Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и характеристика ряда микробных протеиназ

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Получение и характеристика ряда микробных протеиназ"

од

На правах рукописи

ДЕМИДЮК Илья Валерьевич

ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА РЯДА МИКРОБНЫХ ПРОТЕИНАЗ

(03.00.23 - биотехнология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА-1996

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова и в лаборатории белковой инженерии Института молекулярной генетики Российской академии наук.

Научные руководители:

доктор химических наук профессор E.H. Звонкова кандидат биологических Наук . C.B. Костров

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук И.А. Хмель

кандидат химических наук C.B. Швец

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Зашита диссертации СОСТОИТСЯ 19%>г. в 15 часов на

заседаний диссертационного совета Д 063.41.0' по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук в Московской государственной академий тонкой химической технологии им. MB, Ломоносова по адресу: И 7571, Москва, проспект Вернадского, дом 86.

С диссертацией можно ознакомиться в

библиотек« M ИТХТ йМ.М.В. Ломоносова

По адресу: НМЛ, Москва, улица Малая Пироговская, дом 1.

Автореферат ракхяаи "îû ц к&лЩи*. 19%>г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук iï А А.И. Лютик

Ц /И^гг^^

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Протеиназы - давно известный и хорошо изученный класс ферментов-Несмотря на это поиск, выделение и характеристика новых белков этой группы актуален и сегодня. Это связано с перспективами использования протеолитических ферментов как катализаторов в промышленных ¡биотехнологических процессах и в качестве удобных инструментов научного исследования.

Наибольший интерес вызывают, с одной стороны, чысокостабильные ферменты. Так для применения в качестве компонента моющего средства протеиназа должна обладать, как правило, термостабильностью и быть устойчивой к действию детергентов и окислителей. С другой стороны, значительный интерес вызывают ферменты о уникальной субстратной специфичностью, например, гидролизующие связи а-карбоксильной группы дикарбоновых аминокислот. Такие протеиназы могут быть использованы при установлении первичной структуры белков или для конденсации пептидных фрагментов.

Наиболее эффективный и широко используемый подход к получению новых ферментов заключается в поиске их природных продуцентов, очистке и Характеристике интересующих исследователя белков и получении штаммов с высокой экспрессией ферментов. Особенно перспективны в качестве прбдуцентов микроорганизмы. Это связано с их природным многообразием, включая микроорганизмы, живущие в экстремальных условиях. Кроме того, микроорганизмы удобны как объекты генноинженерных манипуляций.

Данная работа - часть исследований, проводимых на кафедре биотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова и в лаборатории белковой инженерии Института молекулярной генетики Российской академии наук в рамках государственной научно-технической программы "Наукоемкие химические технологии", по поиску и характеристике ферментов, перспективных для практического использования.

Цель работы

В задачи работы входило выявление продуцентов стабильных протеина] путем крупномасштабного направленного скрининга микроорганизмов, а также отработка схем получения ряда препаратов протеолитических ферментов для прикладных и исследовательских целей, и характеристика соответствующих протеиназ.

Научная новизна

В результате исследования отобраны 15 новых штаммов-продуцентов терме стабильных протеолитических ферментов. Разработаны подходы к очистке и получены препарат бациллярной металлопротсиказы и препарат протеолитических ферментов из культуральной жидкости термоактшшмицетв. Разработан эффективный вариант очистки геикоинженерной металлопротеиназы из Bacillus amytoliquefaciens.

Выделена, очищена до гомогенного состояния и охарактеризована новая внеклеточная протеиназа из Thermoactinomyces species, относящаяся к группе Glu,Asp-специфичных ферментов.

Практическая значимость

Отобранные в работе штаммы, секретирующие протеолитические ферменты, могут быть использованы в качестве перспективных продуцентов термостабильных протеиназ.

В работе предложены подходы к получению и характеристике препаратов протеолитических ферментов, которые могут послужить основой для схем получения других протеиназ, в том числе и в промышленном масштабе.

Препарат бациллярной металлопротеиназы и препарат протеолитических ферментов из культуральной жидкости термоактиномицета переданы для испытаний в качестве перспективных компонентов моющих средств.

