Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Cтруктурные основы функционального разнообразия протеолитических ферментов

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Cтруктурные основы функционального разнообразия протеолитических ферментов"

На правах рукописи

ДЕМИДЮК ИЛЬЯ ВАЛЕРЬЕВИЧ

СТРУКТУРНЫЕ ОСНОВЫ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО РАЗНООБРАЗИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ

03.01.06 — Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

2 О СЕН №

Москва - 2012

005047102

005047102

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте молекулярной генетики Российской академии наук

Научный консультант:

член-корреспондент РАН, Костров Сергей Викторович

доктор химических наук, профессор

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАН, доктор химических Кочетков Сергей Николаевич

наук, профессор, заведующий лабораторией

молекулярных основ действия физиологически

активных соединений Института молекулярной

биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

доктор химических наук, профессор, Ротанова Татьяна Васильевна

ведущий научный сотрудник лаборатории

химии протеолитических ферментов Института

биоорганической химии им. академиков

М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

доктор биологических наук, профессор, Машко Сергей Владимирович

директор по научной работе ЗАО «Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика»

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт физико-

химической биологии им. А.Н. Белозерского, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится 29 октября 2012 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 212.120.01 при Московском государственном университете тонких химических технологий им. М.В.Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр-т Вернадского, д. 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр-т Вернадского, д. 86.

С авторефератом диссертации можно ознакомиться на Интернет-сайте ВАК РФ: http://vak.ed.gov.ru

Автореферат разослан « // » сентября 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук, старший научный сотрудник

Лютик А.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Белки выполняют огромное количество различных функций в каждом живом организме. Вопрос о структурных основах такого функционального многообразия вот уже несколько десятилетий является одним из центральных пунктов науки о белке. Однако, несмотря на достигнутые успехи, мы еще очень далеки от настоящего понимания структурно-функциональных взаимосвязей в белковых молекулах. В то же время изучение молекулярных механизмов функционирования имеет не только фундаментальное значение. Белки все шире используются человеком не просто как необходимый компонент рациона, но как способные направленно действовать агенты, прежде всего как промышленные катализаторы и лекарственные средства. В этом контексте знания о структурных основах функционирования - ключ к созданию белковых молекул, обладающих оптимальными для решения прикладных задач свойствами. Кроме того, все более широкое развитие получает направленное конструирование лекарств, для которого информация о структурных детерминантах в молекулах белков-мишеней имеет принципиальное значение.

Среди всего многообразия белков особое место занимают ферменты - белки-катализаторы. С одной стороны, они обеспечивают протекание ключевых биохимических реакций, а, с другой стороны, использование ферментов является одним из основных направлений современной биотехнологии. По имеющимся прогнозам мировой рынок промышленных ферментов достигнет к 2015 году объема в 3,74 миллиарда долларов США. Основными отраслями, в которых используются ферменты, сегодня являются пищевая и текстильная промышленность, индустрия моющих средств, а также медицина и производство косметических средств. В последние годы наметилось заметное увеличение выпуска ферментов в связи с бурным ростом производства биоэтанола. Промышленное использование ферментов расширяется, в значительной степени, за счет применения инноваций, которые основаны на исследованиях структурно-функциональных взаимосвязей в молекулах белков. Такие исследования дают возможность модифицировать свойства индустриальных ферментов, добиваясь повышения их активности и удешевления целевых продуктов, а также позволяют получать новые рекомбинантные ферменты с заданными свойствами.

Протеазы - белки, катализирующие гидролиз пептидной связи, наряду с большим прикладным значением (они составляют самый крупный сегмент мирового рынка ферментов), играют важную роль в живых системах. Протеазы не просто являются ферментами деградации, вовлеченными в катаболизм белков, но и осуществляют высокоспецифичное расщепление пептидных связей - протеолитический процессинг. Последний определяет активацию или инактивацию различных ферментов, цитокинов, ростовых факторов и гормонов, а также внутри- или внеклеточную локализацию многих белков. Таким образом, в той или иной степени под управлением протеаз находятся едва ли не все биологические процессы, включая, среди прочих, клеточную пролиферацию и диф-ференцировку, миграцию клеток, апоптоз и ангиогенез. Неудивительно поэтому, что протеазы вызывают неослабевающий интерес.

Сочетание высокой практической значимости и важной биологической роли про-теолитических ферментов стало одним из основных факторов, определивших выбор протеаз в качестве объекта исследования в данной работе, направленной на выяснение новых механизмов функционирования белков.

Цель и задачи работы. Целью работы является изучение молекулярных механизмов, определяющих функционирование протеолитических ферментов.

В ходе выполнения работы решались следующие задачи:

- построение экспериментальных моделей для исследования молекулярных механизмов функционирования белков на основе химотрипсинподобных и термолизинподобных протеаз (ТПП);

- разработка подходов к экспрессии протеаз, синтезируемых клеткой в виде предшественников;

- исследование роли в распознавании субстрата глутамилэндопептидазой Bacillus intermedins консервативных остатков субстратсвязывающего центра;

- исследование функций пропептида и механизма созревания предшественника глута-милэндопептидазы В. intermedins;

- разработка прототипа ферментного препарата для улучшения качества мясного сырья;

- биоинформатический анализ структуры предшественников ТПП;

- изучение функций и механизмов действия пропептидов ТПП;

- определение пространственной структуры предшественника ТПП;

- исследование биологических функций протеализина.

Научная новнзна. В рамках данной работы получены оригинальные данные о механизмах функционирования химотрипсинподобных и термолизинподобных протеаз. Все результаты исследования являются новыми. В том числе:

- охарактеризованы новые протеолитические ферменты;

- впервые изучена функциональная роль консервативных остатков субстратсвязывающего центра глутамилэндопептидазы В. intermedins;

- впервые идентифицирована новая группа термолизинподобных протеаз с короткими N-концевыми пропептидами;

- впервые изучены функции коротких N-концевых пропептидов термолизинподобных протеаз и механизм их удаления;

- впервые для металлопротеаз продемонстрирован эффект «белковой памяти»;

- установлена пространственная структура предшественника протеализина - первая структура предшественника ТПП и первая структура протеазы с коротким N-концевым пропептидом;

- впервые продемонстрировано, что ТПП с короткими N-концевыми пропептидами могут определять инвазию клеток эукариот бактериями.

Практическая значимость.

Полученная в ходе работы информация о молекулярных механизмах функционирования протеаз может быть использована для конструирования ферментов с направленно измененными свойствами.

Практическую ценность имеют также реализованные в работе методы получения протеолитических ферментов в гетерологичных экспрессионных системах на основе клеток Е. coli и В. subtilis. В частности, оригинальный подход для получения синтезируемых в виде предшественников протеаз с узкой субстратной специфичностью, который основан на создании автопроцессирующихся ферментов путем направленной модификации сайтов их процессинга.

Значительный практический интерес представляют охарактеризованные в работе новые протеолитические ферменты и их штаммы-продуценты. Так, глутамилэндопеп-тидаза В. intermedins может быть использована для ограниченного протеолиза полипептидов при определении первичной структуры, доменной организации и идентификации белков, а также для сиквенс-специфического гидролиза слитых белков и получения биологически активных пептидов. Способность протеализина разрушать соединительную

ткань животных при низкой положительной температуре позволяет, в перспективе, использовать этот фермент в различных приложениях, например, при получении культур клеток и тканей животных.

Потенциал иротеализина в качестве промышленного катализатора демонстрирует созданный в ходе работы на основе рекомбинантного протеализина прототип ферментного препарата для улучшения качества мясного сырья в пищевой промышленности. Разработанный препарат протестирован в условиях опытного производства. Показано, что его использование способствуют формированию более высоких качественных показателей готовых продуктов мясопереработки.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. На основе охарактеризованных в работе новых термолизинподобных и химотрипсин-подобных ферментов, их клонированных генов и экспрессионных систем создана экспериментальная модель для исследования молекулярных механизмов функционирования протеаз.

2. Консервативный элемент субстратсвязывающего центра гутамилэндопептидаз - остаток His213 не является основным элементом распознавания заряда субстрата ферментами группы и, по-видимому, для каждой эволюционной ветви Glu-специфичных протеаз характерна своя система компенсации заряда.

3. Идентифицирована новая группа термолизинподобных протеаз с короткими N-концевыми пропептидами. Изучена структурная организация представителей группы. Установлена пространственная структура предшественника протеализина — первая структура предшественника пептидазы семейства М4 и первая структура протеазы с коротким пропептидом. Показано, что протеазы группы протеализина могут определять инвазию клеток эукариот бактериями.

4. Разработан прототип ферментного препарата для улучшения качества мясного сырья в пищевой промышленности.

Личный вклад автора. Автору принадлежит решающая роль на всех этапах работ по исследованию глутамилэндопептидаз и на большинстве этапов исследования пептидаз семейства М4 — от постановки задачи и планирования экспериментов, до анализа, обобщения и представления полученных результатов. Экспериментальный материал преимущественно получен при непосредственном участии автора и под его научным руководством. При разработке ферментного препарата эксперименты по исследованию его действия на мясное сырье осуществлены сотрудниками Всероссийского научно-исследовательского института мясной промышленности им. В.М. Горбатова Россельхозакадемии. Рентгеновские данные с кристаллов протеализина собраны в Курчатовском центре син-хротронного излучения и нанотехнологий, а их обработка осуществлена сотрудниками Института кристаллографии РАН. Эксперименты по изучению вовлеченности протеализина в бактериальную инвазию и действия протеализина на актин проведены сотрудниками Института цитологии РАН.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на 37 конгрессе IUPAC (Берлин, 1999), международной конференции «Biocatalysis 2000: Fundamentals & Application» (Москва, 2000), III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), научно-практической конференции «Современное состояние российской биотехнологии» (Пущино, 2003), международном конгрессе «Biotechnology: State of the Art and Prospects of Development» (Москва, 2003), конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2004), всероссийском симпозиуме «Биотехнология микробов» (Москва, 2004), XIII Международной конференции «Ферменты

микроорганизмов: структура, функции, применение» (Казань, 2005), II российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Санкт-Петербург, 2005), 30 конгрессе FEBS (Будапешт, 2005), IV, V и VI симпозиумах «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 1997, 2002 и 2007), международной конференции «Протеолиз, механизмы его регуляции и роль в физиологии и патологии клетки» (Минск, 2007), I международной научно-практической конференции «Микробная биотехнология - новые подходы и решения» (Казань, 2007), всероссийской научной конференции «Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в АПК России» (Санкт-Петербург, 2008), международном симпозиуме «Biological Motility: Achievements and Perspectives» (Пущино, 2008), VI и VII национальных конференциях «Рентгеновское, синхротронное излучения, нейтроны и электроны для исследования наносистем и материалов. Нано-Био-Инфо-Когнитивные технологии» (Москва, 2007 и 2009), III, IV и V российских симпозиумах «Белки и пептиды» (Пущино, 2007; Казань, 2009; Петрозаводск, 2011).

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 254 страницах, содержит 84 рисунка и 15 таблиц. Работа построена по традиционной схеме и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы и список литературы (544 источника).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 25 оригинальных научных статей, 5 обзоров, а также свыше 70 тезисов научных докладов. По результатам работы получен патент Российской Федерации.

Работа выполнена при участии Московского государственного университета тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова, Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Казанского (Приволжского) федерального университета, Государственного научно-исследовательского институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (Москва), Института кристаллографии РАН (Москва), Института цитологии РАН (Санкт-Петербург), Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (Москва), Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (Москва), Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН (Пущино), Филиала института химических проблем химической физики (Черноголовка), Всероссийского научно-исследовательского института мясной промышленности им. В.М. Горбатова (Москва), Курчатовского центра синхротронного излучения и нанотехнологий (Москва).

Работа проводилась при поддержке РФФИ (гранты 97-04-50162-а, 00-04-48280-а, 00-04-48281-а, 00-04-48320-а, 01-04-06083-мас, 03-04-48754-а, 03-04-48755-а, 06-04-08123-офи, 06-04-48678-а, 09-04-00734-а, 12-04-00961) и программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Структурные детерминанты строгой субстратной специфичности гпутамилэндопептидаз 1.1. Создание модели исследований

Наиболее эффективным подходом к исследованию молекулярных механизмов функционирования белков является сегодня использование методов белковой инженерии. Применение этой стратегии для изучения механизмов, лежащих в основе строгой субстратной специфичности глутамилэндопептидаз (ГЭПаз), диктует свойства необходи-

мой экспериментальной модели. Такой моделью может стать охарактеризованный с биохимической точки зрения белок, ген которого клонирован, секвенирован и экспрессиро-ван в удобной для генно-инженерных манипуляций гетерологичной системе. Поскольку анализ литературных данных показал, что наиболее перспективными объектами исследований являются глутамилэндопептидазы грамположительных бактерий, нами были осуществлены работы по характеристике и клонированию генов ГЭПаз из этой группы микроорганизмов.

В качестве модельного объекта для исследований молекулярных механизмов функционирования ГЭПаз нами была выбрана ранее охарактеризованная сотрудниками Московского и Казанского государственных университетов глутамилэндопептидаза из В. intermedins 3-19 (BIGEP). Совместно с сотрудниками МГУ и Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов нами были осуществлены работы по клонированию, секвенированшо и экспрессии гена BIGEP, а также разработана схема очистки рекомбинантного белка.

Ген глутамилэндопептидазы был клонирован из геномной библиотеки В. intermedins 3-19 и секвенирован (номер доступа в базе данных GenBank— Y15136). Анализ выведенной из нуклеотидной последовательности первичной структуры BIGEP показал, что ген кодирует предшественник фермента содержащий, кроме участка соответствующего каталитическому домену, сигнальную последовательность и про-пептид. Последовательность зрелой BIGEP оказалась наиболее близкой к первичным структурам бациллярных ферментов, сходство с белками стафилококков, стрептомицетов и вирусов было значительно ниже. На основе сравнения первичных структур ГЭПаз были идентифицированы остатки активного центра BIGEP и высказано предположение, что BIGEP и другие бациллярные ГЭПазы имеют сходную организацию S1 участка и механизм компенсации отрицательного заряда субстрата.

Нами была осуществлена гетерологическая экспрессия гена BIGEP в клетках В. subtilis, а также разработана схема очистки белка из культуральной жидкости рекомбинантного продуцента и получен электрофоретически гомогенный препарат фермента. Аминоконцевая последовательность рекомбинантного белка была идентична определенной ранее для природной BIGEP, установленная методом электрофореза молекулярная масса (23,5 кДа) хорошо совпадала с расчетной, а удельная активность протеазы соответствовала установленной ранее для природного фермента.

Таким образом, нами был клонирован, секвенирован и экспрессирован в клетках В. subtilis ген BIGEP. Разработана схема очистки рекомбинантного белка и продемонстрировано, что по своей структуре и свойствам он соответствует природному белку. Полученные результаты были использованы при решении простанственной структуры белка, а также позволили применить BIGEP в качестве модельного объекта для исследования молекулярных механизмов функционирования ГЭПаз.

1.2. Модификация субстратсвязывающего сайта глутамилэндопептидазы В. intermedius

Наиболее интересным аспектом функционирования ГЭПаз является их строгая специфичность к гидролизу пептидных связей, образованных а-карбоксильными группами отрицательно заряженных аминокислотных остатков. Кажется очевидным, что для узнавания заряда в молекуле субстрата S1 участок фермента (обозначение по Шехтеру и Бергеру) должен нести компенсаторный заряд, как показано для целого ряда случаев. Однако у ГЭПаз обнаружить консервативный силыюосновный остаток в S1 кармане не удается.

Таблица 1. Значения Км и kcal при гидролизе Z-AALE-pNa нативной и модифицированной глутамилэндопептидазой В. intermedins*

К,,, мМ к -С"1 cat'

Нативная BIGEP 0,67 16,6 24776

Модифицированная BIGEP-T213 3,3 0,027 8,2

* Стандартное отклонение представленных значений Kj^ и к не превышает 10%.

В то же время рентгеновские структуры, молекулярное моделирование активных центров этих ферментов, а также эксперименты по их направленной модификации демонстрируют, что His213 (нумерация по химотрипсину) - остаток, существенный для функционирования ГЭПаз. Этот остаток, являющийся общей структурной особенностью всех ферментов данной группы, способен нести положительный заряд, и поэтому His213 приписывалась роль наиболее вероятного ключевого элемента в распознавании субстрата ГЭПазами.

Гипотеза требовала экспериментальной проверки, однако получить ГЭПазу с заменой в положении 213 другим исследователям не удавалось. Данные, полученные до начала наших работ, демонстрировали чрезвычайную чувствительность ГЭПаз к природе аминокислотного остатка в положении 213. В связи с этим мы подошли к выбору аминокислотной замены с особым вниманием. Анализ первичных и пространственных структур химотрипсинподобных протеаз (ХПП) показывает структурное сходство регионов 208-214, вовлеченных в формирование S1 участка ГЭПаз, у всех ферментов группы. Причем среднеквадратичное отклонение Ca атомов остатка 213 не превышает 0,564 А в 13 пространственных структурах ХПП млекопитающих, бактерий и вирусов. Среди этих 13 ферментов, не проявляющих Glu-специфичной активности, шесть имеют Val, пять-Thr и по одному - Leu и Met в 213 положении. Исходя из этих данных, можно сделать вывод, что Thr и Val являются наиболее многообещающими нативоподобными заменами для His213. Из этих двух вариантов нами был выбран Thr, поскольку введение мутации, соответствующей замене His213—»Val, в ген ГЭПазы Streptomyces gríseas не позволило получить мутантный белок в экспресснонной системе, аналогичной примененной нами.

Нами был сконструирован и экспрессирован в клетках лабораторного штамма В. siibtilis AJ73 ген BIGEP с двумя нуклеотидными заменами, соответствующими модификации His213—>Thr. Активный мутантный белок накапливался во внеклеточной среде. Электрофоретически гомогенный мутантный фермент (BIGEP-T213) был выделен из культуральной жидкости. Молекулярная масса BIGEP-T213 (23 кДа) и N-концевая последовательность (VVIGD) были идентичны установленным ранее для нативного белка.

Мутантный фермент гидролизовал азоказеин с удельной активностью 0,6 Ед./мг (для фермента дикого типа 36,8 Ед./мг) и специфический субстрат ГЭПаз Z-AALE-pNA (удельная активность 0,16 Ед./мг), но не специфические субстраты химотрипсина (Glp-AAL-pNA) и трипсина (Bz-R-pNA). BIGEP-T213 полностью сохранял активность при инкубации в течение 150 мин при 50°С. Потери активности не наблюдалось также при хранении модифицированного фермента при 4°С в течение 10 месяцев. Таким образом, нами впервые была получена ГЭПаза с заменой в положении 213 и показано, что модифицированный фермент проявляет каталитическую активность и высокую стабильность.

Субстратная специфичность BIGEP-T213 была оценена по гидролизу окисленной B-цепи инсулина. С помощью масс-спектрометрии и N-концевого секвенирования показано, что в результате действия фермента на субстрат образуется только два фрагмента, соответсвующих гидролизу связи Glul3-Alal4. Каталитические свойства нативной и му-тантной BIGEP были изучены по гидролизу Z-AALE-pNa (табл. 1).

Полученные данные демонстрируют, что введение замены His213—>Thr в молекулу BIGEP не приводит к изменению субстратных предпочтений фермента, что позволяет сделать вывод о том, что His213 не определяет специфичность действия протеазы. В то же время модификация существенно влияет на эффективность катализа. При этом введенная замена относительно мало сказывается на константе Михаэлиса (увеличение Км в 4,9 раза), но сильно влияет на каталитическую константу (уменьшение kcat в 615 раз). Интересно, что примерно такой же эффект наблюдается в случае гидролиза нативными ГЭПазами субстратов, содержащих остаток Asp в положении Р1: Км растет примерно в 6 раз, а падение kcat имеет тот же порядок (-150 раз).

Таким образом, результаты проведенного исследования позволяют заключить, что консервативный остаток His213 не является ключевым элементом, определяющим распознавание отрицательного заряда боковой цепи остатка в положения Р1 субстрата ГЭПзами, но, по-видимому, существенен для точного позиционирования расщепляемой связи относительно нуклеофила — кислорода гидроксильной группы серина каталитического центра. Этот вывод предполагает, что для обеспечения субстратной специфичности ГЭПаз, кроме His213, необходим дополнительный структурный элемент. Анализ пространственных структур ферментов группы показывает, что таким элементом в случае BIGEP и протеазы V8, по-видимому, является а-аминогруппа N-концевого остатка фермента, формирующаяся лишь после удаления пропептида.

Для выяснения роли N-концевой аминогруппы в функционировании ГЭПаз может быть предложено два подхода. Первый заключается в получении вариантов зрелых ферментов с модифицированными N-концами. Поскольку удалить N-концевую аминогруппу белка не представляется возможным, то она либо может быть модифицирована химически, либо N-конец фермента может быть удлинен/укорочен на несколько аминокислотных остатков. Второй подход состоит в подробном исследовании механизма созревания ГЭПаз и поиске ответа на вопрос о субстратной специфичности предшественника.

1.3. Получение глутамилэндопептидазы В. intermedias с удаленными N-концевыми остатками

Аминоконцевой остаток Val 1 в молекуле BIGEP расположен непосредственно в суб-стратсвязывающем участке, следовательно, введение дополнительных аминокислотных остатков на N-конец молекулы наиболее вероятно приведет к нарушению/перестройке S1 сайта и потере ферментом активности. Действительно, все известные в настоящее время варианты протеазы V8 с удлиненным N-концом, получающиеся в результате расщепления предшественника (у этого фермента Vail также является элементом S1 участка), не обладают протеолитической активностью. Принимая во внимание высказанные соображения, можно полагать, что и химическая модификация аминогруппы Vail приведет к аналогичным результатам, поскольку вводимые на N-конец фермента заместители будут также локализованы непосредственно в S1 регионе. В то же время, вероятно, оценить влияние аминогруппы Vail на каталитические свойства белка можно, удалив один или несколько N-концевых остатков, как бы отодвинув аминогруппу от субстратсвязываю-щего участка.

Для реализации данного подхода нами была использована очищенная рекомби-нантная BIGEP, продуцируемая клетками В. subtilis. С целью удаления N-концевых аминокислотных остатков ГЭПаза была обработана аминопептидазами, проявляющими предпочтение к гидрофобным остаткам: лейцин-аминопептидазами из Sir. griseus и почек свиньи, а также аминопептидазой Aeromonas proteolytica. После обработки ами-нопептидазой A. proteolytica BIGEP демонстрировала практически полную потерю

протеолитической активности. В то время как при обработке двумя другими аминопепти-дазами подобного эффекта не наблюдалось. При этом по результатам электрофоретиче-ского анализа количество ГЭПазы и ее молекулярная масса оставались неизменными во всех препаратах. Полученные препараты были очищены от аминопептидаз и продуктов гидролиза методом гельпроникающей хроматографии, а затем изучены их структура и ферментативные свойства. Структуру всех полученных вариантов BIGEP анализировали методом MALDI-масс-спектрометрии трипсиновых гидролизатов белков. Было установлено, что под действием ферментов из Str. griseus и почек свиньи структура ГЭПазы не меняется. В то же время, после обработки аминопептидазой /). proteolytica формировался белок (BIGEP-AP), N-концевым остатком которого был Gly4. Детектировать активность очищенной BIGEP-AP по гидролизу азоказеина и специфического субстрата Z-Glu-pNA не удавалось.

Для анализа специфичности BIGEP-AP был использован набор гептапептидных субстратов с внутримолекулярным гашением флуоресценции. Данные пептиды имели общее строение (E(Edans)-AAXAA-K(Dabcyl)-NH,), включая при этом различные аминокислотные остатки в положении 4 (X): Glu, Gin, Leu, Thr, Lys, Val, Ser и Ala. Однако ни в одном случае детектировать активность BIGEP-AP не удалось.

Потеря активности BIGEP при удалении первых трех аминокислот подтверждает важность N-концевых остатков для функционирования фермента. Вероятно, эффект связан с нарушением структуры субстратсвязывающего участка. В то же время, возможно, что модификация аминоконцевой области влияет на пространственное расположение остатков, формирующих каталитический центр. Полученные данные, однако, не дают ответа на вопрос о роли a-аминогруппы Vail в распознавании заряда субстрата, что вызывает необходимость использования другого экспериментального подхода - исследования механизма созревания предшественника.

1.4. Изучение механизма формирования активной глутамилэндопептидазы В. intermedius

1.4.1. Влияние модификации остатка в положении (-1) глутамилэндопептидазы на продукцию активного фермента клетками В. subtilis

Все ГЭПазы синтезируются в виде предшественников, созревание которых происходит по разным механизмам. Предшественники эпидермолитических токсинов стафилококков содержат, кроме каталитического домена, только секреторные лидеры, удаляемые сигнальной пептидазой. Вирусные ГЭПазы синтезируются как часть протяженного полибелка, процессинг которого является основной функцией этих ферментов. Предшественники ГЭПаз стрептомицетов, в дополнение к соответствующей зрелому ферменту области и секреторному лидеру, содержат пропептид, удаляемый автоката-литически. Автокаталитическое удаление пропептида в целом характерно для бактериальных протеаз. Однако автокатализ требует соответствия структуры сайта процессинга специфичности фермента, что в случае ГЭПаз накладывает жесткое ограничение: в положении (-1) в молекуле предшественника должен находиться остаток Glu. Такой остаток характерен для предшественников ГЭПаз вирусов и стрептомицетов, но не консервативен у других бактериальных ферментов. Напротив, у них в позиции (-1) наблюдаются самые разные аминокислотные остатки: Ser, Asn, His, Lys и Arg. Это разнообразие наводит на мысль о непринципиальности свойств остатка в (-1) положении для процессинга ГЭПаз, что может быть объяснено различиями специфичности зрелого фермента и предшественника. Такая трактовка согласуется с гипотезой о ключевой роли остатка 1 зрело-

1-1 pS-1 pE-1 pK-1

Рис. 1. Продукция активной протеазы клетками В. subtilis, несущими интакт-ный и мутантные гены глутамилэндопеп-тидазы В. intermedius в составе соответствующих плазмид. Контроль - клетки В. subtilis BG2036 (рСВ22), не имеющие гена BIGEP. А. 5 мкл ночных культур нанесены на индикаторную среду «молочный агар», чашка выдержана 12 ч при 37°С, а затем 24 ч при 22°С. Б. Специфическая активность в культурапьной среде (через 24 ч) по Z-Glu-pNA. D600 - оптическая плотность культуры при 600 нм.

го белка в определении специфичности фермента и предполагает, что предшественник обладает чрезвычайно широкой специфичностью. Однако существует и другое объяснение - гетероактивация, которая может осуществляться различными протеазами у разных микроорганизмов. В пользу этого варианта на момент начала нашего исследования свидетельствовали только данные, полученные еще в 1978 году для протеазы V8, однако механизм активации бактериальных ГЭПаз в целом оставался невыясненным. Поэтому с использованием модели на основе BIGEP мы предприняли работу по изучению влияния остатка (-1) на формирование зрелого фермента.

Было получено четыре мутантных варианта гена B1GEP, кодирующих ферменты с аминокислотными заменами Lys(-l)—» Ala/Ser/ Asn/Glu (векторы pA-l/pS-l/pN-l/pE-1, соответственно). Кроме того, сконструирован аналогичный вектор (рК-1) с геном, соответствующим BIGEP, не несущей мутаций и сохраняющей Lys(-1 ). Все гены были экс-прессированы в клетках лабораторного штамма В. subtilis. Уровень продукции активной протеазы клетками оценивали по размеру зон гидролиза казеина при культивировании на индикаторной среде «молочный агар» и по специфической активности в культуральной жидкости (рис. 1). Все клетки, несущие векторы с геном BIGEP, оказались способны, в отличие от контрольного штамма, к гидролизу казеина (рис. 1А). Уровень продукции активной BIGEP клетками был оценен количественно по гидролизу специфического субстрата Z-Glu-pNA. Накопление фермента в культуральной жидкости существенно различалось в зависимости от природы остатка в (-1) положении BIGEP (рис. 1Б). Полученные значения хорошо коррелировали с результатами теста на «молочном агаре».

Таким образом, можно констатировать, что ни одна из введенных в положение (-1) мутаций не приводит к полному прекращению продукции активного фермента клетками. В то же время наши результаты показывают, что природа остатка в данной позиции сайта процессинга BIGEP существенно влияет на уровень продукции активного фермента.

Наиболее вероятным представляется, что изменение уровня продукции активной BIGEP при модификациях в положении (-1) связано с профилем субстратного предпочтения процессирующего фермента или ферментов. В настоящее время опубликованы данные, что в клетках В. subtilis процессинг собственной глутамилэндопептидазы осуществляется субтилизинподобной секреторной протеазой — бациллопептидазой F (bpF). Можно предположить, что в нашем случае процессинг BIGEP осуществляется тем же ферментом. При этом показано, что bpF гидролизует связи после Ser, Arg и Lys, но, по-видимому, не способна расщеплять связи с Ala, Asn и Glu в положении Р1. Следовательно, при введении этих остатков в позицию (-1) BIGEP существует вероятность гидролиза в другом месте полипептидной цепи, что может вызывать наблюдаемый эффект. Однако более правдоподобной представляется активация BIGEP с этими остатками в сайте процессинга другими ферментами, поскольку для ГЭПаз показана возможность

процессинга протеазами различных семейств. Так ГЭПаза В. licheniformis in vitro про-цессировалась при действии субтилизина и трипсина. В случае протеазы V8 из S. aureus и родственных ей ГЭПаз других стафилококков процессинг осуществляется тер-молизинподобными протеазами: ауреолизином in vivo и термолизином in vitro. Таким образом, весьма вероятно, что, в зависимости от структуры сайта процессинга, ГЭПаза в одном микроорганизме активируется при участии нескольких разных ферментов. В случае В. siibtilis, например, на эту роль могут претендовать, кроме bpF, еще семь секреторных протеаз различной специфичности. Кроме того, существует возможность автопро-цессинга в случае замены Lys(-l) на Glu, что было показано для ГЭПаз из Str. griseits и В. subtilis, а также нами для самой BIGEP.

Интересно, что, несмотря на введение в положение (-1) BIGEP остатка Ser, находящегося в сайте процессинга ГЭПазы В. subtilis, максимальный уровень протеолитиче-ской активности в культуралыюй среде демонстрируют клетки с геном BIGEP, кодирующим характерный для В. intermedins вариант фермента с Lys(-1 ). Таким образом, наличие Lys(-l) является предпочтительным для достижения более высокого уровня продукции активного белка. Можно предположить, что модификация остатка (-1) ГЭПаз служит механизмом эволюционной адаптации уровня продукции фермента. В таком случае объяснимо разнообразие свойств остатков в этом положении сайта процессинга очень близких в остальном белков.

Таким образом, полученные нами и опубликованные другими авторами данные позволяют утверждать, что природа остатка в положении (-1) предшественника значительно влияет на созревание ГЭПаз, хотя и не является критической для активации ферментов, поскольку последняя может осуществляться различными путями. Эти результаты должны быть учтены при конструировании эффективных продуцентов не только самой BIGEP, но и других протеаз с узкой субстратной специфичностью.

Исследования влияния остатка (-1) на продукцию BIGEP продемонстрировали, что использованная нами на этом этапе работы экспрессионная система на основе клеток В. subtilis не дает возможности получить предшественник фермента и детально изучить процесс его созревания. Это, в свою очередь, не позволяет сделать вывод о субстратной специфичности ГЭПазы до возникновения свободной аминогруппы N-концевого остатка зрелого белка. Для решения этой задачи нами была создана экспрессионная система на основе клеток Е. coli.

1.4.2. Созревание глутамилэндопептидазы В. intermedius in vitro

Гетерологическая экспрессия является в настоящее время наиболее эффективным подходом к получению белков, как для исследований, так и в прикладных целях. В то же время, при использовании такого подхода возникает проблема корректного сворачивания. Для белков, синтезируемых в виде предшественников, во многих случаях показано, что фолдинг определяется пропептидами. Однако это не решает проблему полностью, поскольку для формирования активной формы белков пропоследовательности должны быть корректно удалены. Если отщепление пропептида может происходить автокатали-тически, то экспрессированная в гетерологической системе протеаза после ренатурации, как правило, созревает самопроизвольно. Но если фермент не способен к автокаталитическому удалению прорегиона, что характерно для многих протеаз с узкой субстратной специфичностью, то необходимо использование другого протеолитического фермента.

Глутамилэндопептидаза В. intermedius синтезируется в виде предшественника, однако, к моменту начала наших работ было неизвестно, выполняет ли пропептид фермента функцию фолдинг-ассистента. В то же время имеющиеся данные позволяли предпола-

л *

A WT MMKKVKMLLPSLLVFGMiSVPSFAHATSDSVbTSDYDMraSDGKVISSSDFHiroTKSPSSníKTODLSSTSGEKVKPLSKYLKDFQTKVVIGD. .

♦ О Ф

SPM Mtra<VKMLLPSLLVFGALSVPSFAHATSDSVLTSDYDMVTSlXSKVISSSDFHiroTKSPSSET)KVDDLSSTSGEKVKPLSKYLKDFQTKVVIGD. .

О Ф

РЦ/1 MTSDSVLTSDYDMVTSDGKVISSSDFHNDTKSPSSFDKVDDLSSTSGEKVKPLSKYLKDFQTKWIGD. .

«

РЕМ MTSDSVLTSDYDMVTSDGKVISSSDFHNDTKSPSSFDKVDDLSSTSGEKVKPLSKYLKDFQTEWIGD. .

M MVIGD..

Бэкспрессированные процессированные

белки формы Рис. 2. Полученные варианты глу-

SPM Its. .EKV. .Kiwi. . . l-AgT° IntF тамилэндопептидазы B.intermedi-

J^X M -Kiwi • • ■ "1 us и их процессинт. A — частичные

РМ IMTS. .EKV. .HWI. . . ~l Субтализин! последовательности кодируемых

Трипсин I _ „ r

РЕМ IMTS. .EKV. .ElWI. I Abt°-»twi... 1 генами белков и сайты процессин-

га. Б - схема получения активной I I Пропептид □ Зрелая часть BIGEP. SPM - полноразмерный

предшественник; РМ и РЕМ - предшественники без сигнального пептида и без сигнального пептида с мутацией Lys(-l)—»Glu; M - зрелая часть; IntF - промежуточная форма. Черной стрелкой отмечен сайт процессинга сигнальной пептидазой, белыми стрелками - сайты отщепления пропептидов, серыми-сайты формирования промежуточной формы. Установленные N-концевые последовательности подчеркнуты. Знак «*» соответствует положению (-1).

