Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-термодинамические исследования химерных белков на основе спектринового SH3-домена

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-термодинамические исследования химерных белков на основе спектринового SH3-домена"

На правах рукописи

Щ'

ГУЩИНА ЛЮБОВЬ ВЛАДИМИРОВНА

СТРУКТУРНО - ТЕРМОДИНАМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ХИМЕРНЫХ БЕЛКОВ НА ОСНОВЕ СПЕКТРИНОВОГО БНЗ-

ДОМЕНА

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ПУЩИНО - 2009

003463549

Работа выполнена в Институте белка РАН.

Научный руководитель: кандидат физико-математических наук,

Филимонов Владимир Васильевич Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Железная Людмила Алексеевна доктор физико-математических наук, Семисотнов Геннадий Васильевич

Ведущая организация: Институт биоорганической химии им. академиков

М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова (г. Москва).

Защита диссертации состоится 2009 года в ^^ час. мин. на

заседании совета Д.002.038.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142290 г. Пущино Московской области, Институтская ул. 3, Институт биофизики клетки РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке Путинского НЦБИРАН

Автореферат разослан « » февраля 2009 г.

/

Ученый секретарь Диссертационного совета ~ /

кандидат биологических наук / ///(£'<_-Т.И. Смолихина

' а

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема сворачивания полипептидной цепочки в уникальную пространственную структуру является одной из важнейших и находится на стыке молекулярной биологии, физической химии и химии полимеров. Со времени классических работ Анфинсена известно, что аминокислотная цепочка белка в растворе способна самопроизвольно переходить из развернутого состояния в упорядоченное, соответствующее минимуму свободной энергии. За последние годы в понимании термодинамики сворачивания биополимеров достигнут большой прогресс и разработаны алгоритмы предсказания пространственной структуры белков, основанные на минимизации энергии. Эти алгоритмы, однако, до сих пор не дают однозначного решения из-за недостаточной точности их параметризации. Особенно это актуально для факторов, определяющих стабильность (3-структуры в растворе, а также для оценки энергетики образования полипролиновой спирали II, которая в последнее время считается наиболее предпочтительной конформацией полипептидной цепи в развернутых белках. Фрагменты белков, находящиеся в этой конформации, играют важную роль и в регуляции внутриклеточных процессов эукариот через взаимодействие пролин-богатых участков с БНЗ-доменами - компонентами киназ и других мультидоменных белков.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы является создание белковых моделей и уточнение на их основе термодинамических параметров образования элементов (3-структуры и полипролиновой спирали II, а также параметров белок - пептидных взаимодействий в системе БНЗ-домен/лиганд. Задачами исследования были:

1) проведение дизайна новых химерных белков с пептидными лигандами, присоединенными к телу БНЗ -домена;

2) разработка методики получения рекомбинантных химерных белков в препаративных количествах, в том числе образцов меченных стабильными изотопами и белковых кристаллов;

3) проведение термодинамических исследований процесса разворачивания химерных белков теплом и денатуратами, с использованием дифференциальной сканирующей калориметрии и флуоресцентной спектроскопии;

4) получение структурной информации о белках методами РСА и ЯМР;

5) анализ и структурная интерпретация полученных термодинамических данных.

Научная новизна работы. Экспериментальные подходы к исследованию модельных олигопептидов, имеющих тенденцию к образованию р-шпилек, сильно ограничены ввиду их малых размеров, плохой растворимости, склонности к агрегации и неспособности находиться в полностью структурированной форме без фиксации концов. С целью одновременного устранения перечисленных проблем и облегчения прямых калориметрических и структурных исследований было предложено использовать небольшие химерные белки, в которых имеющаяся в белке-хозяине ^-шпилька удлинена на несколько пар остатков, так, чтобы эти остатки выступали в раствор за пределы глобулы. Структурные исследования, проведенные с помощью ЯМР и РСА, показали, что встроенные фрагменты действительно находятся в конформации Р-шпилькн. В результате использования таких модельных белков впервые путем прямых калориметрических измерений были определены тепловые эффекты и изменения других термодинамических функций при образовании квази-изолированной р-структуры в растворе,

Кроме того, в данной работе был проведен дизайн новых белков путем включения в полипептидную цепь спектринового 8НЗ-домена через линкеры разной длины олигопептидов (лигандов), богатых пролином. Проведены структурные и термодинамические исследования вновь созданных белков и получена важная термодинамическая информация.

Практическая ценность работы. В работе показана перспективность использования исследованных химерных белков в качестве моделей для дальнейшего уточнения термодинамических параметров взаимодействий, определяющих сворачивание белка в уникальную структуру и его взаимодействий с партнерами. Результаты работы могут быть использованы для усовершенствования ал-

горитмов предсказания структуры, основанных на минимизации энергии. Полученные данные могут также использоваться для оценки взаимодействий SH3-доменов с синтетическими олигопептидами при создании лекарственных препаратов.

Апробация работы. Материалы работы представлены на российских и международных конференциях: FEBS Advanced Methods in Macromolecular Crystallization II (Nove Hrady, Czech Republic, 2006); International Conferences of Students, Post-graduates and Young Scientists "Lomonosov" (Moscow, Russia, 2006, 2007, 2008); International Conferences of Young Scientists (Pushchino, Russia, 2006, 2008), FEBS Workshop "The Biology of Modular Protein Domains" (Seefeld in Tirol, Austria, 2007), International Conference on Protein Biosynthesis, Structure and Function (Pushchino, Russia, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ, из них три статьи (одна находится в печати) и 9 тезисов.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на_страницах

машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждений, выводов и списка литературы, включающего_ссылок; содержит_рисунков и_таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Мутагенез и экспрессия химерных вариантов вНЗ-домена. Гены всех белков, клонированные в вектор рВАТ4, находятся под контролем изопропил-P-D-тиогалактозид индуцируемого Т7 промотора. Наличие каждой мутации подтверждали секвенированием (ИБ РАН). Экспрессию мутантных вариантов SH3-домена проводили в штамме BL2I(DE3) Escherichia coli. Рекомбинантные белки очищали с помощью гель фильтрации на АсА202 и ионообменной хроматографии на monoS.

Кристаллография. Рентгеноструктурный анализ (РСА) белковых кристаллов проводили с помощью метода молекулярного замещения. Для кристаллизации белков использовали метод диффузии паров в висящей капле при 295 К. Структуры химерных белков SHH-SH3 и C1-SH3, определенные с разрешением 1.9 А

и 1.75 А, были депонированы в РОВ с кодами доступа 20А\\' и 2РСШ, соответственно.

ЯМР спектроскопия. Отобранные для структурных исследований белки были мечены стабильными изотопами (13С и 15М) и выделены в препаративных количествах. Двумерные и трехмерные спектры ЯМР были зарегистрированы и обработаны с помощью общедоступных программ. В результате для трех белков (БНА-БНЗ, БНЫ-БЮ и Р2-8НЗ) были получены ансамбли из 20 структур, которые были депонированы в РОВ с кодами доступа 21ШО, 1РБВ и 2Ю%, соответственно.

Измерение термодинамической стабильности химерных белков с помощью калориметрии. Эксперименты проводили в буферах с ионной силой 25 мМ в диапазоне рН 2.0 - 7.0 с помощью сканирующего микрокалориметра «БсаМ» (СКАЛ, Россия) с объемом ячейки 0.32 мл и скоростью сканирования 1 К/мин. Каждую калориметрическую кривую, а также их семейства, анализировали методом минимизации (подгонки), исходя из двух равновесных схем (1 и 2, см. ниже) с целью нахождения термодинамических параметров отдельных переходов.

Флуоресцентная спектроскопия и денатурация белков мочевиной. Спектры флуоресценции регистрировались при 298 К на спектрофлуорофотометре БсЫтаски КГ-5301 РС (Япония). Длина волны возбуждения составляла в кюветах 293 нм. Рабочие концентрации белков составляли 3 мкМ, ионная сила раствора - 25 мМ. Центр масс для каждого спектра вычислялся по формуле: А^у/ ~

¿/Д; где /у ~ интенсивность флуоресценции на длине волны Х1 (нм). Для

п / м

расчета ДСц(298) Б-образные кривые разворачивания белков в мочевине анализировали, используя метод линейной экстраполяции (ЬЕМ) и бинарный метод экстраполяции (ВЕМ). Основные формулы для расчета изменения энергии Гиб-бса по этим методам выглядит так: для ЬЕМ- А^С(Сиг) = А^~т.Сиг,

для ВЕМ - Д= д^ - (и - 0.08 • СЦг) ■ СЦг.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Химерные белки типа «Бержерак».

1.1. Структурная организация химерных белков типа «Бержерак». В таблице 1 представлены фрагменты первичных структур исходного спектринового БЮ-домена (WT-SH3), его более стабильного варианта D48G-SH3 и пяти отобранных нами для структурно-термодинамических исследований вариантов химерных белков, полученных путем вставки в исходную последовательность восьми аминокислот.

Таблица 1. Фрагменты аминокислотных последовательностей исходного БНЗ-домена, его мутанта D48G-SH3 (62 а.о.) и пяти вариантов химерных белков семейства «Бержерак» (Viguera and Serrano (2001) JMB 311, 357). Вставки длиной 8 остатков подчеркнуты. Две аминокислоты, образующие p-поворот, показаны курсивом, остатки аланина, введенные в различные позиции «носа», выделены жирным шрифтом.

1 46 abed 48 abed 43 62(70)

WT : MDE, .WWKVEV----ND----RQG. .KLD

D48G: MDE..WWKVEV----NG----RQG..KLD

SHH : MDE..WWKVEVKITVWGKTYERQG. .KLD

SHI : MDE..WWKVEVKATVNGKTYERQG..KLD

SHA : MDE. .WWKVEVKATAA/GKTYERQG. .KLD

SHE : MDE.■WWKVEVKATAaGKTYERQG..KLD

SHT : mde..WWKVEVKIAVNGKAYERQG..KLD

Предполагалось, что такие вставки удлинят центральную ¡З-шпильку исходного домена, так чтобы она выступала за пределы глобулы в виде длинного «носа», поэтому это семейство было названо «Бержерак». Аминокислотная последовательность для вставки с наиболее стабильной конформацией (вариант SHH-SH3) конструировалась из элементов, стабилизирующих p-структуру: (3-поворота NG, противостояния Т-Т, гидрофобного кластера (в данном случае IVY) и пары КЕ с оптимизированным электростатическим взаимодействием. Все остальные варианты семейства создавались путем исключения этих элементов в результате одиночных или парных замен соответствующих остатков на аланин.