Новая GIu,Asp-специфичная протеиназа из Tkermoactinomyces species может быть использована как для гидролиза белков при определении аминокислотной последовательности, так и в синтезе для создания связей с участием а-карбоксильной группы глутаминовой кислоты.

• Положения, выносимые на защиту

1. Идентификация штаммов, продуцирующих термостабильные протеолитические ферменты, путем крупномасштабного скрининга коллекции термофильных микроорганизмов.

2. Разработка способа получения препарата термостабильной бациллярной металлопротеиназы.

3. Разработка способа получения препарата термостабильных протеолитических ферментов из культуральной жидкости термоактиномицета.

4. Разработка эффективного варианта очистки генноинженерной мсталлоироташазы Bacillus amyloliquefaciens.

5. Выделение, очистка и характеристика новой ссриновой протеиназы из Thermoactinomyces species, относящейся к группе Glu,Asp-специфичных ферментов.

Структура работы

Работа построена по традиционному плану и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы, список литературы. Рукопись содержит ^страниц, L9 рисунков и ¿^таблиц. Список литературы включает^ источника.

Апробация работы

Материалы .работы были доложены на конференции "Biotechnology and its global impact" (ФРГ, 1996) и на научной сессии, посвященной 100-летию со дня рождения профессора Н.А. Преображенского (Москва, 1996).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Поиск штаммов-продуцентов термостабильных протеиназ

Первая часть работы посвящена получению протеолитических ферментов, устойчивых к повышенным температурам, детергентам и окислителям, что было обусловлено предполагаемым применением их в качестве компонентов моющих средств. Одним из наиболее эффективных, на сегодняшний день, подходов к получению ферментов с заданными свойствами является поиск природных продуцентов таких белков.

С этой целью нами был проведен скрининг более 200 штаммов микроорганизмов из коллекций Института молекулярной генетики РАН и Института микробиологии РАН, принадлежащих к родам Bacillus, ThermobaciUus, Tliermus, Actinomyces, Thermoactimomyces и имеющих оптимальную температуру роста 50-70°. Использованные в скрининге штаммы ранее как продуценты протеиназ не тестировались. Для выявления продуцентов стабильных протеолитических ферментов была использована следующая схема отбора. На первом этапе отбирались все штаммы способные при выращивании на молочном агаре формировать зоны гидролиза казеина вокруг колоний. Затем отобранные штаммы выращивали в жидкой среде и анализировали термостабильность накапливающихся в культуральной среде протеолитических ферментов. Для этого протеолитичсская активность измерялась после прсинкубации при температурах 40-90° в течение 10-120 мин. В результате были отобраны 15 штаммов, являющихся продуцентами термостабильных протеолитических ферментов.

Протеиназы, продуцируемые штаммами Bacillus 1, 4, 5, 6 и Thermoactinomyces 1, 2, наиболее устойчивые к воздействию повышенных температур, были охарактеризованы более подробно (табл. 1). Протеиназы из Bacillus штаммы 1, 5, 6 ингибйровались этилендиаминтетрауксусной кислотой, но не диизопропилфторфосфатом, что позволяет отнести их по типу ингибирования к металлопротеиназам. Протеиназы же из Bacillus штамм 4 и Thermoactinomyces штаммы 1, 2, наоборот, ингибировались диизопропилфторфосфатом, но не этилендиаминтетрауксусной кислотой, что позволяет отнести их по типу ингибирования к сериновым протеиназам.

Свойства протенназ, отобранных при скрининге

Таблица I

Фермент2 Температура, при которой время полуинактивации составляет 30 мин, °С Температурный оптимум активности, °С рН-оптимум активности, ед Активность в присутствии SDS3, % Сохранение активности4 0,1 % SDS 4 ч, % Активность в присутствии 1%Н202,% Сохранение активности4 1% н2о2 4 ч, %

