Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биосинтез и некоторые физико-химические свойства инулазы Aspergillus awamel ВКМF-808

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Биосинтез и некоторые физико-химические свойства инулазы Aspergillus awamel ВКМF-808"

Государственный комитет РСФСР по дела» науки и высшей школы

ВОРОНЕЖСКИЙ ТЕХНОЛОПЯЕСКЗШ ИНСТИТУТ

На правах рукописи ' Для служебного пользования ! Экз. й!00_

МУСТАФЛЕВ Рафик Магомед оглц

БЮСШТЕЗ II НЕКОТОРЫЕ Фчзшю-хшишапз СВОЙСТВА 151УЛЛЕЫ ^¡иЩСШ аыатсг1 ШР-808

Спошмлыюсть C3.C0.23 - Шотсхнология

Л 21 т о р п ф с р а т ;;тссэт?тг.пп1 ча соискшаш учноЗ сгзиглл х.-'г.'тгтлта

Р.понеп - ТУЛ

Работа выполнена в Воронежском технологическом институте

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ

■зедущая орттшщ

доктор биологических наук, профессор Н.А.Жеребцов

доктор технических наук, профессор М.О.Мосичев

кандидат технических наук, доцент Е.Д.Фарадаева

Московский опытный завод ВНИИ пищевой биотехнологии

Защита состоится ",

МСъЛ 1991 года в /^час.

на заседании Специализированного Совета К 063.90.01 Воронежского технологического института по адресу: 394017, г.Воронея, проспект Революции, 19, ВТИ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВТИ.

"I

Автореферат разослан

. 1991 г.

Учений секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук, Т^ШЦ^^^ ае^.С.Григоров

0Н11ЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теми. Сегодня биотохнологда стремительно видви-гается на передний край научно-технического прогресса. Этому способствуют два обстоятельства. С одной с ^р'нш, бурное развитие современной молекулярной биологии и генетики, опираэдихся на достижения химии и физики, позволило использовать потенциал штнх организмов в интересах хозяйственной деятельности человека. С другой стороны, ни наблюдаем острую практическую потребность в новых технологиях, призванных ликвидировать нехватку продовольствия, энергии, минеральных ресурсов, улучшить состояние здравоохранения и охраны окружающей среда. Вготехнология уже вносит немалую лепту и, вероятно, в будущем сыграет важную роль в реш,з-шш этих глобальных проблем человечества.

Особое место в развитии биотехнологии отводится инженерной энзшологии. Важным направлением инженерной энзшологии является создание технологий заменителей традиционного сахара. Ежегодный дефицит сахара э СССР, покрывай,<.:$ закупками за руоежом, составляет 4 млн.т. Одно из путей ликвидации этого дефицита г/одет быть производство фруктоза н высокофруктозшсс сиропов из инулин-содер~аг;его сырья. Фруктоза в 1,7 раза превышает по сладости сахарозу, что позволит снизить ее расход при производстве пиаевих продуктов, уменьоив тем самым их калорийность; сна гене а карио-генна, может использоваться для детского и диетического питания. Для усвоения фруктозы организмом не требуется инсулин, поэтаrj этот продукт может быть пспользозан большой сахар:шм дкабетсм.

В настоящее время в качестве заменителя сахара за рубепсм широко применяются глюкозо-^руктозные сиропы (КС) :тз кукурузного крахмала. Дет производства ITC необходимо пр^.-зкеыио трех '¡йг.-мен-

tob: гидролиз крахмала до глюкозы последовательно ot-амилазой и глюкоамилазой и изомеризация глюкозы во фруктозу глхжозоизомера-зой с получением КС, содержащего 42 % фруктозы. Кз инулинсодер-яацнх расTeináJ (топинамбура, толинсолнечника, цикория) возможно получение высокофруктозных сиропов. При этом достаточно одного фэрыента инулазы. Содерваниз фруктозы в таких сиропах 80-92 %. Пршвадетше данше говорят о перспективности для народного хозяйства организации производства препарата инулазы, применение которого позволит создать технологии получения и использовшпш фруктозы и фруктозншс сиропов из нетрадиционного сырья.

Цель и задачи работы» Целью работы с5ыло найти активный продуцент фермента инулазы и получить препарат для гидролиза инулин-содеркащего сырья с получением высокофруктозных сиропов для пищевой промышленности.

Для достижения поставленной цели предусматривалось решпь следующие задачи:

- отбор активного продуцента инулазы среди микромицетов;

- исследование условий биосинтеза инулазы отобранным продуцентом при глубинном и твердофазном культивировании;

. - разработка метода выделения и очистки препарата инулазы;

- изучение некоторых физико-химических свойств полученного препарата;

- применение препарата инулазы в хлебопекарной и безалкогольной промышленности.

