Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и характеристика химерных металлопротеиназ бацилл

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Получение и характеристика химерных металлопротеиназ бацилл"

г Г о С Д

На правах рукописи

л П г чп •

1 и Пии »•-' - --

ЧУМАКОВ Владимир Николаевич

ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ХИМЕРНЫХ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗ БАЦИЛЛ

(03.00.23 - биотехнология )

АВТОРЕФЕРАТ

на соискание ученой степени кандидата химических наук

Ж

На правах рукописи

ЧУМАКОВ Владимир Николаевич

ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ХИМЕРНЫХ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗ БАЦИЛЛ

(03.00.23 - биотехнология )

АВТОРЕФЕРАТ

на соискание ученой степени кандидата химических наук

л

Г

Работе выполнена в лаборатории белковой инженерии Института молекулярной генетики Российской академии наук

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Костров C.B.

Официальные оппоненты: профессор, доктор химических наук Звонкова E.H., доктор биологических наук Великодворская Г.А.

Ведущая организация: Институт биоорганической химии им. Шемякина М.М. и Овчинникова ю.А.

Защита диссертации состоится "JW _ " JAjrtO.-.j, 1996 г. в__

часов на заседании диссертационного совета Д 063.41.01 по аавд-те диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Московской государственной академии тонкой химической технологии им М.В.Ломоносова по адресу: 117571, г. Москва, проспект Вернадского, д.86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В.Ломоносова, 119831, г. Москва, ул. Малая Пироговская, д.1.

Автореферат разослан _" 1995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук А.И.Лютик

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы.

Протеолитические ферменты - белки, представляющие несомненный практический и теоретический, интерес. Они широко используются в микробиологической и пищевой промышленности, при производстве детергентов и в медицине. Расширяется применение протеаз в пептидном синтезе. При этом особый практический интерес представляют протеиназы, сохраняющие активность при повышенных температурах. Использование термостабильных ферментов позволяет оптимизировать многие технологические процессы. Одним из наиболее перспективных способов повьеяения термостабильности ферментов является применение методов белковой инженерии.

Для эффективного использования этих методов необходимо исследование молекулярных Основ термостабильности ферментов. Распространенным подходом, используемым исследователями, является анализ семейств родственных белков, члены которых существенно различаются по уровню термостабильности. Однако непосредственное сравнение аминокислотных последовательностей и известных пространственных структур часто оказывается недостаточно информативным.

Мы использовали интенсивно развивающийся в последнее время подход, связанный с получением и анализом свойств структурных гибридов между родственными белками. Изучение набора ферментов, включающего как исходные "родительские" белки, так и различные промежуточные ' варианты. может привести к выявлению областей белковой молекулы, . модификация которых приводит к изменению функциональных характеристик фермента.

В качестве объекта для таких исследований нами были выбраны нейтральные протеиназы (нпр) Bacillus anylollquefaclens и Bacillus brevis СК.Ф. 3.4.24.41 - члены семейства секреторных метал-лопротеияаз. бацилл, существенно различающиеся по уровню термоста-бкльности.

Работа по получен® и характеристике структурно-функциональных особенностей химерных металлопротеиназ бацилл выполнялась в рамках научно-технической программы "Новейзше методы биоинженерии".

- г -

Цель работы.

Целью данной работы являлось получение набора химерных метал-лопротеиназ бацилл и исследование изменения термостабильности и кинетических характеристик химерных ферментов в зависимости от их строения.

Научная новизна.

Впервые получены гибридные гены типа нпр В.ашу1о11чиеГас1-епз/нпр В.Ьгеу^ и нпр В.Ьгеу1з/нпр В.ашу1о11диеГас1епз, кодирующие функционально-активные металлопротеиназы. Определена нуклео-тидная последовательность шести гибридных генов.

Исследована динамика биосинтеза химерных ферментов. На основе разработанной схеме очистки, включающей гель-хроматографию на Се-фадексе 0-100, ионообменную хроматографию на Сервацеле СМ 23 и высокоэффективную гедь-хроматографио на Суперозе-12, получены электрофоретически чистые препараты природных и шести химерных белков.

Исследование термостабильности металлопротеиназ позволило локализовать ранее неидентифицированные области белковой структуры, существенные для термостабилизации молекулы протеиназы. Анализ кинетических характеристик протеолитических ферментов позволил также выявить районы аминокислотной последовательности, удаленные от области активного центра молекулы и влияющие на эффективность катализа.

Практическая значимость.

