Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурные свойства цитохромоксидазы и их связь с функционированием фермента

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Структурные свойства цитохромоксидазы и их связь с функционированием фермента"

-.6; 0 4 9 8

МОСКОВСКИМ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКИМ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГиСУДАКЯВЕНШЯ УНИВЕРСИТЕТ имвн,. М.В. ЛОГОНОСОВА

ФИЗИ1 "5СКИИ ФАКУЛЬТЕТ

На нравах рукописи

БЕРКА ВЛАДИМИР

струю Лине скгствл шохрсмоксидаты и их ^вязь с

ФУНКЦИОНИРОВАНИЕМ ФЕРМЕНТА аз.СЮ.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискании ушной степени кэццидатя физико-матонатичнских нэук

коскяя - 18??.

Работа выполнена на кафедре оиофизики физического факультета Московское государственного университета имени м.В.Ломоносова.

Научный руководитель: доктор физико-математических наук, А.Н.Тихонов.

]

Официальные оппонентыI доктор физико-математических наук, профессор Э.К.Рууге

кандидат оиологичелшх наук В.А.Костырко

Ведущая организация: Институт химической физики

им. Н.Н.Семенова ХАН, г.Москва

Элиста состоится " " ¿¿Ф^Х "1992 года

/л а т '

в '!■ часов минут на заседании Специализировадаого

совета N 3 ОФП (К.063.05.77) в ИГУ ия.М.В.Ломоносова

ю адресу: 119899, ГСП, Москва, Ленинские горы, МГУ, физический

факультет МГУ

С диссертацией мозда ознакомиться в библиотеке физического фисультета МГУ у. 1. И.В.Ломоносоава.

Авторефарат разослан " .¿¿-Ь/и^- " 1992 г.

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Л!СГУАЛЩ&ТЬ_темН. ОсоС5оо место в гагэхоюгизльной цзш юре носа' -электронов прин-щлеж><т одному га наиболее сложных ■еркенгативных комплексов дыхательной цепи - нигохром с оксндаза комплекс IV). Инторес к исследованию этого комплекса оъяснлется тем, что цигохромоксвдаэа обладает важнейшими зтагютнчвскики Функциями, ооесдачивая перенос четырех дш.трс..оз га молеку."/ кислорода. Механизм ?локтгонного переноса отзст в сесл образование ряда ютгермедиэтоа в активном цшггро зрмонта и сопрязсен с трак^окациеЯ протонов поперек :ви. фаны, пжционирспакиз цитохромосидазы возможно гри согласованной збото нескольких субъединиц фермента, влючаювих а сеОя активные .докс-цонтру различной природы. Число субъединиц, входящих в >стаз цжтаср .йссидазы у эукариот достигает тринадцати.

.чшгшзтниз исследования фэрменга, вшолкнниыа в ряда дуо« научных центров, дапг достаточно полную картину руктурной и Функциональной организации цитохромохсидазы. рошо гоуч&на четвертичная структура комплекса, установлен-ннокислотнкй состав отдельных полютеггпдов, входящих в остав гохромоксидазы. Известна тагага локализация редокс-центров в Эъвдиницзх. Достаточно подробно изучено взаимодействие зменга с ого естественным донором электронов - цотохромом с, а езо механизм восстановления кислорода с образованием воды, »ютря на это, остается невыясненным целый ряд вопросов, ¡закных с молекулдркной организацией и №ггосгадий1Юстьн ■злитических процессов з. ЦКТСХрСКСКСЭДЗЗЗ, КОТСрЫЗ «ноет згае значение для Оолоа глубокого понимания механизма хциошрования оггохромоксидэзы.

Исслодовагыэ свойств иитохрококсидазы ооьгшо проводится на выделенном ферменте, солзоошг^зированном в детергентах, или препаратах цигохромоксидазы, встроенных в искусствен) шо меморагошв везикулы (липосомы). Установлено, что часто нзСлэдаемые расхождения результатов., полученных из препаратах цитохромоеидазы, выделенной разными мзтодз?4И, мояет Оьггь обусловлена гетерогенностью препаратов, Такая готерэгпнга ь могшт отражать иалиив ряда фун'ецганзлько знзчгых иетастаоильных конформашгошьгс состояний в нат;тансЯ иитохрснсксидззс, которые "Фиксируется" при выделении фермента. это оостоятельство указывает па иоооходимость дальнейшего Оолое ч п;-тельного исследований сгаОильности препаратов юггохромоксидззы в раствори в зависимости от доторгента, рН, температуры и их взаимодействия с лигакцами. Особый интерес предел эвляэт изучено взаимодействия цигохромоксидазы с поликатион?ки. Известно, что первая стадия взаимодействия фермента с его естественным донором электронов шггохромом с - образование комплекса - определяется аффектом электростатического взаимодействия. В той связи представляете», актуальным исследование влияния кногозарядных катионов, как редокс-неактивных • аналогов цигохрома с, на реакции цитохромоксидазы с лигандами кислород-редуктазного центра, такими как цианид* и с искусственными донорами электронов, которые могут иметь важное значение для выяснения механизма действия формента.

