Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Свойства ДНК зависимых ДНК-полимераз цианобактерии Plectonema boryanum в норме и при вирусной инфекции

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Свойства ДНК зависимых ДНК-полимераз цианобактерии Plectonema boryanum в норме и при вирусной инфекции"

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ім, Д.К.ЗАБОЛОТНОГО

рг в од

15 ДЕК ІЬЗО На правах рукопису

СУХАНОВ СЕРГІЙ МИКОЛАЙОВИЧ

ВЛАСТИВОСТІ ДНК-ЗАПЕЖНИХ ДНК-ПОЛІМЕРАЗ ЦІАНОБАКТЕРІЇ Р1.ЕСТОЫЕМА ВОЯГАЫиМ В НОРМІ ТА ПРИ ВІРУСНІЙ ІНФЕКЦІЇ

03.00.06 • вірусологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ-1996 р.

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі вірусів водоростей Інституту мікробіології та вірусології ім Д.К.Заболотного НАН України.

Науковий керівник - доктор біологічних наук, професор,

Менджул Михайло Іванович

Офіц Ій н і опоненти:

Доктор біологічних наук Тарасишин Леонід Олександрович

Доктор біологічних наук Рибалко Світлана Леонтьєвна

Провідна установа ■ Інститут молекулярної біології та генетики НАН України.

Захист відбудеться 'Е.О" И 1996 р о 10 годині

на засіданні спеціалізованної Вченої ради Д 01.81.01 при Інституті мікробіологи та вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України {252143, Київ-143, вул.Заболотного 154, Інститут мікробіології та вірусології НАН України, зал засідань).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології та вірусології НАН України. .

Автореферат розісланий "2Э 6ЖГ(Ы996 р.

Вчений секретар спеціалізованої Ради кандидат біологічних наук

Л.М.Пуріш

з

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

_______Актуальність проблеми. Однією з центральних та найбільш

складних проблем сучасної вірусології е розкриття молекулярних механізмів взаємодії віруса з клітиною. Незважаючи на те, що система Т-фаг бактерія Escheiichia coli є зручною моделлю при вирішенні питань реплікації, транскрипції та трансляції вірусних нуклеінових кіслот, однак більшість молекулярних механізмів основних реакцій експресії вірусного геному до цього часу ще не з'ясовані. В літературі майже відсутні дані про етапи та конкретні механізми формування в інфікованих клітинах вірусспецифічних реплікативних комплексів, роль та шляхи вірусної модифікації ДНК залежної ДНК-полімерази ■ головного ДНК-синтезуючого фермента клітинихазяїна та характер вірусіндукованих змін функцій цього фермента в процесі вірусної інфекції.

Безсумнівний інтерес в цьому плані представляють ціанофаги -досить велика і різноманітна група вірусів, які уражують ціанобактерії (синьо-зелені водорості) різного еволюційного ускладнення. Незважаючи на порівняно невеликий час дослідження (з 1963 року), виділено і охарактеризовано досить значну кількість ціанофагів, з'ясовані основні особливості їх біології. Широкий інтерес до вивчення ціанофагів та системи ціанофаг-щанобактерія не випадковий. В даній вірус-клітинній системі завдяки низькій швидкості генерації

ціанобактерій та значній подовженності цикла репродукції вірусу, створюються унікальні умови для поетапного вивчення молекулярних механізмів вірусспрямованого формування і функціонування ферментативних комплексів. До того ж, ціанобактерії поєднують у собі простоту будови прокаріотичної клітини і фотосинтетичний тип метабо лізму властивий вищим рослинам. Ця унікальна особливість системи ціанофаг-ціанобактерія, як і її значний еволюційний вік та пов'язана з

ним еволюційна сталість механізмів взаємодії паразита з хазяїном,

дають підстави для екстраполяції в подальшому окремих

закономірностей, виявлених в цій системі, на інші вірусклітинні комплекси.

Мета та завдання роботи. В зв’язку з вищезикладеним, метою даної роботи було виділення та дослідження властивостей ДНК-залежних ДНК полімераз ціанобактерії Plectonema borvanum в нормі та в системі ціанофаг LPP-3-ціанобактерія P.boryanum.

В процесі виконання роботи поставлені такі завдання:

1. Відпрацювати ефективний метод отримання ферментативних препаратів ДНК-залежних ДНК-полімераз неінфікованих та інфікованих ціанобактеріальних клітин.

2. Провести детальне вивчення фізикохімічних та функціональних властивостей ДНК-полімераз неінфікованих клітин ціанобактерії Р. Ьо-ryanum.

3. Дослідити динаміку змін основних характеристик ДНК-полімераз P.boryanum в процесі розвитку ціанофагової інфекції та визначити кількісний і якісний стан ДНК синтезуючого апарату на кожному з етапів функціонування системи LPP-3-P.boryanum.

