Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биотехнология получения нейтральных протеиназ Penicillium wartmannii BKMF 2091 и изучение их физико-химических свойств

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Биотехнология получения нейтральных протеиназ Penicillium wartmannii BKMF 2091 и изучение их физико-химических свойств"

Министерство высшего и среднего специального образования РСФСР

ВОРОНЕЖСКИЕ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

КОЧЕРГИНА Наталья Ивановна

УДК 577.156.07.001.2

БИОТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ НЕЙТРАЛЬНЫХ ПРОТЕИНАЗ Реп1с1?/1ит ¿Опг/тй/ум'/^^р 2091 И ИЗУЧЕНИЕ ИХ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЛСТВ

Специальность 03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Воронеж - 1

Рабога выполнена на кафедре биохимии и микробиологии Воронежского технологического институт»

. Научный руководитель - доктор биологических наук,

профессор ЖЕРЕБЦОВ H.A.

Научный консультант - кандидат технических наук, доцент Антипова Л.В.

Официальные оппоненты - доктор технических наук, профессор

кафедры процессов ферментативного и промышленного биокатализа ЫТИЛЛ

продуктов ВТИ ИЛЬИНА Н.Ы.

Ведущая организация - Научно-производственное объединение "Биотехнология"

Защита состоится "24" октября 1991 г. в 14 час. ш заседании специализированного Совета К 063.90.01 в Воронежской технологическом шсто?у*е по адресу: 394017, г. Воронеа, просп. Револвции, 19.

С диссертацией uosho ознакомиться в библиотеке института,

Автореферат разослан "Л3 " сентября 1991 г,

УченаЯ секретарь спецнализировашюго Совета, ^

х&щидат биологдчесюсх № Гр-?горов B.C.

ГЕРНЕТ Ы.В

- кандидат технических наук, доцент кафедры технологии мяса и шсных

доцент

ОЕЩАЯ ХАРЛ1ГГЕН1С7ШКЛ РАБОТУ

Актуальность темы. Биотехнология в СССР является предметом интенсивных исследований. С особым подъемом и размахом развивается пищевая биотехнология, в первую очередь связанная с применением ферментных препаратов. В связи с этим остро стоит проблема производства препаратов с заданным качественным составом специфических ферментов. Получение ферментных препаратов на основе микроорганизмов прочно вошло в отечественную и зарубежную, практику и на ближайшую перспективу намечаются тенденции к дальнейшему всестороннему развитию этого научного направления, включающие этапы отбора высокоэффективных продуцентов ферментов, изыскания условий повышения их продуктивности выделения и очистки целевых продуктов, разработке путей их рационального использования.

В связи с создавшимся дефицитом пищевого и кормового белка особое значение придается протеолитическим ферментам, которые, как известно, занимают приоритетные позиции и наибольший объем производства на мировом рынке.

Способностью синтезировать протеолитнческие ферменты обладают в той или иной степени практически все микроорганизмы (Грачева, 1976; Новикова, 1986; Алеева, 1973; Васильевская, 1979; Urißi-i Paul , 1989; Futüe L/Ot&, 1987; Patricia, 1983).

Однако микромицеты рода Pani.cilfiätn мало изучены, как продуценты протеиназ. Имеются лишь частные сведения о физико-химических свойствах этих ферментов, их спеи>;'ичностл, механизме и кинетике действия. Тем не менее, представите; г-тсго рода способны синтезировать весьма активные лрствсяятгпе-.-кие комплексы (Повояоцчая, 1947; БилаЯ, t/oiû

,¿67), перспективные при использовании на практике.

Данная работа является составной частью тематики научно-исследовательских работ кафедр биохимии и микробиологии и технологии мяса и мясных продуктов Воронежского технологического института по проблемам: "Изыскание оптимальных условий микробного синтеза ферментов и исследование их физико-химических свойств", которая включена в Координационный план АН СССР и "Разработка наиболее рациональных способов переработки вторичного сырья"

Цель и задачи исследования. Целью исследования настоящей работы явился выбор высокоактивного продуцента протеоли-тических ферментов среди микромицетов рода Реп т

и разработка препаратов различной степени чистоты, проявляющих активность в нейтральной зоне рН, с высокой степенью гидролиза белковых субстратов. Для ее достижения были поставлены следующие задачи:

- отбор активного штамма с заданными биохимическими свойствами микромицетов рода РепСс1 ¿¿¿ат ;

- исследование условий биосинтеза протеиназ;

- разработка состава питательной среда для культивирования продуцента;

- определение условий выделения и очистки протеолити-ческого комплекса, исследование его компонентного состава;

- изучение физико-химических свойств исследуемых ферментов;

- изыскание путей использования разработанного препарата в перерабатывающей промышленности.