Цоль_рэОоты состояла в экспериментальном исследовании структурных особенностей изолированной цитохромоксидазы, определении функциональных свойств фермента, изучения болок-лилилньгх взаимодействий и их влияния на

электрон-транспортную активность цитохромоксидазы. Ь задачи работы входило:

1) исследование конформационной лаоигыюсти вэд&шндай цитохромоксидазы, солюоилизировашоя а разных детергентах при различных рН, конноП силе и текпрэтуре, с шмся&ю ооткчвскоЯ абсорбционной спектроскопии;

2) исследование взаимодейстзия с ютохроноксидазой спиновых меток различной структуры, широко используемых в качестве индикаторов структурных перестроек ферментов;

3) исследование взаимодействия хелэтороэ и полихатионов на спектральные характеристики фермента.

Измерения проводились в основном на изолированном препарате цитохром с оксидазы, выделенном по метода ИонатзНИ Г1ВШ1. Полученный препарат фермента растворяли в минимальном' оогеме буфера, содержащего ьал НЕРЕБ, О.Б* Тчееп-АО рЛ 7.4, замороживали и хранили в жидком азото. оптические измерения проводили на двухлп/чевом-двухволнозом спектрофотометра ьглюасиш зооо ш/\11Б (Япония). Спектр ЭПР регистрировали нэ спектрометре 3-см Диапазона Е-4 фИрМЫ "УагАап" (США).

На^ушя_новизна_радоты заключается в следу паем:

1) оонэругэш медленные Са2+-назависимыа Изменения спектра поглощения окисленной цитохромоксидазы прл ее взаимодействии с рядом хелеторов (аденоэингр.Цюсф^т, ортофенэнтролин, этила н-диаминтетроацетат и др.);

2) обнаружено стимулирующее действив многозарядкых поликатионов (полшмзин, Са2+, на окислигелыю-восстаювитвльНую активность цитохромоксидазы, обусловленное гйзэтом электростатической экранировки отрицательных зарядов на

повераюсти фермаэта, и ь случае полшизина, сопровождащихсг. конфирмационными изменениями фермента, зтрягиваицими ккслород-радуктазный центр;

о, обнаружена корреляция между термоинлуцированными структурными перестройками оелка в гтгохромоксидазе и ферментативной активностью, что ооусловлено влиянием температуры на оелок-липидныа взаимодействия и четвертичную структуру цитохромоксадазы.

Практическая ценность результатов рзроты. Проведенные в работе исследования углуоляюг наши представления о физико-химических механизмах, лежащих в основе функциональной активности цигохромоксидазы и регуляции раооты фермента, что имеет существпкноо значение для понимания оиоэнаргетических процессов.

Апробация раооуы. Основные результаты диссертационной работы доклада» ались на XI и XII биохшичвскйх съездах ЧСвР (Оломовц, 1969 и Братислава 1990), на V Еврофизической датней васоле (Высокие Татры, 1990), а также на Все союзной школа- юнференции "Магнитный резонанс в биологии и медицине" (Звенигород, 1990К

Оуруктура и оОъем диссертация. Диссертация состоит из введения, оозора литературы, описания материалов и катодов исследования, пяти глав и выводов. Диссертация изложена на ... страницах машинописного текста, оодержкг ... рк^унков и список лшридо^из;';. наименований.

II. СОДЕРЖАНИЕ Р»ВОТЫ.

Во_иво£внки обоаювывается актуаль.юсть работы. Формулируются основные задачи и цели исследован .я, отмечается научная новизна полученных результатов.

№ва„Ь_Об322_лет0ратуры. В глзве наложены современные представления о структура и функциях цитохромоксидазы, рассмотрены процессы электронного и протонного транспорта, катализируемые Ферментом.

С^ва.З-.Матерклу.и^методы^. В этой главе приведена схема выдолнния цитохромоксидазы по методу Уонетани [Уопе1ап1 1960) и описаны методы (оотичэская спектроскопия* ЗПР спокт/х-дапия, микрокалориметрия), использованные в работа д.я регистрации исследуемых процессов.