Наукова новизна роботи. Вперше для трихомних ціанобактерій досліджені властивості ДНК-залежних ДНК-полімераз, Визначено основні фізико-хімічні та функціональні параметри двох ДНК-полімераз неінфікованих клітин ціанобактерії P.boryanum, Проведено класифікацію даних ДНК-полімераз та з’ясовані можливі функції цих ферментів in vivo. Вперше визначено стан ДНК-синтезуючого апарату клітин P.boryanum, інфікованих ціанофагом LPP-3. Встановлено наявність змін електрофоретичних, хроматографічних та каталітичних характеристик ДНК-полімераз в системі LPP-3-P.boryanum. В інфікованих ціанобактеріальних клітинах виявлено новий ДНК-полімеразний фермент, досліджені його основні фізико-хімічні та каталітичні характеристики.

Практичне значення. На підставі аналізу отриманих даних і літературних джерел запропонована загальна схема формування вірус-специфічного реплікативно-го комплексу в інфікованих клітинах P.boryanum, яка може бути використана при розробці стратегії керованої інфекції. Наявність надчутливості активності полімераз до марганцю та термостабільності їх реплікативних функцій дають можливість для використання цих ферментів при вдосконаленні методів гено-інженерних та медичних досліджень.

Конкретна особиста участь автора в одержаних результатах. Робота виконана автором особисто. Організаційну, консультативну та методичну допомогу при виконанні ряду експериментів по вивченню фізикохімічних властивостей ДНК-полімераз неінфікованих клітин P.boryanum надано к.б.н. Нестеровою Н.В.

Апробація роботи Головні результати роботи доповідалися на звітній науковій конференції Інституту мікробіології та вірусології НАН України

за 1994 р., VI Українському біохімічному з'їзді (Київ, 1992 р.) і на І Установчому з'їзді Українського мікробіологічного товариства (Одеса, 1993 р,). Досліди по темі дисертації були підтримані грантами ДКИТ "Біотехнологія" на 1991-1995 рр., НАН України для проведення фундаментальних досліджень молодими вченими на 1994 р, та відзначені стипендією Президії НАН України на 1995-1996 рр,

Публікації По матеріалах дисертації опубліковано 9 наукових праць (з яких 3 - за кордоном).

Структура та об'єм дисертації Дисертація складається з вступу, огляду літератури (2 розділи), експериментальної частини з 4-х розділів власних дослідаень, обговорення, висновків і списку цитованої літератури. Робота викладена на 135 ‘сторінках машинопису, ілюстрована 6 таблицями, 2 схемами, 36 малюнками і 3 фотокартками. Бібліографічний вказівник містить 108 робіт, з них - 32 вітчизняних авторів.

Положення, шо виносяться на захист

1. Методи одержання ферментативних препаратів ДНК-залежних ДНК-полімераз неінфікованих та інфікованих клітин ціанобактерії P.boryanum.

2. Основні фізико-хімічні і функціональні характеристики ДНК-полімераз неінфікованих клітин P.boryanum.

3. Вірусіндукований ДНК-полімеразний ензим, його основні фізико-хімічні і функціональні властивості.

4. Загальна модель формування і функціонування ферментативного реплікативного комплексу в системі ціанофаг LPP-3 - ціанобактерія P.boryanum,

ЗМІСТ РОБОТИ МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

В роботі використовували аксенічну культуру ціанобактерії Plectone-та boryanum Gom. штам CALU 465, отриману з колекції Біологічного інституту (С.-Петербург, Росія) та ціанофаг LPP-3, штам якого виділено та охарактерізовано в Інституті мікробіології та вірусології НАН України [Менджул и др., 1974].

ДНК-полімеразну активність ¡n vito визначали радіоізотопним методом з використанням ІН3]-дТ7Ф або [Р32]-дАТФ як мітки [Boilum

1968]. Як системи матриця-затравка використано "активовану” ДНК тимуса теляти (стандартна тест-система), "активовану" ДНК сперми лососю, ДНК фагів Т4, LPP-3, М13 та Я, ДНК P.boryanum, як синтетичні непраймовані системи гоморібополімери, а праймовані - гетерорібо-полімери. ДНК-полімеразну активність in situ визначали безпосердньо в гелі після електрофорезу в нативних умовах за методом Karaway & Wilson [1982].

Нуклеазну акгивність ферментних препаратів визначали з використанням ДНК фага X як субстрата і ДНКази І Є.соІІ як контролю. Електрофорез проводили в 2% агарозному гелі (2 В/см, 4 год.). Протеазну активність тестували за стандартною методикою [Nomoto & Narachashi, 1959]. Контролем слугувала активність протеази жовчі бика.