Полученные в работе результаты могут быть использованы для создания ферментов с модифицированными свойствами. В частности, для получения ферментов, сохраняющих активность при высоких температурах и позволяющих провести оптимизацию ряда технологических процессов.

Положения, выносимые на защиту.

1. Получение набора гибридных генов, кодирующих химерные проте-олитр<ческие ферменты и определение нуклеотидных последовательностей шести гибридных генов.

2. разработка методов очистки природных (нпр В.ату1о11диеГас1-епэ и нпр В.Ьгеу1з) и химерных белков.

3. Сравнительное исследование термостабильности химерных металлопротеиназ.

4. Анализ кинетических характеристик химерных ферментов.

Структура работы.

Диссертация построена по стандартному плану и состоит из разделов: "Введение", "Обзор литературы". "Материала и методы", "Результаты и обсуждение", "Выводы",. "Список литературы", изложена на страницах, включает ■ рисунков и таблиц. Список литературы содержит источников.

Апробация работы.

Материалы работы были доложены на Росийских конференциях "Новейшие методы биоинженерии" и "Генная и клеточная инженерия" (Пу-щино, 1994), на научной школе "Молекулярная биология: конец XX века" (Черноголовка, 1995), а также на семинаре Биохимического отделения Эдинбургского Университета (Великобритания, 1995).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Получение гибридных генов металлопротеиназ бацилл.

В результате сравнения известных (НопЗо М. е1 а1., 1984 Ава-ков А.С. и др., 1990) нуклеотидных последовательностей генов металлопротеиназ В.ату1о1^иеГас1еп5 и В.Ьгеу1з нами было показано, что уровень их гомологии составляет в среднем 55Х. В то же время, в составе генов были выявлены участки полной идентичности различной протяженности (от 7 до 26 н.п.). Мы предполагали, что именно эти области могут быть в первую очередь вовлечены в процесс гомологичной рекомбинации между генами металлопротеиназ. Наличие по меньшей мере пяти протяженных гомологичных участков в составе данных генов позволяло рассчитывать на образование рекомбинантных молекул различной структуры.

С целью получения набора межгенных гибридов совместно с сотрудниками ШГ РАН Сидоренковым И.С. и Пиотухом К.В. были сконструированы специализированные векторные плазмцды. Мы предполагали, что оптимальным подходом для обеспечения эффективной рекомбинации между гомологичными участками двух генов является локализация генов в составе одного вектора в тандемной ориентации и в непосредственной близости друг от друга.

При конструировании были использованы: плазмида рШНОА (Стг) с клонированным геном нейтральной протеиназы В. ашу1о11диеГас1епз и плазмида рТМ2бЗ (Ешг), содержащая клон:грованный ген нпр В.Ьгеу1з. Плазмида были введены в дефектный по секреторным протеиназам

штамм Bacillus subtilis 2036 (apr",npr"), полученный из коллекции культур микроорганизмов ВНИИгенетика. В дальнейшем в качестве ре-ципиентного штамма мы продолжали использовать В. subtilis 2036. ,

В ходе работы нами была использована такая стратегия конструирования, которая позволяла осуществить эффективный отбор рекомби-нантных форм. На первом этапе SalGI - BspMII фрагмент плазмиды РТМ263 (рис.1,А) замещали на малый SalGI - BspMII фрагмент плазмиды pBR322 размером 1026 п.н. При этом нарушается целостность гена нпр B.brevis и удаляется почти вся последовательность, кодирующая про - пептид. Напомним, что клоны В. subtilis 2036, несу-щиё плазмиду с геном, кодирующим секреторную металлопротеиназу, способны формировать зоны гидролиза казеина при росте на чашках с молочным агаром. Таким образом, колонии, несущие векторную плазмиду с нарушенной структурой гена металлопротеиназы не способны продуцировать активный фермент и могут быть легко идентифицированы. Плазмида, несущая делеционный вариант гена нпр B.brevis, была обозначена как рТМ264.

Следующим шагом было клонирование гена нпр B.amyloliquefaci-ens из шшмвды pUBllOA в рТМ264 по сайту рестриктазы BamHI, расположенному с З'-конца от инактивированного гена нпр B.brevis. ртобрав'Кдамы:по наличию зон гидролиза на молочном агаре и определив рриентацио вставки, мы получили плазмиду рТМ265 (рис.1,А), ,содержащую ген нпр B.amyloliquefaciens, расположенный тандемно с дедедаонным вариантом гена нпр B.brevis.

