Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизм активации глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Механизм активации глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius"

На правах рукописи

ГАСАНОВ Евгений Валерьевич

МЕХАНИЗМ АКТИВАЦИИ ГЛУТАМИЛЭНДОПЕПТИДАЗЫ BACILLUS INTERMEDIUS

G03463476

(03.00.23 - биотехнология)

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2009

003463476

Работа выполнена в лаборатории белковой инженерии Института молекулярной генетики Российской академии наук.

Научный руководитель:

кандидат химических наук Демидюк Илья Валерьевич

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Румш Лев Давидович

кандидат биологических наук Кульбачинский Андрей

Владимирович

Ведущая организация:

Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ГосНИИ Генетики)

Защита состоится $ » $ р ~С1 2009 года в 15 часов на заседании Диссертационного совета Д 212.120.01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова по адресу 119571, Москва, проспект Вернадского, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ. С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте www.mitht.ru

Автореферат разослан 2009 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат химических наук —д! //, Лютик А.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. В современных науках о жизни значительное место занимают проблемы изучения белковых молекул, связи структуры и функции белков. Одним из основных направлений является исследование механизмов ферментативного катализа, представляющее значительный интерес как с фундаментальной точки зрения, так и для развития биотехнологии. Важнейшим этапом функционирования ферментов является специфическое распознавание и связывание молекул субстрата. Понимание механизмов, лежащих в основе субстратной специфичности белков, позволяет управлять активностью природных ферментов, в частности, в медицинских целях. Кроме того, знание закономерностей распознавания субстрата позволяет конструировать белки с модифицированной, заданной субстратной специфичностью.

Удобной моделью для исследования механизмов, определяющих субстратную специфичность, являются протеолитические ферменты. Внутри этого класса белков можно выделить ряды родственных протеаз, члены которых при значительном сходстве структуры по-разному взаимодействуют с различными аминонокислотными остатками субстрата. Таким образом, становится возможным проанализировать изменения в структуре ферментов, приводящие к различиям в субстратной специфичности.

Среди протеаз особый интерес вызывают ферменты с узкой субстратной специфичностью, распознающие, например, только положительно или только отрицательно заряженные остатки. Подобные ферменты нашли широкое применение в современных биомедицинских технологиях, благодаря их способности осуществлять ограниченный гидролиз белков и пептидов. Это делает протеазы с узкой специфичностью незаменимой составляющей основанных на масс-спектрометрии протеомных исследований. Такие ферменты применяют для определения первичной структуры и доменной организации, а также идентификации белков. Они могут быть использованы также для сиквенс-специфического гидролиза слитых белков и получения биологически активных пептидов.

Моделью в наших исследованиях служит глутамилэндопептидаза Bacillus intermedius (BIGEP) - сериновая протеаза, с высокой специфичностью гидролизующая пептидные связи, образованные а-карбоксильными группами глутаминовой и аспарагиновой кислот. Подобная специфичность выделяет глутамилэндопептидазы (ГЭПазы) в ряду химотрипсинподобных протеаз. Несмотря на то, что BIGEP относится к хорошо изученному структурному семейству химотрипсина, а для самого фермента установлена пространственная структура и проведен направленный мутагенез субстратсвязывающего сайта, механизм, определяющий субстратную специфичность

3

BIGEP, как и других глутамилэндопептидаз неизвестен. Изучение закономерностей, обеспечивающих распознавание отрицательно заряженных остатков субстрата ГЭПазами на примере BIGEP, и последующее сравнение с таковыми других ферментов семейства, позволит проанализировать эволюционные изменения, обеспечивающие разнообразие субстратных предпочтений химотрипсинподобных протеаз.

Работа поддержана грантами РФФИ № 06-04-48678-а «Пропептиды как модуляторы функциональной активности белков» и № 03-04-48755-а «Про-зависимый фолдинг и конформационное разнообразие белков».

Цели и задачи исследования. Основной целью данного исследования являлось изучение структурно-функциональных особенностей BIGEP, обеспечивающих предпочтение фермента к связям, образованным остатками глутаминовой кислоты. Для этого в работе решались следующие задачи:

1) изучение механизма созревания предшественника BIGEP;

2) получение зрелой BIGEP без N-концевых аминокислотных остатков и анализ ее специфичности.

Научная новизна исследования. В представленной работе впервые продемонстрировано, что модификация сайта процессинга B1GEP влияет на продукцию активного белка клетками В. subtilis. Полученные данные выявляют ключевую роль последнего аминокислотного остатка пропептида, удаляемого при созревании BIGEP, и демонстрируют зависимость продукции активного фермента от эффективности процессинга его предшественника. В работе впервые исследован механизм созревания рекомбинантной BIGEP in vitro, и показана необходимость пропептида BIGEP для формирования активного фермента. Получен вариант зрелой BIGEP с делецией трех N-концевых аминокислотных остатков, что позволило впервые продемонстрировать важность N-концевого района для функционирования фермента. Данные, полученные при изучении созревания фермента и в экспериментах со зрелой BIGEP без трех N-концевых остатков, позволяют делать выводы о механизмах, определяющих узкую субстратную специфичность глутамилэндопептидаз.

Практическая значимость исследования. Полученные в работе данные о влиянии модификации сайта процессинга на продукцию активной BIGEP могут быть использованы при создании эффективных продуцентов протеаз с узкой субстратной специфичностью. Создание эффективных продуцентов имеет большое практическое значение в виду широкого использования протеаз с узкой субстратной специфичностью в современных биомедицинских технологиях. В частности, в работе предложен новый подход к получению BIGEP в гетерологической экспрессионной системе, заключающийся

4

в создании автоактивирующегося варианта целевого фермента путем модификации сайта его процессинга. Подобный подход позволил получить препарат зрелой активной BIGEP, не имеющий примесных активностей, без использования дополнительных стадий очистки.

Публикации и апробация работы. По результатам диссертационной работы опубликовано три статьи в рецензируемых научных журналах. Результаты исследования были доложены на Научно-практической конференции «Современное состояние Российской биотехнологии» (Пущино, 2003), Всероссийском симпозиуме «Биотехнология микробов» (Москва, 2004), XIII Международной конференции "Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение" (Казань, 2005), II Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Санкт-Петербург, 2005), 10-й и 11-й международных пущинских школах-конференциях молодых ученых (Пущино, 2006 и 2007), VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 2007) и семинаре лаборатории белковой инженерии Института молекулярной генетики РАН.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, списка сокращений, обзора литературы, посвященного механизмам, определяющим специфичность протеаз, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (125 ссылок). Диссертация изложена на 82 страницах и содержит 28 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Глутамилэндопептидаза Bacillus intermedius: связь между распознаванием субстрата и активацией предшественника

Глутамилэндопептидазы (ГЭПазы) специфически распознают аминокислотные остатки, несущие в условиях функционирования ферментов отрицательно заряженную группу боковой цепи. На основании многолетнего изучения ГЭПаз, включающего рентгено-структурные исследования и мутационный анализ ферментов группы, было предложено как минимум четыре различные гипотезы, объясняющие предпочтение к отрицательно заряженным субстратам. В то же время по имеющимся в настоящий момент представлениям общего для всех ГЭПаз механизма распознавания субстрата не существует.

Для группы родственных ГЭПаз бацилл и кокков, имеющих высокую гомологию и, вероятно, аналогичную структуру субстратсвязывающего района, была выдвинута гипотеза, объясняющая строгое субстратное предпочтение. На основании рентгено-структурного анализа молекул ГЭПаз Bacillus intermedius (BIGEP) и Staphylococcus aureus

5

(протеаза V8) было выдвинута гипотеза, что основной во взаимодействии с карбоксильной группой боковой цепи остатка субстрата в Р1 положении является свободная аминогруппа N-концевого остатка (Vail) (Prasad et al, 2004; Meijers et al, 2004). Данный остаток (Val 1) приближен к активному центру фермента, а его а-аминогруппа экспонирована в область субстрат-связывающего кармана (рис. 1). Работа, направленая на анализ роли N-концевой аминогруппы во взаимодействии с субстратом, ведется нами на модели ГЭПазы Bacillus intermedins (BIGEP), выделенной и охарактеризованной ранее.

Рис. 1. Пространственная структура BIGEP. Эллипсом выделен активный центр фермента, остатки каталитической триады обозначены. Окружностью выделен Sl-субсайт субстратсвязывающего участка, обозначены консервативные остатки и Vail.

Протеаза V8 и фермент В. intermedius, как и другие бактериальные ГЭПазы, являются секреторными белками и синтезируются в виде предшественников. Помимо последовательности зрелой ГЭПазы, предшественник включает в себя N-концевой сигнальный пептид, необходимый для секреции, и пропептид (пропоследовательность), удаляемый при созревании. Таким образом, N-концевая аминогруппа зрелого фермента формируется в результате процессинга - гидролиза связи между пропептидом и зрелой частью белка. Из этого следует, что если гипотеза об участии свободной аминогруппы в распознавании субстрата верна, то специфичность вышеназванных ГЭПаз также формируется лишь после удаления пропептида (Meijers et al, 2004). Предшественники BIGEP и родственных белков, в таком случае, либо имеют субстратную специфичность, отличную от зрелой ГЭПазы, либо не обладают протеолитической активностью. С другой стороны, если высказанная гипотеза не верна и механизм, определяющий предпочтение ГЭПаз к отрицательно заряженным остаткам, не основывается на участии Vail (нумерация от начала зрелого фермента) во взаимодействии с субстратом, то

Asp 102

His 47

Ser 171

предшественники ГЭПаз должны либо демонстрировать глутамилэндопептидазную активность, либо, как и в предыдущем случае, быть неактивными.