Научная новизна. Предложен новый продуцент нейтральной протекназы кикроницет Pc_nic.ilсшг^ ^агсгпапп'к'2091. Исследована условия направленного биосинтеза ферментов и физиологи-

ческие особенности продуцента в условиях глубинного культивирования. Подобрана рациональная питательная среда для интенсивного биосинтеза протеиназ с применением метода планирования эксперимента. Изучен компонентный состав протеиназ, разработана схема очистки и получения гомогенных фракций исследуемого комплекса. Определены некоторые физико-химические свойства протеолитических фракций: температурный и рН оптимумы, молекулярные мыссы, субстратно-специфические свойства. Показана возможность успешного использования разработанного препарата протеиназ в технологии получения белковых гидролизатов из коллагенсодержащего сырья »ясной прошшлен-ности.

Практическая ценность. Культивирование отобранного продуцента на рациональной питательной среде позволило повысить биосинтез протеиназ в 3,5 раза. Производственные испытания микроскопического гриба на Московском биохимическом заводе от ВНИИ пищевой биотехнологии с целью получения спиртоосажденного препарата протеиназы дали положительные результаты.

Проведены лабораторные исследования применения препарата протеиназы Р гпапп1 / 2091 в технологии получения белковых гидролизатов из коллагенсодерхащего сырья. Ориентировочный экономический аффект от использования предлагаемых белковых гидролизатов составит 2000-5000 руб. для предприятий мощностью 45 тонн продукции в год.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на отчетных научно-технических конференциях Воронежского технологического института в 1085-1990 г.г.,на I научно-технической конференции "Разработка и внедрен/е безотходных технологий, использование вторичных ресурсов

(Москва, 1987), на П научно-технической конференции "Разработка и внедрение безотходных технологий, использование вторичных ресурсов" (Киров,1989), на первой конференции молодых ученых "Биотехника и биотехнология - 90" (Тамбов, 1990).

Публикации. По результатам исследований опубликовано 5 работ, в том числе I авторское свидетельство на изобретение. Две статьи находятся в печати.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, списка литературы, приложений. Материал изложен на /рстраницах машинописного текста, содержит ¿3рисунков и <?^таблиц. Список литературы включает /¿^наименований, в том числе иностранных ^¿Г.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы и методы исследований. Объектами исследований служили чистые культуры микромицетов рода полученные из Всесоюзной коллекции микроорганизмов.

Культивирование проводили в глубинных условиях в колбах емкостью 750 сн^, содержащих по 100 сы'^ питательно;'! среды на лабораторной качалке с частотой вращения л. - 220 -240 ч.мии"* в течение Уо ч при 28-30 °С. В олытно-прс^-ете-и-ных условиях выращаванкз проводили в ферментерах егсоатю 0,04 и 0,1 к3.

Для определения протеолитической активности (ПА) использовали кодифицированный кзгод Анссиа (Рухяядева, йохс-пахива, 1981). За единицу ПД. прикипали количзство ггрдакта, прсгращащее б неосеждаекке трихлоруксусной ккслотсй продукта гидролиза казеината натрия в количестве, соответствую-чэм 1 мкмоль тирозина.

Кератиназную активность (КА) определяли по методу Каш-кина с соавт. (Кашкин и др., 1976), коллагеназную по методу Слуцкого (Слуцкий, 1978), активность сопутствующих ферментов аминолитическую по ГОСТ £0264.4-74, глмолитическую (Рухля-дева, 1981).

Содержание белка находили по методу Л сур) ( ¿¿эип; , Х951), сб'/лй азот - гакрскетодсм Кьзльдаля (Гри'.ъ:- гр., 1982), бе,то:с в гпг. тах - опектро го.'ометри'гсег:; . •' . . 1960), см/миып азот - методом формального ч:::: г и;-:. -лянухнн, 1935).