Фосфотазну активність визначали за Досон и да.[1991]. Як субстрат використано п нітрофенілфосфат, контроль - лужна фосфатаза. ДНК тимуса теляти мітили по З'-кінцю за методом Sambrook et al. [1989]. При тестуванні 3'-5’ екзонуклеазної активності як контроль використовували фрагмент Кленова ДНК полімерази І Е.соІІ та ДНК-полімеразу фага Т4. Для визначення екзонуклеазної активності ферментів в 5'- З' напрямку нативну ДНК фага X мітили по 5'кінцю [Салганик, 1990]. Контролем при визначені даної активності слугувала відповідна активність ДНК-полімерази І Е.соІІ,

Електрофорез в аналітичному режимі проводили в 3-10% поліакріл амідному гелі в нативній системі за Noller [1985]. В препаративному варіанті використовували 4-30% гель з наступною електроелюцією білків з гелю.

Ізоелектрофокусування білків проводили за методом Троицкого и Ажицкого [1982], виділення ДНК ціанобактерії - за Porter [1988] з модифікаціями Менджул и др. [1993], ДНК ціанофага • за Менджул и др, [1992], визначення концентрації білку • за Bradford [1959].

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ІХ ОБГОВОРЕННЯ

Перед початком детальних досліджень властивостей ДНК залежних ДНК-полімераз проведено оптимізацію основних фізико-хімічних параметрів тест-сиетеми для визначення ДНК-полімеразної активності: температури, pH, іонного складу реакційної суміші та часу її інкубації. Встановлено, що при підібраних значеннях тестованих параметрів (температура 43 пС, pH 8,0, концентрація іонів К+ - 50 мМ, Мд2+ ■ 5 мМ,

час інкубації • 45 хв.) вдається приблизно в 10 разів підвищити чутливість ціанобактєріальної тест системи.

З метою відпрацювання процедури руйнування ціанобактеріальних клітин проведено порівняльний аналіз трьох методик : механічного руйнування на гомогенізаторі (МР), ультразвукової дезінтеграції та ферментативного руйнування літичною сумішю з використанням лізоциму. Встановлено, що з числа випробуваних, тільки метод МР забезпечує руйнування ціанобактеріальних клітин більш ніж на 90% з порівняно високим виходом білку (3,24 мг/мл) та питомою активністю кінцевого препарата (14230 од.а./мг білку).

При проведенні очистки ДНК-залежної ДНК-полімерази P.boryarium встановлена наявність в неінфікоеаних клітинах даної ціанобактерії двох форм ферменту. Даний факт підтверджено кількома незалежними методами розділення білків: колонковоі хроматографіі на ДЕАЕ-целюлозі з використанням лінійного градієнту KCL, гель-фільтраціі на колонці з гідроксиепатитом та електрофорезу в градієнтному ПААГ в нативних умовах. При проведенні хроматографіі на ДЕАЕ-целюлозі було виявлено тільки дві групи активних фракцій: одна з фракцій елюювалась 80-100, а друга - 160-180 мМ KCL (мал.1). На профілі елюціі активність представлена двома широкими піками, які не перекривалися з піками білку, що дало можливість в подальшому використати цей метод при отриманні препаратів двох форм ДНК полімерази. Елюція білків з колонки з гідроксиапатитом відбувалась також двома піками - при концентрації елюента 105-110 та 135-140 мМ. Після електрофоретичного розділення сумарного препарату ДНК-полімераз з наступною влюидою білків з гелю і іх тестування на специфічну активність було остаточно доведено, що в екстракті P.boryanum присутні тільки два білки з ДНК-синтезуючою здатністю - з відносною молекулярною вагою 120 та 230 кД.

Розроблений метод одержання двох типів ціанобактеріальних препаратів ДНК-полімераз: частково очищених та очищених для кожної з двох форм ДНК-полімерази неінфікованих клітин ціанобактерії P.boryanum. Встановлено, що завданням досліджень найбільш відповідає такий порядок використання наступних процедур. При отриманні частково очищених препаратів : механічне руйнування клітин на гомогенізаторі, екстракція фермента буфером з KGL (200 мМ) та детергентом (трітон Х-100, 0,1%), преципітація поліетиленгликолем (ПЕГ), гомогенізація преципітату на магнітній мішалці, діаліз та хроматографія на ДЕАЕ-целюлозі (ступінчастий градієнт КСІ). При

в

отриманні очищених препаратів • всі етапи часткової очистки до діалізу включно, потім повторна преципітація поліетиленгликолем з наступною гомогенізацією преципітата, повторний діаліз та препаративний електрофорез. Дані про характеристики етапів часткової очистки ДНК-полімераз Р.Ьогуапит зведені в табл,1

о Білок 2

^ Активність

<о

КСІ

с . ч

в

<0

з

4

Мал.1. Хроматографія на ДЕАЕ-целюлозі сумарного препарату ДНК-полімераз ціанобактерії Р.Ьогуапит

Таблиця 1

Характеристика етапів отримання частково очищених препаратів ДНК-полимераз

Етап Об'єм, мл Білок, Активність, мг од.а. Питома активність, од.а./мг білку Ступінь очистки, рази

