всех обследованных образцах, что сичгтя.ш етЬует о широкой распространенности цнанофагов й природе.

Цтпофэги Н-5Т и Б-9Т в весенне - летнее время обнаруживаются в большом кояготстео , осенью их количество резко падает. Согласно полученным нами датпшм виды циаиобзитерий, чувствительные к цизнофагам никогда на представлены в водоемах в домишрутам количестве. Это вероятна объясняется тем, что меу.пу цнаяе^тяг и цканобзктерияш устанавливается аколоппесюте- "рарпоиеейв в природе.

Структуры*'-? особенности ДНК цианофвгов и ллазияд цияиобяктерий

йгслэд^вагаше нами прегтррэтн нукл&июгых кислот,

шдсшяншо культур ЩКйМОакТер.Ы И ИЗ ОЧВДЬШШХ HípüOiiOi »цкшафшчш Н-ЬТ и S-9T, имеют тшшч.ше дли Д11К circKvpu поглощений с максимумом при 232 нм,- Отношение их onwteCKüí плотности при 200 им 1С таково;) нрл "80 им составляло но шшй 1,74, и отношение В 300/230 Hü таю 1,6.

Идонтк'..1.йкацц1и urna нуклеиновых кислот последусыих циа-нофага и цианооакторий ми ос.у!::-\:;хллл1! но цветным реакциям и по чувствительности к Ферментативному и щилочиому гидролизу. После инкубации в присутствии 0,Vñ N НаОН в течении Т8 ч. при ñ? f'C и посла инкубации с НШэоЯ нуклеиновая кислот и оставалась с ккслоторзстворидай форма. Препарате ДНК гидролизуютса ДНКозой и дают положительную реакций с ди-фониламшюм. Результат!; этого и наших последующих онитов но рестршсгазноиу анализу свидетельстиуыт о том, что иуклашкншо кислоти исследуемых циансфагов N-5T и S-9T принадлежат к дезоксирибознс.му типу.

Вторичную структуру ДНК цианоЛактерий и цианофагов ми исследовали методом термической денатурации ь растворах различной ионной силы - 1 х SSC и 0,1 и SSC. Пони^оцпо ионной силы растворителя на один но[шдок, как доказало hoí.üÍ, снижает температуру плаьлонял ДНК исследуемых нианофагов и щш i ю ö акт a J íiiil соответственно на 1ь.Я0-М.9П и М.йО-Н.аз, практически не влияя на .другие параметры тор1.идинатурац!ш. Содержание суммы ГЦ-пар г? препаратах ДНК, определенное по кривим плавления в буферах 1 х 8SÜ и о,Т л KSG, практически! полностью совпадает для кавдай исследуемой ДНК и равна 65.42% для ДНК цишюфпга ÍÍ-5T, 66.U1S -длл Д1ПС S-9T. 41.4ГЖ для ДНК цианобактерий Not; toe llnc.U.-i, 4J..I9" длл litßi Syne-сВоеосснз elongatua(табл.J).

Проведенное равновесное центрифугировать на гиеной ДНК цианофагоа и цианобакгорг.й в грздисте с.чСЧ позволило получить мизорлшиио о первичной и ъторич»к.й сгрукту{ш. Молекулы ДНК ЦИШЮфаГОЬ N.-VI', S-'Ji' И Д!и( ЦИЫООШПвриИ Ü. linckla, S. olongatns локализуется (.тдильш.-мп ¡ике,.-.,; ь нал с плот пост i, hi 1.730 г: см'', 1.731 пом-5 и i.VitJ г ' i.'/05 r:cMJ, соответственно (таблЛ ).

' Таблица I

Физико-химические параметр« ДШС, циадофагов и цианобактэрий

ПАРАМЕТРЫ

Т пл. ДНКЦхББСО.'С Тпл.ДНК(0.1x380),'С

Г+Ц(опр. по Тши) Плавучая плотность № Оа 01 Г/см3

ГЧКопр. гю пхаву-чсй плотности) % в Са С1

Мслокулярная масса (т.а.о.)

Цианофаги

S-9T N-5T

94,74 95,12

77,84 80,22

66,84 &5,42

1,731 1 ,730

72,44 71 ,42

43,80 •14,30

Цианобактерии

S.elonga- ~7Т7ИгР"

tua ckla

87,42 86,28

72,52 71,36

44,19 41 ,41

1 ,705 1 ,703

45,90 43,87

Процентное содержание пар ГЦ, рассчитанное по плавучей плотности и Т пл., достаточно хорошо совпадают для ДНК обоих цианофах'Ъв и цианобактбрий, что характерно для двусплральшх ДНК со стандартным наборсм_ азотистых оснований. .