Данный раздал диссертационной раОоты Ьосвящен иденгиф-пеции состояний окисленной формы выдельнной цитохромоксидаэы на эснсвэнии анализа спектров поглощения фермоота. Учитьшая литературные данные о гетерогенности препаратов цитохромоксидаэы, можно было предположить что формент, хшхЗилгаировани>'й в детергентах, окажотся нестабильным, что. в ;вов очередь, монет проявиться во временных изменениях спектра тоглоыения гема. Такие изменения нами были действигелыю >бкаружэны.

Для проведения этих экспериментов размороженный препарат )Ыделенной цитохромоксидазы помещали в ютету, содеркащую 2.5 мл эответствуицого буфера, спектр исходного оостаяния фермера гринимали зз нулевую линию» записывали его в память прибора, и

следили за развитием спектральных ответов. В ходе этих исследований были сделаны следующие наблюдения.

A) При инкубации обрззца в точении десят::ов минут происходит самопроизвольна изменение спектра поглощения 1*ермента во времени, проявляющееся как в г, так и с« полосах юглощекля гемов (результаты одного из тшич>и»1Х .экспериментов, ¡тоивэдвны на рис.1). Характер изменений спв/стрз поглощения чо зремеки, а таете отсутствие. изобеетичоской точки в разностных сшктрач. свидетельствуют с протекании по меньшей море двух самостоятельных процессов. Один из них характеризуется возникновением минимума с 416 нм, амплитуда которого практически линейно растет во времени без при.ъна.чов насыщения. По-видимому, этот процесс обусловлен частичной денатурацией фермента (потерей гема). Второй процесс, наиболее отчетливо регистрируемый по изменена» спектра при хнакс= 434 нм, достигает устойчивого состояния с характерным временем полупревращения г ^ = 30-40 мин. Этот процесс нз наблюдается ,п присутствии феррицианида, з то врем» как изменения в спектре при *инн~ 41Ь нм нечувствительны к д-йствию форрицианидэ.

.В) Характер изменений спектра поглощения цигохромоксидазы практически не зависит от условий солхйилиээции фермента, и чоспрэизводится как в ионных, так и а ноионных детергентах ;?w-80, Тритон Х-100, холат натрия, додецил мальтозид); изменение солевого состава и замена буферов (Трис, 11EPES, фосфат и т.д.) также почти не влияет- на форму спектра.

B) Проявление спектральной нестабильности цит' <ромоксидазы не иьлявтя следствием р'зэОчвлинки или j имо^живании-j.-v»mvpoxmj'iHHh /¡е'жангь : ->1<;окт н^ол'-дается ' иожсьмделошг.м

350 <,00 ч 430 500

А,нм

еиси Самопр извольньш изменения дифференциального спектра поглощения 1 тохромоксидаэы 1зэ.3 эо времени з полосе. Соре три инкуоэш- в I® им ТЬ'18 буфе} ¡. рН 3.0 с 0.5« Тиееп-бО три тнипврз- ро 26е С. Концентрация 1аач)=1.5 мхМ.

в

(да замораживавшемся) препарате фермента независимо от его концентрации.

Г) Добавление хелаторов (ЭДТЛ, ЭГТА, о-фензнтролин, у ггрилотриацетат) значительно увеличивает амплитуда спектральных изменения.

По наиему мнению, изучаемый ьроцесч, связан с наличием у части молекул цитохромоксидазы редокс-эквиваленгов в кислород-редукгазном центре, что может приводит к возникновению окси- или пероксикшгшекса фермента. НаОлвдаамыв спектральные изменения могут отражать медленный распад такого комплекса. Добавление окислителей (феррицианидэ) предотвращает образование и значительно ускоряет распад оксикомпдекса и способствует образованию галогенной окисленной популяции цитохромоксидазы. Можно пологать, что хедаторы также влияют на стабильнсть кислородсвязыэаюцаго состияния шггохромоксидазы, специфически взаимодействуя с редокс неакгтшми атомами Сих кли Zn. При этом халаторы ингибируют распад оксикомплекса, или стимулируют его образование.

Глэв§ Влияний "оуплексонов га_уитохромоксидаэ^.

В работах Викстрема с иоавторами (iikstrom et al, 1981« 1086) обнаружен "красный" сдвиг в спектра поггощвния восстановленного цитохрома а2+ под действием ионов Дооавдоша хелаторов приводит к обращению эффекта. Нами было найдено, то Сг2+ и хедаторы влияют ка спектр поглощения не только восстановленной, но и окисленной цитохромоксидазы.