Определение Сахаров просадили методом Бертрама, су.::;:: пецеств - реф; шстометрнчески (Грачева, 1982).

Для выделения технического препарата использовали ссак-денпе органическими растворителями, концентрирование методом многократного замораживания.

Электрофореткческие исследования проводили по методу

Девиса , 1964). Молекулярную массу определял;! гель-

0 ,

фильтрацией на сефадексе ,7-100 (Детерман, 1971).

Опыты по использованию ферментного препарата в технологии получения белковых гидролизатов из коллагенсодержащего сырья проводили согласно технологическим инструкциям, действующим в отрасли промышленности.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Выбор активного продуцента. Исходный штамм Реп1а ¿Ь ит ид^таппи 2091 был выбран по уровню биосинтеза протеолити-ческих ферментов при нейтральном значении рН. Для первоначальной проверки способности штаммов синтезировать протеоли-тические ферменты культуры выращивали на мясопептонном желатине. Но количеству разжиженного желатина судили о наличии

протеолитических ферментов и их относительной активности. 16 отобранных штаммой выращивали глубинным способом в течение 4-5 суток при температуре 28-30 °С на среде состава: пшеничные отруби, солодовые ростки, Л'£- ^ , КН2РОц , водопроводная вода. Как СИдНо Из табл. I, штамм Реп1е.1 ¿iiu.tr> иол^апяи 2091 обладал наивысшей способностью к биосинтезу протеолитических ферментов.

Таблица I

Биосинтез протеиназы микромицетами рода Реп1с1№шт

К1 пп !Наименование культур ! ¡рода Peniei/iium | ! Номер i штамма ! РНкон ! ! ПА, ед/ецз !

I. 6.a.n.esee/ts 178 7,5 0,00

2. с.А/"у"с^ en и sn 227 8,6 0,00

- 3. сА fySa^enii/n 314 8,1 0,01

4. cJa. A. J/пап/г i i 460 8,7 0,02

5. (¿ecu/nde.u.3 269 8,6 0,03

6. £a/iescens 240 7,3 0,03

7. ¿.i ¿finum. 48 7,5 0,06

6. arenariu-m 1487 7,5 0,12

9. cJ Q-As/natinil 1027 7,2 0,19

10. 271 8,8 0,30

II. muftico/ar 468 7,6 0,62

12. ¿Arvsog&nii/n 315 7,5 0,73

13. funic и ¿cSum III5 7,0 1,35

14. eXPd. ffIU/77 / 275 6,9 1,44

15. /*afi£St:errS 1287 8,3 1,44

16. cJert ma ni L i 2091 7,3 1,74

Исследование особенностей биосинтеза протеиназ продуцентом. Для биосинтеза протеиназ используются различные источники углерода и азота, что по мнению ряда исследователей связано со спецификой транспорта через мембраны, системой локализованных в этих мембранах ферментов (Кретович, 1980; Диксон, Уэбб, 1982).

Использованные нами источники углерода оказывали различное влияние на уровень биосинтеза нейтральных протеиназ и рост грибов Р лли ВКМр 2091 . Максимум протео-.

литической активности наблюдался на среде с крахмалом.

Благоприятными для биосинтеза целевых ферментов сказались маннит, арабиноза, галактоза. Полностью подавляли биосинтез протеиназ сахароза, лактоза, рамноза. Глюкоза, которая является хорошим источником углерода для многих грибов-продуцентов протеиназ, для микрошцета Р Ыо^талп'и ¿091 не эффективна, что, видимо, связано с катаболитной репрессией. Интенсивный рост и накопление биомассы обеспечивали арабиноза и глюкоза. Лактоза, инозит, ксилоза, сорбит в значительной степени подавляли рост микромицета и биосинтез протеиназ. Источники углерода по стимулирующему эффекту на биосинтез ферментов можно расположить в следующий убывающий ряд: крахмал > галактоза > маннит > арабиноза > фруктоза > инозит > мальтоза > ксилоза > сорбит.

