Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурные и функциональные свойства цитокинин-связывающих белков растений Arabidopsis thaliana L., Hordeum vulgare L., Oryza sativa L.

ВАК РФ 03.00.05, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Структурные и функциональные свойства цитокинин-связывающих белков растений Arabidopsis thaliana L., Hordeum vulgare L., Oryza sativa L."

На правах рукописи

ПРОКОПЦЕВА Ольга Сергеевна

Структурные и функциональные свойства цитокинин-связывающих белков растений Arabidopsis thatíana Hordeum vulgare Oryza sativa L.

03.00.05 -ботаника

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 6 О KT 2003

Астрахань - 2008

003448938

Работа выполнена в Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, г. Москва и в Астраханском государственном университете, г. Астрахань

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Епинетов Михаил Александрович

Научный консультант:

кандидат химических наук

Копдаков Сергей Эмильевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Дудин Геннадий Петрович доктор сельскохозяйственных наук, Смашевский Николай

Ведущая организация: Российский государственный аграрный университет - МСХА им. К.А. Тимирязева

Зашита состоится «6» ноября 2008 г. в 10-00 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций ДМ 212.009,10 при Астраханском Государственном Университете: г.Астрахань, пл. Шаумяна, 1, Актовый зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Астраханского Государственного Университета.

Автореферат разослан 26 сентября 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доцент

Дмитриевич

доктор биологических наук

Федотова А.В.

Общая характеристика работы

Введение. Актуальность проблемы. Одной из центральных задач науки о растениях является исследование гормональной регуляции роста и развития растений. Это объясняется тем, что вся жизнь растения, начиная от оплодотворенной яйцеклетки и заканчивая отмиранием и смертью, происходит под контролем фитогормонов. Также фитогормоны играют важную роль в реакции растений на внешние воздействия. Именно благодаря большим адаптивным возможностям, растения могут вести «сидячий образ жизни», приспосабливаясь к изменяющимся условиям окружающей среды.

Воздействие гормонов на клетки осуществляется через специфические рецепторы. Изучение механизма действия гормонов заключается в исследовании их рецепторов и процессов, приводящих к проявлению специфического гормонального ответа. Кроме того, состав форм гормона и их количественное соотношение, необходимые для проявления того или иного ответа растительным организмом, поддерживаются в клетке белками-транспортерами гормонов и ферментами метаболизма гормона (ферментами синтеза, распада, модификации, которые могут преобразовать активную форму гормона в неактивную).

Существует пять основных групп гормонов растений - это ауксины, цитокинины, гиббереллины, этилен и абсцизовая кислота. Цитокининам принадлежит важная роль в течение всей жизни растений. Они участвуют в регуляции экспрессии цитокинин-чувствительных генов растений, регуляции деления клеток, дифференцировке хлоропластов, индукции стеблевого морфогенеза, осуществлении контроля корневой системы над ростом и развитием надземных органов растения, и др.

Описан мембранный рецептор цитокининов - гистидинкиназа, которая воспринимает внешний по отношению к клетке цитокинин. Кроме того, накапливаются факты, которые говорят о существовании альтернативного пути передачи цитокининового сигнала в растениях. В связи с этим был обнаружен ядерный растворимый цитокинин-связывающий белок 67 кДа (ЦСБ67), который в присутствии цитокинина активирует транскрипцию in vitro. Этот белок является кандидатом на роль внутриклеточного растворимого рецептора цитокинина растений, подобно ядерным рецепторам стероидных гормонов животных.

Обнаружение как мембранного, так и кандидата на внутриклеточный растворимого рецептор цитокинина, говорит о сложности системы

восприятия цитокининового сигнала, и ставит вопрос о разделении функций между этими рецепторами. Так как мембранный рецептор цитокинина в основном локализован в корне, возможно, что в надземной части рецепция цитокинина происходит с помощью других белков. Возможно также, что мембранный и растворимый рецепторы цитокинина необходимы одновременно в растительной клетке, как это известно для хорошо изученных рецепторов стероидных гормонов животных. Мембранные рецепторы стероидных гормонов животных индуцируют быстрые ответы (активация сигнальных каскадов), ядерные рецепторы — более медленные ответы (усиление или ослабление транскрипции определенных генов). В некоторых случаях показано взаимодействие между мембранными и ядерными рецепторами. Для растений на настоящий момент такие данные отсутствуют.

Для понимания того, как гормональный цитокининовый сигнал регулирует рост и развитие растительного организма, проводится изучение белков-рецепторов цитокинина, а также цитокинин-связывакмцих белков с другими функциями. В связи с этим

ЦЕЛЬЮ РАБОТЫ было дать комплексную оценку структурных и функциональных свойств цитокинин-связывающих белков растений Arabidopsis thaliana L., Hordeum vulgare L., Oryza sativa L.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

1. Оценить структурное сродство цитокинин-связывающего белка ЦСБ67 Hordeum vulgare L. и мембранного рецептора цитокининов -гистидинкиназы CRE1/WOL/AHK4 Arabidopsis thaliana L..

2. Сравнить структурные и функциональные свойства цитокинин-связывающего белка ЦСБ67 Hordeum vulgare L. и ауксин-связывающего белка Джонса АСБ65 Vigna radiata L.

3. Оценить функциональную идентичность ЦСБ67 и транскрипционных систем, выделенных из растений, относящихся к разным таксономическим группам: Классу Однодольных (Hordeum vulgare L.) и Классу Двудольных (Arabidopsis thaliana L.).

4. Определить структуру новых обнаруженных цитокинин-связывающих белков растений Arabidopsis thaliana L. и Oryza sativa L.

5. Сравнить степень сродства цитокинин-связывающего белка аденозинкиназы Hordeum vulgare L. к природному цитокинину транс-зеатину со сродством к природному цитокинину зеатинрибозиду, синтетическому цитокинину 6-БАП, производным аденина и нуклеотидам: аденину, аденозину, АТФ, ГТФ, УТФ.

Научная новизна. Впервые показано, что ЦСБ67 не имеет структурного сродства с мембранным рецептором цитокининов -гистидинкиназой CRE1/WOL/AHK4. Впервые сделано предположение о возможной идентичности цитокинин-связывающего белка ЦСБ67 и ауксин-связывающего белка АСБ65 на основании сходных структурных, иммунохимических и функциональных свойств. Показана высокая консервативность белка ЦСБ67 и транскрипционных систем, выделенных из растений Класса Однодольных (Hordeum vulgare L.) и Класса Двудольных (Arabidopsis thaliana L.). Показано сходство структурных и функциональных свойств двух изоформ аденозинкиназы Arabidopsis thaliana L. (At3g09820 и At5g03300). Изучена степень сродства белков аденозинкиназ Hordeum vulgare L. к различным производным цитокининов и гомологичным им молекулам in vitro. В частности, обнаружено, что аденозинкиназа Hordeum vulgare L. не связывает синтетический цитокинин 6-БАП. Впервые показано, что тиаминаза Arabidopsis thaliana L. связывает цитокинин транс-зеалин in vitro.

Практическое значение работы. Метаболизм фитогормонов и механизм их действия исследуется для понимания того, как реализуется онтогенетическая программа растения и как растение реагирует на внешние воздействия. Эти знания крайне важны для решения практических задач биотехнологии и сельского хозяйства, то есть для получения полезных продуктов растительного происхождения в поле, в лаборатории и в заводских условиях.

В ходе проведения данной работы были разработаны и утверждены методические указания для определения индивидуальной чувствительности к пищевым продуктам (в частности, растительного происхождения) мелких домашних и сельскохозяйственных животных.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на V Съезде Общества физиологов растений, Пенза, 15-21 сент. 2003г, на Международной научной конференции «Ломоносов-2008», Москва, 7-11 апр. 2008г, а также на III Всероссийской конференции-школе «Высокореакционные интермедиаты химических реакций и биологических процессов», Астрахань, 14-17 авг. 2008г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи, 3 тезиса докладов, а также 1 методические указания.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов, одного приложения и списка литературы.

Работа изложена на 106 страницах машинописного текста и содержит 13 рисунков и 9 таблиц. В списке литературы 179 наименований.

Содержание диссертации

Введение

Содержит краткое обоснование выбора диссертационной темы, в нем сформулирована цель работы, приведены основные положения, отражена научная новизна, представлена структура и общее содержание работы.

Первая глава

В первой главе на основе анализа научной литературы обсуждаются: -современные представления о роли группы фитогормонов цитокининов в жизнедеятельности растений;

-современные представления о передаче сигнала цитокининов в растении с помощью мембранного рецептора и о структуре двухкомпонентной системы растений;

-другие возможные пути передачи цитокининового сигнала в растении; научные факты, указывающие на существование растворимого рецептора цитокинина у растений;

-свойства растительного цитокинин-связывающего белка ЦСБ67 как возможного кандидата на растворимый рецептор к цитокинину;

-роль ферментов метаболизма цитокининов (синтеза, распада и модификации), в частности аденозинкиназ, в передаче гормонального сигнала и жизнедеятельности растительной клетки;

-цитокинин-связывающие белки растений: их изучение, выделение и функции;

-гормон-связывающие глютатион-трансферазы и их роль в растении. Вторая глава

Содержит описание объектов и методов исследования: Объектами исследования были выбраны растения с расшифрованными последовательностями генома: Arabidopsis thaliana L., экотип Colombia (3 и 6-недельные розетки листьев); Oryza sativa L., сорт «Юпитер» (листья 4-х недельных растений). Также в качестве объектов

использовались Hordeum vulgare L., сорт «Луч» (закончившие рост 9-10-дневные листья первого яруса); Vigna radiata L. (3-х дневные этиолированные проростки).

Применялось несколько схем выделения белков. Для выделения цитокинин-связывающих белков сначала проводили гель-фильтрацию экстракта из цитозоли или ядер растений на сефадексе G-50 и гидрофобную хроматографию на фенил-сефарозе, затем раствор белков наносили на специально синтезированные аффинные смолы зеатинрибозид-сефарозу или глютатион-сефарозу. Цитокинин-связывающие белки вытесняли с зеатинрибозид-сефарозы неспецифически щелочью или специфически: гормонами и лигандами. в низкой концентрации (0,5-5мМ), чтобы предупредить неспецифическое вытеснение, связанное с увеличением ионной силы раствора. Очищенные таким образом белки тестировались методом твердофазного иммуноферментного анализа на нитроцеллюлозной мембране или полистироловом планшете с помощью антиидиотипических антител к транс-зеатину, антиидиотипических антител к ИУК, антител на пептид N-конца АСБ65 (CASTKRVLV). Антиидиотипические антитела являются вторичными антителами к антителам на гормон и представляют собой антитела к гормон-связывающему участку белка.