гать, что удаление пропептида BIGEP осуществляется другой протеазой. Действительно, удаление пропептида ГЭПаз может происходить автокаталитически лишь при наличии связи Glu-Xaa в сайте процессинга, в противном случае, для активации необходимо участие дополнительного фермента. При созревании BIGEP гидролизуется связь Lys-Val, таким образом, от vivo этот фермент, по-видимому, активируется гетерокаталитически. Следовательно, при экспрессии BIGEP в клетках Е. coli, вероятно, понадобится (как в случае ГЭПаз В. licheniformis и S. aureus) активация другой протеазой с соответствующей специфичностью. Этот факт может оказаться благоприятным для получения полноразмерного предшественника BIGEP. Однако использование для процессинга дополнительного фермента нежелательно, если целью исследования является изучение субстратной специфичности, и абсолютно недопустимо с точки зрения получения высокоспецифичной протеазы, которую предполагается применять для ограниченного протеолиза.

Поскольку в описанной ситуации не представлялось возможным выбрать одно оптимальное решение, то нами был сконструирован набор векторов, позволяющих экспрес-сировать в клетках Е. coli разные варианты гена BIGEP (рис. 2). Вектор рМ нес ген индивидуальной зрелой части BIGEP (М), предназначенной для проверки фолдазной способности пропептида. Плазмида pSPM кодировала полноразмерный предшественник BIGEP (SPM), содержащий сигнальный пептид, поскольку в ряде случаев при гетерологической экспрессии белков-предшественников в Е. coli секреция приводит к их корректному созреванию. Вектора рРМ и рРЕМ, определяющие синтез предшественников без сигнального пептида (РМ) и без сигнального пептида с заменой Lys(-l)—>Glu (РЕМ), были необходимы для получения негидролизованного предшественника и автоактивирующегося фермента, соответственно.

При экспрессии вариантов генов BIGEP в клетках Е. coli BL21 (DE3) все белки (SPM, РМ, РЕМ и М) накапливались в нерастворимой форме. В то же время методом электронной микроскопии было показано, что тела включения имеют различную клеточную локализацию (рис. 3). Полноразмерный предшественник BIGEP (SPM) обнаруживался в периплазматическом пространстве, тогда как остальные белки были локализованы в цитоплазме. Данный факт демонстрирует, что в клетках Е. coli наличие собственного сигнального пептида приводит к секреции BIGEP.

Рекомбинантные белки (БРМ, РМ, РЕМ и М) были очищены в присутствии 8 М мочевины с использованием катионообменной и гельпроникающей хроматографии до электро-форетически гомогенного состояния.

Для получения данных о первичной структуре БРМ, РМ, РЕМ и М были обработаны трипсином и подвергнуты анализу методом МАЬ01-масс-спектрометрии, котрый показал, что набор фрагментов в случае РМ, РЕМ и М полностью соответствует последовательностям белков, кодируемых модифицированными генами (рис. 2). В случае 8РМ фрагмент, соответствующий кодируемому геном ТЯ-концевому участку белка, обнаружен не был. И-концевое секвенирование БРМ показало, что пять первых аминокислотных остатков этого белка: ТБВЗУ Эти результаты свидетельствуют об удалении 26 стартовых аминокислотных остатков БРМ. соответствующих теоретически предсказанному сигнальному пептиду. Таким образом, БРМ отличался от РМ по первичной структуре лишь отсутствием стартового метионина (рис. 2А).

Ренатурацию очищенных БРМ, РМ, РЕМ и М проводили в присутствии 25% глицерина и 0,15 М №С1, снижая концентрацию мочевины в растворе до 0,53 М однократным разбавлением. (Схема созревания представлена на рис. 2Б.) В случае ЭРМ и РМ, после 12 ч инкубации при 4°С от 50 до 70% белка переходило в промежуточную форму (1Щ;Р) (рис. 4А, данные приведены для БРМ). Молекулярная масса МБ, по результатам электрофореза, составляла около 26 кДа, что больше массы зрелого белка (22,8 кДа) и меньше массы предшественника (29,5 кДа). По результатам М-концевого секвенирования первые пять остатков МБ - КУКРЕ (это соответствует участку (-15)-(-11) в последовательности предшественника). Таким образом, промежуточная форма образуется при гидролизе связи С1и(-16)-Еу8 в пропептиде ВЮЕР и имеет расчетную молекулярную массу 24,7 кДа. МБ была стабильна в растворе при 4°С, по крайней мере, в течение 90 суток. Добавление РМББ, ингибитора сериновых протеаз, и о-фенантролина, ингибитора металлопротеаз, не влияло на образование промежуточной формы. Детектировать протеолитическую или специфическую активность 1п1Е не удавалось. При добавлении трипсина или субтилизи-на, но не термолизина или ВЮЕР, полученной в клетках В. (ВЮЕР-Вэ), 1тР пере-

ходила в активную форму, имеющую, по данным электрофореза, молекулярную массу, совпадающую с массой ВЮЕР-Вв (около 23 кДа).

В случае РЕМ детектировать промежуточную форму не удавалось, 50-70% данного белка при инкубации (12 ч, 4°С) переходило в активную форму с молекулярной массой около 23 кДа (рис. 4Б). Присутствие в растворе РМББ и о-фенантролина не влияло на этот процесс. Соответствие первичных структур активных форм, полученных из БРМ, РМ и РЕМ, структуре зрелой ВЮЕР дикого типа подтверждено масс-спектрометрическим анализом их трипсиновых гидролизатов.

Определенная по гидролизу гЮкьрЫА специфическая активность всех полученных вариантов зрелой ВЮЕР, составляла 1,6±0,1 Ед./мг, что соответствует значениям, установленным для нативной ВЮЕР. Протеолитическая активность полученных из 8РМ, РМ и РЕМ ферментов, определенная по гидролизу азоказеина, также была близка к таковой для природной ВЮЕР и составляла 31±3 Ед./мг.

pET23b(+) pSPM

Рис. 3. Электронные микрофотографии клеток Е. coli BL21 (DE3), несущих плазми-ды pPET23b(+), pSPM, рРМ и рМ. Стрелки указывает на положение тел включения.

сл

А Б m

Рис. 4. Электрофоретический анализ препаратов SPM (А) и РЕМ (Б), полученных в ходе ре-нагурации. SPM - полноразмерный предшественник BIGEP; IntF - промежуточная форма; mSPMT и mSPMs- зрелая BIGEP после обработки IntF трипсином и субтилизином, соответственно; M - индивидуальная зрелая часть; РЕМ - предшественник с мутацией Lys(-l)—>Glu; mPEM - зрелая BIGEP, полученная при автокаталитическом созревании РЕМ; BIGEP-Bs -зрелая BIGEP, выделенная из клеток В. siibtilis. MW - маркеры молекулярной массы.

Полученная в клетках Е. coli индивидуальная зрелая часть BIGEP (М), очищенная и обработанная аналогично SPM, РМ и РЕМ, при понижении концентрации денатурирующего агента агрегировала с образованием осадка. Детектировать протеолитическую или специфическую активность в осадке или супернатанте не удавалось. Таким образом, отсутствие пропептида в составе рекомбинантной BIGEP приводит к невозможности формирования активного фермента в условиях эксперимента.

Итак, экспрессия нескольких вариантов гена BIGEP в клетках Е. coli позволила нам выявить целый ряд фактов, проливающих свет на механизмы функционирования этого фермента. Так, было впервые продемонстрировано, что пропептид ГЭПазы В. intermedins необходим для формирования активного фермента, т.е. является фолдинг-ассистентом.

Нами показано, что для активации in vitro BIGEP нуждается в участии других протеаз, специфичность которых соответствует расщепляемой связи пропептид-зрелая часть (Lys-Val). Необходимость гетероактивации была также показана ранее для ГЭПаз из В. subtilis (in vivo) и из В. licbeniformis (in vitro).

В то же время оказалось, что созревание BIGEP осуществляется ступенчато. На первой стадии происходит гидролиз пропептида по единственному остатку глутами-новой кислоты (Glu(-16)) с образованием промежуточной формы (IntF). Образование IntF не требует участия дополнительных протеолитических ферментов и не зависит от присутствия ингибиторов, что соответствует свойствам BIGEP. Эти факты позволяют сделать предположение об автокаталитическом механизме образования IntF. Вероятно, предшественник BIGEP обладает протеолитической активностью, причем природа ги-дролизуемой в пропептиде связи (Glu-Lys) говорит о специфичности, совпадающей с таковой у зрелой ГЭПазы. Тем не менее, обнаружить активность IntF не удавалось. Такое положение может быть связано с низким, не детектируемым используемыми методами, уровнем активности промежуточной формы. Другими объяснениями могут служить внутримолекулярный процессинг предшественника на первой стадии и/или ингибирование активности IntF оставшимися аминокислотами пропептида. Хотя, не исключено, что ав-топроцессинг BIGEP осуществляется межмолекулярно зрелым ферментом, а инициируется с низкой эффективностью другой, примесной протеазой.

Данные о ступенчатом механизме процессинга были недавно получены in vitro для другой ГЭПазы - фермента из В. licheniformis, а также in vivo и in vitro для протеазы V8. Интересно отметить, что процессинг протеазы V8 происходит in vivo при участии термолизинподобной металлопротеазы ауреолизина, a in vitro при участии термолизина.

Однако обработка промежуточной формы BIGEP термолизином не приводила к образованию зрелого фермента. Вероятно, это связано с различной природой гидролизуемой связи: Asn-Val у протеазы V8 и Lys-Val у BIGEP. Эти данные хорошо дополняют результаты, полученные нами при мутагенезе (-1) положения BIGEP, и являются еще одним аргументом в пользу сделанных выводов о том, что модификации (-1) остатка ГЭПаз in vivo служат механизмом эволюционной адаптации.

Приняв во внимание способность BIGEP к автокаталитическому гидролизу про-пептида по остатку Glu(-16), а также данные об автокаталитическом процессинге in vivo родственных ферментов (глутамилэндопептидазы из В. subtilis и Sir. griseus), мы сконструировали ген BIGEP с мутацией, модифицирующей сайт процессинга так, чтобы он соответствовал субстратной специфичности фермента. Полученный мутантный предшественник с заменой Lys(-l)—>Glu при ренатурации переходил в зрелую форму, не отличающуюся от BIGEP дикого типа по первичной структуре и удельной активности. Процесс созревания такого предшественника осуществлялся автокаталитически, то есть не требовал использования других ферментов.

Этот результат имеет важное прикладное значение. Протеолитические ферменты с узкой субстратной специфичностью, к которым относится BIGEP, позволяют проводить ограниченный гидролиз белков и пептидов, что делает эти протеазы незаменимой составляющей основанных на масс-спектрометрии протеомных исследований. Такие ферменты применяют для определения первичной структуры и доменной организации, а также идентификации белков. Они могут быть использованы также для сиквенс-специфиче-ского гидролиза слитых белков и получения биологически активных пептидов. В случае высокоспецифичного фермента, пригодного для ограниченного протеолиза, присутствие примесной активности абсолютно недопустимо. Таким образом, нами предложен новый подход к получению протеаз с узкой субстратной специфичностью в гетерологических экспрессионных системах, состоящий в создании автоактивирующегося варианта целевого фермента путем модификации сайта его процессинга.

1.5. Глутамилэндопептидазы: пропептиды и структурные детерминанты субстратной специфичности

Подведем итог осуществленным в рамках данной работы исследованиям глутамил-эндопептидаз. Ферменты этой группы относятся к структурному семейству химотрип-сина и характеризуются способностью гидролизовать пептидные связи, образованные а-карбоксильными группами остатка Glu и, в некоторых случаях, других отрицательно заряженных аминокислотных остатков. Все ГЭПазы имеют в целом сходное строение S1 субстратсвязывающего участка, различаясь, однако, системой компенсации заряда субстрата. При этом различия в механизмах распознавания отрицательного заряда коррелируют с различиями в архитектурах и путях процессинга предшественников соответствующих ферментов. Изложенные факты, в сочетании с филогенетическим анализом, позволяютсделать предположение о том, что белки с такой специфичностью возникли на эволюционном древе ХПП, по крайней мере, дважды. Все это делает ГЭПазы привлекательными объектами исследований, которые, с одной стороны, позволяют получить информацию о механизмах распознавания заряженных субстратов, а, с другой стороны, могут служить основой для создания протеаз с измененной субстратной специфичностью.

Нами создана экспериментальная модель для исследования механизмов функционирования ГЭПаз на основе протеазы В. intermedins (BIGEP). В рамках этой модели проведен направленный мутагенез субстратсвязывающей области и впервые получена ГЭПаза с аминокислотной заменой по остатку His213 - ключевому элементу S1 участ-

ка. Анализ свойств модифицированного фермента показал, что консервативный у всех ГЭПаз His213 не определяет способность BIGEP расщеплять субстраты после остатка Glu, хотя важен для проявления ферментом высокой каталитической эффективности. Полученный результат позволил сделать вывод, что His213 не является основным элементом распознавания заряда субстрата у ГЭПаз, и стал новым аргументом в пользу предположения, что для каждой эволюционной ветви ГЭПаз характерна своя система компенсации заряда.

Нами впервые изучен механизм созревания BIGEP и получены данные о влиянии модификаций пропептида на формирование активной протеазы. Показано, что пропеп-тид BIGEP необходим для формирования активного фермента и, следовательно, выполняет функцию фолдинг-ассистента. Такие данные для ГЭПаз получены впервые. Продемонстрировано, что удаление пропептида BIGEP происходит ступенчато. Первая стадия процессинга, по-видимому, происходит автокаталитичеки, приводя к образованию неактивного интермедиата, который переходит в активную форму после гетероак-тивации. При этом эффективность гетероактивации и процессирующий фермент определяются остатком в положении (-1) пропептида, а введение остатка Glu(-l) приводит к автоактивации. Таким образом, во-первых, может быть сделан вывод о том, что активация BIGEP in vivo контролируется другими протеазами. Причем изменение остатка (-1) в ходе эволюции, определяя процессирующий фермент, вероятно, дает возможность влиять как на эффективность процессинга, так и на выбор механизма регуляции активности ГЭПазы. Во-вторых, полученные данные позволяют думать, что, поскольку автоактивация предшественника BIGEP сопровождается расщеплением связей остатков Glu, а-аминогруппа Vail, N-концевого остатка зрелого белка, также как и His213, не является единственной детерминантой субстратной специфичности фермента. Учитывая это, можно предположить, что каждый из рассмотренных элементов S1 участка (а-аминогруппа N-концевого остатка и His213) является достаточным, но не является необходимым для обеспечения наблюдаемых субстратных предпочтений бациллярных и родственных им ГЭПаз. Совокупность же этих двух элементов обеспечивает высокую эффективность катализа. Однако для того, чтобы сделать такой вывод полностью обоснованным, необходимо получить доказательства, что запуск процессинга не осуществляется зрелым ферментом, образующимся в результате действия какой-либо примесной протеазы. Кроме того, нельзя исключить, что ключевую роль в распознавании заряда субстрата играет еще один, до настоящего времени не идентифицированный структурный элемент, ведь высокая эффективность катализа вирусными и стрептомицетными ГЭПазами обеспечивается и без а-аминогруппы N-концевого остатка в S1 сайте. Эти предположения еще ждут экспериментальной проверки, которая, вероятно, может быть выполнена в рамках предложенной модели.

Важно отметить, что созданная нами в ходе работы экспериментальная система имеет прикладное значение. Полученные результаты о механизме созревания предшественника BIGEP позволили разработать подход к получению синтезируемых в виде предшественников протеаз с узкой субстратной специфичностью в гетерологичных экс-прессионных системах. Этот подход использует концепцию «инженерии пропоследова-тельностей» и основан на создании автопроцессирующихся ферментов, что позволяет избежать введения чужеродных процессирующих протеаз в препарат целевого белка. В рамках данной работы такой метод был успешно применен для создания продуцента ГЭПазы В. intermedins. Полученный с использованием сконструированного продуцента фермент в настоящее время применяется в нашей лаборатории и других лабораториях Института молекулярной генетики РАН для ограниченного протеолиза белков и

пептидов. Не подлежит сомнению также, что созданная нами экспериментальная модель является хорошей основой для получения ферментов с измененной субстратной специфичностью, в том числе с применением инженерии пропептидов.

2. Термолизинподобные протеазы - модель для исследования модулирующей способности пропептидов 2.1. Характеристика белков семейства М4

Реализация потенциала семейства пептидаз М4, более известного как термолизинподобные протеазы (ТПП), в качестве модельной системы для изучения модулирующей способности пропептидов требует наличия в руках исследователя набора охарактеризованных ферментов этой группы. Поскольку, как уже обсуждалось выше, одним из наиболее эффективных подходов для выявления структурно-функциональных соотношений в белковых молекулах является белковая инженерия, необходимо также располагать клонированными генами целевых протеаз и удобными системами для их экспрессии. Для решения этой задачи сотрудниками лаборатории белковой инженерии Института молекулярной генетики РАН (ЛБИ ИМГ РАН) на протяжении многих лет проводился поиск бактериальных штаммов-продуцентов протеолитических ферментов и конструирование геномных библиотек таких микроорганизмов, что дало возможность подобрать модельные белки для использования в рамках данного исследования.

2.1.1. Новая нейтральная протеаза Thermoactinomyces species 27а

Сотрудниками ЛБИ ИМГ РАН была создана геномная библиотека Thermoactinomyces sp. 27а, при анализе которой был клонирован ген металлопротеазы. Ген был экспрессирован в клетках лабораторного штамма Bacillus subtilis AJ73 под контролем собственных регуляторных элементов. В данной работе была установлена последовательность гена металлопротеазы (номер доступа в базе данных GenBank- AY280367), очищен и охарактеризован соответствующий фермент.

Сравнение выведенной из структуры гена аминокислотной последовательности металлопротеазы Thermoactinomyces sp. 27а (Mpr-Thr) с известными первичными структурами белков показало, что она наиболее близка к последовательностям термолизинпо-добных протеаз (ТПП). Биоинформатический анализ позволил сделать вывод, что белок синтезируется в клетке как предшественник, содержащий, кроме высокогомологичного зрелым пептидазам М4 участка, секреторный лидер, N-концевой пропептид, а также кар-боксиконцевой домен, который не характерен для большинства ТПП.

Электрофоретически гомогенная металлопротеаза была выделена из культуральной жидкости рекомбинантного продуцента В. subtilis AJ73 (рЗ 1) с выходом 23% при очистке примерно в 40 раз. Молекулярная масса белка, установленная методом электрофореза, составляла 34 кДа, что совпадало со значением, полученным при масс-спектрометрическом анализе — (34190±70 Да). Нами была определена N-концевая аминокислотная последовательность фермента (AAATGTGTGV), положение которой в первичной структуре предшественника показало, что при созревании фермента удаляется N-концевой пропептид протяженностью 215 а.о. Кроме того, сопоставление N-концевой последовательности и молекурярной массы зрелого белка с выведенной первичной структурой предшественника дало возможность сделать вывод, что при созревании Mpr-Thr удаляется также С-концевое расширение. Причем процессинг происходит после 317 или 318 остатка. Это позволяет рассматривать С-концевое расширение фермента как пропептид. Следует отметить, что С-концевые пропептиды характерны для примерно 1/3 ТПП.

Сравнение последовательностей зрелой части Mpr-Thr и каталитических доменов бациллярных ТПП показало их существенное сходство. Наибольшая гомология наблюдается в функционально значимых регионах молекулы: активном центре и участках связывания ионов кальция. Таким образом, по первичной структуре каталитического домена Mpr-Thr является типичным представителем семейства пептидаз М4.

Нами были изучены свойства Mpr-Thr. Ингибиторный анализ подтвердил отнесение Mpr-Thr к каталитическому типу металлопротеаз. Подобно другим ТПП, фермент демонстрировал оптимум протеолитической активности при pH 7,0-7,5 и был стабилен при pH 6,5-9,0. Протеаза проявляла оптимум действия при температуре около 55°С. Ионы кальция стабилизировали фермент. Фермент гидролизовал стандартный субстрат ТПП 3-(2-фурил)акрилоил-глицил-Ь-лейцинамид (ФАГЛА), при этом отношение kcat/KM, характеризующее эффективность катализа, составило (2,8±0,1)х103 М 'с1. Для сравнения, в случае термолизина это значение — (2,0±0,1)*104 М 'с1.

Таким образом, нами впервые охарактеризована ТПП термоактиномицета. По своей структуре и свойствам зрелый фермент является типичным представителем семейства М4. В то же время предшественник белка содержит С-концевой пропептид, что характерно лишь для части протеаз группы. Это делает Mpr-Thr перспективной в качестве одного из элементов модели для исследования функций пропоследовательностей.

2.1.2. Протеализин - металлопротеаза Serratia proteamaculans 94, представляющая новую группу термолизинподобных ферментов

Ранее сотрудниками ЛБИ ИМГ РАН и Лаборатории гигиены производства и микробиологии ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института мясной промышленности им. В.М. Горбатова Россельхозакадемии (ВНИИМП) из испорченного мясного сырья был выделен психротолерантный штамм Ser. proteamaculans 94 — продуцент про-теолитических ферментов. В рамках данной работы мы исследовали металлопротеазу из этого организма: клонировали, секвенировали и экспрессировали ее ген, охарактеризовали соответствующий белок. Этот фермент, получивший название «протеализин», был первой выделенной из Ser. proteamaculans протеазой и первой протеазой этого организма, для которой была установлена структура гена.

Ген протеализина (Pin) был клонирован из созданной нами геномной библиотеки Ser. proteamaculans 94 в составе фрагмента ДНК размером около 3,3 тпн и секвенирован (номер доступа в GenBank- AY280367). Сравнение полной выведенной из последовательности гена первичной структуры (341 а.о.), т.е. последовательности предшественника Pin, с первичными структурами известных ТПП показало, что наибольшая гомология наблюдается с внеклеточной протеазой Envinia carotovora и минорной протеазой Serratia marcescens.

Последовательность, соответствующая зрелому Pin (291 а.о.), имеет выраженную гомологию с последовательностью термолизина (Tin) (37% идентичных и 54% сходных остатков) и других хорошо охарактеризованных белков семейства М4. Наибольшее количество совпадающих аминокислотных остатков наблюдается в функционально существенных участках молекулы. Это позволило идентифицировать остатки, формирующие активный центр фермента (His 112, Hisl 16, Glu 136, Asnl35, Aspl40, Glu 113, His214, Tyrl27) и SI' сайт (обозначение по Шехтеру и Бергеру) связывания субстрата (Phel30, Phel33, Vall39 и Leu202). Сопоставление первичной структуры Pin с последовательностью Tin в областях, соответствующих сайтам связывания кальция, показало, что эти участки существенно различаются: в Pin изменено большинство остатков, взаимодействующих с Са:+ боковыми группами.

43-

и 2210-

Находящаяся на N-конце предшественника Pin последовательность (50 а.о.), которая удаляется при созревании белка, полученного нами в клетках Е. coli, не имеет гомологии с препропоследовательностью Tin (232 а.о.) и большинства других ТПП, Рис. 5. LOGO-представление консенсусной по- однако обнаруживает заметное сходство с следовательности PPL-мотива. N-концевыми областями предшественников

целого ряда ферментов группы. В этих последовательностях нами обнаружен консервативный гидрофобный кластер, названный PPL-мотивом и включающий семь аминокислотных остатков, три из которых инвариантны: два следующих друг за другом Pro и Leu через два остатка за ними (рис. 5).

Нами сконструирован рекомбинантный продуцент Pin. При работе с продуцентом Е. coli BL21 (DE3) (pS!T20) обнаружено, что свежий лизат клеток содержит Pin в виде предшественника с молекулярной массой около 37 кДа. При этом детектируемая протео-литическая активность в лизате была крайне низкой. Инкубация препарата при 4°С приводила к созреванию фермента - образованию процессированой формы с массой примерно 32 кДа. Данный процесс сопровождался ростом протеолитической активности, которая достигала максимума через 24-72 часа после лизиса клеток.

Электрофоретически гомогенный активный Pin выделен из клеточного лизата Е. coli в количестве 18,5 мг на литр культуральной суспензии с выходом по активности 12% при очистке в 5 раз. Установлена N-концевая аминокислотная последовательность зрелого белка (AKTSTGGEVI), что позволило идентифицировать точку процессинга предшественника и сделать вывод о том, что при созревании Pin, синтезированного в клетках Е. coli, удаляется аминоконцевой регион, состоящий из 50 а.о., и формируется зрелый активный белок, протяженностью 291 а.о.

Молекулярная масса зрелого Pin составила: определенная посредством гельпрони-кающей хроматографии - около 31,5 кДа и электрофореза в ПААГ в присутствии SDS -около 32 кДа. Экспериментальные значения близки к величине, рассчитанной по последовательности - 31894 Да. Соответствие значений, полученных в денатурированной и активной форме, показывает, что функциональной формой белка является мономер.

Фермент проявляет оптимум активности при гидролизе азоказеина при pH около 7 и температуре 50°С. По типу ингибирования Pin является типичной металлопротеазой. Активность фермента угнетается о-фенантролином и ЭДТА, но не хлоридом ртути (II) и PMSF. Фермент гидролизует ФАГЛА, стандартный субстрат ТПП. При этом отношение кса1/Км составляет (2,52±0,02)х102 М"'с"'. Таким образом, по своим энзиматическим свойствам Pin является типичным представителем семейства пептидаз М4.

Протеализин стабилен при pH 5,5-9,5 и температуре до 40°С. При более высоких температурах фермент заметно инактивируется и при температуре 60°С практически полностью теряет активность за 15 мин. Термостабильность Pin зависит от концентрации ионов кальция. Остаточная активность фермента после 20 мин инкубации при 55°С снижалась в 2,4 раза при увеличении концентрации Са2т до 40 мМ.

Полученные результаты демонстрируют, что Pin не является высокостабильным ферментом. Это может быть связано с неспособностью к акцепции ионов кальция молекулой белка. Известные представители семейства пептидаз М4 существенно отличаются по термостабильности. Причем атрибутом более лабильных белков является отсутствие сайтов связывания кальция СаЗ и Са4. При этом стабильность большинства ТПП растет с увеличением концентрации ионов кальция в диапазоне 1-100 мМ. В случае Pin наблю-

дается обратный эффект. Молекулярные механизмы, лежащие в основе этого явления, не ясны. Однако можно предположить, что оно, как и низкая стабильность, определяется упоминавшимися выше существенными изменениями в регионах молекулы Pin, соответствующих сайтам связывания кальция.

Наиболее интересной особенностью Pin является организация N-концевой области его предшественника. Все известные ТПП синтезируются в виде препробелков, содержащих на N-конце участок, который отсутствует в зрелом активном ферменте. В то же время для большинства белков семейства, в том числе для Tin, характерна иная структура аминоконцевого региона предшественника. Таким образом, внутри семейства М4 могут быть выделены два структурных подсемейства. Это позволяет, учитывая важность N-концевых пропептидов для функционирования пептидаз семейства, рассматривать ТПП как модель для исследования модулирующей способности пропептидов. Использование данной модели требует более глубокого анализа структурной организации предшественников пептидаз семейства М4. Такой анализ был осуществлен нами в рамках данной работы и будет представлен ниже.

2.2. Создание прототипа ферментного препарата для улучшения качества мясного сырья на основе протеализина

Как упоминалось выше, штамм Ser. proteamaculans 94, природный продуцент протеализина, был обнаружен в ходе исследований, проведенных совместно сотрудниками ВНИИМП и ИМГ РАН. Эта работа была направлена на поиск микроорганизмов, продуцирующих коллагенолитические ферменты, активные при низкой положительной температуре. Было показано, что ферменты культуралыюй жидкости Ser. proteamaculans 94 способны гидролизовать соединительную ткань животных при температуре 4-10°С. На их основе был создан ферментный препарат для улучшения качества мясного сырья. Однако из-за неэффективности продуцента препарат имеет высокую себестоимость и, вследствие этого, не рентабелен при промышленном применении. Описанное выше клонирование гена Pin и создание его рекомбинантного продуцента послужило базой для осуществления нового совместного проекта ВНИИМП и ИМГ РАН. Этот проект был направлен на создание ферментного препарата для улучшения качества мясного сырья на основе рекомбинантных протеаз Ser. proteamaculans 94.

На первом этапе коллагенолитическая активность Pin при температурах 4 и 20°С была оценена по гидролизу нативного коллагена I типа. Было установлено, что реком-бинантный фермент способен гидролизовать коллаген при обеих температурах, что позволило сделать вывод о целесообразности проведения исследований действия Pin на мясное сырье. Для осуществления этой работы нами была получена лабораторная партия препарата рекомбинантного фермента.

Сотрудниками ВНИИМП была проведена оценка действия препарата на мясное сырье. Для этого были изучены физико-химические и микроструктурные изменения ферментированной говядины. Основные физико-химические характеристики, такие как рН, содержание влаги и влагосвязывающая способность изучали при различных концентрациях препарата в сырье. Было показано, что при действии препарата рН мясного сырья меняется незначительно. При введении препарата в мясном сырье возрастала массовая доля растворимого белка с высокогидрофильными свойствами, что приводило к увеличению влагосвязывающей способности в 1,7-2,1 раза (в зависимости от использованной концентрации препарата). Влияние препарата на соединительную ткань определяли, сравнивая содержание оксипролина в сырых и вареных образцах без и после 48 ч инкубации с ферментным препаратом. Исследование показало, что содержание свободного

оксипролина в опытных образцах на 2430 мг% выше по сравнению с контролем. Эти данные соответствуют увеличению развариваемое™ коллагена в ферментированном мясном сырье на 74-85%. Эффективное действие на соединительную ткань было под-твеждено микроструктурными исследованиями образцов, обработанных препаратом.

Важным условием применимости ферментного препарата в пищевой промышленности является его полная инактивация в готовом продукте. Поскольку технология приготовления мясных изделий стандартно включает температурную обработку, нами была исследована термоинактивация Pin. Оценка остаточной активности фермента в готовой продукции была проведена совместно с сотрудниками ВНИИМП. Для этого была выработана опытная партия колбасных изделий (сосисок) и изучена протеолитическая активность в изделиях, прошедших термическую обработку и полученных как с использованием ферментного препарата, так и без него. Установлено, что активность Pin не детектируется в готовой продукции, и, следовательно, ферментный препарат может быть использован в пищевой промышленности.

Таким образом, совокупность полученных данных позволила сделать вывод о перспективности использования препарата для обработки сырья с высоким содержанием соединительной ткани. Для проведения дальнейших исследований в опытно-промышленных масштабах были необходимы значительно большие количества ферментного препарата.

Совместно с сотрудниками Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН им. Г.К. Скрябина (ИБФМ РАН) был разработан технологический регламент получения препарата Pin на основе штамма-продуцента Е. coli BL21 (DE3) (pSIT20) в ферментерах объемом 100 л. Была выпущена опытная партия сухого ферментного препарата, с использованием которого на ЗАО «Микояновский мясокомбинат» (совместно с сотрудниками ВНИИМП) была выработана опытная партия варено-копченой колбасы, а затем изучены микроструктурные характеристики ферментированного фарша и готового продукта.

Исследования показали, что ферментный препарат оказывает влияние, в первую очередь, на структуру соединительной ткани. При этом ее характеризует разрыхление компоновки коллагеновых волокон в пучках (рис. 6), что способствует более глубоким изменениям в структуре коллагена при термической обработке. Использование препарата не оказывает негативного влияния на микроструктурные показатели готовых колбасных изделий. Компоновка структурных элементов фарша в готовых изделиях более плотная по сравнению с контрольными образцами. Фрагменты соединительной ткани характеризуются глубокими деструктивными изменениями. Отмеченные морфологические изменения в структуре опытных образцов способствуют формированию более высоких качественных показателей готового продукта.

Таким образом, в результате совместного проекта сотрудниками ВНИИМП, ИБФМ РАН и ИМГ РАН на основе рекомбинантного Pin создан прототип ферментного препарата для улучшения качества мясного сырья в пищевой промышленности.

АНПШ

MJh

Рис. 6. Действие ферментного препарата на основе рекомбинантного протеализина на соединительную ткань в составе мясного сырья. Микрофотографии фарша контрольного образца (А) и фарша, обработанного препаратом (Б).

Рис. 7. Дендрограмма аминокислотных последовательностей М-концевых областей предшественников пептидаз семейства М4.

2.3. Структурная организация предшественников термолизинподобных протеаз

Термолизинподобные протеазы (ТПП) - группа цинксодержащих металлоэндо-пептидаз, обнаруженных у десятков видов грамположительных и грамотрицательных бактерий, а, кроме того, у микроскопических грибов и архей. ТПП, как и многие другие протеолитичекие ферменты, синтезируются в виде предшественников, которые включают дополнительные структурные элементы, отсутствующие в зрелых молекулах. Причем такие дополнительные последовательности могут быть локализованы как в 14-, так и в С-концевой области предшественника.

Во многих случаях показано, что аминоконцевые регионы (АКР) предшественников содержат сигнальный пептид, обуславливающий секрецию ферментов из клетки, и пропоследовательность. Последняя, по крайней мере, у некоторых ферментов семейства, играет роль внутримолекулярного шаперона, который определяет сворачивание белка. Кроме того, продемонстрировано, что прочасти ТПП способны ингибировать соответствующие зрелые белки, а также участвуют в их секреции. Карбоксиконцевые области предшественников ТПП, по-видимому, отвечают за связывание этих ферментов с различными нерастворимыми субстратами, хотя сведения на этот счет весьма ограничены.

Проведенные нами исследования, а также данные, опубликованные другими авторами, свидетельствуют, что пептидазы семейства М4 могут иметь несколько разных типов структурной организации предшественников. В данной работе впервые осуществлен систематический сравнительный анализ первичных структур полноразмерных предшественников ТПП.

2.3.1. Структура и функции М-концевых регионов предшественников

Сравнение аминокислотных последовательностей показало, что по структуре АКР предшественников пептидазы семейства М4 делятся на две основные группы (рис. 7).

Первая группа включает 74 фермента, для которых характерны удаляемые в ходе созревания N-концевые регионы протяженностью 183-287 а.о. (далее длинные АКР). Все экспериментально охарактеризованные белки этой группы секретируются во внеклеточную среду и несут на N-конце предшественника типичные сигнальные пептиды, которые могут быть успешно идентифицированы существующими в настоящее время методами предсказания. За сигнальным пептидом у белков с длинными АКР расположена область, называемая пропоследователыюстью, пропептидом или прочастью. Размер пропептидов составляет 162-264 а.о.