Кромо того, в хода исследования, результаты которых изложен.! в Главе 4, нами было обнаружено .медленное

Са2+-нвзависимое изнононке спектра поглощения окисленной ("resting") цитохромоксидазы, индуцирогэнное добавлением гогрокого 1фуга коиплокоонст (ЭДТА, о-фона>ггролинз, ЭГТА, АТР), проявляющееся как н а, так и 7 тюлосах поглощения гемов формата. Медленные спектральные изменения на обращается избытком и проявляются при добавлении эквимолярного

количества ЭДТА к цитохромоксидазэ в присутствии избьгпс'а тков Са24'. Показано, что Г IT А и о-фензнгролин, добавляемые в качестве хзлаторов, взаимозаменяемы: в присутствии одного хелэтора добавление второго не оказошает дальнейшего действия.

Типичный пример влияния ЭДТА на спекчр поглощения цитохромоксидазы в полосе Сора показан на рис.2. Добавление избытка ЭДТА к ферменту в присутствии ионов Са2+ вызывает дзухфазные с-юктральн :е изменения. Чврвп 2 минуты после добавления ЭДТА, возникает симметричный разностный спв'ят с = 423 нм, \ ц * 440 нм, и ае„,„ ■ б мм^см"'. Этот

ПД^С ПИМ 44Q"42S

зффшет обратим добавлением ионов Са2+. Посла часовой инкубации наряду с первоначальным изменением проявляется медленный (tlyz * 30-40 мин.) спектральный ответ с *-иакс •= 413 нм и Л^ин « 4^3-435 нм, имещий изобостическу» точку при л. » 424 нм. Низкие концентрации ЭДТА (10 мкМ), о-фенантролина (0.5 мМ), а таете 3 мМ АТФ (Физиологический регулятор активности цигохрококсКпазы обладающий свойствами комплексона), вызывают чадлэнныв изменения и в о области спектра.

Как известно, цигохромсксидзза кроме родскс- легивных конов учли и гомового яелззз содержит прочно связанные ионы <;их. ма2*. in2* . функция которых нэ соголня но извостнз. Посхолько ЭДТА и о-фвнз)ггрслин обладает высоким сродствсм к пере численна ионам.

.«и

___j_______i----1--

400' 430! 500

Рис.2 Изменений' спектра поглощения шггохрокосвдззы в полооо Соре, вызываемые добавлением зио мм к эдта в присутствии ISO мкМ С'."Л2. Концентрация laa33.4 мкМ. (н¡= (а)-(0) разчостный'спектр медленной компснгчгы.

"Л

Г

Рис^З' Изменения спектра Э1Р спинового зсвда ](1,)4), индуцированные добавлением Н20„(ЗмМ" к препарату цигохрсмоксздазы.

юте

которые на удаляются из форкенга дзжэ диализом против ЗДТА, влияние хедзторов на спектр поглощения щ*гехракахси£аэк дагло Сы быть свнзэнно с тем, что прочно связанные ионы медя, кзгкия» и цинка могли бы выступать в качество центров связывания ЭДТА и других хелзторов, вызынаюш"х изменение конформации а спектральных свойств цигохромоксидазы. Это же относится и к АТФ, который, как известно, связываясь с цитохромоксидазой влияет на структурные и каталитические свойства фермента,

Глава _5г_0гасление_спшовьо^

Для иследования биофизических параметров (рН, мембранный потенциал, кембрз1сноа движение, температура) в клэтках и су бклеточных системах, в том числа ч для изучения конфсрмациснной подвижности цитохромокскдази, часто используются нитроксшгьные спиновые зонды. Использование спиновых зондов требует стабильности этих соединений. Вместе с тем, как было показано в работах Зиаггг ег а!» (1988, 1В39) нмсроксилъные спиновые зонды могут восстановливатья в клыках, при этом возникает диамагнитный гидроксиламкн, Предползгг.зтся, что эта реакция сопряжена с функционированием мйгохондриальной дыхательной цепы и в первую очередь убихинона. Нам представилось вероятным) что стабильность сигналов Э1ГР зондов может определяться такхе вззимодвиствием с кислородными интермедиатами. С зтей целью а качества модельной системы мы изучали реакции нитроксилььш соединений с кислородными интермедиатами цигохромоксидазы, возшкавдлми при- реакции выделенного фермента в растворе и в лигюссмах с г.2,,2кксья водорода. Нами были обнаружены следующие факты.

и

A) Инкубация' спиновых зондов с окисленной цисохромоксидазой в присутствии перекиси водорода сопровождается падечием сигналов ЭПР от нт'роксильных радикалов (рис.3). При инкубации мотки отдельно с ферментом, либо перекисью водорода» спектры ЭПР зондов на изменияюгся. Доказательством того, что потеря парамагнетизма катализируется фермадаом слухат опыты с инактивованой (инкубированной 10 мин. при температуре 7б°С) китохромосидаэой; в этом случае эффект отсутствует» Потери парамагнетизма также на наолвдается, если вместо фермента добавляли альбумин.

