Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурные и функциональные особенности рекомбинантных белков вируса гепатита C

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурные и функциональные особенности рекомбинантных белков вируса гепатита C"

На правах рукописи

Гудим Елена Александровна

СТРУКТУРНЫЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ ВИРУСА ГЕПАТИТА С

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2004

Работа выполнена на кафедре биоинженерии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова и в лаборатории иммунохимии ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Научный руководитель: Д.б.н., проф. А.Г. Тоневицкий

Официальные оппоненты: Член корр. РАН, проф. С.Н.Кочетков

Д.б.н, проф. Н.К.Янковский

Ведущая организация: Институт биохимии имени А.Н.Баха РАН

Защита состоится "14" декабря 2004 г. в /У Ч СО на заседании диссертационного совета Д.217.013.01 при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд, д.1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

В.И.Щербакова

Актуальность темы. Вирусом гепатита С (ВГС) инфицировано более 170 миллионов человек во всем мире. ВГС известен как один из наиболее распространенных факторов, вызывающих острые и хронические гепатиты у человека и шимпанзе. Хроническая инфекция развивается приблизительно в 70% случаев и в конце концов приводит более 20% пациентов к циррозу и приблизительно 5% пациентов - к гепатоклеточной карциноме [Pawlotsky, 2004; Panther, 2004].

ВГС относится к семейству Flaviviridae (роду Hepacivirus) и представляет собой сферический вирус размером 30-60 нм, имеющий капсид, построенный из субъединиц белка Core, одноцепочечную линейную РНК и белково-липидную оболочку, состоящую из белков Е1 и Е2 (Рис.1).

Рис. 1. Схема строения вириона вируса гепатита С.

Геном ВГС состоит из простой одноцепочечной молекулы РНК положительной полярности длиной приблизительно 9.6 т.н. Это составляет одну открытую рамку считывания (9 т.н.), которая кодирует полипротеин в ЗОН аминокислот (Рис. 2).

&яйстс]пшкн

NS2/3

и»м

г ' t ' г 1 ' 1

El E2 П52 NS3 NS4A NS4B NS5A NS5B

1

3UTR

1 192 384

747 в10 1027

1658 1712 1973

Mil

|,21|рИ| д70 И ,21 | ,70 | ,6 Ц ,27 j ,58 | »Я |

Рис.2. Схематическая диаграмма организации генома и процессинга белков ВГС [Thomson et al., 2000].

•»ОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ I БИБЛИОТЕКА j сл о»

imhutiu I

Одним из механизмов элиминации вируса является выработка анти-Е2 антител, нейтрализующих связывание ВГС с клетками. В белке оболочки Е2 ВГС найдены как линейные, так и конформационные эпитопы. Одним из основных рецепторов для ВГС является CD81, который взаимодействует с белком оболочки Е2 [Clayton et al., 2002].

При анализе иммунного ответа необходимо учитывать все изоляты вируса. Поскольку из-за высокой скорости мутации ВГС постоянно появляются новые вирусные варианты, гуморальный иммунитет к этим вирусным инфекциям сохраняется лишь до появления нового сероварианта возбудителя, что не позволяет рассчитывать на долговременный эффект вакцинации только одним белком [Berzovsky et al., 2004].

В острой фазе антитела к неструктурным белкам определяются позже, чем антитела к структурным белкам. Белок NS3 относится к неструктурным белкам ВГС и обладает несколькими каталитическими функциями. Высокие титры антител к NS3 в острой фазе гепатита С рассматривают как маркер хронизации [Jovilet-Reynaud et al., 2004].

Таким образом, получение рекомбинантных функционально активных белков ВГС имеет огромное диагностическое и клиническое значение. Дальнейшие исследования с использованием данных белков важны не только для понимания различий в механизме иммунного ответа на вирусы к различным генотипам, но и получения терапевтической вакцины.

Цели и задачи работы. Целью данной работы является изучение структурных и функциональных особенностей рекомбинантных белков вируса гепатита С.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить рекомбинантный функционально активный белок Е2 вируса гепатита С, изучить его взаимодействие с рецептором CD81.

2. Получить рекомбинантный полноразмерный белок NS3 вируса гепатита С, изучить его взаимодействие с анти-ВГС антителами в сыворотках инфицированных ВГС.

3. Определить диагностическое, прогностическое, клиническое значение

детекции антител к полученным рекомбинантным белкам.

* I ? К> < Гч I г о- • <• •

Научная новизна и практическая ценность работы. Получены и охарактеризованы рекомбинантные белки Е2 и NS3 ВГС, экспрессированные в E.coli. Показано, что негликозилированная форма Е2 эффективно взаимодействует как с моноклональными антителами, полученными против эукариотического гликопротеина Е2, так и с человеческим клеточным рецептором CD81. Таким образом, метод получения рекомбинантного функционально активного негликозилированного Е2 в бактериальных клетках эффективен и наиболее экономичен, чем получение эукариотического гликопротеина Е2. Кроме того, нами получен полноразмерный рекомбинантный белок NS3 ВГС и показана возможность его использования для детекции анти-NS3 антител в тест-системах в сыворотках больных гепатитом С.

Апробация результатов и публикации. Результаты данной работы докладывались на кафедре Биоинженерии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, на межлабораторных семинарах ГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов и ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов. Основные материалы диссертации опубликованы в 5 печатных работах. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературных данных, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы, список литературы. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клетки, плазмиды, культивирование. В работе были использованы клетки E.coli: штамм BL21(DE3) В F' dem ompT hsdS(rB- mB-) gal x(DE3) (Stratagene) использовали для экспрессии белка оболочки Е2 в Т7 системе; штамм BL21 В F" dem ompT hsdSfo- mB-) gal (Stratagene) - для экспрессии большой внеклеточной петли человеческого клеточного рецептора hCD81 (LEL); штамм M-15(pREP4 - канамицин устойчивая, 25(ig/ml) K12 naf str5 rif lac' ara' gal' mtl" Fr recA+, uvr+ lon+ - для экспрессии белка NS3 ВГС.

Плазмиду pETllcjoe (Novagen) использовали в качестве вектора для клонирования Е2 (384-661). Полученную плазмиду экспрессировали в E.coli в Т7 системе. Плазмиду pQE4 (Quagen) использовали в качестве вектора для создания плазмиды, содержащей ген, кодирующий белок NS3 ВГС. Клетки культивировали при 37°С и аэрации.

Клонирование рекомбинантного Е2 (384-661) ВГС. При клонировании укороченного с С-конца Е2 (384-661 а.о.) использовали кДНК инфицированного больного субтипа 1Ь ВГС. Для экспрессии в Е. coli создали Е2(3 84-661) с С-концевым 6His-tag. Для ПЦР-амплификации кДНК Е2(394-661) были сконструированы праймеры с сайтами для рестриктаз Ndel и Kpnl: прямой праймер:

5' CGCGGATCCTAATACGACTCACTATAGGGGTATTAATACATATG 3' обратный праймер:

5TGGGGTACCTTAGTGATGGTGATGGTGATGGCTGAGTTCTGACCTATCC3' ПЦР-продукт лигировали с вектором pETllcjoe по сайтам рестрикции Ndel и Kpnl Т4-ДНК лигазой (Fermentas). Специфичность вставки нуклеотидной последовательности в плазмиде оценивали методами рестрикционного анализа и секвенированием. Для трансформации использовали штамм BL(DE3) E.coli.