Для целого ряда термолизииподобных протеаз с длинными АКР показано, что про-последовательности выступают в качестве так называемых внутримолекулярных шапе-ронов, без которых, как правило, невозможно формирование активного фермента. Кроме того, такие пропептиды действуют как ингибиторы зрелого белка. Причем, по-видимому, эта функция прочастей существенна in vivo для предотвращения преждевременного высвобождения активного фермента, которое может быть губительно для клетки. Наличие пропептидов, вероятно, также необходимо для секреции ТПП с длинными АКР. Важно отметить, что длинные пропептиды, как показано в ряде случаев, отщепляются автоката-литически и внутримолекулярно.

В структуре пропептидов ТПП с длинными АКР можно выделить две области, отличающиеся наибольшим консерватизмом. Первая область, которую мы обозначили как R-кластер, соответствует остаткам (-144)-(-106) в последовательности термолизина (Tin). Вторая - D-кластер соответствует остаткам (-47)-(-16). Между R- и D-кластерами нами обнаружен консервативный остаток А1а(-83). Оба выявленных кластера соотносятся с консервативными областями, выделявшимися в пропоследовательностях протеаз семейства М4 ранее. R-кластер близок к FTP-мотиву (PFAM ID - PF07504). D-кластер является частью домена PepSY (PF03413). Необходимо подчеркнуть, что, хотя (по данным базы данных PFAM) FTP и PepSY обнаруживаются главным образом в пропептидах ТПП, эти домены идентифицированы также в структурах пептидаз, не относящихся к семейству М4, и, кроме того, во многих белках, не являющихся пептидазами.

Вторая группа ТПП, впервые выделенная нами по структуре АКР предшественников, включает 20 из проанализированных ферментов (рис. 7), N-концевые регионы которых имеют протяженность 50-60 а.о. (далее короткие АКР). Большинство белков этой группы гипотетические. Только три фермента с короткими АКР были выделены и охарактеризованы к моменту нашего анализа. Это — протеаза Pectobacterium carotovorum, минорная протеаза Ser. marcescens и Pin (Ser_pro на рис. 7). Данных о функциональной роли АКР предшественников этой группы не было.

Нам не удалось идентифицировать классические сигнальные пептиды в последовательностях коротких АКР с использованием существующих биоинформатических методов. В то же время в структуре коротких АКР нами обнаружен консервативный гидрофобный кластер в области, близкой к стартовому метионину (рис. 5). Этот кластер, PPL-мотив, содержит семь аминокислотных остатков, три из которых инвариантны: два следующих друг за другом Pro и Leu через два остатка за ними. В большинстве случаев за парой Pro следует ароматический остаток Туг или His. Функциональная роль PPL-мотива в момент обнаружения была не ясна.

Ранее, при первичном анализе последовательности предшественника Pin, нами было высказано предположение, что ферменты с короткими АКР образуют отдельную группу внутри семейства М4. Исследование значительного набора последовательностей предшественников ТПП показало, что в семействе М4 действительно представлены два типа ферментов, отличающихся структурой АКР. При этом не удается обнаружить «про-

межуточных звеньев», которые показали бы эволюционный переход от одного типа АКР к другому. По-видимому, различия в организации АКР не могут быть объяснены видовыми особенностями клеток-хозяев, поскольку один и тот же организм может продуцировать ферменты как с короткими, так и с длинными АКР.

Заканчивая обсуждение структуры АКР предшественников пептидаз семейства М4, следует обратить внимание на два принципиальных, на наш взгляд, момента. Во-первых, пропоследовательности ТПП более толерантны к мутациям, чем зрелые части. Так, нами не обнаружено ни одного аминокислотного остатка, который был бы сохранен во всех проанализированных АКР; доля идентичных аминокислотных остатков в АКР ниже, чем в соответствующих зрелых частях; большинство модификаций наиболее консервативных остатков пропоследовательностей ТПП (есть данные только для длинных АКР) не приводит к полному нарушению функционирования фермента; пропептиды ТПП могут быть «переставлены» от одного белка группы к другому, протяженные участки пропоследовательностей ТПП могут быть заменены чужеродными последовательностями без нарушения способности к фолдингу и процессингу. Во-вторых, анализ накопления мутаций в АКР и зрелых частях белков группы показывает, что оно происходит согласовано, т.е. АКР и каталитические части эволюционируют вместе и обмена этими доменами между разными ферментами не происходит.

Можно предположить, что в такой системе пропептиды, обладающие повышенной вариабельностью, служат специфическим модулем быстрой эволюции, изменения в котором влияют на функционирование зрелых белков in vivo. Мутации в пропоследовательности могут сказываться на накоплении и локализации фермента в клетке. Кроме того, экспериментально показана возможность прямого влияния изменений в пропептидах на каталитические свойства зрелых протеаз. В настоящее время опубликовано, по крайней мере, четыре таких примера. Для субтилизина и дрожжевой карбоксипептидазы Y показано, что к формированию отличающихся по свойствам от белка дикого типа конфор-меров приводят точечные мутации в пропептиде. У катепсина Е такой эффект возникает при замене пропептида на пропоследователыюсть родственного белка катепсина D. И, наконец, недавно такой эффект обнаружен нами для ТПП: при сворачивании фермента из Thermoactinomyces sp. 27а с собственным пропептидом in eis и in trans формируются протеазы, отличающиеся первичной субстратной специфичностью.

2.3.2. Структура и функции С-концевых регионов предшественников

Анализ последовательностей предшественников пептидаз семейства М4 показал, что 37 ферментов из нашей выборки имеют дополнительное, по отношению к каталитической части, расширение на С-конце. Среди этих белков 33 относятся к ТПП с длинными АКР, для 3 характерны короткие АКР и один не удается отнести ни к той, ни к другой группе.

Размер дополнительных карбоксиконцевых регионов (ККР) находится в диапазоне от 110 до 670 а.о. Различия в первичной структуре ККР разных ферментов еще более значительные, чем у АКР. В ряде случаев экспериментально показано, что ККР отсутствуют в зрелых активных белках и, таким образом, могут быть названы С-концевыми пропеп-тидами. Напротив, некоторые протеазы семейства выделены из природных хозяев исключительно в форме (также каталитически активной), включающей ККР. Однако в тех случаях, когда исследования металлопротеаз, гены которых кодируют ККР, проводятся более детально, как правило, оказывается, что in vivo один и тот же белок присутствует в обоих вариантах: с ККР и без него. In vitro рекомбинантные протеазы также переходят из формы, включающей ККР, в укороченную, причем, по-видимому, этот процесс

осуществляется автокаталитически. Суммируя опубликованные данные, можно полагать, что предшественники ТПП в большинстве случаев теряют ККР, однако время жизни форм с ККР существенно отличается для различных белков.

Наиболее заметной особенностью ККР предшественников ТПП является наличие в структуре значительной их части ранее идентифицированных консервативных белковых доменов. Эти домены обнаружены также в большом количестве бактериальных и архебактериальных белков, а также в белках млекопитающих и других позвоночных. Широкая распространенность консервативных доменов, встречающихся в ККР, наводит на мысль о перестановке (шаффлинге) этих доменов между белками различных групп.

Экспериментальных данных о функциях ККР у ТПП в настоящее время мало. Однако они позволяют предполагать, что ККР обеспечивают связывание ферментов с нерастворимыми белковыми и/или полисахаридными субстратами. Вывод о том, что ККР пептидаз семейства М4 являются субстратсвязывающими модулями, подтверждается полученными для ферментов других групп данными о свойствах встречающихся в них консервативных доменов. По-видимому, ККР у ТПП могут отвечать за клеточную локализацию, поскольку в ряде случаев включают консервативные домены, характерные для разнообразных белков клеточной поверхности бактерий.

Таким образом, данные о функциях ККР у ТПП и обнаруживаемых в их составе консервативных доменов позволяют предполагать, что большинство ККР являются модулями, связывающимися с высокомолекулярными нерастворимыми субстратами.

2.3.3. Термолизинподобные протеазы, кодируемые одним геномом

Анализ доступных данных о структуре геномов показывает, что некоторые из них содержат несколько генов термолизинподобных протеаз. Во многих случаях гены одного организма кодируют ТПП, отличающиеся строением предшественников. Эти ферменты могут отличаться структурой как АКР, так и ККР. Анализ последовательностей таких белков показывает, что для них характерны те же, что и для семейства М4 в целом, тенденции. Так, АКР имеют меньший консерватизм по сравнению со зрелыми частями, в то же время накопление мутаций в АКР и зрелых частях происходит согласовано. Структура ККР указывает на перетасовку доменов: близкие каталитические домены сочетаются с разными доменами в ККР.

Описанная ситуация позволяет предполагать, что наличие нескольких ТПП дает организму определенные эволюционные преимущества. По-видимому, функции ферментов набора отличаются, что определяется 14- и С-концевыми пропептидами. При этом многообразие протеаз с длинными АКР, вероятно, является, в первую очередь, следствием дупликации одного гена и перестановки доменов, но эволюция ферментов с длинными и коротким АКР идет независимо.

2.3.4. Основные итоги анализа первичной структуры предшественников термолизинподобных протеаз

Подводя итоги анализа, мы хотели бы констатировать наиболее существенные факты, касающиеся организации предшественников пептидаз семейства М4:

- все предшественники ТПП, кроме каталитического модуля, содержат аминоконцевые регионы (АКР), которые удаляются при созревании;

- существуют АКР двух типов: короткие (около 50 а.о.) и длинные (около 200 а.о.);

- длинные АКР состоят из секреторного лидера и пропептида, который выполняет функции внутримолекулярного шаперона, способен ингибировать зрелый фермент, а также, по-видимому, принимает участие в секреции;

- длинные АКР не содержат ни одного остатка, консервативного во всех последовательностях пептидаз семейства М4;

- в коротких АКР не удается обнаружить классических сигнальных пептидов, в то же время короткие АКР содержат консервативный PPL-мотив вблизи стартового метионина;

- функции коротких АКР неизвестны;

- АКР менее консервативны, чем каталитические части ТПГТ, однако накопление мутаций в АКР коррелирует с накоплением мутаций в каталитических доменах;

- примерно треть предшественников ТПП имеет ККР (у предшественников с длинными АКР они обнаруживаются почти в половине случаев, у предшественников с короткими АКР - заметно реже);

- ККР содержат консервативные домены, которые встречаются во многих других белках различных организмов и, по-видимому, обеспечивают взаимодействие с высокомолекулярными субстратами.

Таким образом, в результате нашего анализа впервые установлено, что существуют две группы ТПП, отличающихся по структуре N-концевых пропептидов. Между двумя типами пропептидов не удается выявить эволюционной связи. При этом имеющаяся информация дает основания полагать, что ферменты с разными типами АКР выполняют в клетке разные функции. Нами также впервые систематически рассмотрена ситуация с С-концевыми расширениями ТПП и сделан вывод о том, что добавление ККР к каталитическому домену этих ферментов может расцениваться как стандартный способ изменения функций протеаз группы in vivo.

Анализ структуры предшественников ТПП демонстрирует важную роль пропептидов в функционировании белков семейства, что делает его представителей перспективными в качестве моделей для изучения механизмов действия пропоследовательностей. Результаты анализа позволяют также выбрать основные направления дальнейших исследований: изучение механизмов влияния пропептидов на функциональные свойства зрелых частей, выяснение функций и механизмов действия коротких пропептидов, а также установление пространственных структур предшественников ТПП.

2.4. Участие пропептидов в формировании активной металлопротеазы Thermoactinomyces species

В соответствии с результатами описанного выше биоинформатического анализа впервые обнаруженная нами металлопротеаза Thermoactinomyces sp. 27а (Mpr-Thr) имеет архитектуру предшественника, характерную для значительного числа представителей семейства пептидаз М4. Поэтому данный фермент был использован нами в качестве модели для исследования функциональной роли длинных N-концевых пропептидов и С-концевых расширений ТПП.

Первым этапом исследования стала попытка выяснить функции С-концевого пропептида Mpr-Thr, удаляемого в процессе созревания и содержащего консервативный РРС-домен. Как обсуждалось выше, функции ККР предшественников ТПП в целом не ясны, хотя имеющиеся данные позволяют предполагать, что эти участки являются связывающими высокомолекулярные субстраты модулями. В то же время, подобные С-концевые участки не являются уникальными для ТПП. Для ряда протеаз других групп показано участие ККР в секреции, что указывает на такую возможность и в случае Mpr-Thr. Кроме того, нельзя исключить, что, аналогично N-концевым пропептидам, ККР может быть существенным для формирования активной протеазы.

Для экспериментальной оценки участия ККР в формировании активной Mpr-Thr нами был сконструирован и экспрессирован в клетках В. subtilis ген, кодирующий

фермент, в котором С-концевой нропептид замещен Непоследовательностью (SNMat на рис. 8). Культуры клеток В. subtilis, несущих вектор с геном SNMat и аналогичный вектор с геном, кодирующим полноразмерный предшественник, демонстрировали схожие кривые роста при периодическом культивировании и динамику накопления протеолитической активности в культуральной среде. Белковые продукты обоих генов (SNMat и SNMatC на рис. 8) не отличаются по термостабильности. Полученные данные позволяют заключить, что удаление С-концевого пропептида не влияет на продукцию внеклеточного фермента клетками бацилл и существенно не влияет на формирование функционально активной молекулы. Таким образом, роль ККР металлопротеазы in vivo, по-видимому, связана со взаимодействием предшественника с другими молекулами или надмолекулярными структурами.

В отличие от ситуации с ККР, для длинных N-концевых пропоследовательностей ТПП хорошо известна их функция фолдинг-ассистента. В то же время, предполагаемое использование Mpr-Thr в качестве модельного объекта при исследовании структурно-функциональной организации длинных пропептидов требует строгого доказательства участия АКР в формировании каталитически активного фермента. Для решения этой задачи на основе штамма Е. coli BL21 (DE3) и плазмиды рЕТ-23с нами были получены продуценты предшественника Mpr-Thr без сигнального пептида и ККР (NMat на рис. 8), зрелой части (Mat) и N-концевого пропептида фермента (N). На З'-конец генов NMat и Mat была введена последовательность, кодирующая №з6-якорь. В случае варианта N такой элемент был введен на 5'-конец гена. При экспрессии доля всех рекомбинантных белков составляла 30-40% от общего количества внутриклеточных белков Е. coli. При этом NMat и Mat накапливались преимущественно в нерастворимой форме, а N был в равной степени представлен в растворимой и нерастворимой фракции бактериальных клеток.

Белки NMat и Mat переводили в раствор, используя 8 М мочевину, а их ренатура-цию инициировали десятикратным снижением концентрации денатурирующего агента путем однократного разведения. За образованием функционального фермента следили, определяя протеолитическую активность в ренатурирующем растворе. В условиях эксперимента Mat был не способен формировать активный фермент. В то время как NMat сворачивался в каталитически активную форму. Функционально активная протеаза также формировалась при сворачивании Mat в присутствии N — ковалентно несвязанного N-концевого пропептида. Полученные данные демонстрируют, что для Mpr-Thr, как для других ТПП с длинными пропептидами, характерен пропептид-зависимый механизм сворачивания. При этом N-концевой пропептид способен выполнять функцию фолдинг-ассистента вне зависимости от того, связан он ковалентно с каталитическим доменом или нет. В то же время, скорость формирования активного фермента существенно выше, если пропоследовательность и зрелая часть представляют собой одну молекулу.

Во всех изученных случаях сворачивание протеаз при участии пропептидов находится под кинетическим, а не термодинамическим контролем, а нативное состояние зрелых белков не является глобальным энергетическим минимумом. Следствием этого является эффект «белковой памяти» - формирование молекул фермента, соответствующих разным локальным энергетическим минимумам и отличающихся пространственной организацией, при участии разных или модифицированных пропоследовательностей. Этот

«да

Рис. 8. Схема первичных структур сконструированных вариантов металлопротеазы Thermoactinomyces sp. 27а. Обозначения соответствующих белков даны слева. S - сигнальный пептид, N - N-концевой пропептид. Mat -зрелая часть, С - С-концевой пропептид.

Таблица 2. Удельная активность вариантов металлопротеазы Thermoactinomyces sp. 27а, полученных при сворачивании с пропептидом in eis и in trans

Субстрат*

Удельная активность, мкмольхмг'хмин"1

in as

in Irans

DNP-Ala-Ala-Leu-Arg-NH, DNP-Ala-Ala-Phe-Arg-NH^ DNP-Ala-Ala-Val-Arg-NH,

3,3±0,1 3,2±0,2 1,8±0,1

3,3±0,2 1,4±0,2 0,4±0,1

Жирным шрифтом выделено положение РГ.

феномен был обнаружен при введении точечных замен в пропептид субтилизина и кар-бокеипептидазы Y, а также при перестановке прорегионов родственных аспартильных протеаз катепсинов Е и D. Можно ожидать, что эффект «белковой памяти» характерен и для белков других групп, и что альтернативные конформации, соответствующие разным локальным энергетическим минимумам, будут возникать также при других изменениях процесса про-зависимого сворачивания, например, при фолдинге in trans.

Для подтверждения этой гипотезы мы охарактеризовали варианты активной металлопротеазы Thermoactinomyces sp. 27а, образовавшиеся при сворачивании in eis и in trans. Белки были очищены до электрофоретически гомогенного состояния с использованием аффинной хроматографии на бацитрацин-сефарозе и высокоэффективной гель-проникающей хроматографии. Аминоконцевая последовательность полученного in eis фермента (AAATGT) совпадала с установленной ранее для нативного белка, что свидетельствует о корректном процессинге.

Субстратная специфичность очищенных белков была изучена с использованием набора синтетических хромогенных пептидных субстратов, отличающихся остатком в положении РГ. Данные об удельной активности обоих вариантов Mpr-Thr по этим субстратам (табл. 2) показывают существенные различия в их первичной специфичности (по отношению к остатку в положении РГ). Таким образом, сворачивание in trans приводит к формированию фермента с более узкой субстратной специфичностью, что предполагает разную структуру субстратсвязывающей области двух исследованных белков. Возможно, различия в структуре объясняются тем, что в случае NMat внутримолекулярное удаление пропептида требует локализации N-концевой области каталитической части в S' субсайте фермента, накладывая дополнительные, по сравнению с фолдингом in trans, ограничения при формировании субстратсвязывающей области.

Таким образом, в ходе исследований Mpr-Thr нами было показано, что С-концевой пропептид этого фермента не влияет на формирование активного белка и его секрецию. Мы установили также, что образование активного фермента происходит только в присутствии N-концевого пропептида, но как in eis, так и in trans. На модели Mpr-Thr впервые для металлопротеаз был продемонстрирован эффект белковой памяти. При этом впервые обнаружено, что формирование конформеров может происходить в системе пропептид-каталитическая часть in trans, а не при изменении последовательности пропептида.

2.5. Процессинг предшественника протеализина

Анализ первичной структуры предшественников пептидаз семейства М4 показал, что по структуре N-концевых пропептидов ТПП делятся на две группы. Пропептиды ферментов, относящихся к первой группе, сходны с пропоследователыюстью термолизина (Tin), в то время как предшественники белков второй группы по структуре аминокон-цевых регионов похожи на протеализин (Pin).

Пропептиды ТПП, сходные с пропоследовательностью Tin, играют важную роль в функционировании соответствующих ферментов. Они выполняют функцию

-50 -40 -30 -20 -10 -1 1 10

MPTLTARSVXPPYMbRRIIEHGSLPQRDCALHTLNHVQSLLGNKPLRAPG-AKTSTGGEVI

proPlnHis,/A proPlnHis, ¡ntPlnHis,/A PlnHis,,; PInHisyA

Рис. 9. Аминоконцевая последовательность предшественника протеализина. Подчеркнуты N-концевые последовательности охарактеризованных форм Pin. PPL-мотив приведен на сером фоне. Позиция 1 соответствует первому аминокислотному остатку зрелого фермента.

внутримолекулярных шаперонов, способны ингибировать соответствующие им зрелые белки, а также участвуют в секреции. Такие пропоследовательности удаляются автока-талитически. При этом для Tin и металлопротеазы Listeria monocytogenes показано, что отщепление пропептида может происходить только внутримолекулярно.

Функции пропептидов протеализинового типа к началу нашей работы известны не были. Созревание протеализинподобных протеаз (ППП) систематически не изучалось. Несмотря на то, что опубликованные данные указывали на автокаталитический про-цессинг таких ферментов, оставалось неясным, способны ли их пропептиды, подобно пропоследовательностям термолизинового типа, удаляться внутримолекулярно, а также может ли гидролиз предшественника осуществляться другой протеазой. Поэтому нами были изучены возможные пути созревания белков данной группы на модели Pin. Для исследования механизма процессинга предшественника Pin в данной работе использованы стандартные подходы: модификация каталитического центра и изучение созревания предшественника в иммобилизованном состоянии.

Для получения рекомбинантных предшественника Pin и зрелого Pin (proPlnHis6 и PlnHis6, соответственно), несущих Ш86-последовательность в С-концевой области, мы сконструировали экспрессионный вектор pProPlnHis6 на основе плазмиды pSlT20. Конструкция pProPlnHis6 была использована для создания pProPlnHis6/A - вектора для экспрессии предшественника Pin, имеющего мутацию Glul 13—>А1а в активном центре фермента (proPlnHis6/A). Остаток Glul 13 (Glul43 в Tin) играет ключевую роль в катализе ТПП, и, как было показано ранее на других моделях, его замена приводит к образованию неактивного фермента.

Для экспрессии модифицированных генов Pin векторы pProPlnHis6 и pProPlnHis6/A были введены в клетки Е. coli BL21 (DE3). Оба варианта накапливались внутри клеток. При этом часть белка находилась в нерастворимом виде, однако значительное количество фермента обнаруживалось в растворе. Именно растворимая фракция была использована нами в дальнейшей работе.

После разрушения клеток Е. coli BL21 (DE3) (pProPlnHis6), как и в случае белка дикого типа, предшественник Pin (proPlnHis6) переходил в зрелую форму (PlnHis6) при инкубации при 4°С в течение 24-72 ч. Этот процесс сопровождался увеличением протео-литической активности клеточного лизата.

Зрелый Pin (PlnHis6) был очищен до электрофоретического гомогенного состояния с использованием металло-хелат аффинной и гельпроникающей хроматографии. Аминоконцевая последовательность полученного белка (AKTST, рис. 9) совпадала с определенной ранее для немодифицированного зрелого Pin. Также как белок дикого типа, PlnHis6 проявлял оптимум активности при гидролизе азоказеина при рН около 7 и полностью ингибировался 1 мМ о-фенантролина.

Для предотвращения процессинга proPlnHis6 все манипуляции при очистке этого белка проводили при рН 11. В этих условиях Pin, подобно другим ТПП, не проявляет протеолитической активности и, следовательно, не способен автопроцессироваться. Предшественник Pin был очищен до электрофоретически гомогенного состояния (рис. 10,

proPlnHis6). Аминоконцевая последовательность этого белка - VIPPY, таким образом, рго-PlnHis6 не содержит восьми N-концевых остатков, кодируемых геном (рис. 9). Очищенный proPlnHis6 стабилен в растворе при рН 11 и 4°С в течение 30 дней. При переводе в раствор с рН 7,3 белок полностью переходит в зрелую форму. Этот процесс идет через образование интермедиата (intPlnHis6) с молекулярной массой около 34 кДа (рис. 10). Скорость про-цессинга proPlnHis6 зависит от рН. Характер этой зависимости совпадает с характером зависимости от рН протеолитической активности зрелого Pin. Созревание proPlnHis6 полностью подавляется 2 мМ о-фенантролина, в то же время 2 мМ PMSF не оказывает влияния на этот процесс.

Для выяснения того, является ли про-цессинг предшественника Pin внутримолекулярным или межмолекулярным событием, была исследована способность proPlnHis6 созревать в иммобилизованном состоянии. Иммобилизацию проводили при рН 11 на Nr-HTK агарозе через Hi непоследовательность. Для осуществления процессинга иммобилизованный белок переводили в буфер с рН 8,4 и инкубировали при 37°С. Как видно из рис. 11, через 4 ч после начала инкубации детектировать промежуточную и зрелую формы фермента не удавалось. Поскольку причиной неспособности предшественника формировать зрелую форму может быть потеря ферментом активности при иммобилизации, с использованием PlnHis6 нами было продемонстрировано отсутствие такого эффекта.

Мутантный предшественник Pin (proPlnHis6/A) был очищен до электрофоретиче-ски гомогенного состояния. Аминоконцевая последовательность (PTLTAR, рис. 9) и молекулярная масса proPlnHis6/A (38103 Да), определенная методом масс-спектрометрии, соответствуют белку без стартового Met, с заменой в активном центре Glu(l 13)—>А1а и шестью гистидинами в С-концевой области.

Очищенный proPInHis6/A стабилен в растворе при рН 8,0 и 4°С в течение 30 суток, а также при рН 7,3 и 37°С в течение 24 ч. При действии активного протеализина proPlnHis6/A переходит в зрелую форму (PlnHis6/A). Этот процесс идет через образование интермедиата (intPlnHis6/A), который по молекулярной массе (около 34 кДа) совпадает с промежуточной формой, образующейся при созревании proPlnHis6. Аминоконцевая последовательность PlnHis6/A (AKTST) идентична N-концу PlnHis6. Аминоконцевая последовательность промежуточной формы - LLGNK, таким образом, интермедиат содержит 11 дополнительных N-концевых остатков по сравнению со зрелым белком (рис. 9).

Мутантный предшественник Pin способен переходить в зрелую форму при обработке субтилизином и Tin. Как и при действии активного протеализина, процессинг идет через промежуточную форму. По данным электрофоретического анализа зрелые и промежуточные формы, образующиеся при действии всех трех ферментов, близки по молекулярным массам.

Рис. 10. Созревание предшественника протеализина (proPlnHis6) в растворе. Положение предшественника (pro), промежуточной (int) и зрелой формы (mat) показано стрелками.

Время инкубации, ч и О 4 |

S Im S Im а

pro ■ nial ■

Рис. 11. Электрофоретический анализ образцов предшественника протеализина (ргоР1пН156), иммобилизованного на №2+-НТК агарозе. 5 - раствор, в котором инкубировалась №2+-НТК агароза с иммобилизованным ргоР1п№56, 1т - ргоР1пЬПз6 после инкубации на сорбенте. Обозначения как на рис. 10.

Полученная нами совокупность экспериментальных данных позволяет сделать выводы о возможных механизмах процессинга протеализина и подобных ему ферментов. Прекращение созревания предшественника Pin, после модификации ключевого остатка активного центра, Glu(l 13)—>А1а, свидетельствует об автокаталитическом процессинге. Аналогичные результаты опубликованы для ряда ТПП, имеющих длинные пропептиды, а также для протеазы PrtS Ph. luminescens, относящейся к группе Pin. Таким образом, можно заключить, что, вне зависимости от структуры предшественника, удаление про-пептидов ТПП может происходить автокаталитически.

При этом данные о поведении предшественника протеализина в иммобилизованном состоянии демонстрируют его неспособность к внутримолекулярному процессингу. Это впервые показывает, что свойства предшественника Pin и, по-видимому, предшественников других ППП отличаются от свойств предшественников ферментов с длинными пропептидами. Так, для Tin и металлопротеазы L. monocytogenes показано, что отщепление пропептида происходит внутримолекулярно. На это указывает и установленная недавно структура гидролизованного комплекса относящегося к семейству пептидаз М4 вибриолизина МСР-02 из Pseudoalteromonas sp. SM9913 с собственным пропептидом термолизинового типа.

В то же время, мутантный предшественник Pin может процессироваться межмо-лекулярно под действием зрелого Pin и других протеаз, например, Tin и субтилизина. Похожие результаты были получены ранее для протеализинподобной протеазы PrtS Ph. luminescens, а также для некоторых ТПП с длинными пропептидами. Однако зрелые Tin и металлопротеаза L. monocytogenes не способны отщеплять собственные пропептиды межмолекулярно.

Сопоставляя данные о возможных вариантах удаления пропоследовательностей у ТПП с длинными и короткими пропептидами, можно сделать вывод о том, что созревание предшественников ферментов этих двух групп происходит по-разному. Неспособность Pin к внутримолекулярному процессингу позволяет предполагать, что, наиболее вероятно, созревание этого фермента in vivo происходит с участием другой протеазы, в то время как для ферментов с длинными пропептидами доминирующим механизмом, по-видимому, является внутримолекулярный автопроцессинг.

Нами впервые изучен путь созревания предшественника ТПП с коротким пропептидом. Созревание предшественника Pin происходит ступенчато. Первая стадия процессинга сопровождается отщеплением восьми лидерных аминокислотных остатков, и, таким образом, не модифицированный предшественник Pin, выделенный из клеток Е. coli, содержит на N-конце последовательность PPL-мотива (рис. 9). Однако эти восемь остатков не удаляются после модификации активного центра фермента. Таким образом, первый этап процессинга происходит автокаталитически и, по-видимому, внутримолекулярно. Следовательно, PPL-мотив взаимодействует с S' субстратсвязывающим субсайтом Pin. Возможно, именно с этим связан консерватизм данного мотива у ППП. На второй стадии происходит удаление большей части пропептида, что приводит к образованию промежуточной формы, которая в случае автопроцессинга содержит 11 дополнительных N-концевых остатков по сравнению со зрелым белком (рис. 9). Третья стадия процессинга приводит к образованию зрелого фермента. Необходимо отметить, что молекулярные массы промежуточных и зрелых форм, полученных при действии Pin, субтилизина и Tin, совпадают по результатам электрофореза. Этот факт позволяет думать, что место, в котором происходит гидролиз предшественника на второй и третьей стадии, определяется, в первую очередь, пространственной струюурой процессируемого белка. В частности,

доступностью для действия протеаз района Leu(-11)-Alal (рис.9). Расщепление предшественника на второй и третьей стадии процессинга, по-видимому, может происходить только межмолекулярно, так как иммобилизованный предшественник Pin процессиро-ваться не способен.

Таким образом, наши результаты впервые демонстрируют, что два типа пропосле-довательностей ТПП заметно отличаются не только структурно, но и функционально. Можно полагать, что такая ситуация определяется различной биологической ролью соответствующих ферментов.

2.6. Пространственная структура предшественника протеализина

Совокупность полученных нами и опубликованных другими исследователями данных о структуре и свойствах ТПП позволяет думать, что биологические функции пеп-тидаз семейства М4 во многих случаях могут определяться именно структурой их про-пептидов, а не зрелыми частями ферментов. Однако для понимания особенностей функционирования этой системы пока недостаточно структурных и биохимических данных. В частности к началу нашей работы отсутствовали данные о пространственной структуре предшественников ТПП и каталитических доменов протеализинподобных проотеаз. Выяснение механизма процессинга Pin и создание его непроцессирующегося варианта позволило нам осуществить рентгеноструктурные исследования этого белка - первые исследования пространственной структуры предшественника ТПП. Кристаллизация и решение пространственной структуры предшественника Pin осуществлены совместно с сотрудниками Института кристаллографии РАН.

2.6.1 Кристаллизация предшественника протеализина

Для кристаллизации нами был использован электрофоретически гомогенный препарат не способного к автопроцессингу предшественника Pin с мутацией ключевого остатка каталитического центра (proPlnHis6/A). Было получено два типа кристаллов, различающихся по морфологии: одни - в виде плоских четырехугольных пластин со средними размерами 0,3х0,3х0,03 мм, другие - в виде треугольных клиньев со средними размерами 0,5х0,3х0,05 мм.

Две кристаллические формы оказались различными по рентгенографическим характеристикам. Выяснилось, что четырехугольные кристаллические пластины относятся к моноклинной сингонии и имеют следующие параметры элементарной ячейки: а = 64,13 Á; b = 77,29 А; с = 69,85 А, угол моноклинности р = 105,88°. Более изометрич-ньте клиновидные кристаллы относятся к ромбоэдрической сингонии и имеют размеры элементарной ячейки а = 59,28 Á; b = 70,76 Á; с = 78,65 Á, углы а = р = у = 90°.

Дифракционные рефлексы от моноклинных кристаллов достигали разрешения 2,2 А, а от ромбоэдрических — 1,8 А, поэтому обе формы были пригодны для дальнейшего рентгеноструктурного исследования. Однако ромбоэдрические кристаллы рассеивали до более высокого разрешения, были более изометричны и содержали только одну молекулу в независимой части элементарной ячейки. Поэтому именно они были использованы при решении пространственной структуры предшественника Pin (proPln). Набор дифракционных данных от кристаллов был собран с разрешением 1,8 Á при длине волны 0,99 Á и 100 К с применением источника синхротронного излучения в Курчатовском центре синхротронного излучения и нанотехнологий. Координаты атомов и структурные данные депонированы в банк данных PDB (www.rcsb.org) под номером доступа 2VQX.

Пропептид формирует в молекуле proPln отдельный домен (рис. 12), который взаимодействует с каталитической частью в области активного центра. При этом N-концевая часть пропептида занимает непосредственно субстратсвязывающий участок фермента. Важно отметить, что на картах электронной плотности нам не удалось идентифицировать некоторые участки молекулы proPln: 2-5, 38-51 и 342-347. В то же время установленная нами при помощи масс-спектрометрии молекулярная масса (38103 Да) и N-концевая последовательность (PTLTAR) очищенного белка, который использовался для кристаллизации, соответству-Рис. 12. Общий вид структуры предше- ют полноразмерному предшественнику без стар-ственника протеализина. Зрелая часть и „

пропептид показаны коричневым и си- тового метионина, с заменой Glul63 на Ala и His6-ним цветом, соответственно. Каталитиче- последовательностью на С-конце. Сопоставление ский Zn2* представлен как зеленая сфера, вышеперечисленных фактов свидетельствует о высокой подвижности указанных регионов, что в случае участков 2-5 и 342-347, представляющего собой №з6-якорь, может быть связано с их положением на N- и С-конце молекулы, соответственно. Подвижность же региона 38-51, по-видимому, имеет функциональное значение. Этот участок, включающий 13 С-концевых остатков пропептида и первый остаток зрелой части, содержит сайты протеолиза при автокаталитическом удалении пропептида, здесь же, судя по всему, происходит и гетерокаталитический процес-синг proPln. Таким образом, доступная широкому спектру эндопептидаз подвижная петля 38-51, вероятно, обеспечивает возможность эффективного удаления пропептида Pin.

2.6.2. Общая характеристика структуры

2.6.3. Структура каталитического домена

Пространственная структура зрелой части Pin в целом демонстрирует высокое сходство со структурой термолизина (Tin) и других ТПП, однако имеет несколько очень существенных локальных отличий.

