Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Формирование изомеров металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27a при про-зависимом фолдинге

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Формирование изомеров металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27a при про-зависимом фолдинге"

На правах рукописи

САФИНА Дина Рашидовна

ФОРМИРОВАНИЕ ИЗОМЕРОВ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗЫ ТНЕЯМОАСТтотСЕЗЯР. 27а ПРИ ПРО-ЗАВИСИМОМ ФОЛДИНГЕ

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

<3^

К

Москва - 2005

Работа выполнена в лаборатории белковой инженерии Института молекулярной генетики Российской академии наук.

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор

доктор химических наук

Костров Сергей Викторович

Каплун Александр Петрович Руденская Галина Николаевна

Ведущая организация: Государственный научно-исследовательский

институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Защита состоится «30» лих л 2005г. в 15 часов на заседании Диссертационного совета Д 212.120.01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, проспект Вернадского, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан <Д£» В/и|\£Л4ДО05г.

Учёный секретарь

диссертационного совета Д 212.120.01,

кандидат химических наук Л * Лютик А.И.

L Lftffi 3

0 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Современная биотехнология включает в себя целый ряд

разнообразных, быстро развивающихся социально ориентированных направлений

исследований. Сюда входит создание новейших лекарственных препаратов,

диагностикумов, разработка новых способов утилизации промышленных отходов и

многое другое. При этом успехи современной биотехнологии во многом связаны с

использованием разнообразных ферментов или ферментативных систем, позволяющих, с

одной стороны, оптимизировать традиционные производства (на основе замены

химических подходов энзиматическими или за счет повышения эффективности уже

существующих ферментативных процессов), а с другой - развивать совершенно новые

направления. Уровень современной белковой инженерии и ее успехи в области,

направленной на оптимизацию биотехнологического производства, дают основания

предполагать, что уже в достаточно скором времени конструирование оптимизированных

ферментов de novo или на основе имеющихся полимерных молекул станет реальной

лабораторной практикой и позволит существенно повысить эффективность

биотехнологических процессов, основанных на использовании биокатализаторов. Тем ни

менее, на настоящее время наши знания о молекулярных механизмах, определяющих

структурно-функциональные взаимосвязи в белковых молекулах, ещё не достаточны для

направленного создания ферментов с заданными свойствами. Широкое применение в

современной биотехнологии получили протеолитические ферменты (в том числе,

продуцируемые микроорганизмами, обитающими в уникальных природных и

искусственных экосистемах), которые являются перспективными для практического

использования, а также весьма интересными с научной точки зрения. В частности,

формирование пространственных структур многих протеиназ по про-зависимому пути

позволяет разработать новые подходы к исследованию молекулярных механизмов,

обеспечивающих фолдинг белковых молекул, а также изучить возможность

конструирования на базе одной и той же аминокислотной последовательности

конформационных изомеров ферментов, обладающих различными свойствами. Данная

работа посвящена изучению возможности образования функционально различающихся

изомеров протеолитических ферментов в ходе про-зависимого фолдинга на модели

термолизин-подобной металлопротеиназы Thermoactinomyces sp.

Работа поддержяяя гряитями РФФИ № 00-04-48280. № 00-04-48281. № 03-04-48755.

Список использованных сокращений: НТК - нитрилтриуксусная кислота; ПААГ -полиакриламидный гель; ПЦР - полимеразная цепная реакция; трис - трис(гидрокси)-аминометан; УЗ - ультразвук; ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота; Ар -ампициллин; DNP - динитрофенил; Em - эритромицин.

РОС. НАЦИоН^нЬНЛВ БИЬ.лОГГ.КА

т^к

Цель работы. Целью данной работы являлось выяснение возможности конструирования различающихся по специфичности действия протеолитических ферментов на базе единой аминокислотной последовательности без внесения замен в функционально существенные области молекулы.

Научная новизна. Впервые сконструированы разнообразные модифицированные варианты гена металлопротеиназы Thermoactinomyces sp., осуществлена их экспрессия в клетках Bacillus subtilis и Escherihia coli, и охарактеризованы соответствующие белки. Показано, что данный фермент формирует свою пространственную структуру по про-зависимому механизму и продемонстрировала возможность получения стабильных, отличных по своей субстратной специфичности, протеиназ на базе одной аминокислотной последовательности.

Практическая значимость. Полученные результаты открывают новый подход для конструирования протеолитических ферментов с модифицированными свойствами, в частности, измененной субстратной специфичностью. Поскольку протеиназы занимают лидирующее место среди ферментов, используемых в практических целях, то этот подход может быть использован при оптимизации целого ряда биотехнологических производств.

Положения, выноснмые на защиту.

1. Конструирование и характеристика модифицированных вариантов металлопротеиназы Thermoactinomyces sp.

2. Доказательство протекания фолдинга металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. по про-зависимому механизму.

3. Изучение возможности использования гетерологичных про-последовательностей в качестве фолдинг-ассистентов.

4. Конструирование на базе одной полипептидной цепи протеолитических ферментов, отличающихся по своей субстратной специфичности.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на Международной конференции молодых ученых "От фундаментальной науки - к новым технологиям" (Москва - Тверь, 2001), на V симпозиуме "Химия протеолитических ферментов" (Москва, 2002), на III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), на III научной конференции молодых ученых, аспирантов, студентов научно-образовательного центра Казанского государственною университета "Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2003), на научно-практической конференции "Современное состояние российской биотехнологии" (Пущино, 2003), на научной конференции "Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии" (Казань, 2004), на Всероссийском симпозиуме "Биотехнология микробов" (Москва, 2004), на XIII

Международной научной конференции "Фермен гы микроорганизмов; структура, свойства, применение." (Казань, 2005), на заседании Ученого совета Института молекулярной генетики РАН (Москва, 2005), на семинаре кафедры биотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова (2005).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 104 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы (156 источников). Работа иллюстрирована 35 рисунками и содержит 5 таблиц.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Характеристика металлопротеиназы ТНегтоаатотусех ер. 27а Ранее в лаборатории белковой инженерии был отобран штамм ПегтоасИпотусе.ч йр. - продуцент термостабильных протеолитических ферментов различных групп, в том числе и металлопротеиназ. В связи с тем, что протеиназы микроорганизмов рода ТИегтоасИпотусез на данный момент недостаточно исследованы, были проведены эксперименты, направленные на молекулярное клонирование и экспрессию гена нейтральной металлопротеиназы ТЪегтоасИпотусеэ эр.

В результате, был получен ген нейтральной металлопротеиназы ТЪегтоасИпотусеч ер., который, в составе векторной плазмиды рСВ 22, был экспрессирован в клетках штамма В зиЫШч А.Т73. с пониженным уровнем секреции собственных протеиназ. Определена нуклеотидная последовательность гена металлпротеиназы ПегтоасНпотусез ер и проведен анализ соответствующего белка. Показано, что фермент синтезируется в виде пре-про-белка и состоит из лидерного пептида - 26 аминокислотных остатков, про-иоследователыюсти - 215 аминокислотных остатков, зрелой части - 432 аминокислотных остатка. В составе зрелой части установлено наличие дополнительной С-концевой последовательности, которая кодируется структурным геном металлопротеиназы ТкегтоасЛтотусез ер, но отсутствует в составе активного фермента. Наличие дополнительной С-концевой последовательности металлопротеиназы ТИегтоасИпотусе.ч ер., которая отщепляется при созревании белка, является интересным и пока неизученным фактом. Функциональная роль С-концевых аминокислотных последовательностей в составе металлопротеиназ не определена. Известно, что С-концевые последовательности предшественников отдельных микробных протеиназ могут бьггь вовлечены в процесс секреции ферментов, однако ситуация с С-концевой последовательностью металлопротеиназы ТЪегтоасНпотусеэ ер. не была ясна.

В данной работе металлопротеиназа ТЪегтоасНпотусе.ч эр. была использована в качестве модели для исследования молекулярных механизмов, определяющих фолдинг и функционирование термолизин-подобных металлопротеиназ.

Конструирование мутантных вариантов металлопротеиназы ТИегтоасМпотусез ер. 27а, с делегированной дополнительной С-концевой последовательностью

Для проверки, является ли наличие дополнительной С-концевой последовательности необходимым условием формирования и секреции функционально-активного фермента, нами были проведены эксперименты по конструированию мутантного варианта гена металлопротеиназы ТЪегтоасЧпотусех зр., с удаленной последовательностью, кодирующей дополнительную С-концевую область.

Ранее было локализовано место Ы-концевого процессинга металлопротеиназы 1ЪегтоасНпотусе$ ер.: амино-концевая последовательность зрелого фермента идентифицирована как А-А-А-Т-й- Г-в-Т-О-У. По результатам масс-спектрометрического анализа металлопротеиназы ТЪегтоасНпотусеч ер., масса зрелого фермента равна 34190±70Да. Эти данные указывают на протекание Ы-концевого и С-концевою процессингов и удаление соответствующих областей из состава зрелого бежа.

290 300 310

1 ОЗАТОЬУСЭТЗОЕУАЗУКОАГОАУСУК

2 +Д+А++++ + + ++++И+4 ++++Ш+ + + У

3 +А+А++++++++++Ы++++++Ы++++У

4 -(А+А+-1 <^АЫ+А+++А++*3+3++++М

5 +А+А++++ ьС++++1++СКЗ++++++(2

6 Ь+*+++Г+АН+К(2->-0А+КА^+++++ +

7 +А+К++++А«+А+АТАААКЗ+++ + +—

8 ЕА+(т++Е0+К23+++ЕК+УЕ+ ++11,

9 +++1Н+++++ - РА+К+ ЕА+1АК+ + +—

10 +++И+++++0—ОА+НЬЕА4™+ + + Ь-

11 А++++Г+АК+Ъ+АТА+АЫ-^АЗ++ ^|С336Ш6СЗСРАУЕРЮЗМЗААКАМ336ТТУМС1ЛЗЗАТРУРУ/1ГКРТР ЗТЗТУЬЗЬЗЬТМЬРАРУРЬУЬУ№АСТЬЬАЯЗЕУА6ТЗЗЕ31АС110ССАТУУУКМСУЫ6АМЗТТКРУА1,КАТУ

Рис. 1. Сравнение аминокислотных последовательностей ряда термолизин-подобных металлопротеиназ в С-концевой области. 1. - Термолизин. Далее ферменты' 2 -В з/еагшИегторИНш КргТ; 3,- В. аШосЫскп-тй: 4.- В. сегеж, 5.- В. те^Шепит', 6.В. Ьгеш', 1 .-В. ро1утуха\ 8.-5 ьиЬ/Ш.ч ХргВ; 9,- В. ¡иЫШз ИргЕ; 10.- В ату1оНдие/ааеш, 11.- ТИегтоасНпотусех ер. Дополнительная С-концевая последовательность металлопротеиназы ТИегтоасИпотусе.ч яр. подчеркнута. Нумерация остатков проведена по последовательности термолизина. Стрелкой указана позиция, по которой осуществляли отщепление дополнительной С-концевой последовательности при последующем конструировании.