Функции пропоследовательностей ГЭПаз до настоящего времени оставались не ясными, однако для большинства протеолитических ферментов других групп показано, что пропептид участвует в формировании пространственной структуры белка (Demidiuk et al, 2003). Удаление пропептида у бактериальных секреторных протеиназ в большинстве изученных случаев происходит автокаталитически, то есть благодаря протеолитической активности предшественника (Serkina et al, 2001). Характерными примерами такого механизма процессинга могут служить субтилизин (Power et al, 1986) и термолизин (Marie-Claire et al, 1998). Природа расщепляемой связи в обоих случаях соответствует свойствам зрелых протеиназ, что не удивительно, так как эти ферменты, в отличие от BIGEP, имеют широкую субстратную специфичность.

В_д. lit

В_сег B_lic B_sub Cl_tet S_epi S_sap Swar S_aur Ent_fae Str_fra Str_gri

Рис. 2. Сравнение аминокислотных последовательностей глутамилэндопептидаз из различных микроорганизмов вблизи сайта процессинга. Нумерация по последовательности BIGEP от начала зрелого

фермента. B_int, В_сег, BJic, B sub, Ci tct, Sepi, S sap, S war, Saur, Ent Гае, Str_fra, Str_gri -последовательности глутамилэндопептидаз из Bacillus intermedius (идентификатор базы данных "GenPept" САС17594), В. cereus (NP830579), В. licheniformis (YP 077583), В. subtilis (NP 388106), Clostridium tetani (NP_781289), Staphylococcus epidermidis (BAC24763), S. saprophytics (YPJ00372), S. warneri (CAC06168), S. aureus (AAG45843), Enterococcus faecalis (AA081585), Streptomyces fradiae (Q03424) и Str. griseus (AAA19747), соответственно. Выделены аминокислотные остатки, идентичные (белым на черном) и сходные (черным на сером) более чем в 50% представленных последовательностей.

В то же время анализ последовательностей известных ГЭПаз показывает, что только у двух из них, ферментов Streptomyces griseus и Str. fradiae, в (-1) позиции расположен остаток глутаминовой кислоты (рис. 2). Таким образом, предшественник ГЭПазы Str. griseus, вероятно, может процессироваться автокаталитически. Существующие экспериментальные данные позволяют думать, что это действительно так (Stennicke et al, 1996). Это значит, что специфичность, характерная для зрелой ГЭПазы Str. griseus, возникает, видимо, до активации предшественника. Однако, ранее было показано, что N-концевая а-аминогруппа зрелого фермента Str. griseus не имеет отношения к

-10

-1

PLSKYLKD FQTK-QVll

NFNYgSNI-LIH—SVl!

EKKSgAKAPYIK-SVIgsï

E-KNIQTL-QPS—Slir

ppqkQ-degpkk-SVl|__

IKPSQNKS - YPS-KlLPNNN

AKVGTNQI-KTR—HVbPl

VKPVEKKE - RAN-SlLPl

NL-KjjLEE -HAN-SlLPl

PAESHSRQ-KRS—LLDP

VTRVg-GVFQRE-BAC

IKRVg-GVFHKE-JbC

механизму, определяющему субстратную специфичность (Nienaber et al, 1993). Следовательно, автоактивация ГЭПазы Str. griseus не противоречит гипотезе об участии свободной аминогруппы BIGEP в распознавании заряда субстрата.

Иная ситуация наблюдается в районе сайта процессинга бациллярных и кокковых ГЭПаз. Очевидно, что, если предшественник BIGEP имеет специфичность, характерную для зрелого фермента, для осуществления автокаталитического процессинга С-концевым остатком пропоследовательности должна быть глутаминовая кислота. Однако в положении (-1) BIGEP расположен остаток лизина, несущий положительный заряд. Этот факт подразумевает две возможности: первая - предшественник BIGEP имеет прямо противоположную зрелому белку специфичность, вторая - процессинг BIGEP происходит гетерокаталитически, то есть при участии другой протеиназы.

Обращает на себя внимание, что зрелые части ГЭПаз в общем, и их N-концевой участок в особенности, демонстрируют достаточно высокий уровень гомологии. Напротив, пропептиды в целом, и их С-концевой участок в частности, имеют весьма низкое сходство. Так в случаях близких BIGEP ферментов бацилл и кокков в (-1) положении предшественников наблюдаются различные аминокислотные остатки: серии, аспарагин, гистидин, лизин и аргинин (рис. 2). Это разнообразие наводит на мысль о непринципиальности свойств остатка в (-1) положении для процессинга ГЭПаз. Это может быть объяснено как чрезвычайно широкой специфичностью предшественника в случае автокаталитического созревания, так и гетероактивацией, возможно осуществляемой у разных микроорганизмов различными протеиназами. Указание на участие в активации ГЭПаз другого фермента были ранее получены in vivo на модели протеазы V8 (Drapeau, 1978).

Итак, для анализа участия N-концевого остатка в механизме, определяющем специфичность бациллярных и кокковых глутамилэндопептидаз, необходимо изучение механизма созревания предшественника фермента и исследование роли N-концевого остатка в функционировании зрелой BIGEP. Ключевым для процессинга ГЭПаз при этом представляется (-1) положение в молекуле профермента.

2. Изучение созревания глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius

2.1. Влияние природы (-1) остатка на созревание глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius

Для анализа влияния природы аминокислотного остатка в положении (-1) BIGEP на продукцию активного белка клетками В. subtilis была проведена модификация гена

8

фермента с применением мегапраймерной схемы сайт-направленного мутагенеза (Sarkar and Sommer, 1990). Нами сконструирован набор плазмидных векторов, включающих ген B1GEP и различающихся лишь кодонами, соответствующими остатку в (-1) положении предшественника. Всего получено четыре мутантных варианта гена BIGEP, кодирующих ферменты с аминокислотными заменами Lys(-l)->Ala/Ser/Asn/Glu (векторы pA-1/pS-l/pN-1/рЕ-1, соответственно). Кроме того, сконструирован аналогичный вектор (рК-1) с геном, соответствующим BIGEP, не несущей мутаций и сохраняющей Lys(-l). Выбор Ser, Asn и Glu в качестве замен для лизина был сделан на основе анализа первичных структур глутамилэндопептидаз (рис. 2). Эти остатки наиболее часто встречаются в (-1) положении ферментов группы. Кроме того, была введена замена лизина на аланин. А Б

Контроль рА.1 pN-1 pS-1 рЕ-1 рК-1

Рис. 3. Продукция активной протеиназы клетками Bacillus subtilis BG2036, несущими интактный и мутантные гены глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius в составе соответствующих плазмид. Контроль - клетки Bacillus subtilis BG2036 (рСВ22), не имеющие гена BIGEP. А. 5 мкл ночной культуры нанесено на

индикаторную среду «молочный агар» и выдержано 12 часов при 37°С, а затем 24 часа при 22°С. Б. Специфическая активность в культуральной среде (после 24 часов роста клеток) по гидролизу Z-Glu-pNA.

D6oo - оптическая плотность культуры при длине волны 600 нм.

Для анализа эффекта полученных мутаций векторы, кодирующие различные варианты гена B1GEP, были введены в клетки лабораторного штамма В. subtilis BG2036. Уровень продукции активной протеиназы клетками оценивали по размеру зон гидролиза казеина при культивировании на индикаторной среде «молочный агар» и по специфической активности в культуральной жидкости (рис. 3). В качестве отрицательного контроля использовали штамм В. subtilis BG2036 (рСВ22), не имеющий гена BIGEP. Все клетки, несущие векторы с геном BIGEP, оказались способны к гидролизу казеина (рис.ЗА). Максимальным размером зон отличались колонии клеток, трансформированных

вектором рК-1 с [«модифицированным геном BIGEP. Колонии клеток, несущих pS-1 и рЕ-1, характеризовались заметно меньшими гало гидролиза. Наименьшая продукция активной протеиназы наблюдалась в случае рА-1 и pN-1. Уровень продукции активной BIGEP клетками был оценен количественно по гидролизу специфического субстрата Z-Glu-pNA. Удельная активность в культуральной жидкости существенно различалась в зависимости от природы остатка в (-1) положении B1GEP (рис. ЗВ). Полученные значения хорошо коррелировали с результатами теста на «молочном агаре».

Таким образом, можно констатировать, что ни одна из введенных в положение (-1) мутаций не приводит к полному прекращению продукции активного фермента клетками. В то же время наши результаты показывают, что природа аминокислотного остатка в данном положении сайта процессинга глутамилэндопептидазы существенно влияет на уровень продукции клетками активного фермента.