В структуре Pin нам не удалось обнаружить ионов кальция, хотя все ТПП, для которых ранее установлены пространственные структуры, связывают от 1 до 4 ионов этого металла. Причем во всех исследованных ранее случаях была продемонстрирована важность ионов кальция для стабилизации молекул белков семейства, следствием чего является повышение термостабильности при увеличении концентрации Са-+. Анализ структуры Pin в областях, соответствующих сайтам связывания ионов кальция Tin и других ТПП, показывает, что в Pin все эти участки заметно отличаются. Сопоставление аминокислотных последовательностей ферментов с короткими пропептидами демонстрирует высокий консерватизм обсуждаемых участков у протеализинподобных протеаз (ППП). Этот факт позволяет заключить, что такая структура является общей особенностью белков этой группы. Таким образом, нами впервые показано, что молекула ТПП может не содержать ионов кальция.

Структура зрелой части Pin отличается от известных пространственных структур других ТПП не только отсутствием ионов кальция. Наиболее значимыми являются различия в структуре активного центра. Все установленные ранее пространственные струк-

ЯШ

туры ТПП принадлежат ферментам с длинными пропептидами. Активные центры этих белков содержат каталитический ион цинка и локализованы в щели между N- и С-концевыми доменами. В случае Pin желоб активного центра перекрыт со Рис. 13. Консенсусная последователь-стороны S' субсайта (обозначение по Шехтеру и ность AYDD-шпильки (подчеркнута) и Бергеру), что обеспечивает дополнительные кон- смежных регионов. Нумерация по proPln. такты N- и С-коицевых доменов. «Перегородка» щели активного центра сформирована участком 235-244, обозначенным нами как AYDD-шпилька. Анализ репрезентативного набора последовательностей ТПП показал, что этот структурный элемент не встречается в известных пептидазах семейства М4 с длинными пропептидами, но обнаруживается во всех ферментах с короткими пропоследовательностями и имеет высококонсервативную последовательность (рис. 13). Таким образом, наличие AYDD-шпильки является характерной особенностью ППП, наряду с коротким пропептидом. При этом пропептид и AYDD-шпилька в молекуле Pin непосредственно взаимодействуют, что позволяет рассматривать AYDD-шпильку как структурный элемент, обеспечивающий комплементарность зрелой части и пропептида. Кроме того, возможно, именно наличие AYDD-шпильки, приводящее к изменению геометрии активного центра в районе S1 субсайта, определяет сужение субстратной специфичности Pin: недавно нами показано, что Pin, высокоспецифично, в отличие от Tin, действует на актин.

Обратим внимание на еще один существенный факт. Tin и эластаза P. aeruginosa (РАЕ) могут быть получены в двух кристаллических формах в зависимости от того, связаны они с лигандом или нет. Причем ферменты в комплексе с лигандом демонстрируют «закрытую» конформацию субстратсвязывающей щели, а свободные ферменты более «открытую» конформацию. Эти данные позволили сделать вывод о том, что у ТПП во время каталитического цикла происходит изменение положения С- и N-концевых доменов относительно друг друга. Предшественник Pin, который можно рассматривать как зрелый фермент в комплексе с лигандом, имеет более открытую конформацию субстратсвязывающей щели, чем «открытая» форма Tin, и почти также открыт, как «открытая» форма РАЕ. Вероятно, такая ситуация является результатом взаимодействия зрелой части с пропептидом (см. ниже). Однако нельзя исключить, что наличие AYDD-шпильки препятствует сближению доменов, вследствие чего для Pin не характерно их движение в ходе каталитического цикла и фермент всегда имеет «открытую» конформацию.

Таким образом, зрелая часть Pin обладает характерными особенностями: не содержит ионов кальция и имеет значительные изменения в области активного центра. Наш анализ показывает, что эти отличия не являются индивидуальными для Pin, а, по-видимому, свойственны для всех ТПП с короткими пропептидами. Таким образом, группа Pin может быть выделена в отдельное подсемейство не только по первичной структуре предшественников, но и по пространственной структуре зрелых частей.

2.6.4. Структура и взаимодействия пропептида

Пропептид Pin, как уже отмечалось выше, представляет собой отдельный домен (рис. 12), соединенный со зрелой частью гибким спейсером (остатки 38-51). В детектируемой части пропептида (остатки 6-37) можно выделить два структурных элемента: шпильку, состоящую из двух а-спиралей (al - 11-22 и a2- 23-36), и N-концевой сегмент (6-10). Пропептид взаимодействует со зрелой частью в области активного центра (рис. 14). При этом а2 контактирует с поверхностью N-концевого домена

каталитической части, С-концевая часть cd -с AYDD-шпилькой (которую можно рассматривать как элемент С-концевого домена), а N-концевая часть al и N-концевой сегмент опущены во впадину активного центра.

Между спиралями al и а2 реализованы гидрофобные контакты, в которые вовлечены боковые группы остатков Leu 15 и fiel9 со стороны al и Arg27, А1а30, Leu31 и Leu34 со стороны а2. С каталитическим доменом al и а2 взаимодействуют по-разному. Для спирали а2 основными, по-видимому, являются водородные связи Gln26.Ns2-Glul48.Osl, ТЬгЗЗ. Oyl-Glnl31.N, а также Cys29.Sy-Glul29.Osl. цинка представлен оранжевой сферой; про- Взаимодействия al более сложны и разно-пептид окрашен синим, кроме PPL-мотива, образны. В С-концевой части al реализовано который показан сиреневым. гидрофобное взаимодействие бокового ради-

кала 11е18 с боковыми цепями остатков Ilel49, Phel50, Leu240 и Leu241, а также алифатической части боковой цепи Arg 17 с Leu241. Существенно, что остатки 149 и 150 относятся к N-концевому домену зрелой части Pin, а остатки 240 и 241 принадлежат AYDD-шпильке, которая является частью С-концевого домена. Таким образом, в молекуле proPln, благодаря взаимодействию с пропептидом, N- и С-концевые домены зрелой части оказываются зафиксированными в положении, соответствующем открытой кон-формации субстратсвязывающей щели.

Ранее в структуре коротких пропептидов ТПП нами был обнаружен консервативный элемент — PPL-мотив (рис. 5). Как показывают полученные нами рентгеноструктур-ные данные, в молекуле proPln этот мотив соответствует N-концевой части спирали al (остатки 11-15) и двум остаткам (9 и 10) N-концевого сегмента пропептида (рис. 14). Шесть из семи остатков PPL-мотива непосредственно взаимодействует с S1 субстрат-связывающими субсайтами активного центра. Седьмой, Leu 15, находясь между al, a2 и N-концевым доменом зрелой части, по-видимому, является одним из главных связующих элементов, обеспечивающих стабильность комплекса пропептид-зрелая часть. Основными партнерами Leu 15 выступают остатки Phel50, со стороны зрелой части, и Leu34, со стороны а2.

Аминоконцевая часть пропептида (с 7 по 14 остаток) оккупирует субстратсвязыва-ющую область Pin. При этом связь Ser8-Val9 расположена так, что карбонильная группа Ser8 находится на расстоянии водородной связи от молекулы воды, взаимодействующей с каталитическим цинком (рис. 15А), т.е. соответствует связи, расщепляемой активным ферментом. Остатки пропептида, взаимодействующие с субстратсвязывающим сайтом, могут быть обозначены по Шехтеру и Бергеру следующим образом: Arg7 - Р2, Ser8 -PI, Val9 — PI', Ile 10 — P2', Proll - P3, Prol2- P4', Tyrl3- P5' и Metl4- P6' (рис. 15A). (Отметим, что позиции Р1-Р6' соответствуют остаткам PPL-мотива.) Таким образом, по сравнению со всеми другими ТПП с известными пространственными структурами S' регион в молекуле proPln существенно расширен и формально включает, вместо двух, шесть субсайтов. Причем дополнительные субсайты формируются за счет наличия AYDD-шпильки, которая консервативна для ППП.

Кристаллическая структура Pin впервые для ТПП включает полипептидный лиганд перекрывающий всю S область субстратсвязывающего центра. Ранее взаимодействия

Рис. 14. Взаимодействие пропептида и зрелой части протеализина. К-кондевой домен зрелой части показан бежевым цветом; С-концевой домен — желтым; АУОО-шпилька - зеленым; каталитический ион

Рис. 15. Субстратсвязывающий сайт протеализина. А - общий вид (стереоизображение). Разностная карта электронной плотности в области, соответствующей пропептиду, показана голубым. Изолинии проведены на уровне Зо. Б - окружение каталитической воды. В - S Г и S2' субсайты. На Б и В карты электронной плотности показаны светло-серым. Изолинии проведены на уровне 1,5а. Зрелая часть показана желто-оранжевым. Фрагменты пропептида выделены светло-зеленым. Ион цинка представлен как зеленая сфера, кислород воды НОН-2277 -как красная сфера. Расстояния между атомами приведены в Ангстремах.

пептидов с S субсайтами, кроме S1, рассматривались только теоретически. Полученные данные показывают, что остаток А1а6 не взаимодействует с каталитическим доменом, а экспонирован в растворитель (рис. 14, рис. 15А). Остатки пропептида 2-5, которые, как упоминалось выше, детектировать не удалось, по-видимому, также экспонированы в растворитель и не связываются со зрелой частью. Это, вероятно, и объясняет высокую подвижность данного участка. Таким образом, для связывания с ферментом существенны только Р1 и Р2 положения пептидного лиганда. Взаимодействие пропептида Pin с каталитическим доменом в участках S2 и S1 в целом аналогично взаимодействию лигандов с субстратсвязывающим сайтом Tin. Остатки Arg7 (Р2) и Ser8 (PI) образуют антипараллельный Р-лист с участком 133-135 каталитического домена. При этом боковые группы остатков 7 и 8 направлены из желоба активного центра в растворитель (рис. 14, рис. 15А) и, по-видимому, их природа не имеет принципиального значения для связывания. Кристаллическая структура proPln - первая пространственная структура ТПП, в которой в Р1 положении лиганда находится немодифицированный аминокислотный остаток, соединенный с остатком в положении РГ обычной пептидной связью. Таким образом, мы, по-видимому, впервые можем наблюдать аналог взаимодействия субстрата с ферментом непосредственно перед началом каталитического акта. Как упоминалось выше, карбонильный кислород Ser8 находится на расстоянии водородной связи от каталитической молекулы воды (НОН-2277) - четвертого лиганда иона цинка (рис. 15Б). Фенольная группа Tyrl77 (157TLN) и Ns2 атом азота имидазольного кольца His264 (231TLN) — остатков, стабилизирующих переходное состояние субстрата подобно «оксианионной впадине» сериновых протеаз, - ориентированы в направлении НОН-2277. При этом расстояния Туг177.0Н-Н0Н-2277.0 и His264.Ne2-H0H-2277.0 в полученной нами структуре proPln превышают длину сильной водородной связи. Не исключено, однако, что в связанной с субстратом зрелой молекуле, имеющей «закрытую» конформацию, такие связи могут образовываться. В то же время в структуре proPln, вероятно, формируется водородная связь Tyrl77.OH-His264.Ns2.

Взаимодействие пропептида Pin с каталитическим доменом в участках S1" и S2' подобно взаимодействию лигандов с аналогичными сайтами Tin и РАЕ. Основная цепь пропептида на участке Val9 (Pl')-llelO (Р21) формирует три водородные связи с регионом Asnl32-Alal33 зрелой части: Val9.N-Alal33.0, Ilel0.N-Asnl32.O51 и ИеЮ.О-Asn-132.N52 (рис. 15В). При этом расстояния Val9.0-Arg227.NHl и Val9.0-Arg227.NH2

значительно превышают длину водородной связи, в то время как при взаимодействии лигандов с Tin и РАЕ водородные связи между карбонильным кислородом остатка в положении РГ и соответствующими группами остатка Arg203TLN (198рдЕ) образуются. Эта ситуация, также как и в случае упоминавшегося выше взаимодействия Туг177 и His264 с НОН-2277, вероятно, является следствием «открытой» конформации субстратсвязываю-шего сайта proPln. Можно полагать, что при связывании лиганда со зрелым ферментом водородные связи между Val9 и Arg227 формироваться будут.

Сайт S1' является главной детерминантой субстратной специфичности ТПП. У Pin, как и у других пептидаз семейства М4, участок связывания боковой группы остатка в положении РГ представляет собой гидрофобный карман, который, однако, заметно отличается от S1' кармана Tin. Основной вклад в формирование этого участка у Pin вносят остатки Phel53, Vall59, Leu216 и Leu226, которые соответствуют остаткам Leul33TLN, Vall39TLN, Vall92TLN и Leu202TLN, формирующим SI' кар.ман Tin. При этом наличие более объемных остатков (Phel53 вместо Leul33TLN и Leu216 вместо Vail92TLN) приводит к тому, что S1' карман протеализина мельче, чем у Tin. Вероятно, Pin должен более эффективно, по сравнению с Tin и другими ТПП со сходным строением S1* кармана, гидролизовать связи образованные a-аминогруппами небольших гидрофобных остатков, таких как Ala или Val. Важной особенностью организации молекулы proPln является наличие выраженного S2' кармана, который образуется благодаря смещению остатка Phel50 (Phel30TLN) и, как бы, удлинению S1' кармана по сравнению с термолизином. Таким образом, эффективность связывания субстрата Pin, по-видимому, должна в большей степени, чем в случае Tin, зависеть от аминокислотного остатка в положении Р2' субстрата.

Как отмечалось выше, в молекуле Tin и других ТПП с установленными ранее пространственными структурами область S' содержит только два субсайта, а в каталитической части молекулы proPln обнаружены дополнительные S' субсайты, взаимодействующие с остатками 11-14 пропептида. Поскольку этот регион наиболее консервативен в коротких пропептидах, можно полагать, что его контакты очень существенны для реализации функций пропоследовательности. Абсолютно консервативные для всех коротких пропептидов остатки Pro 11 и Рго12, соответствующие положениям РЗ' и Р4' лиганда, по-видимому, обеспечивают точное стерическое соответствие между пропептидом и каталитическим доменом: тандем пролинов позволяет опустить полипептидную цепь на N-конце спирали al почти вертикально вниз. Боковым цепям остатков Tyrl3 (Р5') и Met 14 (Р61) в структуре зрелой части соответствуют четко очерченные связывающие карманы. Следует отметить, что поскольку в формировании S51 и S6' субсайтов ключевыми являются консервативные остатки AYDD-шпильки (рис. 13) и SI1, S2' кармана, наблюдаемая нами структура, вероятно, не является уникальной для обсуждаемой молекулы, а характерна для всех белков подсемейства Pin.

Рассмотрение всей совокупности взаимодействий пропоследовательности с каталитической частью позволяет предполагать, что пропептид Pin является внутримолекулярным ингибитором. Ингибиторное действие пропоследовательности реализуется, по-видимому, через блокирование S' субстратсвязывающей области фермента участком пропептида, соответствующим PPL-мотиву, и фиксацию неблагоприятной для осуществления катализа «открытой» конформации активного центра белка.

2.6.5. Основные итоги анализа пространственной структуры предшественника протеализина

Анализ пространственной структуры proPln, первой структуры предшественника пептидазы семейства М4, демонстрирует, что протеализинподобные протеазы могут рас-

сматриваться как отдельное подсемей- pProPiniiís,, | mat НтО-

СТВО термолизинподобных протеаз не pProtPlnllls,. pro Ир^ mal Кт^)-

только по структуре предшественни- pi'imiis, mai Кту)-

KOB, НО И ПО структуре зрелой части. pPlnllis/A [р^Н mal * Кь>

Характерными особенностя- Рис. 16. Схемы конструкций, использованных для экс-ми каталитического домена Pin и, по- прессии различных форм протеализина. Pro - участок видимому, других ТПП с короткими гена Р,п' соответствующий пропоследовательности;

mat - участок гена, соответствующий зрелому фер-пропептидами являются: отсутствие менту; _ ПрОМОтор фага Т7. Т^ - терминатор фага сайтов связывания кальция, изменен- Т7; * - мутация в активном центре Pin, соответствую-ная структура N-концевой области, а щая замене Glu—»Ala.

также наличие высококонсервативной AYDD-шпильки, модифицирующей структуру субстратсвязывающего участка.

Пропептид Pin образует отдельный домен в структуре белка и, по-видимому, выполняет функции внутримолекулярного ингибитора, блокируя субстратсвязывающую область и фиксируя активный центр фермента в неблагоприятной для осуществления катализа «открытой» конформации. Ключевыми элементами интерфейса пропептид-зрелая часть в молекуле proPln являются: со стороны каталитического домена - AYDD-шпилька, а со стороны пропептида -высококонсервативный PPL-мотив.

2.7. Анализ функциональной роли пропептида протеализина

Анализ имеющихся в настоящее время данных демонстрирует, что функциональная роль пропептидов протеолитических ферментов очень разнообразна. Установлено, в частности, что длинные пропептиды ТПП могут выполнять функцию фолдинг-асси-стентов, действуют как ингибиторы зрелых ферментов и, вероятно, принимают участие в секреции соответствующих белков. Впервые полученные в рамках нашего исследования данные о свойствах и структуре коротких пропептидов ТПП указывают на способность таких пропоследовательностей поддерживать соответствующий фермент в неактивном состоянии. Однако остается неясным, важны ли короткие пропептиды для формирования пространственной структуры и вовлечены ли они в транспорт ППП.

2.7.1 Пропептид протеализина необходим для формирования активного фермента

Влияние пропептида на сворачивание Pin было изучено нами с применением классического подхода, который заключается в сравнении эффективности формирования активного фермента при гетерологической экспрессии интактного гена, соответствующего полноразмерному предшественнику, и гена, кодирующего только зрелую часть, а также при совместной экспрессии генов, отвечающих за синтез отдельно пропептида и зрелой части. Для экспрессии полноразмерного предшественника Pin (proPln) нами была использована полученная ранее плазмида pProPlnHis6. Кроме того, дополнительно сконструированы еще три вектора. Два из них, pPlnHis6 и pPlnHisf/A, отвечают за синтез индивидуальных зрелой части протеализина (Pin) и зрелой части Pin с мутацией в каталитическом центре Glu—»Ala (Pln/A), соответственно. Третий, pPro+PinHis6, предназначен для коэкспрессии не связанных ковалентно зрелой части и пропептида (pro) (рис. 16).

При введении описанных векторов в Е. coli все белки накапливались в клетках приблизительно в одинаковых количествах. Однако доли белка, находящегося в растворимом виде, существенно отличались. Зона, соответствующая зрелому белку, отчетливо детектировалась при электрофоретическом анализе растворимого содержимого клеток, экспрессирующих интактный ген Pin, в то время как во всех остальных случаях

обнаружить растворимый фермент удавалось только методом иммуноблоттинга. По приблизительной оценке, сделанной на основе этих данных, при экспрессии интактного гена в клетках Е. coli содержалось в 10-30 раз больше растворимого Pin. В то же время накопление растворимого белка при экспрессии без пропоследовательности или с пропеп-тидом in trans варьировало не значительно. Таким образом, белок, не связанный с пропептидом кова-лентно, по-видимому, более склонен к агрегации. Результаты иммуноблоттинга также показали, что в отсутствие пропептида в клетках образуются низкомолекулярные фрагменты Pin, которые, вероятно, являются продуктами его деградации. Этот факт может быть интерпретирован как свидетельство того, что белок не формирует плотноупако-

26

Время, ч

Рис. 17. Динамика накопления активности в растворимой фракции лизата клеток Е. coli. Обозначения proPin, pro t Pin и Pili соответствуют лизатам клеток Е. coli BL21 (DE3), несущих вектор pProPlnHis6, pPro+PlnHis6 или pPlnHis6.

ванной высокостабильной пространственной структуры, иными словами, не способен сворачиваться без пропоследовательности.

Прямым доказательством формирования ферментом корректной пространственной структуры служит его способность осуществлять катализ. При экспрессии гена полноразмерного предшественника, в полном соответствии с полученными нами ранее данными, после лизиса клеток Е. coli протеолитическая активность фермента в полученном растворе постепенно возрастала в результате процессинга, достигая максимума через 24 ч инкубации при +4°С (рис. 17). При коэкспрессии генов пропептида и зрелой части Pin мы также обнаружили в клеточном лизате протеолитическую активность, уровень которой был в 10-15 раз ниже, чем в случае интактного гена, коррелируя с количеством растворимого Pin. Причем, как и для полноразмерного предшественника, активность постепенно возрастала и через 24 ч достигала максимального значения, что, вероятно, также связано с деградацией пропептида. Напротив, при экспрессии генов, кодирующих Pin без просегмента, нам не удалось обнаружить активность в клеточных лизатах даже через 50 ч после лизиса. При этом результаты не отличались для вариантов с мутацией в каталитическом центре и без нее.

Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что без пропептида Pin не способен эффективно формировать каталитически активную структуру. При этом про-часть способна направлять сворачивание фермента, не зависимо от того, связана она ко-валентно со зрелой частью или нет. Таким образом, пропептид Pin является фолдинг-ас-систентом. Для коротких пропептидов ТПП данная функция выявлена впервые.

На первый взгляд способность пропептида Pin направлять сворачивание не выглядит удивительной. Такая функция прорегионов обычна для протеаз. Более того, ранее она была продемонстрирована для ряда ТПП. Однако все эти пептидазы семейства М4 относятся к подгруппе Tin и имеют длинные пропептиды. Таким образом, несмотря на отсутствие структурного сходства, пропоследовательности протеализинового и термо-лизинового типа могут выполнять одну и ту же функцию.

Модель катализируемого пропептидами фолдинга белков, которая была предложена на основе детальных исследований, проведенных для субтилизина (Sbt) и а-литической протеазы (a-LP), предполагает, что продомены ускоряют сворачивание путем стабилизации одной из возникающих на пути фолдинга локальных структур. Эта субструктура, редко образующаяся в отсутствие связывания с пропептидом, выступает в роли ядра

Рис. 18. Суперпозиция структур (стереоизображение) предшественника протеализина (из 2VQX) и процессированного комплекса протеазы МСР-02 (из 3NQY). Зрелая часть протеализина выделена голубым цветом, пропеп-тид - синим. Зрелая часть МСР-02 — розовым, про-пептид - красным. Зелеными сферами представлены ионы цинка.

сворачивания, вслед за формированием которого, начинается фолдинг других регионов молекулы. Поскольку в переходном состоянии белковой молекулы пропептид, по-видимому, стабилизирует участки, подобные существующим в свернувшемся белке, сделать предположения о природе этой субструктуры можно, основываясь на информации о пространственной структуре фолдированных комплексов пропептид-каталитический домен. В настоящее время опубликованы данные о таких комплексах для Pin и вибриоли-зина МСР-02 из Pseudoalteromonas sp. SM9913, типичной ТПП с длинным пропептидом.

При сравнении фолдированных комплексов бросается в глаза, что длинный и короткий пропептиды взаимодействуют с очень похожими каталитическими доменами абсолютно по-разному (рис. 18). Продомены контактируют с поверхностью зрелых протеаз с разных сторон, так что при наложении каталитических доменов пропептиды практически не перекрываются. Лишь в области активного центра взаимодействие пропепти-да с протеазой в обоих случаях подобно взаимодействию субстрата. Однако пропептид Pin заходит в щель активного центра N-концом, а пропоследовательность МСР-02 -С-концом. Вероятно, как для Sbt и a-LP, стабилизация активного центра за счет контактов пропептид-каталитический домен в субстратсвязывающей области является необходимым условием катализируемого прорегионом фолдинга. Однако для Sbt и a-LP такое взаимодействие не является достаточным для сворачивания. Таким образом, по аналогии можно полагать, что важные для инициации фолдинга ТПП контакты локализованы в других местах. Если считать такими участками основные зоны взаимодействия, то в случае МСР-02 это будут контакты между соответствующей FTP-мотиву N-концевой частью пропептида и С-концевым доменом каталитической части. А для Pin - связывание одновременно с N- и С-концевым доменом вблизи активного центра. (В это взаимодействие вовлечена AYDD-шпилька.) Принимая во внимание все вышесказанное, следует заключить, что опосредованное прочастями сворачивание ТПП с разными типами пропепти-дов идет по разным путям.

Результаты, полученные в данной работе и опубликованные ранее нами и другими исследователями, демонстрируют, что оба типа пропоследовательностей ТПП способны выполнять две наиболее часто обнаруживаемые у пропептидов протеаз функции - направлять сворачивание и поддерживать фермент в неактивной форме. В то же время, молекулярные механизмы, обеспечивающие эти свойства прорегионов, по-видимому, принципиально отличаются. Не подлежит сомнению, что необходимость использования разных пропептидов для «одинаковых» молекул продиктована функциями, которые эти молекулы выполняют в клетке. К сожалению, сегодня мы не можем оценить такое конструкторское решение, поскольку роль ТПП в жизни микроорганизмов исследована слабо. Традиционно ТПП приписывается роль ферментов, переваривающих внеклеточные

белки и пептиды для питания бактерий. Хотя, есть убедительные доказательства того, что ТПП с длинными пропептидами могут выполнять и более тонкие функции, например, процессировать белки-предшественники. Функции протеализинподобных ферментов практически не изучены. Однако полученные нами данные позволяют рассматривать эти белки как специфические факторы бактериальной инвазии (см. п. 2.8). Не исключено, что короткие пропептиды являются ключевыми детерминантами такой функциональности.

2.7.2. Локализация протеализина в клетке

Как упоминалось выше, для длинных пропептидов ТПП предполагается участие в секреции соответствующих белков. В случае коротких пропептидов таких данных сегодня нет. Более того, остается нерешенным вопрос о том, секретируются ли протеализин-подобные протеазы бактериями.

В рамках данной работы нами было оценено накопление Pin в клетках и культу-ральной среде Ser. proteamaculans 94 при периодическом культивировании. Для детекции фермента был применен метод иммуноблоттинга (рис. 19). Используя антитела к proPln, было установлено, что протеализин обнаруживается в клетках уже через 3 ч после инокуляции. При продолжении культивирования количество Pin в клетке возрастает вплоть до достижения культурой стационарной фазы роста, после чего меняется незначительно. Независимо от времени культивирования, в клетках Pin обнаруживается в виде предшественника. Детектировать зрелую форму не удается, однако выявляются имму-ноположительные зоны, соответствующие белкам с молекулярной массой ниже, чем у предшественника, но выше, чем у зрелой формы Pin. По-видимому, эти белки являются продуктами деградации предшественника. В культуральной среде использованная техника позволяет обнаружить proPln через 7 ч после начала культивирования. Концентрация фермента вне клеток, как и в случае внутриклеточного белка, растет в ходе культивирования. По мере увеличения количества Pin в образцах выявляются две иммуноположитель-ные зоны с молекулярной массой ниже, чем у предшественника. Одна из этих зон имеет электрофоретическую подвижность, совпадающую с подвижностью зрелого фермента. Вторая, более тяжелая, по-видимому, соответствует промежуточной форме, наблюдаемой при созревании Pin (см. п. 2.5). При этом доля процессированного фермента в культуральной жидкости увеличивается во времени. Проведенная нами по данным иммуноблоттинга приблизительная оценка относительных количеств Pin в образцах показала, что не зависимо от фазы роста отношение внутриклеточный/внеклеточный фермент сохраняется и примерно равно 100/1.

Таким образом, наши данные позволяют предположить, что Pin не секретируется из клеток Ser. proteamaculans конститутивно, чем принципиально отличается от ТПП с длинными пропептидами - внеклеточных ферментов, секреция которых зависит от классического сигнального пептида и идет по основному пути. В то же время, имеющиеся факты не позволяют сделать вывод ни о том, что Pin не яв-

Время, ч

Рис. 19. Анализ накопления протеализина в клетках и культуральной среде Ser. proteamaculans 94 при периодическом культивировании. На врезке приведены данные иммуноблоттинга. Образцы, подвергнутые электро-форетическому анализу, были приготовлены из 170 мкг клеток или 1 мл культуральной жидкости (КЖ).

ляется секреторным белком, ни о том, что пропептид Pin не участвует в его транспорте. Накопление около 1% синтезируемого Pin во внеклеточном пространстве может быть отражением базального уровня секреции фермента по неустановленному индуцибельно-му механизму. Такая гипотеза представляется вполне оправданной. Поскольку активация предшественника Pin происходит только после выхода белка из клеток, представляется вероятным, что фермент выполняет свои биологические функции вне бактериальной клетки. Учитывая приведенные ниже данные об участии Pin в бактериальной инвазии (см. п. 2.8), можно допустить, что секреция протеазы происходит не во внеклеточное пространство, а в цитоплазму эукариотической клетки, например, через систему секреции третьего или шестого типа.

2.8. Биологические функции протеализинподобных протеаз

Различия в структуре пропептидов и зрелых ТПП, а также в их клеточной локализации, позволяют думать, что протеазы групп Tin и Pin имеют разные биологические функции. К настоящему времени опубликовано достаточно много данных о роли ферментов с длинными пропептидами у различных организмов. Имеющаяся информация дает возможность утверждать, что эта роль не сводятся лишь к функции «пищеварительных» ферментов, неспецифически расщепляющих внеклеточные белки. Напротив, пеп-тидазы подсемейства Tin часто имеют специфические мишени, которые могут быть как белками, продуцируемыми одним с ними организмом, так и экзогенными полипептидами. Направленное действие, в частности, во многих случаях является принципиальным для функционирования ТПП в качестве факторов патогенности.

Биологические функции ТПП с короткими пропептидами практически не изучены. В то же время большинство охарактеризованных протеализинподобных ферментов синтезируются патогенными микроорганизмами. В целом остается не ясным, являются ли ППП факторами патогенности соответствующих бактерий. Однако имеющиеся данные подкрепляют такое предположение. Недавно в Институте цитологии РАН проведены исследования, доказывающие вовлеченность ЕСР32/гримелизина в процесс бактериальной инвазии, а также, при нашем участии, получены аналогичные данные для Pin. (Исследование роли Pin в бактериальной инвазии было представлено в выполненной под руководством С.Ю. Хайтлиной диссертации O.A. Цаплиной на соискание ученой степени кандидата биологических наук.)

Методом конфокальной микроскопии нами было установлено, что после 3 часов инкубации природного продуцента Pin, Ser. proteamaculans 94, с клетками карциномы гортани человека Нер-2 в культуре наблюдается нарушение монослоя, изменение формы клеток Нер-2, появление на их поверхности многочисленных выростов, содержащих актин. При этом бактерии обнаруживаются в цитоплазме примерно 10% эукариотиче-ских клеток. Локализация Ser. proteamaculans 94 в цитоплазме Нер-2 была подтверждена методом электронной микроскопии. Таким образом, нами было продемонстрировано, что бактерии Ser. proteamaculans 94, также как продуцент ЕСР32/гримелизина, способны проникать в клетки эукариот.

Введение гена Pin в составе вектора pProPlnHis6 сообщало клеткам Е. coli способность к инвазии. Как и в случае природного продуцента, методами конфокальной и электронной микроскопии было показано, что, после 3 ч совместной инкубации с культурой клеток Нер-2, бактерии Е. coli BL21 (DE3) (pProPlnHis6), в отличие от контрольного штамма, детектируются внутри эукариотических клеток (рис. 20). При этом большинство бактерий локализуется в вакуолях, но также были обнаружены бактерии, находящиеся в цитоплазме в свободном виде.

ES ;й 0 шт •V 1 ,

Т-у

Рис. 20. Инвазия клеток Нер-2 рекомбинант-ными штаммами Е. coli. А, Б - результаты конфокальной микроскопии. Изображения сделаны в фокальной плоскости, проходящей

Полученные результаты впервые демонстрируют, что ТПП с короткими пропеп-тидами являются элементом механизма проникновения бактерий в клетки животных. В сочетании с обсуждавшимися выше данными о синтезе таких белков болезнетворными микроорганизмами это, по-видимому, свидетельствует, что ППП являются факторами патогенное™ соответствующих бактерий.

В ходе наших исследований также получены результаты, указывающие на вероятную роль Pin в процессе бактериальной инвазии. Было показано, что Pin действует на глобулярный актин (G-актин) подобно ЕСР32/гри-мелизину. Pin полностью расщепляет актин с образованием фрагмента с массой 36 кДа уже через 30 мин инкубации. При массовом соотношении Pln/актин равном 1/50 дальнейший

на участки с зеленой флуоресценцией, соответствующие меченым флуоресцеином бактериям. Черта соответствует Юмкм. Выданные электронной микроскопии. Бактерия внутри эукариотических клеток помечена белой стрелкой, вне клеток - черной. А, В -

через середину клетки. Стрелки указывают протеолиз не наблюдается даже после 4 ч инкубации. При увеличении концентрации Pin (Pln/актин выше 1/10) детектируется расщепление 36 кДа фрагмента с образованием продукта с массой около 33 кДа. N-концевая аминокислотная последовательность фрагмента клетки Нер-2, инфицированные Е. coli BL21 36 кДа (VMVGMQ) соответствует гидролизу (DE3) (РЕТ23Ъ), не несущими ген Pin Б Г- аетина м Gly42 и Val43. В препарате, со-клетки Нер-2, инфицированные Е. со//BL21 ,

(DE3) (PProPlnHis6), несущими ген Pin. Держащем фрагмент 33 кДа, выявлено присутствие двух полипептидов с N-концевыми последовательностями LKYPIE и 1LTLKY, что соответствует гидролизу связей Thr66— Leu67 и Gly63-Ile64. Интересно, что Tin, прототип семейства пептидаз М4, как и Pin, первоначально расщепляет актин с образованием 36 и 33 кДа фрагментов. Однако даже при массовом отношении Tin/актин равном 1/50 эти фрагменты подвергаются интенсивному дальнейшему протеолизу. Таким образом, Pin ограниченно расщепляет актин в петле, связывающей ДНКазу 1 (Gly42-Val43), и при более высоких соотношениях субстрат/ фермент в так называемой нуклеотидной щели (Thr66-Leu67 и Gly63-Ile64).

Поскольку установленные нами сайты расщепления G-актина (Gly42-Val43 и Gly63-Ile64) в актиновом полимере расположены в участках, вовлеченных во взаимодействие мономеров, можно предположить, что фибриллярный актин (F-актин) будет более устойчив к действию фермента. Действительно, при инкубации F-актина с Pin образуется только фрагмент 36 кДа, что указывает на недоступность для действия протеазы участков нуклеотидной щели. По сравнению с G-актином снижена и эффективность гидролиза в сайте Gly42—Val43, находящемся в ДНКазной петле. Однако от 20 до 40% (при разных соотношениях актин/протеаза) F-актина расщепляется протеализином за 3 ч - время, совпадающее со временем инкубации в обсуждавшихся выше инвазионных экспериментах. Таким образом, впервые была продемонстрирована способность протеазы группы Pin гидролизовать F-актин, являющийся основным видом актина в клетке.