На основе данных о молекулярной массе металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. и в результате сравнения ее последовательности с последовательностями других бациллярных термолизин-подобных металлопротеиназ, нами была установлена возможная область отщепления дополнительной С-концевой области при процессинге (рис.1).

Это позволило перейти к конструированию модифицированного гена металлопротеиназы Thermoactinomyces sp., в котором область, кодирующая дополнительную С-концевую последовательность, была бы делетирована. Отщепление дополнительной С-концевой последовательности осуществляли между 309 и 310 аминокислотними остатками металлопротеиназы. При этом в З'-концевую область модифицированного гена, предполагалось ввести дополнительную последовательность, кодирующую шесть остатков гистидина, для обеспечения возможности последующей очистки белка методом аффинной хроматографии на Ni-содержащей НТК-агарозе.

Также планировалось получение полноразмерного фермента металлопротеиназы Thermoactinomyces sp., несущего дополнительный гистидиновый якорь на С-конце молекулы. Сопоставление данных, полученных при анализе этих консфукций, почволило бы более точно оценить как роль дополнительной С-концевой последовательности, так и влияние шестигистидинового якоря на особенности функционирования данного фермента в клетках В subtilis AJ73.

Создание генетических конструкций осуществляли по единой схеме, коюрая включала:

1. Получение методом ПЦР полинуклеотидных фрагментов, соответствующих 3'-концевым областям гена металлопротеиназы, клонирование амплификатов в состав плазмидного вектора pUC 19 и подтверждение их нуклеотидных последовательностей.

2. Конструирование промежуточного плазмидного вектора, содержащего ген металлопротеиназы Thermoactinomyces sp., З'-концевая область которого была замещена на участок чужеродной ДНК фага X. В этом случае ген металлопротеиназы инактивировался и колонии бациллярных клеток, несущие данный вектор, были не способны продуцировать активный фермент. При последующем клонировании в промежуточный вектор модифицированных фрагментов, кодирующих С-концевые районы металлопротеиназы, ферментативная активность должна была восстановиться, и колонии, несущие такие плазмидные вектора, можно было бы легко отобрать, высевая их на селективную питательную среду.

3. Перенос фрагментов ДНК, кодирующих модифицированные участки С-концевой области металлопротеиназы, из векторов на основе плазмиды pUC 19 в состав промежуточного вектора.

В результате нами были получены два модифицированных варианта гена металлопротеиназы ТИегтоасНпотусез ер., в которые были введены перед стоп-кодоном дополнительные последовательности из 18 пар нуклеотидов, кодирующих шесть остатков гистидина, а в одном из них была удалена 3'-концевая последовательность, соответствующая дополнительной С-концевой области фермента. Полученные генетические конструкции были обозначены рВИ №в/720 и рВН ЬЙБ/ЗбО, соответственно. Оба мутаитных варианта гена металлопротеиназы ТИегтоасНпотуса эр. в составе векторных плазмид были введены в клетки штамма В. ¡иЫШх А173. Показано, что полученные рекомбинантные штаммы способны секретировать в культуральную среду активный протеолитический фермент.

Характеристика модифицированных вариантов металлопротеиназы Пегтоасйпотусеь яр. 27а

Для анализа динамики накопления протеолитических ферментов в культуральной жидкости штаммов В. мЫШз АД73, несущих плазмиды рВП №8/720 и рВП Шэ/ЗбО, культуры клеток выращивали в Ь-бульоне в присутствии 1 мМ СаСЬ и Ет в течение 45 ч при высокой аэрации. В качестве контроля использовались штаммы: В. ¡иЫШ.ч АЛ73, несущий плазмиду р3.1, определяющую биосинтез природного фермента и В. зиЫШя АЛ73 с векторной плазмидой рСВ 22, как отрицательный контроль.

На различных стадиях роста отбирали аликвоты для измерения оптической плотности клеточной суспензии и определения общей протеолитической активности ферментов в культуральной жидкости по гидролизу азоказеина.

Показано, что рост всех клеточных культур существенно не отличается друг от друга. При этом ген, кодирующий протеиназу с удаленной дополнительной С-концевой последовательностью и шестью остатками гистидина обеспечивал высокое накопление функционально активного фермента в культуральной жидкости (рис.2).

04 Г 0,35 ■ ■

Рис. 2. Динамика накопления протеолитических ферментов в культуральной жидкости штаммов-продуцентов В. subtilis AJ73, несущих плазмиды рСВ22 -■-, рЗ.1 -♦-, pBII His/720 -•-, pBII IIis/360-А-. По оси абсцисс: время инкубации, ч, по оси ординат: протеолитическая активность по гидролизу азоказеина, O.E. (450 нм).

6 12 18 24 30 36 42 48

Таким образом, удаление дополнительной С-концевой последовательности не привело к ингибированию фолдинга и секреции фермента, а введение гистидиновой последовательности не повлияло на активность металлопротеиназы ТЪегтоасипотусеэ ер. Следует отметить, что данная конструкция обеспечивает несколько более низкое накопление фермента, чем вектор р 3.1. Причина такого явления пока не ясна.

Интересный результат был получен при анализе накопления фермента в штамме В ¡иЫШз А373, несущем плазмиду рВН №8/720. В этом случае наблюдалось лишь незначительное накопление протеолитической активности в культуральной жидкости (рис.2). По уровню продукции данный штамм сильно уступал культурам, продуцирующим как фермент с делегированной дополнительной С-концевой последовательностью, так и природную металлопротеиназу ТИегтоаагпотусех ер.

Рис. 3. Стабильность природной (А) ме1аллопротеиназы Thermoactinomyces sp. и модифицированного (Б) фермента с удаленной С-концевой последовательностью при различных температурах: 1. - 60°С, 2. - 70°С, 3. - 75°С, 4. - 80°С, 5. - 85°С. По оси абсцисс: время инкубации, мин; по оси ординат протеолитичеекая активность но гидролизу азоказеина, O.E. (450 нм).

Были проведены эксперименты по сравнению термостабильности полученной мутант ной формы фермента с делегированной дополнительной С-концевой последовательностью и исходной металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. Отметим, что в случае протеолитических ферменюв характеристика их термостабильности является весьма существенным моментом. Это связано с особенное 1ью температурной инактивации протеиназ, поскольку, в отличие от ферментов других групп, термоинактивация протеиназ сопровождается их эффективной автолитической деградацией, связанной с гидролизом пептидной цепи в районах локальной денатурации молекул. Таким образом, снижение уровня термостабильности в первую очередь свидетельствует об образовании ферментом менее компактной пространственной структуры.

Как видно из рисунка 3, уровень протеолитической активности для обоих ферментов не изменялся при 60°С в течение часа. В интервале температур 70°С-75°С потеря активности составила 30%-40% от начальной активности ферментов после инкубирования в течение часа, а при температуре 80°С оба фермента за 40 мин теряли активность практически полностью. Таким образом, по уровню термостабильности нативный и мутантный ферменты не отличаются друг от друга. Полученные данные указывают на то, что модифицированный вариант металлопротеиназы ТЪегтоасИпотусе^ зр. с делегированной дополнительной С-конпевой областью способен формировать стабильную пространственную структуру. Приведенные результаты свидетельствуют, что дополнительная С-концевая последовательность в структуре предшественника металлопротеиназы ПегтоасИпотусея яр. не оказывает существенного влияния на процессы секреции, сворачивания и функционирования фермента.

Конструирование изолированных фрагментов металлопротеиназы ТИегтоасйпотусеь «р. 27а

Полученные на предыдущих этапах работы результаты позволили начать изучение про-зависимого фолдинга на модели металлопротеиназы ТЪегтоасИпотусея эр. Высокоэффективную экспрессию индивидуальных фрагментов данного фермента осуществляли в клетках Е соИ ВЬ-21 на основе плазмидного вектора рЕТ-23Ь. С этой целью, на начальном этапе работы, были получены амплификаты генов, кодирующих различные области металлопротеинзы, а именно: полноразмерный предшественник металлопротеиназы ТЬегтоаатотусез эр.; предшественник металлопротеиназы 1ЪегтоасНпотусе5 ер. с делегированной дополнительной С-концевой последовательностью; полноразмерную зрелую часть металлопротеиназы ПегтоасНпотусе.1! ер.; зрелую часть металлопротеиназы ТЬегтоасНпотусев ер., с делегированной С-концевой последовательностью; про-последовательность металлопротеиназы ТИегтоасИпотусея ер., а также про-последовательности металлопротеиназ В ату1оИдие/аС1еп<;, В ЬгеуЬ и химерную металлопротеиназу ТИегтоасИпотусея яр., про-часть которой представлена про-частью металлопротеиназы В атуЫ'щие/ааею. Все полученные амплификаты содержали дополнительную последовательность, кодирующую шесть остатков гистидина на 5'-конце в случае про-последовательностей и на 3'-конце, если полинуклеотидный фрагмент кодировал зрелую часть фермента. Эти амплификаты были клонированы в плазмидный вектор рис 19 и их структура подтверждена секвенированием. Па заключительном этапе конструирования данные фрагменты были перенесены в состав экспрессионного вектора рЕТ 23-Ь

Таким образом, были получены конструкции, обеспечивающие синтез ферментов Thermoactinomyces sp., В. brevis, В. amyloliquefaciens в составе экспрессионного вектора рЕТ23-Ь, их обозначения представлены в таблице 1. Все полученные плазмиды были введены в штамм Е. coli BL-21, что позволило осуществить экспрессию чужеродных белков в клетках кишечной палочки.

Табл. 1. Сконструированные рекомбинантные вектора, определяющие биосинтез различных вариантов модифицированных металлопротеиназ Thermoactinomyces sp, В. brevis, В amyloliquefaciens.