Настоящая работа выполнялась в соответствии с тематикой научных исследований кафедры биохимии и микробиологии Воронежского технологического института по проблеме "Изыскание оптиыалышх условий микробного синтеза ферментов и исследование их физико-химических свойств", входящей в координационный план АН СССР.

Научная новизна. Показало, что из 37 исследованшх микроми-цвтов самым перспективным в отношении биосинтеза инулазы является а \vamozi ВИТ -808, который впервые предлагается нами в качество продуцента целевого фермента. Подобраны оптимальные условия культивирования и состав пит. '.'«льноЯ среды в условиях глубинного и твердофазного культивирования. Разработаны способы получения технического препарата фермента к предложена схема его очистки. Получена высокоочиненная зшулаза из (Л. а\уато ВКМР -600. Исследовал процесс кислотной и термической инактивации, идентифицированы некоторые функциональные группы каталитического центра, предложен гипотетический механизм разрыва р -2,1-фруктозидной связи з молекуле инулина инулазой. Показана возмолюсть успешного использования полученного ферментного препарата в технологии газ аса и хлебобулочгшх изделий.

Практик стсач пепиость. Производственные испытания по поверх-ностно:.!у выраашашш микроорганизма на Московском опытном заводо ЕШП1 пиизпей биотехнологии о цельтэ получения сниртоос.злденного прзпарата пнулазы дали пологлтвлышз результаты.

Проведены лаборатории исслздоватш применения препарата пну лазы в технологии кваса. Разработаны рекомендации производству.

Препарат ту лазы а\уа/тгосл шаТР -808 апро-

бирован при получении из топинамбура высокошруктсзного сиропа с использованием его для выпечки хлебобулочных изделий на .хлебозаводе Л 6 г.Воронека. Ориентировочный годовой экономический эффект от внедрения разработанного способа производства хлебобулочных изделий на хлебозаводе мощностью 40 т/сутки составит около 62000 руб.

Апробация работы. Диссертация рассмотрена на расширенном заседании кафедры мшеребкологлп и биохимии Еорокг>.г/.ского технологи-

чвского института и рекомендована к защите. Основные результаты диссертационной работы доложены на отчетных научных конференциях Воронежского технологичеокого инотитута (1987-1990 гг.), Второй Всесоюзной научно-производственной конференции "Топинамбур и то-пинсолнечшгк - проблемы возделывания и использования" (г.Иркутск, 1990 г.). Полученный нами препарат инулазы экспонировался на ВДНХ ССОР и был удостоен серебряной медали.

Публикацт. По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов опытов и их обсуждения, заключения, выводов, списка использованной литературы и приложений. Диссертационная работа изложена на 144 страницах машинописного текста, содержит 34 таблицы, 28 рисунков и 5 приложении. Список литературы включает 165 наименований.

СОДЕШШВ РАБОТЫ

Во введении обоснованы актуальность темы и направление исследований.

В обзоре литературы дана характеристика продуцентов инулаз, найденных в СССР и за рубежом. Приводятся данные об особенностях биосинтеза, выделения и очистки препаратов инулаз, физико-химкче-оких свойствах ферментов, по применению препаратов инулаз.

В результате анализа литературных данных устайовлено, что в настоящее время в б сто!! стране не используется ферментативный способ гидролиза инулинсодернащего сырья из-за отсутствия высог.оспе-ци^ичных -ферментов; обоснованы цели и задачи исследований.

3 эксперипентяльной части представлены материалы исследований, обоснован выбор исследуемых показателзй и факторов, обобщены

и обсукдекы результаты экспериментальных данных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

При выборе продуцента пнулазы использовали культуры микро-мицетов родов dsfltagit&ib , Penic¿£¿¿t¿sn % /2ЛсЛо/шз , полученше из Всесоюзной коллекции микроорганизмов.

Твердофазное культивирование проводили в колбах е1,шостью 500 см3, содержащих 20 г среды по воздушно-сухой массе. Культи-влрование вели в течошю 42-48 ч при 30-33 °С.

Глубинное культивирование проводили в колбах емкостью 750 си? содержащих по 100 см3 питательной среды, на лабораторной качалка о частотой вращения 4 (уровень аэрация 1,4 г 02/да3«ч) в течение 144 ч при 30-33 °0.

При оптимизации условий культивирования и состава питательной среды использовали полный факторный оксперилент (П5Э 24), учитывающий мекфакторша взаимодействия (Грачев, 1975). Статистический анализ регрессионных уравнений проводили по программе, заложенной в матрицу планирования экспериментов согласно избранному методу на ЭВМ ЕС 100,25.