,На ¡третьем этапе конструирования мы инактивировали ген металлопротеиназы B.amyloUquefaciens, делетируя его 5'-концевую часть. Для этого плазмиду рТМ 265 расщепляли рестриктазой Nael, лигировали и вводили в клетки В. subtilis 2036. После отбора кло-•нов, не проявляющих протеиназной активности, и тщательного рест-рикцконного анализа, была получена конструкция, названная рТМ266 (рис.1,А). Данная плазмида содержала инактивированный ген нпр-B.amyloliquefaciens (1240 п.н.), сохраняющий последовательность, .кодирующую-про - пептид и большую часть зрелого белка, за которой •следует последовательность гена нпр B.brevis (980 п.н.), лишенная •большей части про - пептида. Фрагменты разделены спейсером длиной 387 п.н.

Рекомбинация между фрагментами генов металлопротеиназ должна приводить к образованию полноразмерных гибридных генов, кодирующих активную металлопротеиназу. Очевидно, что соответствующие колонии, несущие гены рекомбинантных металлопротеиназ, могут быть легко идентифицированы по формированию зон гидролиза на молочном агаре.

- -В -

Рис. 1. Схема конструирования векторной плазмиды рТМ2бб (рис. 1, А) и схематическое строение плазмиды р5 (рис. 1, Б). Обозначения: Npr А - imp В. amyloliquefaciens, Npr В - нпр B.brevis, N ^ Nael, S - Sali, Bs - BspM II, В - BamH I, Sp - Sph I, R - EcoR I, M - Mlu I, E - Ehe I, P - Pst I.

Аналогичный подход был использован и при конструировании векторной плазмиды р5 (рис. 1,Б), содержащей инактивированные гены металлопротеиназ в следующей ориентации: фрагмент гена В. brevls (1420 п.н.) - фрагмент гена-нпр В. amyloliquefaclens (1002 п.н.).

Следует отметить, что в случае векторной плазмвды рТМ 266 рекомбинация между фрагментами генов металлопротеиназ должна была приводить к образованию полноразмерных гибридных генов типа нпр В.amylollquefaclens/нпр В.brevls, а в случае плазмиды р5 - типа нпр В. brevis/нпр В.amyloliquefaclens.

При трансформации компетентных клеток B.subtilis 2036 сконструированными плазмидными векторами были обнаружены и отобраны клеточные клоны, формирующие зоны гидролиза на молочном агаре и, следовательно, синтезирующие функционально-активные металлопроте-иназы - продукты экспрессии гибридных генов. При этом эффективность рекомбинации составляла 5-10 клонов на мкг ДНК (при эффективности трансформации около 103 клонов на мкг ДНК).

Рестрикционный анализ плазмидной ДНК, выделенной из этих клонов показал, что наряду с искомыми гибридными конструкциями она содержит и исходные плазмидные вектора. Выделение индивидуальных рекомбинантных векторов из гетерогенной популяции осуществляли, используя структурные различия между ними и исходными плазмидами рТМ 266 и рМ 5. Так, оба исходных вектора содержат между фрагментами генов протеиназ короткие спейсерные участки , включающие сайты рестрикции для эндонуклеаз Sty 1 (плазмида рТМ 266), и Mlu 1, Sph 1 (плазмида рМ5 ). В ходе рекомбинации происходит элиминирование спейсеров и, соответственно, указанных сайтов рестрикции. В результате расщепления плазмидной смеси по этим сайтам и последующей трансформации были отобраны клеточные клоны, не содержащие исходного вектора.

Определение нуклеотидной последовательности гибридных генов.

Для определения нуклеотидной последовательности полученных гиб-, ридных генов были отобраны 7 индивидуальных гибридных генов со структурой нпр В.amyloliquefaclens / нпр В.brevls и Б генов нпр В.brevls / нпр В.amyloliquefaclens, определяющих биосинтез функционально-активных протеодитических ферментов. Соответствующие плазмиды были обозначены pHD 1 - pHD 7 и pHR 1 - pHR5.