№№ Название вектора Белок, экспрессия которого определяется данным вектором

1 рНТ-1 полноразмерный предшественник фермента 1 кегтоас1тотусе.ч ер. с дополнительным гистидиновым якорем на С-конце

2 рНТ-2 предшественник фермента '¡ЪегтоасИпотусея эр. с делегированной дополнительной С-концевой областью и дополнительным гистидиновым якорем на С-конце

3 рНТ-3 про-последовательность фермента Ткегтоаатотусев ер. с дополнительным гистидиновым якорем на Оконце

4 рТ-11 про-последовательность фермента ТИегтоасИпотусех эр. без гистидинового якоря

5 рНТ-4 полноразмерная зрелая часть фермента ТИегтоасппотусез зр. с дополнительным гистидиновым якорем на С-конце

6 рНТ-5 зрелая часть фермента ТкегтоасШотусеь вр.с удаленной дополнительной С-концевой областью и дополнительным гистидиновым якорем на С-конце

7 рНВ про-последовательность металлопротеиназы В Ьге\чя с дополнительным гистидиновым якорем на М-конце

8 рНА про-последовательность металлопротеиназы В. amyloliquefaciem с дополнительным гистидиновым якорем на М-конце

9 рАТ химерная конструкция с дополнительным гистидиновым якорем на С-конце

Биосинтез мутантных вариантов металлопротеиназ Thermoactinomyces sp. 27а, В. brevis, В. amyloliquefaciens в клетках Е. coli BL-21

Для анализа динамики накопления целевых белков в клетках штаммов-продуцентов, несущих рекомбинантные плазмиды рНТ-1, рНТ-2, рНТ-3, рТ-11, рНТ-4, pIIT-5, рНВ, рНА, рАТ, кулыуры клеток выращивали в L-бульоне в присутствии Ар до оптической плотности 0,4-0,6 O.E. при длине волны 600 нм. Затем добавляли ИПТГ до конечной концентрации 0,5 мМ, индуцируя процесс транскрипции клонированных генов, и продолжали культивировать клетки в течение 5 ч при высокой аэрации.

Необходимо отметить, что для клеток штамма Е coli BL-21, несущих плазмидный вектор рНВ, наблюдали подавление роста культуры после добавления индуктора. Эю, по-видимому, свидетельствует о токсичности про-последовательности металлопротеиназы

В. brevis для клеток Е. coli BL-21. Этот результат не позволил осуществигь высокоэффективную экспрессию данного белка в клетках кишечной палочки

На различных стадиях роста культур отбирали аликвоты клеточной суспензии для определения уровня накопления целевых белков С этой целью бактериальные клетки отделяли центрифугированием, и анализ их белкового состава проводили электрофорезом по методу Лэммли в 12,5%-ном полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия Необходимо отметить, что накопление чужеродных белков в клетках штаммов-продуцентов было достаточно близким для каждого из вариантов Появление целевого белка происходило в течение уже первого часа, достигало максимума к третьему, и не менялось до пятого часа ферментации На рисунке 4 приведены результаты накопления различных целевых белков в клетках сконструированных нами рекомбинантных

Рис. 4. Накопление модифицированных белков в клетках Е. colt BL-21 1. маркеры молекулярных весов;

2 внутриклеточные белки штамма до индукции ИПТГ,

3 накопление предшественника металлопротеиназы Thermoactmomyces sp , 4 накопление зрелой части металлопротеиназы Thermoactmomyces sp , 5 накопление про-части металлопротеиназы Thermoactmomyces sp , 6 накопление про-части металлопротеиназы Bacillus amylohquefaciens Стрелками указаны полосы, соответствующих белков

1 2 3 4 5 6

штаммов-продуцентов Как видно из рисунка, уровень накопления достаточно высок и составляет около 30%-40% от общего содержания внутриклеточных белков штамма £ coli BL-21

Таким образом, нами была осуществлена высокоэффективная экспрессия всех модифицированных фрагментов металлопротеиназ Thermoactmomyces sp и В. amylohquefaciens в клетках штамма К coli BL-21 Также было установлено их внутриклеточное распределение В качестве примера, на рисунке 5 приведены данные о внутриклеточной локализации химерного фермента

Рис. 5, Анализ распределения целевого белка между внутриклеточными фракциями штамма £ coli BL-21, несущею плазмиду рАТ 1 маркер молекулярных весов, 2 внутриклеточные белки штамма до индукции ИПТГ, 3 внутриклеточные белки после 4 ч инкубации клеток с ИПТГ, 4 цитоплазматическая фракция; 5. мембранная фракция, 6 экстракт мембранной фракции 8 М мочевиной

Показано, что предшественник фермента Thermoactinomyces sp., его полноразмерная зрелая часть, зрелая часть с делегированной дополнительной С-концевой последовательностью, а также химерный белок металлопротеиназы Thermoactinomyces sp., включающий чужеродную про-часть металлопротеиназы В. amyloliquefaciens, локализованы в мембранной фракции клеток Е. coli BL-21. Про-последовательности металлопротеиназ Thermoactinomyces sp. и В. amyloliquefaciens присутствуют в приблизительно равных количествах в цитоплазме и в мембранной фракции клеток Е. coli.

Очистка изолированных частей металлопротеиназ Thermoactinomyces sp. 27а и

В. amyloliquefaciens

Для экспериментов по изучению про-зависимого фолдинга на модели протеолитических ферментов, было необходимо получить очищенные препараты модифицированных фрагментов металлопротеиназ.

Наличие в составе каждох о изолированного фрагмента металлопротеиназ дополнительной полигистидиновой последовательности позволило нам использовать металл-хелат аффинную хроматографию как основную стадию очистки. В качестве сорбента была выбрана Ni-HTK агароза. Металл-хелат аффинную хроматографию проводили по единой схеме для всех изолированных участков металлопротеиназ Thermoactinomyces sp. и В. amyloliquefaciens.

Выращивание штаммов-продуцентов проводили в среде LB, содержащей Ар, при интенсивной аэрации при 37°С до оптической плотности 0,4-0,6 О.Е при длине волны 600 нм. Индукцию синтеза целевых белков осуществляли, добавляя в среду ИПТГ до конечной концентрации 0,5 мМ, и продолжали культивировать клетки при тех же условиях в течение 5 ч. Клеточную биомассу отделяли центрифугированием и полученный осадок ресуспендировали в 20 мМ трис-HCl буфере pH 7.2. Суспензию подвергали воздействию УЗ, а затем разделяли центрифугированием. Поскольку, предварительно, нами была определена внутриклеточная локализация индивидуальных фрагментов металлопротеиназ, в дальнейшей работе использовали мембранную фракцию клеток рекомбинантных продуцентов. Экстракцию белков проводили, ресуспендируя осадочную фракцию в буфере, содержащем 100мМNaH2P04, 10мМтрис-С1, и 8М мочевины, pH 8,0.

Белки, экстрагированные 8 М мочевиной, наносили на Ni-содержащий сорбент Десорбцию белкового препарата проводили, понижая значение pH элюирующего pací вора с 8,0 до 4,5. С использованием данного подхода была осуществлена очистка полноразмерного предшественника металлопротеиназы Thermoactinomyces sp.;

предшественника с делегированной дополнительной С-концевой последовательностью; полноразмерной зрелой части; зрелой части с делегированной дополнительной С-концевой последовательностью; про-последовательности металлопротеиназы Thermoactinomyces sp., про-последовательности металлопротеиназы В amyloliquefaciens, а также химерного белка. Во всех случаях были получены схожие результаты. Белки достаточно прочно связываются с сорбентом и элюируются при низких значениях рН. Фракции, по результатам электрофореза содержащие целевой белок в значительных количествах, объединяли и диализовали против 20 мМ трис-HCl буфера рН 7,2, содержащего 8 М мочевины.

Следующую стадию очистки проводили, используя высокоэффективную гель-проникающую хроматографию на колонке Superdex 75 HR, уравновешенной 20 мМ трис-HCl буфером рН 7,2, содержащим 8 М мочевины и 150 MMNaCl. Элюцию проводили тем же буфером.

Разработанная схема очистки позволила получить электорфоретически гомогенные препараты перечисленных выше модифицированных фрагментов металлопротеиназ Thermoactinomyces sp. и В amyloliquefaciens из экстрактов мембранных фракций клеток рекомбинантных штаммов-продуцентов. При этом выход целевых белков в среднем составлял около 20%, а степень очистки около 3 раз.

Фолдинг ме I аллопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а

Наличие набора, полученных на предыдущем этапе работы, фрагментов металлопротеиназ позволило нам перейти к изучению про-зависимого фолдинга на модели термолизин-подобной металлопротеиназы Thermoactinomyce sp. 27а.

Процесс сворачивания молекул инициировали, удаляя денатурирующий агент (8 М мочевину) при помощи 10-кратного разбавления 10 мМ трис-HCl буфером рН 7,2, содержащим 5 мМ СаСЬ и 0,5 мМ ZnSC>4. Формирование активного фермента детектировали, измеряя появляющуюся протеолитическую активность. Было показано, что изолированная зрелая часть белка металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. в условиях эксперимента не способна формировать функционально активный фермент. В то же время белковая конструкция, содержащая в своем составе про-последовательносгь и зрелую часть фермента - про-нредшественник металлопротеиназы Thermoactinomyces sp., сворачивается в функционально активную форму.

Интересные данные были получены в экспериментах по фолдингу зрелой части металлопротеиназы в присутствии не связанной с ней ковалентно собственной про-последовательности. Было продемонстрировано, что и в этом случае происходит

формирование функционально активной протеиназы. Таким образом, совокупность полученных данных доказывала, что фолдинг данного фермента протекает по про-зависимому механизму.

Однако данный подход, базирующийся на использовании для проведения фолдинга очищенных белков, обладает существенным недостатком. С его помощью удавалось получить лишь незначительные количества функционально активного фермента Thermoactinomyces sp., недостаточные для его дальнейшей характеристики. Методом электрофореза в 12,5%-ном полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия было показано, что причиной низкого выхода активного фермента является эффективный автолитический гидролиз нефолдированного белка возникающими молекулами активной металлопротеиназы. В связи с этим нами был использован другой подход, позволивший получить в ходе фолдинга препаративные количества металлопротеиназы. При этом фолдинг проводили, используя неочищенные препараты фермента и про-последовательностей, полученные при экстракции целевых белков из мембранных фракций соответствующих штаммов-продуцентов раствором 8М мочевины. Присутствующие в этих препаратах примеси белковой и пептидной природы выступали в качестве альтернативных субстратов и в значительной степени подавляли процесс автолиза.

Было показано, что изолированная зрелая часть металлопротеиназы в условиях данного эксперимента также не способна формировать функционально активный фермент. Динамика накопления функционально активной протеиназы при проведении фолдинга в различных условиях представлена на рисунках 6 А и 6 Б. Как видно из рисунков, более эффективно процесс фолдинга металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. проходил в присутствии собственной про-последовательности, которая была ковалентно связана со зрелой частью молекулы in eis (рис.6 А), чем в случае добавления про-последовательности in trans (рис.6 Б). Отметим, что в последнем случае молярное соотношение между зрелой частью фермента и его индивидуальной про-последовательностью составляло около 1:10. Максимальное накопление активного фермента в реакции in eis достигалось через 4 ч инкубации, а при протекании реакции in trans - через 72 ч Можно предположить, что в последнем случае лимитирующей стадией является формирование про-последовательностью и зрелой частью межмолекулярного комплекса. В случае, когда они ковалентно связаны (ситуация т as) этот процесс, очевидно, протекает существенно быстрее.