Для поиска новых цитокинин-связывающих белков Arabidopsis thaliana L. и Oryza sativa L. проводилось специфическое вытеснение белков этих растений с зеатинрибозид-сефарозы цитокинином транс-зезхкти в низкой концентрации (1мМ), электрофорез в денатурирующих условиях полученной цитокинин-связывающей фракции белков. Идентификация белков по результатам MALDI масс-спектрометрии белковых полос осуществлялась с использованием поисковой системы Mascot (www.matrixscience.com) в доступной базе данных NCBInr для Arabidopsis thaliana L. и Oryza sativa L.

Для определения степени сродства белков аденозинкиназ Hordeum vulgare L. к различным производным цитокининов и другим молекулам, проводилась вытеснение этими лигандами в равной концентрации (0,5мМ) белков с аффинной смолы зеатинрибозид-сефарозы.

Третья глава

Содержит результаты проведенных исследований и их обсуждение.

3.1. Взаимодействие ЦСБ67 с антителами к консервативной последовательности гистидинкиназ.

К настоящему времени описано семейство мембранных гибридных гистидинкиназ Arabidopsis thaliana L. (АНК2, АНКЗ, АНК4), причем одна из них (CRE1/WOL/AHK4) является мембранным рецептором цитокинина. Поликлональные антитела на консервативный пептид гистидинкиназ не взаимодействовали с выделенным ЦСБ67 (см. рис.2, трек 5). Кроме того, в отличие от гистидинкиназ АНК, ЦСБ67 не является мембранным белком. Таким образом, ЦСБ67 не относится к белкам класса гистидинкиназ.

3.2. Изучение свойств цитокинин-связывающего белка ЦСБ67 и ауксин-связывающего белка АСБ65 Джонса.

ЦСБ67 из 10-дневных листьев Hordeum vulgare L., полученный путем неспецифического вытеснения щелочью с зеатинрибозид-сефарозы, взаимодействовал с антителами на пептид АСБ65, а также с антиидиотипическими антителами к И УК (рис.2). Также был выделен АСБ65 из 3-дневных этиолированных проростков Vigna radiata L. по методу Джонса, с помощью очистки на Q-сефарозе, который взаимодействовал на иммуноблоте с антиидиотипическими антителами к транс-зеатину (рис.1). Таким образом, каждый из белков АСБ65 и ЦСБ67 содержит три идентичные иммунодетерминанты, так как взаимодействует с тремя типами используемых антител: с антиидиотипическими антителами к транс-зеатину, с антиидиотипическими антителами к И УК и с антителами на пептид АСБ65 (CASTKRVLV). При этом исключена вероятность того, что общие иммунодетерминанты сходны с бычьим сывороточным альбумином, к которому пришивались гормоны и пептид для иммунизации, так как ЦСБ67 не взаимодействует с антителами к пептиду из 19 аминокислот консервативного домена гистидинкиназ (рис.2), которые также были получены иммунизацией кроликов конъюгатом пептида с бычьим сывороточным альбумином.

Так как АСБ65 задерживается глютатион-сефарозой и N-концевая последовательность АСБ65 высоко гомологична некоторым из растительных глютатион-трансфераз, было сделано предположение, что ЦСБ67 также будет связываться с глютатион-сефарозой. С помощью глютатион-сефарозы была получена фракция белков из ядер 10-дневных листьев Hordeum vulgare L., связавшаяся с этой смолой и специфически вытесняемая со смолы восстановленным глютатионом в низкой концентрации (5мМ). Эта фракция использовалась для выделения

цитокинин-связывающих белков с помощью аффинной хроматографии на зеатинрибозид-сефарозе с неспецифическим вытеснением щелочью. В результате был получен белок, который определен как ЦСБ67 (рис.3), поскольку он взаимодействовал с антиидиотипическими антителами к транс-зеалину, а также усиливал синтез РНК in vitro до 300% в совокупности с транс-зеагтном в транскрипционной системе, содержащей хроматин и связанную с ним РНК-полимеразу 1 из листьев Hordeum vulgare L. Следовательно, ЦСБ67 является глютатион-связывающим белком.

Рис. 1. 1-4: очистка АСБ65 Vigna radiata L., электрофорез в ДДС-Na-ПААГ, окраска серебром; 5-7: иммуноблоты очищенного АСБ65. 1-маркеры; 2 - фракция, осажденная сульфатом аммония; 3 - фракция после очистки на фенил-сефарозе; 4 - фракция после очистки на Q-сефарозе; 5 -антитела к пептиду АСБ65; 6 - антиидиотипические антитела к ИУК; 7 -антиидиотипические антитела к транс-зеатину.

Было проведено определение глютатион-трансферазной активности очищенного ядерного и цитозольного ЦСБ67 в реакции с субстратом CDNB in vitro. Ферментативной активности обнаружено не было (табл.1). Для АСБ65 также известно, что он не проявляет глютатион-трансферазной активности с CDNB, однако показывает незначительную активность (120% по сравнению с контролем) с субстратом металохлором. Таким образом, нельзя исключать, что АСБ65 и ЦСБ67 обладают глютатион-трансферазной активностью с другими субстратами. Также вероятно, что

они теряют способность проявлять глютатион-трансферазную активность в результате модификации белков при их выделении.

Рис. 2. ЦСБ67 Hordeum vulgare L. 1: электрофорез в ДДСЖа-ПААГ, окраска Кумасси; 2-5: иммуноблоты очищенного ЦСБ67. 1 - очищенный ЦСБ67; 2 - антиидиотипические антитела к транс-зеатину; 3 - антитела к пептиду АСБ65; 4 - антиидиотипические антитела к ИУК; 5 - антитела к консервативной последовательности гистидинкиназ.

Рис. 3. Очистка ЦСБ67 из ядер Hordeum vulgare L. с помощью глютатион-сефарозы. 1-3: электрофорез в ДДС-Ыа-ПААГ, окраска серебром, 4: иммуноблот. 1 - белок ядер Hordeum vulgare L.,2- фракция после очистки на глютатион-сефарозе, 3 - фракция после очистки на

зеатинрибозид-сефарозе; 4 - иммуноблот выделенного белка с антиидиотипическими антителами к «pawc-зеатину.

В результате проведенных исследований было сделано предположение, что АСБ65 и ЦСБ67 принадлежат к одному классу растительных белков, т.к. обладают одинаковыми структурными и функциональными характеристиками и, таким образом, они являются аналогичными белками, выделенными из разных видов растений, Hordeum vulgare L. и Vigna radiata L.

Табл. 1. Глютатион-трансферазная-активность ЦСБ67, выделенного из ядер Hordeum vulgare L. и из цитозоли Hordeum vulgare L., с субстратом CDNB (данные усреднены по 10 повторностям)._

Контроль ЦСБ67 из ядер ЦСБ67 из цитозоли

Оптическая плотность, 340 нм 0,180 0,189 0,182

Значения в %, относительно контроля 100 105 101

На основании того, что ЦСБ67 и АСБ65 имеют одинаковые свойства, также было сделано предположение, что ЦСБ67 связывает не только гормон цитокинин, но и ауксин. Для выяснения того, связываются цитокинин и ауксин одним участком ЦСБ67 или разными, проведилось вытеснение антиидиотипических антител к транс-зеатину с помощью транс-зеатина и ИУК в системе конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа на микропланшетах. При увеличении концентрации транс-зеатина уже до 10"8М, он практически полностью вытеснял антиидиотипические антитела к транс-зеатину (рис.4). Тогда как ИУК во всем исследуемом диапазоне концентраций 10"9-10"5М не вытесняла антиидиотипические антитела к транс-зеатину. Следовательно, если ЦСБ67 связывает гормоны транс-зеатин и ИУК, то связывание осуществляется разными участками этого белка.

Антитела на пептид 1Ч-конца белка АСБ65 САЯТКНУЬУ не вытеснялись /я/?дис-зеатином и ИУК во всем исследуемом диапазоне концентраций гормонов (10"9-10"5М) в системе конкурентного твердофазного ИФА (рис.5). Это говорит о том, что участок ЦСБ67,

гомологичный пептиду САЗТККУЬУ и взаимодействующий с антителами на пептид АСБ65, не участвует в связывании ауксина и цитокинина.

О490

0,5 - и

0,3 - ;

0,1 - | ;

— — — — —.I...,

НзО 10р 10 ® Ю-7 10 б 10'5 Концентрация гормона

Рис. 4. Вытеснение антиидиотипических антител к транс-зегстну, связанных с ЦСБ67 Hordeum vulgare L., траис-зеагяяом (серые столбики) и ИУК (черные столбики).

Концентрация гормона

Рис. 5. Вытеснение антител к пептиду АСБ65, связанных с ЦСБ67 Hordeum vulgare L., транс-зеатином (серые столбики) и ИУК (черные столбики).

ЦСБ67 и АСБ65 связывают восстановленный глютатион, гомологичны растительным глютатион-трансферазам класса phi, при этом не обнаружена глютатион-трансферазная активность ЦСБ67 и АСБ65 с

субстратом CDNB in vitro. Однако надо отметить, что в отличие от большинства глютатион-трансфераз, для которых характерна молекулярная масса 24-26кДа, АСБ65 и ЦСБ67 имеют молекулярную массу 65-67кДа.

Согласно данным последних лет, глютатион-трансферазы являются не просто участниками в детоксикации ксенобиотиков, а полифункциональными белками с самыми разнообразными функциями. Предполагаются следующие функции связывания гормонов ауксинов и цитокининов растительными глютатион-трансферазами: 1) участие в передаче гормонального сигнала в растении путем гормон-зависимого связывания с протеинкиназами, возможность чего показано на глютатион-трансферазах животных; 2) участие в транспорте гормонов; 3) защита гормонов от метаболизации неспецифическими оксидазами путем его обратимого связывания; 4) регуляция уровня свободного гормона внутри клетки путем его обратимого связывания; 5) модуляция ферментативной активности глютатион-трансфераз гормоном in vivo.

3.3. Изучение активации транскрипции белком ЦСБ67 in vitro.

Ранее было показано, что ЦСБ67 в совокупности с транс-хаттюм усиливает синтез РНК in vitro в 2-3 раза в транскрипционной системе, содержащей хроматин и связанную с ним РНК-полимеразу I из листьев Hordeum vulgare L. Согласно результатам данной работы, ЦСБ67 из ядер 6-недельных розеток листьев Arabidopsis thaliana L. усиливает синтез РНК in vitro более чем в 3 раза в совокупности с /яр<з«с-зеатином в транскрипционной системе, содержащей хроматин и связанную с ним РНК-полимеразу I из листьев Hordeum vulgare L. (табл.2). Таким образом, цитокинин-связывающие белки ЦСБ67, выделенные из разных системных групп растений (Hordeum vulgare L. - Класс Однодольные; Arabidopsis thaliana L— Класс Двудольные) являются консервативными, а также консервативны транскрипционные системы, выделенные из этих объектов.