Инулазную и инвертазную активности устанавливали по количест--ву редуцирующих веществ при гидролизе ннулзша и сахарозы исследуемым объектом.

За единицу инулазной активности принято количество фермента, которое катализирует образование I мод редуцирующих веществ (фруктоза) за I мин в стандартных условиях.

За единицу шпзертазной активности принято количество фермента, которое катализирует образование 2 ггл редуцирующих веществ (фруктоза + глюкоза) за I млн з стандартных условиях.

Количество образовавшееся редуцирующих вецеств в пробе определяли по методу Исмодаи-Нельсона ( íomodyí , 1952; jYetiO/г ,

1944).

В полученных препаратах определяли активность сопутствующих ферментов: протеолитическую (Каверзнева, 1971), амилолитическую и глюкэамилазную (Рухлядева, 1981).

Электрофоретичаские исследования препарата инулазы проводили по методу Дэвиса ffiairis , 19^4),

Дли выделения тех1шческих препаратов фермента использовали осаждение органическими рас творителяли, выоокоочиценных - ионо--обмоннув хроматографию и гельфильтрацию (Детерман, 1971).

В ходе исследований были использованы общепринятые методы: общий азот определяли по Кьельдалю (Белозерский, Проскуряков, 1951); белок - по методу Лоури (cXbwey t 1951); глюкозу - глшко-зооксидазным методом (Щербухин и др., 1970).

РЕЗУЛЬТАТУ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУВДЕШЕ

Выбор актирного продуценту инулазы» Из 37 штаммов микромице-тое различных таксономических групп инулазная активность обнару-неиа у 22 штаммов (табл.1),

Все микроорганизмы выращивали твердофазным способом на среде из пшоничных отрубей с начальной влажностью 60 % в теченио 4042 ч при температуре 30 °С.

Как видно из таблД, микромицет ¿Aawa/погс BKMF -808 наряду с наибольшей способностью к биосинтезу инулазы имеет и самый высокий коэффициент J/S , равный 0,32 ( и S -активности по инулику и сахарозе соответственно).

Глубинное культицщовашто. Для биосинтеза инулазы источники углерода, используемые при культивировании микроскопических грибов, весьма неравноценны, что связано, видааю, с проницаемостью мембран ицышндуалькоИ клетки и спецификой транспорта через них

Таблица I

Биосинтез инулазы некоторыми гажромицеташ

Нашеновшше культуры

Каталитическая активность, ед/г

инулазы шшвртазы

Л/5

1. псдег

2. ^/гегдсК/л пс^ей

3. ^уигдЛ^а

4. Луиас/сМсл /терсз.

5. Лз/гегд^Мслиерей

6. ^/ге^с/'/'ш пи^еА

7.

8., ^^ее^/Лих /Т1с??з 9. с ^ '/¿¿л /г^га

10. перп

11. л^гэ

12. (^е. з

13. е грс '/¿их /г^гз

14. /¿Срез

15. Ж/сеерс/А/зльрег

16. ^/з/гс трг /и^гг

17. ч^гг

18. я^г?

19.

20. Рслссс/Аит уи/п/&о//7Т

ЪЪ^Х/гС^Мш в\YarrtOZL

ВШР-37 ВИ1Р-34 ВКМР-35 кар-Зб

ВКМР-412 ВКММЗОб вшт-1307 ВИ.ЕМЗОЭ

вкмт-гозэ

ВК, 1-2092

вш-225 э

ВШР-2401

ВШР-2754

ВШР-2093

ВКМГ-40

ЕКМР-39

ВЮ.С—1119

ВКМР-801

шячзз

ВШР-358

ВКМР-2250

ШЕ-808

4.12 7,08 5,11 2,50

8.13 5,75 3,10 5,65

13,26 10,30 10,83 5,82 2,80 3,08 15,99 9,35 14,58 12,52 7,43 2,60 235,40 245,70

585,86 719,80 671,92 ' 277,80 959,94 1061,93 344,40 758,66 1058,54 1415,68 1698,61 868,79 403,60

385.00 930,79 986,03

1814,49 1699,28 1096,15 288,90 1022,56

767.01

0,007 0,010 0,008 0,009 0,004 0,005 0,009 0,007 0,010 0,007 0,006 0,007 0,007 0,008 0,020 0,009 0,023 0,007 0,007 0,009' 0,230 0,320

питательных веществ (Кретович, 1980).

Использованные наш источники углерода (moho-, ди- и поли- ' сахариды, многоатомные спирты) при глубинном культивировании по-разному влияли на рост мтпсромицета ds/ieepU¿us awamosi bKLIF-808. Было обнаружено, что максимальное накопление фермента наблюдалось на сроде с крахмалом, несколько меньше (на 20,4 %) на среде с раршозой. Инулин и сахароза не оказывали заметного индуцирующего эффекта на синтез инулазы. В связи с этим сделан вывод, что ds/iesgLifus a wa/7/oet EKMF-808 продуцирует кнула-зу конститутивно.