При модификации аминокислотных остатков в (-1) позиции BIGEP существует возможность осуществления процессинга в другом месте полипептидной цепи, что может вызывать наблюдаемый эффект. Однако гораздо более вероятно, что изменение уровня продукции активной BIGEP при модификациях в (-1) положении связано с профилем субстратного предпочтения процессирующего фермента, или, скорее всего, ферментов. Представляется сомнительным, что при всех вариантах остатков в (-1) позиции процессинг BIGEP осуществляется одной и той же протеиназой. Такой фермент должен был бы обладать и трипсиноподобной, и эластазной, и глутамилэндопептидазной активностями. Гораздо более вероятно, что процессинг BIGEP в клетках В. subtilis осуществлялся различными ферментами в зависимости от природы остатка в (-1) положении.

Экспрессия всех вариантов гена ГЭП осуществлена нами в штамме В. subtilis BG2036, производном от В. subtilis 168. Недавно было показано, что в штаммах, полученных на основе В. subtilis 168, процессинг рекомбинантной глутамилэндопептидазы В. subtilis осуществляется субтилизинподобной секреторной протеиназой - бациллопептидазой F (6nF) (Park et al, 2004). Можно предположить, что в нашем случае процессинг ГЭП осуществляется тем же ферментом. Опубликованные данные о субстратной специфичности 6nF показывают, что эта протеиназа гидролизует связи карбоксильных групп серина, аргинина (Sloma et al, 1990) и лизина (Wu et al, 1990). При этом, 6nF, по-видимому, не способна расщеплять пептидные связи с аланином, аспарагином и глутаминовой кислотой в Р1 положении (Hageman, 2004). Наиболее вероятным представляется, что в активации BIGEP с этими остатками в сайте процессинга принимают участие другие протеиназы.

При наличии в (-1) положении остатка глутаминовой кислоты ГЭПаза В. subtilis способна процессироваться in vivo без участия бациллопептидазы F и других секреторных протеиназ (Park et al, 2004). Вариант BIGEP Е-1, вполне возможно, также активируется автокаталитически. Что касается вариантов BIGEP с аланином и аспарагином в (-1) положении, сложно предположить, какими ферментами осуществляется процессинг.

В то же время, обращает на себя внимание тот факт, что максимальный уровень протеолитической активности в культуралыюй среде демонстрируют клетки с геном BIGEP, кодирующим характерный для В. intermedins и В. licheniformis вариант фермента с лизином (-1) (рис. 3). Таким образом, наличие этого остатка является предпочтительным с точки зрения достижения более высокого уровня продукции активного белка клетками В. subtilis. Это удивительно, поскольку в (-1) положение BIGEP нами был введен и остаток серина, находящийся в сайте процессинга собственной глутамилэндопептидазы В. subtilis (рис. 2). Уровень продукции активного фермента клетками, несущими гены BIGEP, кодирующие серии и глутаминовую кислоту в сайте процессинга, близки (рис. 3), что соответствует данным, полученным для ГЭПазы В. subtilis ранее (Park et al, 2004).

Итак, природа остатка в (-1) положении влияет на уровень продукции активной ГЭПазы. В (-1) положении фермента В. subtilis расположен серии, не обеспечивающий максимального уровня активности ГЭПазы во внеклеточной среде. Из этого логично сделать предположение, что модификация остатка в (-1) положении глутамилэндопептидаз служит механизмом эволюционной адаптации уровня продукции фермента. В таком случае, объяснимо разнообразие свойств остатков в этом положении сайта процессинга очень близких в остальном белков (рис. 2).

Следует отметить, что полученные данные о влиянии модификации (-1) положения сайта процессинга на продукцию активной BIGEP должны быть учтены при конструировании эффективных продуцентов протеаз с узкой субстратной специфичностью.

Итак, свойства остатка в (-1) положении BIGEP существенно влияют на созревание фермента, однако, ни одна из замен не приводит к полному прекращению продукции. Это, очевидно, связано с наличием нескольких процессирующих протеиназ (одна из них, возможно, сама BIGEP) и профилем их субстратного предпочтения. Однако для того, чтобы судить о специфичности предшественника BIGEP, необходимо детальное исследование созревания белка. Для решения этой задачи нами была осуществлена экспрессия гена BIGEP в клетках Escherichia coli.

2.2. Созревание глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius in vitro

Для изучения процесса созревания предшественника BIGEP, нами была осуществлена экспрессия генов, кодирующих два варианта предшественника. Так как эффект сигнальной последовательности на созревание известен не был, а точка отщепления лидерного пептида экспериментально не определена, были получены полноразмерный предшественник BIGEP (SPM) и вариант, лишенный сигнального пептида (РМ). Соответствующие фрагменты гена BIGEP были получены методом ПЦР и клонированы в плазмиду рЕТ23Ь(+). Полученные векторы (рРМ и pSPM) были введены в клетки штамма £ coli BL21 (DE3).

Рис. 4. Микрофотографии клеток £. coli BL21(DE3), несущих плазмиды pPET23b(+), pSPM, рРМ и рМ. Стрелка указывает на положение тел включения.

рЕТ23Ь(+)

pSPM

При экспрессии рекомбинантных генов оба белка (SPM, РМ) накапливались в нерастворимой форме. В то же время методом электронной микроскопии было показано, что тела включения имеют различную клеточную локализацию (рис. 4). Полноразмерный предшественник BIGEP (SPM) обнаруживался в периплазматическом пространстве, тогда как не имеющий сигнального пептида предшественник (РМ) был локализован в цитоплазме. Данный факт демонстрирует, что в клетках Е. coli наличие собственного сигнального пептида приводит к секреции BIGEP.

Рекомбинантные белки (SPM, РМ) были очищены в присутствии 8 М мочевины с использованием катионо-обменной и гель-проникающей хроматографии до электрофорегачески гомогенного состояния (рис. 5).

ЯРУ М РМ РРМ

Рис. 5. Электрофоретический анализ препаратов В1ЕР, полученных в ходе очистки. ЯРМ - полноразмерный предшественник; РМ - предшественник без сигнального пептида; М - индивидуальная зрелая часть В1ЕР; РЕМ - предшественник с мутацией Ьу$(-1 Кл. лизаг - тотальный клеточный лизат; Тела вкл-я - тела

включения, растворенные в буфере, содержащем 8 М мочевины; После ИОХ - целевая фракция после ионообменной хроматографии; После ГПХ - целевая фракция после гель-проникающей хроматографии. Мм маркеры - маркеры молекулярной массы.

Для подтверждения первичной структуры вРМ и РМ были обработаны трипсином и подвергнуты исследованию методом МАЬОГ-масс-спектрометрии. Анализ масс-спектров показал, что набор фрагментов в случае РМ (67% теоретически возможных) полностью соответствует последовательности, кодируемой модифицированным геном. Были обнаружены Ы- и С-концевые пептиды, их массы составляли 4129,972 Да (расщепление после (К(-26)) и 1642,845 Да (после К200). В случае БРМ (52% теоретически возможных пептидов) С-концевой фрагмент был таким же (1642,785 Да), а фрагмент, соответствующий кодируемому геном М-концевому участку белка, обнаружен не был. В то же время был детектирован пептид с молекулярной массой 1920,838 Да, что соответствует последовательности Т(-62)508У1ЛЖУ0МУТ800К(-45) в структуре предшественника ВЮЕР. 1Ч-концевое секвенирование подтвердило, что первые пять аминокислотных остатков БРМ - ТвОЗУ. Этот результат свидетельствует об удалении 26 стартовых аминокислотных остатков вРМ, соответствующих теоретически предсказанному сигнальному пептиду. Таким образом, секреция полноразмерного предшественника ВЮЕР в периплазматическое пространство сопровождается отщеплением сигнальной последовательности, а сайт гидролиза совпадает с предсказанным теоретически. Следовательно, 8РМ отличался от РМ по первичной структуре лишь отсутствием стартового метионина (рис. 6).

Кодируемые генами Экспрессированные Процессированные

белки формы BIGEP формы BIGEP

SPM шттвтшг^ттт^ тттттшшггг

Auto IntF

IKV..KWIG.

РМ [HfS..EKV..aWXGTT: ШТЖО^УУЖТ: Subtilisin

Auto T|Wsine

РЕМ ÍMfS. .EKV. .E'WIG.. ■ MS7.EKVT .EWÍG.'r. 1->"WIG... П

Ш Pre O Pro ZZ Mature

Рис. 6. Схема получения активной BIGEP. SPM - полноразмерный предшественник; РМ - предшественник без сигнального пептида; РЕМ - предшественник с мутацией Lys(-l)-^Glu.