Выделенный с помощью глютатион-сефарозы и зеатинрибозид-сефарозы из ядер 10-дневных листьев Hordeum vulgare L., ЦСБ67 усиливал синтез РНК in vitro до 300% в совокупности с транс-зеатином в транскрипционной системе, содержащей хроматин и связанную с ним РНК-полимеразу I из листьев Hordeum vulgare L

АСБ65, выделенный с помощью преципитации сульфатом аммония, фенил-сефарозы, Q-сефарозы, не усиливал синтез РНК in vitro в совокупности с транс-зеатином в транскрипционной системе,

содержащей хроматин и связанную с ним РНК-полимеразу I из листьев Hordeum vulgare L. Предполагается, что полученный таким образом белок не был активен, так как в схеме его очистки применялось осаждение сульфатом аммония.

После предобработки ЦСБ67 в эквимолярном количестве реактивом Эллмана, блокирующим свободные SH-группы и добавлении его в систему транскрипции in vitro, усиления транскрипции не наблюдалось (табл.2). Сделано предположение, что для проявления активности ЦСБ67, необходимы его свободные SH-группы.

Таблица 2. Влияние ЦСБ67 из ядер 6-недельных розеток листьев Arabidopsis thälianaL. на синтез РНК in vitro в транскрипционной системе, содержащей хроматин и связанную с ним РНК-полимеразу I из листьев Hordeum vulgare L.

ЦСБ67, нг транс-зеатин, 10"7М Включение [Н3] УМФ

Имп/мин на 10 мкг ДНК %

- - 26784 10

- + 25844 97

20 - 30773 115

20 + 97891 319

40 + 79338 297

20 (предобработан реактивом Эллмана) 19980±486 75

20 (предобработан реактивом Эллмана) + 18962±531 71

3.4. Поиск и идентификация новых цитокинин-связывающих белков Arabidopsis thaliana L. и Oryza sativa L.

Была проведена очистка белков, специфически связывающих транс-зеатин, из растений с расшифрованной последовательностью генома: 4-недельных листьев Oryza sativa L. и 3-недельных розеток листьев Arabidopsis thaliana L. В отличие от схемы очистки для ЦСБ67, где белки с аффинной смолы зеатинрибозид-сефарозы неспецифически вытеснялись щелочью, в данном случае проводилась специфическое вытеснение — раствором транс-зеатина в низкой концентрации (1мМ). Таким образом,

можно однозначно заключить, что полученные белки являются цитокинин-связывающими in vitro.

С помощью масс спектрометрии белковых полос цитокинин-связывающей фракции, для Arabidopsis thaliana L. в полосах 150, 80, 45, 42кДа (рис.6) была идентифицирована смесь двух изоформ белков аденозинкиназ: АДК1 (ген At3g09820) и АДК2 (At5g03300). При этом для АДК1 и АДК2 в этих полосах счёт составлял от 82 до 182 (при достоверно значимом счёте более 60), за исключением полосы 80кДа, где счет был 42 для АДК2 и 40 для АДК1, и другие белки для этой полосы также не были достоверно определены. Белки АДК1 и АДК2 во всех полосах, где были идентифицированы, присутствовали в смеси. Об этом говорит тот факт, что среди определенных пептидов, были как общие для родственных белков АДК1 и АДК2, так и специфические только для АДК1 или АДК2. Так, например, в полосе для Arabidopsis thaliana L. 42кДа было определено 10 пептидов, общих для АДК1 и АДК2; 7 пептидов, специфических только для АДК2; 6 пептидов, специфических только для АДК1. Таким образом, в полосах 150, 80, 45, 42кДа белки АДК1 и АДК2 присутствуют в смеси, т.е. оба этих белка имеют сходные структурные свойства и являются цитокинин-связывающими in vitro.

97 кДа 66 ""■"Т? шш if'" J < 4 150 кДа ч— 80

45 ч— 45 42

30 ***** ч- 32 28

1 2

Рис. 6. Выделение цитокинин-связывающих белков из 3-недельных розеток листьев Arabidopsis АаНапа Ь.. Электрофорез в ДДС-Ыа-ПААГ, окраска серебром. 1 — маркеры; 2 — фракция, вытесненная с зеатинрибозид-сефарозы транс-зеатином 1мМ.

Для Oryza sativa L. был выявлен и достоверно определен белок аденозинкиназа с молекулярной массой 42кДа (0s02g0625500) (рис.7). Тогда как для Arabidopsis thaliana L. с помощью аффинной смолы зеатинрибозид-сефарозы очищались белки АДК1 и АДК2 в смеси, то для Oryza sativa L. с помощью метода фингерпринта была определена только одна из двух аденозинкиназ, чьи гены присутствуют в геноме. Можно предположить, что ген второй аденозинкиназы Oryza sativa L. (0s04g0518000) не экспрессируется в растении, или его продукт не выделятся с помощью используемой для очистки схемы, так как его структурные и функциональные свойства значительно отличаются от продукта гена 0s02g0625500.

gjt¡

1 2

Рис. 7. Выделение цитокинин-связывающих белков из 30-дневных листьев Oryza sativa L. Электрофорез в ДДС-Na-IIAAr, окраска серебром. 1 - маркеры; 2 - фракция, вытесненная с зеатинрибозид-сефарозы транс-зеатином 1мМ.

Ранее было показано, что аденозинкиназы связываются с зеатин-сефарозой и вытесняются с нее транс-зеятшюм, фосфорилируют аденозин, дигидрозеатин, изопентениладенин, зеатинрибозид in vitro. Роль связывания ферментами аденозинкиназами цитокининов может заключаться: в преобразовании рибозидов и оснований цитокининов в соответствующие нуклеотиды, что происходит, например, при добавлении экзогенных цитокининов; в поддерживании оптимального уровня активных форм цитокининов в клетке; в обеспечении регуляции метаболизма цитокининов, связанного с клеточным циклом растительных

клеток. Белки аденозинкиназы являются белками «домашнего хозяйства», их гены экспрессируются конститутивно, белки присутствуют в клетках в значительном количестве и являются абсолютно необходимыми для обеспечения жизнедеятельности клетки.

Белок полосы 32кДа Arabidopsis thaliana L. предположительно определен как протеинкиназа НТ1 (ген Atlg62400).

Белок полосы 28кДа Arabidopsis thaliana L. достоверно определен как тиаминаза (ген At3gl6990). Ген At3gl6990 соответствует гибридному эукариотическому белку ThiD-TenA, который содержит на С-конце фрагмент, схожий с бактериальным активатором транскрипции (ТепА), и на N-конце фрагмент, родственный НМР-Р киназам, вовлеченным в биосинтез тиамина/витамина B1 (ThiD). Тиаминазы растений не изучены, известна третичная структура тиаминазы, в результате определения которой исследователями была обнаружена плотность в структуре белка, которая вставлена между двумя ароматическими кольцами и имеет размер и форму пурина или индола. Было сделано предположение, что плотность может образовывать молекула растительного гормона - цитокинина или ауксина, что согласуется с полученными нами данными о связывании тиаминазой гормона транс-гегашт in vitro. Физиологический смысл этого связывания остается неизвестным.

3.5. Вытеснение белка аденозинкиназы Hordeum vulgare L. с зеатннрибозид-сефарозы различными производными цитокининов и гомологичными им молекулами.

Фракция гидрофобных белков из 10-дневных листьев Hordeum vulgare L. наносилась зеатинрибозид-сефарозу. Специфическое вытеснение аденозинкиназы проводилась в промывочном растворе с добавлением лиганда в концентрации 0,5-1мМ.

На рис.8 и рис.9 видно, что транс-зегтт и АТФ вытесняли сходное количество белка аденозинкиназы с зеатинрибозид-сефарозы. Может существовать два объяснения этому факту: АТФ и транс-зегтт связываются в одном месте аденозинкиназы, и добавление свободного АТФ в вытесняющий раствор вытесняет /иранс-зеатин из места связывания, освобождая белок. Также возможно, что связывание АТФ и /ираяс-зеатина осуществляется в разных местах, и вытеснение с помощью АТФ происходит в результате изменения конформации белка при связывании АТФ с АТФ-связывающим участком. Количество вытесненного со смолы белка прямо пропорционально количеству добавленного в вытесняющий раствор лиганда, причем степень точности

достаточно высока (см. рис.8, 9). Таким образом, количество белка аденозинкиназы, вытесненного со смолы лигандом, пропорционально двум факторам: количеству добавленного в вытесняющий раствор лиганда, а также степени сродства лиганда к белку.

Было проведено вытеснение белков аденозинкиназ Hordeum vulgare L. с зеатинрибозид-сефарозы с помощью различных производных цитокининов и гомологичных им молекул в концентрации 0,5мМ (см. рис.10, 11). Количество белка аденозинкиназы, вытесненного транс-зеатином было принято за 100%. Данные обработаны с помощью программы IDScan EX.

1 2 3 4 5

Рисунок 8. Вытеснение аденозинкиназы Hordeum vulgare L. с зеатинрибозид-сефарозы добавлением транс-зеатина и АТФ в разных концентрациях: 1 - транс-зеатин 1мМ; 2 - АТФ 1мМ; 3 - транс-зеатин 0,5мМ; 4 - АТФ 0,5мМ; 5 - контроль (промывочный раствор). Электрофорез в ДДС-Ыа-ПААГ, окраска серебром.

Рисунок 9. Относительное количество вытесненного белка аденозинкиназы Hordeum vulgare L (по данным рис.9). Количество белка, вытесненного /яраяс-зеатином 1мМ, принято за 100%. 1 - транс-зеатт 1мМ; 2 - АТФ 1мМ; 3 - транс-зеатш 0,5мМ; 4 - АТФ 0,5мМ; 5 - контроль.

Согласно полученным результатам, аденозинкиназа Hordeum vulgare L. имеет сходную степень сродства к mpancstатину и зеатинрибозиду, а

также к аденину и аденозину, т.е. появление рибозной группы в молекуле пурина не влияет на степень сродства белка с гормоном, что согласуется с функцией аденозинкиназы - фосфорилированием рибозидов с использованием АТФ в качестве донора фосфорила, и свободных оснований производных аденина с использованием фосфорибозила. Таким образом, наличие или отсутствие рибозного остатка в молекуле пурина не изменяет значимо степень сродства белка к лиганду.

123456789

Рисунок 10. Вытеснение аденозинкиназы Hordeum vulgare L., связанной с зеатинрибозид-сефарозой, различными лигандами (0,5мМ): 1 -зеатинрибозид; 2 - аденозин; 3 - АТФ; 4 - транс-зеатин; 5 - аденин; 6 - 6-БАП; 7 -ГТФ; 8 -УТФ; 9 - контроль (промывочный раствор). Электрофорез в ДДС-Na-nAAr, окраска серебром.

о

123456789

Рисунок 11. Относительное количество вытесненного белка аденозинкиназы Hordeum vulgare L. (по данным рис.Ю). Количество белка, вытесненного /яране-зеатином 0,5 мМ, принято за 100%. 1 -зеатинрибозид; 2 - аденозин; 3 - АТФ; 4 - транс-зеатин; 5 - аденин; 6 - 6-БАП; 7 -ГТФ; 8 -УТФ; 9 - контроль.