При изучении влияния иоточшгков а^ита на бкооинтез инулазы использовали min¡* ,гъные и органические формы азотного питания. В результате иск. .иашш выяснилось, что азот в аммонийной форме усваивается лучше, чем в нитратной. Аммонийные соли серной и фосфорной кислоты в большей степени способствовали росту гриба и накоплению инулазы в культуральной жидкости} самым эффективным среди них был однозамещенный фосфат аммония.

Добавление в питательную ореду органического источника азота - кукурузного экстракта - значительно интенсифицировало рост гриба и его биосинтетическую активность. Следует обратить внимание на тот факт, что значения удельной активности инулазы (активности на единицу биомассы) на средах с неорганичеокш азотом существенно ниже, чем на средах о его органическими формами, Это позволяет сделать вывод о том, что органический азот в виде аминокислот, пептидов, белков необходим не только для лучшего роста V. развития зело ток dsfiezyctíui awarnoai BKMF-808, но и для интенсификации биосинтетической активности гриба. Характерно, что при выращивании awa/noet EKMF-808 на средах

с различными источниками углерода и азота активность инулазы кор-

релирует с активностью инвертазы, коэффициент О / S не меняется и равен 0,32, хотя наблюдается значительное изменение величин как инулазной, Tait и инвертазноЯ активностей. Это указывает либо на сходашй характер ре гулянии обет активностей в клетках продуцента, либо на наличие одного фермента, гндролизующего как инулин, так и сахарозу.

В биосинтезе ферментов важную роль играют внешние условия. Установлено, что наилучшими условиями для биосинтеза пнулазы ijawamosi ВКМ?-808 являются: начальная величина рН 5,0, температура 32-33 °С.

С целью повыше гаи про.дуктивности отобранного шташа исследовали ряд комплексных естественных сред, составленных с учетом физиологических потребностей продуцента. В качестве источника углерода использовали муку различных злаков, картофельную мезгу, мелассу. Значительное увеличение синтеза пнулазы (на 64 %) про-п сходило на ope до с мелассой, что согласуется с данными длн

aiva/rroai 16 (Добролинская, Серова, 1974). Такое возрастание биосинтеза пнулазы при использовании мелассы, по-видимому, связано с большим количеством ростовых веществ, содержащихся в ней (биотип, пантотеновая кислота, инозит).

В дальнейшем исследовали влияние концентрации мелассы и кукурузного экстракта на синтез инулазы продуцентом. Наибольшее количество фермента синтезировалось при внесении в среду 8 % мелао-сп и 2 % кукурузного экстракта. Бшз изучено влшише различных концентраций солодовых ростков на биосинтез инулазы микремицетга: Jt&fiep.gMuS awamozi BKMF-B08 и установлено, что при добавлении в питательную среду 0,5 % солодовых ростков синтез тормэчте-возрастает на 36 р.

Итак, для глубинного культивирования миттсмотета

tus awamozi BKMF-808 можно предложить рациональную питатель-нуп среду следующего состава, %: меласса - 8,0; кукурузный экстракт - 2,0; солодовые ростки - 0,5; JHg&Q4 • 711^0 - 0,05; XCtf -0,05; ^eSDj • VH^O - 0,001; pH 5,0. Культивирование продуцента на данной среде при температуре 32 °С в течение 144 ч позволило по-ьлси-гь активность инулазы в культуралыюй кидкости в 2,5 раза по сразнешш с исходно!).

Динамика роста микроорганизма и биосинтеза им фермента представлена на рис.1, откуда видно, что рост микроорганизма характеризуется лаг-фазой продолжительностью около 24 ч, за ней следует фаза роста, в которой интенсивно потребляются питательные ве-

щества, увеличивается биомасса, и к 96 ч ее накапливается максимальное количество. Поело 96 ч часть клеток претерпевает лизис, о чем свидетельствует уменьшение биомассы. Максимальное значение инулазнои активности наблюдается к 144 ч.

Тзердойазнее г.ультквнровазпге. Грибн рода бЯунздСё^и!, являются аоробаш и хорошо развиваются на поверхности субстрата.