Б} Н202-зависимое исчезновение сигнала ЭПР нигроксильных зондов в присутствии фермента годностью подавляется каталазой, а также специфическими ингибиторами цитохромоКсидазы - цианидом и азидом, но нечувствительно к супероксидисмутазе, этанолу, а такае хелаторам: ЭДТА, ВЕТАРАС. Эффект наблюдается как у гдтохромоксидазы в двтергенгном растворе, так и с фермером встроенным в липооомы.

B) Скорость реакции пропорциональна как концентрации цотохромсжсидазы, шрекИсИ водорода так и концентрации зондов.

Г) Скорость исчезновения сигнала ЭПР возрастает по мере удаления паламаГнигИс-о фрагмента вглубь от поверхности мембраш, что соответствует подо*ению радикала в ряду: 1(1,14), 1(6,12), 1(12,3', САТ1а.

Я) рн зависимость реакики имеет колоколобразный характер, с максимумом при рН 6-е.Б, *?го хорошо сог.асуатся с рН зависимое, ью ферментативной активности цитохрсжюксидазы.

Полученные данные позволяет предположить, что наблюдаемый эффект Н^-зависимого Исчезновения сигнала • ЭПР в присутствии цигохромок'-Чдазы связан с функционированием фермента. Разная

/

скорость исчезновение сигнала в зависимости от погружения N-0 групы обозначает, что реакция требует погружения нитрокснльного радикала в липидный бислой, где, как молю полагать, расположен кислорсд-редуктазный центр. У зонда 1(1,14) группа h-Ю находится ближе всех к реакционному центру фермента.

Известно, чго окисленная цитохромоксиязза взаимодействует с HgOg, образуя два спектрально различных соединения: при низких концентрациях перекиси возникает "пероксидный" комплекс, при увеличении концентрации до а 10"3 М, происходит одновалентное востановление пероксидного компекса избытком перекиси с образованием оксоферильного интермэдиата FeIV+=0. Как было подтверждено в нашей работе, в ходе реакции возникает супероксидный радикал Oj,, который мог бы вчаимодействовать с нитроксильными радикалами зондов, и таким образом уменьшать их сигналы ЭПР, вызывая восстановление или окисление нитроке,ильного радикала. Однако результаты опытов в присутствии супероксидксмутазы, а также отсутствие эффекта этанола, удаляющего ОН радикалы (возможный продукт распада супероксидз), свидетельствуют против возможности восстанс-зления зондов радикалами 0¿-ийй продуктами его распада. Представляется более вероятным, что полученные нами данные, объясняются окислением сгшнових зондов при участии оксоферильноги (FaIV=0) интбрмедкатз цитохромоксНдазы. Существенно, что оксоферрилъный комплекс является физиоло i да е ским интермедиа!»! цнгохромоксУдазной реакции, возникающим п нормальных условях работы клетки, стационарная концентрация которого мояет быть достаточно велика в мембране энаргизоаэнных митохондрий. Таким образом, ok¿,слеше нитрокснльных зондов оксоферильным комплексом ц>*гохромоксвдззы

может быть еще одной причиной их нестабильности в опытах с митохондриями или клетками, наряду с описанным рагее эффектом вс^становления зондов на убихиноновом участке дыхательной цепи.

С друюй стороны, из наших экснэримедаов следует, *-сго в отсутствие добавленной перокчси нитроксильные радикалы спиновых зондов остаются стабильными и не окисляются формантом. Это позволило нам в дальнейших оштах использовать спиновые зонды для исследования термоинду цированных структурных изменений цитохромоксадазы,

Глаза___6.___?§ШШа1ШМ___зависимость___структурных____и.

ката^1«вс!^_сво2ств_у.етохромок

Одной из важных задач биоэнергетики является выяснение связи между структурными и функциональными характеристиками э"иргопреобразу одах ферментных комплексов. В этой сгязи прадтавлявг интерес сравнительное исследование температурных зависимостей каталитической активности фермента и некоторых спектральных параметров, Характеризующих термоиндуциров^.иные структурные перестройки, затрагивающие различные области фермента. Полученные нами результтты, наряду с имеющемся Литературными данными, привели час к необходимости изучения температурных зависимостей стоических спо-.тров,

электронгрзнспортдай активности фермента (окислание цитохрома с окиадазой), процесоов агрегации, а также подв.-кности спиновых зондов, сслюбюг;зированных в липидных областях препеарата или ковалет'но связанных с ферментом. В ходе этих исследований были обнаружен!..;

а) тчрмоиндуцирозанные структурные перестройки в

i. 5

цитохромоксид--зе происходящие при 18-20°С и затрагивающие белковую глобулу и ве липидное окружение; эти перестройки но влияют непосредстзешо кэ спектральные характеристики формекга;

б) процасы необратимой ' денатурации цигохромоксидазы начинает проявляться при температурах выше 30°С, эти процессы иницируюгся диссоциацией оубьодиницы III = 43° С) с

последующим образованием агрогатов между субъединицами III. Удаление субъединииы iii вызывает также структурные изменения, затрагивающие не только белковую глобулу фермента, но и непосредственное окружение гема.