Ранее химерные белки этого семейства были созданы для изучения кинетики разворачивания малых глобулярных белков. Мы использовали «Бержера-ки» для уточнения термодинамических параметров образования квазиизолированных р-шпилек в растворе. Для адекватного применения термодинамического подхода необходимо было убедиться, что во всех перечисленных вариантах шпилька образуется в составе химерных белков при комнатной температуре и при воздействии денатурирующих агентов (мочевина, температура) структура химерных белков будет разрушаться кооперативно. 1.2. Физико-химические характеристики белков семейства «Бержерак». Основные исследования были выполнены методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии (ДСК) в кислой области рН. Было показано, что в этой области (рН 2.5 - 3.5) при относительно низкой концентрации белков (около 250 мкМ) и низкой ионной силе (25 мМ) тепловое разворачивание всех вариантов высоко обратимо, профили теплопоглощения не зависят от скорости прогрева или концентрации белка. Большинство зарегистрированных при этих условиях функций СР(Г) хорошо описывается простой моделью двух состояний:

Ки

N О и (1),

(рис. 1А). Сам по себе этот вывод не тривиален, поскольку можно предсказать, что при сильном снижении собственной стабильности структуры вставки, она может оказаться неструктурированной даже в составе химерного белка. Однако для выбранных нами химерных вариантов фиксации концов вставки путем её встраивания в стабильную структуру белка оказалось достаточно для того, чтобы Р-шпилька не только образовывалась, но и оставалась свернутой до полной денатурации всего химерного белка.

Температурные зависимости тепловых эффектов разворачивания некоторых наиболее полно изученных вариантов в сравнении с температурной функцией для исходного белка (\УТ-8НЗ) представлены на рис. 1Б. Видно, что тепловой эффект разворачивания структуры варианта 8НА-8НЗ при всех значени-

ях температуры существенно превосходит тепловой эффект разворачивания исходного белка.

J—I—I—I—I—1—1—I—1—I—I—I—I—I—к I. I_* '

320 330 Т(К)

Рис. 1. А - температурные зависимости парциальной молярной теплоемкости варианта ЭНЛ-

БНЗ от температуры середины перехода при разных рН: 2.0 (_), 2.2 (.....), 2.5 (-----), 2.8

(_.._.._), 3.0 (___) и 3.5 (_•_■_)• Нижний график: экспериментальные кривые плавления БНА-

ЭНЗ; верхний график: семейство кривых, симулированных на основе экспериментальных данных. Подгонка функций Ср(Т) осуществлялась по модели двух состояний (1). Ср х, Ср,и -теплоемкости нативного и развернутого состояний, соответственно; Б - температурные зависимости теплового эффекта одностадийного денатурационного перехода для вариантов БНА-ЭНЗ (пустые кружки) и 8НН-8НЗ (залитые треугольники). Сплошная и штрих - пунктирная линии показывают квадратичные функции, наилучшим образом описывающие экспериментальные данные. Штриховая линия соответствует литературным данным, полученным ранее для исходного \VT-SH3 домена.

Разница при температуре 323 К составляет 16.4 ± 4 кДж/моль, то есть в предположении, что в тепловой эффект в случае БНА-БШ вносит вклад только разрушение четырех дополнительных водородных связей, получаем, примерно, 4.1 кДж/моль на одну водородную связь в ¡3-шпильке, полностью экспонированной на растворитель. Эта величина, впервые полученная с помощью сканирующей калориметрии, находится в хорошем соответствии с литературными данными по энергетике водородной связи.

Из рис. 1Б. также видно, что тепловой эффект разворачивания структуры SHH-SH3 ниже, чем для SHA-SH3, несмотря на то, что у этого варианта самая стабильная третичная структура. По-видимому, занижение теплового эффекта разворачивания SHH-SH3 связано с наличием на его поверхности плотного гидрофобного кластера IVY. Этот вывод подтверждается тем, что значение ДдРн, найденное для SHT-SH3, также содержащего IVY кластер, ближе к ДNUH SHH-SH3, чем к л/tf SHA-SH3.

При рН ниже 2.5 и выше 4.0 кривые плавления всех вариантов, кроме SHA-SH3, усложняются, особенно это характерно для плавления SHH-SH3, и в некоторой степени для SHE-SH3. И хотя кривые, записанные при рН 2.5 и ниже, удовлетворительно описывались схемой (1), кажущиеся тепловые эффекты разворачивания SHH-SH3 оказались ниже, чем для WT-SH3 (рис. 1Б). При отсутствии белковой агрегации, наиболее вероятное объяснение этого факта заключается в том, что в этих условиях разворачивание структуры происходит по более сложной схеме:

Ki Ки

N о I <-> U (2).

При рН 7.0 и высокой температуре развернутое состояние всех «Бержера-ков» обнаруживает довольно сильную тенденцию к образованию олнгомеров и/или агрегатов. Такое поведение является типичным для большинства глобулярных белков вблизи их изоэлектрических точек.

Полный набор термодинамических данных, полученных из экспериментов для всех исследованных вариантов химерных белков типа «Бержерак» представлен в таблице 2. Из таблицы видно, что замена остатка аспарагина на ала-нин (SHE-SH3) в оптимизированном Р-повороте NG, приводит к значительной дестабилизации структуры шпильки и соответственно всего белка на 3.5 кДж/моль. К очень сильной дестабилизации структуры приводит замена двух остатков треонина, находящихся в противостоянии друг другу, на аланины (SHT-SH3). Структурные основы этого явления не совсем понятны, так как во всех структурах, определенных нами, между этими остатками треонина нет прямых водородных связей. Частичное (вариант SHI-SH3) или полное (SHA-

SH3) разрушение гидрофобного кластера IVY также приводят к заметной дестабилизации структуры шпильки.

Таблица 2. Термодинамические параметры разворачивания структур химерных белков типа «Бержерак» при рН 3.0 по данным ДСК.

Химерный белок Тя( К) ANUH(TJ (кДж/молъ) (кДж/К моль) ¿nuG(29&) (кДж/моль)

1 SHH 337.9 210.0 0.621 16.0

2 SHE 333.3 196.6 0.590 13.5

3 SHI 332.1 192.9 0.581 12.9

4 SHT 330.0 186.2 0.564 11.8

5 SHA 330.0 194.3 0.589 12.8

Рис. 2, Результаты анализа кривых равновесного разворачивания структуры химерного белка 8НЛ-5НЗ под действием мочевины при 298 К при разных рН (А - рН 2.8; 0 - рН 3.0; ■ - рН 3.5; V - рН 4.0; • - рН 7.0). Линиями показана подгонка данных по одностадийной модели ВЕМ.

Кроме тепловой денатурации белков, мы провели равновесные эксперименты по разворачиванию БНА-БИЗ мочевиной, используя триптофановую флуоресценцию. Наборы спектров были получены при 298 К и выбранных значениях рН. Для построения кривых разворачивания (рис. 2) каждый спектральный набор был обработан так, как описано в разделе «Материалы и методы».

Оказалось, что значения А^С?, найденные с помощью модели ВЕМ, практически совпадают с данными ДСК при рН 3.0. Неожиданно выяснилось, однако, что при рН 4.0 и 3.5 структура БНА-БЮ более устойчива к воздействию мочевины, чем при рН 7.0, чего не наблюдалось для МГГ-БНЗ. К такой аномалии могло привести образование при средних значениях рН и низкой концентрации мочевины олигомерных форм (димеров или даже тетрамеров), обнаруженных нами для ЗНН-БНЗ методом РСА.

Смоч (М)

1.3. Структурные исследования белков типа «Бержерак». Методом ЯМР высокого разрешения были определены структуры двух белков: SHH-SH3 (с IVY кластером) и SHA-SH3 (без IVY кластера) (Прохоров и другие. Биоорган. Хим. 34, 645). Эти белки обладают столь же хорошей растворимостью в кислой области рН, что и исходный белок, а их физико-химические свойства были изучены лучше всего. Клетки Е. coli, несущие соответствующие плазмидные ДНК, были выращены нами на минимальной среде, содержащей стабильные изотопы С и после чего обогащенные этими изотопами белки были выделены в препаративных количествах. Упрощенные модели структурной организации полипептидного остова этих белков показаны на рис. ЗА.

Рис. 3. А - суперпозиция скелетных моделей структур химерных белков типа «Бержерак» SHH-SH3 (ЯМР - черный контур) и SHA-SH3 (ЯМР - темно-серый контур) и белка дикого типа WT-SH3 (РСА - светло-серый контур); Б - значения среднеквадратичных отклонений (RMSD) для каждого остатка SHH- и SHA- SII3 «Бержерак», полученные из ЯМР структур этих белков.

На рис. ЗБ представлены данные расчета RMSD для каждого остатка белков SHH- и SHA- Бержерак из набора 20 структур. Значения локального RMSD для семи N- и двух С- концевых остатков белков свидетельствуют о высокой подвижности этих участков. Для остатков 48 - 55, находящихся в составе удлиненной Р-шпилыси («носа»), наблюдаются RMSD ~ I Á, что указывает на ее относительную лабильность, однако подвижность этого участка у SHH-SH3 ниже, чем у SHA-SH3, что как показано выше, коррелирует с разницей в стабильности шпильки.

Как видно из рис. ЗА и ЗБ, укладки цепей в белках SHH-, SHA- и WT- SH3 на гомологичных участках достаточно хорошо совпадает, несмотря на то, что структуры получены разными методами. В ЯМР структурах SHH- и SHA- SH3 выделяется длинный «нос», представляющий собой антипараллельный Р-лист, характерно закрученный в виде пропеллера. Довольно заметное удлинение полипептидных цепей «Бержераков» по сравнению с исходным белком (~ 17%) практически не отражается на общей топологии молекул: все элементы вторичной структуры исходного домена сохраняются и в химерных белках. Кроме того, трехмерные структуры обоих белков содержат все особенности, которые характерны для других Sro-доменов, включая участок связывания полипролино-вых последовательностей.

Кроме того, вариант SHH-SH3 был нами закристаллизован и его третичная структура определена методом РСА с разрешением 1.9 Á. Кристаллы были получены при рН 4.5 (рис. 4) и в этих условиях химерный белок образовывал тет-рамеры в кристаллической ячейке (рис. 5А). Было обнаружено, что тетрамеры образуются за счет взаимодействия «носов», тогда как тела доменов практически не взаимодействую друг с другом в элементарной ячейке. Более детальный анализ носа (рис. 5Б) показал, что кластеры, образованные боковыми остатками I46b/V46d/Y48c (IVY кластер), каждой Р-шпильки организуют гидрофобное ядро, которое имеет плотную упаковку как обычное гидрофобное ядро небольшого глобулярного белка. А сеть внутри- и меж- молекулярных водородных связей стабилизируют эту конформацию.