Аденин и аденозин, которые считаются классическим субстратом аденозинкиназы, снимают примерно в 4 раза меньше белка, чем транс-

зеатин и его производные. Известно, что субстратом аденозинкиназы in vitro являются аденозин и некоторые производные цитокининов (дигидрозеатин, изопентениладенин, зеатинрибозид), но активность фермента с использованием в качестве субстратов цитокининов, ниже, чем с использованием аденозина. Согласно полученным нами результатам, аденозинкиназа связывает транс-зеатин с большей степенью сродства, чем аденозин.

Синтетический цитокинин 6-БАП не вытесняет белок аденозинкиназу с зеатинрибозид-сефарозы. Следовательно, в результате замены боковой группы транс-зеатина на бензольное кольцо, нарушается связывание белка с лигандом, при этом отсутствие радикала в этом положении (как у аденина) уменьшает сродство белка к лиганду примерно в 4 раза, но не полностью. Это согласуется с тем, что искусственный цитокинин 6-БАП вызывает физиологический эффект в растении (вероятно, путем взаимодействия с цитокининовыми рецепторами), однако в отличие от натуральных цитокининов, 6-БАП является высоко стабильным в растении. Можно предположить, что такая особенность объясняется тем, что 6-БАП не используется в качестве субстрата ферментами метаболизма цитокининов, в частности, не фосфорилируется аденозинкиназой.

ГТФ вытесняет со смолы примерно в 3 раза и УТФ в 2 раза меньше аденозинкиназы, чем АТФ. Т.е., сродство белка к другим нуклеотидам значительно ниже по сравнению со сродством к АТФ.

Выводы

1. Установлено, что ЦСБ67 Hordeum vulgare L. не имеет структурного сродства с мембранным рецептором цитокининов гистидинкиназой С RE 1 /WOL/AHK4 Arabidopsis thaliana L..

2. Установлено, что цитокинин-связывающий белок ЦСБ67 Hordeum vulgare L. и ауксин-связывающий белок Джонса Vigna radiata L. имеют сходные структурные и функциональные свойства, а именно: молекулярную массу, три общие иммунодетерминанты, связывание глютатиона, отсутствие глютатион-трансферазной активности.

3. Обнаружено сродство и возможная идентичность ЦСБ67 Hordeum vulgare L. и АСБ65 Vigna radiata L, а также способность ЦСБ67 связывать гормон ауксин.

4. Установлена функциональная идентичность ЦСБ67 и транскрипционных систем, выделенных из растений, относящихся к разным таксономическим группам: Классу Однодольных (Hordeum vulgare L.) и Классу Двудольных (Arabidopsis thaliana L.).

5. Определена первичная структура цитокинин-связывающих белков Arabidopsis thaliana L.: АДК1 (At3g09820), АДК2 (At5g03300), тиаминазы (At3gl6990) и предположительно протеинкиназы НТ1 (Atlg62400); а также цитокинин-связывающего белка Oryza sativa L.: АДК (0s02g0625500).

6. Определена степень сродства цитокинин-связывающего белка аденозинкиназы Hordeum vulgare L, к природному цитокинину: зеатинрибозиду, синтетическому цитокинину: б-БАП, а также к производным аденина и нуклеотидам: аденину, аденозину, АТФ, ГТФ; УТФ, по сравнению со сродством к природному /пранс-зеатину.

к

Публикации по материалам диссертационной работы

1. Кулаева О.Н., Прокопцева О.С. Новейшие достижения в изучении механизма действия фитогормонов // Биохимия. 2004. Т.69. №3. С. 293-311.

2. Мейчик Н.Р., Ермаков И.П., Прокопцева О.С. Диффузия органического катиона в клеточных стенках корня // Биохимия. 2003. Т. 68. №7. С. 926-940.

3. Selivankina S.Yu., Karavaiko N.N., Maslova G.G., Zubkova N.K., Prokoptseva O.S., Smith A.R., Hall M.A., Kulaeva O.N. (2004) Cytokinin-binding protein from Arabidopsis thaliana leaves participating in transcription regulation // Plant Growth Regulation. V. 43. pp. 15-26.

4. Прокопцева О.С., Каравайко H.H., Селиванкина С.Ю., Зубкова Н.К., Кулаева О.Н. Биохимическая характеристика ядерного цитокинин-связывающего белка (67КДА) // Сборник трудов V Съезда Общества физиологов растений. С. 470. Пенза, 15-21 сент. 2003г.

5. Прокопцева О.С., Епинетов М.А., Кондаков С.Э. Очистка зеатин-связывающих белков и идентификация их генов // Сборник трудов Международной научной конференции «Ломоносов-2008». С. 292. Москва, 7-11 апр. 2008.

6. Прокопцева О.С., Епинетов М.А., Кондаков С.Э. Изучение сродства белков аденозинкиназ ячменя к производным растительных гормонов цитокининов и гомологичным им молекулам // Тез. докл. III Всероссийской конференции — школы «Высокореакционные интермедиа™ химических реакций и биологических процессов». — Астрахань - Москва. С. 20.

7. Кузьмин В.А., Святковский A.B., Прокопцева О.С., Кондаков С.Э., Короткина С.А. (2007) Метод определения индивидуальной чувствительности к пищевым продуктам и коррекции патологических состояний мелких домашних и сельскохозяйственных животных // Методические указания для ветеринарных врачей. Министерство сельского хозяйства РФ, Санкт-Петербург.

Подписано в печать 23.09.2008 г. Усл. псч. л. 1,3. Уч.-изд. л. 1,4. Тираж 100 экз. Заказ № 1574.

Опиражировано в Издательском доме «Астраханский университет» 414056, г. Астрахань, ул. Татищева, 20 E-mail: astiprcssitfyantievru Факс (8512)25-17-18, тел. 54-01-89,54-01-87

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Прокопцева, Ольга Сергеевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ

ЦЕЛЬ РАБОТЫ.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

ПУБЛИКАЦИИ.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Современные представления о роли группы гормонов цитокининов в жизнедеятельности растений.

1.2. Современные представления о передаче сигнала цитокининов с помощью мембранного рецептора. Участие двухкомпонентной системы в восприятии и передаче цитокининового сигнала.

1.3. Регуляция транскрипции цитокинином генов АЯЯ.

1.4. Другие возможные пути трансдукции цитокининового сигнала. Существование для стероидных гормонов животных двух рецепторов: мембранного и ядерного растворимого, а также научные факты, указывающие на существование растворимого рецептора цитокинина.

1.5. Свойства ЦСБ67 как возможного кандидата на растворимый рецептор к цитокинину.

1.6. Влияние ферментов метаболизма цитокининов (синтеза, распада и модификации) на ответ клеток на гормон. Возможная роль ферментов АДК и тиаминаз в метаболизме цитокининов и жизнедеятельности растительной клетки.

1.7. ЦСБ: их изучение, выделение и функции.

1.8. Гормон-связывающие глютатион-трансферазы и их роль в растении.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Объекты исследований.

2.2. Синтез аффинных матриц.

2.2.1. Синтез глютатион-сефарозы.

2.2.2. Синтез зеатинрибозид-сефарозы.

2.3. Синтез белок-содержащей аффинной матрицы АТтз-сефарозы для выделения АТа.иТЗ.

2.4. Синтез конъюгатов транс-зеатина с белком.

2.5. Получение АТа.и.

2.5.1. Получение иммунной сыворотки против зеатинрибозида

2.5.2. Определение специфичности антисыворотки против зеатинрибозида и очищенных АТтз.

2.5.3. Выделение АТтз.

2.5.4. Получение АТа.иТЗ.

2.5.5. Выделение АТа.иТЗ с помощью хроматографии на АТтз-сефарозе.

2.5.6. Выявление присутствия АТаиТЗ в системе твердофазного ИФА с иммобилизованными АТтз.

2.6. Выделение ЦСБ.

2.6.1. Выделение из листьев Hordeum vulgare L. и Arabidopsis thaliana L. растворимой цитозольной фракции белков.

2.6.2. Гель-фильтрация цитозольной растворимой фракции на сефадексе G-50.

2.6.3. Гидрофобная хроматография на фенил-сефарозе.

2.6.4. Аффинная хроматография белков на зеатинрибозид-сефарозе.

2.6.5. Выделение ядер.

2.6.6. Очистка ядерного ЦСБ67 с помощью глютатион-сефарозы и зеатинрибозид-сефарозы.

2.6.7. Очистка АСБ65 по методу А.М. Джонса, с использованием Q-сефарозы.

2.6.8. Очистка АСБ65 по методу А.М. Джонса, с использованием глютатион-сефарозы.

2.6.9. Идентификация ЦСБ методом твердофазного ИФА.

2.6.11. Определение концентрации белка.

2.7. Электрофорез белков в ДДС-Ма-ПААГ белков.

2.8. Электроперенос белков.

2.9. Иммуноблотинг.

2.10. Окрашивание электрофоретических гелей серебром.

2.11. Реакция транскрипции in vitro.

2.12. Определение глютатион-трансферазной активности ЦСБ67.

2.13. Определение количества сульфгидрильных групп с реактивом Эллмана.

2.14. Подготовка препаратов для масс спектрометрии.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Взаимодействие ЦСБ67 с антителами к консервативной последовательности гистидинкиназ.

3.2. Изучение сходства цитокинин-связывающего белка ЦСБ67 и ауксин-связывающего белка АСБ65 Джонса.

3.3. Изучение активации транскрипции in vitro ЦСБ67.

3.4. Поиск и идентификация ЦСБ Arabidopsis thaliana L. и Oryza sativa L.

3.5. Вытеснение АДК с зеатинрибозид-сефарозы различными производными цитокининов и гомологичными им молекулами.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурные и функциональные свойства цитокинин-связывающих белков растений Arabidopsis thaliana L., Hordeum vulgare L., Oryza sativa L."