Дезінтеграція

клітин 90 10170,0 3021,4 0,05 1,0

Екстракція 180 1044,0 284,0 2,73 54,6

Діаліз 90 232,5 1187,0 5,11 102,2

Хроматографія

ДП І ЗО 30,1 836,1 27,8 556,0

ДП II 20 1,2 1021,3 851,1 17022,0

В результаті проведення часткової та тонкої очистки було отримано по два препарати кожної форми ДНК-полімерази P.boryanum (дві групи активних фракцій після колонкової хроматографії - частково очищені препарати та два активних елюати з ділянок голю - тонко очищені препарати), позначені як ДНК полімераза і (ДП І) та ДНК-полімераза II (ДГ! II). Використання інших прийомів і методів очистки ферментів не призвело до позитивних наслідків.

Поред дослідженням властивостей ДНК полімераз частково очищені та очищені препарати ДНК-полімераз P.boryanum були охарак теризовані за такими параметрами: кількість та молекулярна вага специфічних та неспецифічних білків, наявність або відсутність нуклеазноі, фосфотазноі тй протеазноі активностей, рівень ДНК-полімеразноі активності та вміст нуклеінових кислот. Порівняльний аналіз вказаних характеристик отриманих препаратів ДНК-полімераз Plectonema і аналогічних параметрів ферментних препаратів ДНК-полімераз Anacystis [Lin et aL, 1991], Chlorella [Aoshima et al., 1984J та Cblamidomonas [Ross & Harris, 1978] засвідчив про високу ефективність використаної методики очистки та визначив можливості застосування отриманих препаратів в подальших експериментах.

З використанням частково очищених препаратів визначені основні фізико хімічні пераметри ДНК-полімераз неінфікованих клітин P.boryanum. За допомогою електрофоретичного аналізу в нативних умовах визначена відносна молекулярна вага (Мг) ДП І та ДП 11-120

±10 та 230 *10 кД, відповідно. Такі ж значення молекулярноі ваги досліджуваних ферментів отримані шляхом тестування ДНК-полімеразної активності in situ. Встановлено, що ДП І та ДП II мають близькі термооптимуми полімеразної активності - 43° та 42° С, не втрачають своїх каталітичних властивостей після шестиразового замороджування і оттаювання, а при зберіганні протягом 6 місяців при 40° С втрачають не більш 25% своєї активності. Здатність даних ферментів включати радіомітку при субкритичних і критичних термоумовах (20, 60, 80 і 100 °С) свідчить про можливість їх використання в практичних цілях, зокрема в полімеразній ланцюговій реакції [Elie & Salhi, 1991], Обидва ферменти мають однаковий pH-оптимум прояву ДНК-синтезуючої здатності 8,0. Шляхом ізоелектрофокусування білків сумарного та частково очищених препаратів визначені ізоточки ДП І • 8,6 та ДП II - 6,8 (мал.2). Досліджено вплив одно- (К+) та двовалентних (Мд2+- Мп2+,

Zn2+, Ca2+, Fe2+) катіонів на активність ДГ1 І та ДП II. Дані цієї серії експериментів сумоваиі в табл.2.

о Еілок

О V"IZ' 'JA

З

S

ЛктиЬність

pH"

Номера фракцій

Мал.2. Ізоелекгрофокусування сумарного препарату ДНК-полімераз ціанобактерії P.boryanum

Таблиця 2

Вплив одно- та двовалентних катіонів на активність ДНК-полімераз ціанобактерії P.boryanum

Катіон (мМ) ДП 1 ДП 11

К+ 50,0 50,0

Мд2+ 1,0 5,0

Мп2+ 35,0-55,0 35,055,0

Fe2+ 2,0 2,0

Са2+ 1,5 2,5

Zn2+ 1,0 1,0

Аналізуючи отримані дані, слід відмітити як наявність абсолютної потреби полімеразної активності обох ферментів в присутності катіонів марганцю (більшість відомих ДНК-полімераз е Мд2+-залежними ферментами [Hubscher, 1984]), так і досить високі значення концентрацій цього катіону, що викликають потужне зростання ак-

тивності обох полімеразних ферментів. Після виявлення у даних ферментів екзонуклеазних активностей, встановлено, що присутність 50 мМ Мп2+ е необхідною також для прояву асоційованої з ДП І 5'-3' екзонуклеази та для функціонування обох 3'-5’ екзонуклеаз, асоційованих з ДП І та ДП II. На підставі отриманих даних можно припустити, що мишенню дії даного катіону є сайт зв'язування полімеразних ферментів з матрицею.