Влияние источника азота на биосинтез протеиназ микроскопическими грибами широко дискутируется в литературе. При изучении отого вопроса использовали минеральные и органические формы азотного питания. Установлено, что //¿¿¿/п

ио^/паг7п11 2091 способен ассимилировать как неорганический, так и органический азот, однако уровень биосинтеза ферментов

был значительно выше при использовании МаМ^. Видимо, стимулирующий оффект обеспечивался за счет воздействия ионов А¡а. Восстановленные формы азота в виде А'//^ N0^ , ННцО! ;

(ННцЬЧРДу подавляли биосинтез протеиназ. Органические источники азота в виде белков и пептидов не привели к увеличению протеолитической активности, однако способствовали значительному накоплению биомассы. Вероятно, образование протеиназ р£П1С.1^шт &01*Ьгг7Ялли 2091 осуществляется конститутивно.

Оптимальным для биосинтеза нейтральных протеиназ установлено соотношение углерода и азота в среде 10:1 - 8:1, что совпадает с рядом литературных данных (Щеблыкина, 1980; Ильина, 1981). Установлено, что смесь аминокислот подавляет синтез целевых ферментов. Иная картина отмечена при использовании их в качестве источников азота. Тирозин, триптофан, ме-тионин, лизин повышали синтез протеиназ, в то время как лейцин, пролин, гистидин, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота в различной степени ингибировали образование протео-литических ферментов.

С целью повышения продуктивности штамма и изучения направленного биосинтеза протеиназ исследовали ряд комплексных питательных сред, составленных с учетом физиологических особенностей продуцента. С помощью математических методов планирования эксперимента оптимизирован состав предварительно отобранной среды, позволившей более чем в 3 раза увеличить уровень биосинтеза протеиназ. Компонентный состав рекомендуемой питательной среды представлен

солодовые ростки-1,0; пшеничные отруби-3,0- . .

динамика выращивания Р&п1с11?1ит сдй^тапп 1I 2091 на оптимизированной питательной среде показана на ртс.1.

Как видно на рисунке, накопление биомассн наблюдается к 72 часам на фоне интенсивного потребления белков и Сахаров. Наибольшее образование нейтральных протеиназ наблюдается к 96 часам культивирования. Уровень максимальной протеолити-ческой активности культуралыюй жидкости составляет 5,0-5,25ед/с$:

рН 11А, ед/ см

♦ РнсЛ Дгакгяпса потребления основнюс питательдак веществ, роста микроорганизма и синтеза протеиназ

1 - нротеолитическап акт::г::ость ПА, чу/см"5

2 - рН; 3 - биомасса, В, мг/ЮОсч3; 4 - редуцирующие вещества, РВ

Получение препарата протеолитнческих ферментов Репсе/¿¿¡ит (¿и^юаппи 2091. Для получения препарата протеинааыРеп.1с)(^¿ат ь)о^таппИ 2091 использовали осаждение фермента из культураль-иой жидкости различными растворителями: ацетоном, этанолом, изопропанолом в различных объемных соотношениях и насыщении сульфатом аммония.

Результаты исследования влияния рН на полноту осаждения протеолитического комплекса показали, что оптимальным является значение рН 7,5 (рис. 2). Наибольший выход по активности отмечен при добавлении этанола к культуральной жидкости в объемных соотношениях 3:1. Однако лучшим органическим ссади-телем явился изопропанол. При его массовой доле в смеси 50 % выход протеиназы составил 90,5 %, степень очистки 2,78 и удельная активность 3,06.

ПА>

80

60

40

20

О

2,0

\\

/ \

—- ---------/ i

A j Y

4,0 6,0

РН

Рис.2 Влияние величины рН на осавдение протеолитического комплекса Pénir.ittiusrj u'vrima/inii PJff^ 5.091 : I - эта : ui; ?. - кзснрошшлц % - адетон

Идентификация и очистка протеолитичс-ского комплекса Рсп'хйИсит ^¡.^¿/лалп'и 2091. При диск-электрофорезе препарата, полученного При осаждении, в ПЛАТ обнаружены четыре белковых фракции. Как показали результаты идентификации, проведенной насыщением ПААГ денатурированным гемоглобином (рН 7,2), две фракции обладают протеолитической активностью. Кроме того, в ферментном комплексе препарата содержится активнее глюкоамилаза и ¿С-амилаза. Дальнейший .-•? исследований связан с получением гомогенных фракций для изучения физико-химических свойств.