Исследование гормональной регуляции жизни растений является одной из центральных задач биохимии, физиологии и молекулярной биологии растений.Это объясняется тем, что вся жизнь растительных организмов, начиная от оплодотворенной яйцеклетки и кончая отмиранием и смертью, происходит под контролем фитогормонов. Фитогормоны играют важную роль в реакции растений на внешние воздействия и в формировании устойчивости растений к экстремальным условиям. Так как растения ведут «сидячий образ жизни» и привязаны к своему ареалу, — они вынуждены приспосабливаться к изменяющимся условиям окружающей среды, например, ксенобиотикам и различным стрессам. Для раскрытия природы чувствительности клеток к гормональным сигналам исследуются свойства и структура рецепторов гормонов.Согласно современным представлениям специфический гормональный эффект обусловлен рядом событий, происходящих в результате взаимодействия гормона со специфическим белком-рецептором. Изучение механизма действия гормонов заключается в исследовании их рецепторов и процессов, приводящих к проявлению специфического гормонального эффекта. Кроме того, необходимый для воздействия уровень гормона и состав его форм поддерживается в клетке белками метаболизма гормона (ферменты синтеза, распада, модификации, которые могут преобразовать активную форму гормона в неактивную), и с помощью такого механизма также регулируется жизнедеятельность клеток и органов.Пять основных групп растительных гормонов — это ауксины, цитокинины, гиббереллины, этилен и абсцизовая кислота. Цитокининам принадлежит важная роль в течение всей жизни растений. Они участвуют в регуляции деления клеток, дифференцировке хлоропластов, индуцируют стеблевой морфогенез, задерживают старение листьев, участвуют в регуляции углеводного метаболизма в растении, с их помощью корневая система б регулирует функциональную активность в надземных органах, в частности, в листьях.Для цитокининов к настоящему времени известны мембранный рецептор гистидинкиназа CRE1/AHK4/WOL (Inoue et al., 2001; Ueguchi et al., 2001), воспринимающий внешний по отношению к клетке гормон. Он участвует в активации ядерных генов первичного ответа (ARR типа А) цитокинином (Sakakibara et al., 1998; D'Agostino et al., 2000). Кроме того, известны факты, которые говорят о существовании другого пути передачи цитокининового сигнала. В связи с этим были обнаружены ядерные цитокинин-связывающие белки, способные в присутствии цитокинина активировать транскрипцию in vitro в транскрипционных системах, содержащих выделенные ядра или препараты хроматина (Каравайко и др., 1995; Kulaeva et al., 1995; Kulaeva et al., 2000), и сделано предположение, что эти белки - возможные кандидаты на роль внутриклеточных рецепторов цитокинина, подобно ядерным рецепторам стероидных гормонов животных (Hall et al., 2001).Обнаружение как мембранного, так и кандидата в ядерные растворимые рецепторы цитокинина, говорит о сложности системы восприятия цитокининового сигнала и приводит к вопросу о разделении функций между этими рецепторами. Так как мембранный рецептор цитокинина в основном локализован в корне, возможно, что в надземной части рецепция цитокинина происходит с помощью других белков. Возможно также, что мембранный и растворимый рецепторы цитокинина необходимы одновременно в клетке, как это показано для стероидных гормонов животных. Мембранные рецепторы стероидных гормонов животных индуцируют быстрые ответы (синтез вторичных передатчиков (мессенджеров) и активация сигнальных каскадов), ядерные рецепторы — более медленные (усиление или ослабление транскрипции определенных генов). Ядерные рецепторы стероидных гормонов млекопитающих контролируют экспрессию генов-мишеней через образование гормон-рецепторного комплекса, который связывается с промоторами генов. В некоторых случаях показано взаимодействие между мембранными и ядерными рецепторами. Для растений на настоящий момент такие данные отсутствуют.На примере наиболее изученных стероидных гормонов животных показано, что характер, направленность, длительность действия гормона на клетки и ткани определяется: 1. типом и количеством рецепторных белков в клетках и тканях, а также балансом белков коактиваторов и корепрессоров в данном типе клеток и тканей, с помощью которых растворимые рецепторы стероидных гормонов действуют на промоторы; 2. посттрансляционными модификациями рецепторов гормонов, коактиваторов и корепрессоров гормонов; 3. взаимодействием рецепторов различных гормонов между собой, активацией или репрессией друг друга. На растениях данные о механизмах взаимодействия различных сигналов пока ограничены, но на уровне физиологических эффектов хорошо известно взаимодействие цитокинина и ауксина, цитокинина и АБК и т.д.; 4. количеством и составом форм гормона (различных по активности), что определяется ферментами синтеза, распада и модификации гормона.Разнообразие перечисленных параметров объясняет существование таких явлений, как: полифункциональность гормонов, компетентность клеток к гормону, различие ответов на гормон разными тканями (Розен, 1994).Для понимания того, как гормональный цитокининовый сигнал регулирует рост и развитие растительного организма, проводится изучение белков-рецепторов цитокинина, а также цитокинин-связывающих белков с другими функциями. В связи с этим ЦЕЛЬЮ РАБОТЫ было дать комплексную оценку структурных и функциональных свойств цитокинин-связывающих белков растений Arabidopsis thaliana L., Hordeum vulgare L., Oryza sativa L.В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи: 1. Оценить структурное сродство цитокинин-связывающего белка ЦСБ67 Hordeum vulgare L. и мембранного рецептора цитокининов -гистидинкиназы CRE1/WOL/AHK4 Arabidopsis thaliana L..2. Сравнить структурные и функциональные свойства цитокининсвязывающего белка ЦСБ67 Hordeum vulgare L. и ауксин-связывающего белка Джонса АСБ65 Vigna radiata L.3. Оценить функциональную идентичность ЦСБ67 и транскрипционных систем, выделенных из растений, относящихся к разным таксономическим группам: Классу Однодольных (Hordeum vulgare L.) и Классу Двудольных (Arabidopsis thaliana L.).4. Определить структуру новых обнаруженных цитокининсвязывающих белков растений Arabidopsis thaliana L.n Oryza sativa L.5. Сравнить степень сродства цитокинин-связывающего белка аденозинкиназы Hordeum vulgare L. к природному цитокинину транс-зехтну со сродством к природному цитокинину зеатинрибозиду, синтетическому цитокинину 6-БАП, производным аденина и нуклеотидам: аденину, аденозину, АТФ, ГТФ, УТФ. Научная новизна. В результате проведения данной работы впервые было показано, что ЦСБ67 не имеет структурного сродства с мембранным рецептором цитокининов - гистидинкиназой CRE1/WOL/AHK4. Впервые сделано предположение о возможной идентичности цитокинин-связывающего белка ЦСБ67 и ауксин-связывающего белка АСБ65 на основании сходных структурных, иммунохимических и функциональных свойств. Показана высокая консервативность белка ЦСБ67 и транскрипционных систем, выделенных из растений Класса Однодольных {Hordeum vulgare L.) и Класса Двудольных (Arabidopsis thaliana L.). Показано сходство структурных и функциональных свойств двух изоформ аденозинкиназы Arabidopsis thaliana L. (At3g09820 и At5g03300). Изучена степень сродства белков аденозинкиназ Hordeum vulgare L. к различным производным цитокининов и гомологичным им молекулам in vitro. В частности, обнаружено, что аденозинкиназа Hordeum vulgare L. не связывает синтетический цитокинин 6-БАП. Впервые показано, что тиаминаза Arabidopsis thaliana L. связывает цитокинин транс-зеашн in vitro.Практическое значение работы. Метаболизм фитогормонов и механизм их действия исследуется для понимания того, как реализуется онтогенетическая программа растения и как растение реагирует на внешние воздействия. Эти знания крайне важны для решения практических задач биотехнологии и сельского хозяйства, то есть для получения полезных продуктов растительного происхождения в поле, в лаборатории и в заводских условиях.В ходе проведения данной работы были разработаны и утверждены методические указания для определения индивидуальной чувствительности к пищевым продуктам (в частности, растительного происхождения) мелких домашних и сельскохозяйственных животных.Апробация работы. Результаты работы были представлены на V Съезде Общества физиологов растений, Пенза, 15-21 сент. 2003г, на Международной научной конференции «Ломоносов-2008», Москва, 7-11 апр. 2008г, а также на III Всероссийской конференции-школе «Высокореакционные интермедиаты химических реакций и биологических процессов», Астрахань, 14-17 авг. 2008г.Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи, 3 тезиса докладов, а также 1 методические указания.Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов и

Заключение Диссертация по теме "Ботаника", Прокопцева, Ольга Сергеевна

выводы

1. Установлено, что ЦСБ67 Hordeum vulgare L. не имеет структурного сродства с мембранным рецептором цитокининов гистидинкиназой CRE1 /WOL/AHK4 Arabidopsis thaliana L.

2. Установлено, что цитокинин-связывающий белок ЦСБ67 Hordeum vulgare L. и ауксин-связывающий белок Джонса Vigna radiata L. имеют сходные структурные и функциональные свойства, а именно: молекулярную массу, три общие иммунодетерминанты, связывание глютатиона, отсутствие глютатион-трансферазной активности.

3. Обнаружено сродство и возможная идентичность ЦСБ67 Hordeum vulgare L. и АСБ65 Vigna radiata L., а также способность ЦСБ67 связывать гормон ауксин.

4. Установлена функциональная идентичность ЦСБ67 и транскрипционных систем, выделенных из растений, относящихся к разным таксономическим группам: Классу Однодольных {Hordeum vulgare L.) и Классу Двудольных {Arabidopsis thaliana L.).

5. Определена первичная структура цитокинин-связывающих белков Arabidopsis thaliana L.\ АДК1 (At3g09820), АДК2 (At5g03300), тиаминазы (At3gl6990) и предположительно протеинкиназы НТ1 (Atlg62400); а также цитокинин-связывающего белка Oryza sativa L.: АДК (0s02g0625500).

6. Определена степень сродства цитокинин-связывающего белка аденозинкиназы Hordeum vulgare L. к природному цитокинину: зеатинрибозиду, синтетическому цитокинину: 6-БАП, а также к производным аденина и нуклеотидам: аденину, аденозину, АТФ, ГТФ; УТФ, по сравнению со сродством к природному шрш/с-зеатину.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

К настоящему времени описаны десятки ЦСБ растений с различными функциями, в частности мембранный рецептор гистидинкиназа CRE1/WOL/AHK4, воспринимающий внешний по отношению к клетке гормон, который участвует в активации ядерных генов первичного ответа цитокинином. Кроме того, накопились факты, говорящие о существовании альтернативного пути передачи цитокининового сигнала и существовании ещё одного рецептора цитокининов. Одним из возможных кандидатов на роль такого рецептора цитокинина является растворимый ядерный белок ЦСБ67, который в присутствии цитокинина активирует транскрипцию in vitro в транскрипционных системах, содержащих выделенные ядра или препараты хроматина. При этом в ходе данной работы доказано, что ЦСБ67 не имеет сродства с мембранным рецептором цитокининов гистидинкиназой CRE1/WOL/AHK4, так как не взаимодействует с антителами на консервативный домен гистидинкиназ.

Обнаружение как мембранного, так и кандидата ядерного растворимого рецептора цитокинина говорит о сложности системы восприятия цитокининового сигнала и приводит к вопросу о разделении функций между этими рецепторами. Возможно, мембранный и растворимый рецепторы цитокинина необходимы одновременно в клетке, как это известно для стероидных гормонов животных. Мембранные рецепторы стероидных гормонов животных индуцируют быстрые ответы (активация сигнальных каскадов), ядерные рецепторы — более медленные (контроль экспрессии генов).

В ходе данной работы была установлена консервативность транскрипционных систем и ЦСБ67, выделенных из растений Класса Однодольных {Hordeum vulgare L.) и Класса Двудольных (Arabidopsis thaliana L.). Показано, что ЦСБ67 из ядер 6-тинедельных растений Arabidopsis thaliana L. в совокупности с транс-зеатином усиливает синтез РНК in vitro в транскрипционной системе, содержащей хроматин и связанную с ним РНК-полимеразу I из листьев Hordeum vulgare L., т.е. транскрипционные системы и ЦСБ67 из разных растений высоко консервативны.