Вакнейишн специфическими факторами, влиявдими на биосинтез ферментов микроорганизмами являются температура, прододллтель-ность культивирования, степень увлажнения питательно:'! среды, ее компонентный состав и структура. В качестве питательной среды ис-пользовили пшеничные отруби крахмалпстостыэ 18 % с внесением солодовых ростков. Нами был проведен последовательный поиск частных оптппумов по ка'хдему фактору при поочередном варьировании его на фоне постоянства остальных. Получегаше данные позволили выбрать в качестве основных факторов, влияющее на биосинтез лнулазы а\уа/пой1 Ш,1?-308: Х| - температуру культивирования, °С) - влалность среды, Х3 - концентрацию солодовых ростков, %1 Х^ - продолжительность процесса, ч. Все эти факторы совместимы и некоррелироваш ыеаду собоП.

В результате оптимизации условий культивирования и состава питательней среды с помощью полного факторного эксперимента (ПФЗ 2'1) с использованием центрального композиционного ротата-бельного уннформплшшрования получено уравнение'регрессии, адекватно описывающее процесс биосинтеза инулазы при твердофазном культивировании продуцента!

7 = 468,330- 47,943ХГ 3,082Х2+ 24,261Х3+ 28,530Х4-

- 46,850Х1Х2- Ю#81СХ1Х3+ 17,4С6Х1Х,1+ Г^бОбХ^-

- 14,549X0X4- 6,166Х3Х4->1,024Х| - 54,230Х| -

- 22,9З6Х3 - 15,107X2

Таким образом, оптимальные интервалы изменения параметров для био«штеза инулазы äs/itaptS/us QW/ttosi BKMF-808 при твердофазном выращивании равны; температура культивировшшя ~ 32-33 °С; влажность среды - 61-64 %•, концентрация солодовых ростков - 11-16 продолжительность процесса - 43-44 ч. При таких значениях исследуемых параметров активность инулазы в поверхностной культуре составляет 493-504 ед/г.

Разработка метода получения препарата mc/лазы. д waто а С Eü,g-B08. Ферментный препарат получали из экстракта поверхностной культуры гриба методом осавдения органическими растворителят.ш (этанолом, изопропанолом, ацетоном). Установлено, что наиболее полное осалденне фермента всеми растворителями имело место при pH 5,0, Это дает основание к предположению, что изо-электрическая точка инулазы trfs/tespt'f/us dwamozi BKMF-808 близка к этой величине рН.Наилучшм осадателем дет инулазы оказался изопропачол в концентрации 75

Данные по очистке 1шулазы представлены в табл.2.

Таблица 2

Очистка 1шулазы ¿fs/iesgcSSaj awamosi EKMF-808

Стадия очистки Активность инулазы, ер Количество белка, мг Удольная активность, Ьд/мг белка Степень очистки Еыэрд,

Экстракт поверхностной культуры 4417,0 738,0 5,98 1,00 100

0са".дение изопропанолом в соотношении объемов 1:1,5 2517,7 243,2 10,35 1,73 57,0

Хроматография на ДЕ-52 1104,3 13,0 84,95 14,21 25,0

Ультрафильтрация 1104,3 II, 6S 93,46 15,62 25,0

Гель- фильтрация на сефадексе G-IOO 60,6 0,16 378,75 63,33 6,1

Как видно из таблицы, разработанный наш метод дает возможность подучить высокоочищегашй препарат инулазы с удельной активностью 379 ед/мг белка.

Некоторые физико-химические свойства инулазы. Исследованием влияния температуры и рН на каталитическую активность инулазы установлены оптимальные параметры действия фермента: температура 65 °С, рН 4,5.

Изучена динамика кислотной инактивации инулазы в интервале рН 3,0-6,0. Наибольшую стабильность фермент проявлял в зоне рН 4,0-6,0. Так, через 96 ч инкубации при 40 °С фермент был инакти-вирован при рН 4,0 на 14 %, при рН 5,0 - на 7 %, при рН 6,0 - на 10 %. Более интенсивная инактивация инулазы наблюдалась в кислой и слабощелочной зоне.

Термическую инактивацию инулазы изучали в интервале температур 30-70 °С в зоне рН 3,0-6,0. Пну лаза Лх^езрСМа* амйгтгогс ВМ,1Г-808 тлела достаточно высокую термостабильность в зоне рН

Рис.2. Д;шамнка инактивации инулазы апа/ттоы

ВКЗ<1Г-Ви8 при температуре 60 °С и рИ: I- 3,0; 2- 4,0; 3- 5,0} 4- 6,0

Таким образом, над лаза ан/ато^С ВИ.С-вШ

обладает высокой кислотной и термической устойчивостью.

Нами установлено, что процесс кислотной инактивации инулазы

является типичной реакцией первого порядка. Константы скорости

инактивации рассчитывали по уравнению и _ Л,¿05 а, А

где Е0 - исходная актипнооть; £ - активность в момент времени 5> .

Данные кинетики инактивации инулазы представлены в табл.3.