З метою вивчення каталітичних властивостей ціанобактеріальних ДНК-полімераз та їх класифікації, проведений інгібіторний аналіз чутливості активності цих ферментів до впливу -ряда стандартних інгібіторів: афідіколіну, нагіідіксової кислоти, N-етилмалеіміду, ЕДТА, спермідину, етідіумброміду та дідезоксинуклеозидтрифосфатів (останні вносили до реакційної суміші у різних співвідношеннях з дезок синуклеозидтрифосфатами). Встановлено, що активність. ДП II, на відміну від активності ДП І, сильно інгібується афідіколіном і N-етилмалеімідом та в більш значній мірі стимулюється спермідином.

З використанням очищенних препаратів ДНК-полімераз P.boryanum досліджені функціональні характеристики ДП І та ДП II: наявність або відсутність у даних ферментів екзонуклеазних активностей, асоційованих з ДНК-полімеразною, специфічність по відношенню до ряду натуральних та синтетичних систем матриця затравка з різною структурою, специфічність до включення в матрицю того чи іншого дезсксинуклеозидтрифосфата. Встановлено, що ДП II та ДП І мають асоційовану коректуючу активність (3'-5' екзонуклеазу), до того ж останній фермент здатний гідролізувати фосфодіефірні зв'язки і в протилежному напрямку, тобто має асоційовану репаругачу активність. Проведено порівняльний аналіз відповідних екзонуклеазних активностей ДП І та ДГ) II з аналогічними активностями ДНК-полімерази І Е.соїі, фрагмента Кленова ДНК-полімерази І Е.соіі та ДНК-полімерази фага Т4 по швидкості вищеплення мітки та по специфічності до дволанцюгової матриці. При вивченні здатності ДНК-полімераз P.boryanum до використання натуральних матриць-затравок з різною структурою (мал.З), ДП іі виявила дуже широку специфічність. Цей фермент виявився здатним використовувати "активовані” і "неактивовані" ДНК фагового та клітинного походження і навіть непраймовані матриці, але останні ■ з низькою ефективністю. Важливо підкреслити, що ДП II виявила високу специфічність (в 5,9 разів вище контролю) до ДНК P.boryanum та ДНК ціанофагу LPP-3 (в 2,5 рази).

Мал.З Специфічність ДНКполімераз P.boryanum по відношенню до натуральних систем матриця-затравка: АСЛ-”активована" ДНК сперми лососю, ЦБ ДНК P.boryanum, Т7- ДНК фага Т7, LPP-3- ДНК ціанофага LPP-3, Л - ДНК фага X, М13 • ДНК фага М13. За 100% (контроль) прийнято активність фермента на "активованій" ДНК тимусу теляти. Активність ДП ! ціанобактерії на фагових матрицях значно нижче її активності в контролі, однак даний фермент ефективно включає радіоактивну мітку в ДНК еукаріотичного походження та ДНК P.boryanum (в 2,6 рази вище контролю). Показано також, що обидва ферменти даної ціанобактерії практично не в змозі використовувати синтетичні непраймовані матриці, а при використанні праймованих систем матриця-затравка, ДП і більш ефективно включає мічені дАТФ та дЦТФ, а ДП Іі - дГТФ. Слід відзначити, що тільки ДП І здатна використовувати синтетичні гетерорібополімери більш ефективно ніж "активовану” ДНК тімусу теляти.

Дані інгібіторного аналізу, аналіз фізико-хімічних та функціональних властивостей ДНКполімераз P.boryanum дають можливість провести класифікацію даних ферментів - визначити іх належність до відомих типів полімеразних ензимів {Hübscher, 19841, Так, ДП II, безумовно, близька до а-ДНК-полімераз, a ДП І е проміжною формою між ДНК-полімеразами а- і ß-типів. У відповідності з іншою відомою класифікацією ДНКполімераз [Blanco, 1991} вдається однозначно класифікувати досліджувані ферменти: ДП II P.boryanum може бути

піднесена до надродини ДНК-гтолімераз, подібних ДНКполімеразі а хребетних, а ДП І - до надродини полімераз, подібних ДНКполімеразі І E.,coli, ДП І виявилась близькою полімеразі Е.соІІ за цілим комплексом ознак: молекулярна вага, наявність асоційованих активностей і їх специфічності, полімеразна матрична специфічність, чутливість полімеразної активності до інгібіторів та ін. Така значна подіібність властивостей цих бактеріальних ензимів обумовлена, можливо, схожістю їх функцій in vivo.

Аналіз результатів власних досліджень властивостей ДНК-полімераз P.boryanum та літературних даних про відомі функції інших полі-меразних ензимів з подібними характеристиками [Краевский и Кухянова, 1984; Hubscher, 1984] дає підстави для висновків про функціональні ролі ДП І та ДП !і в неінфікованих ціанобактеріальних клітинах: головним реплікативним ферментом (репліказою) P.boryanum е ДП II: а ропаруючим, допоміжним ферментом (репаразою) ціанобактерії ДП І.