В результате подбора условий выделения протеолатичес-кого комплекса, разработки методов удаления сопутствующих белков и условий фракционирования протеинаэ на сефадексе V-100 (рис. 3) нами предложена схема получения высокоочищен-ных фракций исследуемых ферментов.

Схема получения высокоочищенных фракций протеолитического комплекса РеляМЬит сйа^мам'и 2091

Инактивация -амилазы оксалатом аммония рН 6,0, 30°С

акционирование на сефа-дексе б'-ЮО

Фракция И

Концентриров аше изопропанолоы

i ■

Концентрирование изопропанолсм

У Прот

еиназа I

I Протеяназз П

Субстратная специфичность протеиназы I., Исследования убстратной специфичности действия протеиназы I на белки по-азалл, что фермент проявил наибольшее сродство к пептидной вязи глицил-лейцин, что предполагает эффективное использо-зние фермента для гидролиза животных белков. По эффектив-эсти гидролиза исследуемые субстраты располагаются в убываю-5й ряд: казеин > гемоглобин > желатин > коллаген > кера-ш (рис. д,).

12 3 4 5 ? ,ч

Рис.5 Динамика гидролиза различных белков препаратом протеиназ Реп^аМ¿и/к ойо^таппи ВКМ /-"2091: I - казеин; 2 - гемоглобин; 3 - желатина; 4 - коллаген; 5 - кератин Исследование возможности применения препарата протеина-

в технологии получения белковых гидролизатс.з из коллаген-;

эдиащего сырья. Наличие коллагеназной актитзгости в протео-

гическом комплексе РспЬыМ^ит Ыа^тапп'ч 2091 явит.ось

?дпосылксй возможности его использования для гидролиза кол-

лагенсодержащего сырья, в том числе и вторичных ресурсов мясного производства, которые для улучшения функциональных белковых систем, нуждаются в ферментном преобразовании.

В качестве коллагенсодержащего сырья использовали шква-ру (отход технологии топленых жиров) и малоценные продукты переработки птицы (головы, ноги). Условия ферментцрования сырья определены методом математической оптимизации. Рекомендуете режимы: при гидролиза шкварш время - 6 часов; дозировка фермента - 4,0 ед на 10 г гомогената; температура о процессе гидролиза - Б0°С; при получении гп.цролизатов голов и ног сухопутной птицы: температура обработки измельченного сь.рья 90-100°С, соотношение ферментов "протовортманин ГЮХ": "протохромагенин Г10Х" - 1:1; продолжительность гидролиза 4.4-5 часов, оптимальная температура гидролиза - 50°С.

В результате гидролизат шквары значительно обогащается водорастворимыми фракциями (в 7 раз в сравнении с исходным продуктом). Гидролиз служит приемом для получения дополнительного жиросырья. Гидролизат обогащается свободными аминокислотами, в том числе незаменимыми, и улучшает вкус продукта. Исследована возможность замены 20 % основного сырья на гидролизат при производстве мясных хлебов. Гидролизати голов и ног птицы характеризуются также высоким содержанием растворимых белков. При этом улучшались

свойства, значительно возрастала функциональность белковых компонентов. В табл. £ приведена сравнительная характеристика гидролизатов коллагенсодержащего сырья.

Свойства ферментативно обработанных малоценных вторичных продуктов мясной промышленности позволяют рекомендовать их для технологии фаршевых изделий.

Таблица 2

Сравнительная характеристика гидролизатов коллаген-содержащего сьфья

Перечень показателей' Ноги_| Головы ' Шквара_

} сырье !гидро-|сырье!гидро-1сырьетидро-

_! лизат '_!лизат '_! лизат

1. Массовая доля (%):

- сухих веществ 15,53 2,05 11,81 2,80 8,4 8,4

- протеина 14,29 15,02 7,88 8,76 7,25 7,58

- жира 6,98 6,03 5.66 5,34 2,2 2,2

2. Содержание водорастворимых белков, ц.ю-б 63,4'Ю"^ 25,0*10"^ от/г 81,2-КГ6 ' 41,8-Ю"6 9.01Л0-6

3. Перевариваемость

мкмоль/см3 0,69 0,60 1,28 1,25 1,51 1,48

ВЫВОДЫ

1. Устеютлспп спосг'чссть грибов рсд? Ягп¿(¡¿¿'¿¿штт

:: спнтэзу протез" :: Лчзс';;;-; ферментов, :м. ' .'ы:с г: нейтральней зеке рН.