* * Н л. V|? 1

J * <1 * Кристаллы белка SHH-SH3, выращенные в

»'It

Л t ' ; капле, содержащей 7.5% раствор малоната натрия,

' ; 25 мМ глицина, рН 4.5 с концентрацией белка в

•г - Л :

О- " капле 5 мг/мл и уравновешенной против 15%

. ; раствора малоната натрия, 50 мМ глицина, рН 4.5.

Рис, 5. Структура химерного белка ЭНН-БЮ по данным РСА: А - упаковка четырех полипептидных цепей БИН-БЮ в кристаллической ячейке; Б - плотная упаковка четырех «носов» БНИ-вНЗ в кристалле. «Носы» показаны разными оттенками серого, пунктиром обозначены водородные связи. Видно, что остатки изолейцина, валина и тирозина четырех цепей образуют плотное гидрофобное ядро в центре.

Рис. 6. Среднеквадратичные отклонения (ЯМБО) между положениями атомов основной цепи двух гомологичных структур. Серым цветом показаны отклонения между цепями А и Б в кристаллической структуре БИН-вНЗ, черным цветом - отклонения между гомологичными фрагментами 0480-БНЗ и А-цепью ЗМН-ЭНЗ.

20 30 40 Номер остатка

Как показано на рис. 6, основная часть цепи 8НН-8НЗ имеет конформацию близкую к конформации мутанта Б480-8НЗ за исключением положений, фланкирующих вставку (выделена серым цветом) и формирующих КТ-петлю (остатки 19-21). Обе аномалии, возможно, являются следствием кристаллизационных эффектов: ориентации четырех носов по отношению к телам доменов неодинаковы, к тому же они обладают определенной гибкостью (рис. 6). Аналогичным образом, гибкая ЛТ-петля фиксируется в искривленной конформации вследствие соприкосновения боковых цепей 1121, принадлежащих смежным кристаллическим ячейкам. Такая тенденция к образованию надмолекулярных

' комплексов за счет «липких» гидрофобных кластеров на поверхности ß-шнилек | может играть важную роль и в растворе, однако в ЯМР экспериментах ассоциа-

I

I тов обнаружено не было даже при сравнительно высоких концентрациях белка. В целом можно заключить, что во всех выбранных нами вариантах химер-

ных белков «Бержерак» олигопептидные вставки образуют регулярную и стабильную вторичную структуру в виде р-шпилек, экспонированных на растворитель.

II. Химерные белки с пришитыми лигандами.

Известно, что ЭНЗ-домены в составе мультидоменных белков осуществляют регуляторные функции путем взаимодействия с пролин-богатыми участками белка-хозяина и/или белков-партнеров. Основную роль при этом играет протяженное консервативное место связывания пептидов, расположенное на поверхности домена и образованное, как правило, четырьмя остатками: триптофаном, пролином и двумя тирозинами, как это показано для С-вгс домена на рис. 7.

Кроме того, связывание может происходить и за пределами консервативного участка, в частности, в так называемом «кармане специфичности». Оптимизированное взаимодействие в районе этого кармана обеспечивает селективность связывания пептида. Несмотря на то, что участок связывания лиганда оказывается весьма протяженным, БНЗ-домены имеют сравнительно невысокое сродство к модельным пептидам: наименьшие константы диссоциации находятся на уровне 1 мкМ. Для наилучшего из лигандов, известного для спектри-

Рис. 7. Модель третичной структуры комплекса ЭНЗ-домена БЯС-киназы (показан в виде ленты) и пептидного лиганда АРР12 (показан в виде скелетной модели). Серым цветом выделены

Л консервативные остатки, образующие место

Туг(,о связывания пептида в большинстве БГО-доменов. Диганд лежит на месте связывания в ориентации II (Ы-конец пептида у остатков тирозина). Карман специфичности расположен слева от остатка триптофана.

нового домена, константа диссоциации составляет примерно 160 мкМ. Фрагменты пептидов, лежащие на консервативном участке связывания, находятся в конформации полипролиновой спирали II и способны связываться с БНЗ-доменами в двух противоположных ориентациях, I и II. При этом для спектри-нового домена было до сих пор показано связывание лигандов в ориентации I и оставалось неясным, способен ли этот домен прочно связывать пептидные ли-ганды в ориентации II.

Невысокое сродство модельных пептидов к БНЗ-доменам сильно затрудняет структурно-термодинамические исследования их взаимодействий ввиду необходимости использования высоких концентраций компонентов. Поэтому, для облегчения исследований и для увеличения прочности комплекса домен-пептид были созданы химерные варианты, в которых пептидные лиганды присоединены к домену на генном уровне. Такая «пришивка» лиганда к домену через гибкую петлю имеет ряд практических преимуществ: а) сродство лиганда к домену должно возрастать за счет превращения бимолекулярной реакции в мономолекулярную; б) становится возможным изменение специфичности и сродства лиганда в широких пределах с помощью мутагенеза; в) появляется возможность фиксации лиганда в определенной ориентации; г) решается проблема растворимости лиганда; д) структуру таких белков легче определять как методом ЯМР, так и РСА.

11.1. Дизайн химерных белков с пришитыми лигандами. Для проверки возможности связывания спектриновым БНЗ-доменом лигандов в ориентации II были сконструированы несколько белков путем удлинения аминокислотных последовательностей Р\УТ-8НЗ (домен псевдодикого типа) и его кругового пермутанта 819Р20з-8НЗ (табл. 3, 4). В случае РТ/Т-ЭНЗ использовались линкеры длиной 10-12 аминокислотных остатков, поскольку С-конец белка удалён от консервативной поверхности связывания, а в случае 819Р20з-8НЗ были применены короткие линкеры длиной 2-3 остатка, так как место связывания находится вблизи разрезанной ИТ - петли.

Таблица 3. Аминокислотные последовательности спектринового ЭНЗ-домена псевдодикого типа (Р\¥Т-8НЗ) и его кругового пермутанта 9Р20б-8НЗ). Идентичные фрагменты выделены жирным шрифтом и подчеркиванием.

РЯТ: т6ТОКЕЬУЬАЬУРУ0ЕКЗРНЕУТМКК6А1ЬТЬШЗТ№Ш№»КУТУЫРЕавГУРААГУККЬС

319Р203: т6РНЕтаШСеР1ЬТЬШ5Т1ШЗИИКУЕУ1ГОН0СГУРДЯУУ1аа.Р36ТСКЕЪУЬДЬУРУаЕКЗ

Таблица 4. Химерные белки, сконструированные на основе РШТ-ЭНЗ и 519Р20з-8НЗ.

Линкеры выделены курсивом, лиганды жирным шрифтом.

А) Химерные белки на основе в 19Р20э (модель - лиганд-линкер-белок).

ЬУ11/6С/819Р20з (Е-2) : тйАРРЬРРУБА- й 19 Р 2 0 э

Б) Химерные белки на основе Р\УТ (модель - белок-линкер-лиганд).

РИТ/5Р12/УУ10 (С1) : РИТ-РАОБАЗЯЕМЬвС-РРРУРРЯ БАЙ

РИТ/ЗСЮ/ЪУЭ (С2) : рит-ббсгекшзе-рррьррувА

Р№Г/2610/1)У9 (СЗ) : рт-ввтзмшвв-юхьючзА.

РИТ/2С9/ЬУ9 (С<3) : PWT-GGiг5ДД^ÍGG-PPPЬPPYSA

РШ/ЗвЮ/ЪЮ (С5) : рит-ссе/зйддас-рррьрри

РИТ/3610/ЬКЕ8 (С6) : РИТ-вССгеКРШЗ-РРРЬРРБ®

РИТ/ЗС10/ЪНЕ8 (С7) : рит-еебУЗдлшг-рррьррнЕ

Н.2. Структурные исследования белков с пришитыми лигандами. II.2.1. Структурные исследования Р2-ШЗ методом ЯМР. Для определения структуры Р2-8НЗ нами был получен препарат этого белка, меченный стабильными изотопами углерода (13С) и азота (15М), а структурные исследования были проведены совместно с группой В.П. Кутышенко (ИТЭБ РАН). Скелетная модель усредненной структуры данного белка представлена на рис. 8.

Рис. 8. Модель пространственной структуры химерного белка Р2-8НЗ. Основная цепь кругового пермутанта 819Р20з-8НЗ схематично показана в виде ленты. Консервативное место связывания в виде четырех остатков (триптофана, пролина и тирозинов) выделено темно-серым цветом. Черным цветом слева показан линкер, состоящий из двух остатков глицина.

Как видно из представленной модели, лиганд прочно садится на консервативное место связывания в конформации полипролиновой спирали и ориентации II. Остаток лейцина лиганда занимает место в углублении, на дне которого располагается консервативный остаток Рго47. Однако в «кармане специфичности» находится не остаток тирозина лиганда, как ожидалось, а следующие за ним аминокислотные остатки серина и аланина.

Никаких дополнительных водородных связей при посадке лиганда не образуется. На рис. 9 представлены данные расчета КМ8Б для каждого остатка Р2-8НЗ из набора 20 структур. Значения локального ЯМБО для последних С-концевых остатков белка свидетельствуют о высокой их подвижности, однако они более фиксированы в сравнении с КМЭО концевых участков родительского кругового пермутанта. Для остатков лиганда 11М8Б не превышает ~ 0.4 А (то есть он занимает довольно фиксированное положение), а для остатков линкера несколько выше, что указывает на относительную гибкость последнего. Значения 1Ш8Э для остальных остатков основной цепи белка не превышает 0.5 А, а на отдельных участках еще ниже.

1.4 1.2 -1.0 -

О

ОТ 0.8 Н

г

* 0.6 4

0.4 -0.2 -0.0

Атомы ОСНОВНОЙ цепи рг-ЭНЗ ■ЯШ Атомы линкора Р2-5ИЗ

Концевые атомы 519Р20$-5НЗ

Й|н Ц] ФНШН

„«А

,¡1

~г

т

0 10 20 30 40 50 60 Номер остатка

Рис. 9. Среднеквадратичные отклонения (1Ш80) двадцати структур Р2-8НЗ, вычисленные относительно средней структуры. Первый и последний (73 а.о.) в расчет не включались. Черным цветом выделен участок линкера (йО), а темно-серым - С-концевой фрагмент кругового пермутанта Э19Р20з-8НЗ (остатки 56 - 61).

Таким образом, показано, что круговой пермутант спектринового 8НЗ-домена способен одинаково хорошо связывать лиганды как в ориентации I, так и в ориентации II.

П.2.2. Структурные исследования С1-БНЗ методом РСА. Нами были получены кристаллы данного белка (рис. 10) хорошего качества, что позволило определить его структуру с высоким разрешением 1.75 А (рис. 11).