Результаты экспериментов, свидетельствующие о существовании структурно-кинетических корреляций в препарате цитохромосидахы, приведены на рис 4. В координатах Аррениуса показаны температурные зависимости параметра 2'Г^ спектра ЭПР липофильного спинового зонда 1(5,10), характеризующего структурные изменения, в липидном окружении белков, спиновой метки NEM-TEMPO модифицирующей тиоловые группы фермента (и служащей, таким образом, источником инфорклми о кои{юрмэционных изменения" белковой глобулы), а тпкже отношение А/В для спектра JHP зонда 1(5,10) и времени вращательной корреляции ic, измеренного для липофильного зонда 1(1,14). Все эти графики имеет общую особенность -• разрывы и "переломы" з области 18-20° С. Этот Факт мояет означать, что структурные изменения при 18-20° С одновременно затрагивает различные области цитохромоксидазы, то есть носят "кооперативный" характер. Именно поэтому спиновые эонды, локализованные в разных местах цитохромоксидазы, как непосредстзешк/ связанные с глобулой, так и находящиеся в ее лигидаюм окружеюч, выявляет структурный пореход в сравнительно

узкой области температуры, 19-~0°С.

Температурные зависимости спектральных параметров 2Т,1. А/В и т0, когорые характеризуют подвижности спиноиих зондов (и соответственно отражают конформационное состояние цитохромоксидазы), коррелируют с Аррениусовой зависимостью Ферментативной активности. Из рис.4L» видно, что температурная зависимость логарифма константы скорости окисления цитохрома с ферментом также имеет четко выраженный перелом при 20°С. Эта коррелация наблюдается для различных спиновых меток, чте укззывэет на взаимосвязь между структурными изменениями различных участков белковой глобулы и ез блихайщвго окружэнкл и функциональной активностью цитохромоксидазы.

При исследовании спектральных изменений цигохромосидэзь; с ростом температуры наблюдается увеличение светорассаяния в суспензией цитохромоксидазы. Это явленно может быть сгязано с образованием агрегатов в растворе. На рис б» ;,-рквая 1.) приведены темрерагурные зависимости параметра лА630-7?0 харатеризущегс aiperanrao фермента (з этой области полностью отсутствует вклад тема в спектр поглощения). Видно, что при температуре около 2б°-30° С становится заметным процесс агрогации = 43° С). Из литературных данных известно, что

при этой температуре происходит отцеггзние субъединицы III. Таким образом, увеличение тепэратурь! вызывает переход некоторых субъвдиниц из натизнсго в денатурировать состояние, что сспрвождается дисс цизциэй и последующий агрогацией отдзлных су С-.единиц фермента между собой, Непосредственным доказательство)., этого служат результаты наших зкеперикгнгов с препаратом цитохромоксидазы, на содержащим субьединицу III

мо-тзо

0.04

002

в

А

о 2

о

о о

/

20

эо

40

о о

50

Рислб Температурная зависимость спектрального параметра аа08о_72(1, характеризующего агрегзцик нативного препарата (кривая 1), и фермента без субъединицы III (кривая 2).

«

Ч мни

ДТ

1 мин

АСК

Рис.« Влия-'ие полилизина (ПЛ> на восстановление цитохухжа а. Концентрация цианидного комплекса окисленной цитохрсмоксидазы 1.3 мкИ. Добавки. ,$Ц) - 2мМ ферроцианкд; (АСК) - 1мМ а^-корбэт; (ПЛ) - 10 1.кмоль/мл полилизин; (ДАД) - 4 мкМ диамидодурен.

(рис.5, кривая 2). Видно, что в таком препарате цитохромокоидазы аграгаиия наступает в области более высоких темг. jparyp 'Л*^,,-52° С). Таким образом, имегно процесс диссоциации субъединиц ill и их агрегации является причиной увеличения мутности сузпонзии сростом температуры.