В клітинах P.boryanum, інфікованих ціанофагом LPP-3, відбуваються різноманітні зміни стану нуклеїнових кислот клітинного і вірусного походження поряд з модифікацією ферментів, які забезпечують відтворення та функціонування даних Сіололімеріа. Раніше показано, що в системі LPP-3-P.boryanum на початку латентного періоду розвитку ціанофага (0,5 ■ 2,5 години інфекції) відбувається, з одного боку ■ деградація клітинної ДНК, а з другого - синтез вірусспецифічної матриці з використанням продуктів гідролізу ДНК клітини-хазяїна. Вірусна ДНК з'являється в ціанобактеріальних клітинах через 2 години інфекції. Починаючи з цього моменту і до кінця латентного періоду включення радіоактивної мітки рееструется лише в складі вірусної ДНК [Калиниченко, 1990J. Можно припустити, що для забезпечення процесу відтворення ДНК LPP-З на початку латентного періоде розвитку фага в клітинах P.boryanum повинна мати місце або вірус детермінована модифікація ДНК-полімеразного екзима клітини-хазяїна, або синтез de novo вірускодованої ДНК полімерази. Слід зауважити також, що обидва процеси в даній вірус-клітиній системі можуть відбуватись одночасно. Наведені нижче результати досліджень свідчать, що саме в даній системі реалізується останній, інтегральний механізм ферментативного забезпечення реплікації вірусспецифічної матриці.

Встановлено, що активність сумарних препаратів інфікованих клітин Р.Ьогуапит, отриманих на різних етапах інфекції (через ЗО та 90 хв після зараження ціанофагом) практично не відрізняється від активності препарата неінфікованих клітин, а активність препарата 150 (проби відібрані через 150 хв) лише на 20% нижче контролю. Після внесення в реакційні суміші інгібіторе ДП II (10 мМ (Ч-етиямалеіміда) динаміка змін активності мала дещо інший характер : в препараті-30 реєструється 30% зменшення активності по відношенню до контролю з інгібітором, а в препаратах, отриманих на більш пізніх етапах інфекції -значне (40%) пригнічення ДНК-полімеразної активності, як по відношенню до активності контрольного препарата та препарата-30, так і по відношенню до активності усіх препаратів без інгібіторе. Саме відсутність різкого підвищення полімеразної активності сумарного препарата-30 без інгібіторе свідчить про те, що якщо в даний період внутриклітинного розвитку ціанофага і відбувається синтез нової ДНК-полімерази, то тільки за рахунок адекватного пригнічення активності однієї або двох ДНК-полІмераз хазяїна. В умовах значного інгібування активності ДП і! (проби з N етилмалеімідом) виявлено, що дійсно має місце швидке (через ЗО хв. після зараження клітин ціанофагом) та ефективне пригнічення активності саме ДП І - клітинної репарази.

Хроматографічний аналіз препаратів неінфікованих та інфікованих ціанобактеріальних клітин виявив наявність змін хроматографічних характеристик ДП І. встановлено також, що в препараті-150 має місце загальне зниження активності ДП І та ДП II. Аналіз активності індивідуальних форм ДП І та ДП И в процесі інфекції (мал.4) також підтверджує, що активність ДП І інгібується вже через ЗО хе після зараження клітин, в той час як активність ДП II залишається на рівні контролю до 2,5 год інфекції.

Електрофоретичний аналіз препаратів ДНК-полімераз неінфікованих та інфікованих клітин ціанобактерії підтвердив вищевикладені дані про якісно різний характер змін активності обох клітинних полімераз протягом латентног о періоду розвитку ІРР-3. Показано також, що вже в препараті-30 мають місце зміни електрофоретичної рухомості ДП 1. Крім того, за допомогою електрофорезу в нативній системі встановлено факт присутності в усіх препаратах інфікованих клітин нового ДНК-полімеразного ензиму (ДНК-полімераза X, ДП X), ак тивність якого досягає максимуме через 1,5 год після початку інфекції.

Очищений препарат ДГ1 X разом о очищеними препаратами ДП 1 та ДП II нєінфікованої культури Р.Ьогуапит було досліджено за основними властивостями. Встановлено, що ДП X має відносну молекулярну вагу 200 *10 кД, pH оптимум прояву ДНК-синтезуючої здатності 8Д термооптимум ■ 43 °С, для функціонування потрєбуе присутності катіонів К+ в концентрації 100 мМ та Мд?+ - 2,5 мМ. Активність фермента суперактивуеться катіонами Мпг+ (45-65 мМ), не пригнічується М-етилмалеімідом та стимулюється спермідином. На відміну від ДП І і ДП II, активність ДП X інгібується налідиксовою кіслотою. На підставі порівняльного аналізу фізико-хімічних, каталітичних та Функціональних характеристик ДНК полімеразних ферментів Р.Ьогуапит можно зробити припущення про вірусспецифічну природу ДП X та її можливі функції в системі ІРР-З Р.Ьогуапит, як реплікуючого фермента. Не виключена можливість, що ДП X забезпечує реалізацію в інфікованих клітинах процесів репарації, оскільки клітинна регіараза функціонально неактивна.