0,01 % 0,10%

Нейтральная протеиназа Bacillus штамм 5 85 85 7,50 100 42 96 48 100

Нейтральная протеиназа Bacillus штамм 1 87 70 7,50 100 58 95 263 100

Нейтральная протеиназа Bacillus штамм 6 80 80 7,50 85 55 90 90 100

Щелочная протеиназа Bacillus штамм 4 82 70 9,00 100 75 93 149 100

Щелочная протеиназа Thennoactinomyces штамм 1 87 85 >10 75 45 96 100 100

Щелочная протеиназа Thermoactinomyces штамм 2 85 80 >10 100 . 37 87 250 . 100

'Относительная ошибка величии приведенных s таблице не привышает 5% с вероятностью 0,95 2Иэмерения проводились на культуральной жидхостн штаммов JSDS - додсцплсульфат натрия

'Определение активности проводили при концентрации SD5 0,001% и Н;02 0,01%

Отобранные штаммы продуцировали ферменты, имеющие время полуинактивации 30 мин при температурах 80-87° и температурные оптимумы протеолитичекой активности при 70-85°. Изучение рН-оптимум'а протеолитической активности позволило охарактеризовать протеиназы из Bacillus штаммы 1, 5, 6 как нейтральные (pH-оптимум активности 7,5), а ферменты из Bacillus штамм 4 и Thermoactinomyces штаммы 1, 2 как щелочные протеиназы (pH-оптимум активности 9-10).

В связи с предполагаемым использованием исследуемых ферментов в качестве компонентов моющих средств была изучена их активность и стабильность в присутствии додецилсульфата натрия и перекиси водорода (табл. 1).

Следует отметить, что для получения характеристик ферментов на этом этапе использовались не гомогенные препараты, а непосредственно культуральная жидкость штаммов-продуцентов. Следовательно, данные приведенные в табл. 1, могут относиться не к индивидуальным ферментам, а к сумме секретируемых белков, что в ряде случаев было показано позже.

Следующим шагом работы явилась разработка схем получения препаратов двух отобранных ферментов (металлопротеиназы из Bacillus штамм 6 и щелочной протеиназы Thermoactinomyces штамм 1) для прикладных целей. С точки зрения практического использования ферментных препаратов во многих случаях, например, для мягчения мяса, обработки шкур или при применении в стиральных порошках, не важно, является ли используемая протеиназа гомогенной или нет, важно - удовлетворяет ли она необходимым техническим условиям. Поэтому при выполнении этой части работы перед нами стояла задача получения препаратов с известным содержанием активного белка, а не выделение гомогенного фермента. С чем и был связан выбор схем очистки, включающих минимальное количество операций.

Получение препарата металлопротеиназы из Bacillus штамм 6

Для получения препарата металлопротеиназы из Bacillus штамм 6 нами была разработана схема очистки, включающая осаждение сульфатом аммония, фильтрацию через анионит и гель-хроматографию. Ход очистки металлопротеиназы Bacillus штамм 6 представлен в табл. 2. С использованием предложенной схемы удалось достичь выхода по активности 58,7% и очистки в 102,1 раза. Полученный препарат металлопротеиназы, как было показано при анализе высокоэффективной гель-хроматографией, содержал один протеолитичсски активный белок с молекулярной массой около 35 кДа , (время удерживания 17 мин; колонка Bio-Sil TSK 250; элюент - 0,05М Na-фосфатный буфер, содержащий 0,15М NaCi и 0,0Ш NaNj, pH 6,8; объемная скорость - 0,5 мл/мин). Содержание протеиназы составляет около 50% суммарного белка. Результаты хроматографического анализа хорошо подтверждаются данными электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.

Таблица 2

Очистка металлопротеиназы из Bacillus штамм 6

Общий Активность Выход по Степень

Стадии очистки белок, мг Общая, ед Удельная, ед/мг активности, % очистки

Культуральная жидкость 2474,7 566,7 0,23 100,0 1,0

Осаждение (КН^БО* и здализ 2141,8 539,5 0,25 95,2 1.1

Фильтрация через сервацел 72,7 406,3 5,59 71,7 24,3

Ультрафильтрация 60,5 338,3 5,59 59,7 24,3

Хроматография на ссфадексе С-75 ¡4,2 332,7 23,48 58,7 102,1

il

Наиболее существенную очистку дает фильтрация через сервацел DE-32.