Рестрикционным картированием были локализованы области ыежген-ной рекомбинации полученных гибридов. Генные фрагменты, содержащие участки рекомбинации, были выделены из плазмидных векторов по следующим сайтам рестрикции: из плазмиды pHD 1 - Ваш Hl-Pstl (1100 п.н.), из плазмид pHD 2,3,4 - Bam Hl-Narl (1200п.н.), иэ

pHD 5,6,7 - Ban Hl-Pstl (1500 П.Н.), И8 pHR 1-5 - EcoRl-Pstl(1600 п.н.). Указанные фрагменты встраивали в полилинкер фага MlSmplS и выделяли одноцепочечную форму фага, служащую матрицей для дальнейшего определения нуклеотидной последовательности. Первичная структура фрагментов была определена с использованием автоматического ДНК-секвенатора (Модель 370-А, Applied Biosystems) совместно с сотрудником ИМГ РАН Володиным A.A. Результаты определения структуры участков межгенной рекомбинации представлены в таб.1.

Таблица 1

Нуклеотидные последовательности областей межгенной рекомбинации и соответствующие участки гибридных металлопротеиназ.

N Вектор Фермент Последовательность в области рекомбинации

1 pHDl A75B 210 CTTCTCAGCGC GCTGC AGICßATGCACACGCCCAT 70 S S Q R AA V D А H А H

г pHD2,3,4 A95B 259 TCAGAAQTTTAAT CGACAACAGCTACSA TGGAAACGG 87 QKFNRHSYDßWG

3 pHD5 A1038 295 CGGCAAGATCGTA TCC ACCGTTCACTACAGCACG 99 G К I V S T V R Y S T

4 pHD6 A107B 302 AAGATCGTATCCTCG 6ГТСАС TACAQCACGAGAT 101 К I V S S V H Y S T R

5 pHD7 A114B 318 ATTACGGCAGC ASATACAATAACSC CTTCTGGAA 106 H Y Q SR YU H A FWW

6 pHRl-5 B233A 668 GACT /ХШХШЗГеСАТАОАААСАеСИААТС AAC 223 D Y6e7HTUSei N

Примечания!

1 Нумерация иуклаотидных и аминокислотных последовательностей соответствует зрелым осластям лротеиназы В.аа/1о!lquefaolen».

Выделенным ори»том 0101начены области рекои1инации и соответствующие участки аминокислотной последовательности.

Стандартным, приетом выделены нуклеотидные и аминокислотные последовательности прогеиназы B.aoylolIquefactens, курсивом - нуклеотидные ^ аминокислотные последовательности протеииазы В.bravia.

Как видно, во всех случаях образование гибридных генов происходило в результате гомологичной рекомбинации между генными фрагментами с идентичными нуклеотидныыи последовательностями. При этом в большинстве случаев межгенная рекомбинация осуществлялась по идентифицированным ранее протяженным участкам'полной идентичности.

Вместе с тем, обнаружено, что образование межгенных гибридов происходит и по участкам нуклеотидной последовательности со значительно более низким уровнем гомологии. Так, сайт рекомбинации в гибридном гене плазмиды рНО 5 состоит всего лишь из трех нуклео-тидных остатков. Таким образом, нами продемонстрировано, что, несмотря на значительное расстояние между гомологичными областями в структуре векторных молекул, для аффективной рекомбинации в клетках бацилл может быть достаточно наличия коротких участков гомологии. Подученные результаты указывают на возможность эффективного получения разнообразных химерных ферментов на основе гомологичной рекомбинации между соответствующими родственными генами.

Строение химерных металлопротеинав.

Определение точной нуклеотидной последовательности полученных нами гибридных генов позволило, теы самым, однозначно установить первичную структуру соответствующих функционально - активных химерных протеиназ (рис.2). Следует отметить, что некоторые из независимо полученнных генов оказались идентичными. Таким образом, двенадцать изученных генов кодируют шесть различных ферментов.

Белки, кодируемые плазшщами рШ) 1-7, различаются протяженностью последовательности неталлопротеиназы В.агпу1о11чиеГас1епз, локализованной на амино-конце молекулы и содержащей: 71 аминокислотный остаток (рТО 1), 95 (рНО 2,3,4), 103 (рНБ 5), 107 (рНО 6) и 114 остатков (рНО 7) (длина последовательности указана для вре-лой формы фермента.) Пре- и про - части ферментов в этих случаях также кодируются геном металлопротенназы В.а.иу1о11чиеГ£с1епз, а карбокси-концевые последовательности - соответствующими фрагментами гена металлопротенназы В.Ьгеу1з.

• Все 6 ферментов, кодируемые генами плазмид рНК 1-5 идентичны и содержат пре-про последовательность н первые 229 аминокислотных остатков металлопротенназы В.Ьгеу15 н С-концевой фрагмент металлопротенназы В.шу1о11диеГас1епз.