Клонирование полноразмерного белка NS3 ВГС. При клонировании полноразмерного белка NS3 использовали кДНК инфицированного больного субтипа 1Ь ВГС. Нуклеотидную последовательность, кодирующую NS3, амплифицировали с использованием праймеров: прямой праймер:

5'- (T/G)TGGCGAGATCTCGCGCC(C/T)ATGACGGCCTA - 3'; обратный праймер:

5' - CA(G/A)GTGCTCTAGACGACCTA(C/A)AGGTCAGC - 3'.

Продукты П1ДР и вектор после обработки рестриктазами разделяли с помощью электрофореза в 1%-ном агарозном геле. Фракцию с ожидаемой длиной фрагмента вырезали и очищали от геля. ПЦР-продукт лигировали с плазмидой pQE4 (Quagen) по сайтам рестрикции BgLII и Xbal Т4-ДНК лигазой (Fermentas). Специфичность вставки нуклеотидной последовательности в плазмиде оценивали методами рестрикционного анализа и секвенированием. Для трансформации использовали штамм М-15 (rep4) E.coli (ВНИИ СБ РАСХН).

Экспрессия белков Е2, NS3 и CD81 в клетках E.coli. Культуры трансформированных E.coli инкубировали при непрерывном перемешивании при температурах от 15 до 37°С с шагом в 3-4 °С в 100 мл среды LB. Рост культуры контролировали по величине оптической плотности при 600 нм. При

ОП=0.5-0.8 экспрессию индуцировали с помощью 0.2-1мМ изопропил-тио-P-D-галактозида (IPTG). После 3-4 ч от начала индукции клетки центрифугировали при 4000 g в течение 15 мин. Клоны бактерий, экспрессирующие рекомбинантные белки с ожидаемой молекулярной массой, были отобраны с помощью ДСН-электрофореза в 12% ПААГ с последующей их очисткой и иммуноферментным анализом.

Очистка телец включения. Для выделения телец включения осадок клеток E.coli (200 до 600 мг), продуцирующих Е2 и NS3 белки ВГС, ресуспендировали в 30 мл STET-буфера (50мМ Трис/НС1, 8% сахарозы, 50 мМ ЭДТА, 1.5 % Triton Х-100, PMSF рН 7.4). Суспензию центрифугировали 12000g, 30 мин при +4°С. Процедуру повторяли трижды. Далее осадок отмывали ФСБ и замораживали. Супернатанты и осадок во время очистки телец включения анализировали с помощью ДСН-электрофореза в 12% ПААГ.

Для растворения телец включения использовали 6М гуанидин. Затем центрифугировали при 12000g 30 мин при комнатной температуре.

Специфическая очистка рекомбинантного Е2 на Ni-NTA смоле. Для специфической очистки рекомбинантного Е2 использовали Ni-NTA смолу. Количество белка определяли по результатам ДСН-электрофореза в 12% ПААГ. Для связывания Е2 с Ni-NTA смолой использовали буфер, содержащий: 6М гуанидин, 50 мМ NaH2PO4 рН8.0, 300 мМ NaCl, ЮмМ имидазол. Для отмывки от несвязавшихся белков с Ni-NTA использовали буфер, содержащий: 50 мМ NaH2PO4 рШ.О, 300 мМ NaCl, 0.1% Тритон Х-100, 20 мМ имидазол. Для специфической элюции рекомбинантного Е2 использовали буфер, содержащий: 50 мМ NaH2PO4 рШ.О, 300 мМ NaCl, 0.1% Тритон Х-100, 20 мМ имидазол, 0.05% NaN3. Все инкубации проводили при комнатной температуре.

Твердофазный иммуноферментный анализ (ТИФА). 96-луночную плату сорбировали рекомбинантными белками. Для проведения ТИФА взаимодействия рекомбинантного Е2 с человеческим рекомбинантным рецептором CD81 делали ряд последовательных разведений Е2 1:2. Для проведения ТИФА с рекомбинантным белком NS3 1 мл денатурированного белка добавляли по каплям к 100 мл охлажденного Карбонатно-бикарбонатного буфера Вносили моноклональные

антитела или сыворотки. Добавляли античеловеческие антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (ИМТЕК, Россия). В качестве хромогенного маркера пероксидазной реакции использовали о-фенилендиамин (Sigma). Поглощение измеряли при длине волны 492 нм на спектрофотометре Multiscan (LKB, Щвеция).

Иммуноблотинг. Иимуноблотинг проводили согласно методике, описанной ранее [Towbin et al., 1982]. После ДСН-электрофореза в 12% ПААГ белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану полусухим методом в течение 1 часа при 200 мА. В качестве хромогенного маркера пероксидазной реакции использовали хлор-нафтол и диаминобензидин (Sigma, USA).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Получение рекомбинантного экспрессированного в E.coli E2 (384-661) ВГС. Для получения рекомбинантного белка Е2 ВГС был амплифицирован ген белка Е2 с кДНК генотипа 1Ь ВГС. Известно, что у пациентов с субтипом 1Ь хронизация ВГС-инфекции происходит в 90% случаев и сопровождается более тяжелым течением заболевания, развитием цирроза печени и гепатоклеточной карциномы. Поэтому этот субтип ВГС наиболее важен для изучения.

Полноразмерный Е2 составляет аминокислоты с 384 по 746 аминокислоты вирусного полипротеина. Для амплификации был выбран участок гена, кодирующий с 384 по 661 аминокислоты. Известно, что только 661 форма эукариотического гликопротеина Е2 могла эффективно секретироваться и только Е2(3 84-661) могла ренатурировать, в то же время гидрофобный С-концевой регион не важен для экспрессии в бактериях. Кроме того, эта форма связывается с человеческим рецептором CD81 с высокой аффинностью.

Ген Е2 был клонирован в экспрессионный вектор pETl lcjoe (Рис. 3) и при помощи секвенирования и рестриктного анализа было показано, что полученная плазмида pETl lcjoe-E2 содержала нужную вставку Е2 (384-661) с 6His-tag.

Kf«l<334)

---"N/.144.1(376)

{ \ , КМ (9) Niel (ГЩ

1 pETllcjoe 1 Т ЯШЯ^ШШ

ПЦР-ф*т«*1Е2(384-ЛН)

^«1(33«)

1 pETl lcJoe-E2|

Рис.3. Схема клонирования рекомбинантного Е2 ВГС.

Затем рекомбинантный белок Е2 был экспрессирован в BL21 (DE3) E.coli. Максимальный уровень экспрессии Е2 наблюдался только при 37°С, тогда как при 28 °С он был значительно меньше, при других температурах экспрессии Е2 не было. При помощи электрофореза в денатурирующих условиях было показано, что экспрессируемый белок имеет молекулярный вес 32 кД, что свидетельствует о том, что нсгликозилированный укороченный Е2 почти в два раза меньше по весу его эукариотической гликозилированной формы. Во всех случаях белок находился в тельцах включения. Полученный белок Е2 был очищен на Ni-NTA смоле в неденатурирующих условиях. Были подобраны оптимальные условия для сорбирования белка на смолу, отмывки от несвязавшихся белков и элюции Е2 (Рис. 4).

Рис. 4 Электрофорез экспрессии и специфической очистки рекомбинантного Е2 в 12% ПААГ:

1 - маркеры молекулярного веса;

2 - клеточный лизат без белка Е2;

3 - клеточный лизат с экспрессией в клетках Е coli белка Е2; 4 - белок Е2, очищенный на Ni-NTA смоле.

Определение функциональной активности полученного рекомбинантного белка Е2. Функциональную активность полученного рекомбинантного белка Е2 проверяли с помощью панели моноклональных антител против эукариотического гликопротеина Е2. ТИФА с моноклональными антителами АРЗЗ, Я646 и К1020 был проведен параллельно как с эукариотическим глико протеином Е2, так и с полученным нами рекомбинантным негликозилированным Е2. Эукариотический глико протеин Е2 и моноклональные антитела против него были получены ранее и любезно предоставлены А.Пателом, НИИ Вирусологии, Глазго, Шотландия.