Применение этой стадии позволяет существенно упростить процедуру

очистки металлопротеиназы и обрабатывать большие объемы сырьЯ)

используя более простое оборудование. Целевой фермент не задерживается

А

на сорбенте и выходит с нулевым объемом колонки, при этом сорбируется до 95% балластных белков и пигмент, содержащийся в культуральной жидкости. Интересно, что при применении вместо колоночного варианта сорбции в объеме удается достичь выхода по активности до 95% (колоночный вариант 75%), но при этом степень очистки падает до 10 раз (степень очистки э колоночном варианте 25 раз).

Рассматриваемая »схема достаточно эффективна и, по-зидимому, при необходимости может быть доработана соответствующим образом для получения гомогенного фермента.

Полученный препарат металлопротеиназы обладал оптимумом протеолитической активности при рН 7,5 и температуре 80°, имел время полуинактивации 30 мин при температуре 80°. Фермент сохранял 90% активности после инкубации в течение 4 ч в 0,1% додецилсульфате натрия и 100% после инкубации в течение 4 ч в 1% Н2О2. Металлопротеиназа проявляла 85% и 55% активности в присутствии 0,01% и 0,1% додецилсульфата натрия, соответственно, и 90% активности в присутствии 1% Н202.

Препарат передан для испытаний в качестве перспективного компонента моющих средств.

Получение препарата протеолитических ферментов из Thermoactinomycee штамм 1

При получении препарата протеолитических ферментов культуральной жидкости термоактиномицета основной проблемой было присутствие большого количества пигмента, затруднявшего проведение хроматографического анализа. Ход получения препарата протеолитических ферментов из культуральной жидкости Thermoactinomyces штамм I представлен в табл. 3.

Схема очистки включает осаждение сульфатом аммония, гель-хроматографию на сефадсксе G-75 и ультра фильтрацию. Предлагаемая процедура позволяет решить главную проблему - эффективно отделить пигмент, но практически не дает очистки по белку. В полученном препарате при анализе высокоэффективной гель-хроматографией (колонка Bio-Sil TSK 250; элюент - 0,05М Na-фосфэтный буфер, содержащий 0,15М NaCI и 0,01М NaNj, рН 6,8; объемная скорость • 0,5 мл/мин) было обнаружено несколько белкоз, проявляющих протеолитическую активность. Суммарное содержание протеолитически активных белков в препарате составило не менее 50%.

Препарат обладал оптимумом протеолитической активности при рН

Таблица 3

Получение ферментного препарата из Thermoactinomyces штамм 1

Общий Активность Выход по Степень

Стадии очистки белок, мг Общая, ед ' Удельная, • ед/мг активности, % очистки

Культуральная жидкость 65,8 2424,4 36,8 100,0 1,0

Осаждение (NH^SO« 55,8 2259,5 ' 40,5 93,2 и

Хроматография на гефадексё G-75 53,8 2179,5 40,5 89,9

Ультрафильтрация 48,7 2150,4 44,2 88,7 ',2

выше 10. Температурный оптимум протеолитической активности препарата -80°, время полуинактивации 30 мин при температуре 85°. Препарат сохранял 87% активности после инкубации в течение 4 ч в 0,1% додецилсульфате натрия и 100% после'инкубации в течение 4 ч в 1% Н2О2. Препарат проявлял 100% и 37% активности в присутствии 0,01% и 0,1% додецилсульфата натрия соответственно. В присутствии 1% Н202 наблюдалось увеличение активности препарата в 2,5 раза.

Препарат передан для испытаний в качестве перспективного компонента моющих средств.

Вариант очистки аенноинженерной металлопротвиназы Bacillus amyloliquefaciens

Естественным развитием работы по идентификации микробных штаммов, секретирующих протецлитические ферменты, является конструирование генноинженерных продуцентов. Это связано с биосинтезом ферментов в клетках чужеродного микроорганизма (часто Bacillus subtilis) и, соответственно, приводит к изменению спектра примесных белков по сравнению с природным штаммом. Данный факт определяет необходимость изменения схемы очистки фермента при переходе от природного к генноинженерному продуценту. В связи с этим, мы решили отработать подходы к очистке рекомбинантных протеолитических ферментов на модели металлопротеиназы Bacillus amyloliquefaciens, продуцируемой клетками Bacillus subtilis.