Рис. 2. Схематическое строение химерных металлонротеине» баиилл.

Особенности экспрессии "родительских"и химерных ферментов в клетках Вас.зиЬМПБ.

Культуры штаммов - продуцентов металлопротеиназ выращивали в колбах Эрленмейера в объеме 300 мл на качалке при 37° С в ЬВ-бульоне, содержащем 10 г/л триптона. 5 г/л дрожжевого экстракта. 6 г/л ИаС1 и 0,5 г/л СаС1а. Для характеристики особенностей биосинтеза химерных и "родительских" протеолитических ферментов ночную культуру клеток В.БиШПз 2036, несущих соответствующие клонированные гены, разводили в соотношении 1/50 средой ЬВ и выращивали в течении 30 ч, измеряя оптическую плотность и отбирая пробы на различных стадиях роста. Протеолитическую активность в культу-ральной жидкости определяли по гидролизу азоказеина по стандартной методике (Ансон,1982).

На рис. 3 представлены кривая роста клеточной культуры и динамика накопления протеиназ в культуральной жидкости. Как видно из рисунка, кривые роста культур клеток, несущих рекомбинантные и исходные плазмиды, практически совпадают. Начало биосинтеза нпр B.aшyloli<íuefaclens соответствует середине логарифмической фазы роста клеточной культуры. Аналогичный характер носит накопление химерных металлопротеиназ типа нпр В.ату1о11<1иеГас1епз/ нпр В.ЬгеУ1з. В то же время, в случае нпр В.Ьгеу1з и фермента В233А заметная протеолитическая активность в культуральной среде обнаруживается лишь на 20-м часу ферментации, в начале стационарной фазы клеточного роста.

—— I -+-2 -*- 4 -*-3

Рис.3. Изменение «ктиаиости природ пых и химерных мсталлопвотеинм я культуральной жидкости,

Цифрами указаны: 1 - кривая роста (А'м )клеток штамма В.виЬгШв 2036, содержащих клонированные гены металлопротеинаэ, 2 - протеолити-чвская активность (А410 )нпр В.вту1о11чивГас1впз и ферментов типа нпр А/ нпр В в присутствии 10 мМ СеС1г, 3 - протеолитическая активность Ферментов типа нпр А/ нпр В в отсутствие ионов кальция. 4 - протеолитическая активность нпр В.Ьгеу1а и нпр В233А.

Следует отметить, что наблюдалось быстрое снижение протеолити-

ческой активности химерных ферментов черев несколько часов после достижения максимального уровня активности. По-видимому, это связано с повышенной чувствительностью химерных металлопротеинаэ к процессу автопротеолиза. С целью стабилизации ферментов в культу-ральную среду вводили до 10 мМ СаС1г. Добавление ионов кальция предотвращало снижение протеолитической активности (рис.3).

Выделение и очистка ферментов.

Культуральную жидкость, характеризующуюся максимальным содержанием металлопротеинаэ, отделяли от клеточной биомассы центрифугированием при 4000 об/мин. Осаждение белков из супернатакта осуществляли добавлением сульфата аммония до 60% насыщения. Раствор центрифугировали при 6000 об/мин в течение 25 мин. Осажденный белок ресуспендировали в 2 мл 10 мМ Трис-НС1 буфере рН 7,2 содержащем 10 мМ СаС1г. Гель-хроматографию белков проводили в том де буфере на колонке с Сефадексом 6-100.

Фракции, содержащие металлопротеинаау обьединяли и пропускали через колонку с сорбентом Сервацел СМ 23, уравновешенным 10 мМ Трис-НС1 буфером , рН 7,2, содержащем 10 мМ СаС1г. Элюцию осуществляли 0-0,БМ градиентом N601 в том же буфере. -

Высокоэффективную жидкостную хроматографию осуществляли на сорбенте Супероза 12 в 10мМ Трис-НС1 буфере, рН 7,2, в присутствии 2 мМ СаС1г. За один хроматографический цикл на колонку наносили 300 ыкл пробы. Примененный метод очистки позволил в три стадии получить высокоочиценные препараты природных и химерных металлопротеинаэ (табл.2). .

Гомогенность очищенных металлопротеинаэ была подтверждена электрофорезом в 12.ЕЖ-ном полиакриламидном геле в присутствии О,IX додецилсульфата натрия.

Таблица В

Результаты очистки природных и химерных ферментов.