В экспериментах по фолдингу полноразмерного предшественника металлопротеиназы было показано, что и в этом случае наблюдается формирование

функционально активного фермента. При этом динамика его накопления соответствовала таковой для предшественника с удаленной дополнительной С-концевой последовательностью. Полученные данные указывают на то, что дополнительная С-концевая область фермента не оказывает существенного влияния на формирование пространственной структуры in vitro.

Рис. 6. Динамика накопления протеолитической активности при фолдинге предшественника металлопротеиназы 7 hermoactinomyces sp. в системе in eis (А) и в системе in trans (Б). По оси абсцисс: время инкубации, ч, по оси ординат, протеолитическая активность по гидролизу азоказеина, O.E. (450 нм).

Фолдинг металлпро геиназы Thermoactmomyces sp. в присутствии чужеродной иро-

последовательности

Используя разработанный подход, мы осуществили фолдинг зрелой части фермента Thermoactmomyces sp. в присутствии чужеродной изолированной про-последовательности металлопротеиназы В amyloliquefaciem. Молярное соотношение зрелой части и про-последовательности составляло -1:10. Появление активного фермента обнаруживалось лишь через 100 ч инкубации, его накопление составляло около 3% по сравнению с анало1ичными экспериментами, в которых в качестве фоддинг-ассистента использовали собственную про-последовательность металлопротеиназы Thermoactmomyces sp., и не увеличивалось в течение последующих 2 суток. Образование активного фермента свидетельствует о том, что в качестве фолдинг-ассистента при сворачивании термолизин-подобной металлопротеиназы может выступать чужеродная про-последовательность с достаточно низким уровнем гомологии. (Гомология между про-частями металлопротеиназ Thermoactmomyces sp. и В. amyloliquefaciens составляет 27%).

Формирование активной протеиназы не отмечалось при фолдинге химерного фермента, состоящего из зрелой части металлопро1еиназы Thermoactmomyces sp. без дополнительной С-концевой области, слитой с про-последовательностью металлопротеиназы В. amyloliquefaciens. Однако в этом случае был обнаружен следующий

факт. Образующийся в результате фоддинга химерный предшественник оказался устойчив к гидролизу субтилизином (молярное соотношение 200:1), что свидетельствует о формировании предшественником компактной пространственной структуры. Полученные результаты указывают на то, что в данном случае отсутствие функционально активного фермента может быть связано не с некорректным фолдингом, а с подавлением процессинга, например, в связи с неоптимальной структурой района стыковки зрелой части металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. и про-последовательности фермента В amyloliquefaciens. Это предположение кажется тем более обоснованным, поскольку нам удалось продемонстрировать формирование активной протеиназы при фолдинге зрелой части фермента Thermoactinomyces sp. в присутствии изолированной про-последовательности металлопротеиназы В. amyloliquefaciens.

Очистка вариантов металлопротеиназы Thermoactinomyces sp., полученных при проведении фолдинга in eis и in trans

Нами была проведена очистка функционально активной металлопротеиназы, полученной при фолдинге как in eis, так и in trans. Выделение активной металлопротеиназы и, в том числе, ее отделение от не свернувшегося фермента, осуществляли при помощи аффинной хроматографии. В качестве лиганда был использован негидролизуемый аналог субстрата - бацитрацин, иммобилизованный на сефарозе. Сорбент был уравновешен 50 мМ трис-HCl буфером pH 7,2, содержащим 1 мМ СаС1г, 1 M NaCl. Элюцию осуществляли ступенчатым градиентом изопропанола (10%, 20%, 25%) в том же буфере.

Дальнейшую очистку фермента проводили при помощи высокоэффективной гель-проникающей хроматографии на колонке Superdex 75 HR, уравновешенной ЮмМ трис-HCl буфером рН7,2, содержащим 1 мМ СаС12 и 150MMNaCl. Разработанная схема двухстадийной очистки активных молекул металлопротеиназ дала возможность получить электрофоретически гомогенные препараты данных ферментов. При этом выход целевых белков составил 13-15%, а степень очистки около 20-30 раз.

Характеристика металлопротеиназ Thermoactinomyces sp., реактивированных в системах in eis и in trans

При помощи автоматической деградации по методу Эдмана была установлена амино-концевая последовательность для металлопротеиназы Thermoactinomyces sp, фолдинг которой проводили в условиях in eis. Идентифицированная последовательность A-A-T-G-T отличается от амино-концевой последовательности для природного фермента

ПегтоасИпотусеч sp. - A-A-A-T-G-T. По-видимому, при созревании in vitro, происходит смещение точки N-концевого процессинга полипептида.

Проанализирована термостабильность фермента Thermoactinomyces sp., полученного при осуществлении фолдинга в системе in eis. При температуре 60°С протеиназа не теряла своей активности в течение 1 ч. При температурах 70°С-75°С потери составляли 30-40% от начальной активности фермента после инкубации в течение 1 ч, а при температуре 80°С фермент за 40 мин терял активность практически полностью. Эти данные, характеризующие термостабильность реактивированной металлопротеиназы Thermoactinomyces sp , соответствуют таковым для природного фермента. Таким образом, нами получен фермент, по уровню термостабильности не отличающийся от природной металлопротеиназы Thermoactinomyces sp Это свидетельствует о корректном протекании процесса фолдинга и формировании белковой молекулы с компактной пространственной структурой.

Нами была проанализирована субстратная специфичность очищенных металлопротеиназ Thermoactinomyces sp.. полученных в системах: in eis и in trans. Были использованы синтетические пептидные хромогенные субстраты металлопротеина! DNP-Ala-Ala-Leu-Arg, DNP-Ala-Ala-Phe-Arg и DNP-Ala-Ala-Val-Arg, отличающиеся аминокислотным остатком в положении РГ (подчеркнуто).

Табл. 2. Удельные активности металлопротеиназ Thermoactinomyces sp., фолдированных в системах in eis и in trans, по отношению к синтетическим субстратам. Аминокислотный остаток субстрата в положении PI' выделен жирным шрифтом.

Субстрат Удельная активность ммоль/мг мин

in eis in trans

DNP-Ala-Ala—Leu-Arg-NH2 3,3±0,14 3,3+0,12

DNP-Ala-Ald--Phe-Arg-NH2 3,2+0,15 1,4±0,1

DNP-Ala-Ala--Val-Arg-NH2 1,8±0,1 0,4±0,05

Необходимо отметить, что обе протеиназы проявляют меньшее предпочтение к расщеплению связи, формируемой остатком валина. Для металлопротеиназы, фолдированной в системе in eis, можно говорить о равном предпочтении по отношению к субстратм, содержащим в позиции РГ как остаток лейцина, так и остаток фенилаланина Однако, в случае металлопротеиназы, сворачивание которой осуществляли в системе in trans, отмечено менее эффективное расщепление субстрата, содержащего фенилаланин в РГ положении. Как видно из таблицы 3, значение удельной активности при расщеплении субстрата, содержащего остаток фенилаланина в позиции РГ, для металлопротеиназы, полученной при протекании фолдинга in eis, превышает в 2,3 раза

значение удельной активности по отношению к этому же субстрату для фермента, полученного in trans. Растепление субстрата с остатком валина в положении РГ осуществляется, как уже было отмечено, менее эффективно обоими ферментами, при этом металлопротеиназа, фондированная в системе in eis, обладает удельной активностью, значение которой в 4,5 раза превышает таковое для металлопроетианзы, фолдированной в системе in trans. Следовательно, рассматриваемые металлопротеиназы, имеющие практически идентичные аминокислотные последовательности, но фолдированные в двух различных системах, обладают отличными специфичностями по отношению к синтетическим пептидным субстратам. Таким образом, нами сконструированы и охарактеризованы изомеры термолизин-подобной металлопротеиназы, образующиеся по про-зависимому механизму, и показано, что они различаются по своей субстратной специфичности.

Полученные данные прямо указывают на возможность возникновения энзиматически различных вариантов ферментов без накопления мутаций в их функционально-существенных сайтах. Это явление представляется нам весьма интересным, поскольку позволяет сформулировать новый взгляд на процессы расширения ферментативного разнообразия в микробных сообществах. Действительно, генерация в ходе эволюции микробной экосистемы протеолитических ферментов несколько различных специфичностей, с последующей секрецией их в межклеточное пространство, позволило бы повысить эффективность деградации природных субстратов белковой и пептидной природы. При этом, очевидно, что такой процесс не может осуществляться за счет модификации субстрат-связывающих областей протеинач, поскольку мутации в этом районе, в подавляющем большинстве случаев, приведут к драматической инактивации ферментов. Природные мутации аминокислотных остатков металлопротеиназ, вовлеченных в распознавание субстрата, крайне редки и весьма специфичны по своему характеру. В то же время полученные данные свидетельствуют, что расширение спектра ферментов в микробных сообществах могло бы базироваться на использовании гипервариабельных фолдинг-ассистентов, активное накопление мутаций в которых приводило бы к формированию функционально различающихся информационных изомеров зрелых белков. В таком случае модель про-зависимого фолдинта протеолитических ферментов может представлять собой яркий пример функционирования подобного механизма Следует подчеркнуть, что накопление мутаций в про-районах бактериальных протеиназ различных групп действительно происходит значительно быстрее, чем в областях, соответствующих зрелым частям ферментов. Например, гомология зрелых металлопротеиназ Thermoactinomyces sp. и В amyloliquefaciens

составляет 52%, а их про-последовательностей всего 27%. В то же время, как было продемонстрировано нами выше, даже при столь низкой гомологии про-последовательность протеиназы В amyloliquefaciens способна направлять фолдинг фермента Thermoactinomyces sp. При этом модификация процесса фолдинга, даже в случае использовании природной про-части, может приводить к формированию энзиматически различных конформеров фермента. Таким образом, полученные нами результаш, в •

совокупности с литературными данными, позволяют предполагагь, что система про-зависимого фолдинга может являться молекулярным механизмом, функционирование которого направлено на увеличение функционального разнообразия ферментов без модификации их каталитических центров.

ВЫВОДЫ

1. Дополнительная С-концевая область металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. не оказывает существенного влияния на протекание процесса фолдинга белковой молекулы и ее отсутствие не препятствует секреции протеиназы в клетках Bacillus subtilis AJ73.