16

Рис. 10. Кристаллы белка СЛ-БНЗ, выращенные в капле, содержащей раствор 1 М сульфата аммония, 20 мМ ацетата натрия, 5 мМ р-МЕ, рН 4.6. Концентрация белка в капле 7.5 -10 мг/мл, которая уравновешенна

против 2 М раствора сульфата аммония.

Из рис. 11 видно, что в элементарной ячейке кристалла находятся две глобулы 8НЗ-домена, консервативные места связывания которых обращены друг к другу, а между ними зажат фрагмент одного из лигандов. По отношению к одному домену этот лиганд лежит в ориентации 1, а по отношению к другому - в ориентации II, при этом, нельзя однозначно сказать какому домену принадлежит данный лиганд.

Таким образом, в одной структуре реализуются обе ориентации лиганда и только за счет связывания канонической последовательности полипролиновой спирали, поскольку «карман специфичности» в данном случае оказывается не заполненным - остаток тирозина, также как в случае белка F2-SH3, в него не ложится. По-видимому, такой комплекс имеет относительно высокую стабильность, однако возможность его образования была показана впервые и позволяет сделать предположение, что аналогичные структуры могут образовываться и in vivo, поскольку известно, что в составе многих киназ встречаются несколько SH3-доменов, следующих один за другим.

й

f

Рис. П. Две проекции модели пространственной структуры белка О-БНЗ. В элементарной ячейке кристалла оказались зафиксированными лишь конформации двух доменов и фрагмента рррурр"/ одного из двух лигандов.

II.3. Физико-химические характеристики белков с пришитыми лигандами. II.3.1. Физико-химические характеристики F2-SH3.

Денатурация F2-SH3 мочевиной. На рис. 12. представлены зависимости центра масс спектров F2-SH3 при четырех значениях рН. Кривые имеют характерную для кооперативного одностадийного перехода S-образную форму и хорошо подгоняются по модели ВЕМ, в том числе при одновременной подгонке семейства кривых с общими для всего семейства базовыми линиями и параметром т. В таблице 5 приведены термодинамические параметры, полученные при подгонке экспериментальных кривых плавления.

Рис. 12. Результаты анализа кривых равновесного разворачивания структуры химерного белка F2-SH3 под действием мочевины при 298 К при разных рН (▲ - рН 3.0; • - рН 3.5; ■ - рН 4.0; ♦ - рН 7.0). Сплошные линии показывают результаты одновременной подгонки по одностадийной модели ВЕМ. Пунктиром обозначены базовые линии нативного и 12 развернутого состояний.

Смоч(М)

Таблица 5. Термодинамические параметры, найденные в ходе одновременной подгонки кривых мочевинной денатурации F2-SH3 по модели ВЕМ в предположении об одностадий-ности перехода. В результате подгонки также выяснилось, что базовые линии не зависят от концентрации мочевины: Xcw.u - 366.04 нм и Xcw,n = 348.16 нм. Для сравнения приведены данные, полученные для исходного пермутанта методами мочевинной денатурации (#, (Viguera et al. (1995) JMB 247, 670) и сканирующей микрокалориметрии (*, (Martinez et al. (1999) Biochem. 38,549).

рН т (кДж/К моль) &nuGwu (кДж/моль)

3.0 3.98 ± 0.04 10.94 ±0.3

3.5 4.05 ±0.08 12.93 + 0.5

4.0 4.08 ±0.03 19.16 ±0.3

7.0 3.98 ±0.03 (2.8 ±0.05/ 23.51 ± 0.3 (10.4 + 0.3)#, (11.1 ± 0.6)'

Из рисунка и таблицы видно, что мочевинная денатурация химерного белка Р2-БНЗ проходит кооперативно и сопровождается заметным увеличением как изменения свободной энергии (стабильности), так и параметра т, по срав-

18

нению с исходным белком. (Как правило, величина последнего хорошо коррелирует с размером кооперативной единицы). Эти наблюдения подтверждают результаты структурного анализа и свидетельствуют о большом стабилизирующем воздействии на структуру домена пришивки лиганда через короткий линкер.

Тепловая денатурация Р2-ЗНЗ. Микрокалориметрические исследования химерного белка Р2-8НЗ с коротким линкером также подтвердили, что его полипептидная цепь сворачивается в стабильную и кооперативную структуру.

Рис. 13. Температурные зависимости теплового эффекта разворачивания исходного кругового пермутанта 819Р20з-8НЗ (квадраты, литературные данные) и химерного белка Р2-8НЗ (кружки). Сплошная и штрих - пунктирная линии показывают квадратичные функции, наилучшим образом описывающие

300 310 320 330 340 350 экспериментальные данные.

Т(К)

На рис. 13 представлены результаты калориметрических исследований химерного варианта Р2-8НЗ в сравнении с ранее полученными данным для исходного кругового пермутанта. Из рисунка видно, что при одном и том же значении рН Р2-8НЗ имеет более стабильную структуру, чем 819Р20б-8НЗ. Основной вклад в увеличение стабильности вносит высокий отрицательный тепловой эффект, сопровождающий посадку лиганда на место связывания в составе химерного белка. Полный анализ калориметрических данных показывает, что тепловой эффект при 323 К составляет около 37 кДж/моль. Это большая величина, соответствующая примерно трети теплового эффекта разворачивания пермутанта при этой же температуре, в то время как лиганд с линкером составляют лишь шестую часть от полной длины химерного белка. Все тепло выделяется без образования дополнительных водородных связей внутри увеличенной белковой глобулы. Исходя из оценки площадей гидрофобной и гидрофильной поверхностей, прикрываемых от растворителя при образовании структуры Р2-

19

БНЗ, и существующих эмпирических соотношений, можно ожидать, что инкремент парциальной теплоемкости при разворачивании структуры, ДциСр, у химерного белка должен быть гораздо выше, чем у исходного пермутанта. Однако это не так, и ДциСр у двух белков примерно одинаковы. 11.3.2 Физико-химические характеристики белков с лигандами, пришитыми через длинный линкер.

Денатурация белка С1-БНЗ мочевиной. Чтобы установить, садится ли лиганд на место связывания в составе мономера белка СЬБНЗ, нами были зарегистрированы спектры флуоресценции белка при разных значениях рН и проведены опыты по разворачиванию его структуры мочевиной.

Рис. 14. Результаты анализа кривых равновесного разворачивания белков СЛ-ЭНЗ (кружки) и РШ'-ЗНЗ (треугольники) под действием мочевины. Зачерненные символы - рН 7.0, светлые кружки - рН 3.5, светлые треугольники - рН 4.0. Сплошные линии показывают результаты наилучшей подгонки данных при рН 7.0 по одностадийной модели (1) для исходного белка и двухстадийной модели (2) для химерного белка. Верхняя пунктирная кривая показывает общую базовую линию для развернутых состояний белков. Нижняя пунктирная линия соответствует изменению центра масс спектра дая первого, а штрих - пунктирная линия - для второго перехода в модели (2). Верхний рисунок: зависимости заселенностей трех состояний СЛ-вНЗ в двухстадийной модели (сплошная линия - состояние N. пунктирная линия - состояние I, штрих -пунктир - развернутое состояние Ц).

Для этого белка регистрации триптофановой флуоресценции отдано предпочтение перед методом сканирующей микрокалориметрии по ряду причин. Во-первых, один из остатков триптофана находится непосредственно на поверхности связывания лиганда и его спектр должен изменяться при контакте с последним. Во-вторых, метод флуоресценции обладает высокой чувствительностью, что позволяет избежать процессов олигомеризации, работая при низких концентрациях белка. В третьих, оказалось, что тепловая денатурация С1-БНЗ при нейтральных рН сопровождается агрегацией развернутых цепей, а в

области кислых рН наблюдается гидролиз нолииептидной цепи по свну.; AspPro непосредственно в калориметрической ячейке.

Результаты равновесного разворачивания исходного PWT-SH3 и C1-SH3 белков мочевиной в нейтральной и кислой областях рН показаны на рис. 14. Следует отметить, что в целом спектр нативной формы C1-SH3 сдвинут по отношению к спектру исходного домена в коротковолновую область, что свидетельствует в пользу уменьшения доступности остатков триптофана растворителю, вероятно, за счет их экранирования лигандом. Если для исходного белка центр массы спектра (A-cw) находится в районе 352 нм, то для C1-SH3 он расположен около 349 нм, в то время как у химерного белка F2-SH3 XCw в отсутствие мочевины расположен в районе 348 нм. Поскольку из анализа структуры F2-SH3 видно, что лиганд прочно сидит на месте связывания и, действительно, плотно контактирует с одним из остатков триптофана, можно предположить, что аналогичный контакт имеется и в химерном белке C1-SH3. На кривых разворачивания белков мочевиной видно, однако, что при рН 7.0 начальный участок кривой для C1-SH3 имеет аномально высокий наклон. По-видимому, эта широкая кривая отражает не один одностадийный переход, как в случае исходного PWT-SH3 белка, а два последовательных, первый из которых соответствует диссоциации лиганда с поверхности связывания. Исходя из этого предположения, для анализа кривых плавления химерного белка C1-SH3 была использована двухстадийная равновесная схема (2). Анализ результатов показал, что: а) сродство лиганда к домену в составе белка C1-SH3 невелико и полностью свернутое состояние (N) даже в отсутствие мочевины заселено лишь на 70% или чуть больше с учетом погрешности анализа; б) понижение рН приводит к дестабилизации структуры C1-SH3, в основном, за счет дестабилизации структуры самого домена (состояния I) примерно также, как это происходит с исходным белком; в) сильное понижение стабильности промежуточного состояния I химерного белка при понижении рН до 3.5 приводит к тому, что это состояние перестает заселяться, то есть денатурационный переход приближается к модели двух состояний.

Тепловая денатурация белков с длинным линкером. Калориметрические исследования остальных химерных вариантов с длинными линкерами, сконструированных без связи Asp-Pro, показали, что если лиганды и садятся на место связывания в кислой области рН, то их сродства к домену не достаточно для образования кооперативного комплекса, поскольку увеличения энтальпия и температуры перехода не наблюдается. Статистическое превышение тепловых эффектов разворачивания химерных белков над тепловым эффектом разворачивания PWT-SH3 наблюдается только в нейтральных значениях рН (рис. 15) и оно невелико. Скорее всего, потому, что и в ходе тепловой денатурации реализуется схема разворачивания (2) с высокой заселенностью промежуточного состояния. Приходится сделать вывод, что длинный линкер (10 - 12 остатков) не обеспечивает существенного увеличения сродства лиганда к домену по сравнению с бимолекулярной реакцией.