■ В качестве исходного препарата для выделения и очистки фермента служила культуральная жидкость штамма Bacillus subtilis AJ73, несущего ген

металлопротеиназы Bacillus amyloliquefaciens в составе плазмидного вектора plNl. Штамм любезно предоставлен сотрудником ГосНИИГенетика Ю.В. Йомантасом.

Металлопротеиназы бацилл (К.Ф. 3.4.24.4) - группа близкородственных ферментов, выделению и очистке которых посвящен целый ряд работ. В этих работах, как правило, авторы решают задачу получения roí з ген но го препарата с целью изучения свойств фермента. Это обуславливает, с одной стороны, многостадийность методов очистки и, с другой стороны, применение таких высокоэффективных приемов как ионообменная и аффинная хроматография.

Для выделения и очистки нейтральных протеиназ бацилл наиболее часто используются комбинации таких методов как высаливание, осажден^ органическими растворителями (ацетон, этанол), диализ, ультрафильтрация, гель-фильтрация (сефадексы G-25 и G-75, акрилекс П-10, TSK-гели), катионо-и анионообменная хроматография (КМ-сефароза, . КМ-сефадекс, ДЭАЭ-целлюлоза, ДЭАЭ-сефацел), аффинная хроматография (бацитрацин-силохром, бацитращщгссфароза, сефароза-(1МН-СН2-СН2)3-С!у-0-Р11е). Процедура очистки обычно включает ионообменную или аффинную хроматографию как основной метод. Оба метода, особенно последний, исключительно эффективны, но требуют либо достаточно сложных операций при подготовке и регенерации сорбента, а также в процессе хроматографии (градиентное элюирование), либо коммерчески недоступных сорбентов. Однако для биотехнологических целей, зачастую, гомогенные ферменты не являются необходимыми. Кроме того, существует принципиальная возможность оптимизации разделения белков относительно простыми методами, такими как гель-хроматография. Благодаря этому, процедура очистки может быть значительно упрощена, особенно в случае

генноинженерных продуцентов, уровень продукции которыми протеиназ обычно выше по сравнению с природными штаммами. В соответствии с этими соображениями, мы разработали для получения препарата металлопротеиназы Bacillus amyloliquefaciens способ очистхи, включающий две стадии - высаливание и гель-хроматографию на сефадексе G-75, в отличие-от ранее описанного, в котором используется ультрафильтрация, осаждение ацетоном, гель-фильтрация на сефадексе G-25 и ионообменная хроматография на КМ-сефарозе CL-4B или аффинная хроматография на бацитрацин-сефарозе [Йомантас Ю.В. и др., 1988].

В табл. 4 представлен ход очистки металлопротеиназы Bacillus amyloliquefaciens, продуцируемой штаммом Bacillus subtiüs AJ73. Первая стадия (высаливание) позволяет, наряду с первичной очисткой, сконцентрировать фермент для последующей хроматографии. При гель-хроматографни на сефадексе G-75 отделяются пигменты и основная масса примесных белков (рис. 1). Причем, применение в качестве элюента буферного раствора с высокой ионной силой (0,025М трис-HCl, IM NaCl, 10-3М CaCi2, pH 7,2) позволяет значительно повысить выход активного белка (в 1,5 раза) и степень очистки (в 1,5 раза) на этой стадии по сравнению с-использованием другого буферного раствора (0.025М трис-HCl, 10-3М СаС12, pH 7,2).

Полученный препарат при электрофорезе в 12,5%-ном полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия дает основную полосу, соответствующую целевому ферменту, с молекулярной массой 38-39 кДа, что соответствует литературным данным о молекулярной массе металлопротеиназы Bacillus amyloliquefaciens, и минорные полосы, соответствующие белкам с молехулярной массой 63 и 25 кДа.