Кроме того, цитокинин-связывающий белок ЦСБ67 и ауксин-евязывающий белок Джонса АСБ65 имеют целый ряд общих свойств, на основе чего сделано предположение о сродстве и возможной идентичности ЦСБ67 и АСБ65, а также о способности ЦСБ67 связывать гормон ауксин. Таким образом, ЦСБ67 связывает in vitro цитокинин транс-зеатин и, возможно, ауксин ИУК. С помощью конкурентного твердофазного ИФА было показано, что связывание транс-зеатина и ИУК осуществляется разными сайтами белка.

Также была проведена работа по поиску новых ЦСБ растений для для выявления новых аспектов метаболизма и передачи сигнала гормонов растений цитокининов. В результате были идентифицированы гены следующих ЦСБ Arabidopsis thaliana L.\ АДК1 (At3g09820) и АДК2 (At5g03300), тиаминаза (At3gl6990) и, предположительно, протеинкиназа НТ1 (Atlg62400). Кроме того, идентифицирован ген белка Oryza sativa L. АДК, связывающегося с зеатинрибозид-сефарозой (0s02g0625500).

Изучено сродство белков АДК из цитозоли листьев Hordeum vulgare L. к некоторым производным цитокининов и гомологичным им молекулам. Показано, что количество белка АДК, вытесненного со смолы лигандом, прямо пропорционально двум факторам: количеству добавленного в элюат лиганда, а также степени сродства лиганда к белку. Согласно полученным нами результатам, АДК связывает ш/?а«с-зеатин с большей степенью сродства, чем аденозин. 6-БАП вытесняет со смолы зеатинрибозид-сефарозы количество белка АДК, сравномое с контролем, что коррелирует с известными данными о том, что этот синтетический цитокинин не метаболизируется растением.

Полученные знания о метаболизме фитогормонов и механизме их действия важны для понимания новых аспектов реализации онтогенетической программы растения и того, как растение реагирует на внешние воздействия. Это необходимо для решения практических задач биотехнологии и сельского хозяйства, для получения полезных продуктов растительного происхождения в поле, в лаборатории и в заводских условиях.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Прокопцева, Ольга Сергеевна, Москва

1. Аберкромби Д., Алленмарк С., Араме С. Аффинная хроматография /М.: Мир, 1988. 278с.

2. Гладун A.A., Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В. Выделение и исследование функций цитокинин-связывающих белков из культуры ткани табака // Физиология и биохимия культурных растений. 1986. Т. 18 С. 333-337.

3. Зубо Я.О., Селиванкина С.Ю., Ямбуренко М.Б., Зубкова Н.К., Кулаева О.Н., Кузнецов В.В. Цитокинины активируют транскрипцию хлоропластных генов // Доклады Академии Наук. 2005. Т. 400. С. 396-399.

4. Каравайко H.H., Земляченко Я.В., Кулаева О.Н. Выделение из цитозоля листьев ячменя зеатин-связывающего белка, учавствующего в активации транс-зеатином синтеза РНК in vitro // Физиология растений. 1995. Т. 42. С. 547-554.

5. Кулаева О.Н. Цитокинины, их структура и функция // М.: Наука, 1973.-264с.

6. Кулаева О.Н., Кузнецов В.В. Новейшие достижения и перспективы в области изучения цитокининов // Физиология растений. 2002. Т. 49. С. 626-640.

7. Кулаева О.Н., Прокопцева О.С. Новейшие достижения в изучении механизма действия фитогормонов // Биохимия. 2004. Т. 69 С. 293-310.

8. Кулаева О.Н., Селиванкина С.Ю., Романко Е.Г., Николаева М.К., Ничипорович A.A. Активация цитокинином РНК-полимеразной активности в изолированных ядрах и хлоропластах // Физиология растений. 1979. Т. 26. С. 1016-1028.

9. Курсанов A.JI., Кулаева О.Н., Свешникова И.Н., Попова Э.А., Болякина Ю.П., Клячко Н.Л., Воробьева И.П. Восстановление клеточных структур и обмена веществ в желтых листьях под действием 6-бензиламинопурина// Физиология растений. 1964. Т. 11. С. 838.

10. Микулович Т.П., Хохлова В.А., Кулаева О.Н., Свешникова И.Н. Влияние 6-бензиламинопурина на изолированные семядоли тыквы // Физиология растений. 1971. Т.18. С. 98.

11. Никифоров В.Г. Структурно-функциональные исследования РНК-полимеразы (1962-2001) //Молекулярная биология. 2002. Т. 36. С. 197-207.

12. Розен В.Б. Основы эндокринологии // М: Издательство Московского университета, 1994. 384с.

13. Селиванкина С.Ю., Романко Е.Г., Овчаров А.К., Харченко В.И. Участие цитокинин-связывающих белков из листьев ячменя в активации цитокинином связанной с хроматином РНК-полимеразы // Физиология растений. 1982. Т. 29. С. 274-281.

14. Смирнов А.Н. Ядерные рецепторы мелатонина // Биохимия. 2001. Т. 66. С. 28-36.

15. Abramovitz М., Homma Н., Ishigaki S., Tansey F., Cammer W., Listowsky I. Characterization and localization of glutathione-S-transferases in rat brain and binding of hormones, neurotransmitters, and drugs // J. Neurochem. 1988. V. 50. pp. 50-57.

16. Adler V., Yin Z., Fuchs S.Y., Benezra M., Rosario L., Tew K.D., Pincus M.R, Sardana M., Henderson C.J., Wolf C.R. Regulation of JNK signaling by GSTp // EMBO J. 1999. V. 18. pp. 1321-1334.

17. Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W., Lipman, D.J. Basic local alignment search tool // J. Mol. Biol. 1990. V. 215 pp. 403-410.

18. Anantharaman V., Aravind L. The CHASE domain: a predicted ligand-binding module in plant cytokinin receptors and other eukaryotic and bacterial receptors // Trends Biochem. Sci. 2001. V. 26 pp. 579-582.

19. Bassil N.V., Mok D., Mok M.C. Partial purification of a cis-trans-isomerase of zeatin from immature seed of Phaseolus vulgaris L.ll Plant Physiol. 1993. V. 102. pp. 867-872.

20. Bers G., Garfin D. Protein and nucleic acid blotting and immunobiochemical detection // BioTechniques. 1985. V. 3. pp. 276-288.

21. Bilang J., Macdonald H., King P.J., Striim A. A soluble auxin-binding protein from Hyoscyamus muticus is a glutathione S-transferase // Plant Physiol. 1993. V. 102. pp. 29-34.

22. Bilang J., Strum A. Cloning and characterization of a glutathione S-transferase that can be photolabeled with 5-azido-indole-3-acetic acid // Plant Physiol. 1995. V. 109. pp. 253-260.

23. Bleecker A.B. Ethylene perception and signaling: an evolutionary perspective // Trends Plant Sci., (1999) 4, 269-274.

24. Bleecker A.B., Kende H. Ethylene: a gaseous signal molecule in plant // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2000. V. 16. pp. 1-18.

25. Blommel P.G., Smith D.W., Bingman C.A., Dyer D.H., Rayment I., Holden H.M., Fox B.G., Phillips G.N.J. Crystal structure of gene locus from Arabidopsis thaliana II Proteins. 2004. V. 57. pp. 221-222.

26. Brandstatter I., Kieber J. Two genes with similarity to bacterial response regulators are rapidly and specifically induced by cytokinin in Arabidopsis II Plant Cell. 1998. V. 10. pp. 1009-1020.

27. Brault M., Caiveau O., Pedron J., Maldiney R., Sotta B., Miginiac E. Detection of membrane-bound cytokinin-binding proteins in Arabidopsis cells // Eur. J. Biochem. 1999. V. 260. pp. 512-519.

28. Brinegar A.C., Stevens A., Fox J.E. Resolution of subunit composition of a cytokinin-binding protein from wheat embryos // Biol. Plantarum. 1985. V. 27. pp. 100-104.

29. Brown J.C., Prasad P., Wu M.J., Irzyk G.P., Jones A.M. Purification of a 65-kiloDalton nuclear protein with structural homology to glutathione S-transferase // Plant Sci. 1998. V. 136. pp. 227-236.

30. Buchanan-Wollaston V. The molecular biology of leaf senescence // J. Exp. Bot. 1997. V. 48. pp. 181-199.

31. Cato A.T., Nestl A., Mink S. Rapid actions of steroid receptors in cellular signaling pathways II Sci. STKE. 2002. V. 138. P. 9.

32. Chen C. and Eckert R.L. Phosphorylation of cytokinin by adenosine kinase from wheat germ II Plant Physiol. 1977. V. 59. pp. 443-447.

33. Chen C., Melitz D., Petschow B., Eckert R.L. Isolation of cytokinin-binding protein from plant tissues by affinity chromatiography // Eur. J. Biochem. 1980. V. 108. pp. 379-387.

34. Chen C.M., Jin G., Andersen B.R., Ertl I. Modulation of plant gene expression by cytokinins II J. Plant Physiol. 1993. V. 20. pp. 609-619.

35. Chen J.G., Ullah H., Young J.C., Sussman M.R., Jones A.M. ABP1 is required for organized cell elongation and division in Arabidopsis embryogenesis // Genes Dev. 2001. V. 15. pp. 902-911.

36. Chen P., Juchau M.R. Recombinant human glutathione ¿"-transferases catalyse enzymic isomerization of 13-cw-retinoic acid to all-/ram-retinoic acid // Biochem. J. 1998. V. 336. pp. 223-226.

37. Chuang C.C., Wu S.H., Chiou S.H., Chang G.G. Homology modeling of cephalopod lens S-crystallin: A natural mutant of sigma-class glutathione transferase with diminished endogenous activity //Biophys J. 1999. V. 76. pp. 679-690.

38. Coleman J.O.D. Detoxification of xenobiotics by plants: chemical modification and vacuolar compartmentation // Trends Plant Sci. 1997. V. 2. pp. 144151.

39. D'Agostino I.B., Deruere J., Kieber J.J. Characterization of the response of the Arabidopsis response regulator gene family to cytokinin // Plant Physiol. 2000. V. 124. pp.1706-1717.

40. Deruere J., Kieber J. Molecular mechanisms of cytokinin signaling // J. Plant Growth Regul. 2002. V. 21. pp. 32-39.

41. Divekar A.Y., Slocum H.K., Hakala M.T. N6-(delta2-isopentenyl)adenosine 5'-monophosphate: formation and effect on purine metabolism in cellular and enzymatic systems // Mol. Pharmacol. 1974. V. 10. pp. 529-543.

42. Dorion S., Lambert H., Landry J. Activation of the p38 signaling pathway by heat shock involves the dissociation of glutathione ¿"-transferase Mu from Askl // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. pp. 30792-30797.