Кроме того мы измеряли зависимости скорости окисления цитохромэ с и спекграль.гыв изменения а-полосы гема литохрсюксвдэзы, не содержещеЯ субъедикицу 11^, при розных семпературах. В.'ло обнаружено, ^гго удаление cyöi,единицы III ¡ызывзет смещение точки перегиба на графике температурной »азисимссти консташ'ы скорости от 19° 0 к .26° С, а такте »прозаждаотся появлением при этой температура перегиба в .ррениусовой зависимости спектрального параметра (разностный пвктр «20-Ш. км), чеп не наблюдается у нзтивного фермеь.'а. ти данные сввдетпльствуот о том, что удаление суоединшь' Ш ызывзет структурные изменения, который затрагивают на только элковую глобулу фермента, но и непосредственное окружение ема.

...вбестановлтмв ^охромоксвдазы_искуствешА|ми. донорами_электрондв.

Природный донор электронов для цт>хромоксидазы - цигохром - является полочным белком и его связывание с оксидазой имеет изктростчтичоский характер. Из литературных данных известно, •с- некоторые щелочные оелки и полигегггиды, являясь в ■редолонном смысле режже-неакт: зными аналогами цитохрома с, 1КЖ9 могут оказывать сильное влияние на реакционную способность тохромоксидлзы. Например, полилизкн и протамин является

эффективными ингибитора« ютохром с-х;кхкцззной {>е акции (а.л.Константинов. юты. с д^га* стороны, в работе 1А.Мусатов, ' 983! описано ус.кор«нкг связуйз кия цианида с окисленной ци'''о:<ромоксидазой под влияние« 'рада основигл* содкоз. однако механизм этого эффекта оставался кзясдеэс, В этой связи нами было •^поставлено влияние поликатионоз Окшиксин, прогамин) и дзухзарядных неорганических ионов (Со'"'1", М^'*) (к восстановленш цотохрюма а и дыхательную -активность п>ггохрсмоксидазм в присутствии искусственных доноров э ектроноз и на взаимодействие окисленного фермента с нианидом.

Выло обнаружено, что полшмзин резко ускоряет восстановление цитохрома а отрицательно заряженными донорами электронов (аскорбзт и феррсцианид) (рис. 6) и в несколько раз увеличивает фарроцианидоксглдаэную активность цитохромоксидззы, но но оказывает заметного влияния на восстановление цитохрома а с нейтральным донором электронов (ЛАД). В случае окислени° положительно заряженного гексэаммиэкага рутения полимгеин вызывает торможение роакции. Эти »¡фоты достигает насыщения пр" добавлении двух молой полилизинз на моль фермента. Кроме этот, сило обнаружено, . что в тех же концентрациях полилизин стимулирует связывание цианида с окисленной ютохромоксидезоЯ.

Интересно лшю проверить, не оказывают ли аналогичного действия ;тухзалчнгныа катионы (М^ . С а1 ). Было найдено, что ионы кальция и гчтош, подобно гюлилизину. ускоряют восстановление цитохрс>моксвдэзы «•■трицнтелько заряженными донорами, но д то ¡га вр-омя но влияет • на ферроциэнидоксидяэную активность и на взаимодействие Федоть с цианидом.

На основе этлх дчкных кож»'- нр^лгк.лохи-'ь, ьо гарвых, тг~

полилизин, как и двухвалентные катионы Mg24, Са2''.

электростатически взаимодействуют с цитохромосидэзой, зкрашф.уя

отрицательно заряженные группы озлка, скружа.хдао участок

(предположительно место связывания "видимой" меди, ка

котором происходит перекос эле«т;эшв от доноров к оксидазе.

Эффект экранировки позволяет искусственным донорам с

отрицательным зарядом приблизиться к Ферменту, обеспечивая,

таким образом, быстрое восстзнавленке гена а. Во-вторых,

предстазляется вероятным, что толикатионы (полилизин, протсмии,

иитохром с), в отличие от ионог Сэ2+, tig2*, вызывают болзэ

глубокие (конформационные) изменения, затрагивающие нз только

окружение тема а, но и кислород-рбдуктэзныЯ центр (a^-CUg)

цитохромоксидазы, (переход в так называемую "'ткрьггую" форму).

i

III. выводи.

1. К-;Д8донны" препарат "окисленной" щтеохромоксмдэзы в детергенгном растворе представляет собой reTepoi энную популяцию (смесь нескольких форм фермента), взаимопразр.щсния которых характеризуются медленными изменениями спеетрз поглсвдэтш {юрмента. Эти юменения не зависят от состава • среда эолюбилизации фермента и наблвдаются при различных детергентах (Tween-80, Тритон Х-100, хола^ натрия), буферах (TRIS, KETES, >ртофосфат) и ионной сила.