Ренатурацию очищенных SPM и РМ проводили в присутствии 25% глицерина и 0,15 М NaCl, снижая концентрацию мочевины в растворе до 0,53 М однократным разбавлением. (Схема созревания представлена на рис. 6.) После 12 часов инкубации при 4°С от 50 до 70 % SPM и РМ переходило в промежуточную форму (IntF) (рис. 7А, данные приведены для SPM). Молекулярная масса IntF, по результатам электрофореза, составляла около 26 кДа, что больше массы зрелого белка (22,8 кДа) и меньше массы предшественника (29,5 кДа). Данная форма была выделена из ПААГ и подвергнута трипсинолизу. При анализе продуктов гидролиза методом MALDI-масс-спектрометрии не было обнаружено фрагментов, соответствующих участку от Тге(-62) до Lys(-9) в структуре предшественника BIGEP. Наиболее близкий к N-концу фрагмент пропептида, обнаруженный в спектре IntF, имел массу 1041,562 Да, что соответствует последовательности Y(-8)LKDFQTK(-1). По результатам N-концевого секвенирования первые пять остатков IntF - KVKPL (это соответствует участку (-15) - (-11) в последовательности предшественника). Таким образом, промежуточная форма образуется при гидролизе связи Glu(-16)-Lys в пропептиде BIGEP и имеет расчетную молекулярную массу 24,7 кДа. IntF была стабильна в растворе при 4°С, по крайней мере, в течение 90 суток. Добавление ингибитора сериновых протеиназ фенилметилсульфонилфторида (PMSF) и 1,10-фенантролина, ингибитора металлопротеиназ, не влияло на образование промежуточной формы. Детектировать протеолитическую или специфическую активность IntF не удавалось. При добавлении трипсина или субтилизина В. intermedius (но не термолизина или активной BIGEP, полученной из клеток В. subtilis (BIGEP-Bs)) IntF переходила в активную форму, обладающую, по данным электрофореза, молекулярной массой, совпадающей с массой зрелой ВШЕР (около 23 кДа).

■29 кДа 24 кДа

20 кДа

Рис. 7. Электрофоретический анализ препаратов SPM (А) и РЕМ (Б), полученных в ходе ренатурации. SPM

- полноразмерный предшественник BIGEP; IntF - промежуточная форма; BIGEPt - зрелая BIGEP после активации IntF трипсином; BIGEPS - зрелая BIGEP после активации IntF субтилизином; M - индивидуальная зрелая часть BIGEP; РЕМ - предшественник с мутацией Lys(-I )->Glu; BIGEP - зрелая активная BIGEP, полученная при автокаталитическом созревании РЕМ; BIGEP-Bs - зрелая BIGEP, выделенная из клеток В. subliUs AJ73. Мм маркеры - маркеры молекулярной массы.

Соответствие первичных структур активных форм, полученных из SPM и РМ, структуре зрелой BIGEP дикого типа было подтверждено масс-спектрометрическим анализом трипсиновых гидролизатов белков. N-концевое секвенирование форм, полученных при активации IntF трипсином и субтилизином, также показало их идентичность природному ферменту: установленные нами пять N-концевых аминокислот были WIGD.

Определенная по гидролизу Z-Glu-pNA специфическая активность всех вариантов зрелой BIGEP, полученных из экспрессированных в Е. coli предшественников (SPM и РМ), составляла 1,6 ± 0,1 Ед./мг, что соответствует значениям, опубликованным для нативной BIGEP ранее (Leshchinskaya et al, 1997). Протеолитическая активность полученных из SPM и РМ ферментов, определенная по гидролизу азоказеина, также была близка к таковой для природной BIGEP и составляла 31 ± 3 Ед./мг (Demidyuk et al, 2004).

Итак, нами показано, что для активации in vitro BIGEP нуждается в участии других протеиназ (например, трипсина или субтилизина), специфичность которых соответствует расщепляемой связи пропептид-зрелая часть (Lys-Val). Необходимость гетероактивации была также показана ранее in vivo для ГЭПазы В. subtilis (Park et al, 2004).

В то же время оказалось, что созревание BIGEP осуществляется ступенчато. На первой стадии происходит гидролиз пропептида по единственному остатку глутаминовой кислоты (Glu(-16)) с образованием промежуточной формы (IntF). Образование IntF не требует участия дополнительных протеолитических ферментов и не зависело от присутствия ингибиторов PMSF и 1,10-фенантролина, что соответствует свойствам BIGEP. Эти факты позволяют сделать предположение об автокаталитическом механизме образования промежуточной формы. По-видимому, предшественник BIGEP обладает протеолитической активностью, притом природа гидролизуемой в пропептиде связи (Glu-Lys) говорит о специфичности, совпадающей с таковой у зрелой ГЭПазы. Тем не менее,

15

обнаружить активность IntF не удавалось. Такое положение может быть связано с низким, не детектируемым используемыми методами, уровнем активности промежуточной формы. Другими объяснениями могут служить внутримолекулярный процессинг предшественника на первой стадии, и/или ингибирование активности IntF оставшимися аминокислотами пропептида.

Подобные данные о ступенчатом механизме процессинга были недавно получены in vitro для другой ГЭПазы - фермета из В. licheniformis (Trachuk et al, 2005), и in vivo и in vitro для ГЭПазы St. aureus (протеаза V8) (Nickerson et al, 2007; Nemoto et al, 2008). Интересно отметить, что процессинг протеазы V8 происходит in vivo при участии термолизинподобной металлопротеиназы ауреолизина (Nickerson et al, 2007), a in vitro при участии термолизина (Nemoto et al, 2008). Однако обработка промежуточной формы BIGEP термолизином не приводила к образованию зрелого фермента. Вероятно, это связано с различной природой гидролизуемой связи: Asn-Val у протеазы V8 и Lys-Val у BIGEP. В таком случае, благодаря разнообразию свойств остатков в (-1) положении (рис. 2), в различных микроорганизмах ГЭПазы, вероятно, процессируются при участии различных протеолитических ферментов, обладающих различной специфичностью и относящихся к разным каталитическим типам.

Эти данные хорошо дополняют результаты, полученные нами при мутагенезе (-1) положения BIGEP, и являются еще одним аргументом в пользу сделанных выводов о том, что модификации (-1) остатка ГЭПаз in vivo служат механизмом эволюционной адаптации.

2.3. Автоактивация глутамилэндопептидазы В. intermedius

Для выяснения способности BIGEP к автокаталитическому созреванию нами был получен предшественник, не имеющий сигнального пептида, с заменой Lys(-l)-^Glu (РЕМ) (рис. 6). Для этого был сконструирован вектор рРЕМ, являющийся результатом клонирования в плазмиду рЕТ23Ь(+) фрагмента гена BIGEP, кодирующего предшественник без сигнальной последовательности. Данный фрагмент был получен методом ПЦР на матрице плазмиды рЕ-1. Аналогично РМ, предшественник с мутацией в сайте процессинга накапливался в нерастворимой форме в цитоплазме клеток Е. coli BL21 (DE3). Для подтверждения структуры, очищенный аналогично SPM и РМ (рис. 5), РЕМ был подвергнут трипсинолизу с последующим анализом методом MALDI-масс-спектрометрии. Полученный набор фрагментов (покрытие 52%) включал N- и С-концевые пептиды: 2050,966 Да (гидролиз после К(-33)) и 1642,849 Да (после К200), а также пептид

с молекулярной массой 1449,692 Да, что соответствует последовательности 5)Р<2ТЕУУ1СПЮСН(8) с мутацией >-»С1и.

Ренатурированный аналогично БРМ и РМ, мутантный предшественник (РЕМ) самопроизвольно переходил в активную форму (рис. 7В), по первичной структуре совпадающую с нативной зрелой ВЮЕР. Ы-концевая аминокислотная последовательность активной формы, полученной при созревании РЕМ, совпадала с таковой для зрелой ВЮЕР дикого типа: УУЮО. Удельная активность полученного фермента также не отличались от таковой природной ВЮЕР (ЬезИсЫ^кауа е1 а1,1997; Вегш(1уик е1 а1, 2004). Обнаружить промежуточную форму (М7) при активации РЕМ не удавалось (рис. 7В). Активация РЕМ не требовала присутствия дополнительных протеиназ, на процессинг не влияло присутствие в растворе РМ8Р и 1,10-фенантролина. Таким образом, предшественник ВЮЕР способен к автокаталитическому процессингу при наличии остатка глутаминовой кислоты в (-1) положении.

Этот результат имеет важное прикладное значение. Протеолитические ферменты с узкой субстратной специфичностью, к которым относится ВЮЕР, позволяют проводить ограниченный гидролиз белков и пептидов, что делает эти протеиназы незаменимой составляющей основанных на масс-спектрометрии протеомных исследований. Такие ферменты применяют для определения первичной структуры и доменной организации, а также идентификации белков. Они могут быть использованы также для сиквенс-специфического гидролиза слитых белков и получения биологически активных пептидов.

Наиболее эффективным подходом к получению белков как в исследовательских, так и в прикладных целях является их гетерологическая экспрессия. В то же время при использовании такого подхода возникает проблема корректного созревания белка. Если фермент синтезируется в виде предшественника, для образования активной формы необходимо удаление пропептида. Однако в случае протеиназ с узкой субстратной специфичностью для гидролиза пропептида необходимо использование другого протеолитического фермента. В то же время введение в препарат исследуемого белка примесной протеиназы всегда нежелательно и ставит перед исследователем дополнительную и часто нетривиальную задачу ее последующего удаления. С точки зрения получения высокоспецифичной протеазы, пригодной для ограниченного протеолиза, присутствие примесной активности абсолютно недопустимо.