Таблица 3

Влияние рН и температуры на константу скорости инактивации ивдлазн rfi/iespcffui awa/rrost BKi.IF-808

Температура, °С К- ГО^. ч"1 при рН

3,0 4,0 5,0 6,0

30 0,134 0,046 0,015 0,027

40 0,422 0,159 0,071 0,106

50 1,767 0,542 0,319 0,424

60 127,218 23,638 7,545 14,221

65 1602,272 ' 178,155 47,711 101,701

70 7357,413 1277,283 324,301 731,915

Воспользовавшись теорией абсолютных скоростей реакций Ирин-га нами были рассчитаны основные термодинамические характеристики л И*, дА^и , которые описывают переходное состояние фермента из активной формы в инактивированную. Результаты расчетов продставлеш в табл.4. Еноргия активации Еакгопределялась но графикам Арренцуса (рис.3).

Полученные данные свидетельствуют о том, что инактивация, инулазы акатояб ШанЧЮв носит слокный харак-

Таблица 4

Термодинамическая характеристика активированного комплекса процесса инактивации инулази of3/ie.3ffbi!£uS awasnoai BKMF-808

Температура, °С РН В акт &Н* ДА* Дж.К"1. моль"-"- ■

кДн- моль-1

30-50 3,0 95,3 92,7 83,1 30,7

50-70 3,0 344,7 341,9 71,8 811,1

30-50 4,0 105,3 102,7 92,0 32,2

50-70 4.0 330,3 327,5 76,8 752,8

30-50 5,0 127,7 125,1 93,5 101,0

50-70 5,0 306,4 303,6 80,6 669,7

50-50 6,0 . И4,9 112,3 92,7 62,6

50-70 6,0. 325,6 322,8 78,3 734,2

¥

-I

-2

v

*

г_ з х

2.9

3,0

3,2

3,5 (f/T)f05

Рис.3. Графики Аррениуса Ы-fU/T) для значений рН: 1-3,0; 2- 4,0; 3- 5,0; 4-6,0

тир и в формировании белковой глобулы фермента участвуют два типа взаимодействий: различные виды электростатических связей и ' гидрофобные шиш.

Особого внимания заслуживает величина а 5 ф , по которой судят об упорядоченности конфорыации белковой глобулы. В зоне температур 30-50 °С инулаза имеет относительно меньший прирост энтропии л5 ^ , что свидетельствует о достаточно высокой прочности и меткости глобулы фермента. Резкое увеличение * в интервале 50-70 °С свидетельствует об интенсивном переходе белковой глобулы фермента в хаотический клубок и дает основание предположить, что в формирование белковой глобулы фермента существенный вклад вносят гидрофобные взаимодействия.

Идентификация функциональных групп каталитического центра. Идентификация функциональных групп активного центра фермента играет существенную роль в развитии представлений о механизме ферментативного катализа. Важными критериями идентификации этих групп являются величины констант ионизации (рК) и тепло? ионизации ( &Н ). Эти величины мы находили используя кинетическую зависимость активность - рН при температурах 3 и 60 °С, Результаты графс-аналитических расчетов представлены в табл.5.

Таблица 5

Величины рК и дН каталитически активных групп инулазы аууатоас ВШР-803

Ветви кривой рК при температуре. °С АН,

активность - рК 3 60 кДж* моль"1

"Кислая" 2,90 3,25 11,0

"Щелочная" 6,35 5,60 23,1

Полученные данные, а такке результаты йотооклелзния фермента г присутствии ыетиленового сшего, позволил:! сделать внвод,

что а активный центр инулазы ^¿^(^¿¿¿их а.№т?оэ£ В1ШР-808 входят имидазояьная и карбоксильная группы. На основании этого предположения нами предложен гипотетический механизм разрыва _/5-2,1-фруктозидной связи л молекуле г-уллна ш гул аз ой:

'////////////////////г

СОО'

i

А

снан

-у

чз-

V -(у

1<

I

///////////////////Л'

СОО" н н

!

----о-с,

о

Ч /Г

<

1 +

Ним

^///////А/л/;;;///

СОО" н \\

Лп : К

С!1,0И 1 О И+см I

'/////////А*/////;//,

нон

сн,он ¡. о

Ним I

соо" н н

О ОН Уоп

А К

снгон о

Ним 1

Получение вноокофруктозного сиропа, из топинамбура с применением Ферментного препарата инулазы. В результате исслодовшчй определены рациональные условия гидролиза инулина ¡пгулазой Лз/гезрсМсл а>т/770ёс ЕКМР-808: концентрация ш:ужша в растворе - 10-20 %, температура - 60 °С, рН 4,5, продолжительность гидролиза -8 ч, дозировка ферглзнта - 6 ед/г субстрата. С использованием данных параметров получен высокофруктозшй сироп из топинамбура. Характеристика сиропа приведена ь табл.6.