Рис. IS. Температурные зависимости тепловых эффектов разворачивания химерных белков с длинными линкерами: а - С2-SH3; А - C3-SH3; о - C4-SH3; ■ -C5-SH3; Д - C6-SH3; • - C7-SH3. Нижняя сплошная кривая -регрессия по данным PWT-SH3 белка.

Т(К)

выводы

1. Созданы, подобраны и охарактеризованы модельные конструкции, пригодные для определения вкладов различных структурных элементов в термодинамику сворачивания полипептидных цепей и белок - лигандных взаимодействий.

2. Прямыми структурными исследованиями методами ЯМР и РСА показано, что включение в аминокислотную последовательность БНЗ-домена четырех пар специально подобранных аминокислот приводит к образованию удлиненной стабильной р-шпильки, экспонированной на растворитель.

3. Методом сканирующей микрокалориметрии показано, что удлиненная шпилька встраивается в единую кооперативную систему белка. Это позволило напрямую определить некоторые термодинамические параметры образования квази-изолированной р-структуры и провести их структурную интерпретацию.

4. Показано, что тепловой эффект образования одной водородной связи в рамках доступного растворителю элемента Р-структуры составляет примерно - 4 кДж/моль, что хорошо согласуется с косвенными литературными данными.

5. Проведен дизайн новых химерных белков на основе спектринового 8НЗ-домена с лигандами, включенными в полипептидную цепь белка.

6. Показано, что присоединение лиганда к телу домена через короткий линкер приводит к его прочной посадке на консервативное место связывания в ориентации II с образованием новой единой кооперативной системы.

7. Обнаружено, что сворачивание такого химерного белка сопровождается большим тепловым эффектом (- 37 кДж/моль), нулевым изменением теплоемкости и значительным увеличением стабильности структуры (- 10 кДж/моль). Большой тепловой эффект и отсутствие изменения теплоемкости находятся в противоречии с некоторыми общепринятыми структурно-термодинамическими корреляциями и, по-видимому, определяются параметрами образования поли-пролиновой спирали II в ходе фиксации лиганда на домене.

8. Присоединение лиганда к телу белка через длинный линкер (10 - 12 остатков) не дает термодинамической выгоды по сравнению с бимолекулярной реакцией связывания.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНО В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

1. L.V. Gushchina (2006). Structural thermodynamics investigation of the new chimeric proteins on basis of circular permutant of the a-spectrin SH3 domain. XIII International Conference of Students, Post-graduates and Young Scientists "Lomonosov-2006", Moscow, Russia 12-15 April. Collected thesis, pp. 69-70.

2. L.V. Gushchina, R.D. Gaisin, V.V. Filimonov (2006). Design and investigation of chimeric proteins on base of the circular permutant SH3-domain. 10-th International Conference of Young Scientists. Pushchino, Russia 17-21 April. Collected thesis, p. 13.

3. R.D. Gaisin, L.V. Gushchina, V.V. Filimonov (2006). Design and physical-chemical properties of the chimeric protein on basis of the a-spectrin SH3-domain. 10-th International Conference of Young Scientists. Pushchino, Russia 17-21 April. Collected thesis, p. 8.

4. L.V. Cushchina, A.G. Gabdulkhakov and V.V. Filimonov (2006). Crystallization of the spectrin SH3 domain complex with a proline-rich ligand in the orientation II. FEBS Workshop "Materials Structure in Chemistry, Biology, Physics and Technology". Nove Hrady, Czech Republic, CSCA 13(4): 213-214.

5. L.V. Cushchina. T.A. Nikolaeva and V.V. Filimonov (2007). The investigation of chimeric SH3 domains with proline-rich peptide ligands. XIV International Conference of Students, Post-graduates and Young Scientists "Lomonosov-2007". Moscow, Russia 11-14 April. Electronic-collected thesis.

6. L.V. Gushchina. A.G. Gabdulkhakov, V.V. Filimonov (2007). The structure of the chimeric protein imitating SH3-peptide interaction. International Conference on Protein Biosynthesis, Structure and Function. Pushchino, Russia 9-13 June, p 44.

7. L.V. Gushchina. V.V. Filimonov (2007). Chimeric derivatives of SH3-domains. FEBS Workshop "The Biology of Modular Protein Domains ". Seefeld in Tirol, Austria 8-13 September, pp. 54-55.

8. L.V. Gushchina, A.G. Gabdulkhakov, V.V. Filimonov (2008). Structural and thermodynamic studies of bergerac-SH3 chimeras. XV International Conference of Students, Post-graduates and Young Scientists "Lomonosov-2008 ". Moscow, Russia 8-11 April. Collected thesis, p. 147.

9. L.V. Gushchina, A.G. Gabdulkhakov, V.V. Filimonov (2008). High-resolution X-ray structure of the chimeric protein type "SHH - Bergerac". 12-th International Conference of Young Scientists. Pushchino, Russia 10-14 November. Collected thesis, p. 18.

10. Д.А Прохоров, M.A. Тимченко, Ю.А. Кудреватых, Д.В. Федюкина, JIB. Гущина. B.C. Христофоров, В.В. Филимонов, В.П. Кутышенко (2008). Исследование методом ЯМР структуры и динамики химерного варианта SH3-домена («SHA-Бержерак»). Биоорган. Хим. 34(5), 645-653.

11. L.V. Gushchina. A.G. Gabdulkhakov, S.V. Nikonov, P.L. Mateo, V.V. Filimonov (2009). Structural and thermodynamic studies of Bergerac-SH3 chimeras. Biophys. Chem. 139,106-115.

12. JIB. Гущина. А.Г. Габдулхаков, В.В. Филимонов (2009). Дизайн и структурно-термодинамические исследования химерного белка на основе спектрино-вого Sffi-домена. Молекул. Биол. 43(3), в печати.

Подписано в печать: 17.02.2009

Заказ № 1594 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гущина, Любовь Владимировна

I. ВВЕДЕНИЕ.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

11.1. Структура и функции 8НЗ-доменов.

II. 1.1. Общая характеристика SH3-доменов.

11.1.2. Структура 8НЗ-доменов.

11.1.3. Спектриновый 8НЗ-домен дикого типа и его варианты.

11.2. Структурные и термодинамические особенности р-шпилек в изолированном виде и в составе 8НЗ-доменов.

11.2.1. Принципы организации изолированной Р-структуры.

11.2.2. Химерные формы спектринового БНЗ-домена типа «Бержерак».

П.З. Анализ структуры комплексов SH3-aomchob с лигандами.

11.3.1. Полипролиновая спираль И.

11.3.2. Взаимодействие БНЗ-доменов с полипролиновыми пептидами.

11.3.3. Способность SH3-доменов связывать полипролиновые спирали в двух ориентациях.

11.3.4. Энергетика связывания пептидных лигандов SH3-доменами.

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1П.1. Материалы.

111.1.1. Химические реактивы, приборы.

III. 1.2. Бактериальные штаммы и плазмиды.

III.2. Методы.

111.2.1. Методы генной инженерии и микробиологии.

111.2.2. Биохимические методы.

111.2.3. Кристаллизация белков и сбор дифракционных данных.

111.2.4. Спектроскопия ЯМР.

III.2.5. Физические методы исследования.

111.2.5.1. Анализ данных сканирующей калориметрии и проверка справедливости модели двух состояний.

111.2.5.2. Флуоресцентная спектроскопия и применение модели двух состояний к анализу денатурации белков мочевиной.

111.2.5.3. Более сложные модели равновесных переходов.

IV. РЕЗУЛЬАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

IV. 1. Структурно-термодинамические исследования белков семейства «Бержерак».

IV. 1.1. Кристаллизация белков и исследование их структуры методом РСА.

IV. 1.2. Структуры SHH-SH3 и SHA-SH3, определенные методом ЯМР.

IV. 1.3. Микрокалориметрические исследования белков «Бержерак».

IV. 1.4. Спектры флуоресценции и разворачивание SHA-SH3 мочевиной.

IV. 1.5. Отклонения от одностадийной модели разворачивания.

IV.1.6. Обсуждение результатов исследований белков «Бержерак».

IV.2. Структурно-термодинамические исследования доменов с пришитыми лиганадами.

IV.2.1. Дизайн химерных белков с пришитыми лигандами.

IV.2.1.1. Дизайн F2-SH3.

IV.2.1.2. Дизайн химерных белков с длинным линкром на основе PWT-SH3.

IV.2.2. Клонирование белков с пришитыми лигандами.

IV.2.3. Кристаллизация белков с пришимыми лигандами.

IV.2.4. Структура F2-SH3, определенная методом ЯМР.

IV.2.5. Кристаллографическая структура C1-SH3.

IV.2.6. Исследования термодинамики разворачивания структуры химерных белков с пришитыми лигандами.

IV.2.6.1.Спектры флуоресценции и равновесное разворачивание структуры химерных белков мочевиной.

IV.2.6.1.1. Разворачивание F2-SH3 мочевиной.

IV.2.6.1.2. Разворачивание WT-SH3 и C1-SH3 мочевиной.

IV.2.6.2. Калориметрические исследования белков.

IV.2.6.2.1. Исследования F2-SH3.

IV.2.6.2.2. Оценка возможных отклонений от «идеализированной» модели двух состояний для белка F2-SH3.

IV.2.6.2.3. Оценка теплоемкости и других параметров для F2-SH3, исходя из структуры белка.

IV.2.6.2.4. Калориметрические исследования химерных белков с длинными линкерами.

ТУ.2.1. Обсуждение результатов структурно-термодлинамических исследований химерных белков с пришитыми лигандами.

V. ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-термодинамические исследования химерных белков на основе спектринового SH3-домена"

Проблема сворачивания полипептидной цепочки в уникальную пространственную структуру является одной из важнейших и находится на стыке молекулярной биологии, физической химии и химии полимеров. Со времени классических работ Анфинсена известно, что аминокислотная цепочка белка в растворе способна самопроизвольно переходить из развернутого состояния в упорядоченное, соответствующее минимуму свободной энергии. За последние годы в понимании термодинамики сворачивания биополимеров достигнут большой прогресс и разработаны алгоритмы предсказания пространственной структуры белков, основанные на минимизации энергии. Эти алгоритмы, однако, до сих пор не дают однозначного решения из-за недостаточной точности их параметризации. Особенно это актуально для факторов, определяющих стабильность (3-структуры в растворе, а также для оценки энергетики образования полипролиновой спирали II, которая в последнее время считается наиболее предпочтительной конформацией полипептидной цепи в развернутых белках. Фрагменты белков, находящиеся в этой конфор-мации, играют важную роль и в регуляции внутриклеточных процессов эука-риот через взаимодействие пролин-богатых участков с SH3-доменами - компонентами киназ и других мультидоменных белков. Данная работа посвящена созданию белковых моделей и уточнению на их основе термодинамических параметров образования элементов Р-структуры и полипролиновой спирали II, а также параметров белок - пептидных взаимодействий в системе SH3 -домен/лиганд.Экспериментальные подходы к исследованию модельных олигопептидов, имеющих тенденцию к образованию р-шпилек, сильно ограничены ввиду их малых размеров, плохой растворимости, склонности к агрегации и неспособности находиться в полностью структурированной форме без фиксации концов. С целью одновременного устранения перечисленных проблем и облегчения прямых калориметрических и структурных исследований мы решили использовать небольшие химерные белки, в которых имеющаяся в бел-ке-хозяине |3-шпилька удлинена на несколько пар остатков, так чтобы эти остатки выступали в раствор за пределы глобулы. Структурные исследования, проведенные с помощью ЯМР и РСА, показали, что встроенные фрагменты действительно находятся в конформации (3-шпильки. В результате использования таких модельных белков впервые путем прямых калориметрических измерений были определены тепловые эффекты и изменения других термодинамических функций при образовании квази-изолированной р-структуры в растворе. Этим исследованиям посвящена первая часть диссертации.Кроме того, в данной работе был выполнен дизайн новых белков путем включения в полипептидную цепь спектринового SH3-домена олигопептидов (лигандов) богатых пролином, через линкеры разной длины. Проведены термодинамические исследования вновь созданных белков, а также определена структура некоторых из них, что позволило дать адекватную структурную интерпретацию термодинамической информация.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Гущина, Любовь Владимировна

V. выводы

1. Созданы, подобраны и охарактеризованы модельные конструкции, пригодные для определения вкладов элементарных структурных элементов в термодинамику сворачивания полипептидных цепей и белок-лигандных взаимодействий.

2. Обнаружено, что удлинение центральной (3-шпильки 8НЗ-домена на 4 пары специально подобранных аминокислот приводит к удлинению этого элемента вторичной структуры, что подтверждено прямыми структурными исследованиями методами ЯМР и РСА.

3. Методом сканирующей микрокалориметрии показано, что модельные химерные белки образуют единую кооперативную систему. Это позволило напрямую определить некоторые термодинамические параметры образования (3-структуры и провести их структурную интерпретацию.

4. Показано, что тепловой эффект образования одной водородной связи в рамках квази-изолированного и доступного растворителю элемента (3-структуры составляет примерно - 4 кДж/моль, что хорошо коррелирует с косвенными литературными данными.

5. Проведен дизайн новых химерных белков на основе спектринового SH3-домена с лигандами, включенными в полипептидную цепь белка.

6. Показано, что присоединение лиганда к телу домена через короткий линкер приводит к его прочной посадке на консервативное место связывания в ориентации II с образованием новой единой кооперативной системы.

7. Обнаружено, что сворачивание такого химерного белка сопровождается большим тепловым эффектом (-37 кДж/моль) и значительным увеличением стабильности структуры (-10 кДж/моль). Высокое значение теплового эффекта и отсутствие изменения теплоемкости находятся в противоречии с некоторыми общепринятыми структурно-термодинамическими корреляциями и, по-видимому, определяются параметрами образования полипролиновой спирали II в ходе фиксации лиганда на домене.

8. Присоединение лиганда к телу белка через длинный линкер (10 - 12 остатков) не дает термодинамической выгоды по сравнению с бимолекулярной реакцией связывания.

БЛАГОДАРНОСТИ

Я приношу свою глубокую и искреннюю благодарность

Владимиру Васильевичу Филимонову, моему научному руководителю, за его доброжелательное и вместе с тем критическое отношение ко мне и к моей работе, за его постоянное внимание и поддержку.

Валентине Васильевне Матвеевой за постоянное внимание ко мне, постоянную помощь в работе и плодотворное обсуждение всех вопросов, связанных с настоящей работой и не связанных с ней.

Выражаю искреннюю благодарность всему коллективу лаборатории термодинамики белка, и в особенности Сергею Александровичу Потехину, за помощь и плодотворное обсуждение результатов.

Приношу свою глубокую благодарность сотрудникам ИТЭБ РАН: Виктору Павловичу Кутышенко и Владимиру Сергеевичу Христофорову, Дмитрию Прохорову, Марии Тимченко.

Азату Габдулхакову за плодотворное сотрудничество.

Моим родителям, Владимиру Николаевичу и Галине Геннадьевне Гущиным без помощи которых данная работа не состоялась бы.

Всем сотрудникам Института белка РАН, оказавшим мне поддрежку и помощь, в чем бы она не выражалась.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гущина, Любовь Владимировна, Пущино

1. Andreotti А.Н., Bunnel S.C., Feng S., Berg L.J. and Schreiber S.L. (1997) Regulatory intramolecular association in a tyrosine kinase of the Tec family. Nature 385, 93-97.

2. Arold S., Franken P., Strub M.P., Hoh F., Benichou S., Benarous R. and Dumas

3. C. (1997) The crystal structure of HIV-l Nef protein bind to the Fyn kinase SH3 domain suggests a role for this complex in altered T cell receptor signaling. Struct. 5, 1361-1372.

4. Avbelj F., Baldwin RL. (2002) Role of backbone solvation in determining thermodynamic beta propensities of the amino acids. PNAS 99, 1309-13.

5. Baker B.M., Murphy K.P. (1998) Prediction of binding energetics from structure using empirical parameterization. Methods Enzymol. 295, 294-315.

6. Bar-Sagi D., Rotin D., Batzer A., Mandiyan V. and Schlessinger J (1993) SH3 domains direct cellular localization of signaling molecules. Cell 74, 83-91.

7. Bauer F., Urdaci M., Aigle M. and Crouzet M. (1993) Alteration of a yeast SH3 protein leads to conditional viability with defects in cytoskeletal and budding patterns. Mol. Cell. Biol. 13, 5070-5084.

8. Berisio R., Viguera A., Serrano L., Wilmanns M. (2001) Acta Crystallogr. Sect.1. D. 57, 337- 340.

9. Berjanskii M.V., Neal S., Wishart D.S. (2006) PREDITOR: a web server for predicting protein torsion angle restraints. Nucleic Acids Res. 34, 63-69.

10. Birnboim H. and Doly J. (1997) A rapid alkaline extraction method for screening recombinant plasmid DNA. Nucl. Acid. Res. 7, 1513-1522.

11. Blanco F.J., Rivas G., Serrano L. (1994) A short linear peptide that folds into a native stable (3-hairpin in aqueous solution. Nat. Struct. Biology 1, 399409.

12. Blanco F.J., Ortiz A.R., Serrano L. (1997) 1H and 15N NMR assignment and solution structure of the SH3 domain of spectrin: comparison of unrefined and refined structure sets with the crystal structure. J. Biomol. NMR. 9, 347-357.

13. Blanco F.J., Ramirez-Alvarado M. and Serrano L. (1998) Formation and stability of P-hairpin structures in polypeptides. Curr Opinion in Struct. Biol. 8, 107-111.

14. Booker G.W., Gout I., Downing A.K., Driscoll P.C., Boyd J., Waterfield M.D. and Campbell I.D. (1993) Solution structure and ligand-binding site of the SH3 domain of the p85a subunit of phosphatidylinositol-3 '-kinase. Cell 73, 813822.

15. Brown M.T. and Cooper J.A. (1996) Regulation, subsrates and function of src. Biochem. Biophys. Acta 1287, 121-149.

16. Casares S., Sadqi M., Lopez-Mayorga J.C., Conejero-Lara F. (2003) Structural cooperativity in the SH3 domain studied by site-directed mutagenesis and amide hydrogen exchange. FEBS Lett. 539, 125-130.

17. Cesareni G., Panni S., Nardelli G. and Castagnoli L. (2002) Can we infer peptide recognition specificity mediated by SH3 domain. FEBS Lett. 5X3, 38-44.

18. Chant J., Corrado K., Pringle J.R. and Herskowitz I. (1991) Yeast BUD5, encoding a putative GDP-GTP exchange factor, is necessary for bud site selection and interact with bud formation gene BEM1. Cell 65, 1213-1224.

19. Chen J., Wang J., Wang W. (2004) Transition states for folding of circular-permuted protein. Proteins: Struct, andBioinform. 57, 153-171.

20. Chenevert J., Corrado K., Bender A., Pringle J.R. and Herskowitz I. (1992) A yeast gene (BEM1) necessaiy for cell polarization whose product contains two SH3 domains. Nature 356, 77-79.

21. Clark S.C., Stern M.J. and Horvitz H.R. (1992) C. elegans cell-signaling gene sem-5 encodes a protein with SH2 and SH3 domains. Nature 356, 340-344.

22. Cobos E.S., Filimonov V.V., Vega M.C., Mateo P.L., Serrano L., Martinez J.C. (2003) A thermodynamic and kinetic analysis of the folding pathway of an SH3 domain entropically stabilised by a redesigned hydrophobic core. J. Mol. Biol. 328, 221-233.

23. Collaborative Computational Project (1994) The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography. Acta Ciystall D. 50, 760-763.

24. Dalgarno D.C., Botfield M.C., Rickles R.J. (1997) SH3 domains and drug design: ligands, structure and biological function. Biopol. 43, 383-400.

25. De Alba E., Jimenez M.A., Rico M. (1997) Turn residue sequence determines P-hairpin conformation in designed peptides. J. Am. Chem. Soc. 119, 175-183.

26. De Alba E., Blanco F.J., Jimenez M.A., Rico M., Nieto J.L. (1995) Interactions responsible for the P-hairpin conformation population formed by a designed linear peptide. Eur. J. Biochem. 233, 283-292.

27. De Alba E., Jimenez M.A., Rico M., Nieto J.L. (1996) Conformational investigation of designed short linear peptides able to fold into P-hairpin structures in aqueous solution. Fold. Des. 1, 122-144.

28. Drubin D.G., Miller K.G. and Botshein D. (1988) Yeast actin-binding proteins: Evidence for a role in morphogenesis. J. Cell. Biol 107, 2551-2561.

29. Drubin D.G., Mulholiand D., Zhu Z. and Botshein D. (1990) Homology of a yeast actin-binding protein to signal transduction proteins and myosin-I. Nature 343, 288-290.

30. Dubendorff J. W. and Studier W. (1991) Creation of T7 autogene. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase under control of its cognate promoter. J. Mol. Biol. 219, 61-68.

31. Emsley P. and Cowtan K. (2004) Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr. D. 60, 2126-2132.

32. Feng S., Chen J.K., Yu H., Simon J.A. and Schreiber S.L. (1994) Two binding orientation for peptides to the Src SH3 domain: development of a general model for SH3-ligand interactions. Scien. 266, 1241-1246.