Итак, нами предложен новый эффективный подход к получению протеиназ с узкой субстратной специфичностью в гетерологических экспрессионных системах, заключающийся в создании автоактивирующегося варианта целевого фермента путем модификации сайта его процессинга.

Суммируя все данные, полученные нами в результате изучения созревания различных форм предшественника BIGEP in vitro, можно сделать вывод, что предшественник BIGEP обладает протеолитической активностью. Хотя природный фермент требует для активации присутствия другой протеазы, гидролиз пропептида по единственному остатку глутаминовой кислоты (Glu(-16)) происходит, видимо, автокатапитически. Введение остатка глутаминовой кислоты в сайт процессинга (Glu(-1)) приводит к автоактивации BIGEP. Данные процессы не ингибируются PMSF и 1,10-фенантролином, что полностью соответствует свойствам ГЭПазы, равно как и специфичность расщепляемых связей. В то же время, N-концевой остаток зрелой части (Valí) в молекуле предшественника не имеет свободной аминогруппы и, следовательно, не может выступать в качестве компенсатора отрицательного заряда субстрата. По-видимому, высказанная ранее гипотеза о том, что субстратная специфичность BIGEP формируется после созревания фермента (Meijers et al, 2004) не верна.

3. Изучение роли N-концевого остатка в функционировании зрелой глутамилэндопептидазы Bacillus ¡ntermedius

3.1. Получение вариантов глутамилэндопептидазы Bacillus ¡ntermedius без N-концевых остатков

Данные, полученные нами при исследовании механизма активации BIGEP, позволяют думать, что распознавание остатков глутаминовой кислоты субстрата предшественниками ГЭПаз происходит без участия свободной аминогруппы N-концевого остатка. Однако в субстратсвязывающем кармане BIGEP и родственных ГЭПаз кроме а-аминогруппы Val 1 нет положительно заряженных групп, способных выполнять роль компенсатора заряда карбоксигруппы субстрата. Таким образом, представляется необходимым проанализировать роль N-концевого остатка в функционировании зрелого фермента, поскольку существует вероятность того, что механизмы, определяющие субстратную специфичность предшественников ГЭПаз и зрелых белков различны. Можно допустить, что N-концевая аминогруппа зрелой BIGEP необходима для распознавания субстрата, а в предшественнике эту функцию несет иной аминокислотный остаток.

Для анализа роли a-аминогруппы Valí в механизме, определяющем субстратную специфичность зрелой BIGEP, необходимо удалить один или даже несколько N-концевых остатков зрелого белка. Химическая модификация аминогруппы, по-видимому, является в данном случае неподходящим методом, так как введение в субстратсвязывающий карман BIGEP дополнительной группировки приведет к существенной перестройке этого района.

18

Другой возможный метод - обработка зрелой ВЮЕР аминопептидазой с последующим анализом свойств полученной формы. Недостатком этого подхода является вероятность образования нескольких трудноразделимых форм (в том числе исходной) с различными каталитическими свойствами. Такая ситуация существенно затруднила бы анализ. Третьим подходом для удаления Ы-концевых остатков является генно-инженерная модификация ВЮЕР. Именно этот метод был выбран нами на первом этапе, так как он представляется наиболее удобным для получения белка с заданной первичной структурой. В то же время на пути его реализации существуют определенные сложности.

Как обсуждалось выше, ВЮЕР синтезируется в виде предшественника, и № концевой район зрелого фермента образуется в результате процессинга. Таким образом, одно из возможных решений получения зрелой формы без М-концевых остатков -модификация района отщепления пропептида. Однако для ряда ферментов, синтезируемых в виде пробелков, в том числе протеазы У8 показано, что подобная модификация сайта процессинга со стороны зрелой части весьма негативно сказывается на созревании (Ыешой еС а1, 2008). Поэтому, нами был применен другой подход, направленный на получение зрелых «укороченных» с Ы-конца форм.

-10 -1 1 10

BIGEP ...PLSKYLKDFQTK—WIGDDGRTKVANTR...

М MVIGDDGRTKVANTR...

N-1 MIGDDGRTKVANTR..

N-2 MGDDGRTKVANTR..

Н-3 MDDGRTKVANTR-

BIGEP-AP GDDGRTKVANTR...

Рис. 8. N-концевые последовательности полученных вариантов рекомбинантной зрелой части ВЮЕР. Для сравнения приведена последовательность предшественника ВЮЕР в районе сайта процессинга. Нумерация

от N-конца зрелого фемента.

Для многих секреторных протеаз установлено, что пропептид необходим для формирования пространственной структуры белка (Shinde and Inouye, 2000; Demidiuk et al, 2003). Однако, для некоторых протеиназ, синтезирующихся in vivo в виде предшественника, продемонстрирована способность к образованию активного белка без участия пропептида (Mansfeld et al, 2005; Pulido et al, 2006). Функции пропоследовательностей ГЭПаз до настоящего времени не были исследованы. Исходя из этого, мы попытались получить активную ВЮЕР, экспрессировав индивидуальную зрелую часть фермента.

Для этого, на основе плазмиды рЕТ23Ь(+) созданы векторы для экспрессии индивидуальной зрелой части ВЮЕР (М), зрелой части без одного (N-1), двух (N-2), и

трех (N-3) N-концевых аминокислотных остатков (рис. 8). Варианты зрелой части BIGEP (М, N-l, N-2, N-3) накапливались в нерастворимой форме, как видно на примере М (рис. 4), в цитоплазме клеток Е. coli BL21 (DE3). Полученные белки были переведены в раствор и очищены по схеме, использованной ранее для выделения различных форм предшественника BIGEP (SPM, РМ, РЕМ) (рис. 5). Соответствие первичной структуры М кодируемой модифицированным геном было подтверждено методом MALDI-масс-спектрометрии трипсинового гидролизата белка.

Для проведения ренатурации рекомбинантных вариантов зрелой части использовались условия, подобранные для предшественника BIGEP, однако при понижении концентрации денатурирующего агента все формы зрелой части агрегировали с образованием осадка. Ни в одном случае (М, N-l, N-2, N-3) детектировать протеолитическую (по гидролизу азоказеина) или специфическую (по гидролизу Z-Glu-pNA) активность в осадке или супернатанте не удавалось. Эти факты, наряду с эффективным образованием активной BIGEP из предшественника, указывают на то, что пропептид необходим для корректного формирования активной BIGEP.

Итак, отсутствие пропептида в составе рекомбинантной BIGEP приводит к невозможности формирования активного фермента в условиях эксперимента. В то же время для ряда протеолитических ферментов, синтезирующихся в виде предшественников и нуждающихся в пропоследовательности, показано, что наличие ковалентной связи между пропептидом и зрелой частью необязательно (Demidiuk et al, 2003). Корректное созревание таких протеиназ наблюдается при взаимодействии с собственным пропептидом, полученным независимо, то есть в системе in trans. Именно эту схему было решено использовать для сворачивания вариантов индивидуальной зрелой части BIGEP.

3.2. Исследование созревания глутамилэндопептидазы Bacillus intermedins с собственным пропептидом в системе in trans

Для сворачивания форм зрелой части in trans нами были получены два варианта пропептида BIGEP с различными N-концевыми якорными последовательностями: шестигистидиновой (HP) и целлюлозосвязывающим доменом CelD (CBD-P) целлюлазы Anaerocellum thermophilum. Введение таких последовательностей необходимо, так как пропептид BIGEP имеет низкую молекулярную массу (менее 7 кДа). Манипуляции с такими полипептидами обычно затруднены, поскольку они не имеют устойчивой пространственной структуры и весьма чувствительны к внутриклеточному протеолизу. Кроме того, наличие якорных элементов позволяет применить для выделения и очистки

пропептида высокоэффективные методы: металло-хелат аффинную хроматографию в случае HP и аффинную хроматографию на целлюлозе в случае CBD-P.

Для получения HP была использована плазмида рЕТ23Ь(+), в которою был введен полученный с помощью ПЦР модифицированный участок гена BIGEP. Пропептид, содержащий шестигистидиновый N-концевой участок, накапливался в растворимой форме и после разрушения клеток Е. coli BL21 (DE3) был очищен на Ni-NTA агарозе (рис. 9А).

А _

Я о Ni-NTA-агароза

с; О ЭЛЮЦИЯ

5 £12 3 4

Целлюлоза £ Целлюлоза элюция J злюция

-6,5 кДа

-66 кДа -45 кДа

-24 кДа -20 кДа

Рис. 9. Электрофоретический анализ препаратов пропептидов BIEP, полученных в ходе очистки. Кл. лизат -тотальный клеточный лизат. A. HP. pET23b(+) - контроль, лизат клеток Е. coli BL21 (ОЕЗ)/рЕТ23Ь(+);Проскок - несвязавшаяся с Ni-NTA агарозой фракция; Ni-NTA-агароза, элюция -элюируемые с Ni-NTA-агарозы фракции: 1 — 50 мМ имидазола, 2—100 мМ имидазола, 3, 4 - 1 М имидазола.