Электронно-микроскопическими исследованиями мы установили, что молекулы ДНК цианофагов N-51 и 3-9Т линейны, имеют открытие концы, а плазмидшо ДНК цианобактерий N. 11лск1а и 3.е1ощгэгид-кольцевые, замкнутые. Число нуклаотидных пар ДНК цианофагов и плазмнд цнанооактерий соответстЕеннш равна 44.3; 48.8 и ь.9; 8.7 т.п.О.

Рестрикциоышй анализ ДНК цнанофагов и плазшд ' цнанобакте.рий

Для рестрикциошюго анализа на первом зтвпе мы ис-нользсьапа 10 ферментов (Bam HI, Ввр RI, Hind III, Mspl, Ecc-RI, EcoRV, PstI, Sau3A, EniaL", 'Sail)'- эидонуклеаэ рестрикции. Ферменты В:jr. HI", Hind III, Mspl, PstT и Sau 3AI

расщепляли ДНК изучаамнх цивнофзгов и плапмид цишюбзктериП. Поэтому сравнительный анализ ДНК испытуемых памп цианофагов е шгазтд циоюбактврпЯ. был ироввдэи с помощью этих Формантов. . "

1

< I

23.19,4 6.5

2,3_ 2,0-

Рис.З. Злектрофорочичоскоо рпэдплепго фрагментов, образующихся при дэйятвни различных рестрикгоз на ДНК цианофага Б-ЭТ Н1п;:1 III - фрагменты Д?Ж фага А., ?,. Ват НГ, 3. ШгкЗ 111, 4. Мзр1, Б. ГуН, 6. Баи ЗА - фрагмента ДНК цианофага 8-9Т. /

3 4

1 г

23,1 ^ ~ | 9,4. 6.5-

2.З.. 2.0-

6

И

Рис.4. Элэкграфсрэтлчосксе разделош? фрагментов, образующихся при действии различных ростриктао на ДНК цианофага К-5Г. !. Шлс! Ш - фрагменты ДНК фэгя X, Р.. Паш НТ, 3. Шла III, 4. Кар!, п. ГсЫ, 6. Яаи ЗА -- Фрагменты Щ{ нигнсфчга М-5Т.

Кок видно из приведенных рис. 3 и 1., фарменш Вага HI, Hlndlll, L'spl, Pstl и Sau 3AI гидролиз уь/г ДНК цианофага S-ST на 6, 7, 7, 9, 8 фрагментов, а ДНК щшпофага N-5T -па л, Z, Э, ß, 7 Фрагментов, соответственно. Фермс-н-га Бат ¡ГГ, llind III расщепляют' нлаамидную ДИК цшюбактзрии N.HßcKia &ЗЭ (pUI £39) к а 7 и 6 фрагментов, а ДНК плааг.шды цианобактерии S.elongatua. J868(pSe 58) - иа 1Г а 8 Фрзгкентоп, соответственно (рас.Б, табл.2)

33,1.

9,46,54,4-

с.,с -2,0~

к '

и

I V

5 6

Vf-"

I. л*»

Рас.5. Электрофорбшчоское разделены Фрагментов, образу вакся при действии рааллшш ростриктаз на шааыадц циако-бактерий рН159 и р3е53

1. Hlnd III - фрагменты ДНК фага X,

2. ЬатН I - фрагмент pilI59,

3. Ват ,Н I -- фрагмент рУе58, Й, Stoü III- фрагменты рШ59, ( Hisri III- <JpaiM>:inu pSräB, С. Esc-ii V - фрагиск'.и ДНК фага

Таблица 2

Молекулярные массы фрагментов одинарного гидролиза ДНК цианофагов и плазмид цкано-бзктериЯ рестрйктазой Ваш ИГ.(т.п.о.)

Порядковый Л фрагментов Цианофаги 11лэзмидыи

S-9T N-5T pNI-59 j)Se~58

1 23.0 22.8 2.3 3.3

2 9.2 11 .3 1 .3 1.4

3 т.з : 5.9 1.1 1.2

4 4.3 4.3 0.6 О.Т

5 3.8 0.3 0.6

б 1.2 0.2 0.5

Т 0.1 0.4

8 0.3

9 0.2

10 0.1

48.8т.и 0. 43.3 T.tl.o. 5.9 т.п.п. 8.7'г.п.о.