2. Металлопротеиназа Thermoactinomyces sp. формирует свою пространственную структуру по про-зависимому механизму, при этом не требуется наличия ковалентной связи между про-последовательностью и зрелой частью.

3 Гетерологичная про-последовательность металлопротеиназы Bacillus amyloliquefaciens

способна направлять фолдинг фермента Thermoactinomyces sp. 4. Варианты металлопротеиназы Thermoactinomyces sp, полученные на базе одной аминокислотной последовательности, отличаются по субстратной специфичности.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

1. Демидюк И.В., Заболотская М.В., Велишаева Н.С., Сабина Д. Р.. Костров C.B. Про-зависимый фолдинг микробных протеолитических ферментов// Молекулярная генетика, вирусология, микробиология. 2003. № 4. С. 11-15.

2. Демидюк И.В., Заболотская М.В., Сафина Д. Р.. Костров C.B. Молекулярные механизмы стабилизации протеолитических ферментов. Модель термолизин-подобных микробных мегаллопротеиназ// Биоорганическая химия. 2003. Т.29. №5. С. 461-469.

3. Заболотская М.В., Акимкина Т.В., Каплун М.А., Сафина Д.Р.. Носовская Е.А., Демидюк И.В., Костров C.B. Новый протеолитический фермент Thermoactinomyces sp. Структура и свойства/ Международная конф молодых ученых "От фундаментальной науки - к новым технологиям" Москва - Тверь, 2001. С.36.

4. Заболотская М.В., Акимкина Т.В., Сафина Д.Р.. Носовская Е.А., Шевелев А.Б., Демидюк И.В., Костров C.B. Новая металлопротеиназа Thermoactinomyces sp. Идентификация, структура и свойства/ V симпозиум "Химия протеолитических ферментов" Москва, 2002. С.46.

5. Заболотская М.В., Акимкина Т.В., СаФина ДР., Носовская Е.А., Новикова С.И., Демидюк И.В., Костров C.B. Новая металлопротеиназа Thermoactinomyces sp. Структура и свойства/ III съезд биохимического общества. Санкт-Петербург, 2002. С.491.

6. Сафина Д.Р.. Рафиева Л.М., Филиппова М.А, Демидюк И.В., КостровС.В. Конструирование мутантных вариантов металлопротеиназы Thermoactinomyces sp./ III Научная конференция молодых ученых, аспирантов, студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета "Материалы и технологии XXI века" Казань, 2003. С. 77

7. Сафина Д.Р.. Рафиева Л.М., Филиппова М.А, Демидюк И.В., КостровС.В. Изучение механизмов сворачивания белковых молекул на модели протеолитических ферменгов. / Научно-практическая конференция "Современное состояние российской биотехнологии" Пущино, 2003. С. 9-10.

8. Сафина Д.Р.. Рафиева Л.М., Филиппова М.А, Заболотская М.В., Демидюк И.В., Честухина Г.Г., Костров C.B. Про-зависимый фолдинг металлопротеинзы Thermoactinomyces sp. / Научная конференция "Постгепомная эра в биологии и проблемы биотехнологии" Казань, 2004. С 23.

9. Сафина Д.Р.. Гасанов Е.В., Рафиева Л.М., Остроумова Л.В., Ретунская Е.В., Демидюк И.В., Костров C.B. Конструирование протеолитических ферментов с

измененной субстратной специфичностью. / Всероссийский симпозиум "Биотехнология микробов" Москва, 2004. С.78.

10. Сафина Д.Р.. Гасанов Е.В., Рафиева JI.M., Демидюк И.В., Костров С.В. Конструирование протеолитических ферментов с модифицированной субстратной специфичностью в системе про-зависимого фолдинга. / XIII Международная конференция "Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение." Казань, 2005. С. 76-77.

Допущено к печати 25/04/2005

Принято к исполнению 26/04/2005 Заказ № 793

Исполнено 26/04/2005 Тираж- 100 экз .

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 \у\у\у.аиКя^ега1 ги

РНБ Русский фонд

2005-4 44816

"X

Й08

19 МАЙ 2005

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Сафина, Дина Рашидовна

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Про-зависимый фолдинг белков

1.1.1. Про-зависимы фолдинг протеолитических ферментов.

1.2. Термолизин-подобные металлопротеиназы

1.2.1. Структурно-функциональная организация термолизин-подобных металлопротеиназ бацилл

1.2.2. Организация активного центра молекулы термолизина

1.2.3. Организация субстрат-связывающего кармана

1.2.4. Организация сайтов связывания ионов кальция.

1.2.5. Про-последователыюсти термолизин-подобных металлопротеиназ

1.3. Термолизин-подобная металлопротеиназа

Thermoactinomyces sp. 27а

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЕДОВАНИЯ

2.1. Микробные штаммы и плазмиды

2.2. Культивирование микроорганизмов

2.3. Выделение плазмидной ДНК

2.4. Электрофоретический анализ нуклеиновых кислот

2.5. Ферментативный гидролиз.

2.6. Полимеразная цепная реакция.

2.7. Получение конструкций, обеспечивающих экспрессию модифицированных генов металлопротеиназ в клетках штамма Bacillus subtilis AJ73.

2.8. Обработка амплификационных фрагментов полинуклеотидкиназой.

2.9. Трансформация клеток Bacillus subtilis AJ73.

2.10. Трансформация клеток Escherichia coli штаммы XL-1 (Blue) и

BL-21 (DE3-A.).

2.11. Определение нуклеотидной последовательности ДНК.

2.12. Анализ динамики накопления протеолитических ферментов в культуральной жидкости штаммов-продуцентов В. subtilis AJ73.

2.13. Анализ динамики накопления целевых белков в клетках Е. coli BL-21, несущих экспрессионные плазмиды.

2.14. Экстракция нерастворимых целевых белков из мембранных фракций рекомбинантных штаммов-продуцентов, несущих экспрессионные плазмиды.

2.15. Очистка целевых белков из биомассы штаммов-продуцентов, несущих экспрессионные плазмиды.

2.16. Очистка металлопротеиназы на аффинном сорбенте.

2.17. Электрофоретический анализ белков.

2.18. Количественное определение белка.

2.19. Фолдинг в системе in cis.

2.20. Фолдинг в системе in trans.

2.21. Определение протеолитической активности ферментов.

2.22. Влияние температуры на стабильность фермента.

2.23. Статистическая обработка данных.

2.24. Представление молекул.

2.25. Компьютерный анализ результатов электрофорезов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Характеристика металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а.

3.2. Конструирование мутантных вариантов металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а, с делетированной дополнительной С-концевой последовательностью.

3.3. Характеристика модифицированных вариантов металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а.

3.4. Конструирование изолированных фрагментов металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а.

3.5. Биосинтез мутантных вариантов металлопротеиназ Thermoactinomyces sp. 27а, В. brevis, В. amyloliquefaciens в клетках Е. coli BL-21.

3.6. Анализ внутриклеточной локализации модифицированных вариантов металлопротеиназ в клетках Е. coll BL-21.

3.7. Очистка изолированных частей металлопротеиназ Thermoactinomyces sp. 27 и В. amyloliquefaciens.

3.8. Фолдинг металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а.

3.9. Фолдинг металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а в присутствии чужеродной про-последовательности.

3.10. Очистка вариантов металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а, полученных при проведении фолдинга в системах in cis и in trans

3.11. Характеристика металлопротеиназ Thermoactinomyces sp. 27а, реактивированных в системах in cis и in trans—.

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Формирование изомеров металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27a при про-зависимом фолдинге"

Актуальность работы.

Современная биотехнология включает в себя целый ряд разнообразных, быстро развивающихся социально ориентированных направлений исследований. Сюда входит создание новейших лекарственных препаратов, диагностикумов, разработка новых способов утилизации промышленных отходов и многое другое. При этом успехи современной биотехнологии во многом связаны с использованием разнообразных ферментов или ферментативных систем, позволяющих, с одной стороны, оптимизировать традиционные производства (на основе замены химических подходов энзиматическими или за счет повышения эффективности уже существующих ферментативных процессов), а с другой - развивать совершенно новые направления. Уровень современной белковой инженерии и ее успехи в области, направленной на оптимизацию биотехнологического производства, дают основания предпологать, что уже в достаточно скором времени конструирование оптимизированных ферментов de novo или на основе имеющихся полимерных молекул станет реальной лабораторной практикой и позволит существенно повысить эффективность биотехнологических процессов, основанных на использовании биокатализаторов. Тем ни менее, на настоящее время наши знания о молекулярных механизмах, определяющих структурно-функциональные взаимосвязи в белковых молекулах, ещё не достаточны для направленного создания ферментов с заданными свойствами. Широкое применение в современной биотехнологии получили протеолитические ферменты (в частности, продуцируемые микроорганизмами, обитающими в уникальных природных и искусственных экосистемах), которые являются перспективными для практического использования, а также весьма интересными с научной точки зрения. Так одним из интригующих и мало изученных вопросов является механизм образования ферментами корректной пространственной структуры, а так же способность на базе одной и той же аминокислотной последовательности формировать функционально-активные белковые молекулы с различными свойствами.

Данная работа посвящена изучению возможности образования функционально различающихся изомеров протеолитических ферментов в ходе про-зависимого фолдинга на модели термолизин-подобной металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. Работа поддержана грантами РФФИ № 00-04-48280, № 00-04-48281, № 03-04-48755.

Цель работы.

Целью данной работы являлось выяснение возможности конструирования различающихся по специфичности действия протеолитических ферментов на базе единой аминокислотной последовательности без внесения замен в функционально существенные области молекулы.

Научная новизна.

Впервые сконструированы разнообразные модифицированные варианты гена металлопротеиназы Thermoactmomyces sp., осуществлена их экспрессия в клетках Bacillus subtilis и Escherihia coli и охарактеризованы соответствующие белки. Показано, что данный фермент формирует свою пространственную структуру по про-зависимому механизму и продемонстрирована возможность получения стабильных, отличных по своей субстратной специфичности, протеиназ на базе одной аминокислотной последовательности.

Практическая значимость.

Полученные результаты открывают новый подход для конструирования протеолитических ферментов с модифицированными свойствами, в частности, измененной субстратной специфичностью. Поскольку протеиназы занимают лидирующее место среди ферментов, используемых в практических целях, то этот подход может быть использован при оптимизации целого ряда биотехнологических производств.

Положения, выносимые на защиту.

1. Конструирование и характеристика модифицированных вариантов металлопротеиназы Thermoactinomyces sp.

2. Доказательство протекания фолдинга металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. по про-зависимому механизму.