Фермент Выход по активности, X Степень очистки

AMY 54 23

BREV 45 28

А 75 В 34 37

А 95 В . 47 34

А 103 В 60 20

А 107 В 55 25

А 114 В 39 28

В 233 А 43 33

Изучение структурных основ термостабильности металлопротеинаа бацилл на модели химерных ферментов.

Выбор в качестве исходных объектов для согдаиия химерных белковых конструкций нейтральных протеинав B.amyloliquefaclens и B.brevls в значительной мере был обусловлен существенными различиями их температурных характеристик. Так, нлр В.amylollquefaniens является одним ив наиболее термолабильных представителей семейства металлопротеинаа бацилл. В то же время, значения температурного оптимума активности и уровня термостабильности нлр В. brevls превышают соответствующие величины для нпр B.amyloliquefaclens почти на 20° С.

Мы надеялись, что исследование температурных свойств структурных гибридов между термостабильным и термолабильным представителями одного семейства белков позволит прояснить механизмы термостабилизации белковой молекулы, обнаружить структурные компоненты и взаимодействия между ними, ответственные за повышение уровня термотолерантности протеоштических ферментов.

Термостабильность очищенных ферментов анализировали, прогревая образцы при температурах 50 - 80° С, отбирая аликвоты на различных сроках инкубации и определяя в них остаточную протеолитичес-кую активность по гидролизу азоказеина. На основе полученных данных было расчитано время полуинактивации ферментов для каждой температуры.

Результаты анализа термостабильности природных и химерных протеиназ представлены на рис.4 и рис.5. Как видно ив представленных данных, химерные протеолитические ферменты заметно различаются по этим параметрам как между собой, так и от природных протеинав B.brevls и B.amyloliquefaclens.

При этом уровень терыостабильности и температурный оптимум активности химерной протеиназы В233А достаточно близки к соответствующим характеристикам нпр B.brevls. По сравнении с природной термостабильной протеинавой температурные параметры гибридного, белка понизились всего лишь на 4-5° С (рис. 4). Интересно, что столь существенное изменение структуры белковой молекулы - замена более семидесяти С-концевых аминокислотных остатков - практически не сказывается на его терыостабильности. Это указывает на то, что С-концевой домен нейтральных протеиназ бацилл (234-316 аминокислотные остатки), вероятно, не содержит областей, существенных для обеспечения термостабильности белка. Следует отметить, что это может быть связано с тем, что фермент В233А сохраняет все аминокислотные остатки нпр Вас. brevls, участвующие в образовании известных функционально-важных областей: активного центра, субс-

-*-Л107В СЯЕУ 8233А АМУ

Рис. 4. Зависимость времени лолуинактивации природных (нпр в.ату1о11 чиеГас1епз и В.ЬгеУ1з) и химерных (А75Н и В23ЭА) металлопротеиназ о температуры.

49 50 51 52 53 54 63 5в 57 58 59 —— А1038 А1С78 -»~А114в А958 А750

Рис.5. Зависимость времени лолуинактивации химерных ферментов типа нпр А/ ипр В от температуры.

- Ü4 -

трат-связывавдего участка, междоменной области и кальций-связыва-ющих участков.

В то же время, для химерных металлопротеиназ типа А/В (нпр B.amylollquefaclens / нпр B.brevls) , характеризующихся заменой N-концевой аминокислотной последовательности нпр B.brevls последовательностью нпр B.amylollquefaclens, наблюдается резкое снижение уровня термостабильности. Некоторые из них ( А75В и А95В) оказались еще более термолабильными, чем нпр B.amylollquefaclens (рис.4).. Это означает, что про-часть или первые семьдесят четыре аминокислотных остатка N-домена нпр B.brevls включают структурные компоненты, необходимые для термостабилизации белковой молекулы.

По-видимому, одним из таких элементов структуры, общим для всех ферментов группы А/В, является второй кальций-связывающий район (аминокислотные остатки Asp Б7, Asp 69, Gin 61 по последовательности термолизина). Следует отметить, что рядом авторов (Fromnel et al,1989, Kawamura F.et al.,1984), была продемонстрирована важная роль ' кальций-связываюших участков в обеспечении термотолерантности нейтральных и сериновых протеиназ. Как было показано ранее (Костров, 1989) на основе сравнения аминокислотных последовательностей, в случае нпр B.amylollquefaclens этот кальций-связывающий район, по-видимому, инактивирован, что представляется одной из возможных причин пониженной термостабильности данного фермента. Соответственно, в гибридных белках типа А/В, данный функциональный участок также неактивен.