Нами были изучены свойства F-актина, обработанного Pin. Расщепление F-актина сопровождается снижением интенсивности светорассеяния и флуоресценции (для ме-

ченного пиренилом актина) его раствора примерно на 30%. Это свидетельствует о сдвиге равновесия мономер-полимер в сторону коротких филаментов и/или мономеров, что должно влиять на динамику F-актина- обмен субъединиц филаментов с молекулами пула мономеров. Поскольку включение мономеров в полимер сопровождается гидролизом содержащегося в них АТФ, динамика F-актина может быть оценена путем измерения АТФазной активности F-актина, находящегося в равновесном состоянии в растворе. Действительно, определенная нами АТФазная активность F-актина, расщепленного Pin на 30%, составляет 1,2 (моль Р1)/(моль актина) в час, что значительно превышает значение для немодифицированного F-актина в сходных условиях - 0,02-0,04 (моль)/(мольхч).

Полученные результаты важны для понимания механизмов бактериальной инвазии, происходящей с участием ППП. Проникновение бактерий в эукариотические клетки, как правило, включает «разборку» актиновых структур в месте контакта бактерии с клеточной стенкой, что приводит к полимеризации актина в прилегающих участках и образованию на поверхности клетки выступов, которые охватывают бактерию и обеспечивают ее поглощение в ходе процесса подобного макропиноцитозу. Ограниченное расщепление F-актина Pin существенно усиливает динамику актиновых филаментов и способствует их деполимеризации. Этот эффект может приводить к разборке актинового цитоскелета в месте контакта, в результате чего будет расти концентрация мономеров, необходимых для сборки актиновых филаментов в выростах клеточной поверхности. Таким образом, специфическая способность Pin и других ферментов группы расщеплять актин может быть использована бактерией для изменения функциональных свойств актина, вызывая перестройки цитоскелета и обеспечивая проникновение микроорганизма в эукариотическую клетку.

2.9. Термолизинподобные протеазы - модель для исследования функций пропептидов

Подведем итог осуществленным в рамках данной работы исследованиям ТПП. Семейство пептидаз М4 объединяет около пятнста белков, обнаруженных у многочисленных бактерий и, кроме того, у микроскопических грибов и архей. В настоящее время охарактеризовано около 30 представителей семейства и установлено несколько пространственных структур протеаз этой группы. Наличие данных о структуре и свойствах близкородственных, но отличающихся функционально ферментов делает ТПП привлекательной моделью для изучения структурно-функциональных взаимосвязей в белковых молекулах. В рамках данной работы ТПП были использованы как модель для исследования механизмов функционирования пропептидов.

Нами впервые проведен систематический анализ первичных структур предшественников ТПП и показано, что по организации N-концевых регионов предшественников семейство может быть разделено на две группы. Представители первой имеют хорошо изученные длинные пропептиды, сходные с пропоследовательностью Tin. Для белков второй группы характерны ранее не описанные короткие прорегионы, подобные пропептиду протеализина. Таким образом, нами идентифицирована новая группа пептидаз семейства М4, представители которой обозначены нами как протеализинподобные ферменты (ППП).

Для исследования методами белковой инженерии механизмов функционирования двух типов пропептидов ТПП создана экспериментальная модель на основе двух новых детально охарактеризованных в ходе данной работы ферментов: металлопроте-азы Thermoactinomyces sp. (Mpr-Thr) и протеализина Ser. proteamaculans (Pin). Важно подчеркнуть, что Mpr-Thr и Pin имеют разные типы пропептидов. Модель включает

охарактеризованные гены ферментов, системы для их экспрессии, а также схемы получения высокоочищенных рекомбинантных белков.

С использованием одного из модельных белков, Mpr-Thr, впервые для металлопро-теаз был продемонстрирован эффект белковой памяти. При этом впервые обнаружено, что формирование конформеров может происходить в системе пропептид-каталитиче-ская часть in trans, а не при изменении аминокислотной последовательности пропептида. Другой модельный белок, Pin, стал основой для изучения структуры, функций и механизмов действия коротких пропептидов.

Нами была установлена (совместно с сотрудниками ПК РАН) пространственная структура предшественника Pin - первая структура предшественника пептидазы семейства М4 и первая структура ППП. Анализ этой структуры позволил выявить характерные особенности каталитического домена ТПП с короткими пропептидами и показал, что ППП могут рассматриваться как отдельное подсемейство ТПП не только по структуре предшественников, но и по структуре зрелой части. Было установлено, что пропеп-тид Pin образует отдельный домен в структуре белка и выполняет функции внутримолекулярного ингибитора, блокируя субстратсвязывающую область и, вероятно, фиксируя активный центр фермента в неблагоприятной для осуществления катализа «открытой» конформации.

Анализ функциональной роли пропептнда Pin впервые показал, что короткие про-пептиды ТПП выступают в качестве фолдинг-ассистентов, определяя сворачивание соответствующих белков. Было установлено, что удаление таких пропептидов может происходить автокаталитически, но, в отличие от длинных пропропоследовательностей, по межмолекулярному механизму. Также впервые было обнаружено, что Pin и, вероятно, другие ППП не секретируются бактериальной клеткой конститутивно, хотя активируются только при попадании во внеклеточную среду. Совместно с сотрудниками Института цитологии РАН мы впервые продемонстрировали, что ТПП с короткими пропептидами являются элементом механизма проникновения бактерий в клетки эукариот. Было также показано, что ферменты группы Pin специфически расщепляют актин, что, вероятно, является основной функцией этих ферментов при инвазии.

Таким образом, структурные и функциональные свойства протеализинподобных ферментов и пептидаз семейства М4, сходных с термолизином, существенно отличаются. Совокупность полученных данных позволяет предполагать, что эти различия в значительной степени определяются пропептидами.

В ходе наших исследований также получены результаты, имеющие прикладное значение. Уникальные свойства Pin позволили создать (совместно с сотрудниками ВНИИМП и ИБФМ РАН) на его основе прототип ферментного препарата для улучшения качества мясного сырья в пищевой промышленности. Эффективность разработанного препарата подтверждена в условиях опытного производства.

Следует подчеркнуть, что потенциал использованной в данной работе модельной системы далеко не исчерпан. Не подлежит сомнению, что продолжение исследований свойств пропептидов ТПП даст новую информацию о механизмах модуляции функциональной активности белков пропоследовательностями. Наиболее перспективным, по-видимому, является изучение биологических функций пептидаз семейства М4 и влияния на них соответствующих прочастеи. Существенный интерес представляет также вопрос о приводящих к функциональному разнообразию белков путях эволюции пропептидов. Кроме того, в рамках описанной модели могут решаться и задачи, не связанные с исследованием пропоследователыюстей.

выводы

1. Клонирован ген глутамилэндопептидазы В. intermedins (BIGEP), осуществлена его ге-терологичная экспрессия в клетках В. subtilis и Е. coli, разработаны методы получения высокоочищенного рекомбинантного белка, что позволяет использовать BIGEP в качестве экспериментальной модели для исследования механизмов функционирования Glu-специфичных протеаз.

2. Впервые получена, на модели BIGEP, глутамилэндопептидаза с аминокислотной заменой по остатку His213 - консервативному у всех Glu-специфичных протеаз элементу S1 участка. Анализ свойств модифицированного фермента показал, что His213 не определяет способность BIGEP расщеплять субстраты после остатка глутаминовой кислоты, хотя важен для проявления ферментом высокой каталитической эффективности. Таким образом, His213 не является основным элементом распознавания заряда субстрата глутамил-эндопептидазами и, по-видимому, для каждой эволюционной ветви Glu-специфичных протеаз характерна своя система компенсации заряда.

3. Впервые для глутамилэндопептидаз на модели BIGEP показано, что пропептид необходим для формирования активного фермента и, следовательно, выполняет функцию фолдинг-ассистента.

4. Установлено, что удаление пропептида BIGEP in vitro происходит ступенчато. Первая стадия процессинга происходит автокаталитически, приводя к образованию неактивного интермедиата, который переходит в активную форму только после гетероактивации. Таким образом, активация BIGEP in vivo контролируется другими протеазами.

5. Эффективность гетероактивации in vivo и процессирующий фермент определяются остатком в положении (-1) пропептида BIGEP. Введение остатка Glu в позицию (-1) делает фермент автоакгивирующимся. Таким образом, модификация остатка (-1) позволяет в ходе эволюции изменять механизмы регуляции активности глутамилэндопептидаз.

6. Разработан подход для получения синтезируемых в виде предшественников протеаз с узкой субстратной специфичностью в гетерологичных экспрессионных системах. Подход основан на создании автопроцессирующихся ферментов путем направленной модификации сайтов их процессинга.

7. Идентифицирована новая группа термолизинподобных протеаз, представители которой отличаются от классических членов семейства структурой N-концевого пропептида.

8. Создана экспериментальная модель для исследования механизмов функционирования пропептидов пептидаз семейства М4 на основе двух новых детально охарактеризованных в ходе данной работы и имеющих разные типы пропоследовательностей ферментов: металлопротеазы Thermoactinomyces sp. и протеализина Ser. proteamaculans. Модель включает охарактеризованные гены ферментов, системы для их гетерологической экспрессии и методы получения высокоочищенных рекомбинантных белков.

9. На основе рекомбинантного протеализина разработан прототип ферментного препарата для улучшения качества мясного сырья в пищевой промышленности. Эффективность препарата подтверждена в условиях опытного производства.

10. На примере фермента Thermoactinomyces sp. впервые для металлопротеаз продемонстрирован эффект белковой памяти. Впервые обнаружено, что формирование конфор-меров может происходить в системе пропептид-каталитическая часть in trans, а не при изменении аминокислотной последовательности пропептида.

11. Впервые продемонстрировано, что короткие пропептиды термолизинподобных про-теаз выступают в качестве фолдинг-ассистентов, определяя сворачивание соответствующих белков.

12. Впервые установлено, что удаление коротких пропептидов термолизинподобных протеаз может происходить автокаталитически, но, в отличие от длинных пропоследова-тельностей, по межмолекулярному механизму.

13. Впервые продемонстрировано, что термолизинподобные протеазы с короткими про-пептидами могут определять инвазию клеток эукариот бактериями, что, вероятно, связано со способностью ферментов группы протеализина специфически расщеплять актин.

14. Методом рентгеноструктурного анализа определена пространственная структура предшественника протеализина - первая структура предшественника пептидазы семейства М4 и первая структура протеализинподобной протеазы. Показано, что ферменты с короткими пропептидами могут рассматриваться как отдельное подсемейство термолизинподобных протеаз не только по структуре предшественников, но и по структуре каталитического домена. Установлено, что пропептид протеализина образует отдельный домен в структуре белка и выполняет функции внутримолекулярного ингибитора, блокируя субстратевязывающую область и фиксируя активный центр фермента в неблагоприятной для осуществления катализа «открытой» конформации.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

Статьи

1. Демидюк И.В., Звонкова Е.Н., Носовская Е.А., Швец В.И. Вариант очистки генноинже-нерной металлопротеиназы Bacillus amyloliquefaciens. II Биотехнология. 1994. № 11-12. С. 13-15.

2. Демидюк И.В., Носовская Е.А., Цаплина И.А., Каравайко Г.И., Костров С.В. Выделение и характеристика сериновой протеиназы из Thermoactinomyces species, относящейся к группе Glu,Asp-специфичных ферментов. // Биохимия. 1997. Т. 62. № 2. С. 202-207.

3. Rebrikov D.V., Akimkina T.V., Shevelev А.В., Demidyuk I.V., Bushueva A.M., Kostrov S.V., Chestukhina G.G., Stepanov V.M. B. intermedins glutamyl endopeptidase. Molecular cloning and nucleotide sequence of the structural gene. I I J. Protein Chem. 1999. V. 18. № 1. P. 21-7.

4. Zabolotskaya M.V., Demidyuk I.V., Akimkina T.V., Kostrov S.V. A novel neutral protease from Thermoactinomyces sp. 27a: sequencing of the gene, purification, and characterization of the enzyme. // Protein J. 2004. V. 23. № 7. P. 483-492.

5. Титов Е.И., Митасева Л.Ф., Машенцева Н.Г., Костров С.В., Демидюк И.В. Изменение аминокислотного состава мясного сырья. //Пищевая пром. 2004. № 11. С. 82-83.

6. Demidyuk I.V., Kalashnikov А.Е., Gromova T.Yu., Gasanov E.V., Safina D.R., Zabolotskaya M.V., Rudenskaya G.N., Kostrov S.V. Cloning, sequencing, expression, and characterization of protealysin, a novel neutral proteinase from Ser. proteamaculans representing a new group of thermolysin-like proteases with short N-terminal region of precursor. // Protein Expr. Purif. 2006. V. 47. № 2. P. 551-561.

7. Михайлова А.Г., Лихарева B.B., Хайруллин Р.Ф., Лубенец Н.Л., Румш Л .Д., Демидюк И.В., Костров С.В. Новая психрофильная трипсиноподобная протеиназа из Ser. proteamaculans. II Биохимия. 2006. Т. 71. № 5. С. 697-706.

8. Sharipova M.R., Shagimardanova E.I., Chastukhina I.В., Shamsutdinov T.R., Balaban N.P., Mardanova A.M., Rudenskaya G.N., Demidyuk I.V., Kostrov S.V. The expression of Bacillus

intermedins glutamyl endopeptidase gene in Bacillus subtilis recombinant strains. // Mol. Biol. Rep. 2007. V. 34. № 2. P. 79-87.

9. Гасанов E.B., Романова Д.В., Громова Т.Ю., Демидюк И.В. Эффект делеции З'-некодиру-ющей области гена глутамилэндопептидазы В. intermedins на продукцию активного белка клетками В. subtilis. И Мол. ген. микробиол. вирусол. 2007. № 2. С. 31-32.

lO.Sharipova М., Balaban N., Kayumov A., Kirillova Y., Mardanova A., Gabdrakhmanova L., Leshchinskaya I., Rudenskaya G., Akimkina Т., Safina D., Demidyuk I., Kostrov S. The expression of the serine proteinase gene of Bacillus intermedins in Bacillus subtilis. II Microbiol. Res. 2008. V. 163. № 1. P. 39-50.

П.Можина H.B., Бурмистрова O.A., Пупов Д.В., Руденская Г.Н., Дунаевский Я.Е., Демидюк И.В., Костров С.В. Выделение и свойства цистеиновой протеиназы Ser. pro-teamaculans 94. II Биоорг. химия. 2008. Т. 34. № 3. С. 303-309.

12. Demidyuk I.V., Gasanov E.V., Safina D.R., Kostrov S.V. Structural organization of precursors of thermolysin-like proteinases. // Protein J. 2008. V. 27. № 6. P. 343-354.

13.Громова Т.Ю., Демидюк И.В., Костров C.B., Сосфенов Н.И., Мелик-Адамян B.P., Куранова И.П. Кристаллизация и предварительные рентгеновские исследования кристаллов предшественника пептидазы семейства М4 - протеализина. // Кристаллография. 2008. Т. 53. № 5. С, 840-842.

Н.Велишаева Н.С., Гасанов Е.В., Громова Т.Ю., Демидюк И.В. Влияние модификации сайта процессинга глутамилэндопептидазы Bacillus intermedins на продукцию активного фермента клетками Bacillus subtilis. II Биоорг. химия. 2008. Т. 34, № 6. С. 786-791.

15. Gasanov E.V., Demidyuk I.V., Shubin A.V., Kozlovskiy V.l., Leonova O.G., Kostrov S.V. Hetero- and auto-activation of recombinant glutamyl endopeptidase from В. intermedins. II Protein Eng. Des. Sei. 2008. V. 21. № 11. P. 653-658.

lö.Gromova T.Yu., Demidyuk I.V., Kozlovskiy V.l., Kuranova I.P., Kostrov S.V. Processing of protealysin precursor. // Biochimie. 2009. V. 91. № 5. P. 639-645.

17. ЦаплинаО. А., Ефремова Т.Н. ,КеверЛ. В., КомиссарчикЯ.Ю., ДемидюкИ. В., Костров С.В., Хайтлина С.Ю. Выявление актиназной активности протеализина. // Биохимия. 2009. Т. 74. № 6. С. 797-804.

18.Хайруллин Р.Ф., Михайлова А.Г., Себякина Т.Ю., Лубенец Н.Л., Зиганшин Р.Х., Демидюк И.В., Громова Т.Ю., Костров С.В., Румш Л.Д. Олигопептидаза В из Ser. pro-teomaculans. I. Определение первичной структуры, выделение и очистка природного и рекомбинантного фермента. // Биохимия. 2009. Т. 74. № 10. С. 1427-1437.

19.Demidyuk I.V., Gromova T.Yu., Polyakov K.M., Melik-Adamyan W.R., Kuranova I.P., Kostrov S.V. Crystal structure of protealysin precursor: insights into propeptide function. // J. Biol. Chem. 2010. V. 285. № 3. P. 2003-2013.

20. Sabirova A.R., Rudakova N.L., Balaban N.P., Ilyinskaya O.N., Demidyuk I.V., Kostrov S.V., Rudenskaya G.N., Sharipova M.R. A novel secreted metzincin metalloproteinase from B. intermedins. II FEBS Lett. 2010. V. 584. № 21. P. 4419-4425.

21. Михайлова А.Г., Хайруллнн Р.Ф., Демидюк И.В., Громова Т.Ю., Костров С.В., Румш Л.Д. Олигопептидаза В из Ser. proteamaculans. II. Энзиматическая характеристика — субстратный анализ, влияние ионов кальция, pH- и температурная зависимость. // Биохимия. 2011. Т. 76. № 4. С. 590-602.

22.Bozhokina E.S., Tsaplina O.A., Efremova T.N., Kever L.V., Demidyuk I.V., Kostrov S.V., Adam Т., Komissarchik Ya.Yu., Khaitlina S.Yu. Bacterial invasion of eukaryotic cells can be mediated by actin-hydrolyzing metalloproteases grimelysin and protealysin. // Cell Biol. Int. 2011. V. 35. №2. P. 111-118.

23. Safina D., Rafieva L., Demidyuk I., Gasanov E., Chestukhina G., Kostrov S. Involvement of propeptides in formation of catalytically active metalloproteinase from Thermoactinomyces sp.

//Protein Pept. Lett. 2011. V. 18. № 11. P. 1119-1125.

24. Klykov S.P., Kurakov V.V., Vilkov V.B., Demidyuk I.V., Gromova T.Yu., Skladnev D.A. A cell population structuring model to estimate recombinant strain growth in a closed system for subsequent search of the mode to increase protein accumulation during protealysin producer cultivation. // Biofabrication. 2011. V. 3. № 4. P. 045006.

25. Tsaplina O., Efremova Т., Demidyuk I., Khaitlina S. F-actin is a substrate for protealysin, a me-talloprotease of invasive Ser. proteamaculans. IIFEBS J. 2012. V. 279. № 2. P. 264-274.

Обзоры

26. Демидюк И.В., Костров С.В. Особенности функциональной организации глутамилэндо-пептидаз. //Мол. биология. 1999. Т. 33. № 1. С. 100-105.

27. Демидюк И.В., Заболотская М.В., Велишаева Н.С., СафинаД.Р., Костров С.В. Прозависимый фолдинг микробных протеолитических ферментов. // Мол. ген. микро-биол. вирусол. 2003. № 4. С. 11-15.

28. Демидюк И.В., Сафина Д.Р., Заболотская М.В., Костров С.В. Молекулярные механизмы стабилизации протеолитических ферментов. Модель термолизинподобных микробных металлопротеиназ. // Биоорг. химия. 2003. Т. 29. № 5. С. 418-426.

29. Демидюк И.В., Костров С.В. Организация и функционирование белковых молекул. Модель протеолитических ферментов. / В книге: Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 2. Отв. редактор Е.Д. Свердлов. // М.: Наука, 2004. С. 125-163.

30. Demidyuk I.V., Shubin A.V., Gasanov E.V., Kostrov S.V. Propeptides as modulators of functional activity of proteases. // Biomolecular Concepts. 2010. V. 1. № 3-4. P. 305-322.

Патент

31. Костров С.В., Демидюк И.В. Способ хроматографического выделения и очистки белка. Патент РФ № 2322505, приоритет от 30.06.2006.

Подписано в печать 10.09.12 Заказ № 62 Тираж 100 экз. Типография ООО "Генезис" 119571, г. Москва, пр-т Вернадского, 86 www.copycentr.su 8 (495) 434-83-55

Содержание диссертации, доктора химических наук, Демидюк, Илья Валерьевич

1. Введение.

2. Обзор литературы.

2.1. Пропептиды как модуляторы функциональной активности протеаз.

2.1.1. Пропептиды и их основные функции.:.

2.1.2. Пропептиды, участвующие в сворачивании белков.

2.1.3. Пропептиды, поддерживающие белок в неактивном состоянии.

2.1.4. Пропептиды, участвующие в сортировке белков.

2.1.5. Пропептиды, обеспечивающие взаимодействия предшественника с другими молекулами или надмолекулярными структурами.

2.1.6. Изменчивость пропептидов.

2.1.7. Пропептиды и инженерия белков.

2.1.8. Перспективы исследований пропептидов.

2.1.9. Термолизинподобные протеазы как модель для исследования механизмов функционирования пропоследовательностей.

2.2. Глутамилэндопептидазы: связь между созреванием предшественника и субстратной специфичностью зрелой протеазы.

2.2.1. Глутамилэндопептидазы - члены структурного семейства химотрипсина.

2.2.2. Структурные детерминанты субстратной специфичности химотрипсинподобных ферментов.

2.2.3. Общая характеристика глутамилэндопептидаз.

2.2.4. Глутамилэндопептидаза Streptomyces griseus.

2.2.5. Вирусные ЗС-подобные сериновые протеазы.

2.2.6. Моделирование пространственных структур глутамилэндопептидаз.

2.2.7. Эпидермолитичекие токсины стафилококков.

2.2.8. Глутамилэндопептидазы бацилл и стафилококковые Glu-специфичные протеазы, не являющиеся эпидермолитическими токсинами.

2.2.9. Глутамилэндопептидазы - связь между созреванием предшественника и субстратной специфичностью.

2.2.10. Перспективы исследования глутамилэндопептидаз.

3. Материалы и методы исследования.

3.1. Реактивы и материалы.

3.2. Клеточные линии, бактериальные штаммы и плазмиды.

3.3. Общие методы.

3.3.1. Питательные среды для культивирования микроорганизмов.

3.3.2. Манипуляции с ДНК.

3.3.3. Манипуляции с белками.

3.3.4. Биоинформатический анализ.

3.3.4.1. Общие методы.

3.3.4.2. Анализ структурной организации предшественников термолизинподобных протеаз.

3.4. Выделение и характеристика глутамилэндопептидазы из Thermoactinomyces species.

3.5. Клонирование, секвенирование и экспрессия гена глутамилэндопептидазы из bacillus intermedius.

3.6. Модификация субстратсвязывающего сайта глутамилэндопептидазы в. intermedius.

3.7. Обработка глутамилэндопептидазы в. intermedius аминопептидазами.

3.8. Введение мутаций в позицию (-1) глутамилэндопептидазы в. intermedius.

3.9. Получение вариантов глутамилэндопептидазы в. intermedius в клетках е. coli.

3.10. Характеристика металлопротеазы Thermoactinomyces sp. 27а.

3.11. Протеализин: клонирование, секвенирование и экспрессия гена, очистка рекомбинантного белка.

3.12. Создание ферментного препарата для улучшения качества мясного сырья.

3.13. Исследование участия пропептидов в формировании активной металлопротеазы Thermoactinomyces species.

3.14. Изучение процессинга предшественника протеализина.

3.15. Кристаллизация и рентгеноструктурные исследования предшественника протеализина.

3.16. Исследование функций пропептида протеализина.

3.17. Исследование актиназной активности протеализина.

3.18. Исследование инвазивной способности бактерий.

4. Результаты и их обсуждение.

4.1. Структурные детерминанты строгой субстратной специфичности глутамилэндопептидаз.

4.1.1. Создание модели исследований.

4.1.1.1. Выделение и характеристика глутамилэндопептидазы из Thermoactinomyces species.

4.1.1.2. Клонирование, секвенирование и экспрессия гена глутамилэндопептидазы из BACILLUS INTERMEDIUS.

4.1.2. Модификация субстратсвязывающего сайта глутамилэндопептидазы в. intermedius.

4.1.3. Получение глутамилэндопептидазы в. intermedius с удаленными N-концевыми остатками.

4.1.4. Изучение механизма формирования активной глутамилэндопептидазы в. intermedius.

4.1.4.1. Влияние модификации остатка в положении (-1) глутамилэндопептидазы в. intermedius на продукцию активного фермента клетками В. subtilis.

4.1.4.2. Созревание глутамилэндопептидазы В. intermedius in vitro.

4.1.5. Глутамилэндопептидазы: пропептиды и структурные детерминанты субстратной специфичности.

4.2. Термолизинподобные протеазы - модель для исследования модулирующей способности пропептидов.

4.2.1. Характеристика белков семейства М4.

4.2.1.1. Новая нейтральная протеаза Thermoactinomyces species 27а.

4.2.1.2. Протеализин - металлопротеаза Serratia proteamaculans 94, представляющая новую группу термолизинподобных ферментов.

4.2.2. Создание прототипа ферментного препарата для улучшения качества мясного сырья на основе протеализина.

4.2.3. Структурная организация предшественников термолизинподобных протеаз.

4.2.3.1. Структура и функции N-концевых регионов предшественников.

4.2.3.2. Структура и функции С-концевых регионов предшественников.

4.2.3.3. Термолизинподобные протеазы, кодируемые одним геномом.

4.2.3.4. Основные итоги анализа первичной структуры предшественников термолизинподобных протеаз.

4.2.4. Участие пропептидов в формировании активной металлопротеазы Thermoactinomyces species.

4.2.5. Процессинг предшественника протеализина.

4.2.6. Пространственная структура предшественника протеализина.

4.2.6.1. Кристаллизация предшественника протеализина.

4.2.6.2. Общая характеристика структуры.

4.2.6.3. Структура каталитического домена.

4.2.6.4. Структура и взаимодействия пропептида.

4.2.6.5. Основные итоги анализа пространственной структуры предшественника протеализина.

4.2.1. Анализ функциональной роли пропептида протеализина.

4.2.7.1. Пропептид протеализина необходим для формирования активного фермента.

4.2.7.2. Локализация протеализина в клетке.

4.2.8. Биологические функции протеализинподобных протеаз.

4.2.9. Термолизинподобные протеазы - модель для исследования функций пропептидов.

5. Выводы.

6. Благодарности.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Cтруктурные основы функционального разнообразия протеолитических ферментов"

Белки выполняют огромное количество различных функций в каждом живом организме. Вопрос о структурных основах такого функционального многообразия вот уже несколько десятилетий является одним из центральных пунктов науки о белке. Однако, несмотря на достигнутые успехи, мы еще очень далеки от настоящего понимания структурно-функциональных взаимосвязей в белковых молекулах. В то же время изучение молекулярных механизмов функционирования имеет не только фундаментальное значение. Белки все шире используются человеком не просто как необходимый компонент рациона, но как способные направленно действовать агенты, прежде всего как промышленные катализаторы и лекарственные средства. В этом контексте знания о структурных основах функционирования - ключ к созданию белковых молекул, обладающих оптимальными для решения прикладных задач свойствами. Кроме того, все более широкое развитие получает направленное конструирование лекарств, для которого информация о структурных детерминантах в молекулах белков-мишеней имеет принципиальное значение.

Среди всего многообразия белков особое место занимают ферменты -белки-катализаторы. С одной стороны, они обеспечивают протекание ключевых биохимических реакций, а, с другой стороны, использование ферментов является одним из основных направлений современной биотехнологии. По имеющимся прогнозам мировой рынок промышленных ферментов достигнет к 2015 году объема в 3,74 миллиарда долларов США. Основными отраслями, в которых используются ферменты, сегодня являются пищевая и текстильная промышленность, индустрия моющих средств, а также медицина и производство косметических средств [1]. В последние годы наметилось заметное увеличение выпуска ферментов в связи с бурным ростом производства биоэтанола. Промышленное использование ферментов расширяется, в значительной степени, за счет применения инноваций, которые основаны на исследованиях структурно-функциональных взаимосвязей в молекулах белков. Такие исследования дают возможность модифицировать свойства индустриальных ферментов, добиваясь повышения их активности и удешевления целевых продуктов, а также позволяют получать новые рекомбинантные ферменты с заданными свойствами [2].

Протеазы - белки, катализирующие гидролиз пептидной связи, наряду с большим прикладным значением (они составляют самый крупный сегмент мирового рынка ферментов [1]), играют важную роль в живых системах. Протеазы не просто являются ферментами деградации, вовлеченными в катаболизм белков, но и осуществляют высокоспецифичное расщепление пептидных связей протеолитический процессинг. Последний определяет активацию или инактивацию различных ферментов, цитокинов, ростовых факторов и гормонов, а также внутри-или внеклеточную локализацию многих белков. Таким образом, в той или иной степени под управлением протеаз находятся едва ли не все биологические процессы, включая, среди прочих, клеточную пролиферацию и дифференцировку, миграцию клеток, апоптоз и ангиогенез [3-5]. Неудивительно поэтому, что протеазы вызывают неослабевающий интерес.

Сочетание высокой практической значимости и важной биологической роли протеолитических ферментов стало одним из основных факторов, определивших выбор протеаз в качестве объекта исследования в данной работе, направленной на выяснение новых механизмов функционирования белков. Цель и задачи работы

Целью работы является изучение молекулярных механизмов, определяющих функционирование протеолитических ферментов.

В ходе выполнения работы решались следующие задачи:

- построение экспериментальных моделей для исследования молекулярных механизмов функционирования белков на основе химотрипсинподобных и термолизинподобных протеаз (ТПП);

- разработка подходов к экспрессии протеаз, синтезируемых клеткой в виде предшественников;

- исследование роли в распознавании субстрата глутамилэндопептидазой Bacillus intermedius консервативных остатков субстратсвязывающего центра;

- исследование функций пропептида и механизма созревания предшественника глутамилэндопептидазы В. intermedius',

- разработка прототипа ферментного препарата для улучшения качества мясного сырья;

- биоинформатический анализ структуры предшественников ТПП;

- изучение функций и механизмов действия пропептидов ТПП;

- определение пространственной структуры предшественника ТПП;

- исследование биологических функций протеализина.

Научная новизна

В рамках данной работы получены оригинальные данные о механизмах функционирования химотрипсинподобных и термолизинподобных протеаз. Все результаты исследования являются новыми. В том числе:

- охарактеризованы новые протеолитические ферменты;

- впервые изучена функциональная роль консервативных остатков субстратсвязывающего центра глутамилэндопептидазы В. intermedius',

- впервые идентифицирована новая группа ТПП с короткими N-концевыми пропептидами;

- впервые изучены функции коротких N-концевых пропептидов ТПП и механизм их удаления;

- впервые для металлопротеаз продемонстрирован эффект «белковой памяти»;

- установлена пространственная структура предшественника протеализина -первая структура предшественника ТПП и первая структура протеазы с коротким N-концевым пропептидом;

- впервые продемонстрировано, что ТПП с короткими N-концевыми пропептидами могут определять инвазию клеток эукариот бактериями.

Практическая значимость

Полученная в ходе работы информация о молекулярных механизмах функционирования протеаз может быть использована для конструирования ферментов с направленно измененными свойствами.

Практическую ценность имеют также реализованные в работе методы получения протеолитических ферментов в гетерологичных экспрессионных системах на основе клеток Е. coli и В. subtilis. В частности, оригинальный подход для получения синтезируемых в виде предшественников протеаз с узкой субстратной специфичностью, который основан на создании автопроцессирующихся ферментов путем направленной модификации сайтов их процессинга.

Значительный практический интерес представляют охарактеризованные в работе новые протеолитические ферменты и их штаммы-продуценты. Так, глутамилэндопептидаза В. intermedius может быть использована для ограниченного протеолиза полипептидов при определении первичной структуры, доменной организации и идентификации белков, а также для сиквенс-специфического гидролиза слитых белков и получения биологически активных пептидов. Способность протеализина разрушать соединительную ткань животных при низкой положительной температуре позволяет, в перспективе, использовать этот фермент в различных приложениях, например, при получении культур клеток и тканей животных.

Потенциал протеализина в качестве промышленного катализатора демонстрирует созданный в ходе работы на основе рекомбинантного протеализина прототип ферментного препарата для улучшения качества мясного сырья в пищевой промышленности. Разработанный препарат протестирован в условиях опытного производства. Показано, что его использование способствуют формированию более высоких качественных показателей готовых продуктов мясопереработки.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. На основе охарактеризованных в работе новых термолизинподобных и химотрипсинподобных ферментов, их клонированных генов и экспрессионных систем создана экспериментальная модель для исследования молекулярных механизмов функционирования протеаз.

2. Консервативный элемент субстратсвязывающего центра гутамил-эндопептидаз - остаток Н1б213 не является основным элементом распознавания заряда субстрата ферментами группы и, по-видимому, для каждой эволюционной ветви 01и-специфичных протеаз характерна своя система компенсации заряда.

3. Идентифицирована новая группа термолизинподобных протеаз с короткими Т\[-концевыми пропептидами. Изучена структурная организация представителей группы. Установлена пространственная структура предшественника протеализина -первая структура предшественника пептидазы семейства М4 и первая структура протеазы с коротким пропептидом. Показано, что протеазы группы протеализина могут определять инвазию клеток эукариот бактериями.

4. Разработан прототип ферментного препарата для улучшения качества мясного сырья в пищевой промышленности.

2. Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Демидюк, Илья Валерьевич

5. Выводы

1. Клонирован ген глутамилэндопептидазы В. intermedius (BIGEP), осуществлена его гетерологичная экспрессия в клетках В. subtilis и Е. coli, разработаны методы получения высокоочищенного рекомбинантного белка, что позволяет использовать BIGEP в качестве экспериментальной модели для исследования механизмов функционирования Glu-специфичных протеаз.

2. Впервые получена, на модели BIGEP, глутамилэндопептидаза с аминокислотной заменой по остатку His213- консервативному у всех Glu-специфичных протеаз элементу S1 участка. Анализ свойств модифицированного фермента показал, что His213 не определяет способность BIGEP расщеплять субстраты после остатка глутаминовой кислоты, хотя важен для проявления ферментом высокой каталитической эффективности. Таким образом, His213 не является основным элементом распознавания заряда субстрата глутамилэндопептидазами и, по-видимому, для каждой эволюционной ветви Glu-специфичных протеаз характерна своя система компенсации заряда.