2. Обнаружены медленные изменения спектра поглощения жислешой цитохромоксидазъ., индуцированные комплакоонамм, з том теле АТР. Предполагается, что хелаторы могут свяэыва.ься с )ормантом и вызывать конформационные ■ перестройки

цитохромокидазы. Медленные кон{ормационные изменения цитохромоидазы под действием хелаторов, указывают нч возможность регуляции фермента физиологически активными веществами, сЭладаицими свойствами комплексонов (AT). Предполагается, что центрами взаимодействия цотохромосидазы с комплесонами служат прочно связанные редокс-неатыныь ионы (Cux, Mg, Zn),

3. Показано, что нигроксильные спиновые зонды стабильны при аэробной инкубации с окисленной цитохромоксидазой, но достаточно эффективно окисляются оксоферрильшм комплексом фермента. Результаты сравнительного исследования кинетики окислния спиновых зовдов различной структуры согласуются с данными о локолизиации кислород-родуктазного цеотра фермента в глубине липидного бислоя. Взаимодействие нитроксильных радикалов с окооферрильным комплексом может быть одной из причин нестабильности спиноаих зопдов в огагтах с митохондриями или клетками.

4. Методом спиновых зондов обнаружены термоиндуцированные структурные перестройки в ичтохромоксидазе, происходящие при 18-20° С, которые одновременно затрагивают белковую глобулу и ее липидное окружение^ Эт" перестройки че влияют непосредственно на спектральные характеристики цитохромоксидазы, но коррелируют с тормоюодцирова^ми изменрни^ми ферментативной актичости. Можно предположить, что регуляция активности фермента может сыть реализован? в цитохромоксидазе на уровне белок-липидных взаимо^ей твий.

5. Процессы необратимой денатурации цитохромоксидазы при ч'омперату. ах выше 30° С инишруюгся диссоциацией субъединицы III

= 43° С). Удаление субъединицы III вызывает изменения в

непосредственном окружении тема.

б. Обнаружен эффект стимуляции активное .'и щ 'охромоксидазы под действием поликатионов (поли-иэин) и двухвалентных катионов

о«. р |

(И^ , Са ' }. Показано, что влияние м"огозарядных катионов на окиолттгельно-посстановительные свойства цитохромокепдазы обусловлено, а первую очередь, эффектен электростатической з!фан:гр01!кн отр!щзтелъкых зирядов . на поверхности фермента, облегчяклеЯ отрицат -льно заряженным декора элзкггрока восстэкоалзниа тема а. Наряду с этим действием, поликатиокы (в от .тачка <т ионов лвухвалени&к металлов) вызызакя1 допол!мтсЛънь!о суш,ествс.[кь!е изменения фермента, эатрагиза..<диь не только оруление гема а, но и кислород-редуктэзшй (а3-Сив) центр.

ссН0ВШЕ_геЗУЛЬТАТЫ диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Konstantlnov.A. .Vygodina.T., Pcpova.K., BerkaMu.satov.A.: "Spektral .'ihlfts ol cytochome с oxidase lnduced by comploxons" t'EBS Lett.. 245 (1-2), 1989, 39-42

2. Мусатов А.П., Взгеловз Я., ВеркаВ^, " Свя?ывание цианида < гормичеекч обработлной нитохромоксидазой - кинетический и

' рокалориметрический ■члиС, Тезисы док-адов XI биохимического «зда ЧСФР. Оломовц, в9 г.

Берка В., Тихонов д., Вы година Т.П., Константинов A.A. 'Окисление нитрон- ьнух . ггюювых юндов гжсу^рилькым

комплексом ищохром о окоидазы", Тезисы докладов Всесоюзной щхолы-конференики "Магнитный'рззонанс в биологии и медицине", Звенигород, 1990 г.

4. Кусатов А.П., Берка__В., Константинов A.A., "Спектральная нестабильность окисленней цдаохромоксидазы", Тезисы докладов XII биохимического съезда ЧС5ФР, Братислава, 19У0 г.

5. Tichoncv.A.A., Fabian,М., "Thema J у induced Chartas In isolated cytochrome oxlto.se", 5th Europhyslcs summer school. High latras, Europhyslcs Conference Abstracts, Vol.UK, 1590, p. p.39-40.

5. MycaTOD А.П., . Варка__Вл, Ксензенко M.S. Еь:годи: э T.B., Константинов A.A., "Влияние поликатионоа на взаимздийтзиэ цигохромоксидазы с искусственными донорами элеотронов и цианидом", Виологичес5сио кембрзкы, T.S, был.З, Hi91, стр. 2Ä9--234.

7. Вегка_Ул, Tichonov A.A. Svarcberger J.. агЛ Fabian М "Dependence or structural, spectral arid agregattonal properties of resting cytochrome с oxidase", Biochen. Blophys. Acta, 199.. (In press).