Молекулярные массы мы вычисляли, .используя в качество стандарта Hind III - фрагызц'гы ДНК . фогп X, а размеры фрагментов, выражали в тысячах пар основания (т. п.' о.). Фрагменты ДНК исследуемых цианофагов и плазмид обозначали цифрами.

Сравноше расположения фрагментов на электрофореграммах, т.е. молекулярных масс Фрагментов, показывает, что картина распределения сайтов рестрикции по ДЕК исслодоппгашх цианофагов и плазмид цианобактерий неодинакова ложе в тех случаях, когда рестриктаза давало равное общее число фрагментов ДНК. Это видно из рис. 3 и 4. гдо перечислены фрагменты ДНК цианофагов. Гис. 3 и i свидетельствуют о том, что совпадения величин фрагментов ДНК ш'шгсфагов почти отсутствуют. Картина распределения сайтов рестрикция по молекуле ДНК у каждого циэнсфага и .у каждой шетзкады циэнобчкюрии индивидуальна, что шкот служить ц«шюй информацией для плвчтЩякашт цивнефзгов и плазмид циано-бактприй.

Результаты исследований по рестршшиошюму анализу нуклеиновых кислот впдедешшх и изучешшх нами цианофагов и пляемид цпапобактерий, приведенных в тг.бл. 2 и рис. 3-5, показали, .что otra отличаются • как. по электрофоротической подвижности фрагментов в агарозном гелэ, так и по количеству самих фрагментов. Таким образом,- рзстрикцпонпнй анализ - ото . специфический кетод, который MÓiüóT быть использован для характеристики и идентификации 'да цианофагов и плазмид нианобактерий. Накопление . материалов такого характера позволило ■ нам выявить' сходства и различия ' мааду разными шазмидныш и цкапофаговыми структурами ДНК, которая могут служить оснсвсЛ для дальнейшей- ■успешной работы -п области мплекулярноЯ- биологии цианофагов и плазмид щгонобакторлй.

' выводы .;. ,

£. Впервые - охарактеризованы два' новых Цианофага-Ы-5Т' -и S-9T, выделенный из .различных-водоемов Рйспублнкй Узбекистан, Установлено их широкое распространение ь'исследованных водоемах. Титр цианофагов-и веседше-летпий период- года максимален, а осенью титр их резко'-падает. •'' . -Z. По строению ЕЙрисиов выделенные-цианофаги четко отличаются друг от друга и относятся к группе цианофагов с дшшшми отросткам; и носокращающимися чехлами., Изучена морфология негативных колоний цианофагов на газоне индикаторных культур и установлены их различия по размерам, 'форчам , и времени образования." . '

3. Щюнофаги отличаются по' веем параметрам литического цикла: латентному периоду, периоду лизиса и выходу вирионов в пересчете на клетку. Оки строго- специфичны, для .каждой системы цищюфзг - цианобактерия но таким. характеристикам среди, как рн, освещенность и чувствительность к температура и другим физико-химическим воздействиям. ,

4. Впервые шделени три нлазмидннх ДНК различной молекулярной мзеец, ;.,'д:ш из культуры S.elongatus-58 и две - из- N. Unckla-59. •

¿3. ^лек-урошю-микроскопичвеюоли исследованиями установлено, что молекулы ДНК цианофагов N-5T и. 3-9Т линейны,

1мсшт открытые концу, а плазмиднэя ДНК 'циянобактерий N. ■llnckia-59 и S. elongatus-58 - кольцевая', замкнутая. Число нуклеотидных пар ДНК цианофагои и плаомид цианобактерий соответственно равно 44.3, 40.8, и Б.9, 0.7 т.п.о.

6. Рострикщгашшй анализ ДНК исследованных цианофагои и плозмид .цианобактерий показал, что они отличаются как по электрофоротической подвижности фрагментов в агарозном геле, так и по количеству самих фрагментов, что является убедительным доводом н пользу видовой специфичности згих цианофагов и плазмид цианобактерий,

7. Полученные данные могут быть положены в основу токсснотш цианофагои и плазмэд • цианобактерий. а сами цианофпп: и шгазмиды рекомендуются использовать в качестве модели для молсжулярно-биологичоских исследований и как векторы б генно-инкенершк' работах. ■

Список, работ, оиубликовтишх по токе диссертации

1. М. Мурадов, ©.Д. Камшгава, К.У. ТуЛчети?, О.С. Еею.у-хамодов. Рострикциошмй анализ ДНК укоренных циглюфгпов. //Тезис;; докл.У Конференции биохимиков республик Сродной Азии и Казахстана. Ташкент.; "Фан"Л931. с.375.