3. Впервые для глутамилэндопептидаз на модели BIGEP показано, что пропептид необходим для формирования активного фермента и, следовательно, выполняет функцию фолдинг-ассистента.

4. Установлено, что удаление пропептида BIGEP in vitro происходит ступенчато. Первая стадия процессинга происходит автокаталитически, приводя к образованию неактивного интермедиата, который переходит в активную форму только после гетероактивации. Таким образом, активация BIGEP in vivo контролируется другими протеазами.

5. Эффективность гетероактивации in vivo и процессирующий фермент определяются остатком в положении (-1) пропептида BIGEP. Введение остатка Glu в позицию (-1) делает фермент автоактивирующимся. Таким образом, модификация остатка (-1) позволяет в ходе эволюции изменять механизмы регуляции активности глутамилэндопептидаз.

6. Разработан подход для получения синтезируемых в виде предшественников протеаз с узкой субстратной специфичностью в гетерологичных экспрессионных системах. Подход основан на создании автопроцессирующихся ферментов путем направленной модификации сайтов их процессинга.

7. Идентифицирована новая группа термолизинподобных протеаз, представители которой отличаются от классических членов семейства структурой N-концевого пропептида.

8. Создана экспериментальная модель для исследования механизмов функционирования пропептидов пептидаз семейства М4 на основе двух новых детально охарактеризованных в ходе данной работы и имеющих разные типы пропоследовательностей ферментов: металлопротеазы Thermoactinomyces sp. и протеализина Ser. proteamaculans. Модель включает охарактеризованные гены ферментов, системы для их гетерологической экспрессии и методы получения высокоочищенных рекомбинантных белков.

9. На основе рекомбинантного протеализина разработан прототип ферментного препарата для улучшения качества мясного сырья в пищевой промышленности. Эффективность препарата подтверждена в условиях опытного производства.

10. На примере фермента Thermoactinomyces sp. впервые для металлопротеаз продемонстрирован эффект белковой памяти. Впервые обнаружено, что формирование конформеров может происходить в системе пропептид-каталитическая часть in trans, а не при изменении аминокислотной последовательности пропептида.

11. Впервые продемонстрировано, что короткие пропептиды термолизинподобных протеаз выступают в качестве фолдинг-ассистентов, определяя сворачивание соответствующих белков.

12. Впервые установлено, что удаление коротких пропептидов термолизинподобных протеаз может происходить автокаталитически, но, в отличие от длинных пропоследовательностей, по межмолекулярному механизму.

13. Впервые продемонстрировано, что термолизинподобные протеазы с короткими пропептидами могут определять инвазию клеток эукариот бактериями, что, вероятно, связано со способностью ферментов группы протеализина специфически расщеплять актин.

14. Методом рентгеноструктурного анализа определена пространственная структура предшественника протеализина - первая структура предшественника пептидазы семейства М4 и первая структура протеализинподобной протеазы. Показано, что ферменты с короткими пропептидами могут рассматриваться как отдельное подсемейство термолизинподобных протеаз не только по структуре предшественников, но и по структуре каталитического домена. Установлено, что пропептид протеализина образует отдельный домен в структуре белка и выполняет функции внутримолекулярного ингибитора, блокируя субстратсвязывающую область и фиксируя активный центр фермента в неблагоприятной для осуществления катализа «открытой» конформации.

6. Благодарности

Автор выражает благодарность всем, кто принимал участие в этой работе.

В первую очередь, автор благодарен сотрудникам, аспирантам, студентам Лаборатории белковой инженерии Института молекулярной генетики РАН и кафедры Биотехнологии и бионанотехнологии МИТХТ, без участия которых осуществление этой работы было бы не возможно: C.B. Кострову, E.H. Звонковой, В.И. Швецу, Е.А. Носовской, Т.В. Акимкиной, Д.В. Романовой, Н.С. Велишаевой, Е.В. Гасанову, Т.Ю. Громовой, А.Е. Калашникову, Д.Р. Сафиной, A.B. Шубину, М.В. Заболотской, Э.Р. Мухаметгалиевой, Н.С. Левиной, О.В. Свиридовой, И.В. Сенечкину, О.В. Васильевой.

Автор благодарен всем коллегам из других организаций, совместно с которыми выполнялись исследования: Г.Г. Честухиной (ГосНИИгенетика), Г.Н. Руденской (Московский государственный университет), Л.Д. Румшу и А.Г. Михайловой (Институт биоорганической химии РАН), М.Р. Шариповой (Казанский (Приволжский) федеральный университет), С.Ю. Хайтлиной, Е.С. Божокиной и O.A. Цаплиной (Институт цитологии РАН), И.П. Курановой и В.Р. Мелик-Адамяну (Институт кристаллографии РАН), В.И. Козловскому (Филиал института энергетических проблем химической физики РАН), Ю.Г. Костенко и Д.С. Батаевой (ВНИИ мясной промышленности), В.А. Самойленко (Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН), В.И. Попенко и О.Г. Леоновой (Институт молекулярной биологии РАН).

Автор благодарит за оказанную финансовую поддержку Российский фонд фундаментальных исследований и программу Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».

Библиография Диссертация по биологии, доктора химических наук, Демидюк, Илья Валерьевич, Москва

1. Industrial enzymes: a global strategic business report. San Jose: Global Industry Analysts, Inc., 2011. 447 p.

2. Докучаева Г. Рынок ферментов: в ожидании перемен. // 2009. URL: http://www. bioinformatix.ru/interesnoe/ryinok-fermentov-v-ozhidanii-peremen.html (дата обращения 24.02.2012).

3. Sternlicht M.D., Werb Z. How matrix metalloproteinases regulate cell behavior. // Annu Rev Cell Dev Biol. 2001. V. 17. P. 463-516.

4. Lopez-Otin C., Overall C.M. Protease degradomics: a new challenge for proteomics. // Nat Rev Mol Cell Biol. 2002. V. 3. № 7. P. 509-519.

5. Yan S.J., Blomme E.A. In situ zymography: a molecular pathology technique to localize endogenous protease activity in tissue sections. // Vet Pathol. 2003. V. 40. № 3. P. 227-236.

6. Von Heijne G. The signal peptide. // J Membr Biol. 1990. V. 115. № 3. P. 195-201.

7. Inouye M. Intramolecular chaperone: the role of the pro-peptide in protein folding. // Enzyme. 1991. V. 45. № 5-6. P. 314-321.

8. Eder J., Fersht A.R. Pro-sequence-assisted protein folding. // Mol Microbiol. 1995. V. 16. №4. P. 609-614.

9. Shinde U., Inouye M. Intramolecular chaperones: polypeptide extensions that modulate protein folding. // Semin Cell Dev Biol. 2000. V. 11. № 1. P. 35-44.

10. Khan A.R., James M.N. Molecular mechanisms for the conversion of zymogens to active proteolytic enzymes. // Protein Sci. 1998. V. 7. № 4. P. 815-836.

11. Ikemura H., Takagi H., Inouye M. Requirement of pro-sequence for the production of active subtilisin E in Escherichia coli. // J Biol Chem. 1987. V. 262. № 16. P. 7859-7864.

12. Silen J.L., Agard D.A. The alpha-lytic protease pro-region does not require a physical linkage to activate the protease domain in vivo. // Nature. 1989. V. 341. № 6241. P. 462-464.

13. Silen J.L., Frank D., Fujishige A., Bone R., Agard D.A. Analysis of prepro-alpha-lytic protease expression in Escherichia coli reveals that the pro region is required for activity. // J Bacteriol. 1989. V. 171. № 3. P. 1320-1325.

14. Winther J.R., Sorensen P. Propeptide of carboxypeptidase Y provides a chaperone-like function as well as inhibition of the enzymatic activity. // Proc Natl Acad Sci U S A. 1991. V. 88. № 20. P. 9330-9334.

15. Lee Y.C., Miyata Y., Terada I., Ohta Т., Matsuzawa H. Involvement of NH2-terminal pro-sequence in the production of active aqualysin I (a thermophilic serine protease) in Escherichia coli. //Agric Biol Chem. 1991. V. 55. № 12. P. 3027-3032.

16. Fabre E., Nicaud J.M., Lopez M.C., Gaillardin C. Role of the proregion in the production and secretion of the Yarrowia lipolytica alkaline extracellular protease. // J Biol Chem. 1991. V. 266. № 6. P. 3782-3790.

17. Conner G.E. The role of the cathepsin D propeptide in sorting to the lysosome. // J Biol Chem. 1992. V. 267. № 30. P. 21738-21745.

18. Rehemtulla A., Dorner A.J., Kaufman R.J. Regulation of PACE propeptide-processing activity: requirement for a post-endoplasmic reticulum compartment and autoproteolytic activation. // Proc Natl Acad Sci USA. 1992. V. 89. № 17. P. 8235-8239.

19. Fukuda R., Horiuchi H., Ohta A., Takagi M. The prosequence of Rhizopus niveus aspartic proteinase-I supports correct folding and secretion of its mature part in Saccharomyces cerevisiae. // J Biol Chem. 1994. V. 269. № 13. P. 9556-9561.

20. Ohnishi Y., Nishiyama M., Horinouchi S., Beppu T. Involvement of the COOH-terminal pro-sequence of Serratia marcescens serine protease in the folding of the mature enzyme. // J Biol Chem. 1994. V. 269. № 52. P. 32800-32806.

21. Chang S.C., Chang PC., Lee Y.H. The roles of propeptide in maturation and secretion of Npr protease from Streptomyces. // J Biol Chem. 1994. V. 269. № 5. P. 3548-3554.

22. Tao K., Stearns N.A., Dong J., Wu Q.L., Sahagian G.G. The proregion of cathepsin L is required for proper folding, stability, and ER exit. //Arch Biochem Biophys. 1994. V. 311. № l.P. 19-27.

23. Mclver K.S., Kessler E., Olson J.C., Ohman D.E. The elastase propeptide functions as an intramolecular chaperone required for elastase activity and secretion in Pseudomonas aeruginosa. // Mol Microbiol. 1995. V. 18. № 5. P. 877-889.

24. Chang Y.C., Kadokura H., Yoda K., Yamasaki M. Secretion of active subtilisin YaB by a simultaneous expression of separate pre-pro and pre-mature polypeptides in Bacillus subtilis. // Biochem Biophys Res Commun. 1996. V. 219. № 2. P. 463-468.

25. Baier K., Nicklisch S., Maldener I., Lockau W. Evidence for propeptide-assisted folding of the calcium-dependent protease of the cyanobacterium Anabaena. // Eur J Biochem. 1996. V. 241. № 3. P. 750-755.

26. Wetmore D.R., Hardman K.D. Roles of the propeptide and metal ions in the folding and stability of the catalytic domain of stromelysin (matrix metalloproteinase 3). // Biochemistry. 1996. V. 35. № 21. P. 6549-6558.

27. O'Donohue M.J., Beaumont A. The roles of the prosequence of thermolysin in enzyme inhibition and folding in vitro. // J Biol Chem. 1996. V. 271. № 43. P. 26477-26481.

28. Cawley N.X., Olsen V., Zhang C.F., Chen H.C., Tan M., Loh Y.P. Activation and processing of non-anchored yapsin 1 (Yap3p). // J Biol Chem. 1998. V. 273. № 1. P. 584-591.

29. Baardsnes J., Sidhu S., MacLeod A., Elliott J., Morden D., Watson J., Borgford T. Streptomyces griseus protease B: secretion correlates with the length of the propeptide. // J Bacteriol. 1998. V. 180. № 12. P. 3241-3244.

30. Nirasawa S., Nakajima Y., Zhang Z.Z., Yoshida M., Hayashi K. Intramolecular chaperone and inhibitor activities of a propeptide from a bacterial zinc aminopeptidase. //Biochem J. 1999. V. 341 (Pt 1). P. 25-31.

31. Marie-Claire C., Ruffet E., Beaumont A., Roques B.P. The prosequence ofthermolysin acts as an intramolecular chaperone when expressed in trans with the mature sequence in Escherichia coli.//J Mol Biol. 1999. V. 285. № 5. P. 1911-1915.

32. Yamamoto Y., Watabe S., Kageyama T., Takahashi S.Y. Proregion of Bombyx mori cysteine proteinase functions as an intramolecular chaperone to promote proper folding of the mature enzyme. // Arch Insect Biochem Physiol. 1999. V. 42. № 3. P. 167-178.

33. Lesage G., Prat A., Lacombe J., Thomas D.Y., Seidah N.G., Boileau G. The Kex2p proregion is essential for the biosynthesis of an active enzyme and requires a C-terminal basic residue for its function. // Mol Biol Cell. 2000. V. 11. № 6. P. 1947-1957.

34. Wiederanders B. The function of propeptide domains of cysteine proteinases. // Adv Exp Med Biol. 2000. V. 477. P. 261-270.

35. Zhang Z.Z., Nirasawa S., Nakajima Y., Yoshida M., Hayashi K. Function of the N-terminal propeptide of an aminopeptidase from Vibrio proteolytics. // Biochem J. 2000.V. 350 (Pt3). P. 671-676.

36. Tang B., Nirasawa S., Kitaoka M., Hayashi K. The role of the N-terminal propeptide of the pro-aminopeptidase processing protease: refolding, processing, and enzyme inhibition. // Biochem Biophys Res Commun. 2002. V. 296. № 1. P. 78-84.

37. Feeney В., Clark A.C. Reassembly of active caspase-3 is facilitated by the propeptide. // J Biol Chem. 2005. V. 280. № 48. P. 39772-39785.

38. Yasuda Y., Tsukuba Т., Okamoto K., Kadowaki Т., Yamamoto K. The role of the cathepsin E propeptide in correct folding, maturation and sorting to the endosome. // J Biochem (Tokyo). 2005. V. 138. № 5. P. 621-630.

39. Muntener K., Willimann A., Zwicky R., Svoboda В., Mach L., Baici A. Folding competence of N-terminally truncated forms of human procathepsin B. // J Biol Chem. 2005. V. 280. № 12. P. 11973-11980.

40. Gasanov E.V., Demidyuk I.V., Shubin A.V., Kozlovskiy V.l., Leonova O.G., Kostrov S.V. Hetero- and auto-activation of recombinant glutamyl endopeptidase from Bacillus intermedius. // Protein Eng Des Sei. 2008. V. 21. № 11. P. 653-658.

41. Schilling К., Korner A., Sehmisch S., Kreusch A., Kleint R., Benedix Y., Schlabrakowski A., Wiederanders B. Selectivity of propeptide-enzyme interaction in cathepsin L-like cysteine proteases. // Biol Chem. 2009. V. 390. № 2. P. 167-174.

42. Safina D., Rafieva L., Demidyuk I., Gasanov E., Chestukhina G., Kostrov S. Involvement of propeptides in formation of catalytically active metalloproteinase from Thermoactinomyces sp. // Protein Pept Lett. 2011. V. 18. № 11. P. 1119-1125.

43. Baker D., Shiau A.K., Agard D.A. The role of pro regions in protein folding. // Сип-Орт Cell Biol. 1993. V. 5. № 6. P. 966-970.

44. Bryan P.N. Prodomains and protein folding catalysis. // Chem Rev. 2002. V. 102. № 12. P. 4805-4816.

45. Демидюк И.В., Заболотская M.B., Велишаева H.C., Сафина Д.Р, Костров C.B. Прозависимый фолдинг микробных протеолитических ферментов. // Мол ген микробиол вирусол. 2003. № 4. Р. 11-15.

46. Zhu X.L., Ohta Y., Jordan F., Inouye M. Pro-sequence of subtilisin can guide the refolding of denatured subtilisin in an intermolecular process. //Nature. 1989. V. 339. № 6224. P. 483-484.

47. Winther J.R., Sorensen P., Kielland-Brandt M.C. Refolding of a carboxypeptidase Y folding intermediate in vitro by low-affinity binding of the proregion. // J Biol Chem. 1994. V. 269. № 35. P. 22007-22013.

48. Braun P., Tommassen J., Filloux A. Role of the propeptide in folding and secretion of elastase of Pseudomonas aeruginosa. // Mol Microbiol. 1996. V. 19. № 2. P. 297-306.

49. Yasukawa K., Kusano M., Inouye K. A new method for the extracellular production of recombinant thermolysin by co-expressing the mature sequence and pro-sequence in Escherichia coli. // Protein Eng Des Sei. 2007. V. 20. № 8. P. 375-383.

50. Bryan P., Alexander P., Strausberg S., Schwarz F., Lan W., Gilliland G., Gallagher D.T. Energetics of folding subtilisin BPN'. // Biochemistry. 1992. V. 31. № 21. P. 4937-4945.

51. Ваганова Т.И., Медведева Н.П., Степанов B.M. Ренатурация бактериальных металлопротеиназ. //Биохимия. 1993. Т. 58. № 6. Р. 913-920.

52. MatsubaraM., Kurimoto Е., Kojima S., MiuraK., Sakai Т. Achievement ofrenaturation of subtilisin BPN' by a novel procedure using organic salts and a digestible mutant of Streptomyces subtilisin inhibitor. // FEBS Lett. 1994. V. 342. № 2. P. 193-196.

53. Hayashi Т., Matsubara M., Nohara D., Kojima S., Miura K., Sakai T. Renaturation of the mature subtilisin BPN' immobilized on agarose beads. //FEBS Lett. 1994. V. 350. № l.P 109-112.

54. Mansfeld J., Petermann E., Durrschmidt P., Ulbrich-Hofmann R. The propeptide is not required to produce catalytically active neutral protease from Bacillus stearothermophilus. // Protein Expr Purif. 2005. V. 39. № 2. P. 219-228.

55. Sohl J.L., Jaswal S.S., Agard D.A. Unfolded conformations of alpha-lytic protease are more stable than its native state. //Nature. 1998. V. 395. № 6704. P. 817-819.

56. Subbian E., Yabuta Y., Shinde U. Positive selection dictates the choice between kinetic and thermodynamic protein folding and stability in subtilases. // Biochemistry. 2004. V. 43. №45. P. 14348-14360.

57. Truhlar S.M., Cunningham E.L., Agard D.A. The folding landscape of Streptomyces griseus protease В reveals the energetic costs and benefits associated with evolving kinetic stability. // Protein Sci. 2004. V. 13. № 2. P. 381-390.

58. Eder J., Rheinnecker M., Fersht A.R. Folding of subtilisin BPN': role of the pro-sequence. // J Mol Biol. 1993. V. 233. № 2. P. 293-304.

59. Gallagher Т., Gilliland G., Wang L., Bryan P. The prosegment-subtilisin BPN' complex: crystal structure of a specific 'foldase'. // Structure. 1995. V. 3. № 9. P. 907-914.

60. Anderson D.E., Peters R.J., Wilk В., Agard D.A. alpha-lytic protease precursor: characterization of a structured folding intermediate. // Biochemistry. 1999. V. 38. № 15. P. 4728-4735.

61. Baker D., Agard D.A. Kinetics versus thermodynamics in protein folding. // Biochemistry. 1994. V. 33. № 24. P. 7505-7509.

62. Cunningham E.L., Jaswal S.S., Sohl J.L., Agard D.A. Kinetic stability as a mechanism for protease longevity. // Proc Natl Acad Sci USA. 1999. V. 96. № 20. P. 11008-11014.

63. Jaswal S.S., Sohl J.L., Davis J.H., Agard D.A. Energetic landscape of alpha-lytic protease optimizes longevity through kinetic stability. // Nature. 2002. V. 415. № 6869. P. 343-346.

64. Kelch B.A., Agard D.A. Mesophile versus thermophile: insights into the structural mechanisms of kinetic stability. // J Mol Biol. 2007. V. 370. № 4. P. 784-795.

65. Shinde U.P., Liu J.J., Inouye M. Protein memory through altered folding mediated by intramolecular chaperones. //Nature. 1997. V. 389. № 6650. P. 520-522.

66. Shinde U., Fu X., Inouye M. A pathway for conformational diversity in proteins mediated by intramolecular chaperones. // J Biol Chem. 1999. V. 274. № 22. P. 15615-15621.

67. Nagayama M., Maeda H., Kuroda K., Ueda M. Mutated intramolecular chaperones generate high-activity isomers of mature enzymes. // Biochemistry. 2012. V. 51. № 17. P. 3547-53.

68. Zabolotskaya M.V., Demidyuk I.V., Akimkina T.V., Kostrov S.V. A novel neutral protease from Thermoactinomyces species 27a: sequencing of the gene, purification, and characterization of the enzyme. // Protein J. 2004. 483-492.

69. Seidah N.G., Mayer G., Zaid A., Rousselet E., Nassoury N., Poirier S., Essalmani R., Prat A. The activation and physiological functions of the proprotein convertases. // Int J Biochem Cell Biol. 2008. V. 40. № 6-7. P. 1111-1125.

70. Muller L., Cameron A., Fortenberry Y., Apletalina E.V., Lindberg I. Processing and sorting of the prohormone convertase 2 propeptide. // J Biol Chem. 2000. V. 275. № 50. P. 39213-39222.

71. Wang D., Bode W., Huber R. Bovine chymotrypsinogen A X-ray crystal structure analysis and refinement of a new crystal form at 1.8 A resolution. // J Mol Biol. 1985. V. 185. №3. P. 595-624.

72. Wroblowski B., Diaz J.F., Schlitter J., Engelborghs Y. Modelling pathways of alpha-chymotrypsin activation and deactivation. // Protein Eng. 1997. V. 10. № 10. P. 1163-1174.

73. Kitamoto Y., Yuan X., Wu Q., McCourt D.W., Sadler J.E. Enterokinase, the initiator of intestinal digestion, is a mosaic protease composed of a distinctive assortment of domains. // Proc Natl Acad Sci USA. 1994. V. 91. № 16. P. 7588-7592.

74. Stroud R.M., Kossiakoff A. A., Chambers J.L. Mechanisms of zymogen activation. // Annu Rev Biophys Bioeng. 1977. V. 6. P. 177-193.

75. Schechter I., Berger A. On the size of the active site in proteases. I. Papain. // Biochem Biophys Res Commun. 1967. V. 27. № 2. P. 157-162.

76. Ruthenburger M., Mayerle J., Lerch M.M. Cell biology of pancreatic proteases. // Endocrinol Metab Clin North Am. 2006. V. 35. № 2. P. 313-331.

77. Yousef G.M., Diamandis E.P. The new human tissue kallikrein gene family: structure, function, and association to disease. // Endocr Rev. 2001. V. 22. № 2. P. 184-204.

78. Yoon H., Laxmikanthan G., Lee J., Blaber S.I., Rodriguez A., Kogot J.M., Scarisbrick I.A., Blaber M. Activation profiles and regulatory cascades of the human kallikrein-related peptidases. // J Biol Chem. 2007. V. 282. № 44. P. 31852-31864.

79. Cloutier S.M., Chagas J.R., Mach J.P., Gygi C.M., Leisinger H.J., Deperthes D. Substrate specificity of human kallikrein 2 (hK2) as determined by phage display technology. // Eur J Biochem. 2002. V. 269. № 11. P. 2747-2754.

80. Memari N., Jiang W., Diamandis E.P., Luo L.Y. Enzymatic properties of human kallikrein-related peptidase 12 (KLK12). // Biol Chem. 2007. V. 388. № 4. P. 427-435.

81. Borgono C.A., Gavigan J.A., Alves J., Bowles B., Harris J.L., Sotiropoulou G., Diamandis E.P. Defining the extended substrate specificity of kallikrein 1-related peptidases. //Biol Chem. 2007. V. 388. № 11. P. 1215-1225.

82. Li H.X., Hwang B.Y., Laxmikanthan G., Blaber S.I., Blaber M., Golubkov P.A., Ren P., Iverson B.L., Georgiou G. Substrate specificity of human kallikreins 1 and 6 determined by phage display. //Protein Sci. 2008. V. 17. № 4. P. 664-672.

83. Yoon H., Blaber S.I., Debela M., Goettig P., Scarisbrick I.A., Blaber M. A completed KLK activome profile: investigation of activation profiles of KLK9, 10, and 15. // Biol Chem. 2009. V. 390. № 4. P. 373-377.

84. Borgono C.A., Diamandis E.P. The emerging roles of human tissue kallikreins in cancer. //Nat Rev Cancer. 2004. V. 4. № 11. P. 876-890.

85. Delbaere L.T., Sudom A.M., Prasad L., Leduc Y., Goldie H. Structure/function studies of phosphoryl transfer by phosphoenolpyruvate carboxykinase. // Biochim Biophys Acta. 2004. V. 1697. № 1-2. P. 271-278.

86. Park C.H., Lee S.J., Lee S.G., Lee W.S., Byun S.M. Hetero- and autoprocessing of the extracellular metalloprotease (Mpr) in Bacillus subtilis. // J Bacteriol. 2004. V. 186. № 19. P. 6457-6464.

87. Велишаева H.C., Гасанов E.B., Громова Т.Ю., Демидкж И.В. Влияние модификации сайта процессинга глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius на продукцию активного фермента клетками Bacillus subtilis. // Биоорг химия. 2008. Т. 34. №6. Р. 786-791.

88. Baker D., Silen J.L., Agard D.A. Protease pro region required for folding is a potent inhibitor of the mature enzyme. //Proteins. 1992. V. 12. № 4. P. 339-344.

89. Ohta Y., Hojo H., Aimoto S., Kobayashi Т., Zhu X., Jordan F., Inouye M. Pro-peptide as an intramolecular chaperone: renaturation of denatured subtilisin E with a synthetic pro-peptide. //Mol Microbiol. 1991. V. 5. № 6. P. 1507-1510.

90. Hu Z., Haghjoo K., Jordan F. Further evidence for the structure of the subtilisin propeptide and for its interactions with mature subtilisin. // J Biol Chem. 1996. V. 271. №7. P. 3375-3384.

91. Markaryan A., Lee J.D., SirakovaT.D., Kolattukudy P.E. Specific inhibition of mature fungal serine proteinases and metalloproteinases by their propeptides. // J Bacteriol. 1996. V. 178. №8. P. 2211-2215.

92. Taylor M.A., Lee M.J. Trypsin isolated from the midgut of the tobacco hornworm, Manduca sexta, is inhibited by synthetic pro-peptides in vitro. // Biochem Biophys Res Commun. 1997. V. 235. № 3. P. 606-609.

93. Boudreault A., Gauthier D., Lazure C. Proprotein convertase PCl/3-related peptides are potent slow tight-binding inhibitors of murine PC 1/3 and Hfurin. // J Biol Chem. 1998. V. 273. № 47. P. 31574-31580.

94. Lesage G., Tremblay M., Guimond J., Boileau G. Mechanism of Kex2p inhibition by its proregion. // FEBS Lett. 2001. V. 508. № 3. P. 332-336.

95. Fugere M., Limperis P.C., Beaulieu-Audy V., Gagnon F., Lavigne P., Klarskov K., Leduc R., Day R. Inhibitory potency and specificity of subtilase-like pro-protein convertase (SPC) prodomains. // J Biol Chem. 2002. V. 277. № 10. P. 7648-7656.

96. Golabek A.A., Dolzhanskaya N., Walus M., Wisniewski K.E., Kida E. Prosegment of tripeptidyl peptidase I is a potent, slow-binding inhibitor of its cognate enzyme. // J Biol Chem. 2008. V. 283. № 24. P. 16497-16504.

97. Fox T., de Miguel E., Mort J.S., Storer A.C. Potent slow-binding inhibition of cathepsin B by its propeptide. // Biochemistry. 1992. V. 31. № 50. P. 12571-12576.

98. Carmona E., Dufour E., Plouffe C., Takebe S., Mason P., Mort J.S., Menard R. Potency and selectivity of the cathepsin L propeptide as an inhibitor of cysteine proteases. // Biochemistry. 1996. V. 35. № 25. P. 8149-8157.

99. Maubach G., Schilling K., Rommerskirch W., Wenz I., Schultz J.E., Weber E., Wiederanders B. The inhibition of cathepsin S by its propeptide specificity and mechanism of action. // Eur J Biochem. 1997. V. 250. № 3. P. 745-750.

100. Roche L., Tort J., Dalton J.P. The propeptide of Fasciola hepatica cathepsin L is a potent and selective inhibitor of the mature enzyme. // Mol Biochem Parasitol. 1999. V. 98. №2. P. 271-277.

101. Guay J., Falgueyret J.P., Ducret A., Percival M.D., Mancini J.A. Potency and selectivity of inhibition of cathepsin K, L and S by their respective propeptides. // Eur J Biochem. 2000. V. 267. № 20. P. 6311-6318.

102. Billington C.J., Mason P., Magny M.C., Mort J.S. The slow-binding inhibition of cathepsin K by its propeptide. // Biochem Biophys Res Commun. 2000. V. 276. № 3. P. 924-929.

103. Sijwali P.S., Shenai B.R., Rosenthal P.J. Folding of the Plasmodium falciparum cysteine protease falcipain-2 is mediated by a chaperone-like peptide and not the prodomain. // J Biol Chem. 2002. V. 277. № 17. P. 14910-14915.

104. Silva F.B., Batista J.A., Marra B.M., Fragoso R.R., Monteiro A.C., Figueira E.L., Grossi-de-Sa M.F. Pro domain peptide of HGCP-Iv cysteine proteinase inhibits nematode cysteine proteinases. // Genet Mol Res. 2004. V. 3. № 3. P. 342-355.

105. Burden R.E., Snoddy P., Jefferies C.A., Walker B., Scott C.J. Inhibition of cathepsin L-like proteases by cathepsin V propeptide. // Biol Chem. 2007. V. 388. № 5. P. 541-545.

106. Pandey K.C., Barkan D.T., Sali A., Rosenthal P.J. Regulatory elements within the prodomain of Falcipain-2, a cysteine protease of the malaria parasite Plasmodium falciparum. // PLoS One. 2009. V. 4. № 5. P. e5694.

107. Fusek M., Mares M., Vagner J., Voburka Z., Baudys M. Inhibition of aspartic proteinases by propart peptides of human procathepsin D and chicken pepsinogen. // FEBS Lett. 1991. V. 287. № 1-2. P. 160-162.

108. Kubota K., Nishii W., Kojima M., Takahashi K. Specific inhibition and stabilization of aspergilloglutamic peptidase by the propeptide. Identification of critical sequences and residues in the propeptide. // J Biol Chem. 2005. V. 280. № 2. P. 999-1006.

109. Kessler E., Safrin M. The propeptide of Pseudomonas aeruginosa elastase acts an elastase inhibitor. // J Biol Chem. 1994. V. 269. № 36. P. 22726-22731.

110. Serkina A.V., Gorozhankina T.F., Shevelev A.B., Chestukhina G.G. Propeptide of the metalloprotease of Brevibacillus brevis 7882 is a strong inhibitor of the mature enzyme. // FEBS Lett. 1999. V. 456. № 1. P. 215-219.

111. Gonzales P.E., Solomon A., Miller A.B., Leesnitzer M.A., Sagi I., Milla M.E. Inhibition of the tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme by its pro domain. // J Biol Chem. 2004. V. 279. № 30. P. 31638-31645.

112. Demidyuk I.V., Gromova T.Y., Polyakov K.M., Melik-Adamyan W.R., Kuranova I.P., Kostrov S.V. Crystal structure of the protealysin precursor: insights into propeptide function. //J Biol Chem. 2010. V. 285. № 3. P. 2003-2013.

113. Li Y., Hu Z., Jordan F., Inouye M. Functional analysis of the propeptide of subtilisin E as an intramolecular chaperone for protein folding. Refolding and inhibitory abilities of propeptide mutants. // J Biol Chem. 1995. V. 270. № 42. P. 25127-25132.

114. Wang L., Ruvinov S., Strausberg S., Gallagher D.T., Gilliland G., Bryan P.N. Prodomain mutations at the subtilisin interface: correlation of binding energy and the rate of catalyzed folding. // Biochemistry. 1995. V. 34. № 47. P. 15415-15420.

115. Braun P., Bitter W., Tommassen J. Activation of Pseudomonas aeruginosa elastase in Pseudomonas putida by triggering dissociation of the propeptide-enzyme complex. // Microbiology. 2000. V. 146 (Pt 10). P. 2565-2572.

116. Bever R.A., Iglewski B.H. Molecular characterization and nucleotide sequence of the Pseudomonas aeruginosa elastase structural gene. // J Bacteriol. 1988. V. 170. № 9. P. 4309-4314.

117. Kessler E., Safrin M. Synthesis, processing, and transport of Pseudomonas aeruginosa elastase. //J Bacteriol. 1988. V. 170. № 11. P. 5241-5247.

118. Braun P., de Groot A., Bitter W., Tommassen J. Secretion of elastinolytic enzymes and their propeptides by Pseudomonas aeruginosa. // J Bacteriol. 1998. V. 180. № 13. P. 3467-3469.

119. Lin L., Lobel P. Production and characterization of recombinant human CLN2 protein for enzyme-replacement therapy in late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis. // Biochem J. 2001. V. 357 (Pt 1). P. 49-55.

120. Golabek A.A., Kida E., Walus M., Wujek P., Mehta P., Wisniewski K.E. Biosynthesis, glycosylation, and enzymatic processing in vivo of human tripeptidyl-peptidase I. // J Biol Chem. 2003. V. 278. № 9. P. 7135-7145.

121. Golabek A.A., Wujek P., Walus M., Bieler S., Soto C., Wisniewski K.E., Kida E. Maturation of human tripeptidyl-peptidase I in vitro. // J Biol Chem. 2004. V. 279. №30. P. 31058-31067.

122. Golabek A.A., Kida E. Tripeptidyl-peptidase I in health and disease. // Biol Chem. 2006. V. 387. № 8. P. 1091-1099.

123. Johnson L.M., Bankaitis V.A., Emr S.D. Distinct sequence determinants direct intracellular sorting and modification of a yeast vacuolar protease. // Cell. 1987. V. 48. № 5. P. 875-885.

124. Pohlner J., Halter R., Beyreuther K., Meyer T.F. Gene structure and extracellular secretion of Neisseria gonorrhoeae IgA protease. // Nature. 1987. V. 325. № 6103. P. 458-462.

125. Vails L.A., Hunter C.P., Rothman J.H., Stevens T.H. Protein sorting in yeast: the localization determinant of yeast vacuolar carboxypeptidase Y resides in the propeptide. // Cell. 1987. V. 48. № 5. P. 887-897.

126. Klionsky D.J., Banta L.M., Emr S.D. Intracellular sorting and processing of a yeast vacuolar hydrolase: proteinase A propeptide contains vacuolar targeting information. //Mol Cell Biol. 1988. V. 8. № 5. P. 2105-2116.

127. Vails L.A., Winther J.R., Stevens T.H. Yeast carboxypeptidase Y vacuolar targeting signal is defined by four propeptide amino acids. // J Cell Biol. 1990. V. 111. № 2. P. 361-368.