43. Earnshaw B.A., Johnson M.A. The effect of glutathione on development in wild carrot suspension cultures // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1985. V. 133. pp. 988-993.

44. Ellman G.L. Tissue sulfhydryl groups // Arch. Biochem. Biophys. 1959. V. 82. pp. 70-77.

45. Engvall E. Enzyme immunoassay ELISA and EMIT // Methods Enzymol. 1980. V. 70. pp. 419-439.

46. Erion J.L., Fox J.E. Purification and properties of a protein which binds cytokinin-active 6-substituted purines // Plant Physiol. 1981. V. 67. pp. 156-162.

47. Estelle M. Cytokinin action: two receptors better than one? // Curr. Biol. 1998. V. 8. pp. 539-541.

48. Farid N.R. Anti-idiotypic antibodies as probes of hormone receptor structure and function //Methods Enzymol. 1989. V. 178. pp. 191-212.

49. Favaloro B., Tambinro A., Angelucci S., De Luca A., Melino S., Di Ilio C., Rotilio D. Molecular cloning, expression and site-directed mutagenesis of glutathione ¿"-transferase from Ochrobacterum anthropi // Biochem. J. 1998. V. 335. pp. 573-579.

50. Fox J.E., Erion J.L. Cytokinin binding proteins in higher plants. In: Plant Growth Regulation (Pilet P.E., ed.)- Berlin: Springer-Verlag. 1977. pp.139-146.

51. Fujimoto Y., Nagata R., Fukasawa H., Yano K., Azuma M., Iida A., Sugimoto S., Shudo K., Hashimoto Y. Purification and cDNA cloning of cytokinin-specific binding protein from mung bean (Vigna radiata) // Eur. J. Biochem. 1998. V. 258. pp. 794-802.

52. Fukai F., Ohtaki H., Ueda T., Katayama T. A possible role of glutathione iS-transferase in rat ovary and testis // J. Clin. Biochem. Nutr. 1992. V. 12. pp. 93-107.

53. Glass C.K. Same new twists in the regulation of gene expression by thyroid hormone and retinoic acid receptors // J. Endocrinology. 1996. V. 150. pp. 349-357.

54. Gonneau M., Mornet R., Laloue M. A Nicotiana plumbaginifolia protein labeled with an azido cytokinin agonist is a glutathione ¿»-transferase // Physiologia Plantarum. 1998. V. 103. pp. 114-124.

55. Goodman C.D., Casati P., Walbot V. A multidrug resistance-associated protein involved in anthocyanin transport in Zea mays II Plant Cell. 2004. V. 16. pp. 1812-1826.

56. Goto S., Kamada K., Soh Y., Ihara Y., Kondo T. Significance of nuclear glutathione ¿»-transferase pi in resistance to anticancer drugs // Jpn J. Cancer Res. 2002. V. 93. pp. 1047-1056.

57. Haas A.L., Laun N.P., Begley T.P. Thi20, a remarkable enzyme from Saccharomyces cerevisiae with dual thiamin biosynthetic and degradation activities // Bioorg Chem. 2005. V. 33. pp. 338-344.

58. Haberer G., Kieber J.J. Cytokinins. New insights into a classic phytohormone // Plant Physiol. 2002 V. 128. pp. 354-362.

59. Habig W.H., Jakoby W.B. Assays for differentiation of GST // Methods Enzymol. 1981. V. 77. pp. 735-740.

60. Hahn K., Strittmatter G. Pathogen-defence gene prpl-1 from potato encodes an auxin-responsive glutathione ¿"-transferase // Eur. J. Biochem. 1994. V. 226. pp 619-626.

61. Hall J.M., Couse J.F., Korach K.S. The multifaceted mechanisms of estradiol and estrogen receptor signaling // J. Biol. Chem. 2001 V. 276. pp. 3686936872.

62. Hamilton R.H., Kunsch U., Temperli A. Simple rapid procedures for isolation of tobacco leaf nuclei // Anal. Biochem. 1972. V. 49. pp. 48-57.

63. Hare P., Staden J. The molecular basis of cytokinin action // Plant Growth Regul. 1997. V. 23. pp. 41-78.

64. Hermanson O., Glass C.K. and Rosenfeld M.G. Nuclear receptor coregulators: multiple modes of modification // Trends Endocrinol. Metab. 2002. V. 13. pp. 55-60.

65. Homma H., Listowsky I. Identification of Yb-glutathione-S-transferase as a major rat liver protein labeled with dexamethasone 21-methanesulfonate // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. V. 82. pp. 7165-7169.

66. Hua J., Meyerowitz E.M. Ethylene responses are negatively regulated by a receptor gene family in Arabidopsis II Cell. 1998. V. 94. pp. 261-271.

67. Hwang I., Sheen J. Two-component circuitry in Arabidopsis cytokinin signal transduction // Nature. 2001. V. 413 pp. 383-389.

68. Inoue T., Higuchi M., Hashimoto Y., Seki M., Kobayashi M., Kato T., Tabata S., Shinozaki K., Kakimoto T. Identification of CRE1 as a cytokinin receptor from Arabidopsis //Nature. 2001. V. 409. pp. 1060-1063.

69. Ishigaki S., Abramovitz M., Listowsky I. Glutathiones-transferases are major cytosolic thyroid hormone binding proteins // Arch. Biochem. Biophys. 1989. V. 273. pp. 265-271.

70. Jayabaskaran C. Isolation and characterization of a cytokinin-binding protein from cucumber cotyledons. Plant Growth Regulation. 1990. V. 9. pp. 9-17.

71. Jeffery C.J. Multifunctional proteins: examples of gene sharing // Annals of Medicine. 2003. V. 35. pp. 28-35.

72. Kakimoto T. CKI1, a histidin kinase homolog implicated in cytokinin signal transduction // Science. 1996. V. 274. pp. 982-985.

73. Kakimoto T. Identification of plant cytokinin biosynthetic enzymes as dimethylallyl diphosphate: ATP/ADP isopentenyltransferases // Plant Cell Physiol. 2001. V. 42. pp. 677-685.

74. Kakimoto T. (2003) Perception and signal transduction of cytokinins // Annu Rev Plant Biol. V. 54. pp. 605-627.

75. Katzenellenbogen B.S. Mechanisms of action and cross-tolk between estrogen receptor and progesteron receptor pathways // J. Soc. Gynecol. Investig. 2000. V. 7. 33-37.

76. Ketley J.N., Habig W.H., Jakoby W.B. Binding of nonsubstrate ligands to the glutathione S-transferases // J. Biol. Chem. 1975. V. 250. pp. 8670-8673.

77. Kim Y., Kim D., H., Jung J. Isolation of a novel auxin receptor from soluble fraction of rise (Oryza sativa L.) shoots // FEBS Lett. 1998 V. 438. pp. 241244.

78. Kim Y.S., Kim D.H., Jung J. Two isoforms of soluble auxin receptor in rice (Oryza sativa L.) Plants: Binding property for auxin and interaction with plasma membrane H+-ATPase // Plant Growth Regul. 2000. V. 32. pp. 143-150.

79. Kobayashi K., Fukuda M., Igarashi D., Sunaoshi M. Cytokinin-binding proteins from Tobacco callus share homology with osmotin-like protein and an endochitinase // Plant. Cell Physiol. 2000. V. 41. pp. 148-157.

80. Kobayashi K., Zbell B., ReinertJ. A high affinity binding site for cytokinin to a particulate fraction in carrot suspension cells // Protoplasma. 1981. V. 106. pp. 145-155.

81. Kulaeva O.N., Karavaiko N.N. Selivankina C.Yu., Zemlyachenko Ya.V., Shipilova S.V. Receptor of fnms-zeatin involved in transcription activation by cytokinin II FEBS Lett. 1995. V. 366. pp. 26-28.

82. Kulaeva O.N., Karavaiko N.N., Selivankina S.Yu., Moshkov I.E., Novikova G.V., Zemlyachenko Y.V., Shipilova S.V., Orudgev E.M. Cytokinin signaling systems // Plant Growth Regul. 1996 V. 18. pp. 29-37.

83. Kulaeva O.N., Karavaiko N.N., Selivankina S.Yu., Zemlyachenko Ya.V., Shipilova S.V. Receptor of trans-zeatin involved in transcription activation by cytokinin // FEBS Lett. 1995. V. 366. pp. 26-28.

84. Kulaeva O.N., Zagranichnaya T.K., Brovko F.A., Karavaiko N.N., Selivankina S.Yu., Zemlyachenko Y.V., Hall M., Lipkin V.M., Boziev K.M. A new family of cytokinin receptors from Cereales II FEBS Lett. 1998. V. 423. pp. 239-242.

85. Kulaeva O.N., Prokoptseva O.S. Recent advances in the study of mechanisms of action of phytohormones // Biochemistry. 2004. V. 69. pp. 233-247.

86. Kusnetsov V.V., Oelmuller R., Sarwat .1., Porfirova S.A., Cherepneva

87. G.N., Herrmann R.G., Kulaeva O.N. Cytokinins, abscisic acid in Lupinus luteus cotyledons without notable effect on stady-state mRNA levels // Planta. 1994. V. 194. pp. 318-327.

88. Kwade Z., Swiatek A., Azmi A., Goossens A., Inze D., Van Onckelen

89. H., Roef L. Identification of four adenosine kinase isoforms in tobacco By-2 cells and their putative role in the cell cycle-regulated cytokinin metabolism // J. Biol. Chem. 2005. V. 29. pp. 17512-17519.

90. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during assembly of head of bacteriophage T4 //Nature. 1970. V. 227. pp. 680-685.

91. Laukens K., Lenobel R., Strnad M., Van Onckelen H., Witters E. Cytokinin affinity purification and identification of a tobacco BY-2 adenosine kinase // FEBS Lett. 2003. V. 533. pp. 63-66.

92. Listowsky I., Abramovitz H., Homma H., Niitzu Y. Intracellular binding and transport of hormones and xenobiotics by glutathione ^-transferases // Drug Metab. Rev. 1988. V. 19. pp. 305-318.

93. Lohrman J., Buchholz G., Keitel C., Sweere U., Kircher S., Baurle I., Kudla J., Scafer E., Harter K. Differential expression and nuclear localization of response regulator-like proteins from Arabidopsis thaliana II Plant Biol. 1999. V. 1, pp. 495-505.

94. Lohrmann J, Harter K. Plant two-component signaling systems and the role of response regulators // Plant Physiol. 2002. V. 128. pp. 363-369.

95. Macdonald H., Jones A.M., King PJ. Photoaffinity labeling of soluble auxin-binding proteins // J. Biol. Chem. 1991. V. 266. pp. 7393-7399.

96. Marrs K.A. The functions and regulation of glutathione S-transferases in plants // Annu. Rev. Plant Mol. Biol. 1996. V. 47. pp. 127-158.