3. Изучение возможности использования гетерологичных про-последовательностей в качестве фолдинг-ассистентов.

4. Конструирование на базе одной полипептидной цепи протеолитических ферментов, отличающихся по своей субстратной специфичности.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Сафина, Дина Рашидовна

ВЫВОДЫ

1. Дополнительная С-концевая область металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. не оказывает существенного влияния на протекание процесса фолдинга белковой молекулы и ее отсутствие не препятствует секреции протеиназы в клетках Bacillus subtilis AJ73.

2. Металлопротеиназа Thermoactinomyces sp. формирует свою пространственную структуру по про-зависимому механизму, при этом не требуется наличия ковалентной связи между про-последовательностью и зрелой частью.

3. Гетерологичная про-последовательность металлопротеиназы Bacillus amyloliquefaciens способна направлять фолдинг фермента Thermoactinomyces sp.

4. Варианты металлопротеиназы Thermoactinomyces sp., полученные на базе одной аминокислотной последовательности, отличаются по субстратной специфичности.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает признательность своему научному руководителю, доктору химических наук, профессору Кострову Сергею Викторовичу и благодарит за поддержку, внимание, доброжелательное отношение и всестороннюю помощь, проявленные в ходе выполнения работы. Автор выражает благодарность кандидату химических наук Демидюку Илье Валерьевичу за помощь в работе и за участие в обсуждении полученных результатов, а также кандидату химических наук Акимкиной Татьяне Викторовне, кандидату биологических наук Носовской Елене Алексеевне, кандидату химических наук Заболотской Марии Васильевне, кандидату химических наук Романовой Дарье Викторовне, всем аспирантам и студентам лаборатории белковой инженерии ИМГ РАН за помощь, ценные советы в работе и дружеское отношение. Автор благодарит сотрудников ИМГ РАН за внимание и содействие, оказанное ими. Автор благодарит доктора биологических наук, профессора Честухину Галину Георгиевну (ГНИИ Генетика), а также сотрудников ИМБ РАН, ИБХ РАН, ценра "Биоинженерия" за помощь в выполнении экспериментальной части работы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Сафина, Дина Рашидовна, Москва

1. Simonen М., Pavla I. Protein secretion in Bacillus species. // 1993. Microboil. Rev. 57(1): 109-137.

2. Shinde U., Inouye M. Intramolecular chaperones: polypeptide extensions that modulate protein folding. // 2000. Semin. Cell Dev. Biol. 11(200): 35-44.

3. Ikemura H, Takagi H, Inouye M. Requirement of pro-sequence for the production of active subtilisin E in Escherichia coli. II 1987. J. Biol. Chem. 262:7859-7864.

4. Silen J.L., Agard D.A. The alpha-lytic protease pro-region does not require a physical linkage to activate the protease domain in vivo. // 1989. Nature. 341: 362-264.

5. Winther J.R., Sorensen P. Propeptide of carboxypeptidase Y provides a chaperone-like function as well as inhibition of the enzymatic activity. // 1991. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9330-9334.

6. Smith S.M., Gottesman M.M. Activity and deletion analysis of recombinant human cathepsin L expressed in Escherichia coli. // 1989. J. Biol. Chem. 264: 20487-20495.

7. Lee Y.C., Miyata Y., Terada I., Ohta Т., Matsuzawa H. Involvement of NH2-terminal pro-sequence in the production of active aqualysin I a thermophilic serine protease in Escherichia coli. // 1991. Agric. Biol. Chem. 55: 3027-3032.

8. Van den Hazel H.B., Kielland-Brandt M.C., Winther J.R. The propeptide is required for in vivo formation of stable active yeast proteinase A and can function even when not covalently linked to the mature region. // 1993. J. Biol. Chem. 268: 18002-18007.

9. Marie-Claire S., Ruffet E., Beaumont A., Roques B.P. The prosequence of thermolysin acts as a intramolekular shaperone when expressed in trans with the mature sequence in Escherichia coli. II 1999. J. Mol. Biol. 285(5): 1911-1915.

10. Zhu X., Ohta Y., Jordan F., Inouye M. Pro-sequence of subtilisin can guide the folding of denatured subtilisin in an intermolecular process. //1989. Nature. 339: 483-484.

11. Li Y., Hu Z., Jordan F., Inouye M. Functional analysis of the propeptide of subtilisin E as a intramolecular chaperone for protein folding. Refolding and inhibitiry abilities of propeptide mutants. // 1995. J. Biol. Chem. 270(42): 25127-25132.

12. RuanB., HoskinsJ., Bryan P. Rapid folding of calcium-free subtilisin by a stabilized pro-domen mutant. // 1999. Biochemistry. 38(26): 8562-8571.

13. ShindeU.P., Liu J.J., InouyeM. Protein memory through altered folding mediated by intramolecular chaperones. // 1997. Nature. 389(6650): 520-522.

14. Wang L., Ruan В., RuvinovS., Bryan P. Engineering the independent folding of the subtilisin BPN' pro-domen: correlation of pro-domen stability with the rate of subtilisin folding. // 1998. Biochemistry. 37(9): 3165-3171.

15. OhtaY., InouyeM. Pro-subtilisin E: purification and characterization of its autoprocessing to active subtilisin E in vitro. // 1990. Mol. Microbiol. 4(2): 295-304.

16. IkemuraH., InouyeM. In vitro processing of pro-subtilisin in Escherichia coli. II 1988.

17. Biol. Chem. 263: 12959-12963.

18. ДемидюкИ.В., Заболотская M.B., Велишаева H.C., Сафина Д.Р., Костров С.В.

19. Про-зависимый фолдинг микробных протеолитических ферментов. // 2003.

20. Молекулярная генетика, микробиология, вирусология. 4: 11-15.

21. Buevich A., Shinde U., Inouye M., Baum J. Backbone dynamics of the natively unfolded pro-peptide of subtilisin by heteronuclear NMR relaxation studies. // 2001. J. Biomol. NMR. 20(3): 233-49.

22. Strausberg S., Alexander P., WangL., Schwarz F., Bryan P. Catalysis of a protein folding reaction: thermodynamic and kinetic analysis of subtilisin BPN' interactions with its propeptide fragment. // 1993. Biochemistry. 32(32): 8112-8119.

23. Cunningham E.L., Jaswal S.S., Sohl J.L., Agard D.A. Kinetic stability as a mechanism for protease longevity. // 1999. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96: 1108-11014.

24. Cunningham E.L., Agard D.A. Interdependet folding of the N- and C-terminal domains defines the cooperative folding of a-lytic protease. // 2003. Biochemisrty. 42: 1321213219.

25. Eader J., Fersht A. Pro-sequence-assisted protein folding. I1 1995. Mol. Microbiol. 16(4): 609-614.

26. Matsubara M., Kurimoto E., Kojima S., Miura K., Sakai T. Achivement of renaturation of subtilisin BPN' by a novel procedure using organic salts and a digestible mutant of Streptomyces subtilisin inhibitor. // 1994. FEBSLett. 342(2): 193-196.

27. Ваганова Т.И., Медведева Н.П., Степанов B.M. Ренатурация бактериальных металлопротеиназ. // 1993. Биохимия. 58(6): 913-920.

28. Eader J., Rheinnecker M., Fersht A. Folding of subtilisin BPN': role of the pro-sequence.// 1993. J. Mol Biol. 233(2): 293-304.

29. Bryan P., Alexander P., Strausberg S., Schwarz F., Lan W., Gilliland G., Gallagher D.T. Energetics of folding subtilisin BPN'. // 1992. Biochemistry. 31: 4937-4945.

30. JainS.C., ShindeU., LiY., InouyeM., BermanH.M. The crystal structure of an autoprocessed Ser22ICys-subtilisin E-propeptide complex at 2.0 A resolution. // 1998. J. Mol. Biol. 284: 137-144.

31. Barret A.J., Rawlings N.D., Woessner J.F. // 1998. Handbook of Proteolytic Enzymes. Academic Press. Inc. New York. 1033-1064.

32. FujinagaM., Delbaere L.T., BrayerG.D., James M.N. Refined structure of alpha-lytic protease at 1.7 A resolution. Analysis of hydrogen bonding and solvent structure. // 1985. J. Mol. Biol 184: 479-502.

33. Lesk A.M., Fordham W.D. Conservation and variability in the structures of serine proteinases of the chymotrypsin family. // 1996. J. Mol. Biol. 258(3): 501-537.

34. Baker D., Sohl J.L., AgardD.A. A protein-folding reaction under kinetic control. // 1992. Nature. 356: 263-265.

35. AndersonD.E., PetersR.J., WilkB., AgardD.A. Alpha-lytic protease precursor: characterization of a sructured folding intermediate. // 1999. Biochemistry. 38: 47284735.

36. Серкина A.B., Шевелев А.Б., Честухина Г.Г. Структура и функции предшественников бактериальных протеиназ. // 2001. Биоорган, хим. 27(5): 3 23346.

37. Baardsnes J., SidhuS., MacLeod A., Elliott J., MordenD., Watson J., Borgford T. Streptomyces griseus protease В: secretion correlates with the length of propeptide. // 1998. J. Bacteriol. 180: 3241-3244.

38. Takagi H., Koga M., Katsurada S., Yabuta Y., Shinde U., Inouye M., Nakamori S. Functional analysis of the propeptides of subtilisin E and aqualysin I as intramolecular chaperones. //2001. FEBS Lett. 508(2): 210-214.

39. ShindeU., InouyeM. Folding pathway mediated by an intramolecular chaperone: characterization of the structural changes in pro-subtilisin E coincident with autoprocessing. // 1995. J. Mol. Biol. 252(l):25-30.

40. Li Y., Inouye M. Autoprocessing of prothiolsubtilisin E in wich active-site Serine 221 is altered to cysteine. // 1994. J. Biol. Chem. 269: 4169-4174.

41. Wandersman C. Secretion, processing and activation of bacterial extracellular proteases. // 1989. Mol Microbiol. 3(12): 1825-1831.

42. Agard D.A. To fold or not to fold. // 1993. Science. 260: 1903-1904.

43. Eader J., Fersht A. Pro-sequence-assisted protein folding. // 1995. Mol. Microbiol. 16(4): 609-614.

44. Stennicke H.R., Birktoft J.J., BreddamK. Characterization of the SI binding site of the glutamic acid-specific protease from Streptomyces griseus. II 1996. Prot. Sci. 5: 22662275.

45. Gallagher Т., Gilhland G., Wang L., Bryan P. The prosegment-subtilisin BPN1 complex: crystal structure of a specific 'foldase'. // 1995. Structure. 3(9): 907-914.