128. Manser E., Fernandez D., Lim L. Processing and secretion of human carboxypeptidase E by C6 glioma cells. // Biochem J. 1991. V. 280 (Pt 3). P. 695-701.

129. Fabre E., Tharaud C., Gaillardin C. Intracellular transit of a yeast protease is rescued by trans-complementation with its prodomain. // J Biol Chem. 1992. V. 267. № 21. P. 15049-15055.

130. Wetmore D.R., Wong S.L., Roche R.S. The role of the pro-sequence in the processing and secretion of the thermolysin-like neutral protease from Bacillus cereus. // Mol Microbiol. 1992. V. 6. № 12. P. 1593-1604.

131. Mclntyre G.F., GodboldG.D., EricksonA.H. ThepH-dependent membrane association of procathepsin L is mediated by a 9-residue sequence within the propeptide. // J Biol Chem. 1994. V. 269. № 1. P. 567-572.

132. Takeshima H., Sakaguchi M., Mihara K., Murakami K., Omura T. Intracellular targeting of lysosomal cathepsin D in COS cells. // J Biochem (Tokyo). 1995. V. 118. №5. P. 981-988.

133. Taylor N.A., Shennan K.I., Cutler D.F., Docherty K. Mutations in the pro-peptide of PC2 prevent transit through the secretory pathway. // Biochem Soc Trans. 1996. V. 24. №2. P. 193S.

134. Kim D.W., Lee Y.C., Matsuzawa H. Role of the COOH-terminal pro-sequence of aqualysin I (a heat-stable serine protease) in its extracellular secretion by Thermus thermophilus. // FEMS Microbiol Lett. 1997. V. 157. № 1. P. 39-45.

135. Kim D.W., Matsuzawa H. Requirement for the COOH-terminal pro-sequence in the translocation of aqualysin I across the cytoplasmic membrane in Escherichia coli. // Biochem Biophys Res Commun. 2000. V. 277. № 1. P. 216-220.

136. Mclver K.S., Kessler E., Ohman D.E. Identification of residues in the Pseudomonas aeruginosa elastase propeptide required for chaperone and secretion activities. // Microbiology. 2004. V. 150 (Pt 12). P. 3969-3977.

137. Tapper H., Kallquist L., Johnsson E., Persson A.M., Hansson M., Olsson I. Neutrophil elastase sorting involves plasma membrane trafficking requiring the C-terminal propeptide. // Exp Cell Res. 2006. V. 312. № 18. P. 3471-3484.

138. Koo B.H., Longpre J.M., Somerville R.P., Alexander J.P., Leduc R., Apte S.S. Regulation of ADAMTS9 secretion and enzymatic activity by its propeptide. // J Biol Chem. 2007. V. 282. № 22. P. 16146-16154.

139. Yeung P.S., Zagorski N., Marquis H. The metalloprotease of Listeria monocytogenes controls cell wall translocation of the broad-range phospholipase C. // J Bacteriol. 2005. V. 187. № 8. P. 2601-2608.

140. Bitar A.P., Cao M., Marquis H. The metalloprotease of Listeria monocytogenes is activated by intramolecular autocatalysis. // J Bacteriol. 2008. V. 190. № 1. P. 107-111.

141. Marcusson E.G., Horazdovsky B.F., Cereghino J.L., Gharakhanian E., Emr S.D. The sorting receptor for yeast vacuolar carboxypeptidase Y is encoded by the VPS 10 gene. // Cell. 1994. V. 77. № 4. P. 579-586.

142. Mclntyre G.F., Erickson A.H. The lysosomal proenzyme receptor that binds procathepsin L to microsomal membranes at pH 5 is a 43-kDa integral membrane protein. //Proc Natl Acad Sci U S A. 1993. V. 90. № 22. P. 10588-10592.

143. Huete-Perez J.A., Engel J.C., Brinen L.S., Mottram J.C., McKerrow J.H. Protease trafficking in two primitive eukaryotes is mediated by a prodomain protein motif. // J Biol Chem. 1999. V. 274. № 23. P. 16249-16256.

144. Muntener K., Zwicky R., Csucs G., Baici A. The alternative use of exons 2 and 3 in cathepsin B mRNA controls enzyme trafficking and triggers nuclear fragmentation in human cells. //Histochem Cell Biol. 2003. V. 119. № 2. P. 93-101.

145. Moin K., Demchik L., Mai J., Duessing J., Peters C., Sloane B.F. Observing proteases in living cells. //Adv Exp Med Biol. 2000. V. 477. P. 391-401.

146. Baici A., Muntener K., Willimann A., Zwicky R. Regulation of human cathepsin B by alternative mRNA splicing: homeostasis, fatal errors and cell death. // Biol Chem. 2006. V. 387. № 8. P. 1017-1021.

147. Muntener K., Zwicky R., Csucs G., Rohrer J., Baici A. Exon skipping of cathepsin B: mitochondrial targeting of a lysosomal peptidase provokes cell death. // J Biol Chem. 2004. V. 279. № 39. P. 41012-41017.

148. Zwicky R., Muntener K., Csucs G., Goldring M.B., Baici A. Exploring the role of 5' alternative splicing and of the 3'-untranslated region of cathepsin B mRNA. // Biol Chem. 2003. V. 384. № 7. P. 1007-1018.

149. Vignon F., Capony F., Chambon M., Freiss G., Garcia M., Rochefort H. Autocrine growth stimulation of the MCF 7 breast cancer cells by the estrogen-regulated 52 K protein. //Endocrinology. 1986. V. 118. № 4. P. 1537-1545.

150. Vetvicka V., Vektvickova J., FusekM. Effect of human procathepsin D on proliferation of human cell lines. // Cancer Lett. 1994. V. 79. № 2. P. 131-135.

151. Fusek M., Vetvicka V. Mitogenic function of human procathepsin D: the role of the propeptide. // Biochem J. 1994. V. 303 (Pt 3). P. 775-780.

152. Vetvicka V., Vetvickova J., Fusek M. Effect of procathepsin D and its activation peptide on prostate cancer cells. // Cancer Lett. 1998. V. 129. № 1. P. 55-59.

153. BazzettL.B., WatkinsC.S., Gercel-Taylor C., Taylor D.D. Modulation of proliferation and chemosensitivity by procathepsin D and its peptides in ovarian cancer. // Gynecol Oncol. 1999. V. 74. №2. P. 181-187.

154. Vetvicka V., Vetvickova J., Fusek M. Role of procathepsin D activation peptide in prostate cancer growth. // Prostate. 2000. V. 44. № 1. P. 1-7.

155. Vetvicka V., Vetvickova J., Benes P. Role of enzymatically inactive procathepsin D in lung cancer. //Anticancer Res. 2004. V. 24. № 5A. P. 2739-2743.

156. Vashishta A., Ohri S.S., Proctor M., Fusek M., Vetvicka V. Role of activation peptide of procathepsin D in proliferation and invasion of lung cancer cells. // Anticancer Res. 2006. V. 26. № 6B. P. 4163-4170.

157. Glondu M., Coopman P., Laurent-Matha V., Garcia M., Rochefort H., Liaudet-Coopman E. A mutated cathepsin-D devoid of its catalytic activity stimulates the growth of cancer cells. // Oncogene. 2001. V. 20. № 47. P. 6920-6929.

158. Berchem G., Glondu M., Gleizes M., Brouillet J.P., Vignon F., Garcia M., Liaudet-Coopman E. Cathepsin-D affects multiple tumor progression steps in vivo: proliferation, angiogenesis and apoptosis. // Oncogene. 2002. V. 21. № 38. P. 5951-5955.

159. Vetvicka V., Vetvickova J., Hilgert I., Voburka Z., Fusek M. Analysis of the interaction of procathepsin D activation peptide with breast cancer cells. // Int J Cancer. 1997. V. 73. №3. P. 403-409.

160. Laurent-Matha V., Farnoud M.R., Lucas A., Rougeot C., Garcia M., Rochefort H. Endocytosis of pro-cathepsin D into breast cancer cells is mostly independent of mannose-6-phosphate receptors. //J Cell Sci. 1998. V. Ill (Pt 17). P. 2539-2549.

161. Benes P., Vetvicka V., Fusek M. Cathepsin D many functions of one aspartic protease. // Crit Rev Oncol Hematol. 2008. V. 68. № 1. P. 12-28.

162. Vetvicka V., Vetvickova J., Fusek M. Anti-human procathepsin D activation peptide antibodies inhibit breast cancer development. // Breast Cancer Res Treat. 1999. V. 57. № 3. P. 261-269.

163. Vetvicka V., Benes P., Fusek M. Procathepsin D in breast cancer: what do we know? Effects of ribozymes and other inhibitors. // Cancer Gene Ther. 2002. V. 9. № 10. P. 854-863.

164. Ohri S.S., Vashishta A., Proctor M., Fusek M., Vetvicka V. The propeptide of cathepsin D increases proliferation, invasion and metastasis of breast cancer cells. // Int J Oncol. 2008. V. 32. №2. P. 491-498.

165. Journet A., Chapel A., Kieffer S., Louwagie M., Luche S., Garin J. Towards a human repertoire of monocytic lysosomal proteins. // Electrophoresis. 2000. V. 21. № 16. P. 3411-3419.

166. Garin J., Diez R., Kieffer S., Dermine J.F., Duclos S., Gagnon E., Sadoul R., Rondeau

167. C., Desjardins M. The phagosome proteome: insight into phagosome functions. // J Cell Biol. 2001. V. 152. № 1. P. 165-180.

168. Nagler D.K., Kruger S., Kellner A., Ziomek E., Menard R., Buhtz P., Krams M., Roessner A., Kellner U. Up-regulation of cathepsin X in prostate cancer and prostatic intraepithelial neoplasia. // Prostate. 2004. V. 60. № 2. P. 109-119.

169. Krueger S., Kalinski Т., Hundertmark Т., Wex Т., Küster D., Peitz U., Ebert M., Nagler

170. D.K., Kellner U., Malfertheiner P, et al. Up-regulation of cathepsin X in Helicobacter pylori gastritis and gastric cancer. // J Pathol. 2005. V. 207. № 1. P. 32-42.

171. Demidyuk I.V., Gasanov E.V., Safina D.R., Kostrov S.V. Structural organization of precursors of thermolysin-like proteinases. // Protein J. 2008. V. 27. № 6. P. 343-354.

172. Fuentes-Prior P., Salvesen G.S. The protein structures that shape caspase activity, specificity, activation and inhibition. // Biochem J. 2004. V. 384 (Pt 2). P. 201-232.

173. Pop C., Salvesen G.S. Human caspases: activation, specificity, and regulation. // J Biol Chem. 2009. V. 284. № 33. P. 21777-21781.

174. Pop C., Timmer J., Sperandio S., Salvesen G.S. The apoptosome activates caspase-9 by dimerization. // Mol Cell. 2006. V. 22. № 2. P. 269-275.

175. Schweigreiter R. The dual nature of neurotrophins. // Bioessays. 2006. V. 28. № 6. P. 583-594.

176. Dicou E. Peptides other than the neurotrophins that can be cleaved from proneurotrophins: a neglected story. //Arch Physiol Biochem. 2007. V. 113. № 4-5. P. 228-233.

177. Серкина A.B., Шевелев А.Б., Честухина Г.Г. Структура и функции предшественников бактериальных протеиназ. // Биоорг химия. 2001. Т. 27. № 5. Р. 323-346.

178. Nakayama К. Furin: a mammalian subtilisin/Kex2p-like endoprotease involved in processing of a wide variety of precursor proteins. // Biochem J. 1997. V. 327 (Pt 3). P. 625-635.

179. Egnell P., Flock J.I. The autocatalytic processing of the subtilisin Carlsberg pro-region is independent of the primary structure of the cleavage site. // Mol Microbiol. 1992. V. 6. №9. P. 1115-1119.

180. Ramos C., Winther J.R. Exchange of regions of the carboxypeptidase Y propeptide. Sequence specificity and function in folding in vivo. // Eur J Biochem. 1996. V. 242. № 1. P. 29-35.

181. Van den Hazel H.B., Kielland-Brandt M.C., Winther J.R. Random substitution of large parts of the propeptide of yeast proteinase A. // J Biol Chem. 1995. V. 270. № 15. P. 8602-8609.

182. Takagi H., Koga M., Katsurada S., Yabuta Y., Shinde U., Inouye M., Nakamori S. Functional analysis of the propeptides of subtilisin E and aqualysin I as intramolecular chaperones. // FEBS Lett. 2001. V. 508. № 2. P. 210-214.

183. Parr-Vasquez C.L., Yada R.Y. Functional chimera of porcine pepsin prosegment and Plasmodium falciparum plasmepsin II. // Protein Eng Des Sel. 2010. V. 23. № 1. P. 19-26.

184. Reed J.C., Doctor K.S., Godzik A. The domains of apoptosis: a genomics perspective. // Sci STKE. 2004. V. 2004. № 239. P. re9.

185. Delaria K., Fiorentino L., Wallace L., Tamburini P., Brownell E., Muller D. Inhibition of cathepsin L-like cysteine proteases by cytotoxic T-lymphocyte antigen-2 beta. // J Biol Chem. 1994. V. 269. № 40. P. 25172-25177.

186. Kurata M., Hirata M., Watabe S., Miyake M., Takahashi S.Y., Yamamoto Y. Expression, purification, and inhibitory activities of mouse cytotoxic T-lymphocyte antigen-2alpha. // Protein Expr Purif. 2003. V. 32. № 1. P. 119-125.

187. Yamamoto Y., Watabe S., KageyamaT., Takahashi S. Y. Purification and characterization of Bombyx cysteine proteinase specific inhibitors from the hemolymph of Bombyx mori. //Arch Insect Biochem Physiol. 1999. V. 42. № 2. P. 119-129.

188. Yamamoto Y., Watabe S., Kageyama T., Takahashi S.Y. A novel inhibitor protein for Bombyx cysteine proteinase is homologous to propeptide regions of cysteine proteinases. // FEBS Lett. 1999. V. 448. № 2-3. P. 257-260.

189. Yamamoto Y., Kurata M., Watabe S., Murakami R., Takahashi S.Y. Novel cysteine proteinase inhibitors homologous to the proregions of cysteine proteinases. // Curr Protein Pept Sci. 2002. V. 3. № 2. P. 231-238.

190. Deshapriya R.M., Takeuchi A., Shirao K., Isa K., Watabe S., Murakami R., Tsujimura H., Yamamoto Y. Drosophila CTLA-2-like protein (D/CTLA-2) inhibits cysteine proteinase 1 (CP1), a cathepsin L-like enzyme. // Zoolog Sci. 2007. V. 24. № 1. P. 21-30.

191. Comas D., Petit F., Preat T. Drosophila long-term memory formation involves regulation of cathepsin activity. //Nature. 2004. V. 430. № 6998. P. 460-463.

192. Luziga C., Nakamura O., Deshapriya R.M., Usui M., Miyaji M., Wakimoto M., Wada N., Yamamoto Y. Expression mapping of cytotoxic T-lymphocyte antigen-2alpha gene transcripts in mouse brain. // Histochem Cell Biol. 2007. V. 127. № 6. P. 569-579.

193. Luziga C., Nakamura O., Deshapriya R.M., Usui M., Miyaji M., Wakimoto M., Wada N., Mbassa G., Yamamoto Y. Dendritic and axonal localization of cytotoxic T-lymphocyte antigen-2 alpha protein in mouse brain. // Brain Res. 2008. V. 1204. P. 40-52.

194. Cheon Y.P., DeMayo F.J., Bagchi M.K., Bagchi I.C. Induction of cytotoxic T-lymphocyte antigen-2beta, a cysteine protease inhibitor in decidua: a potential regulator of embryo implantation. // J Biol Chem. 2004. V. 279. № 11. P. 10357-10363.

195. Campo M.A., Rice E.J., Kasik J.W. There is an increase in expression of the cytotoxic T-lymphocyte antigen-2 alpha gene during pregnancy. // Am J Obstet Gynecol. 1996. V. 174. №5. P. 1605-1607.

196. Jerala R., Zerovnik E., Kidric J., Turk V. pH-induced conformational transitions of the propeptide of human cathepsin L. A role for a molten globule state in zymogen activation. // J Biol Chem. 1998. V. 273. № 19. P. 11498-11504.

197. DohmaeN., TakioK., TsumurayaY., Hashimoto Y. The complete amino acid sequences of two serine proteinase inhibitors from the fruiting bodies of a basidiomycete, Pleurotus ostreatus. //Arch Biochem Biophys. 1995. V. 316. № 1. P. 498-506.

198. Maier K., Muller H., Tesch R., Trolp R., Witt I., Holzer H. Primary structure of yeast proteinase B inhibitor 2. // J Biol Chem. 1979. V. 254. № 24. P. 12555-12561.

199. Kojima S., Iwahara A., Yanai H. Inhibitor-assisted refolding of protease: a protease inhibitor as an intramolecular chaperone. // FEBS Lett. 2005. V. 579. № 20. P. 4430-4436.

200. Fu X., Inouye M., Shinde U. Folding pathway mediated by an intramolecular chaperone. The inhibitory and chaperone functions of the subtilisin propeptide are not obligatorily linked. // J Biol Chem. 2000. V. 275. № 22. P. 16871-16878.

201. Takagi H., Takahashi M. A new approach for alteration of protease functions: pro-sequence engineering. //Appl Microbiol Biotechnol. 2003. V. 63. № 1. P. 1-9.

202. Sidhu S.S., Borgford T.J. Selection of Streptomyces griseus protease B mutants with desired alterations in primary specificity using a library screening strategy. // J Mol Biol. 1996. V. 257. № 2. P. 233-245.

203. Visal S., Taylor M.A., Michaud D. The proregion of papaya proteinase IV inhibits Colorado potato beetle digestive cysteine proteinases. // FEBS Lett. 1998. V. 434. №3. P. 401-405.

204. Plainkum P., Fuchs S.M., Wiyakrutta S., Raines R.T. Creation of a zymogen. // Nat Struct Biol. 2003. V. 10. №2. P. 115-119.

205. Johnson R.J., Lin S.R., Raines R.T. A ribonuclease zymogen activated by the NS3 protease of the hepatitis C virus. // FEBS J. 2006. V. 273. № 23. P. 5457-5465.

206. Han S., Craig J.A., Putnam C.D., Carozzi N.B., Tainer J.A. Evolution and mechanism from structures of an ADP-ribosylating toxin and NAD complex. // Nat Struct Biol. 1999. V. 6. № 10. P. 932-936.

207. Jucovic M., Walters F.S., Warren G.W., Palekar N.V., Chen J.S. From enzyme to zymogen: engineering Vip2, an ADP-ribosyltransferase from Bacillus cereus, for conditional toxicity. // Protein Eng Des Sel. 2008. V. 21. № 10. P. 631-638.

208. Lazure C. The peptidase zymogen proregions: nature's way of preventing undesired activation and proteolysis. // Curr Pharm Des. 2002. V. 8. № 7. P. 511-531.

209. Wiederanders В., Kaulmann G., Schilling K. Functions of propeptide parts in cysteine proteases. // Curr Protein Pept Sci. 2003. V. 4. № 5. P. 309-326.

210. Adekoya O.A., Sylte I. The thermolysin family (M4) of enzymes: therapeutic and biotechnological potential. // Chem Biol Drug Des. 2009. V. 73. № 1. P. 7-16.

211. Matthews B.W., Sigler P.B., Henderson R., Blow D.M. Three-dimensional structure of tosyl-alpha-chymotrypsin. //Nature. 1967. V. 214. № 5089. P. 652-656.

212. Whitcomb D.C., Lowe M.E. Human pancreatic digestive enzymes. // Dig Dis Sci. 2007. V. 52. № 1. P. 1-17.

213. Davie E.W., Fujikawa K., Kisiel W. The coagulation cascade: initiation, maintenance, and regulation. // Biochemistry. 1991. V. 30. № 43. P. 10363-10370.

214. Barry M., Bleackley R.C. Cytotoxic T lymphocytes: all roads lead to death. // Nat Rev Immunol. 2002. V. 2. № 6. P. 401-409.

215. Duncan R.C., Wijeyewickrema L.C., Pike R.N. The initiating proteases of the complement system: controlling the cleavage. // Biochimie. 2008. V. 90. № 2. P. 387-395.

216. Honda A., Siruntawineti J., Baba T. Role of acrosomal matrix proteases in sperm-zona pellucida interactions. // Hum Reprod Update. 2002. V. 8. № 5. P. 405-412.

217. GorbalenyaA., Snijder E. Viral cysteine proteinases. //Perspectives in Drug Discovery and Design. 1996. V. 6. № 1. P. 64-86.

218. Bazan J.F., Fletterick R.J. Viral cysteine proteases are homologous to the trypsin-like family of serine proteases: structural and functional implications. // Proc Natl Acad Sci USA. 1988. V. 85. № 21. P. 7872-7876.

219. Rawlings N.D., Barrett A.J. Evolutionary families of peptidases. // Biochem J. 1993. V. 290 (Pt 1). P. 205-218.

220. Rawlings N.D., Barrett A. J., Bateman A. MEROPS: the peptidase database. //Nucleic Acids Res. 2010. V. 38. № Database issue. P. D227-233.

221. Stroud R.M. A family of protein-cutting proteins. // Sci Am. 1974. V. 231. № 1. P. 74-88.

222. Руденская Т.Н. Брахиурины сериновые коллагенолитические ферменты крабов. // Биоорг химия. 2003. Т. 29. № 2. Р. 117-128.

223. Polanowska J., Krokoszynska I., Czapinska H., Watorek W., Dadlez M., Otlewski J. Specificity of human cathepsin G. // Biochim Biophys Acta. 1998. V. 1386. № 1. P. 189-198.

224. Ziebuhr J., Snijder E.J., Gorbalenya A.E. Virus-encoded proteinases and proteolytic processing in the Nidovirales. // J Gen Virol. 2000. V. 81. (Pt 4). P. 853-879.

225. Czapinska H., Otlewski J. Structural and energetic determinants of the SI-site specificity in serine proteases. // Eur J Biochem. 1999. V. 260. № 3. P. 571-595.

226. Hedstrom L. Trypsin: a case study in the structural determinants of enzyme specificity. // Biol Chem. 1996. V. 377. № 7-8. P. 465-470.

227. Hedstrom L. Serine protease mechanism and specificity. // Chem Rev. 2002. V. 102. № 12. P. 4501-4524.

228. Perona J.J., Craik C.S. Structural basis of substrate specificity in the serine proteases. // Protein Sci. 1995. V. 4. № 3. P. 337-360.

229. Perona J.J., Craik C.S. Evolutionary divergence of substrate specificity within the chymotrypsin-like serine protease fold. // J Biol Chem. 1997. V. 272. № 48. P. 29987-29990.

230. Knowles J.R. Enzyme specificity: alpha-chymotrypsin. // J Theor Biol. 1965. V. 9. №2. P. 213-228.

231. Dorovska V.N., Varfolomeyev S.D., Kazanskaya N.F., Klyosov A.A., Martinek K. The influence of the geometric properties of the active centre on the specificity of chymotrypsin catalysis. //FEBS Lett. 1972. V. 23. № 1. P. 122-124.

232. Blow D. The structure of chymotrypsin, in The Enzymes., P. Boyer, Editor. 1971, New York. p. 185.

233. Krieger M., Kay L.M., Stroud R.M. Structure and specific binding of trypsin: comparison of inhibited derivatives and a model for substrate binding. // J Mol Biol. 1974. V. 83. №2. P. 209-230.

234. Shotton D.M., Watson H.C. Three-dimensional structure of tosyl-elastase. // Nature. 1970. V. 225. № 5235. P. 811-816.

235. Waugh S.M., Harris J.L., Fletterick R., Craik C.S. The structure of the pro-apoptotic protease granzyme B reveals the molecular determinants of its specificity. // Nat Struct Biol. 2000. V. 7. № 9. P. 762-765.

236. Tsu C.A., Perona J. J., Fletterick R. J., Craik C.S. Structural basis for the broad substrate specificity of fiddler crab collagenolytic serine protease 1. // Biochemistry. 1997. V. 36. № 18. P. 5393-5401.

237. Pletnev V.Z., Zamolodchikova T.S., Pangborn W.A., Duax W.L. Crystal structure of bovine duodenase, a serine protease, with dual trypsin and chymotrypsin-like specificities. // Proteins. 2000. V. 41. № 1. P. 8-16.

238. Hedstrom L., Szilagyi L., Rutter W.J. Converting trypsin to chymotrypsin: the role of surface loops. // Science. 1992. V. 255. № 5049. P. 1249-1253.

239. Graf L., Jancso A., Szilagyi L., Hegyi G., Pinter K., Naray-Szabo G., Hepp J., Medzihradszky K., Rutter W.J. Electrostatic complementarity within the substrate-binding pocket of trypsin. // Proc Natl Acad Sci USA. 1988. V. 85. № 14. P. 4961-4965.

240. Hedstrom L., Perona J.J., Rutter W.J. Converting trypsin to chymotrypsin: residue 172 is a substrate specificity determinant. // Biochemistry. 1994. V. 33. № 29. P. 8757-8763.

241. Hedstrom L., Farr-Jones S., Kettner C.A., Rutter W.J. Converting trypsin to chymotrypsin: ground-state binding does not determine substrate specificity. // Biochemistry. 1994. V. 33. № 29. P. 8764-8769.

242. Perona J.J., Hedstrom L., Rutter W.J., Fletterick R.J. Structural origins of substrate discrimination in trypsin and chymotrypsin. // Biochemistry. 1995. V. 34. № 5. P. 1489-1499.

243. Drapeau G.R., Boily Y., Houmard J. Purification and properties of an extracellular protease of Staphylococcus aureus. // J Biol Chem. 1972. V. 247. № 20. P. 6720-6726.

244. Dancer S.J., Garratt R., Saldanha J., Jhoti H., Evans R. The epidermolytic toxins are serine proteases. // FEBS Lett. 1990. V. 268. № 1. P. 129-132.

245. HanakawaY.,SchechterN.M.,LinC.,NishifujiK.,AmagaiM.,StanleyJ.R.Enzymatic and molecular characteristics of the efficiency and specificity of exfoliative toxin cleavage of desmoglein 1. // J Biol Chem. 2004. V. 279. № 7. P. 5268-5277.

246. Ohara-Nemoto Y., Ikeda Y., Kobayashi M., Sasaki M., Tajika S., Kimura S. Characterization and molecular cloning of a glutamyl endopeptidase from Staphylococcus epidermidis. // Microb Pathog. 2002. V. 33. № 1. P. 33-41.

247. Yokoi К., KakikawaM., KimotoH., WatanabeК.,YasukawaH.,YamakawaA., Taketo A., KodairaK.I. Genetic and biochemical characterization of glutamyl endopeptidase of Staphylococcus warneri M. // Gene. 2001. V. 281. № 1-2. P. 115-122.

248. Ono Т., Ohara-Nemoto Y., Shimoyama Y., Okawara H., Kobayakawa Т., Baba T.T., Kimura S., Nemoto Т.К. Amino acid residues modulating the activities of staphylococcal glutamyl endopeptidases. // Biol Chem. 2010. V. 391. № 10. P. 1221-1232.

249. Fudaba Y., Nishifuji K., Andresen L.O., Yamaguchi Т., Komatsuzawa H., Amagai M., Sugai M. Staphylococcus hyicus exfoliative toxins selectively digest porcine desmoglein 1. // Microb Pathog. 2005. V. 39. № 5-6. P. 171-176.

250. Хайдарова H.B., Руденская Г.Н., Ревина Л.П., Степанов В.М., Егоров Н.С. Glu,Asp-специфичная протеиназа из Streptomycetes thermovulgaris. // Биохимия. 1989. Т. 54. № 1. Р. 46-53.

251. Svendsen I., Breddam К. Isolation and amino acid sequence of a glutamic acid specific endopeptidase from Bacillus licheniformis. // Eur J Biochem. 1992. V. 204. № 1. P. 165-171.

252. Rufo G.A., Jr., Sullivan B.J., Sloma A., Pero J. Isolation and characterization of a novel extracellular metalloprotease from Bacillus subtilis. // J Bacteriol. 1990. V. 172. №2. P. 1019-1023.

253. Leshchinskaya I.B., Shakirov E.V., Itskovitch E.L., Balaban N.P., Mardanova A.M., Sharipova M.R., Viryasov M.B., Rudenskaya G.N., Stepanov V.M. Glutamyl endopeptidase of Bacillus intermedius, strain 3-19. // FEBS Lett. 1997. V. 404. №2-3. P. 241-244.

254. Мосолова O.B., Руденская Т.Н., Степанов В.М., Ходова О.М., Цаплина И.А. Glu,Asp-специфичная протеиназа актиномицетов. // Биохимия. 1987. Т. 52. № 3. Р. 414-422.

255. Демидюк И.В., Носовская Е.А., Цаплина И.А., Каравайко Г.И., Костров С.В. Выделение и характеристика сериновой протеиназы из Thermoactinomyces species, относящейся к группе Glu,Asp-специфичных ферментов. // Биохимия. 1997. Т. 62. №2. Р. 202-207.

256. McGavin M.J., Zahradka C., Rice K., Scott J.E. Modification of the Staphylococcus aureus fibronectin binding phenotype by V8 protease. // Infect Immun. 1997. V. 65. № 7. P. 2621-2628.

257. Rice K., Peralta R., Bast D., de Azavedo J., McGavin M.J. Description of staphylococcus serine protease (ssp) operon in Staphylococcus aureus and nonpolar inactivation of sspA-encoded serine protease. // Infect Immun. 2001. V. 69. № 1. P. 159-169.

258. Shaw L., Golonka E., Potempa J., Foster S.J. The role and regulation of the extracellular proteases of Staphylococcus aureus. //Microbiology. 2004. V. 150 (Pt 1). P. 217-228.

259. Nishifuji K., Sugai M., Amagai M. Staphylococcal exfoliative toxins: «molecular scissors» of bacteria that attack the cutaneous defense barrier in mammals. // J Dermatol Sci. 2008. V. 49. № 1. P. 21-31.

260. Шарипова M.P., Балабан Н.П., Габдрахманова JI.А., Шилова М.А., Кадырова Ю.М., Руденская Г.Н., Лещинская И.Б. Гидролитические ферменты и спорообразование у Bacillus intermedius. II Микробиология. 2002. Т. 71. № 4. Р. 494-499.

261. Wensvoort G. Lelystad virus and the porcine epidemic abortion and respiratory syndrome. // Vet Res. 1993. V. 24. № 2. P. 117-124.

262. MacLachlan N.J., Balasuriya U.B. Equine viral arteritis. //Adv Exp Med Biol. 2006. V. 581. P. 429-433.

263. Nienaber V.L., Breddam K., Birktoft J.J. A glutamic acid specific serine protease utilizes a novel histidine triad in substrate binding. // Biochemistry. 1993. V. 32. №43. P. 11469-11475.

264. Cortes A., Emery D.C., Halsall D.J., Jackson R.M., Clarke A.R., Holbrook J.J. Charge balance in the alpha-hydroxyacid dehydrogenase vacuole: an acid test. // Protein Sci. 1992. V. 1. № 7. P. 892-901.

265. Svendsen I., Jensen M.R., Breddam K. The primary structure of the glutamic acid-specific protease of Streptomyces griseus. // FEBS Lett. 1991. V. 292. № 1-2. P. 165-167.

266. Sidhu S.S., Kalmar G.B., Borgford T.J. Characterization of the gene encoding the glutamic-acid-specific protease of Streptomyces griseus. //Biochem Cell Biol. 1993. V. 71. №9-10. P. 454-461.

267. Stennicke H.R., Birktoft J. J., Breddam K. Characterization of the SI binding site of the glutamic acid-specific protease from Streptomyces griseus. // Protein Sci. 1996. V. 5. № 11. P. 2266-2275.

268. Dougherty W.G., Semler B.L. Expression of virus-encoded proteinases: functional and structural similarities with cellular enzymes. // Microbiol Rev. 1993. V. 57. № 4. P. 781-822.

269. Spall V.E., Shanks M., Lomonossoff G.P. Polyprotein Processing as a Strategy for Gene Expression in RNA Viruses. // Seminars in Virology. 1997. V. 8. № 1. P. 15-23.

270. Snijder E.J., Wassenaar A.L., van Dinten L.C., Spaan W.J., Gorbalenya A.E. The arterivirus nsp4 protease is the prototype of a novel group of chymotrypsinlike enzymes, the 3C-like serine proteases. // J Biol Chem. 1996. V. 271. № 9. P. 4864-4871.

271. Mosimann S.C., Cherney M.M., Sia S., Plotch S., James M.N. Refined X-ray crystallographic structure of the poliovirus 3C gene product. // J Mol Biol. 1997. V. 273. №5. P. 1032-1047.

272. Bergmann E.M., Mosimann S.C., Chernaia M.M., Malcolm B.A., James M.N. The refined crystal structure of the 3C gene product from hepatitis A virus: specific proteinase activity and RNA recognition. // J Virol. 1997. V. 71. № 3. P. 2436-2448.

273. Anand K., Palm G.J., Mesters J.R., Siddell S.G., Ziebuhr J., Hilgenfeld R. Structure of coronavirus main proteinase reveals combination of a chymotrypsin fold with an extra alpha-helical domain. // EMBO J. 2002. V. 21. № 13. P. 3213-3224.

274. Anand K., Ziebuhr J., Wadhwani P., Mesters J.R., Hilgenfeld R. Coronavirus main proteinase (3CLpro) structure: basis for design of anti-SARS drugs. // Science. 2003. V. 300. № 5626. P. 1763-1767.

275. Ziebuhr J., Heusipp G., Siddell S.G. Biosynthesis, purification, and characterization of the human coronavirus 229E 3C-like proteinase. // J Virol. 1997. V. 71. № 5. P. 3992-3997.

276. Nagata K., Yoshida N., Ogata F., Araki M., Noda K. Subsite mapping of an acidic amino acid-specific endopeptidase from Streptomyces griseus, GluSGP, and protease V8. // J Biochem. 1991. V. 110. № 6. P. 859-862.

277. Breddam K., Meldal M. Substrate preferences of glutamic-acid-specific endopeptidases assessed by synthetic peptide substrates based on intramolecular fluorescence quenching. // Eur J Biochem. 1992. V. 206. № 1. P. 103-107.

278. Barbosa J.A., Garratt R.C., Saldanha J.W. A structural model for the glutamate-specific endopeptidase from Streptomyces griseus that explains substrate specificity. // FEBS Lett. 1993. V. 324. № 1. P. 45-50.