В результате негликозилированный Е2 взаимодействовал со всеми моноклональными антителами, как и гликозилированная форма, хотя и в меньшей степени (Рис. 5).

Рис 5. Связывание моноклональных антител АРЗЗ, Я646 и Я1020 против рекомбинантного негликозилированного Е2 и рекомбинантного гликозилированного Е2 ВГС.

Вестерн-иммуноблотинг подтвердил взаимодействие полученного рекомбинантного белка с анти-Е2 моноклональным антителом АРЗЗ (Рис. 6).

Рис. 6. Вестерн-иммуноблотинг с использованием анти-Е2 моноклонального антитела ЛРЗЗ:

1- клеточный лизат без белка Е2;

2- клеточный лизат с экспрессированным белком Е2 в клетках E.coli.

Таким образом, полученные результаты имеют важное практическое значение, так как показывают, что для вакцины может быть использована и негликозилированная форма Е2, экспрессированная в E.coli. Этот метод экспрессии рекомбинантного более экономичен и менее дорог, чем получение эукариотической гликозилированной формы Е2.

Взаимодействие рекомбинантного Е2 с рецептором CD81. CD 81 является трансмембранным белком 26 кДа (236 а.о.), экспрессированным на многих клеточных линиях человека и характеризуется присутствием четырех трансмембранных доменов, трех внутриклеточных петель и двух внеклеточных доменов, которые в случае CD81 являются малой внеклеточной петлей (SEL) и большой внеклеточной петлей (LEL). Известно, что только LEL петля hCD81 участвует во взаимодействии с Е2. Плазмида, содержащая CD81 была любезно предоставлена А. Пателом, НИИ Вирусологии, Глазго, Шотландия.

Для изучения взаимодействия рекомбинантного белка Е2 с человеческим клеточным рецептором CD81, был экспрессирован и очищен слитный белок, состоящий из hCD81(LEL) и гена глютатион-С-трансферазы (GST).

Наряду с ожидаемым продуктом 30 кДа индуцировался также полипептид размером 25 кДа, возможно, являющийся продуктом внутриклеточного протеолиза исходного белка. После получения фракции растворимых белков появлялись небольшие количества полипептидов меньших размеров. Применение ингибиторов протеаз снижало их количество, но не предотвращало их появление полностью. Полученный белок выделяли на глютатион-сефарозе. Основной индуцируемый полипептид 30 кДа и продукты его протеолиза

97кДа—> 1 2

67кДа—> "1

ЗОхДа—> с* . . í .1-4-^

20 к Да—>

14кДа—>

адсорбировались на носитель и элюировались буфером, содержащим 5 мМ восстановленного глютатиона (Рис. 7).

Рис. 7. Электрофорез экспрессии и специфической очистки рекомбинантного hCD81(LEL) в 12% ПААГ:

1 - маркеры молекулярного веса;

2 - клеточный лизат без белка CD81; 3 -клеточный лизат с экспрессией в клетках Е. coli белка CD81; 4 - белок CD81, очищенный на глютатион-сефарозе.

Иммобилизованный на глютатион-сефарозе hCD81-GST инкубировали со свежеочищенным рекомбинантным Е2. Несвязавшийся материал отмывали, а связавшийся элюирован с помощью буфера, содержащего 0.1% додецилсульфат натрия (ДСН). В качестве контроля был взят иммобилизованный на глютатион-сефарозе hCD81-GST без добавления рекомбинантного Е2 (384-661). В результате, на ДСН-электрофорезе присутствовали оба белка (Рис. 8). Это говорит, по-видимому, о взаимодействии рекомбинантного Е2 (384-661) с рекомбинантным человеческим рецептором CD81.

Для подтверждения этого взаимодействия провели ТИФА, где к рекомбинантному СБ81, сорбированному на иммунологическую плату, добавляли разные концентрации рекомбинантного Е2. Взаимодействие рецептора СБ81 с рекомбинантным Е2(3 84-661) определяли с помощью моноклонального антитела АРЗЗ, полученного против эукариотического рекомбинантного гликопротеина Е2. В результате рекомбинантный Е2 взаимодействовал с СБ81 в доза-зависимом соотношении (Рис. 9).

2

X сч

0» »

С О

Рис. 9. ТИФА взаимодействия рекомбинантного Е2 с hCD81(LEL).

Сходные результаты были получены в обратном ТИФА, где к разным концентрациям Е2, сорбированным на иммунологическую плату добавляли рекомбинантный CD81. Взаимодействие детектировали с помощью анти-СБ81 моноклональных антител (Рис. 10).

0,3 0,25 0,2 0,15

<Д

0,05

01 23456 789 1011 Разведения Е2

Рис.10. ТИФА взаимодействия рекомбинантного hCD81(LEL) рекомбинантным Е2.

2 X

Ц

с

Следовательно, рекомбинантный Е2, полученный путем экспрессии в Ecoli, способен специфически взаимодействовать с рекомбинантным человеческим клеточным рецептором CD81.

Таким образом, был получен рекомбинантный функционально активный белок Е2 вируса гепатита С, который способен взаимодействовать как с различными моноклональными анти-Е2 антителами, так и с человеческим клеточным рецептором к ВГС CD81.

Получение рекомбинантного экспрессированного в E.coli поляоразмерного белка NS3 ВГС. Белок NS3 относится к неструктурным белкам ВГС и обладает несколькими каталитическими функциями. Протеазной активностью обладает N-концевой домен (180 аминокислот). Эта сериновая протеаза участвует в процессинге почти всех вирусных неструктурных белков. С-концевой домен белка NS3 обладает АТФазной/хеликазной активностью. Антитела к протеазному домену образуются реже (у 10% обследованных), чем к АТФ-хеликазному домену.

Для получения рекомбинантного белка NS3 ВГС был амплифицирован ген полноразмерного белка NS3 генотипа 1Ь ВГС. Полноразмерный NS3 составляет с 1027 по 1658 аминокислоты вирусного полипротеина. Ген NS3 был клонирован в экспрессионный вектор pQE4 и при помощи секвенирования и рестриктного анализа было показано, что полученная плазмида pQE4-NS3 содержала нужную вставку NS3 (1027-1658) (Рис. 11).

Рис.11. Схема клонирования рекомбинантного полноразмерного NS3 ВГС.

Плазмиды с ожидаемой вставкой использовали для экспрессии. Экспрессию рекомбинантного NS3 в трансформированных клетках E.coli контролировали с помощью 12%-ного ПААГ-электрофореза с использованием додецилсульфата натрия. Максимум экспрессии достигался через 4 ч после индукции IPTG, причем при 28°С уровень экспрессии был значительно выше, чем при 37°С. Рекомбинантный белок, в основном, накапливается в виде телец включения. На рис. 12 показана экспрессия и очистка белка от других компонентов клетки.

Рис. 12. Электрофорез экспрессии и очистки рекомбинантного полноразмерного NS3 в 12% ПААГ:

1 - маркеры молекулярного веса;

2 - клеточный лизат без белка NS3;

3 - клеточный лизат с экспрессией в клетках E.coli белка NS3;

4 - очищенный белок NS3.