46. Jain S.C., ShindeU., Li Y., Inouye M. The crystal structure of an autoprocessed Ser221Cys-subtilisin E-propeptide complex at 2.0 A resolution. // 1998. J. Mol. Biol. 284(1): 137-144.

47. Li Y., Inouye M. Mechanism of autoprocessing of the propeptide of subtilisin E: intramolecular or intermolecular event? //1996. J. Mol. Biol. 262: 591-594.

48. Fu H., Inouye M., Shinde U. Folding pathway mediated by an intramolecular chaperone: the inhibitory and chaperone functions of the subtilisin propeptide are not obligatorily linced. // 2000. J. Biol. Chem. 275(22): 16871-16878.

49. Yabuta Y., Takagi H., Inouye M., Shinde U. Folding pathway mediated by an intramolecular chaperone: propeptide release modulates activation precision of pro-subtilisin. // 2001. J. Biol. Chem. 276(48): 44427-44434.

50. Takagi H., Takahashi M. A new approach for alteratoin of protease functions: pro-sequence engineering. // 2003. Appl. Microbiol. Biothecnol. 63: 1-9.

51. Li Y., Hu Z., Jordan F., Inouye M., Functional analysis of the propeptide of subtilisin E as an intramolecular chaperone for protein folding. // 1995. J. Biol. Chem. 270: 2512725132.

52. Kettner C.A., Bone R., Agard D.A., Bachovchin W.W. Kinetic properties of the binding of a-lytic protease to peptide boronic acids.// 1988. Biochemistry. 27: 7682-7688.

53. Bode W., Huber R. Natural protein proteinase inhibitors and their interaction with proteinases. // 1992. Eur. J. Biochem. 204: 433-451.

54. Sohl J.L., Shiau A.K., Rader S.D., Wilk B.J., Agard D.A. Inhibition of alpha-lytic protease by pro region C-terminal steric occlusion of the active site. // 1997. Biochemistry. 36: 3894-3902.

55. Shinde U.P., Liu J.J., Inouye M. Protein memory through altered folding mediated by intramolecular chaperones. // 1997. Nature. 389:520-522.

56. Shinde U.P., Fu X., Inouye M. // A pathway for conformational diversity in proteins mediated by intramolecular chaperones. 1999. J Biol Chem. 274:15615-15621.

57. Pruisner S.B., Scott M.R., DeArmond S.J., Cohen F.E. Prion protein biology. // 1998. Cell. 93:337-348.

58. Ellis R.J. Steric chaperones. // 1998. Trends Biochem. Sci. 23: 43-45.

59. Prusiner S.B. Prions. // 1998. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13363-13383.

60. Bross P., Corydon T.J., Andresen B.S., Jorgensen M.M., Bolund L., Gregersen N. Protein misfolding and degradation in genetic diseases. // 1999. Hum. Mutat. 14(3): 186198.

61. Schulz J., Dichgans J. // Molecular pathogenesis of movement disorders: are protein aggregates a common link in neuronal degeneration? // 1999. Curr. Opin. Neurol. 12(4): 433-439.

62. Rehemtulla A., Dorner A.J., Kaufman R.J. Regulation of PACE propeptide-processing activity: requirement for a post-endoplasmic reticulum compartment and autoproteolytic activation. // 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:8235-8239.

63. Van de Ven W.J., Roebroek A.J., Van Duijnhoven H.L. Structure and function of eukaryotic proprotein processing enzymes of the subtilisin family of serine proteases. // 1993. Crit. Rev. Oncog. 4:115-136.

64. Thomas G., Molly S.S., Anderson E.D., Thomas L. Multistep activation of Furin: a model for eukaryotic pro-protein convertases, in Iintramolecular Chaperones (Shinde U., Inouye M.) // 1995. RGLandes Company, Austin TX. 157-179.

65. Seidah N.G. The mammalian family of subtilisin/kexin-like pro-protein convertases, in Intramolecular Chaperones (Shinde U., Inouye M.) // 1995. RGLandes Company, Austin TX. 181-203.

66. Taubes G. Misfolding the way to disease. // 1996. Science. 271:1493-1495.

67. Thomas P.J., Qu B.H., Pedersen P.L. Defective protein folding as a basis of human disease. // 1995. Trends Biochem. Sci. 20:456-459.

68. Qu B.H., Strickland E., Thomas P.J. Cystic fibrosis: a disease of altered protein folding. // 1997. J. Bioenerg. Biomembr. 29:483-490.

69. Matsubara H., Feder J. Other bacterial, mold and yeast proteases. // 1971. The Enzymes. 3rd ed. (Boyer P.D., eds.) Academic Press. New York. 3: 721-792.

70. LattS.A., HolmquistB., ValleeB.L. Thermolysin: a zinc metalloenzyme. II 1969. Biochem. Biophys. Res. Comm. 37: 333-339.

71. Feder J., Garrett L.R., Wildi B.S. Studies on the role of calcium in thermolysin. // 1971. Biochemistry. 10: 4552-4556.

72. Veltman O.R., VriendG., van den Burg В., Hardy F., VenemaG., EijsinkV.G. Engineering thermolysin-like proteases whose stability is largely independent of calcium. // 1997. FEBSLett. 405(2): 241-244.

73. FederJ., KeayL., GarettL.R., CirulisN. MoseleyM.N., Wildi B.S. Bacillus cereus neutral protease. // 1971. Biochim. Biophys. Acta. 251(1): 74-78.

74. Feder J. Studies on the specificity of Bacillus subtilis neutral protease with synthetic substrates.// 1967. Biochemistry. 6(7): 2088-2093.

75. Feder J., Schuck J.M. Studies on the Bacillus subtilis neutral-protease-and Bacillus thermoproteolyticus thermolysine-catalyzed hydrolysis of dipeptide substrates. // 1970. Biochemistry. 9(14): 2784-2791.

76. Weaver L.H., KesterW.R., Matthews B.W. A crystallographic study of the complex of phosphoramidon w ith t hermolysin. A m odel f or the p resumed с atalytic t ransition s tate and for the binding of structures. // 1977. J. Mol. Biol. 114: 119-132.

77. Titani K., Hermodson M.A., Ericsson L.H., Walsh K.A., Neurath H. Amino-acid sequence of thermolysin. // 1972. Nature New Biol. 238: 35-37.

78. Holmes M.A., Matthews B.W. Structure of thermolysin refined at 1.6 A resolution 8TLN. // 1982. J.Mol.Biol. 160: 623-639.

79. Monzingo A.F., Matthews B.W. Structure of a mercaptan-thermolysin complex illustrates mode of inhibition of zinc proteases by substrate-analogue mercaptans. // 1982. Biochemistry. 21: 3390-3394.

80. Holmes M.A, Matthews B.W. Binding of hydroxamic acid inhibitors to crystalline thermolysin suggests a pentacoordinate 3 zinc intermediate in catalysis. // 1981. Biochemistry. 20: 6912-6920.

81. Bolognesi M.C., Matthews B.W. Binding of the biproduct analog 1-benzylsuccinic acid to thermolysin determined by x-ray crystallography. // 1979. J.Biol. Chem. 254: 634-639.

82. Kester W.R., Matthews B.W. Comparison of the structures of carboxypeptidase A and thermolysin. // 1977. J.Biol.Chem. 252: 7704-7710.

83. Kester W.R., Matthews B.W. Crystallographic study of the binding of dipeptide inhibitors to thermolysin. Implications for the mechanism of catalysis. // 1977. Biochemistry. 16: 2506-2516.

84. Dahlquist F.W., Long J.W., Bigbee W.L. Role of calcium in the thermal stability of thermolysin. // 1976. Biochemistry. 15: 1103-1111.

85. LevyP.L., Pangburn M.K., BursteinY., Ericsson L.H., NeurathH., Walsh K.A. Evidence of homologous relationship between thermolysin and neutral protease A of Bacillus subtilis. II 1975. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 72: 4341-4345.

86. Matthews B.W., Weaver L.H., К ester W.R. The с onformation of thermolysin. // 1974. J. Biol. Chem. 249: 8030-8044.

87. Matthews B.W., Weaver L.H. Binding of lanthanide ions to thermolysin. // 1974 Biochemistry. 13(8): 1719-1725.

88. Colman P.M., Jansonius J.N., Matthews B.W. The structure of thermolysin, an electron density map at 2.3 A resolution. // 1972. J. Mol.Biol. 70: 701-724.

89. Matthews B.W., Jansonius J.N., Colman P.M., Schoenborn B.P., DuporqueD. Three dimensional structure of thermolysin.// 1972. Nature New Biol. 238: 37-40.

90. Matthews B.W., Colman P.M., Jansonius J.N., TitaniK., Walsh K.A, NeurathH. Structure of thermolysin. // 1972. Nature New Biol. 238: 41-43.

91. Dayhoff M.O. Atlas of protein sequence and structure. // 1976. Publ National Biomedical Research Foundation, Silver Spring, MD. SBN 0-912466-05-7 V.5: 98

92. Stark W., Pauptit R.A., Wilson K.S., Jansonius J.N. The structure of neutral protease from Bacillus cereus at 0.2-nm. // 1992. Eur. J.Biochem. 207: 781-791.

93. Thayer M.M., Flaherty K.M., McKay D.B. Three-donensional structure of the elastase of Pseudomonas aeruginosa at 1.5 A resolution. // 1991. J. Biol. Chem. 266: 2864-2871.

94. Vriend G., Eijsmk V.G. Prediction and analysis of structure, stability and unfolding of thermolysin-like proteases. // 1993. J. Comput. Aided. Mol. Des. 7: 367-396.

95. Eijsink V.G., Vriend G., van den Burg В., Venema G., Stulp B.K. Contribution of the C-terminal amino acid to the stability of Bacillus subtilis neutral protease. // 1990. Protein Eng. 4: 99-104.

96. Tsuru D., Imajo S., Morikawa S., Yoshimoto Т., Ishiguro M. Zinc protease of Bacillus subtilis var. amylosacchariticus: construction of a three-dimensional model and comparison with thermolysin. // 1993. J. Biochem. (Tokyo) 113: 101-105.

97. O'Donohue M.J., Roques B.P., Beaumont A. Cloning and expression in Bacillus subtilis of the npr gene from Bacillus thermoproteolyticus Rokko coding for the thermostabile metalloprotease thermolysin. // 1994. Biochem. J. 300: 599-603.

98. De Kreij A, Venema G., van den Burg B. Substrate specificity in the highly heterogeneous M4 peptidase family is determined by a small subset of amino acids. // 2000. J. Biol. Chem. 275(40): 31115-31120.

99. Schlechter Т., BergerA. On the size of the active site in proteases. // 1967. Biochem. Biophys. Res. Commun. 27(2): 157-162.