Таблица 4

Очистка металлопротеиназы Bacillus amytoliquefaciens

Общий Активность Выход по Степень

Стадии очистки белок, мкг общая, ед удельная, ед/мкг активности, % очистки

Культуральная жидкость 671,7 0,806 0,0012 100,0 1,0

Осаждение (КН4)2304 81,2 0,726 0,0090 90,0 7,0

Хроматография на сефадексе 0-75, элюироваиие буфером с низкой ионной силой 1,8 0,328 0,0870 40,5 72,5

Хроматография на сефадексе 0-75, элюирование буфером с высокой ионной силой 2,1 0,524 0,1300 64,8 108,3

А' Б

Рис. 1. Профиль элюирования при хроматографии на сефадексе G-75 металлопротеиназы из Bacillus amyloliquefaciens:

А - элюент 0.025М трис-HCI, 10-ЗМ CaCI2, pH 7,2; 5 - элюент 0.025М трис-HCI, 1М NaCI, 10"3М CaCI2, pH 7,2

Приемлемое для биотехнологачесхого применения качество ферментного препарата (металлопротеиказа составляет около 90% от суммарного белка в полученном нами препарате) в предлагаемом здесь способе очистки металлопротеиназы Bacillus amyloliquefaciens достигается благодаря оптимизации хроматографии на сефадексе G-75 путем создания в элюенте высокой ионной силы (рис. 1, Б). Это приводит, по-видимому, к усилению вклада в хроматографический процесс взаимодействий между углеводной матрицей носителя и компонентами разделяемой смеси и, как следствие этого, к изменению объемов удерживания и улучшению картины разделения (рис. 1). Такой подход, очевидно, может быть использован для оптимизации гель-хроматографии при выделении и очистке других ферментоБ этой группы, а сама предложенная здесь методика очистхи пригодна как для получения ферментных препаратов металлопротеиназы Bacillus amyloliquefaciens для биотехнологического использования, так и в качестве предварительных стадий для. получения зысокоочищенных препаратов этого фермента.

Выделение и характеристика еврииовой протеин азы аз ThermoactJnomyces species, относящейся к группе Glu,Asp-специфичных ферментов

В ходе проведенных исследований нами было обнаружено, что Thermoactimomyces species штамм 2, отобранный нами в процессе ехриникга, продуцирует протеиназу с уникальной субстратной специфичностью х связям а-карбоксильной группы глутаминовой кислоты.

Протеолитические ферменты с узкой субстратной специфичностью, в том числе ферменты, катализирующие гидролиз пептидных связей с С-конца дикарбоновых аминокислот, находят применение при определении аминокислотных последовательностей белков и пептидов. В настоящее время выделены и охарактеризованы микробные Glu,Asp-специфичные протеазы из Staphylococcus aureus, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Slreptomyces griseus, Slreptomyces fradiae, Slreptomyces thermovulgaris, Actinomyces species. Наличие семейства родственных ферментов и все увеличивающееся количество данных об их структурах и функциональных особенностях позволяют предполагать, что эти белки могут быть в дальнейшем использованы в качестве удобной модели для конструирования протеииаз с модифицированными свойствами: субстратной специфичностью, рН-оптимумом активности, термостабильностью. В связи с этим дальнейшее исследование было направлено на выделение и характеристику идентифицированной нами Glu-специфичной протеиназы.

Ход очистки Glu-специфичной протеазы из Thermoactinomyces species представлен в табл. 5. Предложенная схема позволила получить очистку в 5,3 раза при выходе по активности 41,2 %. На рис. 2 приведен профиль элюирования при хроматографии на фенил-сефарозе CL 4В, которая являлась ключевой стадией очистки и позволила отделить целевой фермент от других протеиназ, присутствующих в культуральной жидкости.

Таблица 5

Очистка Glu-сисцифичной протеиназы из Thermoactinomyces species

Стадии очистки Общий белок, Активность по Z-Glu-pNA Выход по активности, Степень очистки

мг Общая, ед Удельная, ед/мг %

Кулмуральная жидкость 65,8 0,767 0,012 100,0 1,0

Осаждение (NH^SOj 55,8 0,715 0,013 93,2 1,1

Хромато|рафия на сефадексе G-75 52,2 0,690 0,013 89,9 1,1

Ультрафильтрация 48,6 0,680 ",014 88,7 1,2

Хроматография на феннл-сефарозе CL 4В 8,3 0,410 0,049 53,4 4,2

Ул ьтр афи л ьтр а ци я 6,9 0,372 0,054 48,5 4,6

Хромакирафия на сефадексе G-75 5,1 0,316 0,062 41,2 5,3

-1--1--1-Г-1-1-1--1-1-

О 20 40 60 SO 100 120 140 160 Объем, мл

Рис. 2. Профиль элюирования при гидрофобной хроматографии белков культуральной жидкости Thermoactinomyces species на фенил-сефарозе CL 4В: 1 - светопоглощение элюата при 280 нм; 2 - протеолитическая активность в элюате по гидролизу азоказеина; 3 - концентрация сульфата аммония. Пик II соответствует Glu-специфичной протеиназе