Б. CBD-P. Целлюлоза, элюция - элюируемые с целлюлозы фракции: 1,2 - 800 мМ гуанидинхлорида, 3-2

М гуанидинхлорида, 4 - 8 М гуанидинхлорида. Мм маркеры - маркеры молекулярной массы.

Для получения CBD-P кодирующая пропептид BIGEP последовательность была клонирована в экспрессионный вектор рТТ9, любезно предоставленный Луниным В.Г. (НИИ Сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН) и Великодворской Г.А. (ИМГ РАН). Данная плазмида несет ген, кодирующий целлюлозосвязывающий домен CelD целлюлазы Anaerocellum thermophilum с С-концевым серин-глициновым спейсером, а также расположенный за ним полилинкерный участок. Для экспрессии CBD-P, полученный в результате клонирования вектор pCBD-P был введен в клетки штамма Е. coli TGI. Несущий HaN-кокце целлюлозосвязывающий домен пропептид был обнаружен в цитоплазме клеток в растворимой форме и очищен на колонке с микрокристаллической целлюлозой (рис. 9Б).

На основе литературных данных о сворачивании других протеаз в системе in trans (Strausberg et al, 1993; O'Donohue and Beaumont, 1996; Anderson et al, 2005), сворачивание вариантов зрелой части BIGEP (М, N-l, N-2, N-3) осуществлялось при 5-20 кратном мольном избытке пропоследовательности (HP или CBD-P). Для всех вариантов зрелой части были испытаны различные условия ренатурации. Однако, несмотря на все попытки,

детектировать активность ни в одном случае не удавалось. Более того, несмотря на присутствие собственного пропептида, все варианты зрелой части BIGEP по-прежнему были склонны к агрегации и выпадали в осадок.

Следует отметить, что такой результат не удивителен. Для ферментов, сворачивание которых в системе in trans было осуществлено, показано, что эффективность этого процесса в десятки раз ниже, чем при наличии ковапентной связи с пропептидом (Strausberg et al, 1993; O'Donohuc and Beaumont, 1996; Anderson et al, 2005). По-видимому, подобный способ сворачивания может быть осуществлен далеко не в каждом случае, хотя, возможно, нам просто не удалось подобрать условия фолдинга BIGEP в системе in trans.

Таким образом, в результате использования генно-инженерного подхода к получению «укороченных» форм зрелой BIGEP, можно сделать вывод, что наличие пропептида, по-видимому, необходимо для формирования активного фермента. В то же время, это не позволило нам получить активные формы BIGEP с удаленными N-концевыми остатками. Тогда нами был использован другой подход, основанный на обработке зрелой активной BIGEP аминопептидазой.

3.3. Получение глутамилэндопептидазы Bacillus intermedins с тремя удаленными N-концевыми остатками.

Для реализации подхода, основанного на удалении N-концевых остатков зрелой BIGEP аминопептидазой, были наработаны препаративные количества активного фермента. Были получены два варианта зрелой BIGEP: первый - из автоактивирующегося предшественника (РЕМ), экспрессированного в клетках Е. coli, был очищен как описано выше. Второй вариант (BIGEP-Bs), полученный при экспрессии гена BIGEP в клетках В. subtilis, был очищен по схеме, описанной ранее (Rebrikov et al, 1999).

Так как прогнозировать эффект обработки зрелой BIGEP конкретной аминопептидазой невозможно, мы использовали набор ферментов, имеющих предпочтение к гидрофобным остаткам. Это позволяло рассчитывать на удаление Vail, или даже первых трех остатков BIGEP - WI (рис. 8). Зрелая активная BIGEP была подвергнута обработке лейцин-аминопептидазами Streptomyces griseus и из почек свиньи, а также аминопептидазой Aeromonas proteolytica. Для отделения от аминопептидаз и продуктов гидролиза полученные формы BIGEP были очищены с использованием гель-проникающей хроматографии.

Было показано, что препарат, обработанный аминопептидазой A. proteolytica, демонстрировал значительное падение общей протеолитической активности, измеряемой

22

по гидролизу азоказеина. В случае обработки другими аминопептидазами подобного эффекта не наблюдалось. При этом, по данным электрофоретического анализа количество и молекулярная масса BIGEP осталась неизменной во всех препаратах. Структуру всех форм BIGEP, полученных в результате обработки, анализировали методом MALDI-масс-спектрометрии трипсиновых гидролизатов белков. Масс-спектрометрическое исследование показало, что структура BIGEP, обработанной ферментами Str. griseus и из почек свиньи, не отличается от нативной. В то же время, при действии фермента А. proteolytica происходит удаление N-концевых остатков BIGEP. Вместо фрагмента V( 1 )VIGDDGRTK( 10) с массой 1059,542 Да присутствовал фрагмент с массой 1289,816 Да, что соответствует последовательности G(4)DDGRTKVANTR(15). Итак, обработанная аминопептидазой А. proteolytica BIGEP (BIGEP-AP) не имела первых трех аминокислот (WI) и начиналась с остатка Gly4 (рис. 8). Очищенная BIGEP-AP демонстрировала полное отсутствие активности, детектируемой по гидролизу азоказеина и специфического субстрата Z-Glu-pNA.

12000

10000

5

к 8000

3"

I

« ZT 6000

О

Q.

О >. 4000

С

в

2000

0

1 2 3 4 5 6 7

Glu(Edans)AlaAlaXaaAlaAlaLys(Dabcyl)-NH,

а

<

< 3

I—.!—.

t о. t а. 3 < 3 <

а. <

а. <

о. <

Количество белка, мг 0,5 1 1 10 1 5 1 5 1 5 1 S 1 5 1 S 1 5

Хаа Glu Gin Leu Thr Lys Val Ser Ala

Рис. 10. Активность нативной и модифицированной (без трех Ы-концевых остатков) ВЮЕР, детектируемая с помощью различных субстратов с внутримолекулярным тушением флуоресценции. Ес1аш - флуорофор Е(1ап8 (Ы-(аминоэтил)-5-нафтиламин-1-сульфоновая кислота); 1)аЬсу1 -тушитель ПаЬсу1 (4-диметиламино-4'-карбоксилазобензен). \УТ - нативный фермент, АР - ВЮЕР-АР.

Для анализа специфичности ВЮЕР без трех Ы-концевых остатков был использован набор субстратов с внутримолекулярным тушением флуоресценции, имеющих строение, представленное на рис. 10 (Рерэсап, Нидерланды). Использованные субстраты включали в положении 4 следующие аминокислотные остатки: глутаминовую кислоту, глутамин, лейцин, треонин, лизин, валин, серин и аланин. Подобный набор должен был помочь

детектировать возможное изменение специфичности BIGEP. Однако ни в одном случае детектировать активность BIGEP-AP не удавалось (рис.10).

Потеря активности BIGEP при удалении первых трех аминокислот говорит о важности N-концевых остатков для функционирования фермента. Данные о существенной роли амино-концевого района фермента недавно получены также и для протеазы V8 (Nemoto et al, 2008). По всей видимости, ухудшение каталитических свойств BIGEP связано с нарушением фермент-субстратного взаимодействия, что представляется возможным, исходя из пространственного положения остатка Vail в молекуле фермента. В то же время отсутствие активности не говорит об участии a-аминогруппы в распознавании заряда субстрата.

4. Заключение

Таким образом, как полученные нами, так и литературные данные говорят о важности N-концевых остатков бациллярных и кокковых ГЭПаз в функционировании фермента. В то же время предшественник BIGEP, по-видимому, обладает характерной для ГЭПаз специфичностью до формирования свободной аминогруппы Val 1. Этот факт подразумевает, что a-аминогруппа Val 1 является как минимум не единственным элементом, определяющим субстратную специфичности ГЭПаз. Подтверждают такую трактовку данные о ГЭПазах Str. griseus (Nienaber et al, 1993) и nsp4 вируса артериита (Barrette-Ng et al, 2002), чьи N-концевые районы удалены от субстратсвязывающего участка ферментов.

ГЭПазы с высокой избирательностью распознают отрицательно заряженные остатки. В то же время, ни свободная аминогруппа, ни абсолютно консервативный у ГЭПаз остаток His213 (Demidyuk et al, 2004), видимо, не являются элементами, целиком определяющими субстратные предпочтения фермента. Можно предположить, что специфическое взаимодействие с отрицательно заряженными остатками осуществляется благодаря суммарному эффекту целой группы положительно заряженных остатков ГЭПаз. В таком случае ни один из остатков не является единственным «компенсатором» отрицательного заряда и, следовательно, критическим для распознавания субстрата. Тогда центральную роль в механизме, определяющем специфичность, должна играть геометрия субстратсвязывающего района ГЭПаз, обеспечивающая точное распознавание остатков глутаминовой кислоты. Следовательно, можно предполагать, что ГЭПазы способны с низкой эффективностью распознавать и близкие по структуре, но нейтральные остатки глутамина. Хотя для большинства ферментов этой группы таких данных нет, способность гидролизовать связи, образованные остатками глутамина, описана для протеаз V8 и nsp4

24

in vivo (Nickerson et al, 2007; Snijder et al, 1996). Исходя из этого, возможно предположение, что Vail является в первую очередь важнейшим структурным элементом, необходимым для формирования правильной геометрии субстратсвязывающего района BIGEP, в то время как заряд свободной аминогруппы важен в значительно меньшей степени.