279. Melish M.E., Glasgow L.A. The staphylococcal scalded-skin syndrome. // N Engl J Med. 1970. V. 282. №20. P. 1114-1119.

280. Kapral F.A., Miller M.M. Product of Staphylococcus aureus responsible for the scalded-skin syndrome. // Infect Immun. 1971. V. 4. № 5. P. 541-545.

281. Kondo I., Sakurai S., Sarai Y. New type of exfoliatin obtained from staphylococcal strains, belonging to phage groups other than group II, isolated from patients with impetigo and Ritter's disease. // Infect Immun. 1974. V. 10. № 4. P. 851-861.

282. Bailey C.J., Smith T.P. The reactive serine residue of epidermolytic toxin A. // Biochem J. 1990. V. 269. № 2. P. 535-537.

283. Prevost G., Rifai S., Chaix M.L., Piemont Y. Functional evidence that the Ser-195 residue of staphylococcal exfoliative toxin A is essential for biological activity. // Infect Immun. 1991. V. 59. № 9. P. 3337-3339.

284. Redpath M.B., Foster T.J., Bailey C .J. The role of the serine protease active site in the mode of action of epidermolytic toxin of Staphylococcus aureus. // FEMS Microbiol Lett. 1991. V. 65. № 2. P. 151-155.

285. Rogolsky M., Wiley B.B., Keyhani M., Glasgow L.A. Interaction of staphylococcal exfoliative toxin with concanavalin A. // Infect Immun. 1974. V. 10. № 6. P. 1260-1265.

286. Bailey C.J., de Azavedo J., Arbuthnott J.P. A comparative study of two serotypes of epidermolytic toxin from Staphylococcus aureus. // Biochim Biophys Acta. 1980. V. 624. № l.P. 111-120.

287. Arbuthnott J.P., Billcliffe B., Thompson W.D. Isoelectric focusing studies of staphylococcal epidermolytic toxin. // FEBS Lett. 1974. V. 46. № 1. P. 92-95.

288. Bailey C.J., Redpath M.B. The esterolytic activity of epidermolytic toxins. //Biochem J. 1992. V. 284 (Pt 1). P. 177-180.

289. Vath G.M., Earhart C.A., Rago J.V., Kim M.H., Bohach G.A., Schlievert P.M., Ohlendorf D.H. The structure of the superantigen exfoliative toxin A suggests a novel regulation as a serine protease. // Biochemistry. 1997. V. 36. № 7. P. 1559-1566.

290. Vath G.M., Earhart C.A., Monie D.D., Iandolo J. J., Schlievert P.M., Ohlendorf D.H. The crystal structure of exfoliative toxin B: a superantigen with enzymatic activity. // Biochemistry. 1999. V. 38. № 32. P. 10239-10246.

291. Amagai M., Matsuyoshi N., Wang Z.H., Andl C., Stanley J.R. Toxin in bullous impetigo and staphylococcal scalded-skin syndrome targets desmoglein 1. // Nat Med. 2000. V. 6. № 11. P. 1275-1277.

292. Amagai M., Yamaguchi T., Hanakawa Y., Nishifuji K., Sugai M., Stanley J.R. Staphylococcal exfoliative toxin B specifically cleaves desmoglein 1. // J Invest Dermatol. 2002. V. 118. № 5. P. 845-850.

293. Ahrens P., Andresen L.O. Cloning and sequence analysis of genes encoding Staphylococcus hyicus exfoliative toxin types А, В, C, and D. // J Bacteriol. 2004. V. 186. №6. P. 1833-1837.

294. Rago J.V., Vath G.M., Bohach G.A., Ohlendorf D.H., Schlievert P.M. Mutational analysis of the superantigen staphylococcal exfoliative toxin A (ETA). // J Immunol. 2000. V. 164. № 4. P. 2207-2213.

295. Prasad L., Leduc Y., Hayakawa K., Delbaere L.T. The structure of a universally employed enzyme: V8 protease from Staphylococcus aureus. // Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2004. V. 60 (Pt 2). P. 256-259.

296. Drapeau G.R. Role of metalloprotease in activation of the precursor of staphylococcal protease. // J Bacteriol. 1978. V. 136. № 2. P. 607-613.

297. Trachuk L.A., Shcheglov A.S., Milgotina E.I., Chestukhina G.G. In vitro maturation pathway of a glutamyl endopeptidase precursor from Bacillus licheniformis. // Biochimie. 2005. V. 87. № 6. P. 529-537.

298. Nemoto Т.К., Ohara-Nemoto Y., Ono Т., Kobayakawa Т., Shimoyama Y., Kimura S., Takagi T. Characterization of the glutamyl endopeptidase from Staphylococcus aureus expressed in Escherichia coli. // FEBS J. 2008. V. 275. № 3. P. 573-587.

299. Балабан Н.П., Марданова A.M., Шарипова M.P., Габдрахманова JI.A., Соколова Е.А., Руденская Г.Н., Лещинская И.Б. Получение и характеристика тиолзависимой сериновой протеиназы 2 Bacillus intermedius 3-19. // Биохимия. 2004. Т. 69. №4. Р. 519-526.

300. Yang M.Y., Ferrari Е., Henner D.J. Cloning of the neutral protease gene of Bacillus subtilis and the use of the cloned gene to create an in vitro-derived deletion mutation. //J Bacteriol. 1984. V. 160. № 1. P. 15-21.

301. Сорокин А.В., Хазак В.Э. Экспрессионная единица в области инициации репликации плазмиды pSM19035 стрептококов. // Мол биол. 1990. Т. 24. № 4. Р. 993-1000.

302. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis Т. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1982. 545 p.

303. Anagnostopoulos С., Spizizen J. Requirements for Transformation in Bacillus Subtilis. // J Bacteriol. 1961. V. 81. № 5. P. 741-746.

304. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. //Nature. 1970. V. 227. № 5259. P. 680-685.

305. Schagger H., von Jagow G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. //Anal Biochem. 1987. V. 166. № 2. P. 368-379.

306. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. // Anal Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.

307. Гаспаров B.C., Дягтярь В.Г. Определение белка по связыванию с красителем кумасси бриллиантовым голубым G-250. // Биохимия. 1994. Т. 59. № 6. Р. 763-777.

308. Dawson М.С., Elliott D.C., Elliott W.H., Jones K.M. Data for Biochemical Research. 3rd ed. Oxford: Clarendon Press, 1989. 592 p.

309. Charney J., Tomarelli R.M. Determination of the proteolytic activity of duodenal juice. // J. Biochem. 1947. V. 177. P. 501-505.

310. Ревина Л.П., Хайдарова H.B., Руденская Г.Н., Гребенщиков Н.И., Баратова Л.А., Степанов В.М. Исследование действия Glu, Asp-специфичной протеиназы Streptomyces thermovulgaris на пептидные и белковые субстраты. // Биохимия. 1989. Т. 54. №5. Р. 846-850.

311. Bendtsen J.D., Nielsen H., von Heijne G., Brunak S. Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0. // J. Mol. Biol. 2004. V. 340. № 4. P. 783-795.

312. Thompson J.D., Gibson T.J., Plewniak F., Jeanmougin F., Higgins D.G. The CLUSTAL X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. № 24. P. 4876-4882.

313. Larkin M.A., Blackshields G., Brown N.P., Chenna R., McGettigan P.A., McWilliam H., Valentin F., Wallace I.M., Wilm A., Lopez R., et al. Clustal W and Clustal X version 2.0. // Bioinformatics. 2007. V. 23. № 21. P. 2947-2948.

314. Schneider T.D., Stephens R.M. Sequence logos: a new way to display consensus sequences. //Nucleic Acids Res. 1990. V. 18. № 20. P. 6097-6100.

315. Crooks G.E., Hon G., Chandonia J.M., Brenner S.E. WebLogo: a sequence logo generator. // Genome Res. 2004. V. 14. № 6. P. 1188-1190.

316. Guex N., Peitsch M.C. SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: an environment for comparative protein modeling. // Electrophoresis. 1997. V. 18. № 15. P. 2714-2723.

317. DeLano W.L. The PyMOL Molecular Graphics System. 2007, DeLano Scientific LLC, Palo Alto, CA, USA.

318. Акимкина T.B., Носовская E.A., Костров С.В. Клонирование и экспрессия гена нейтральной протеиназы В. cereus в клетках В. subtilis. // Мол биол. 1992. Т. 26. №2. Р. 418-423.

319. Erlanger B.F., Kokowsky N., Cohen W. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin. //Arch Biochem Biophys. 1961. V. 95. P. 271-278.

320. Sarkar G., Sommer S.S. The «megaprimer» method of site-directed mutagenesis. // Biotechniques. 1990. V. 8. № 4. P. 404-407.

321. Заболотская M.B., Носовская E.A., Каплун M.A., Цаплина И.А., Акимкина Т.В. Новая термостабильная протеиназа на Thermoactinomyces sp. 27а. Клонирование и экспрессия гена. // Мол ген микробиол вирусол. 2001. № 1. Р. 32-34.

322. Feder J. A spectrophotometry assay for neutral protease. // Biochem Biophys Res Commun. 1968. V. 32. № 2. P. 326-332.

323. Inouye K. Effects of salts on thermolysin: activation of hydrolysis and synthesis of N-carbobenzoxy-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester, and a unique change in the absorption spectrum of thermolysin. // J Biochem. 1992. V. 112. № 3. P. 335-340.

324. Tsu C.A., Perona J.J., Schellenberger V., Turck C.W., Craik C.S. The substrate specificity of Uca pugilator collagenolytic serine protease 1 correlates with the bovine type I collagen cleavage sites. // J Biol Chem. 1994. V. 269. № 30. P. 19565-19572.

325. Журавская Н.К., Алехина JT.T., Отряшенкова JI.M. Исследование и контроль качества мяса и мясопродуктов. М. Агропромиздат, 1985. 295 р.

326. ЛюблинскаяЛ.А.,ВагановаТ.И.,ПасхинаТ.С.,СтепановВ.М.2,4-Динитрофенил-производные пептидов субстраты нового типа для определения активности протеолитических ферментов. Определение активности карбоксипептпдаз. // Биохимия. 1973. Т. 38. № 4. Р. 790-795.

327. Честухина Г.Г., Загнитько О.П., Ревина Л.П., Клепикова Ф.С., Степанов В.М. Внеклеточные сериновые протеазы подвидов Bacillus thutingiensis эволюционируют существенно медленнее сответствующих 8-эндотоксинов. //Биохимия. 1985. Т. 50. № 10. Р. 1724-1732.

328. Kabsch W. Automatic processing of rotation diffraction data from crystals of initially unknown symmetry and cell constants. // J Appl Crystallogr. 1993. V. 26. № 6. P. 795-800.

329. Long F., Vagin A.A., Young P., Murshudov G.N. BALBES: a molecular-replacement pipeline. // Acta Crystallogr, Sect D: Biol Crystallogr. 2008. V. 64 (Pt 1). P. 125-132.

330. Vagin A., Teplyakov A. MOLREP: an Automated Program for Molecular Replacement. //J Appl Crystallogr. 1997. V. 30. № 6. P. 1022-1025.

331. The CCP4 suite: programs for protein crystallography. // Acta Crystallogr, Sect D: Biol Crystallogr. 1994. V. 50 (Pt 5). P. 760-763.

332. Murshudov G.N., Vagin A.A., Dodson E.J. Refinement of Macromolecular Structures by the Maximum-Likelihood Method. // Acta Crystallogr, Sect D: Biol Crystallogr. 1997. V. 53. №3. P. 240-255.

333. Emsley P., Cowtan K. Coot: model-building tools for molecular graphics. // Acta Crystallogr, Sect D: Biol Crystallogr. 2004. V. 60 (Pt 12, Pt 1). P. 2126-2132.

334. Diederichs K., Karplus P.A. Improved R-factors for diffraction data analysis in macromolecular crystallography. //Nat. Struct. Biol. 1997. V. 4. № 4. P. 269-275.

335. Pivovarova A.V., Khaitlina S.Y., Levitsky D.I. Specific cleavage of the DNase-I binding loop dramatically decreases the thermal stability of actin. // FEBS J. 2010. V. 277. № 18. P. 3812-3822.

336. Itzhaki R.F., Gill D.M. A micro-biuret method for estimating proteins. // Anal Biochem. 1964. V. 9. P. 401-410.

337. Kouyama Т., Mihashi K. Fluorimetry study of N-(l-pyrenyl)iodoacetamide-labelled F-actin. Local structural change of actin protomer both on polymerization and on binding of heavy meromyosin. // Eur J Biochem. 1981. V. 114. № 1. P. 33-38.

338. Kodama Т., Fukui K., Kometani K. The initial phosphate burst in ATP hydrolysis by myosin and subfragment-1 as studied by a modified malachite green method for determination of inorganic phosphate. // J Biochem. 1986. V. 99. № 5. P. 1465-1472.

339. Беляева E.B., Руденская Г.Н., Степанов B.M., Дегтева Г.К. Выделение и свойства внеклеточной протеиназы золотистого стафилококка. // Прикл биохим микробиол. 1984. Т. 20. № 3. Р. 363-368.

340. Гасанов E.B., Романова Д.В., Громова Т.Ю., Демидюк И.В. Эффект делеции З'-некодирующей области гена глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius на продукцию активного белка клетками Bacillus subtilis. // Мол ген микробиол вирусол. 2007. № 2. Р. 31-32.

341. Jana S., Deb J.K. Strategies for efficient production of heterologous proteins in Escherichia coli. //Appl Microbiol Biotechnol. 2005. V. 67. № 3. P. 289-298.

342. Nudler E., Gottesman M.E. Transcription termination and anti-termination in E. coli. // Genes to Cells. 2002. V. 7. № 8. P. 755-768.

343. Thornberry N.A., Molineaux S.M. Interleukin-1 beta converting enzyme: a novel cysteine protease required for IL-1 beta production and implicated in programmed cell death. // Protein Sci. 1995. V. 4. № 1. P. 3-12.

344. Демидюк И.В., Костров С.В. Особенности функциональной организации глутамилэндопептидаз. //Мол биол. 1999. Т. 33. № 1. Р. 100-105.

345. Demidyuk I.V., Romanova D.V., Nosovskaya Е.А., Chestukhina G.G., Kuranova I.P., Kostrov S.V. Modification of substrate-binding site of glutamyl endopeptidase from Bacillus intermedius. // Protein Eng Des Sel. 2004. V. 17. № 5. P. 411-416.

346. Lesk A.M., Fordham W.D. Conservation and variability in the structures of serine proteinases of the chymotrypsin family. // J Mol Biol. 1996. V. 258. № 3. P. 501-537.

347. Power S.D., Adams R.M., Wells J.A. Secretion and autoproteolytic maturation of subtilisin. // Proc Natl Acad Sci USA. 1986. V. 83. № 10. P. 3096-3100.

348. Marie-Claire C., Roques B.P, Beaumont A. Intramolecular processing of prothermolysin. // J Biol Chem. 1998. V. 273. № 10. P. 5697-5701.

349. Sloma A., Rufo G.A., Jr., Rudolph C.F., Sullivan B.J., Theriault K.A., Pero J. Bacillopeptidase F of Bacillus subtilis: purification of the protein and cloning of the gene. // J Bacteriol. 1990. V. 172. № 3. P. 1470-1477.

350. Wu X.C., Nathoo S., Pang A.S., Carne Т., Wong S.L. Cloning, genetic organization, and characterization of a structural gene encoding bacillopeptidase F from Bacillus subtilis. // J Biol Chem. 1990. V. 265. № 12. P. 6845-6850.

351. Hageman J.H. Bacillopeptidase F, in Handbook of Proteolytic Enzymes, 2 edn, A.J. Barrett, Editor. 2004, London, p. 1795-1796.

352. Ikemura H., Inouye M. In vitro processing of pro-subtilisin produced in Escherichia coli. // J Biol Chem. 1988. V. 263. № 26. P. 12959-12963.

353. Suh Y., Benedik M.J. Production of active Serratia marcescens metalloprotease from Escherichia coli by alpha-hemolysin HlyB and HlyD. // J Bacteriol. 1992. V. 174. № 7. P. 2361-2366.

354. Nishiya Y., Imanaka T. Cloning and nucleotide sequences of the Bacillus stearothermophilus neutral protease gene and its transcriptional activator gene. // J Bacteriol. 1990. V. 172. № 9. P. 4861-4869.

355. Kuhn S., Fortnagel P. Molecular cloning and nucleotide sequence of the gene encoding a calcium-dependent exoproteinase from Bacillus megaterium ATCC 14581.// J Gen Microbiol. 1993. V. 139. № 1. P. 39-47.

356. Аваков А.С., Болотин А.П., Сорокин A.B. Структура гена металлопротеиназы Bacillus brevis. Молекулярная биология. // Мол биол. 1990. Т. 24. № 5. Р. 13631372.

357. Takekawa S., Uozumi N., Tsukagoshi N., Udaka S. Proteases involved in generation of beta- and alpha-amylases from a large amylase precursor in Bacillus polymyxa. // J Bacteriol. 1991. V. 173. № 21. P. 6820-6825.

358. Tran L., Wu X.C., Wong S.L. Cloning and expression of a novel protease gene encoding an extracellular neutral protease from Bacillus subtilis. // J Bacteriol. 1991. V. 173. №20. P. 6364-6372.

359. Inouye K., Lee S.B., Tonomura B. Effect of amino acid residues at the cleavable site of substrates on the remarkable activation of thermolysin by salts. // Biochem J. 1996. V. 315 (Pt 1). P. 133-138.

360. Костенко Ю.Г., Спицина Д.Н., Батаева Д.С., Костров С.В., Носовская Е.А. Штамм Serratia proteamaculans 94 продуцент коллагеназы. // Патент Российской Федерации № 2175350. 2001.

361. Kyostio S.R., Cramer C.L., Lacy G.H. Erwinia carotovora subsp. carotovora extracellular protease: characterization and nucleotide sequence of the gene. // J Bacteriol. 1991. V. 173. № 20. P. 6537-6546.

362. Kwon Y.T., Lee H.H., Rho H.M. Cloning, sequencing, and expression of a minor protease-encodinggene from Serratiamarcescens ATCC21074. //Gene. 1993. V. 125. № l.P 75-80.

363. Frigerio F., Margarit I., Nogarotto R., Grandi G., Vriend G., Hardy F., Veltman O.R., Venema G., Eijsink V.G. Model building of a thermolysin-like protease by mutagenesis. //Protein Eng. 1997. V. 10. № 3. P. 223-230.

364. Toma S., Campagnoli S., Margarit I., Gianna R., Grandi G., Bolognesi M., De Filippis V., Fontana A. Grafting of a calcium-binding loop of thermolysin to Bacillus subtilis neutral protease. //Biochemistry. 1991. V. 30. № 1. R 97-106.

365. Vriend G., Eijsink V. Prediction and analysis of structure, stability and unfolding of thermolysin-like proteases. // J Comput Aided Mol Des. 1993. V. 7. № 4. P. 367-396.

366. Dahlquist F.W., Long J.W., Bigbee W.L. Role of Calcium in the thermal stability of thermolysin. //Biochemistry. 1976. V. 15. № 5. P. 1103-1111.

367. Veltman O.R., Vriend G., van den Burg В., Hardy F., Venema G., Eijsink V.G. Engineering thermolysin-like proteases whose stability is largely independent of calcium. // FEBS Lett. 1997. V. 405. № 2. P. 241-244.

368. Veltman O.R., Vriend G., Berendsen H.J., van den Burg В., Venema G., Eijsink V.G. A single calcium binding site is crucial for the calcium-dependent thermal stability of thermolysin-like proteases. //Biochemistry. 1998. V. 37. № 15. P. 5312-5319.

369. Matthews B.W. Structural basis of the action of thermolysin and related zinc peptidases. //Acc Chem Res. 1988. V. 21. P. 333-340.

370. Argos P., Garavito R.M., Eventoff W., Rossmann M.G., Branden C.I. Similarities in active center geometries of zinc-containing enzymes, proteases and dehydrogenases. //J Mol Biol. 1978. V. 126. №2. P. 141-158.

371. Jongeneel C.V., Bouvier J., Bairoch A. A unique signature identifies a family of zinc-dependent metallopeptidases. // FEBS Lett. 1989. V. 242. № 2. P. 211-214.

372. Demidyuk I.V., Shubin A.V., Gasanov E.V., Kostrov S.V. Propeptides as modulators of functional activity of proteases. // BioMolecular Concepts. 2010. V. 1. № 3-4. P. 305-322.

373. Miyoshi S., Wakae H., Tomochika K., Shinoda S. Functional domains of a zinc metalloprotease from Vibrio vulnificus. // J Bacteriol. 1997. V. 179. № 23. P. 7606-7609.

374. Miyoshi S., Kawata K., Tomochika K., Shinoda S., Yamamoto S. The C-terminal domain promotes the hemorrhagic damage caused by Vibrio vulnificus metalloprotease. //Toxicon. 2001. V. 39. № 12. P. 1883-1886.

375. Miyamoto K., Nukui E., Hirose M., Nagai F., Sato T., Inamori Y., Tsujibo H. A metalloprotease (Mprlll) involved in the chitinolytic system of a marine bacterium, Alteromonas sp. strain 0-7. // Appl Environ Microbiol. 2002. V. 68. №11. P. 5563-5570.

376. Bateman A., Coin L., Durbin R., Finn R.D., Hollich V., Griffiths-Jones S., Khanna A., Marshall M., Moxon S., Sonnhammer E.L., et al. The Pfam protein families database. //Nucleic Acids Res. 2004. V. 32. Database issue. P. D138-141.

377. Yeats C., Rawlings N.D., Bateman A. The PepSY domain: a regulator of peptidase activity in the microbial environment? // Trends Biochem Sci. 2004. V. 29. № 4. P. 169-172.

378. Braun P., Ockhuijsen C., Eppens E., Koster M., Bitter W., Tommassen J. Maturation ofPseudomonas aeruginosa elastase. Formation of the disulfide bonds. // J Biol Chem.2001. V. 276. № 28. P. 26030-26035.

379. Hase C.C., Finkelstein R.A. Comparison of the Vibrio cholerae hemagglutinin/ protease and the Pseudomonas aeruginosa elastase. // Infect Immun. 1990. V. 58. № 12. P. 4011-4015.

380. Norqvist A., Norrman B., Wolf-Watz H. Identification and characterization of a zinc metalloprotease associated with invasion by the fish pathogen Vibrio anguillarum. // Infect Immun. 1990. V. 58. № 11. P. 3731-3736.

381. Oda K., Okayama K., Okutomi K., Shimada M., Sato R., Takahashi S. A novel alcohol resistant metalloproteinase, vimelysin, from vibrio sp. T1800: purification and characterization. // Biosci Biotechnol Biochem. 1996. V. 60. № 3. P. 463-467.

382. Kato J.Y., Suzuki A., Yamazaki H., Ohnishi Y., Horinouchi S. Control by A-factor of a metalloendopeptidase gene involved in aerial mycelium formation in Streptomyces griseus. // J Bacteriol. 2002. V. 184. № 21. P. 6016-6025.

383. Miyoshi N., Shimizu C., Miyoshi S., Shinoda S. Purification and characterization of Vibrio vulnificus protease. // Microbiol Immunol. 1987. V. 31. № 1. P. 13-25.

384. Chuang Y.C., Chang T.M., Chang M.C. Cloning and characterization of the gene (empV) encoding extracellular metalloprotease from Vibrio vulnificus. // Gene. 1997. V. 189. №2. P. 163-168.

385. David V.A., Deutch A.H., Sloma A., Pawlyk D., Ally A., Durham D.R. Cloning, sequencing and expression of the gene encoding the extracellular neutral protease, vibriolysin, of Vibrio proteolyticus. // Gene. 1992. V. 112. № 1. P. 107-112.

386. Teo J.W., Zhang L.H., Poh C.L. Cloning and characterization of a metalloprotease from Vibrio harveyi strain AP6. // Gene. 2003. V. 303. P. 147-156.

387. Behmlander R.M., Dworkin M. Biochemical and structural analyses of the extracellular matrix fibrils of Myxococcus xanthus. // J Bacteriol. 1994. V. 176. № 20. P. 6295-6303.

388. Toyoshima T., Matsushita O., Minami J., Nishi N., Okabe A., Itano T. Collagen-binding domain of a Clostridium histolyticum collagenase exhibits a broad substrate spectrum both in vitro and in vivo. // Connect Tissue Res. 2001. V. 42. № 4. P. 281-290.

389. Matsushita O., Koide T., Kobayashi R., Nagata K., Okabe A. Substrate recognition by the collagen-binding domain of Clostridium histolyticum class I collagenase. // J Biol Chem. 2001. V. 276. № 12. P. 8761-8770.

390. Creemers J.W., Siezen R.J., Roebroek A.J., Ayoubi T.A., Huylebroeck D., Van de Ven W.J. Modulation of furin-mediated proprotein processing activity by site-directed mutagenesis. // J Biol Chem. 1993. V. 268. № 29. P. 21826-21834.

391. Gluschankof P., Fuller R.S. A C-terminal domain conserved in precursor processing proteases is required for intramolecular N-terminal maturation of pro-Kex2 protease. // EMBO J. 1994. V. 13. № 10. P. 2280-2288.

392. Zhou A., Martin S., Lipkind G., LaMendola J., Steiner D.F. Regulatory roles of the P domain of the subtilisin-like prohormone convertases. // J Biol Chem. 1998. V. 273. № 18. P. 11107-11114.

393. Zhu X., Muller L., Mains R.E., Lindberg I. Structural elements of PC2 required for interaction with its helper protein 7B2. // J Biol Chem. 1998. V. 273. № 2. P. 1158-1164.

394. Stepanov V.M., Rudenskaya G.N. Proteinase affinity chromatography on bacitracin-Sepharose. // J Appl Biochem. 1983. V. 5. № 6. P. 420-428.

395. Held K.G., LaRock C.N., D'Argenio D.A., Berg C.A., Collins C.M. Ametalloprotease secreted by the insect pathogen Photorhabdus luminescens induces melanization. // Appl Environ Microbiol. 2007. V. 73. № 23. P. 7622-7628.

396. GromovaT.Y.,Demidyukl.V.,KozlovskiyV.I.,KuranovaI.P.,Kostrov S.V. Processing of protealysin precursor. // Biochimie. 2009. V. 91. № 5. P. 639-645.

397. Matthews B.W. Solvent content of protein crystals. // J. Mol. Biol. 1968. V. 33. № 2. P. 491-497.

398. Kantardjieff K.A., Rupp B. Matthews coefficient probabilities: Improved estimates for unit cell contents of proteins, DNA, and protein-nucleic acid complex crystals. // Protein Sci. 2003. V. 12. № 9. P. 1865-1871.

399. Matthews B.W., Jansonius J.N., Colman P.M., Schoenborn B.P., Dupourque D. Three-dimensional structure of thermolysin. // Nature New Biol. 1972. V. 238. P. 37-41.

400. Stark W., Pauptit R.A., Wilson K.S., Jansonius J.N. The structure of neutral protease from Bacillus cereus at 0.2-nm resolution. // Eur J Biochem. 1992. V. 207. № 2. P. 781-791.

401. Thayer M.M., Flaherty K.M., McKay D.B. Three-dimensional structure of the elastase of Pseudomonas aeruginosa at 1.5-A resolution. // J Biol Chem. 1991. V. 266. № 5. P. 2864-2871.

402. Roche R.S., Voordouw G. The structural and functional roles of metal ions in thermolysin. // CRC Crit Rev Biochem. 1978. V. 5. № 1. P. 1-23.

403. Corbett R.J., Roche R.S. The unfolding mechanism of thermolysin. // Biopolymers. 1983. V. 22. № l.p. 101-105.

404. Khaitlina S., Smirnova T.D., Usmanova A.M. Limited proteolysis of actin by a specific bacterial protease. // FEBS Lett. 1988. V. 228. № 1. P. 172-174.

405. Bozhokina E., Khaitlina S., Adam T. Grimelysin, a novel metalloprotease from Serratia grimesii, is similar to ECP32. // Biochem Biophys Res Commun. 2008. V. 367. № 4. P. 888-892.

406. Цаплина O.A., Ефремова Т.Н., Кевер JI.B., Комиссарчик Я.Ю., Демидюк И.В., Костров С.В., Хайтлина С.Ю. Выявление актиназной активности протеализина. // Биохимия. 2009. Т. 74. № 6. Р. 797-804.

407. McKay D.B., Thayer М.М., Flaherty K.M., Pley H., Benvegnu D. Crystallographic structures of the elastase of Pseudomonas aeruginosa. // Matrix Suppl. 1992. V. 1. P. 112-115.

408. Hausrath A.C., Matthews B.W. Thermolysin in the absence of substrate has an open conformation. // Acta Crystallogr, Sect D: Biol Crystallogr. 2002. V. 58 (Pt 6, Pt 2). P. 1002-1007.

409. Hangauer D.G., Monzingo A.F., Matthews B.W. An interactive computer graphics study of thermolysin-catalyzed peptide cleavage and inhibition by N-carboxymethyl dipeptides. // Biochemistry. 1984. V. 23. № 24. P. 5730-5741.

410. Feder J. Studies on the specificity of Bacillus subtilis neutral protease with synthetic substrates. // Biochemistry. 1967. V. 6. № 7. P. 2088-2093.

411. Feder J., Schuck J.M. Studies on the Bacillus subtilis neutral-protease- and Bacillus thermoproteolyticus thermolysin-catalyzed hydrolysis of dipeptide substrates. // Biochemistry. 1970. V. 9. № 14. P. 2784-2791.

412. Tsaplina O., Efremova Т., Demidyuk I., Khaitlina S. Filamentous actin is a substrate for protealysin, a metalloprotease of invasive Serratia proteamaculans. // FEBS J. 2012. V. 279. №2. P. 264-274.

413. Cabral C.M., Cherqui A., Pereira A., SimoesN. Purification and characterization of two distinct metalloproteases secreted by the entomopathogenic bacterium Photorhabdus sp. strain Az29. //Appl Environ Microbiol. 2004. V. 70. № 7. P. 3831-3838.

414. Izore T., Job V., Dessen A. Biogenesis, regulation, and targeting of the type III secretion system. // Structure. 2011. V. 19. № 5. P. 603-612.

415. Cascales E., Cambillau C. Structural biology of type VI secretion systems. // Philos Trans R Soc Lond B Biol Sei. 2012. V. 367. № 1592. P. 1102-1111.

416. Schultz D.R., Miller K.D. Elastase of Pseudomonas aeruginosa: inactivation of complement components and complement-derived chemotactic and phagocytic factors. // Infect Immun. 1974. V. 10. № 1. P. 128-135.

417. Mariencheck W.I., Alcorn J.F., Palmer S.M., Wright J.R. Pseudomonas aeruginosa elastase degrades surfactant proteins A and D. // Am J Respir Cell Mol Biol. 2003. V. 28. № 4. P. 528-537.

418. Kuang Z., Hao Y., Walling B.E., Jeffries J.L., Ohman D.E., Lau G.W. Pseudomonas aeruginosa Elastase Provides an Escape from Phagocytosis by Degrading the Pulmonary Surfactant Protein-A. // PLoS One. 2011. V. 6. № 11. P. e27091.

419. Schmidtchen A., Frick I.M., Andersson E., Tapper H., Bjorck L. Proteinases of common pathogenic bacteria degrade and inactivate the antibacterial peptide LL-37. // Mol Microbiol. 2002. V. 46. № 1. P. 157-168.

420. Diebel L.N., Liberati D.M., Amin P.B., Diglio C. A. Cleavage of SIgAby gram negative respiratory pathogens enhance neutrophil inflammatory potential. // J Trauma. 2009. V. 66. №5. P. 1336-1342.

421. Holder I.A., Wheeler R. Experimental studies of the pathogenesis of infections owing to Pseudomonas aeruginosa: elastase, an IgG protease. // Can J Microbiol. 1984. V. 30. №9. P. 1118-1124.

422. Mintz C.S., Miller R.D., Gutgsell N.S., Malek T. Legionella pneumophila protease inactivates interleukin-2 and cleaves CD4 on human T cells. // Infect Immun. 1993. V. 61. №8. P. 3416-3421.

423. Grimont F., Grimont P. The Genus Serratia, in The Prokaryotes, M. Dworkin, Editor. 2006, New York. p. 219-244.

424. Jackson T.A., Boucias D.G., Thaler J.O. Pathobiology of amber disease, caused by Serratia spp., in the New Zealand grass grub, Costelytra zealandica. // J Invertebr Pathol. 2001. V. 78. № 4. P. 232-243.

425. Bollet C., Grimont P., Gainnier M., Geissler A., Sainty J.M., De Micco P. Fatal pneumonia due to Serratia proteamaculans subsp. quinovora. // J Clin Microbiol. 1993. V. 31. №2. P. 444-445.

426. Усманова A.M., Хайтлина С.Ю. Протеаза из штамма бактерий Е2, специфически расщепляющая актин. // Биохимия. 1989. Т. 54. № 8. Р. 1308-1314.

427. Ефремова Т.Н., Эндер H.A., Комиссарчик Я.Ю., Хайтлина С.Ю. Реорганизация актиновых микрофиламентов в клетках Нер-2 в результате инвазии бактерий Escherichia coli А2. // Цитология. 1998. Т. 40. № 6. Р. 524-528.

428. Efremova Т., Ender N., Brudnaja М., Komissarchik Y., Khaitlina S. Specific invasion of transformed cells by Escherichia coli A2 strain. // Cell Biol Int. 2001. V. 25. № 6. P. 557-561.

429. Khaitlina S., Collins J.H., Kuznetsova I.M., Pershina V.P., Synakevich I.G., Turoverov K.K., Usmanova A.M. Physico-chemical properties of actin cleaved with bacterial protease from E. coli A2 strain. // FEBS Lett. 1991. V. 279. № 1. P. 49-51.

430. Khaitlina S.Y., Strzelecka-Golaszewska H. Role of the DNase-I-binding loop in dynamic properties of actin filament. // Biophys J. 2002. V. 82. № 1 (Pt 1). P. 321-334.

431. Carlier M.F., Pantaloni D., Korn E.D. Evidence for an ATP cap at the ends of actin filaments and its regulation of the F-actin steady state. // J Biol Chem. 1984. V. 259. № 16. P. 9983-9986.

432. Dai S., Sarmiere P.D., Wiggan O., Bamburg J.R., Zhou D. Efficient Salmonella entry requires activity cycles of host ADF and cofilin. // Cell Microbiol. 2004. V. 6. № 5. P. 459-471.

433. Cossart P., Sansonetti P.J. Bacterial invasion: the paradigms of enteroinvasive pathogens. // Science. 2004. V. 304. № 5668. P. 242-248.1