В то же время (рис. 5), существуют заметные различия в уровне термостабильности между этими белками. Так, например, при 55° С Еремя полуинактивации ферментов составляет, соответственно: для А75В - 10 МИН, А953 - 30 МИН, А114В - 55 МИН, А107В - 90. МИН И А103В - 120 мин.

Необходимо отметить, что для ферментов А75В , А95В и А103В возрастание термостабильности коррелирует с увеличением протяженности в составе гибридной молекулы N-концевой последовательности' термолабильного фермента В.amylollquefaniens. При этом наличие в последовательности фермента А103В короткого кластера из пяти аминокислотных остатков, принадлежащих последовательности нпр B.amylollquefaclens (аминокислотные остатки 95,96,98,99,101), приводит к особо заметному повышению его Термостабильности по сравнению с белком А95В.'

Полученные результаты позволяют предполагать, что этот район последовательности вовлечен во взаимодействие с амино-концевым

Рис. 6. Пространственная структура Ы-домена молекулы термолизина. Указаны аминокислотные остатки 36-42 и 95-103, Формирующие участок бета-склалчатой структуры.

фрагментом белка, представленным последовательностью нпр B.amylo-liquefaolens. Тогда нарушение этого взаимодействия в результате введения негомологичных аминокислотных остатков нпр В. brevls должно приводит к снижению стабильности фермента, что и наблюдается в случае белка А95В. Действительно, как видно ив представленной яа рис.6 пространственной структуры N-домена молекулы термолизина, аминокислотные остатки 95-101 находятся зо взаимодействии с К-концевой частью молекулы, формируя совместно с аминокислотами 36-42 участок бета-складчатого структуры.

Таким образом, полученные результаты позволяют с высокой степенью вероятности предполагать, что внутримолекулярные контакты, образованные аминокислотными остатками 95 - 101 и 103, в значительной степени вовлечены в стабилизацию молекулы протеиназы в целом.

Изучение кинетических характеристик химерных металлопротеиназ бацилл.

Располагая набором биологически активных химерных металлопроте-оиназ с иззестной первичной структурой, мы предприняли исследование их ферментативных характеристик с целью локализации новых функционально-существенных районов молекулы.

Для измерения протеолитической активности очищенных природных и химерных ферментов использовали хромогенный субстрат ДНФ-Gly-Gly-Leu-Arg. Реакцию проводили в ЮмМ Трис-HCl буфере, pH 7,5 при 25° С в течении 30 мин и останавливали добавлением 0,5 N HCl. Расщепленный субстрат отделяли на SP-Сефадексе С-25.

Удельную активность очищенных гомогенных ферментных препаратов определяли по результатам измерения протеолитической активности и концентрации белка в пробе. Концентрацию белка определяли модифицированным методом Брэдфорда (1976). Значения удельных активностей ферментов приведены на рис.7.

Кинетику ферментативных реакций протеолиза хромогенного субс-. трата прослеживали спектрофотометрическим методом при 360 нм на спектрофотометре Shlmadzu. Результаты измерений были обработаны с помощью компьютерной программы Enzfltter, version 1.05 (Elsevi-er-Biosoft). Значения кинетических констант, полученные по уравнению Лайнуивера-Берка представлены в табл.3.

Следует отметить, что в составе исследуемых химерных металлопротеиназ сохраняется центральная область молекулы нпр В.brevls, включающая все известные аминокислотные остатки, формирующие

Рис. 7. Значения удельных активностей металлопротвинаа. 1 - нпр В. ату1о11яиеГас1пз, 2 - нпр В. breviз, 3 - А75В, 4 -А95В, 5 - А10ЭВ, в - А107В. 7 - А114В. 8 - В23ЭА.

Таблица 3

КИНЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ГИДРОЛИЗА СУБСТРАТА ДНФ-а1у-61у-Ьеа-Агд ПРИРОДНЫМИ И ХИМЕРНЫМИ

Фермент Кш, шМ к к cat/ К гп М-с

А 43 + 4 4.5 + 0.4 105

В 68 + 6 10.6 + 1.2 156

А75В 62 + Ь 4.2 + 0.3 68

А95В 67 + 6 5.5 + 0.7 82

А103В 62 + 6 9.8 + 0.8 158

А107В 64 + 7 9.4 + 1.1 • 147

А114В 68 + 8 10.1 + 1.3 148

В233А 116 + 16 0.8 0.1 7

субстрат-свявывающий участок и активный центр секреторных метаз-лопротеинас бацилл, локализованные в районе 130-232 аминокислотных остатков. Логично было бы предположить, что для химерных ферментов кинетические параметры должны сохраняться на уровне значений, характерных для нпр B.brevis.