100. De Kreij A., Van den Burg B, Veltman O.R., Vriend G., Venema G., Eijsink V.G. The effect of changing the hydrophobic SI' subsite of thermolysin-like proteases on substrate specificity. // 2001. Eur. J. Biochem. 268: 4985-4991.

101. Eakin A.E., McGrath M.E., McKerrow J.H., Fletterick R.J., Craik C.S. Production of crystallizable cruzain, the major cysteine protease from Trypanosoma cruzi. // 1993. J.Biol.Chem. 268: 6115-6118.

102. Veltman O.R., Vriend G., Berendsen H.J.C., van den Burg В., Venema G., Eijsink V.G. A single calcium binding site is crucial for the calcium-dependent thermal stability of thermolysin-like proteases. // 1998. Biochemistry 37: 5312-5319.

103. Coolbear Т., Whittaker J.M., Daniel R.M. The effect of metal on the activity and thermostability of the extracellular proteinase from a thermophilic Bacillus, strain EA.l. // 1992. Biochem. J. 287: 367-374.

104. Voordou G., Milo C., Roche R.S. Role of bound calcium ions in thermostable, proteolytic enzymes. Separation of intrinsic and calcium ion contributions to the kinetic thermal stability. // 1976. Biochemistry. 15: 3716-3724.

105. Corbett R.J.T., Ahmad F., Roche R.S. Domain unfolding and the stability of thermolysin in guanidine hydrochloride. // 1986. Biochem. Cell Biol. 64: 953-961.

106. WetmoreD., Wong S., Roche R. The role of the pro-sequence in the processing and secretion of the thermolysin-like neutral protease from Bacillus careus. II 1992. Mol. Microbiol. 6(12): 1593-1604.

107. Chang S.C., Chang P.C., Lee Y.-H.W. The roles of propeptide in maturation and secretion of Npr protease from Streptomyces. II 1994. J.Biol.Chem. 269: 3548-3554.

108. Takagi M., Imanaka T. Role of the pre-pro-region of neutral protease in secretion in Bacillus subtilis. И 1989. J. of fermentation and Bioengineering. 67(2): 71-76.

109. O'Donohue M.J., Beaumont A. The role of the prosequense of thermolysin in enzyme inhibition and folding in vitro. // 1996. J. Biol. Chem. 271(43): 26477-26481.

110. Zhang Z.Z., Nirasawa S., Nakajima Y., YoshidaM., Hayashi K. Function о f the N-terminal propeptide of an aminopeptidase from Vibrio proteolyticus. II 2000. Biochem. J. 350: 671-676.

111. Tang В., Nirasawa S., Kitaoka M., Hayashi K. The role of the N-terminal propeptide of the pro-aminopeptidase processing protease: refolding, processing, and enzyme inhibition. // 2002. Biochem. Biophys. Resear. Commun. 296: 78-84.

112. ShidhuS.S., BorgfordT.J. Selection of Streptomyces griseus protease В mutants with desired alterations in primary specificity using a library screening strategy. // 1996. J. Mol. Biol. 257(2): 233-245.

113. Silen J.L., Frank D., Fujishige A., Bone R., Agard D.A. Analysis of prepro-a-lytic protease expression in Escherichia coli reveals that the pro region is required for activity.// 1989. J. Bacteriol. 171(3): 1320-1325.

114. ShidhuS.S., KalmarG.B., Willis L.G., BorgfordT.J. Protease evolution in Streptomyces griseus. Discovery of a novel dimeric enzyme. // 1995. J. Biol. Chem. 270(13): 7594-7600.

115. TomaS., Campagnoli S., De Gregoriis E., GiannaR., MargaritL, Zamai M., Grandi G. Effect of Glu-143 and His-231 substitutions on the catalytic activity and secretion of Bacillus subtilis neutral protease. // 1989. Protein Eng. 2(5): 359-364.

116. Beaumont A., O'Donohue M.J., Paredes N., Rousselet N., Assicot M., Bohuon C., Fournie-Zaluski M.C., Roques B.P. The role of histidine 231 in thermolysin-likeenzymes. A site-directed mutagenesis study. // 1995. J. Biol. Chem. 270(28): 1680316808.

117. Чумаков B.H., ПиотухК.В., Володин A.A., Костров C.B. Характеристика гибридных генов, кодирующих функционально активные секреторные металлопротеиназы бацилл. // 1995. Молекулярная биология. 29: 756-760.

118. Чумаков В.Н., Азимова М.И., Зайцев Д.А., Габриэлян А.Э., Костров С.В. Анализ структурных основ термостабильности секреторных мталлопротеиназ бацилл на модели химерных ферментов. // 1995. Молекулярная биология. 29: 9921000.

119. Чумаков В.Н., Азимова М.И., Хромов И.С., Костров С.В. Изучение кинетических характеристик химерных металлопротеиназ бацилл. // 1996. Молекулярная биология. 30: 339-343.

120. SerkinaA., Gorozhankina Т., ShevelevA., Chestukhina G.G. Propeptide of metalloprotease of Brevibacillus brevis 7882 is a strong inhibitor of mature enzyme. // 1999. FEBSLett. 456: 215-219.

121. Kessler E., Safrin M., Gustin J.K., Ohman D.E. Elastase and the LasA protease of Pseudomonas aeruginosa are secreted with their propeptides. // 1998. J. Biol. Chem. 273(46): 30225-30231.

122. Mclver K.S., Kessler E., Olson J., Ohman D.E. The elastase propeptide functions as an intramolecular chaperone required for elastase activity and secretion in Pseudomonas aeruginosa. // 1995. Mol. Microbiol. 18(5): 877-889.

123. Braun P., Tommassen J., Filloux A. Role of the propeptide in folding and secretion of elastase of Pseudomonas aeruginosa.// 1996. Mol. Microbiol. 19(2): 297306.

124. Kessler E., Safrin M. Synthesis, processing, and transport of Pseudomonas aeruginosa elastase. // 1988. J. Bacterid. 170: 1215-1219.

125. Заболотская M.B., Носовская E.A., Каплун M.A., Цаплина И.А., Акимкина Т.В. Новая термостабильная протеиназа из Thermoactinomyces sp. 27а. Клонирование и экспрессия гена. // 2001. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1: 32-34.

126. Zabolotskaya М.V., Demidyuk I.V., Akimkina T.V., Kostrov S.V. A novel neutral protease from Thermoactinomyces species 27a: sequencing of the gene, purification, and characterization of the enzyme. // 2004. Prot. J. 23(7): 483-492.

127. David V.A., Deutch A.H., Sloma A., Pawlyk D., Ally A., Durham D.R. Cloning, sequencing and expression of the gene encoding the extracellular neutral protease, vibriolysin, of Vibrio proteolytics. // 1992. Gene. 112(1): 107-112.

128. HaseC.C., Finkelstein R.A., Cloning and nucleotide sequence of the Vibrio cholerae hemagglutinin/protease (HA/protease) gene and construction of an HA/protease-negative strain. //1991. J. Bacteriol. 173(11): 3311-3317.

129. NorqvistA., NorrmanB., Wolf-Watz H. Identification and characterization of a zinc metalloprotease associated with invasion by the fish pathogen Vibrio angullarum. II 1990. Infect. Immun. 58(11): 3731-3736.

130. Miyoshi S., Wakae H., Tomochika K., S hinoda S. Functional domains о fa zinc metalloproteinase from Vibrio vulnificus. // 1997. J. Bacteriol. 179(23): 7606-7609.

131. Tang В., Nirasawa S., KitaokaM., Hayashi K. In vitro stepwise autoprocessing of the proform of pro-aminopeptidase processing protease from Aeromonas caviae T-64. II 2002. Biochim. Biophys. Acta. 1596: 16-27.

132. Сорокин A.B., ХазакВ.Э. Экспрессионная единица в области инициации репликации плазмиды pSM19035 стрептококков. // 1990. Молекулярная биология. 24(4): 993-999.

133. Mierendorf R., Yeager К., Novy R. The pET system: your choice for expression. // 1994.News Letter of Novagen. 1(1): 1-3.

134. MBI Fermentas. Catalog and product application guide. // 1996-1997.

135. Avakov A.S., Bolotin А.Р., Sorokin A.V. Strukture of the Bacillus brevis metalloprotease gene. // 1990. Mol. Biol. (Most). 24: 1363-1372.

136. Anagnostopoulos C., SpizizienJ. Requirements for transformation in Bacillus subtilis. // 1961.У. Bacteriol. 81: 741-746.

137. Маниатис E., Фрич Э. Методы генной инженерии. Молекулярное клонирование. // 1984. Москва. Мир.

138. DagertM., Ehrlich S.D. Prolonged incubation in calcium chloride improves the competence of Escherichia coli cells. // 1979. Gene. 6(1): 23-28.

139. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head bacteriophage T4. // 1970. Nature. 227(5259): 680-685.

140. BredfordM.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding. // 1976. Anal. Biochem. 72(1-2): 248-254.

141. Гаспаров B.C., Дягтярь В.Г. Определение белка по связыванию с красителем кумасси бриллиантовым голубым G-250. // 1994. Биохимия. 59(6): 763-777.

142. Charney J., Tomarelli R.M. Determination of the proteolytic activity of duodenal juice. //1947. J. Biochem. 177: 501-505.

143. Люблинская Л.А., Ваганова Т.И., ПасхинаТ.С., Степанов В.М. 2,4-динитрофенил-производные пептидов — субстраты нового типа для определения активности протеолитических ферментов. Определение активности карбоксипептидаз. // 1973. Биохимия. 38(4): 790-795.

144. Юсупова М.П, КотловаЕ.К., Тимохина Е.А., Степанов В.М. Ферментативный синтез пептидов аргинина хромофорных субстратов металлопротеиназ и карбоксипептидаз. // 1995. Биооргапическая химия. 21(1): 3338.

145. Pholner J., Halter R., Beyreuther К., Meyer T.F. Gene structure and extracellular secretion of Neisseria gonorrhoeae IgA protease. // 1987. Nature. 325(6103): 458-462.

146. YanagidaN., Uozumi Т., BeppuT. Specific excretion of Serratia marcescens protease through the outer membrane of Escherichia coli. II 1986. J. Bacteriol. 166(3): 937-944.

147. Gray L., Mackman N., Nicaud J.M., Holland I.B. The carboxy-terminal region of haemolysin 2001 is required for secretion of the toxin from Eshcerichia coli. // 1986. Mol. Gen. Genet. 205(1): 127-133.

148. Лопатин C.A., Варламов В.П. Новые тенденции в металлохелат аффинной хроматографии беков. // 1995. Биохимия. 31(3): 259-266.