Рекомбинантный NS3 был использован нами для определения антител против NS3 в сыворотках больных ВГС, полученных в ГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов МЗ и СР РФ. В эксперименте использовали 2 сыворотки больных гепатитом С, но только в одной из них тест-системой «РекомбиБест-анти-ВГС-спектр» (Россия) были выявлены антитела к белку NS3 (№№4, см. Таблицу 1). Две сыворотки были взяты у здоровых доноров (№№ 1-2).

№ сыворотки Наличие/отсутствие антител к разным антигенам ВГС, выявленных тест-системой «РекомбиБест анти-ВГС-спектр»

Соге NS3 NS4 NS5

1 - - - -

2 - - - -

3 + - + +

4 + + + +

Таблица 1. Выявление антител к разным антигенам ВГС с помощью тест-системы «РекомбиБест анти-ВГС-спектр» в сыворотках больных ВГС.

Тест-система «РекомбиБест-анти-ВГС-спектр» представляет собой набор компонентов, основой которой являются рекомбинантные антигены ВГС, соответствующие участкам белков, кодируемые структурной (Core) и неструктурной (NS3, NS4, NS5) областью генома ВГС, иммобилизованные на поверхности лунок разборного полистиролового планшета раздельно. NS3 в тест-системе «Вектор-Бест» относится к субтипу 1Ь ВГС и содержит от 195 до 452 а.о., что составляет примерно половину от полноразмерно NS3 ВГС. Для ТИФА полученный рекомбинантный полноразмерный NS3 сорбировали на иммунологическую плату и проверяли наличие антител к этому белку в сыворотках больных гепатитом С. По результатам ТИФА (Рис. 13) мы наблюдали выраженное взаимодействие полученного нами рекомбинантного NS3 с сыворотками больных ВГС. Это взаимодействие наблюдалось также в случае сыворотки больного гепатитом С, отобранной по данным тест-системы «Вектор Бест» как отрицательной по NS3. Это взаимодействие было меньше, чем в случае сыворотки больного гепатитом С, отобранного как положительного по NS3. Это говорит о том, что антитела детектируются к рекомбинантному NS3. Однако полноразмерный рекомбинантный NS3 незначительно взаимодействует с сыворотками здоровых доноров.

Рис. 13. Исследование взаимодействия рекомбинантного NS3 с сыворотками больных ВГС и здоровых доноров в ИФА. Анализ сывороток в разных разведениях.

Взаимодействие рекомбинантного NS3 с данными сыворотками можно объяснить присутствием примесей, оставшихся после очистки рекомбинантного белка. По результатам этого ТИФА было выбрано оптимальное разведение сывороток 1:40 для последующих экспериментов.

Таким образом, был получен рекомбинантный функционально активный полноразмерный белок №3 вируса гепатита С, который дает вызывает гуморальный иммунный ответ у больных гепатитом С.

Определение диагностического, прогностического и клинического значения детекции антител к полученным рекомбинантным белкам ВГС.

Современная диагностика гепатита С основывается на выявлении антител к ВГС (анти-ВГС) и РНК ВГС. Самым распространенным современным методом диагностики является твердый иммуноферментный анализ (ТИФА). При гепатите С методом ТИФА определяются антитела, так как концентрации белковых антигенов чрезвычайно малы и они практически не регистрируются в сыворотке.

Полученный нами рекомбинантный NS3 был использован для определения его диагностической значимости. Для сравнения мы использовали тест-систему «Вектор Бест» (Россия). В эксперименте использовали 24 сыворотки больных гепатитом С, полученные в ГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов МЗ и СР РФ. В 17-ти из них тест-системой «Вектор Бест» были выявлены антитела к NS3 (№№8-24 - группа 2, см. таблицу 2), в 7-и - антитела к №3 обнаружены не были (№№1-7 - группа 1). Положительный и отрицательный контрольные образцы во всех ИФА были одинаковыми и соответствовали таковым в тест-системе «Вектор-Бест» (см. таблицу 2 и рис. 14).

№ сыворотки Наличие/отсутствие антител к разным антигенам ВГС, выявленных тест-системой «РекомбиБест анти-ВГС-спектр» Субтип ВГС

Соге N83 N84 N85

+ контроль + + + + 1Ь

- контроль - - - - -

1 + - - - не типируется

2 + - + + 2а

3 + - + + За

4 + - + + 1Ь

5 + - + - За

6 + - - - не типируется

7 + - - - 2а

8 + + + + За

9 + + - - 1Ь

10 + + + + 1Ъ

И + + + + 1Ь

12 + + - - 1Ь

13 + + - - 1Ь

14 + + - - 1Ь

15 + + + + 2а

16 + + + + 1Ь

17 + + + - 1Ь

18 + + + + не типируется

19 + + + + 1Ь

20 + + + + 1Ь

21 + + - - 1Ь

22 + + + - 1Ь

23 + + + + 1Ь

24 + + + + За

Таблица 2. Выявление антител к разным антигенам ВГС с помощью тест-системы «Вектор-Бесг» в сыворотках больных ВГС (не типируется - низкий уровень виремии).

+К -К 1 2 3 4 5 6 7 а 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

Рис.14. Анализ взаимодействия рекомбинантного N83 с сыворотками больных ВГС и здоровых доноров в ТИФА (разведение сывороток 1:40). Номера сывороток на рисунке соответствуют номерам в таблице.

Полноразмерный рекомбинантный NS3 незначительно взаимодействует с сыворотками здоровых доноров, что можно объяснить присутствием примесей, оставшихся после очистки рекомбинантного белка.

Мы наблюдали выраженное взаимодействие полученного нами рекомбинантного NS3 с сыворотками больных ВГС, в том числе и отобранных по данным тест-системы «Вектор -Бест» как отрицательных по анти-ШЗ.

Для предсказания антигенных эпитопов в структуре NS3 были использованы методы Хоппа и Вудса и Джеймсона и Вульфа [Wisdom et al., 1994]. Метод Хоппа и Вудса базируется на анализе первичной структуры белков и предсказании антигенных эпитопов на основе локальной гидрофильности аминокислотных остатков. Метод Джеймсона и Вульфа основан на анализе доступности аминокислотных остатков растворителю, гибкости углеродного скелета и особенностях вторичной структуры. Из рисунка 15 видно, что оба метода дают примерно одинаковый профиль и можно выделить четыре основных антигенных эпитопа: 23-31, 116-124, 370-379 и 456-469 а.о. Важно отметить, что при этом в пептид, который используется в тест-системе «Вектор Бест» входит только один из этих эпитопов (370-379 а.о.).

Рис. 15. Предсказание антигенных эпитопов в структуре рекомбинантного NS3 по методу Хоппа и Вудса и Джеймсона и Вульфа [Wisdom et al., 1994].

В эксперименте были использованы сыворотки больных гепатитом С, которые имели в основном субтипы 1Ь и За (см. таблицу 2). Из трех предсказанных эпитопов, наиболее вероятным общим антигеном является 4-й участок. Сравнение аминокислотных последовательностей субтипов 1Ь и За 4-го антигенного эпитопа показывает полную гомологию этих участков (рис. 16).

Рис. 16. Сравнение аминокислотных последовательностей субтипов 1Ь и За 4-го антигенного эпитопа рекомбинантного NS3.

Следовательно этот эпитоп определяет aHгa-NS3 антитела как у больных гепатитом С с субтипом 1Ь, так и с За. Анализ третичной структуры молекулы №3 [Tai et а1., 2001] показал, что данный эпитоп представляет собой петлю, экспонированную на поверхности молекулы.