■ Использование вноокофруктозного сироп а :в хлобогочеиг^. Зысс-кофруктозный сироп из тошздамбура использовал! пг-л гг'Игото^летгл теста з качестве подслацивалпего компоненла вэаыен сахгф.-.-гк-с"-д.

Таблица 6

Характеристика высокофруктозного сиропа

Наименование показателей

Характеристика

Массовая доля сухих веществ, % Массовая доля фруктозы, % Массовая доля глюкозы, % Содержанке общего азота, мг/100 г Содержание яшнного азота, мг/100 г Массовая доля минеральных веществ, %

70,00 56,56 4,66 1241

460 0,82

Tocto готовили безоларным способом по рецептуре хлеба белого из пшеничной муки высшего сорта, батона нарезного, батончика к чаю, дозировку дрожжей увеличивали в 1,5 раза, високофруктозный сироп вносили с учетом полной замены сахара-песка по сладости.

Результаты исследований показали, что в образцах теста с использованием высокофруктозного сиропа интенсифтдаруются процессы кислотонаколлшшя, улучшаются структурно-механические свойства теста. При эти,! увеличение дозировки высокофруктозного сиропа в большей степени способствует укреплению консистенции теста, оно становится более упругим и менее растяжимым. Полученные сведения подтверждаются данными фаринограмм и альвеограмы.

Сравнительная сценка качества готовых изделий позволила установить, что по органолептическим показателя.] опытше образцы хлебобулочных изделий соответствовали ГОСТ 26987-86, 27844-88, KI2I-69. Анализ физико-химических характеристик показал, что использование высокофруктозного сиропа- способствует увеличению пористости и удельного объема изделий на 3-5 % (табл.7). Кроме того, изделия с внесением высокофруктозного сиропа характеризовались меньшей массовой долей общего сахара на 17-30 % при рав-

ной степени сладости, что обусловлено большим содержанием фруктозы.

На основе полученных результатов можно оделать вывод, что внесение высокофруктозного сиропа улучшат качество изделий, обеспечивает их диетические свойства, сажает оахароемкость.

Таблица 7

Физико-химические показатели качества готовых изделий

Наименование показателей

Хлеб белый из муки пшеничной

Батон нарезной из муки шшшчной

Батончик к

чли

контроль опыт контроль опыт контроль опыт

Влажность, % 43,0 42,8 42,0 42,0 39,2 39,6

Кислотность, град 2,6 2,7 2,5 2,6 2,7 2,8

Пористость, % 72,0 77,1 78,8 79,1 72,7 73,4

Объем, см3 1025 1070 1110 ИЗО 1030 1050

Удельный объем, смз/100 г 277 289 297 305 276 283

Приготовление внеокофруктозного сиропа и его использование при производство хлебобулочных изделий ащюбировано в условглх хлебозавода 1& 6 г.Воронежа. Результаты проведенгаос испытагпг:! показали целесообразность использования данного способа а проиш-лешости как технологически оправданного.

Исследование возможности применения високо^руктозного сиропа в технологи; кваса. Ш попытались изучить возможность использования в производстве хлебного кваса в качестве подслатоизапвдго компонента высокофруктозног'о сиропа, полученного по разработанной

технолопш. В результате исследований установлено, что при активации дрожжей на среде с высокофруктозиым с1фопом увеличивается их бродильная активность на К %. Показана возможность полной за-

мены сахара высокофруктозным сиропом на стадии брожения квасного сусла и 30 % сахара, идущего на купажирование. Опытные образцы кваса соответствовали требованиям действующей нормативно-технической документации по физико-химичеоккм показателям, характеризовались чистым вкусом, ароматом ржаного хлеба.

ВЫВОДЫ

1. Из 37 проверенных микроорганизмов максимальная способность к биосинтезу инулазы отмечена у Ж^э^Мщ а№¡2/77021 БКМР-808.

2. Определено, что для культивирования продуцента целесообразно применять как твердофазный, так и глубинный способ культивирования.

3. Подобрана рациональная питательная среда с целью максимального биосинтеза инулазы при глубинном культивировании, включающая, %: мелассу - 8,0; кукурузный экстракт - 2,0; солодовые ростки - 0,5; • 7Н20 - 0,05; 7СС€ - 0,05; «%:ОД-7Н20 -0,001. Установлено, что оптимальными условиями глубшшого культивирования продуцента являются: температура - 32-33 °С, начальное значение рН среды - 4,5-5,0; длительность - 144 ч.