ДП І д㥠II

ЗО 90 150

Час і нсрекціі, хб

Мал.4, Зміни активності ДНК полімераз Р.Ьогуапит в процесі інфекції

Таким чином, результати власних досліджень і дані динаміки син тезу вірусспецифічної ДНК [Калиниченко, 1990] та шляхів синтезу субстратів [Нестерова и др., 1991; Менджул и др., 1991а; Менджул и др., 19916] дозволяють запропонувати найбільш загальну схему формування та функціонування ферментативного реплікативного комплексу в системі LPP-3-P.boryamjm. 8 даній системі вірус-клітина на початку латентного періоде розвитку фага (0,5 год інфекції) водночас відбувається два важливих процеси: трансформація клітинного

реплікативного комплексу шляхом вірусної модифікації репарази (ДП І) та синтез нового фермента - ДП X. Перший процес е важливим для початку вірусіндукованої деградації клітинної ДНК, а другий - для створення нового, вірусспецифічного реплікативного комплексу. Такий ферментативний комплекс забезпечує синтез ДНК LPP-3 (протягом 0,5 2,5 год інфекції) і складається, таким чином, з ДП И як реплікази і ДП X як допоміжного фермента. Важливим е те, що функціонування данного комплексу не лімітується субстратом, оскільки в цей час в клітинах ціанобактерії присутній вільний нуклеотидний пул, який створюється внаслідок деградації хромосомапьної ДНК. Крім того, в інфікованих клітинах Piectonema активізуються і шляхи вірус-спрямованого синтезу de novo пуринів і пірімідинів. Максимальна активність реплікативного комплексу співпадає з піком синтеза вірусної ДНК (1,5 год інфекції), а його розпад відбувається, мабуть, з початком лізису ціанобактеріальних клішн.

ВИСНОВКИ

1. Вперше для трихомних ціанобактерій розроблена методика швидкого і ефективного виділення та очистки ДНК-залежних ДНК полімераз неінфікованих та інфікованих клітин ціанобактерії P.boryanurm, яка полягає в послідовному застосуванні механічного руйнування клітин на гомогенізаторі, екстрагування ферменту буфером з КСІ в присутності детергента, преципітації фермент-нуклеінового комплексу поліетилен-гліколем та препаративного електрофорезу з подальшою електроелю-цією білків з геля. Дана методика дозволяє отримувати очищені більш як в 100 000 разів ферментні препарати з високою питомою активністю.

2. В неінфікованих клітинах Р.Ьогуапут присутні дві форми ДНК-полімерази - ДП І та ДП II з молекулярною вагою 120 та 230 кД, відповідно. ДП І виконує функцію голосного репаруючого фермента та за рядом ознак не може бути віднесена до жодної з відомих родин ДНК-полімеразних ензимів. ДП II є клітинною репліказою альфа-типу.

3. ДП І та ДП II близькі за термо- та рН-оптимумами полімеразної активності, потребою в одно- та двовалентних катіонах, чутливістю до ЕДТА, етідіумброміду, налідіксової кислоти і дідезоксинуклеозид-трифосфатів та здатністю використовувати праймовані рібополімери, проте відрізняються за матричною специфічністю, значенням ізоелектричних точок, чутливістю до афідиколіну, М-етилмалеіміду і спермідмну. ДП І на відміну від ДП Іі, поряд з асоційованою 3'-5' екзо-нуклеазною активністю здатна до гідролізу фосфодіефірних зв'язків і в напрямку 5’ З’.

4. В інфікованих клітинах Р.Ьогуапигп ДП І та ДП II присутні протягом усього латентного періоду розвитку ціанофага ІРР-3. Починаючи з 0,5 год інфекції активність ДП І швидко пригнічується одночасно з зміною ЇЇ каталітичних, хроматографічних та електрофоретичних властивостей. Активність та основні фізико-хімічні властивості ДП II не змінюються на протязі 2,5 год ціанофагової інфекції,

5. В системі Р.Ьо(уапит-1_РР-3 з початком синтеза вірусспецифічної матриці реєструється поява нового полімеразного ензиму - ДП X, активність якого змінюється відповідно інтенсивності синтеза ДНК І.РР-3. ДП X відрізняється від обох клітинних полімераз за молекулярною вагою, потребою в катіонах калію і магнію та чутливістю до налідіксової кислоти, але подібна за термо- і рН-оптимумами, потребою в катіонах марганцю і чутливістю до спермідину.

6. На відміну від усіх відомих ДНК-полімераз, полімеразна активність ДП І, ДП II та ДП X Р.Ьогуапигп піддається супервктивації катіонами марганцю у високих концентраціях (35-65 мМ). Такому ж впливу піддаються екзонуклеазні активності ДП І та ДП II. ДНК-полімерази Р.Ьогуапигп мають здатність функціонувати при високих температурах, що може бути використано в практичних цілях.