Ранее было показано [2Иощ et а1., 2000], что при инфицировании достаточно быстро появляются антитела к NS3. Однако их не удается идентифицировать с помощью синтетических додекапептидов, что говорит о конформационной структуре эпитопов. При хронизации инфекции наблюдается постоянный невысокий уровень антител к NS3. При этом антитела реагируют главным образом с С-концевым доменом и узнают пептидные антигены, т.е. неконформационные эпитопы. Таким образом, использование как пептидов, так и полноразмерного белка №3 при определении антител может быть важным критерием в диагностике стадий инфекции.

Таким образом, нами получен полноразмерный рекомбинантный белок №3 ВГС и показана возможность его использования для детекции amn-NS3

антител в тест-системах в сыворотках больных гепатитом С. Дальнейшие исследования с использованием данного белка важны не только для понимания различий в механизме иммунного ответа на вирусы к различным генотипам, но и получения терапевтической вакцины [РгеИп, 2004].

Выводы:

1. С помощью панели анти-Е2 моноклональных антител и рецептора СБ81 показано, что полученный рекомбинантный белок Е2 вируса гепатита С является функционально активным.

2. Получен рекомбинантный полноразмерный белок NS3 ВГС. Определено наличие антител к NS3 в сыворотках больных гепатитом С.

3. Полученные рекомбинантные белки Е2 и №3 имеют важное диагностическое и прогностическое значение и могут быть использованы в тест-системах для детекции анти-КБЗ антител в сыворотках больных гепатитом С.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Федоров А.Н., Юркова М.С., Гудим Е.А., Тоневицкий А.Г. // Создание и характеристика рибосомных комплексов, несущих вновь синтезированный белок Е2 вируса гепатита С // Аллергия, астма и клиническая иммунология, Т. 7, с. 4144,2003.

2. Гудим Е.А. // Взаимодействие гликопротеина Е2 вируса гепатита С с клеткой // Биотехнология, №3, с. 3-11,2004.

3. Гудим Е.А., Агапов И.И., Лунин В.Г., Комолов И.С. // Клонирование и экспрессия белка NS3 вируса гепатита С // Биотехнология, № 5, с. 80-86,2004.

4. Гудим Е.А., Агапов И.И., Комолов И.С, Тоневицкий А.Г. // Особенности гуморального иммунного ответа на рекомбинантный вирусный белок NS3 в сыворотках больных гепатитом С // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, Т. 138, №9, с. 378-385,2004.

5. Малюченко Н.В., Агапов И.И., Тоневицкий А.Г., Мойсенович М.М., Савватеев М.Н., Гудим ЕА., Быков В.А., Кирпичников М.П. // Количественный анализ образования комплексов ^М с иммобилизованным лигандом с помощью атомно-силовой микроскопии // Биофизика, Т.49, №6, с. 1015-1020,2004.

Подписано в печать 10.11.2004 Формат 60x88 1/16. Объем 1.5 усл.п.л.

Тираж 100 экз. Заказ № 180 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. 102

№22 6 9 1

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гудим, Елена Александровна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературных данных.

1.1. Строение вируса гепатита С (ВГС).

1.2. Молекулярная биология ВГС.

1.2.1. Клеточная культура и модели животных.

1.2.2. Организация генома и генетическая вариабельност

1.2.3. Структура белков ВГС и их функции.

1.2.4. Цикл репликации ВГС.

1.2.5. Патогенез, диагностика и лечение гепатита С.

1.3. Взаимодействие белка Е2 ВГС с клеточной поверхностью.

1.3.1. Функциональная организация белка Е2.

1.3.2. Структура рецептора CD81.

1.3.3. Взаимодействие белка Е2 с рецептором CD81.

1.3.4. Взаимодействие белка Е2 с другими рецепторами для ВГС.

1.4. Структурные и функциональные особенности белка NS3 ВГС.

1.4.1. Сериновая npOTea3aNS3 и механизмы ее ингибирования.

1.4.2. Структура и функции хеликазы NS3.

1.5. Роль белков ВГС в гуморальном и клеточном иммунитете.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Клетки, плазмиды, культивирование.

2.2. Клонирование рекомбинантного белка Е2(384-661) ВГС для экспрессии в E.coli.

2.3. Клонирование рекомбинантного полноразмерного белка NS3 ВГС для экспрессии в E.coli.

2.4. Экспрессия рекомбинантных белков Е2, NS3 и CD81 в клетках E.coli.

2.5. Очистка телец включения.

2.6. Очистка рекомбинантного Е2 на Ni-NTA смоле.

2.7. Очистка рекомбинантного рецептора CD81 на глютатион-сефарозе 4В.

2.8. Взаимодействие рекомбинантного белка Е2 с рецептором CD81.

2.9. Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA).

2.10. Иммуноблоттинг.

Глава 3. Результаты и обсуждение.

3.1. Получение рекомбинантного функционально активного белка Е2 (384-661) ВГС.

3.1.1. Клонирование рекомбинантного белка Е2 (384-661) ВГС.

3.1.2. Экспрессия Е2(384-661) в клетках E.coli BL21[DE3].

3.1.3. Выделение и очистка белка Е2 на Ni-NTA смоле.

3.1.4. Взаимодействие полученного рекомбинантного белка Е2(384-661) с моноклональными антителами.

3.1.5. Экспрессия, выделение и очистка рецептора CD81.

3.1.6. Взаимодействие рекомбинантного белка Е2(384-661) с рецептором CD81.

3.2. Получение рекомбинантного полноразмерного белка NS3 ВГС. Изучение его взаимодействия с анти-ВГС антителами в сыворотках инфицированных ВГС.

3.2.1. Клонирование рекомбинантного полноразмерного белка NS3 ВГС.

3.2.2. Экспрессия и очистка полноразмерного белка NS3 в клетках Е. coli М-15 [REP4].

3.2.3. Взаимодействие рекобинантного белка NS3 с сыворотками больных гепатитом С.

3.3. Определение диагностического, прогностического, клинического значения детекции антител к полученному рекомбинантному белку NS3.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурные и функциональные особенности рекомбинантных белков вируса гепатита C"

Вирусом гепатита С (ВГС) инфицировано более 170 миллионов человек во всем мире. ВГС известен как один из наиболее распространенных факторов, вызывающих острые и хронические гепатиты у человека и шимпанзе. Хроническая инфекция развивается приблизительно в 50-80% случаев и в конце концов приводит 20-50% пациентов к циррозу и приблизительно 5% пациентов - к гепатоклеточной карциноме [Gardner et al., 2003; Pawlotsky, 2004; Panther, 2004].

Гликопротеиновую часть вирусной оболочки представляют собой гетеродимерные нековалентные комплексы оболочечных гликопротеинов Е1 и Е2. Основным рецептором для ВГС считается CD81, который взаимодействует с белком оболочки Е2. Одним из механизмов элиминации вируса является выработка анти-Е2 антител, нейтрализующих связывание ВГС с клетками. В белке оболочки Е2 ВГС найдены как линейные, так и конформационные эпитопы. [Clayton et al., 2002]. ВГС высоко изменчив, что определяет трудности в его изучении [Shaw, 2003]. Поэтому при анализе иммунного ответа необходимо учитывать все изоляты вируса. Поскольку из-за высокой скорости мутации ВГС постоянно появляются новые вирусные варианты, гуморальный иммунитет к этим вирусным инфекциям сохраняется лишь до появления нового сероварианта возбудителя, что не позволяет рассчитывать на долговременный эффект вакцинации только одним белком [Berzovsky et al., 2004].

В острой фазе антитела к неструктурным белкам определяются позже, чем антитела к структурным белкам. Белок NS3 относится к неструктурным белкам ВГС и обладает несколькими каталитическими функциями. Высокие титры антител к NS3 в острой фазе гепатита С рассматривают как маркер хронизации [Jovilet-Reynaud et al., 2004].