2. И.У. Туйчпев, О.С. Еекмухамедов, М. Мурадов. Создание циэиофаговых лизатов Nos toc linckia (ROTfl) KLENK Jf69 и применение их при предпосевной обработке семян хлопчатника. //Тезисы докл. Конференции "Микроорганизмы в сельском хозяйство". Пущшю, 1992. с.201-202.

И.У. Туйчиев, О.С. Векмухамедов, М. Мурадов. Цианофаг Б-9Т - новый вирус одноклеточных циапобактерий. //Доклады АН РУз,1992, ХЗ, с.54-56. 4. М. Мурадов, И.У. Туйчиов, Г.В. Черкасова, А.Г. Халму-радов. Выделешта и изучение свойств плазмидаых ДНК шзггабакторий. //Тезисы докл. II- Конференции биохимиков Узбекистана. Ташкент, "Фзн", 1993. с.62. Б. К.У. Туйчиев, Г.В. Черкасова, М. Мурадов, А.Г. Халмура-дов. Рестрикционнкй анализ ДНК цианофагои Н-5Т и 5-9Т. //Тезисы летел. II- Конференции биохимиков Узбекистана. Ташкент, "фен", 1993. с.202.'

УЕШШСЮН ФАЯЯАР А1£АдаШ1СЯ

КЗСРОЕЯОЛОПИ ШСТИТУТИ

ïfffMÎB ЙСКАНДАР ШРШШЯ

Биология фзнлари номкоди кл.тий даракасини слташ учун хююя щшшго тапсия этилган

"Илсимои îio3toc lliickia ва Лир хужайрали Synechoccocua

elongatus ционабактерияларииииг циянофаглари ва плазмида-

лари" мовзуидагн диссертациянтг

ХУЛОСАЛАРИ

Узбекистон Ресиубликасининг сув хеьзаларидан ипсхгмои Hcatcc ïinckia ва бир хужайрали Synechoccocua elongatus турларига мансуб цианоОактериялврни (кук -яшил сув утларкни) иарчаловчи внруслар (нианофаглар) акрйтиб оланди ва улар емалдаги цоидалар асосида шартли равишда N-5T ва S-9'I' доо ношганиляи. Бу. • цаансфаглар сув ^авзаларида конр тар-цалганлиги ургзшлди. Улариинг глвддори бахор ва ез фасллв-рида ¡куда купайиб, кузга келиб эиз кэекин квыаЯиО кеиаюгиги аншяюндп. Ажратилган цданофаглар катар физик-кишвиЗ усуллар ' билан тозаландо ва уларшшг мухим биолзгик хусусиятлари ургакилди.

Электрон микроскоп ордамидп (50 мшг иаротаба катта ка-либ) щшнофэгларншг квклий тузшлдка ¿а уларшнг улчемя атэршнди. N-51' ва S-9T щкшофсг.чар тузилкаи, удчамд

жихатидан олдин урганилган U1-! - Н-4Т ва 3-1 - S-ШС) циа-нсфаглардан тубдан фарч «далздл ва бир- оирага ухиамайди. Шакли жихатидан оу 1аглафагларнн "узун усштадикдар" гурухига киритса булади. Н-5Т шшнофчгшшнг Оош грюми nf'n чиррали булиб, кирралар орасинжг улчами 62 ил, усилтасишиг узунлиги зса 170 издай кборат. 3-9-1 цнанофагининг улчами И-5Тг нисбатан бироз катта буллб, бош цидаидаги чирралар оршютй 65 нмш, усштасл 125 нмни, усимтпсииинг кенглик оражги зса 14 шш: ташкил цилади. Петри вдишида цианофагларшшг сезгир цианобакториялар хужайрасини емириш (негатив колониялар хосил килиш) ^'обилияти ва уларня улчами аншранди. Бу хусусиятлари тахатидвн хам цианофаглар бир

бирядон катта фардоанади г.а олдин урганплгаи цианофагларга ухиамайди.