33. Fernandes-Ballester G., Blanes-Mira C. and Serrano L. (2004) The tryptophan switch: changing ligand-binding specificity from type I to type II in SH3 domains. J. Mol Biol 336, 619-629.

34. Ferreon J.C., Hilser V.J. (2004) Thermodynamics of binding to SH3 domains: the energetic impact of polyproline II (PII) helix formation. Biochem. 43, 7787-97.

35. Filimonov V.V., Matveev S.V., Potekhin S.A., Privalov P.L. (1982) Thermodynamic analysis of the scanning microcalorimetry data. Mol. Biol. (U.S.S.R.) 16, 551-562.

36. Filimonov V.V. and Rogov V.V. (1996) Reversible association of the equilibrium unfolding intermediate of X Cro repressor. J. Mol. Biol. 255, 767777.

37. Filimonov V.V., Azuaga A.I., Viguera A.R., Serrano L., Mateo P.L. (1999) A thermodynamic analysis of a family of small globular proteins: SH3 domains. Biophys. Chem. 77, 195-208.

38. Gnose R., Shekhtman A., Goger M.J., Ji H. and Cowburn D. (2001) A novel, specific interaction involving the Csk SH3 domain and its natural ligand. Nat. Struct. Biol. 8, 998-1004.

39. Gomez J., Freire E. (1995) Thermodynamic mapping of the inhibitor site of the aspartic protease endothiapepsin. J Mol Biol 252, 337-50.

40. Grantcharova V.P. and Baker D. (1997) Folding dynamics of the src SH3 domain. Biochem. 36, 15685-15692.

41. Grantcharova V.P., Riddle D.S., Santiago J.V. and Baker D. (1998) Important role of hydrogen bonds in the structurally polarized transition state for folding of the src SH3 domain. Nat. Struct. Biol. 5, 714-720.

42. Gsponer J. and Caflisch A. (2001) Role of native topology investigated by multiple unfolding simulation of four SH3 domains. J. Mol Biol. 309, 285-298.

43. Guntert P. (2004) Automated NMR structure calculation with CYANA. Meth. Mol. Biol. 278, 353-378.

44. Haque T.S., Gellman S.H. (1997) Insights on P-hairpin stability in aqueous solution from peptides with enforced type I' and type II' p-turns. J. Am. Chem. Soc. 119, 2303-2304.

45. Hackel M., Hinz H.J., Hedwig G.R. (1999) A new set of peptide-based group heat capacities for use in protein stability calculations. J Mol Biol 291, 197-213.

46. Harkiolaki M., Lewitzky M., Gilbert R.J.C., Jones E.Y., Bourette R.P., Mouchiroud G., Sonderman H., Moarefi I. and Feller S.M. (2003) Structural basis for SH3 domain-mediated high-affinity binding between Mona-Gads and SLP-76. EMBOJ. 22, 2571-2582.

47. Haslam R.J., Kolde H.B. and Hemmings B.A. (1993) Pleckstrin domain homology. Nature 363, 309-310.

48. Hiroaki H., Klaus W., Senn H. (1996) Determination of the solution structure of the SH3 domain of human p56 Lck tyrosine kinase. J. Biomol. NMR. 8, 105-122.

49. Holtzman D.A., Yang S. and Drubin D.G. (1993) Synthetic-lethal interactions identify two novel genes, SLA1 and SLA2, that control membrane cytoskeleton assembly in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell. Biol. 122, 635-644.

50. Hutchens J.O., Cole A.G., Stout J.W. (1969) Heat capacities from 11 to 305 degrees К and entropies of hydrated and anhydrous bovine zinc insulin and bovine chymotrypsinogen A. Entropy change for formation of peptide bonds. J. Biol. Chem.244, 26-32.

51. Jancarik J. and Kim S.H. (1991) Sparse Matrix Sampling, a screening method for crystallization of proteins. J. Appl. Cryst. 24, 409-411.

52. Jonson C.M. and Fersht A.R. (1995) Protein stability as a function concentration: the therminal stability of barnase in the presense of urea. Biochem. 34, 6795-6804.

53. Kang H., Freund C., Duke-Cohan J. S., Musacchio A., Wagner G. and Rudd С. E. (2000) SH3 domain recognition of a praline independent tyrosine -based RKxxYxxY motif in immune cell adaptor SKAP55. EMBOJ. 11, 2889-2899.

54. Kato J.-Y., Takeya Т., Grandori C., Iba H., Levy J.B. and Hanafiisa H. (1986) Amino acid substitutions sufficient to convert the nontransforming p60c~ src protein to a transforming protein. Mol. Cell. Biol. 6, 4155-4160.

55. Kay B.K., Williamson M.P. and Sudol M. (2000) The importance of being proline: the interaction of praline rich motifs in signaling proteins with their cognate domains. FASEB J. 14, 231-241.

56. Khechinashvili, N. N. Janin, J., Rodier, F. (1995) Thermodynamics of the temperature-induced unfolding of globular proteins. Protein Sci. 4, 1315-24.

57. Koch C.A., Anderson D., Moran M.F., Ellis C. and Pawson T. (1991) SH2 and SH3 domains: elements that control interactions of cytoplasmic signaling molecules. Scien. 252, 668-674.

58. Lazaridis T, Archontis G, Karplus M (1995) Enthalpic contribution to protein stability: insights from atom-based calculations and statistical mechanics. Adv Protein Chem 47, 231-306.

59. Lehto V.-P., Wasenius V.-M., Salven P. and Saraste M. (1988) Transforming and membrane proteins. Nature 334, 388.

60. Lefferts J.A., Wang C., Sridharan D., Baralt M. and Lambert M.W. (2009) The SH3 domain of RII spectrin is a target for the fanconi anemia protein, FANCG. Biochemistry 48, 254-263.

61. Li X., Chen Y., Liu Y., Gao J., Gao F., Wu J.Y. and Rao Z. (2006) Structural basis of Robo proline-rich motif recognition by the srGAPl Src homology 3 domain in the Slit-Robo signaling pathway. J. Biol. Chem. 38, 28430-28437.

62. Lopez de la Paz M., Lacroix E., Ramirez-Alvarado M., Serrano L. (2001) Computer-aided design of beta-sheet peptides. J. Mol. Biol. 312, 229-246.

63. Macias M.J., Hyvonen M., Baraldi E., Schultz J., Sudol M., Saraste M., Oschkinat H. (1996) Structure of the WW domain of a kinase-associated protein complexed with a proline-rich peptide. Nature 382, 646-649.

64. Macias M.J., Wiesner S., Sudol M. (2002) WW and SH3 domains, two different scaffolds to recognize proline-rich ligands. FEBSLett. 513, 30-37.

65. Makarov A.A., Adzhubei I.A., Protesevich I.I., Lobachev V.M., Fasman G.D. (1994) Melting of the left-handed helical conformation of chrged poly-L-lysine. Biopolym. 34, 1123-1124.

66. Makhatadze G.I. and Privalov P.L. (1990) Heat capacity of proteins. I. Partial molar heat capacity of individual amino acid residues in aqueous solution: hydration effect. J. Mol. Biol. 213, 375-384.

67. Mandel M. and Higa A. (1970) Calcium-dependent bacteriophage DNA infection. J. Mol. Biol, 53: 159-162.

68. Markossian K.A, Zamyatnin A.A. Kurganov B.I. (2004) Antibacterial proline-rich oligopeptides and their target proteins. Biochem. (Mosc.) 69, 10821091.

69. Martin-Sierra F.M., Candel A.M., Filimonov V.V., Martinez J.C., Conejero -Lara F. (2003) A binding event converted into a folding event. FEBS Lett. 553, 328-332.

70. Martinez J.C., Pisabarro M.T. and Serrano L. (1998) Obligatory steps in protein folding and the conformational diversity of the transition state. Nat. Struct. Biol. 5, 721-729.

71. Martinez J.C. and Serrano L. (1999) The folding transition state between SH3 domains is conformationally restricted and evolutionarily conserved. Nat. Sti-iict. Biol. 11, 1010-1016.

72. Matveev S.V., Filimonov V.V., Privalov P.L. (1983) Thermodynamic approach to the study of the structural organization of 5S from Escherichia coli ribosomes. II. Analysis of optical, curved melting. Mol. Biol. (Mosk). 17, 17280.

73. Matthews D.A., Smith S.L., Baccanaru D.P., Burchall J.J., Oatley S.J. and Kraut J. (1986) Crystal structure of a novel trimethiprim-resistant dihydrofolate reductase specified in Escherichia coli by R-plasmid R67. Biochem. 25, 41924204.

74. Mayer B.J. (2001) SH3 domains: complexity in moderation. J. Cell. Sci. 114, 1253-1263.

75. Mayer B.J. and Baltimore D. (1993) Signaling through SH2 and SH3 domains. Trends Cell. Biol 3, 8-13.

76. Mayer B.J., Hamaguchi M. and Hanafusa H. (1988) A novel viral oncogene with structural similarity to phospholipase C. Nature 332, 272-275.

77. Mayer B.J., Ren R., Clark K.L. and Baltimore D. (1993) A putative modular domain present in diverse signaling proteins. Cell 73, 629-630.

78. Merilainen J., Palovuori R., Sormunen R., Wasenius V.-M. and Lehto V.-P. (1993) Binding of the a-fodrin SH3 domain to the leading lamellae of locomoting chicken fibroplasts. J. Cell. Scien. 105, 647-654.

79. Moncalian G., Cardenes N., Deribe Y.L., Spinola-Amilibia M., Diric I. and Bravo J. (2006) Atypical polyproline recognition by the CMS N-terminal Src homology 3 domain. J. Biol. Chem. 50, 38845-38853.

80. Mongiovi A.M., Romano P.R., Panni S., Mendoza M., Wong W.T., Musacchio A., Cesareni G. and Di Fiore P.P. (1999) A novel peptide-SH3 interaction. EMBO J. 19, 5300-5309.

81. Morel В., Casares S., Conejero-Lara F. (2006) A single mutation induces amyloid aggregation in the alpha-spectrin SH3 domain: analysis of the early stages of fibril formation. J. Mol. Biol. 356, 453-468.

82. Morton C.J., Pugh D.J.R., Brown E.L.J., Kahmann J.D., Renzoni D.A.C. and Campbell I.D. (1996) Solution structure and peptide binding of the SH3 domain from human Fyn. Struct. 4, 705-714.

83. Munoz V., Ghirlando R., Blanco F.J., Jas G.S., Hofrichter J. and Eaton W.A. (2006) Folding and aggregation kinetics of a beta-hairpin. Biochem. 45, 70237035.