97. Marx J.L. Making antibodies without the antigens // Science. 1985. V. 228. pp. 162-165.

98. Maruyama H., Listowsky I. Preferential binding of steroids by anionic forms of rat glutathione ^-transferase // J. Biol. Chem. 1984. V. 259. pp. 12449-12454.

99. Merezhinskaya N., Kuijpers G.A.J., Raviv Y. Reversible penetration of alpha-glutathione 5-transferase into biological membranes revealed by photosensitized labelling in situ II Biochem. J. 1998. V. 335. pp. 597-604.

100. Mitsui S., Sugiura M. Purification and properties of cytokinin-binding proteins from tobacco leaves // Plant Cell Physiol. 1993a. V. 34. pp. 543-547.

101. Mitsui S., Sugiura M. A cDNA encoding the 57 kDa subunit of a cytokinin-binding protein complex from tobacco: the subunit has high homology to S-adenosyl-Z,-homocysteine hydrolase // Plant Cell Physiol. 1993b. V. 34. pp. 10891096.

102. Moffat B.A., E. McWhinnie E. Burkhart JJ. Pasternak, Rothstein SJ. A complete cDNA for adenine phosphoribosyltransferase from Arabidopsis thaliana II Plant Mol. Biol. 1992. V. 18 pp. 653-662.

103. Moffat B.A., Wang L., Allen M.S., Stevens Y.Y., Wensheng Q., Snider J., von Schwartzenberg K. Adenosine kinase of Arabidopsis. Kinetic properties and gene expression // Plant Physiol. 2000. V. 124. pp. 1775-1785.

104. Mok D.W., Mok M.C. Cytokinin metabolism and action // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 2001. V. 52. pp. 89-118.1992. V. 33. pp. 407-412.

105. Moore III F.H. A cytokinin binding proteins from wheat germ // Plant Physiol. 1979. V. 64. pp. 594-599.

106. Morris R.O., Bilyeu K.D., Laskey J.G., Cheikh N.N. Isolation of a gene encoding a glycosylated cytokinin oxidase from maize // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. V. 16. pp. 328-33.

107. Moshkov I.E., Novikova G.V., Mur L.A., Smith A.R., Hall M.A. Ethylene rapidly up-regulates the activities of both monomeric GTP-binding proteins and protein kinase(s) in epicotyls of pea// Plant Physiol. 2003. V. 131. pp. 1718-1726.

108. Mueller L.A., Goodman C.D., Silady R.A., Walbot V. AN9, a petunia glutathione ^-transferase required for anthocyanin sequestration, is a flavonoid-binding protein//Plant Physiol. 2000. V. 123. pp. 1561-1570.

109. Nagata R., Kawachchi E., Hashimoto Y., Shudo K. Cytokinin-specific binding protein in ethyolated mung bean seedlings // Biochem. Biophys. Res. Comm.1993. V. 191. pp. 543-549.

110. Nogue F., Mornet R., Laloue M. Specific photoafflnity of a thylakoid membrane protein with azido-cytokinin agonist // Plant Growth Regul. 1995. V. 18. pp. 51-58.

111. Oakley B.R., Kirsch D.K., Morris N.R. A simplified ultrasensitive silver stain for detecting proteins in Polyacrylamide gels // Anal. Biochem. 1980. V. 105. pp. 361-363.

112. Ouzounis C.A., Kyrpides N.C. ThiD-TenA: a gene pair fusion in eukaryotes // J. Mol. Evol. 1997. V. 45. pp. 708-711.

113. Pang A.S., Nathoo S., Wong S.L. Cloning and characterization of a pair of novel genes that regulate production of extracellular enzymes in Bacillus subtilis II J. Bacteriol. 1991. V. 173. pp. 46-54.

114. Perkins D.N., Pappin D.J.C., Creasy D.M., Cottrell J.S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data//Electrophoresis. 1999. V. 20. pp. 3551-3567.

115. Pettersson P.L., Mannervik B. The role of glutathione in the isomerization of delta 5-androstene-3,17-dione catalyzed by human glutathione transferase Al-1 //J.Biol. Chem. 2001. V. 276. pp. 11698-11704.

116. Polya G.M., Davis A.W. Properties of high-affinity cytokinin-binding protein from wheat germ // Planta. 1978. V. 139. pp 139-147.

117. Prasad P.V., Jones A.M. Putative receptor for the plant growth hormone auxin identified and characterized by anti-idiotypic antibodies // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. pp. 5479-5483.

118. Rashotte A., Carson S., To J., Kieber J. Expression profiling of cytokinin action in Arabidopsis. Plant Physiology. 2003. V. 132. pp. 1998-2011.

119. Reinemer P., Dirr H.W., Ladenstein R., Schaffer J., Gallay O., Huber R. The three-dimensional structure of class iz glutathione S-transferase in complex with glutathione sulfate at 2.3 A resolution // EMBO J. 1991. V. 10. pp. 1997-2005.

120. Remoue F., Mani J.C., Pugniere M., Schacht A.M., Capron A., Riveau G. Functional specific binding of testosterone to Schistosoma haematobium 28-kilodalton glutathione S-transferase // Infection and Immunity. 2002. V. 70. pp. 601605.

121. Romanov G.A., Kieber J.J., Schmulling T. A rapid cytokinin-response assay in Arabidopsis indicates a role for phospholipase D in cytokinin signaling // FEBS Lett. 2002. V. 515. pp. 39-43.

122. Romanov G.A., Taran V. Ya., Chvojka L., Kulaeva O.N. Receptor-like cytokinin-binding protein(s) from barley leaves // J. Plant Growth Regul. 1988. V. 7. pp. 1-17.

123. Sakai H., Honma T., Aoyama T., Sato S., Kato T., Tabata S., Oka A. ARR1, a transcription factor for genes immediately responsive to cytokinins // Science. 2001. V. 294. pp. 1519-1521.

124. Sakakibara H., Suzuki M., Takei K., Deji A., Taniguchi M., Sugiyama T. A response-regulator homologue possibly involved in nitrogen signal transduction mediated by cytokinin in maize // Plant J. 1998. V. 14. pp. 337-344.

125. Schmulling T. CREam of cytokinin signalling: receptor identified // Trends Plant Sci. 2001. V. 6. pp. 281-284.

126. Schmulling T., Schafer S., Romanov G. Cytokinin as regulators of gene expression//Physiologia Plantarum. 1997. V. 100. pp. 505-519.

127. Sheehan D., Meade G., Foley V.M., Dowd C.A. Structure, function and evolution of glutathione transferases: implication for classification of non-mammalian members of an ancient enzyme superfamily // Biochem. J. 2001. V. 360. pp. 1-16.

128. Sheen J. Phosphoreay and transcription control in cytokinin signal transduction// Science. 2002. V. 296. pp. 1650-1652.

129. Smale S. Core promoters: active contributors to combinatorial gene regulation // Genes and Development. 2001. V. 15. pp. 2503-2508.

130. Takegami E.T., Yoshida K. Isolation and purification of cytokinin binding protein from tobacco leaves by affynity column chromatiography // Biochem. Biophys. Res. Com. 1975. V. 67. pp. 782-789.

131. Takei, K., Sakakibara, H., Sugiyama, T. Identification of genes encoding adenylate isopentenyltransferase, a cytokinin biosynthesis enzyme, in Arabidopsis II Biol.Chem. 2001. V. 276. pp. 26405-26410.

132. Tan K.H., Meyer D.J., Gillies N. Ketterer B. Detoxification of DNA hydroperoxide by glutathione transferases and the purification and characterization of glutathione transferases of the rat liver nucleus // Biochem. J. 1988. V. 254. pp. 841845.

133. The Arabidopsis Initiative. Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis II Nature. 2000. V. 408. pp. 796 815.

134. Tsai M.J., O'Malley B.W. Molecular mechanisms of action of steroid. Thyroid receptor superfamily members // Annu. Rev. Biochem. 1994. V. 63. pp. 451486.

135. Tun N. N., Hoik, A. & Scherer, G. F. E. Rapid increase of NO release in plant cell cultures induced by cytokinin // FEBS Lett. 2001. V. 509. pp. 174-176.

136. Urao T., Miyata S., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K. Possible His-to-Asp phosphorelay signaling in an Arabidopsis two-component system // FEBS Lett. 2000. V. 478. pp. 227-232.

137. Urao T., Yakubov B., Satoh R., Yamaguchi-Shinozaki K., Seki M., Hirayama T.,Shinozaki K. A transmembrane hybrid-type histidine kinase in Arabidopsis functions as an osmosensor// Plant Cell. 1999. V. 11. pp. 1743-1754.

138. Urao, T., Yakubov, B., Yamaguchi-Shiniozaki, K., Shinozaki, K. Stress-responsive expression of genes for two-component response regulator-like proteins in Arabidopsis II FEBS Lett. 1998. V. 427. pp. 175-178.

139. Vicente M., Chater K., Lorenzo V. Bacterial transcription factors involved in global regulation // Molecular Microbiology. 1999. V. 33. pp. 8.

140. Watahiki M.K., Mori H., Yamamoto K.T. Inhibitory effects of auxins and related substances on the activity of an Arabidopsis glutathione ^-transferase isozyme expressed in Escherichia coli II Physiologia Plantarum. 1995. V. 94. pp. 566575.

141. Watson C.S., Gametchu B. Proteins of multiple classes may participate in nongenomic steroid action // Experimental biology and medicine. 2003. V. 228 pp. 1272-1281.

142. Werner E., Motyka V., Strand M., Schmulling T. Regulation of plant growth by cytokinin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. pp. 10487-10492.

143. Woo E.J., Bauly J., Chen J.G., Marshall J., MacDonald H. Crystallization and preliminary X-ray analysis of the auxin receptor ABP1 // Acta Crystallogr. 2000. V. 56. pp. 1476-1478.

144. Woo E.J., Marshall J., Bauly J., Chen J.G., Venis M., Napier R.M., Pickersgill R.W. Crystal structure of auxin-binding protein 1 in complex with auxin // EMBO J. 2002. V. 21. pp. 2877-2885.

145. Xiang C., Werner B.L., Christensen E.M., Oliver D.J. The biological functions of glutathione revisited in Arabidopsis transgenic plants with altered glutathione levels // Plant Physiol. 2001. V. 126. pp. 564-574.

146. Yoshida K., Tagami E.T. Isolation of cytokinin binding protein from tobacco leaves by bioaffinity chromatiography and its partial characterization // J. Biochem. 1977. V. 1. pp.791-799.

147. Zettl R., Schell J., Palme K. Photoaffinity labeling of Arabidopsis plasma membrane vesicles by 5-azido-7-3H.indole-3-acetic acid: identification of a glutathione ^-transferase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. pp. 689-693.

148. Zhang D.P., Wu Z.Y., Li X.Y., Zhao Z.X. Purification and identification of 42-kilodalton abscisic acid-specific-binding protein from epidermis of broad bean leaves // Plant Physiol. 2002. V. 128. pp. 714-725.