Еундан ташнарч цраиофвг Сулакчаларп (вириошшр)га айрпм ташци физик-кимёвий мухитнинг (харорат, теки валептлп металл тузлар, мухкт рН, хлороформ, • мочовкна ва ботца органик моддалар)таъснри ургапнлди. Бу хусусияглари ва' бошка урганилган бир цанча хоссалари- кодатидан лиги ажратилгак цианофаглар аввад ургашлган цпанофаглзрдан тубдзп фарт; 1;илади. Шушшг учун хам бу иккита ажратилгап нианофаглар фан учун янги тошшган фаглар деб болгилавди.

Шюиофаг 11-5Т, Б-9Г вириопларидан, . И. ПпсМа г.а 5. е1огщгНиз гшанобацтериллар хукайрзларидан хромосома ва плазмида нуклеин кислоталари ажратиб олиндн, тозаланди- ва уларшшг баъзи бир ^усусилтлари ургашлди. Авваламбор бу акратилган нуклеин кнслоталари икки спиралли ДНК эканлигл анщланди. Электрон микроскоп ердамида цианофаг вирионлэрид'ан акратилган ДНКлар узунчок ипекмон шагслида эканлиги, цианобакториллар ' хужайраларидан акратилган хромосома ДНКси тарной хрдда куп шхлиляги, нлазмид ДШси эса хллкасимон шаклдалиги аникланди. Диссертацилда бу' пгаклларшнгг 'микросуратлари колтирилгап. Хор хнл £ш>ик усуллэр ё'рдашда тоза т,олда айратилгаи ДФ< тзрмгбидагл ГЦ -•куфтларитшг умужгй мщдори агопрюнди.

. Гель - электрофорез усули ердамида натор ростршстаза ферментларидан фойдэланилиб цианофаг га плязмид ДНКлари рестрикцион-анализ килилди ва шу усул оркадц цланофаглар га нлазмидалар бир биридан тубдан фар»; цилизга ашг^ландл.

Шундай килиб, длссертацпяда тюимоп ва блр хукайрали цианобактерияларнинг айрцм вакилларшш парчаловчи итскито янги цкатюфаглар [ табиатдгн ажратиганлрги, уларшшг биоло-гше, физик юмввий %усусиятлэри ургаиилгаплпги баен зтплган. Бундан таищари бу кк.кк гурух цианобактерпя взкилларя хукай-раларидап янги., илгари урганилмагач нлапупдалар ДНКси топа г,олда мгратпб оли.чдя ео уларшшг айрпм хоссаларн урганглдл. Цианофаг ва плаакпд ЛТГСларн ва уларнинг а5"рш рестркпцпок булакларптш амалиотда г?к куховдрслт-вда вектор спфотидч, №Ю(,'офаг.яарга чидапли ш;а.чобактеряяляр!и.чг аГри-т юутях'ларк-пи слип? к'члатил'.'Угя чумккплчп: ергтялт -'Ч

INSTIIUTB OF UICnOBIOLOGY, ACADBH' 0? SCIENCES 0? UZBZi REPUBLIC, TASHKENT, UZBEKISTAN

Cyanophages and plasmlds oi filamentous cyanobacterla "lootoo llnckia and unicellular Synechococcus elongatus

Fox* the first time 2 new cyanophages: N-5T and S-9T Isolated iron water sources, have been' characterized. It has been established that cyanophages are widely distributed over Water sources of Uzbekistan. Cyanophage tltr la maximal at aprlng and summer, and it quickly decreases at fall and

By structure of virions isolated cyanophages differ each from other and relate to group cyanophages with long branch and nonshorten cover. Morpliology of cyanophages negative colonies on lawn-of indicator culture has been studied and their differences' by size, form and time formation have: been established.

Cyanophages differ by all parameters of lytic cycle, latent period, lysis period.and virions exit on cell.

For the flrot time 3 plasaid DNA from culture of N. llnckia -X69 and 2 from S. elcngatus -J©8 with different molecular weights have been extracted. DNA molecules of cyanophages N-5T and S-9T are linear, have open ends, and plasmid DNA of N.linckia -ii50 and S. elongatus -JS58 is circle closed average molecular «eight of cyanophages DNA cyanobacterla plasmid is 44,3; 48,8; 5,9; 8,7 t.p.n. accordingly.

Restriction analysis of DNA studied cyanophages and cyanobacterla plasmid showed that they differ both by electrophoretical mobility of fragments in agarous gel and by quantity of these fragments, that is convincing argument to species specificity of these cyanophages.

TDICHIEV ISKANMR IEURAII2VICH

SUMMARY

winter.