84. Murshudov G.N., Vagin A.A., Dodson E.J. (1997) Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallogr. D. 53, 240-255.

85. Murzin A.G. (1992) Familiar strangers. Nature 360, 365.

86. Musacchio A., Gibson N., Lehto V.P. and Saraste M. (1992a) SH3-an abundant protein domain in search of a function. FEBS Lett. 307, 55-61.

87. Musacchio A., Noble M.E.M., Pauptit R., Wierenga R.K. and Saraste M. (1992b) Crystal structure of a Scr-homology 3 (SH3) domain. Nature 359, 851855.

88. Musacchio A., Gibson N., Rice P., Thompson J. and Saraste M. (1993) The PH domain: A new piece in the structural patchwork of signaling proteins. Trends Biochem. Scien. 18, 343-348.

89. Musacchio A., Wilmanns M. and Saraste M. (1994a) Structure and function of the SH3 domain. Prog. Biophys. Mol. Biol. 61, 283-297.

90. Musacchio A, Saraste M, Wilmanns M. (1994b) High-resolution crystal structures of tyrosine kinase SH3 domains complexed with proline-rich peptides. Nat. Struct. Biol. 8, 546-51.

91. Nakanishi M. and Tsuboi M. (1974) A slow fluctuation in the molecular conformation of a soya bean trypsin inhibitor. J. Mol. Biol. 83, 379-391.

92. Noble M.E., Musacchio A., Saraste M., Courtneidge S.A., Wierenga R.K (1993) Crystal structure of the SH3 domain in human Fyn; comparison of the three-dimensional structures of SH3 domains in tyrosine kinases and spectrin. EMBOJ. 12,2617-2624.

93. Ortega Rolden J.L., Romero Romero M.L., Ora A., AB E., Lopez-Mayorga O., Aznaga A.I., N. A.J. van Nuland. (2007) The high resolution NMR structure of the third SH3 domain of CD2AP. J. Biomol. NMR. 39, 331-336.

94. Otvos J.L (2002) the short proline-rich antibacterial peptide family. Cell. Mol. Life Scien. 59, 1138-1150.

95. Padmanabhan S., Laurents D.V., Fernandez A.M., Elias-Arnanz M., Ruiz-Sanz J., Mateo P.L., Rico M., and Filimonov V.V. (1999) Thermodynamic analysis of the structural of phage 434 Cro protein. Biochem. 38, 15536-15547.

96. Palencia A., Cobos E.S., Mateo P.L., Martinez J.C., Luque I. (2004) Thermodynamic dissection of the binding energetics of proline-rich peptides to the Abl-SH3 domain: implications for rational ligand design. J Mol Biol. 336, 527-37

97. Pawson T. (1988) Non-catalytic domains of cytoplasmic protein-tyrosine kinases: regulatory elements in signal transduction. Oncogene 3, 491-495.

98. Pawson T. and Schlessinger J. (1993) SH2 and SH3 domains. Curr. Biol. 3, 434-442.

99. Peranen J., Rikkonen M., Hyvonen M. and Kaariainen L. (1996) T7 vectors with modified Tllac promoter for expression of proteins in Escherichia coli. Anal. Biochem. 236, 371-373.

100. Pisabarro M.T., Ortiz A.R., Viguera A.R., Gago F. and Serrano L. (1994) Molecular modeling of the interaction of polyproline-based peptides with the Abl-SH3 domain: rational modification of the interaction. Protein Eng. 7, 14551462.

101. Pisabarro M.T. and Serrano L. (1996) Rational design of specific high-affinity peptide ligands for the Abl-SH3 domain. Biochem. 35, 10634-10640.

102. Pisabarro M.T., Serrano L. and Wilmanns M. (1998) Crystal structure of Abl-SH3 domain complexed with a designed high-affinity peptide ligand: implications for SH3-ligand interactions. J. Mol. Biol. 281, 513-521.

103. Privalov P.L. (1979) Stability of proteins: small globular proteins. Adv Protein Chem. 33, 167-241.

104. Privalov P.L., Tiktopulo E.I. (1970) Thermal conformational transformation of tropocollagen. I. Calorimetric study. Biopolym. 9, 127-39.

105. Privalov P.L. and Potekhin S.A. (1986) Scanning microcalorimetry in studying temperature-induced changes in proteins. Methods Enzymol. 131, 4-51.

106. Privalov P.L., Tiktopulo E.I., Venyaminov S.Yu., Griko Yu.V., Makhatadze G.I., Khechinashvili N.N. (1989) Heat capacity and conformation of proteins in the denatured state. J. Mol Biol 205, 737-750.

107. Privalov P.L. and Makhatadze G.I. (1990) Heat capacity of proteins. II. Partial molar heat capacity of the unfolded polypeptide chain of proteins: protein unfolding effects. J. Mol Biol 213, 385-391.

108. Ramirez-Alvarado M., Blanco F.J., Serrano L. (1996) De novo design and structural analysis of a model P-hairpin peptide system. Nat. Struct. Biol. 3, 604612.

109. Ramirez-Alvarado M., Blanco F.J., Niemann H., Serrano L. (1997) Role of P-turn residues in P-hairpin formation and stability in designed peptides. J. Mol Biol 273, 898-912.

110. Rayment I., Rypniewski W.R., Schmidt-Base K., Smith R., Tomchick D.R., Benning M.M., Winkelmann D.A., Wesenberg G and Holden H.M. (1993) Three-dimensional structure of myosin sub fragment-1: A molecular motor. Scien. 261, 50-58.

111. Reiersen H. and Rees A.R. (2001) The hunchback and its neighbours: proline as an environmental modulator. Trends in Biochem. Scien. 26, 679-684.

112. Ren R., Mayer В., Cicchetti P. and Baltimore D. (1993) Identification of a ten-amino acid proline-rich SH3 binding site. Scien. 259, 1157-1161.

113. Roskoski R.J. (2004) Src protein-tyrosine kinase structure and regulation. Biochem. andBiophys. Res. Commun. 324, 1155-1164.

114. Rodaway A.R.F., Sternberg M.J.E. and Bentley D.L. (1989) Similarity in membrane proteins. Nature 342, 624.

115. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual cold spring harbor, NY.

116. Sibanda B.L., Blundell T.L., Thornton J.M. (1989) Conformation of p-hairpins in protein structures. A systematic classification with applications to modeling by homology, electron density fitting and protein engineering. J. Mol. Biol. 229, 759-777.

117. Schagger H. and von Jagow G. (1987) Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrilamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379.

118. Sheldrick G.M. (2008) A short history of SHELX. Acta Cryst. A.' 64, 112122.

119. Stahl M.L., Ferenz C.R., Kelleher K.L.O., Kriz R.W. and Knoph J.L. (1988) Sequence similarity of phospholipase С with the non-catalytic region of src. Nature 332, 269-272.

120. Studier F.W., Rosenberg A.H., Dunn J.J. and Dubendorff J.W. (1990) Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Metod. Enzym. 185, 60-89.

121. Tiktopulo EI, Kajava AV. (1998) Denaturation of type I collagen fibrils is an endothermic process accompanied by a noticeable change in the partial heat capacity. Biochem. 37, 8147-52.

122. Tong A.H., Drees В., Nardelli G., Bader G.D., Brannetti В., Castagnoli L. (2002) A combined experimental and computational strategy to define protein interaction networks for peptide recognition modules. Science 295, 321-324.

123. Tsodikov O.V., Record M.T., Sergeev Y.V. (2002) Novel computer program for fast exact calculation of accessible and molecular surface areas and average surface curvature. J Comput Chem. 23, 600-9.

124. Vaguine A.A., Richelle J., Wodak S.J. (1999) SFCHECK: a unified set of procedure for evaluating the quality of macromolecular structure-factor data and their agreement with atomic model. Acta Crystall. D. 55, 191-205.

125. Vega M.C., Martinez J.C. and Serrano L. (2000) Thermodynamic and structural characterization of Asn and Ala residues in the disallowed II' region of the Ramachandran plot. Prot. Scien. 9, 2322-2328.

126. Viguera A.R., Arrondo J.L., Musacchio A., Saraste M. and Serrano L. (1994a) Characterization of the interaction of natural proline-rich peptides with five different SH3 domains. Biochem. 33, 10925-10933.

127. Viguera A.R., Martinez J.C., Filimonov V.V., Mateo P.L. and Serrano L. (1994b) Thermodynamic and kinetic analysis of the SH3 domain of spectrin shows a two-state folding transition. Biochem. 33, 2142-2150.

128. Viguera A.R. and Serrano L. (2001) Bergerac-SH3: «frustration» induced by stabilizing the folding nucleus. J. Mol. Biol. 311, 357-371.

129. Viguera A.R. and Serrano L. (2003) Hydrogen-exchange stability analysis of Bergerac-Src homology 3 variants allows the characterization of a folding intermediate in equilibrium. PNAS100, 5730-5735.

130. Viguera A.R., Francisco J.B., Serrano L. (1995) The order of secondary structure elements does not determine the structure of a protein but does affect its folding kinetics J. Mol. Biol. 247, 670-681.

131. Viguera A.R., Serrano L., Wilmanns M. (1996) Different folding transition states may result in the same native structure. Nat. Struct. Biol. 3, 874-880.

132. Warren J.R. and Gordon J.A. (1966) On refractive indices of aqueous solutions of urea. J. Phys. Chem. 70, 297.

133. Wasenius V.-M., Saraste M., Salven P., Eramaa M., Holm L. and Lehto V,-P. (1989) Primary structure of brain a-spectrin. J. Cell. Biol. 108, 79-93.

134. Whitten S.T., Yang H.W., Fox R.O., Hilser V.J. (2008) Exploring the impact of polyproline II (PII) conformational bias on the binding of peptides to the SEM-5 SH3 domain. Protein Sci. 17, 1200-11.

135. Wildes D., Meadowanderson L., Sabogal A., Marqusee S. (2006) Native state energetics of the Src SH2 domain: Evidence for a partially structured state in the denatured ensemble. Prot. Scien. 15, 1769-1779.

136. Wilson K.P., Shewchuk L.M., Brennan R.G., Otsuka A.J. and Matthews B.W. (1992) Escherichia coli biotin holoenzyme synthetase/^ю repressor crystal structure delineates the biotin- and DNA-binding domains. PNAS 89, 9257

137. Zhou H.X., Hoess R.H., Degrade W.F. (1996) In vitro evolution of thermodynamically stable turns. Nat.

138. Xie D., Fox R., Freire E., (1994) Thermodynamic characterization of an equilibrium folding intermediate of staphylococcal nuclease. Protein Sci. 3,9261.2175-84.