ВЫВОДЫ

1) Впервые продемонстрировано влияние (-1) остатка на формирование активной глутамилэндопептидазы В. intermedias (BIGEP) и продукцию активной протеиназы бактериальными клетками. Показано, что, в зависимости от природы аминокислотных остатков, формирующих сайт процессинга, BIGEP активируется различными ферментами. Возможно, модификация (-1) положения служит эволюционным механизмом изменения уровня продукции глутамилэндопептидаз.

2) Предложен новый подход для создания эффективных рекомбинантных продуцентов протеиназ с узкой субстратной специфичностью, заключающийся в модификации их сайта процессинга. С использованием этого подхода на основе клеток Е. coli сконструирован продуцент BIGEP.

3) Впервые исследовано созревание BIGEP с собственным пропептидом in eis и in trans, а также без пропоследовательности и показано, что пропептид BIGEP необходим для формирования активного фермента.

4) Продемонстрировано, что отсутствие свободной a-аминогруппы Val 1 в предшественнике BIGEP не влияет на его способность распознавать отрицательно заряженные остатки.

5) Впервые получен вариант зрелой BIGEP с удаленными тремя N-концевыми аминокислотными остатками и продемонстрировано, что эти остатки важны для функционирования фермента.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. Gasanov E.V., Demidyuk I.V., Shubin A.V., Kozlovskiy V.l., Leonova O.G., Kostrov S.V. Hetero- and auto-activation of recombinant glutamyl endopeptidase from Bacillus intermedius. // Protein Eng. Des. Sei. - 2008. - V. 21, N 11. - p. 653-658.

2. Велишаева H.C., Гасанов E.B., Громова Т.Ю., Демидюк И.В. Влияние модификации сайта процессинга глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius на продукцию активного фермента клетками Bacillus subtilis. // Биоорганическая химия. -2008.-Т. 34, №6.-С. 786-791.

3. Гасанов Е.В., Романова Д.В., Громова Т.Ю., Демидюк И.В. Эффект делеции 3 '-некодирующей области гена глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius на продукцию активного белка клетками Bacillus subtilis. Н Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2007. - № 2. - С. 31-32.

4. Велишаева Н.С., Гасанов Е.В., Костров C.B., Демидюк И.В. Направленная модификация гена секреторной глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius с целью введения Мвб-якорной последовательности в молекулу белка. // Материалы научно-практической конференции «Современное состояние Российской биотехнологии». Пущино, 2003. - С. 6.

5. Сафина Д.Р., Гасанов Е.В., Рафиева Л.М., Остроумова Л.В., Ретунская Е.В., Демидюк И.В., Костров C.B. Конструирование протеолитических ферментов с измененной субстратной специфичностью. // Тезисы докладов всероссийского симпозиума «Биотехнология микробов». Москва, 2004. - С. 78.

6. Демидюк И.В., Сафина Д.Р., Гасанов Е.В., Костров C.B. Пропептиды как модуляторы функциональной активности бактериальных секреторных протеиназ. // Тезисы докладов и стендовых сообщений II российского симпозиума по химии и биологии пептидов. Санкт-Петербург, 2005. - С. 45.

7. Сафина Д.Р., Гасанов Е.В., Рафиева Л.М., Демидюк И.В., Костров C.B. Конструирование протеолитических ферментов с модифицированной субстратной специфичностью в системе про-зависимого фолдинга. // Материалы XIII международной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение». Казань, 2005.-С. 76-77.

8. Гасанов Е.В., Демидюк И.В., Костров C.B. Созревание рекомбинантной глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius. // Сборник тезисов 10-ой пущинской школы-конференции молодых ученых. Пущино, 2006. - С. 9.

9. Гасанов Е.В., Шубин A.B., Демидюк И.В., Костров C.B. Пропептид глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius необходим для формирования активного фермента. // Тезисы докладов VI симпозиума «Химия протеолитических ферментов», Москва, 2007.-С. 107.

10. Гасанов Е.В., Шубин A.B., Шардакова Э.В., Демидюк И.В. Для формирования активной глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius необходим пропептид. // Сборник тезисов 11-ой международной пущинской школы-конференции молодых ученых. Пущино, 2007.-С. 74.

Подписано в печать 22.01.2009 г. Печать лазерная цифровая Тираж 110 экз.

Типография Aegis-Print 115230, Москва, Варшавское шоссе, д. 42 Тел.: (495) 785-00-38 www.autoref.webstolica.ru

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Гасанов, Евгений Валерьевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Механизмы распознавания заряженных субстратов протеолитическими ферментами.

2.1. Введение.

2.2. Номенклатура, применяемая для описания взаимодействия протеазы с субстратом.

2.3. Аспартильные протеазы.

2.4. Металлопротеазы.

2.5. Цистеиновые протеазы.

2.6. Сериновые протеазы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизм активации глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius"

Актуальность исследования

В современных науках о жизни значительное место занимают проблемы изучения белковых молекул, связи структуры и функции белков. Наибольшее внимание при этом привлекают каталитически активные белки — ферменты. Одним из основных направлений является исследование механизмов ферментативного катализа, представляющее значительный интерес как с фундаментальной точки зрения, так и для развития биотехнологии. Важнейшим этапом функционирования ферментов является специфическое распознавание и связывание молекул субстрата. Понимание механизмов, лежащих в основе субстратной специфичности белков, позволяет управлять активностью природных ферментов, в частности, в медицинских целях. Кроме того, знание закономерностей распознавания субстрата позволяет конструировать белки с модифицированной, заданной субстратной специфичностью.

Удобной моделью для исследования механизмов, определяющих субстратную специфичность, являются протеолитические ферменты. Внутри этого класса ферментов можно выделить ряды родственных белков, по-разному взаимодействующих с различными аминонокислотными остатками субстрата. Таким образом, становится возможным проанализировать изменения в структуре ферментов, приводящие к различиям в субстратной специфичности.

Среди протеаз особый интерес вызывают ферменты с узкой субстратной специфичностью, распознающие, например, только положительно или только отрицательно заряженные остатки. Подобные ферменты нашли широкое применение в современных биомедицинских технологиях, благодаря их способности осуществлять ограниченный гидролиз белков и пептидов. Это делает протеазы с узкой специфичностью незаменимой составляющей основанных на масс-спектрометрии протеомных исследований. Такие ферменты применяют для определения первичной структуры и доменной организации, а также идентификации белков. Они могут быть использованы также для сиквенс-специфического гидролиза слитых белков и получения биологически активных пептидов.

Моделью в наших исследованиях служит глутамилэндопептидаза Bacillus intermedins (BIGEP) - сериновая протеаза, с высокой специфичностью гидролизующая пептидные связи, образованные а-карбоксильными группами глутаминовой и аспарагиновой кислот. Подобная специфичность выделяет глутамилэндопептидазы 5

ГЭПазы) в ряду химотрипсинподобных протеаз. Несмотря на то, что BIGEP относится к хорошо изученному структурному семейству химотрипсина, а для самого фермента установлена пространственная структура и проведен направленный мутагенез субстратсвязывающего сайта, механизм, определяющий субстратную специфичность BIGEP, как и других глутамилэндопептидаз, неизвестен. Изучение закономерностей, обеспечивающих распознавание отрицательно заряженных остатков субстрата ГЭПазами на примере BIGEP, и последующее сравнение с таковыми других ферментов семейства, позволит проанализировать эволюционные изменения, обеспечивающие разнообразие субстратных предпочтений химотрипсинподобных протеаз.

Цели и задачи исследования

Основной целыо данного исследования являлось изучение структурно-функциональных особенностей BIGEP, обеспечивающих предпочтение фермента к связям, образованным остатками глугаминовой кислоты. Для этого в работе решались следующие задачи:

1) изучение механизма созревания предшественника BIGEP;

2) получение зрелой BIGEP без N-концевых аминокислотных остатков и анализ ее специфичности.

Научная новизна исследования

В представленной работе впервые продемонстрировано, что модификация сайта процессинга BIGEP влияет на продукцию активного белка клетками В. subtilis. Впервые исследован механизм созревания рекомбинантной BIGEP in vitro, и показана необходимость пропептида BIGEP для формирования активного фермента. Получен вариант зрелой BIGEP с делецией трех N-концевых аминокислотных остатков, что позволило впервые продемонстрировать важность N-концевого района для функционирования фермента.

Практическая значимость исследования

Полученные в работе данные о влиянии модификации сайта процессинга на продукцию активной BIGEP могут быть использованы для создания эффективных продуцентов протеаз с узкой субстратной специфичностью. В частности, в работе предложен новый подход к получению BIGEP в гетерологической экспрессионной системе, заключающийся в создании автоактивирующегося варианта целевого фермента путем модификации сайта его процессинга.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

МЕХАНИЗМЫ РАСПОЗНАВАНИЯ ЗАРЯЖЕННЫХ СУБСТРАТОВ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИМИ ФЕРМЕНТАМИ

2.1. Введение

Исследование механизмов, лежащих в основе ферментативного катализа, является одним из важнейших направлений современной науки. Это связано как с исключительной важностью биологических функций ферментов, так и с их широчайшим биотсхпологическим применением.