2. "з:'лз целого лр:; ¡;ул!)г;:.!:-';:ровпнип не эйряс 'т от недячия субстрата в среде к определяется наличием неорганической формы азота 1! углерода . Редомендуе-

соотношения в среде углерод-азот 1:8 - 1:10.

3. Методами математической оптимизации установлен состав питательной среды для биосинтеза пр- теш: >э Реп1с1&1шя ¿За^талаи 2091 (*): ппеничикв отруби - 2 ,0; ■гч^.гг^о рс-зт-'ки - 2го , МаА'Й^ - о,1 ЛИгРОн - 0,2- Уровень п^теояитичес-

n

«¿ой активности достигает 5,0-5,25 ед/см при продолжительности культивирования - 96 часов.

4. Для получения комплексного препарата ферментов рекомендуется осаждение иаопропанолом из культуральной жидкости в соотношении 1:1, при рН 7,5.

5. Разработана схема очистки протеолитических фракций, гомогенность которых доказана электрофоретически.

6. Электрофоретически и хроматографически идентифицированы две протеиназы, одна из которых имеет нейтральный характер и обладает коллагенаэной активностью. Вторая - щелочная протеиназа, инактивируемая ингибиторами ."сериновых" про-теиназ.

7. Молекулярные массы протеиназ I и П - 34500 + 1000 и 20800 + 1000 соответственно. рН оптимум и температурный опт! мум для протеиназы I 7,2 и 60°С. Для протеиназы П - 10,0 и 40°С.

8. Кислотная и термическая стабильность находится в ди£ пазонах: протеиназа I - в области рН 6-9 при температурах 20-40°С; протеиназа П-в области рН 6-10 при температурах 20-40°С.

9. Комплексный препарат "протовортманинПОХ" из PeriLcltfi urti tJoftrttonnit 2091 перспективен для гидролиза коллагенсодержащего сырья. Успешно может использоваться для ферментативной обработки шквары и голов, и ног сухопутной птицы с последующим использованием для технологии мясных фа] шевых изделий.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

I. Жеребцов H.A., Кочергина Н.И., Антипова Л.В./ Некоторые

(Jürtmannii ВКМ/^ 2091 в получении белковой массы из шквары// Тез. докл. Всесоюзной науч.-техн. конф. "Разработка и совершенствование технологических процессов, машин и оборудования для производства, хранения и транспортировки продуктов питания" - М.,¡АТИЛЛ, 19в7 - с. 137

2. Крылова В.Б., Антипова Л.В., Ееребцов H.A., Кочергина Н.И., Шкаленко З.Н. / Способ производства белково-жировых композиций // Заявка M43I823/3I-I3 п.р. от 03.08.08

3. Антипова Л.В., Насонова Л.В., Кочергина Н.И./ Свойства и использование ферментативной шквары при получении фаршевых мясных продуктов// Тез. докл. П областной науч.-техн. конф. "Разработка и внедрение безотходных технологий, использование

ь вторичных ресурсов" - Киров, 1989 - с. 82-83

4. Кочергина Н.И., Жеребцов H.A., Антипова л.В./ Оптимизация биосинтеза нейтральной протеинааы, специфичной к коллагеновом/ сырью// Тез. докл. науч.-техн. конф. "Биотехника и биотехнология" - Тамбов, 1990 - с.73

5. Кочергина ПЛ., Антипова Л.В., Насонова Л.В. / Исследование возможности получения белковой кассы из коллагенсодержащего сырья методом микробной ферментации // Тез. докл. науч.-техн. конф. "Биотехника и биотехнология" - Тамбов, 1990 - с. 79

свойства и использование микробного препарата Penictifoum

Подписано в печать 19.09.91г. Форм.бум. Í 0x84 Г/7 Тираж 100. Заказ . Бесплатно.__

39-5017 Бороне.-;, ;:; .Р"»«.- ;./и, 19. УОП. 317