СПИСОК ПУБЛІКАЦІЙ ПО ТЕМІ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Суханов С.Н..Нестерова Н,В,,Мєнджул М,И.Физико-химические свой-

ства и чувствительность к ингибиторам ДНК полимераз цианобактерии Plectonema Ьогуапит//Микробиол,журн. 1993. -55, N5.- С.46-56.

2. Суханов С.Н.,Нестерова Н.В.,Менджул М.И. и др. Матричная специфичность и экзонуклеазные активности ДНК-полимераэ цианобактерии Р.Ьогуапит//Биополимеры и клетка.-1993.- 10, N1.- С.76-81,

3. Суханов С.Н.,Нестерова Н,В,.Менджул М.И, Характеристика ДНК полимеразной активности в системе цианобактерия P.boryanum -циано-фаг LPP-3 //Микробиология.-1995.- 64, N1,- С165-172.

4. Менджул М.И..Нестерова Н.В.,Суханов С,Н.Выделение и частичная очистка ДНК-зависимой ДНК-полимеразы из клеток цианобактерии Plectonema Ьогуапит//Микробиол,журн.-1993.-55, N2.-C.46-51.

5. Nesterova N.V.,Mendzhul М.I..Sukhanov S.N. Cyanobacteiial DNA polymerases purified and characteri2ed//Cyanonews. -1992.-8, N1.-P.4.

6. Менджул М.И.,Суханов С,H..Нестерова Н.В, Изменение состояния ДНК-полимеразного аппарата цианобактерии P.boryanum при репродукции цианофага 1.РР-3//Тез.Международ.конф. "Проблемы экологии и биотехнологии в фитовирусологии",Ялта,1994.- С.23.

7. Нестерова Н.В.,Менджул M.I.,Суханов С.М. ДНК-полімерази шанобак* терії P.boryanum //Матеріали VI Українського біохімічного з'їзду-КіВидавництво УСГА.-1992.С.46,

8. M.I.Mendzhul, N.V.Nesterova, S.N.Sukhanov.Pecularities of DNA polymerase activity in the system of cyanophage LPP-3 - cyanobacterium P.boryanum /Матеріали І устан, (VIII) з’їзду УМТ, Одеса,1993 //Мікро-біол.журн.-1994.-56,N 5. -С. 119-120.

9. N.V.Nesterova, S.N.Sukhanov, S.A.Syrchin. Functional properties of DNA polymerases of cyanobacterium Р.Ьогуапит/Матеріали І устан.(VIII)з'їзду УМТ,Одеса,1993//Мікробіол.журн. -1994.-56,N 5.-С.121.

АННОТАЦИЯ

Суханов С.Н.Свойства ДНК зависимых ДНК-полимеваз цианобактерии Plectonema borvanum в норме и пои вирусной инфекции.

Дисертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.06.-вирусология.

Институт микробиологии и вирусологии им.Д.«.Заболотного НАН Украины, Киев, 1996.

Защищается рукопись кандидатской диссертации, которая содержит результаты экспериментальных исследований и их обсуждение в области изучения биологических свойств ДНК-зависимых ДНК-полимераэ цианобактерии Plectonema boryanum в норме и при цианофаговой инфекции. В неинфицированных клетках P.boryanum выделены, детально исследованы и классифицированы две ДНК-полимеразы. В системе LPP-3-P.boryanum в течение латентного периода развития фага появляется новый ДНК-полимеразный фермент и происходят изменения функциональных, каталитических и физикохимических свойств обоих клеточных полимераз. Предложена наиболее общая схема формирования и функционирования ферментного репликативного комплекса в данной вирус клеточной системе.

BRIEF INFORMATION Sukhanov S.N. Properties' of DNA-dopendent DNA Polymerases ot Cyanobacterium Plectonema borvanum in the Intact Cells and Purina Viral Infection. .

The Candidat Thesis for a Philosophy Doctor degree, the speciality

03.00.06 • virology. The Institute of Microbiology and Virology nm. D.K.Zabolotny of the NAS of Ukraine, Kiev, 1996.

Biological properties of DNA dependent DNA polymerases of cyanobacterium Plectonema boryanum in the intact cells and during viral infection having been under investigation and discussion were represented in the Manuscript offered for defending. Two forms of DNA polymerase were isolated, detaily characterized and classified. In the beginning of a latent period of infection process new enzyme appeared in system LPP-3-P.boryanum and changes of functional, catalitical and phisical-chemical properties of both cell polymerases occur. The most general scheme of formation and functioning of replicative apparatus in tested system virus-cell is offered.

КЛЮЧ081 СЛОВА: ДНК-залежна ДНК-пол1мераза, щанобактер^я,

щанофаг, ¡нпб1торний анал1з, система в'фус кл1тииа