В результате очистки был получен препарат фермента, дававший при элехтрофорезе в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия одну полосу, соответствующую белку с молекулярной массой 23 кДа (рис. 3). Электрофорез показывает, ' что Ои-специфическая протеиназа составляет около 20% суммарного белка, секретируемого продуцентом в культуральную жидкость. Этот факт определяет возможность . использования достаточно простой

схемы очистки.

Фермент не терял активности при

рН 5-11 и температуре 20° в течение 24 Рис. 3. Электрофорез в

полиакриламидном геле с часов и имел рН-оптимум гидролиза додецилсульфатом натрия:

1 - стандарты молекулярных азоказеина, соответствующий 8,5. В масс; 2 - очищенная Glu-

специфичная протеиназа из 0ТЛИчие от ряда Glu,Asp-специфичных Thermoactinomyces species', 3 -

культуральная жидкость протеиназ протеиназа Thermoactinomyces

Thermoactinomyces species

species не обладала двумя выраженными оптимумами рН при гидролизе белкового субстрата.

Температурный оптимум протеолитической активности, определенный при рН 8,5, составил 55°. При рН 8,5 и температуре ниже 50° протеиназа не теряла своей активности в течение 2 часов. В интервале температур 50-60°

кДе 66 су

45 т 36 «*

29- У*.

2 3 «#

потеря активности становилась заметной, а при температуре 65° фермент терял активность почти полностью за 30 мин.

Обработка протеиназы из Thermoaclinomyces species фенилметилсульфонилфторидом, этилендиаминтетрауксусной кислотой и ацетатом ртути (II) не приводила к потере активности ферментом, в то время как диизопропилфторфосфат полностью инактивировал фермент. Подобный тип ингибирования свидетельствует о принадлежности фермента к классу сериновых протеиназ и характерен для Glu,Asp-специфичных протеиназ.

Фермент гидролизовал синтетический субстрат Glu,Asp-специфичных протеиназ л-ннтроанилид N-бензилоксикарбонил-глутаминовой кислоты (Z-Glu-pNA) с удельной активностью 0,062 мкмоль/мин на мг фермента. Для сравнения, по литературным данным, протеиназы Staphylococcus aureus и Streplomyces thermovulgaris Т54 имеют близкие значения удельных активностей 0,053 и 0,075 мкмоль/мин на мг фермента соответственно, а фермент той же группы из Actinomyces species характеризуется более высоким значением - 1,8 мкмоль/мин на мг фермента. Ф

Субстратная специфичность протеиназы при действии на белковые субстраты изучалась на примере окисленной В-цепи инсулина. При гидролизе этого субстрата препаратом исследуемого фермента, с помощью метода дансилирования, было обнаружено дополнительное появление только N-концевого аланина. При дансилировании без проведения последующего кислотного гидролиза дансилаланин обнаружен не был. Эти данные однозначно свидетельствуют о расщеплении только связи Gluu-Alau:

I

FVNQHLC(S03H)GSHLVEALYLVC<S03H)GERGFFYTPKA

1 5 10 15 20 25 30

10

20

Thermoactinomyces species Bacillus licheniformis Bacillus subtilis Actinomyces species Streptomyces thermovulgaris

Streptomyces griseus Streptomyces fradiae

Staphylococcus aureus

GTDERTRVTNT T T Y P Y

GGD°GDr t r у t n T t|a|y p Y gtdTr t rii s sit tIsTIp y T OJV Y A NIvjy УТТ>ГТр Y ТПГ T G W МГ0 a ofnv A tag

-IVLGIGGA. IYGGGSRCSAAFN -jvpT|GjG DAIYGGGSRCSAAFN

-01 LPNNDRHQIT DFTTIN G H Y

Рис. 4. Сравнение N-концевых аминокислотных последовательностей Glu,Asp-специфичных протеаз. Обведены остатки, совпадающие с последовательностью протеиназы Thermoactinomyces species

Такой тип расщепления B-цепи инсулина описан лишь для специфичной к кислым аминокислотам протеиназы Streptomyces fradiae. Другие протеиназы этого типа имеют более широкую субстратную специфичность и гидродизуют связи Gluij-Alai4 и Gluji-Arga, а для протеиназы Bacillus subtilis показан кроме того гидролиз связи Cys(SOaH)rGly8.