4. С помощью математического планирования эксперимента оптимизированы условия к состав питательной среды для твердофазного культивирования. Состав среды, %\ пшеничные отруби - 84-69, солодовые ростки - 11-16. Условия культивирования: температура -32-33 °С, влажность среды - 61-64 %\ продолжительность - 43-44 ч.

. 5. Разработан метод получения высокоочщешюго препарата инулазы с удельной активностью 379 ед/мг белка и степенью очистки 63.

' 6. Оптимальными условиям для действия инулазы Л'.р.сзр^-

■¿US dwamoai BKMF-808 является: pH 4,5 н температура 65 °C.

7. Исследован процесс кислотной и термической инактивации инулазы. Установлено, что инактивация фермента описывается уравнением первого порядка. Расчет термодинамических параметров этого процесса позволяет сделать вывод о том, что в формировании белковой глобулы фермента вожную роль играют гидрофобные взаимодействия.

8. Кривые зависимости активность-рН, расчет теплот ионизации и инактивации инулазы фотоокислением в присутствии метилено-вого синего позволили установить, что в состав активного центра фермента входит электрофильно-нуклеофильная система карбоксил-имидазол. Предложен птотетический механизм разрыва уЗ-2,1-фруктозидной связи в молекуле инулина щ{улазсй dsfiesgi-ttus awamoai BKMF-808.

9. Определены рациональные условия гидролиза инулинсодержа-щего сырья инулазой vfsfies^i^fus awa/nozi BKI.IF-808: концентрация инулина в раствора - 10-20 %; температура - 60 °С; рН -4,5; дозировка фермента - 6 ед/г субстрата; продолжительность -

8 ч. При этом достигается 100 %-лая степень гидролиза инулина.

10. Показана перспектива и целесообразность использования высоксфруктозного сиропа из топинамбура, полученного с помощью препарата инулазы Ji/iesgittus awamozc Ш.1Г-808, п хлебопечении и при производстве напитков.

11. Ориентировочай годовой экономический эффект от внедрения предлагаемого способа производства хлебобулочных изделий с применением высокофруктозного опропа из топинамбура для хлебозавода производительностью 40 т/сутки составит около 62000 руб.

Список работ, опубликованных по гате риалам диссертации: I. Цустафаев P.M., Керебцов Н.А., Сербулов Ю.С. Биосинтез ;:"ула-

au Js/icsgCffas а wa/nosi BKMF-808 /Воронеж.технол.ин-т. -Воронеж, 1990. - 21 с. - Деп.в ВИНИТИ 08.01.ЭО, Js5I0-mö90.

2. Г^стафаев P.M., Ееребцов H.A., Щуваева Г.П. Особенности состава питательной среды для биосинтеза ннулазы df/iesgtffas CtwasnozL BKMF-808 /Вороне к.технол.ин-т. - Воронеж, 1990. - II с. - Деп.в ВИНИТИ 08.01.90, /£5П-мб90.

3. Оптимизация биосинтеза инулазы /ЭДустафаев P.M., йребцов H.A., Щуваева Г.П., Сербулов Ю.С, //Тез.докл.науч.-техн.копф. "Биотехника и биотехнология". - Тамбов, 1990. - С.72.

4. Влияние некоторых факторов на гидролиз ииулинсодержащего сырья /Ееребцов H.A., Пащенко ЛЛ., Мустафаев P.M., Щуваева Г.П. //Тез.докл. 2 Воесошн.н&уч.-произв.койф. "Топинамбур п топип-солнечник - проблемы возделывания и использования", 6-10 авг, 1920 г. - Иркутск, 1990. - С.64-65.

5. 0 перспективе использозазшя новых источников сахара в пищевой промышленности /Пащенко Л.П., Ееребцов H.A., Щуваева Г.П., Мустафаез P.M., Ралдугика Т.Н. //Тез.докл.2 Всесоэзп.науч.-произв.конф. "Топинамбур и токшеолнечкак - проблем! возделывания и использовшшя", 6-10 aur.ISSO г. - Иркутск, IS90.-C.50

е. ZAezeSisoirJfJ., Jiiiiiia/aei' Р.М, Suuiracva (г. A SiowniAc-id с! fuagat inui&zast //¿0 HI J.ieitog о/ ¿Ac §£-äesaicon а/ ¿аго/геа/г ßoocAernica£ £ocie&eit*/an-аоиш, tf-Mdugu&i /990 - &uc'aued, /99О. -P.

<J С С/ / >

Пс.шгсыто ь imaib 10.04.91 r. vojvr.x c!y;.:cvw; 85x84 T/I6 Wbi.v 1 к..;. Tnp. 201). 'cr_r.c:: CR Веоздсдиз