Таким образом, получение рекомбинантных функционально активных белков ВГС имеет огромное диагностическое и клиническое значение. Дальнейшие исследования с использованием данных белков важны не только для понимания различий в механизме иммунного ответа на вирусы к различным генотипам, но и получения терапевтической вакцины.

Цель и задачи работы. Целью данной работы является изучение структурных и функциональных особенностей рекомбинантных белков вируса гепатита С.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить рекомбинантный функционально активный белок Е2 вируса гепатита С, изучить его взаимодействие с рецептором CD81.

2. Получить рекомбинантный полноразмерный белок NS3 вируса гепатита С, изучить его взаимодействие с анти-ВГС антителами в сыворотках инфицированных ВГС.

3. Определить диагностическое, прогностическое, клиническое значение детекции антител к полученным рекомбинантным белкам.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Получены и охарактеризованы рекомбинантные белки Е2 и NS3 ВГС, экспрессированные в E.coli. Показано, что негликозилированная форма Е2 эффективно взаимодействует как с моноклональными антителами, полученными против эукариотического гликопротеина Е2, так и с человеческим клеточным рецептором CD81. Таким образом, метод получения рекомбинантного функционально активного негликозилированного Е2 в бактериальных клетках эффективен и наиболее экономичен, чем получение эукариотического гликопротеина Е2. Кроме того, нами получен полноразмерный рекомбинантный белок NS3 ВГС и показана возможность его использования для детекции анти-NS3 антител в тест-системах в сыворотках больных гепатитом С.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Гудим, Елена Александровна

выводы

1. С помощью панели анти-Е2 моноклональных антител и рецептора CD81 показано, что полученный рекомбинантный белок Е2 вируса гепатита С является функционально активным.

2. Получен рекомбинантный полноразмерный белок NS3 ВГС. Определено наличие антител к NS3 в сыворотках больных гепатитом С.

3. Полученные рекомбинантные белки Е2 и NS3 имеют важное диагностическое и прогностическое значение и могут быть использованы в тест-системах для детекции aHTH-NS3 антител в сыворотках больных гепатитом С.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гудим, Елена Александровна, Москва

1. Мохонов В.В., Новиков Д.В., Самохвалов Е.И., Шаталов А.Г., Прилипов А.Г. // Структурные белки вируса гепатита С // Вопросы вирусологии, №1, 2002.

2. Ястребова О.Н. // Гепатит С // Кольцово, С. 30, 2000.

3. Artsaenko O., Tessmann K., Sack M., Haussinger D., Heintges T. // Abrogation of hepatitis С virus NS3 helicase enzymatic activity by recombinant human antibodies // J. Gen. Virol., v. 84(Pt 9), pp. 2323-2332, 2003.

4. Bartenschlager R., Kaul A., Sparasio S. // Replication of the hepatitis С virus in cell culture // Antiviral. Res., v. 60(2), pp. 91-102, 2003.

5. Beard M.R., Abell G., Honda M., Carroll A., Gartland M., Clarke В., Suzuki K., Lanford R., Sangar D.V., Lemon S.M. // An infectious molecular clone of a Japanese genotype lb hepatitis С virus // Hepatology, v. 30(1), pp. 316324, 1999.

6. Berzovsky J.A., Ahlers J.D., Janik J., Morris J., Oh S., Terabe M., and Belyakov I.M. // Progress on new vaccine strategies against chronic viral infections // J. Clin. Invest., v. 114, pp. 450-462, 2004.

7. Beeck A., Dubuisson J. // Topology of hepatitis С virus envelope glycoproteins // Rev. Med. Virol., v. 13(4), pp. 233-241, 2003.

8. Blight K.J., Kolykhalov A.A., Rice C.M. // Efficient initiation of HCV RNA replication in cell culture // Science., v. 290(5498), pp. 1972-1974, 2000.

9. Blight K.J., McKeating J.A., Marcotrigiano J., Rice C.M. // Efficient replication of hepatitis С virus genotype la RNAs in cell culture // J. Virol., v. 77(5), pp. 3181-3190, 2003.

10. Carloni G., Iacovacci S., Sargiacomo M., Ravagnan G., Ponzetto A., Peschle C., Battaglia M. // Susceptibility of human liver cell cultures to hepatitis С virus infection // Arch. Virol. Suppl., v. 8, pp. 31-39, 1993.

11. Carlos M.P., Yamamura Y., Vu Q., Conzen K., Anderson D.E., Torres J.V. // Humoral immunity to immunodominant epitopes of Hepatitis С vims inindividuals infected with genotypes la or lb // Clin. Immunol., v. 111(1), pp. 22-27, 2004.

12. Carrere-Kremer S., Montpellier-Pala C., Cocquerel L., Wychowski C., Penin F., Dubuisson J. // Subcellular localization and topology of the p7 polypeptide of hepatitis С virus // J. Virol., v. 76(8), pp. 3720-3730, 2002.

13. Chen L., Chen P., Fan G., Li L., Liu C. // Localization of hepatitis С virus core protein in the nucleus of peripheral blood mononuclear cells of hepatitis С patients // Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi., v. 16(1), pp. 37-39, 2002.

14. Clayton R.F., Owsianka A., Aitken J., Graham S., Bhella D., Patel A.H. // Analysis of antigenicity and topology of E2 glycoprotein present on recombinant hepatitis С virus-like particles // J.Virol., v. 76(15), pp. 76727682, 2002.

15. Cocquerel L., Kuo C.C., Dubuisson J., Levy S. // CD81-dependent binding of hepatitis С virus E1E2 heterodimers // J. Virol., v. 77(19), pp. 1067710683,2003.

16. Diepolder HM. // Prevention and therapy of viral hepatitis // Internist.(Berl). v. 45(2), pp. 197-209,2004.

17. Dou X.G., Talekar G., Chang J., Dai X., Li L., Bonafonte M.T., Holloway В., Fields H.A., Khudyakov Y.E. // Antigenic heterogeneity of the hepatitis С virus NS5A protein // J. Clin. Microbiol., v. 40(1), pp. 61-67, 2002.

18. Drummer H.E., Poumbourios P. // Hepatitis С virus glycoprotein E2 contains a membrane-protein heptad repeat sequence that is essential for E1E2 glycoprotein heterodimerization and viral entry // J. Biol. Chem., v. 279(29), pp. 30066-30072, 2004.

19. Drummer H.E., Wilson K.A., and Poumbourios P. // Identification of the Hepatitis С virus E2 glycoprotein binding site on the large extracellular loop of CD81 // J. Virol., v. 76(21), pp. 11143-11147, 2002.

20. Duenas-Carrera S. // DNA vaccination against hepatitis С // Curr. Opin. Mol. Ther., v. 6(2), pp. 146-150, 2004.

21. Errington W., Wardell A.D., McDonald S., Goldin R.D., McGarvey M.J. // Subcellular localization of NS3 in HCV-infected hepatocytes // J. Med. Virol., v. 59(4), pp. 456-462, 1999.

22. Failla C.M., Pizzi E., De Francesco R., Tramontano A. // Redesigning the substrate specificity of the hepatitis С virus NS3 protease // Fold. Des., v. 1(1), pp. 35-42, 1996.

23. Fan Z., Yang Q.R., Twi J.S., Sherker A.H. // Specific in vitro association between the hepatitis С viral genome and core protein // J. Med. Virol., v. 59(2), pp. 131-134, 1999.

24. Farci P., Purcell R.H. // Clinical significance of hepatitis С virus genotypes and quasispecies // Semin. Liver. Dis., v. 20(1), pp. 103-126, 2000.