Одним из основных элементов, определяющих эффективность функционирования любого фермента, является точность и сила его взаимодействия с субстратом — то есть его специфичность. С одной стороны, правильное позиционирование молекулы субстрата в активном центре необходимо для эффективного ферментативного катализа. С другой стороны, способность к тонкому распознаванию субстрата обеспечивает избирательность фермента. Таким образом, понимание механизмов, лежащих в основе специфического взаимодействия с субстратами, может позволить нам изменять как эффективность работы ферментов, так и их специфичность.

Удобной моделью для изучения механизмов фермент-субстратного взаимодействия являются протеолитические ферменты. Все протеазы взаимодействуют с одним и тем же субстратом - полипептидной цепью. В то же время существует огромное разнообразие протеолитических ферментов (эти белки встречаются абсолютно у всех известных организмов). При этом многие заметно отличающиеся по структуре протеазы взаимодействуют с одними и теми же участками полипептидной цепи, и наоборот, часто структурно близкие ферменты заметно различаются по специфичности. Таким образом, изучение закономерностей, лежащих в основе взаимодействия протеаз с субстратом, заметно приблизит нас к пониманию механизмов, определяющих субстратную специфичность ферментов.

Наиболее распространенными методиками, применяемыми для анализа механизмов, определяющих субстратную специфичность, являются рентген о-структурный анализ молекул фермента (чаще в комплексе с субстратом или его аналогом) и генно-инженерная модификация белка. Первый метод позволяет визуализировать фермент-субстратное взаимодействие, и дает возможность выдвинуть предположение о роли отдельных структурных элементов фермента. С помощью второго подхода возможно 7 вносить изменения в структуру белка, а последующий анализ наблюдаемого эффекта позволяет судить об участии модифицированных элементов в функционировании фермента. Совместное применение этих методов позволяет формулировать гипотезы о механизмах, лежащих в основе специфичности того или иного белка, в том числе протеазы.

Аминокислотные остатки, образующие пептидную цепь, можно разделить на различные группы. Одно из наиболее очевидных делений - на заряженные и нейтральные. К первым относятся имеющие отрицательный заряд остатки дикарбоновых кислот: аспарагиновой и глутаминовой, а также положительно заряженные лизин и аргинин. Протеолитические ферменты, специфически взаимодействующие с участками полипептидной цепи, несущими заряд, играют заметную роль в биологических процессах. Достаточно упомянуть каспазы, играющие ключевую роль в процессе апоптоза, факторы свертывания крови и комплемента, пищеварительные ферменты эукариот и факторы патогенности микроорганизмов. Ниже представлен обзор данных, существующих для различных протеолитических ферментов, относительно механизмов, лежащих в основе специфического взаимодействия протеаз с заряженными субстратами.

По каталитическому механизму протеазы принято делить на четыре типа в зависимости от природы нуклеофильного агента, участвующего в реакции. Это аспаргильные, сериновые, цистеиновые и металлопротеазы. Эта классификация использована нами далее при анализе данных о механизмах, определяющих предпочтение различных протеолитических ферментов к заряженным субстратам.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Гасанов, Евгений Валерьевич

выводы

1) Впервые продемонстрировано влияние (-1) остатка на формирование активной глутамилэндопептидазы В. intermedius (BIGEP) и продукцию активной протеиназы бактериальными клетками. Показано, что, в зависимости от природы аминокислотных остатков, формирующих сайт процессинга, BIGEP активируется различными ферментами. Возможно, модификация (-1) положения служит эволюционным механизмом изменения уровня продукции глутамилэндопептидаз.

2) Предложен новый подход для создания эффективных рекомбинантных продуцентов протеиназ с узкой субстратной специфичностью, заключающийся в модификации их сайта процессинга. С использованием этого подхода на основе клеток Е. coli сконструирован продуцент BIGEP.

3) Впервые исследовано созревание BIGEP с собственным пропептидом in cis и in trans, а также без пропоследовательности и показано, что пропептид BIGEP необходим для формирования активного фермента.

4) Продемонстрировано, что отсутствие свободной а-аминогруппы Vail в предшественнике BIGEP не влияет на его способность распознавать отрицательно заряженные остатки.

5) Впервые получен вариант зрелой BIGEP с удаленными тремя N-концевыми аминокислотными остатками и продемонстрировано, что эти остатки важны для функционирования фермента

4.4. Заключение

Таким образом, как полученные нами, так и литературные данные говорято важности N-концевых остатков бациллярных и кокковых ГЭПаз в функционироватьии фермента. В то же время предшественник BIGEP, по-видимому, обладает характерной ГЭПаз специфичностью до формирования свободной аминогруппы Vail. Этот подразумевает, что а-аминогруппа Vail является как минимум не единствен

Ым элементом, определяющим субстратную специфичности ГЭПаз. Подтверждают та.^^^^^ трактовку данные о ГЭПазах Str. griseus [83] и nsp4 вируса артериита [82], чьи: ^ концевые районы удалены от субстратсвязывающего участка ферментов.

Итак, ГЭПазы с высокой избирательностью распознают отрицательно заряжетз^^^ остатки. В то же время, ни свободная аминогруппа, ни абсолютно консервативиь.^.^ ГЭПаз остаток His213 [90], видимо, не являются элементами, целиком определяюгхд—-^

-•^МИ субстратные предпочтения фермента. Можно предположить, что специфичен

Кое взаимодействие с отрицательно заряженными остатками осуществляется благо суммарному эффекту целой группы положительно заряженных остатков ГЭПаз. В случае ни один из остатков не является единственным «компенсатором» отрицагел того заряда и, следовательно, критическим для распознавания субстрата. Тогда централ ^^^ роль в механизме, определяющем специфичность, должна играть геом субстратсвязывающего района ГЭПаз, обеспечивающая точное распознавание ос*: гков глутаминовой кислоты. Следовательно, можно предполагать, что ГЭПазы спосо^> ^ ы с низкой эффективностью распознавать и близкие по структуре, но нейтральные ос^-^ глутамина. Хотя для большинства ферментов этой группы таких данных нет, способ ^ атки ость гидролизовать связи, образованные остатками глутамина, описана для протеаз V8 nsp4 in vivo [87, 118]. Исходя из этого, возможно предположение, что Vail является в

Лрвую очередь важнейшим структурным элементом, необходимым для формир<^>^ правильной геометрии субстратсвязывающего района BIGEP, в то время как ~ аряд свободной аминогруппы важен в значительно меньшей степени.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Гасанов, Евгений Валерьевич, Москва

1. Schechter I., Berger A. On the size of the active site in proteases. I. Papain. // Biochem Biophys Res Commun, 1967. 27(2): p. 157-62.

2. Rawlings N.D., Morton F.R., Kok C.Y., Kong J., Barrett A.J. MEROPS: the peptidase database. II Nucleic Acids Res, 2008. 36(Database issue): p. D320-5.

3. Fruton J.S. The mechanism of the catalytic action of pepsin and related acid proteinases. // Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol, 1976. 44: p. 1-36.

4. Lowther W.T., Majer P., Dunn B.M. Engineering the substrate specificity of rhizopuspepsin: the role of Asp77 of fungal aspartic proteinases in facilitating the cleavage of oligopeptide substrates with lysine in PI. // Protein Sci, 1995. 4(4): p. 689702.

5. Gagnon-Arsenault I., Tremblay J., Bourbonnais Y. Fungal yapsins and cell wall: a unique family of aspartic peptidases for a distinctive ccllular function. // FEMS Yeast Res, 2006. 6(7): p. 966-78.

6. Setlow P. Small, acid-soluble spore proteins of Bacillus species: structure, synthesis, genetics, function, and degradation. // Annu Rev Microbiol, 1988. 42: p. 319-38.

7. Kramer R.A., Vandeputte-Rutten L., de Roon G.J., Gros P., Dekker N., Egmond M.R. Identification of essential acidic residues of outer membrane protease OmpT supports a novel active site. // FEBS Lett, 2001. 505(3): p. 426-30.

8. Vandeputte-Rutten L., Kramer R.A., Kroon J., Dekker N., Egmond M.R., Gros P. Crystal structure of the outer membrane protease OmpT from Escherichia coli suggests a novel catalytic site. // Embo J, 2001. 20(18): p. 5033-9.

9. Varadarajan N., Gam J., Olsen M.J., Georgiou G., Iverson B.L. Engineering of protease variants exhibiting high catalytic activity and exquisite substrate selectivity. // Proc Natl Acad Sci USA, 2005. 102(19): p. 6855-60.

10. Garrigue-Antar L., Barker C., Kadler K.E. Identification of amino acid residues in bone morphogenetic protein-1 important for procollagen C-proteinase activity. IIJ Biol Chem, 2001.276(28): p. 26237-42.

11. Dcmidyuk I.V., Gasanov E.V., Safina D.R., Kostrov S.V. Structural organization of precursors of thermolysin-like proteinases. // Protein J, 2008. 27(6): p. 343-54.