Аминокислотный состав изучаемой протеиназы оказался близким к 'аминокислотным составам Glu,Asp-специфичных протеиназ из Bacillus subtilis, Actinomyces species и Streptomyces thermovulgaris.

N-концевая аминокислотная последовательность белка, определенная нами автоматической деградацией по Эдману на приборе Model 816 Protein Sequencer (Knauer, Германия) оборудованном анализатором Model 120А РТН (Applied Biosystem, США), имела ' высокую гомологию с последовательностями Glu,Asp-специфичных протеиназ ' из Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis и Actinomyces species (рис. 4). Эти данные позволяют отнести охарактеризованный фермент к той же эволюционной

Streplomyces griseus Streplomyces tradiae Bacillus sublilis ■

Bacillus licheniformis

ThermoactinomYces species! Actinomyces species Streplomyces thermovulgarls Staphylococcus aureus

Рис. 5. Гипотетический ход эволюции Glu.Asp-специфичных лротеиназ. Схема построена на основании гомологии полных и N-концевых аминокислотных последовательностей.

ветви, что и Glu,Asp-специфичные протеиназы бацилл и актиномицетов (рис. 5).

Таким образом, нами выделена новая 1.ротеиняза Thermoactinomyces species, представитель семейства Glu,Asp-специфичных протеиназ. Протеиназа такой специфичности у термоактиномицетов обнаружена впервые.

1. Проведен крупномасштабный скрининг коллекции термофильных микрорганизмов и отобраны 15 штаммов-продуцентов термостабильных

2. Разработана схема получения препарата термостабильной бациллярной металлопротеиназы для практического использования.

3. Разработана схема получения препарата термостабильных протеолитических ферментов из культуральной жидкости термоактиномицета для практического использования.

4. Разработан эффективный вариант очистки генноинженерной

i -

металлопротеиназы Bacillus amyloliquefaciens.

ВЫВОДЫ

протеолитических ферментов.

5. Выделена, очищена и охарактеризована новая сериновая протеиназа из Thermoaciinomyces species, относящаяся к группе Glu,Asp-специфичных ферментов.

Список работ, опубликованных автором по теме диссертации:

1. Демидюк II.В., Звонкова Е.Н., Носовская Е.А., Швец В.И. Вариант

ч

очистки генноинженерной металлопротеиназы Bacillus ayloliquefaciens. // Биотехнология. 1994. № 11-12. С. 13-15.

2. Демидюк И.В., Носовская Е.А., Цаплина И.А., Каравайко Г.И., Костров С.В. Выделение и характеристика сериновой протеиназы из Thermoaciinomyces species, относящейся к группе Glu,Asp-специфичных ферментов. П Биохимия. 1996. 61. № 12. С. 2196-2201.

3. Demidyuk I., Chumakov V., Akimkina Т., Nosovskaya Е., Kostrov S. Research of thermostable proteolytic enzymes. // A scientific conference: "Biotechnology and its global impact". October 7-11 1996. Braunschweig. Germany.

4. Демидюк И.В., Носовская E.A., Костров C.B. Сериновая протеиназа термоактиномицета, относящаяся к группе Glu,Asp-специфичных ферментов. // Научная сессия, посвященная 100-летию со дня рождения профессора Н.А. Преображенского 21-22 октября 1996 г.. Москва. Тезисы докладов. С. 118-119.

Слано в печать 12.11.1996 г.

Бум. офсетн. Печать офсетная. Формат 60 х 90/16.

Уч. им. л. 1,2. Тираж 80 экз. Заказ № 9.

11ПЦ МИТХТ им. М.В. Ломоносова

1 17571, пр. Вернадского, д. 86.