25. Flint M., Dubuisson J., Maidens C., Harrop R., Guile G. R., Borrow P., and McKeating J. A. // Functional characterization of intracellular and secreted forms of a truncated hepatitis С virus E2 glycoprotein // J.Virol., v. 74, pp. 702-709, 2000.

26. Foy E., Li K., Wang C., Sumpter R. Jr., Ikeda M., Lemon S.M., Gale M. Jr. // Regulation of interferon regulatory factor-3 by the hepatitis С vims serine protease // Science., v. 300(5622), pp. 1145-1148, 2003.

27. Francesco R., Pessi A., Steinkuhler C. // Mechanisms of hepatitis С virus NS3 proteinase inhibitors // J. Viral. Hepat., v. 6(Suppl 1), pp. 23-30, 1999.

28. Frelin L. // Development of vaccines and experimental models for chroniv infections caused by the hepatitis С virus // Karolinska University Press, Stockholm, Sweden, p. 84, 2004.

29. Fried M.W. // Viral factors affecting the outcome of therapy for chronic hepatitis С // Rev. Gastroenterol. Disord., v. 4(Suppll), pp. 8-13, 2004.

30. Gardner J.P., Durso R.J., Arrigale R.R., Donovan G.P., Maddon P.J., Dragic Т., and Olson W.S. // L-SIGN (CD 209L) is a liver-specific capture receptor for hepatitis С virus // PNAS, v. 100(8), pp. 4498-4503, 2003.

31. Germi R., Crance J.M., Garin D., Zarski J.P., Drouet E. // Hepatitic С virus culture systems // Pathol. Biol (Paris)., v. 49(3), pp. 255-261, 2001.

32. Goutagny N., Fatmi A., De Ledinghen V., Penin F., Couzigou P., Inchauspe G., Bain C. // Evidence of viral replication in circulating dendritic cells during hepatitis С virus infection // J. Infect. Dis., v. 187(12), pp. 19511958,2003.

33. Grakoui A., Shoukry N.H., Woollard D.J., Han J.H., Hanson H.L., Ghrayeb J., Murthy K.K., Rice C.M., Walker C.M. // HCV persistence and immune evasion in the absence of memory T cell help // Science., v. 302(5645), pp. 659-662, 2003.

34. Howard C.R. // Hepatitis С vims: clades and properties // J. Gastroenterol. Hepatol., 17 Suppl, pp. 468-470, 2002.

35. Howe A.Y., Chase R., Taremi S.S., Risano C., Beyer В., Malcolm В., Lau J.Y. // A novel recombinant single-chain hepatitis С vims NS3-NS4A protein with improved helicase activity // Protein. Sci., v. 8(6), pp. 13321341, 1999.

36. Hsu M., Zhang J., Flint M., Logvinoff C., Cheng-Mayer C., Rice C.M., and McKeating J.A. // Hepatitis С vims glycoptoteins mediate pH-dependent cell entry of pseudotyped retroviral particles // PNAS, v. 100(12), pp. 72717276, 2003.

37. Imbert I., Dimitrova M., Kien F., Kieny M.P., Schuster C. // Hepatitis С vims IRES efficiency is unaffected by the genomic RNA 3'NTR even in thepresence of viral structural or non-structural proteins // J. Gen. Virol., v. 84(Pt6), pp. 1549-1557, 2003.

38. Jones I.M., Chan-Fook C. // Receptors for hepatitis С virus // J. Virol., pp. 10860-10861,2000.

39. Kato N. // Genome of human hepatitis С virus (HCV): gene organization, sequence diversity, and variation // Microb. Сотр. Genomics., v. 5(3), pp. 129-151,2000.

40. Keck Z.Y., Sung V.M., Perkins S., Rowe J., Paul S„ Liang T.J., Lai M.M., Foung S.K. // Human monoclonal antibody to hepatitis С virus El glycoprotein that blocks virus attachment and viral infectivity // J. Virol., v. 78(13), pp. 7257-7263, 2004.

41. Kien F., Abraham J.D., Schuster C., Kieny M.P. // Analysis of the subcellular localization of hepatitis С virus E2 glycoprotein in live cells using EGFP fusion proteins // J. Gen. Virol., v. 84(Pt3), pp. 561-566, 2003.

42. Kim D.W., Kim J., Gwack Y., Han J.H., and Choe J. // Mutational analysis of the hepatitis С virus RNA helicase // J. of Virology., v. 71(12), pp. 94009409, 1997.

43. Kitadokoro K., Bordo D., Galli G., Petracca R., Falugi F., Abrignani S., Grandi G., and Bolognesi M. // CD81 extracellular domain 3D structure: insight into the tetraspanin superfamily structural motifs // EMBO J., v.20(l), pp. 12-18,2001.

44. Kunkel M., Watowich S.J. // Biophysical characterization of hepatitis С virus core protein: implications for interactions within the virus and host // FEBS Lett., v. 557(1-3), pp. 174-180, 2004.

45. Kups J., Wozniakowska-Gesicka T. // Evaluation of specific humoral response to hepatitis С core antigen in children // Przegl. Lek., v. 60(12), pp. 802-805,2003.

46. Kwong A.D., Kim J.L., Rao G., Lipovsek D., Raybuck S.A. // Hepatitis С vims NS3/NS4A protease // Antiviral. Res., v. 41(1), pp. 67-84, 1999.

47. Kwong A.D., Kim J.L., Lin C. // Structure and function of hepatitis С virus NS3 helicase // Curr. Top. Microbiol. Immunol., v. 242, pp. 171-196, 2000.

48. Lam A.M.I., Keeney D., and Frick D.N. // Two novel conserved motifs in the hepatitis С virus NS3 protein critical for helicase action // J. of Biol. Chem., v. 278(45), pp. 44514-44524, 2003.

49. Lanford R.E., Bigger C., Basset S., Klimpel G. // The chimpanzee model of hepatitis С vims infections // ILAR J., v. 42(2), pp. 117-126, 2001.

50. Levy S., Nguyen V.Q., Andria M.L., Takahashi S. // Structure and membrane topology of TAPA-1 // J. of Biol.Chem., v. 266, pp.14597-14602, 1991.

51. Liang T.J., Hoofnagle J.H., Gallin J.I., Fauci A.S. // Hepatitis С (A volume in the biomedical research reports) // Academic Press, P. 512, 2000.

52. Lin C., and Kim J.L. // Structure-based mutagenesis study of hepatitis С virus NS3 helicase // J. of Virology., v. 73(10), pp. 8798-8807, 1999.

53. Marco S.D., Rizzi M., Volpari C., Walsh M.A., Narjes F., Colarusso S., Francesco R.D., Matassa V.G., and Sollazzo M. // Inhibition of the hepatitis С virus NS3/4A protease // J. of Biological Chemistry., v. 275(10), pp. 7152-7157, 2000.

54. Martin F., Dimasi N., Volpari C., Perrera C., Di Marco S., Brunetti M., Steinkuhler C., De Francesco R., Sollazzo M. // Design of selective eglin inhibitors of HCV NS3 proteinase // Biochemistry., v. 37(33), pp. 1145911468, 1998.

55. Mihm S., Frese M., Meier V., Wietzke-Braun P., Scharf J.G., Bartenschlager R., Ramadori G. // Interferon type I gene expression in chronic hepatitis С // Lab. Invest., v. 84(9), pp. 1148-1159, 2004.

56. Mondelli M.U., Cerino A., Meola A., Nicosia A. // Variability or conservation of hepatitis С virus hypervariable region 1? Implications for immune responses // J. Biosci., v. 28(3), pp. 287-304, 2003.