Действительно, как видно из табл.3 и рис.7, в ряде случаев (белки А103В,А107В,А114В) наблюдается практически полное совпадение значений удельной активности и кинетических констант химерных белков и протеин азы из B.brevis, Это свидетельствует о том, что даже столь радикальное изменение структуры протеолитичесюэго фермента, как замена более 100 аминокислотных остатков в N-домене молекулы на последовательность родственного белка не сопровождается существенным изменением каталитической эффективности фермента.

Одначо, для ферментов А75В и А95В было обнаружено заметное (в 2 раза) снижение величин удельной активности и каталитической константы. Полученные результаты свидетельствуют о влиянии района последовательности 95-103 , имеющего различную структуру для ме-таллопротеинаг А95В и А103В, на каталитические свойства фермента. По-Еидимому, причина такого влияния связана с опосредованным воздействием аминокислотных остатков данного фрагмента молекулы на конфигурацию активного центра фермента.

Как видно из табл.З и рис. 7 в случае белка В233А наблюдается резкое ( почти в десять раз) снижение удельной активности и каталитической константы, а также увеличение вдвое константы Михаэли-са (по сравнению с остальными изучаемыми ферментами). Возможно, что ухудшение каталитических характеристик этого фермента связано с тем, что соединение аминокислотных последовательностей нпр B.amyloliquefaclens л нпр B.brevis в структуре данного химерного белка осуществляется в позиции 233-го аминокислотного остатка, т.е. в непосредственной близости от аминокислотных остатков Asp 225 и His 231, вовлеченных в формирование активного центра. Возникновение неоптимальной пространственной структуры в данном районе молекулы могло привести к изменению конформации активного центра фермента.

Таким образом, в результате проведенного исследования были локализованы районы аминокислотной последовательности молекул ме-таллопротеиназ бацилл, влияющие на эффективность катализа.

- 19 -ВЫВОДЫ.

1. На основе рекомбинации между фрагментами генов секреторных металлопротеиназ Bacillus amyloliquefaciens и Bacillus brevis subtllis получен набор гибридных генов, кодирующих функционально-активные химерные протеолитические ферменты. Установлена нук-леотидная последовательность шести полученных генов..

2. На основе разработанной схемы очистки, включающей гель-хроматографию на Сефадексе 6-100, ионообменную хроматографию на Сер-вацеле СМ 23 и гысокоэффективную гель-хроматографио на Суперо-зе-12, получены электрофоретически чистые препараты природных (нпр В. amyloliquefaciens и нпр В. brevis) и шести химерных металлопротеиназ.

3. Исследована термостабильность природных и химерных ферментов. Полученные экспериментальные результаты позволили локализовать ранее неидентифицированные области белковой структуры, существенные для термостабилизации молекулы протеиназы.

4. Анализ кинетических характеристик протеолитических ферментов выявил районы аминокислотной последовательности, влияющие на эффективность катализа.

Список работ,' опубликованных автором по теме диссертации.

1. Чумаков В.Н., ПиотуХ К.В., Володин A.A., Костров C.B. Характеристика гибридных генов, кодирующих функционально-активные секреторные металлопротеинавы бацилл // Молекул, биология.-1995.- Т.29.- С. 756-760.

2. Чумаков В.Н., Азимова М. И., Зайцев Д.А., Габриэлян А.Э., Костров C.B. Анализ структурных основ термостабильности секреторных металлопротеиназ бацилл на модели химерных ферментов // Молекул. биология." 1995.- Т. 29. С.- 992-1000.

3. Чумаков В.Н., Пиотух К.В., Костров C.B. Получение и определение структуры химерных металлопротеиназ бацилл.// Тезисы доклада. конференция "Генная и клеточная инженерия. Пущино.- 1994.-С. 3-4.

4. Чумаков В.Н., Азимова М.И., Костров C.B. Молекулярные механизмы термостабильности на модели химерных металлопротеиназ бацилл // Материалы конференции "Новейшие методы биоинженерии". Москва.- 1994.- С. 10.

5. Чумаков В.Н., Азимова М.И., Хромов И.С., Костров C.B. Изучение кинетических характеристик химерных металлопротеиназ бацилл // Молекул, биология. Находится в печати.