57. Moriishi K., Matsuura Y. // Mechanisms of hepatitis С virus infection // Antivir. Chem. Chemother., v. 14(6), pp. 285-297, 2003.

58. Nakano I., Fukuoa Y., Katano Y., and Hayakawa I. // Conformational epitopes detected by cross-reactive antibodies to envelope 2 glycoprotein of the hepatitis С virus // J.Infection diseases., v. 180, pp. 1328-1333, 1999.

59. Nozaki A., Ikeda M., Naganuma A., Nakamura Т., Inudoh M., Tanaka K., Kato N. // Identification of a lactoferrin-derived peptide possessing binding activity to hepatitis С virus E2 envelope protein // J. Biol. Chem., v. 278(12), pp. 10162-10173,2003.

60. Panther E., Spangenberg H.C., Neumann-Haefelin C., Rosier K., Blum H.E., von Weizsacker F., Thimme R. // The role of the virus specific T-cell response in acute and chronic HBV and HCV infection // Z. Gastroenterol., v. 42(1), pp. 39-46, 2004.

61. Petit М-A., Jolivet-Reynaud С., Peronnet E., Michal Y., and Trepo C. // Mapping of conformational epitope shared between El and E2 jn the serum-derived human hepatitis С virus envelope // JBC., p. 33., 2003.

62. Pawlotsky J.M. // Pathophysiology of hepatitis С virus infection and related liver disease // Trends. Microbiol., v. 12(2), pp. 96-102, 2004.

63. Penin F., Dubuisson J., Rey F.A., Moradpour D., Pawlotsky J.M. // Structural biology of hepatitis С virus // Hepatology, v. 39(1), pp. 5-19, 2004.

64. Pietschmann Т., Bartenschlager R. // Tissue culture and animal models for hepatitis С virus // Clin. Liver Dis., v. 7(1), pp. 23-43, 2003.

65. Pohlmann S., Zhang J., Baribaud F., Chen Z., Leslie G.J., Lin G., Granelli-Piperno A., Doms R.W., Rice C.M., McKeating J.A. // Hepatitis С virus glycoproteins interact with DC-SIGN and DC-SIGNR // J. Virol., v. 77(7), pp. 4070-4080, 2003.

66. Randall G., Grakoui A., and Rice C.M. // Clearance of replicating hepatitis С virus replicon RNAs in cell culture by small interfering RNAs // PNAS, v. 100(1), pp. 235-240, 2003.

67. Seder R.A., Hill A.V. // Vaccines against intracellular infections requiring cellular immunity // Nature., v. 406(6797), pp. 793-798, 2000.

68. Serebrov V., and Pyle A.M. // Periodic cycles of RNA unwinding and pausing by hepatitis С virus NS3 helicase // NATURE., v. 430, pp. 476-480, 2004.

69. Shaw M.L., McLauchlan J., Mills P.R., Patel A.H., McCruden E.A. // Characterisation of the differences between hepatitis С virus genotype 3 and 1 glycoproteins // J. Med. Virol., v. 70(3), pp. 361-372, 2003.

70. Shimizu Y.K., Igarashi H., Kiyohara Т., Shapiro M., Wong D.C., Purcell R.H., Yoshikura H. // Infection of a chimpanzee with hepatitis С virus grown in cell culture // J. Gen. Virol., v.79(Pt6), pp. 1383-1386, 1998.

71. Soldaini E., Wack A., D'Oro U., Nuti S., Ulivieri C., Baldari C.T., Abrignani S. // T cell costimulation by the hepatitis С virus envelope protein E2 binding to CD81 is mediated by Lck // Eur. J. Immunol., v. 33(2), pp. 455-464, 2003.

72. Steinkuhler C., Biasiol G., Brunetti M., Urbani A., Koch U., Cortese R., Pessi A., De Francesco R. // Product inhibition of the hepatitis С virus NS3 protease // Biochemistry.,v. 37(25), pp. 8899-8905, 1998.

73. Szabo E., Lotz G., Paska C., Kiss A., Schaff Z. // Viral hepatitis: new data on hepatitis С infection // Pathol. Oncol. Res., v. 9(4), pp. 215-221, 2003.

74. Tai C-L., Pan W-C., Liaw S-H., Yang U-C., Hwang L-H., and Chen D-H. // Structure-based mutational analysis of the hepatitis С virus NS3 helicase // J. of Virology., v. 75(17), pp. 8289-8297, 2001.

75. Tanikawa K. // Pathogenesis and treatment of hepatitis С virus-related liver diseases // Hepatobiliary Pancreat. Dis. Int., v. 3(1), pp. 17-20, 2004.

76. Teoh N.C., Farrell G.C. // Management of chronic hepatitis С virus infection: a new era of disease control // Intern. Med. J., v. 34(6), pp. 32437, 2004.

77. Thimme R., Oldach D., Chang K-M., Steiger C., Ray S.C., and Chisari F.V. // Determinants of viral clearance and persistence during acute hepatitis С virus infection // J. Exp. Med., v. 184(10), 1395-1406, 2001.

78. Torresi J., Bharadwaj M., Jackson D.C., Gowans E.J. // Neutralising antibody, CTL and dendritic cell responses to hepatitis С virus: a preventative vaccine strategy // Curr. Drug. Targets., v. 5(1), pp. 41-56, 2004.

79. Urbani A., Bazzo R., Nardi M.C., Cicero D.O., Francesco R., Steinkuhler C., and Barbato G. // The metal binding site of the hepatitis С virus NS3 protease//J. of Biol. Chem., v. 273(30), pp. 18760-18769, 1998.

80. Wisdom G.V. // Peptide Antigens // Oxford University Press Inc., Oxford New York Tokyo., P. 252, 1994.

81. Woollard D.J., Grakoui A., Shoukry N.H., Murthy K.K., Campbell K.J., Walker C.M. // Characterization of HCV-specific Patr class II restricted CD4+ T cell responses in an acutely infected chimpanzee // Hepatology., v.38(5), pp. 1297-1306, 2003.

82. Wood J., Frederickson R.M., Fields S., and Patel A.H. // Hepatitis С vims 3'X region interacts with human ribosomal proteins // J. of Virology, v. 75(3), pp. 1348-1358, 2001.

83. Wright-Minogue J., Yao N., Zhang R., Butkiewicz N.J., Baroudy B.M., Lau J.Y., Hong Z. // Cross-genotypic interaction between hepatitis С vims NS3 protease domains and NS4A cofactors // J. Hepatol., v. 32(3), pp. 497504, 2000.

84. Xie Z.C., Riezu-Boj J.I., Lasarte J.J., Guillen J., Su J.H., Civeira M.P., Prieto J. // Transmission of hepatitis С vims infection to tree shrews // Virology., v. 244(2), pp. 513-520, 1998.

85. Xu J., Ye L., Gao J., Zhang В., Ruan H., Wu Z. // Detection of antibody against hepatitis С vims first envelope (HCV-E1) protein and its clinical application // Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi., v. 16(4), pp. 392-394, 2002.

86. Yao P., Ни X., Hu D. // Study of hepatitis С vims specific immune responses in anti-HCV positive patients without hepatitis С viremia // Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi., v. 14(3), pp. 22730, 2000.

87. Yi M., Kaneko S., Yu D.Y., Murakami S. // Hepatitis С virus envelope proteins bind lactoferrin// J. Virol., v. 71(8), pp. 5997-6002, 1997.

88. Zhang X.X., Zhang S.Y., Liu J., Lu Z.M., Wang Y. // Expression of hepatitis С virus hypervariable region 1 and its clinical significance // World J. Gastroenterol., v. 9(5), pp. 1003-1007, 2003.