Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Стабилизация и использование кислых протеиназ в сложных субстратных смесях

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Стабилизация и использование кислых протеиназ в сложных субстратных смесях"

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН

ег;

ИНСТИТУТ Л\ИКРОБИОЛОГИИ

э

- СЧ|

На правах рукописи УДК 577.152

ИРМАТОВ Л Л ИМ ИРИСМАТОВИЧ

СТАБИЛИЗАЦИЯ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КИСЛЫХ ПРОТЕИНАЗ В СЛОЖНЫХ СУБСТРАТНЫХ СМЕСЯХ

03.00.23 — биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ташкент — 1997

Работа выполнена на кафедре биотехнологии биолого-почвенного факультета Ташкентского Государственного Университета.

Научный консультант — доктор биологических наук,

профессор М. М. Рахимов. Научный руководитель — кандидат биологических наук

X. Т. Хасанов.

Официальные оппоненты — доктор биологических наук,

профессор Бабаев Т. О.

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Ахмедова 3. Р.

Ведущее учреждение Институт биоорганической хи-

мии им. А. С. Садыкова AM РУз.

Защита диссертации состоится «lh » dt-tyTafy.± 1997 г. в ч. на заседании Специализированного Совета Д.015.02.01 по защите диссертации на соискание ученой степени доктора наук при Институте микробиологии АН РУз по адресу: 700128, Ташкент—128, ул. А. Кадыри, 7 6. Fax. 3712 (417129).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии АН РУз.

Автореферат разослан «ЛЗ » CjJliy¿у си 1997 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета

доктор биологических наук ХОДЖИБАЕВА С. М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Протеолитические ферменты нашли яиро-кое применение в различных отраслях производства. К числу пр-:медленно важных ферментов относятся и кислые протеиназн. Использование этих ферментов в конкретных технологических процессах по:«аза-ло, что эффективность их действия в системах со сложными субстратными смесями, с которыми приходится иметь дело в производственных условиях, гораздо ниже, чем это следовало бы ожиде.ть из результатов модельных опытов. Одной из причин этого является денатурация ферментов при жестких температурных условиях, а таюАе под влиянием различных компонентов, входящих в состав сложной субстратной среды. Многокомпонентное^ природных субстратом приводит к тому, что применяемые фермелты теряют свое актипность из-за взаимодействия с различными компонентами обрабатываемого сырья. Эти процессы ускоряются при повышении температуры При этом не только растворимые компоненты, но и нерастворимые Iкомпоненты обрабатываемого сырья, играя роль твердой фазы, могут взаимодействовать с определенными группа.«! белка и придавать ферменту ¡информационную неустойчивость. Как показали исследования последних лет, многие из этих трудностей могут быть преодолены. При этом кз передний план выходит проблема регуляции активности и стабильности ферментов в сложных субстратной смесях. В силу этого актуальной проблемой является разработка эффективных путей стабилизации и применения фэрмэнтоз в конкретных технологических процессах. Иммшо изучению каталитических свойств кислых протоиназ в гетерогенных системах и регуляции их' активности и стабильности а сложных субстратам смесях посвяцеиа настоящая работа.

Цель работы._Цель исследования - изучение поведения кпешх

протеина? в приграничных слоях вода: твердая фаза и разработка пфкэктш;;:!!;; способов их использования.

Для достижения поставленной цели предстояло решить сл*дущие задачи:

1. М:<угцт?> .';о":.:р6т:пг,ш:г?? и каталитическое есстоягам ккслик прстегогаз в приграничных слоях вода : твердзя фаза.

2. к.:гк-'г.т;у пнг/.кгппацшТ ююяих протеинаэ иа г ранние ф:1:-:.

3. Разработать эффективные способli применения кислых протеи-

наз.

Научная новизна: В результате проведанной работы определены основные закономерности инактивации и стабилизации кислых протеи-наз в приграничных слоях вода : твердая фаза. Показано, что эффекты инактивации и стабилизации в значительной степени определяются поверхностными группами нерастворимой фазы и адсорбционной способностью ферментов. Впервые показано, что можно регулировать значения каталитической константы реакции и константы Михаэлиса, т.е. таким образом можно осуществлять регуляцию каталитических свойств кислых протеиназ в системах с твёрдыми фазами, а также в сложных субстратных смесях. Установлено, что эффект стабилизации в присутствии твердой фазы в значительной степени связан с явлением концентрирования субстрата и фермента на границе раздела фаз.

Практическая значимость работы: Разработанный биотехнологический подход позволяет проводить технологические процессы при более высокой температуре, с более высокой скоростью и при меньших количествах ферментных препаратов, что значительно повышает эффективность использования ферментных препаратов. В частности, предложенный способ регуляции адсорбционных и каталитически-; свойств 1шслих протеиназ в гетерогенных системах мо:г.ет найти применение для оптимизации процессов ферментативной сбработга растительных масел, а такие прп производстве белковых гидролкзатоз.

Результаты исследований волгли в учебные пособия по практически занлткш,; для студентов спецкурс "Инженерна! энзи^олсгил". Диссертационная работа выполнялась в плане научно-исследовательских работ лаборатории биотехнологии ТааГУ, по теме: "Использование достижении ферментативного катализа в технологии получеши новых водов жировой продукции на основе кироз естественного происхождении" (Госрегистрация N 01910000524).

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы.

Работа изложена на 123 страницах машинописного текста, гл-люстрирована 20 рисунками, 4 таблицами. Список цитированной литературы включает 140 наименований.

Публикации и апробация работ»: По теые диссертационной работы опубликовано 8 работ.

Методика. В работе использовали кислые протеинази, продуцируемые микроорганизмами Asp. asvafiori и Asp. oryzae и дополнительно очищенные путем Сисспецифической хроматографии (Хасакоз Х.Т, 1S83), а такие пепсин ("Merck", Германия).

В качестве твердой {азы испортьзовали К),!- и ДЭАЭ-цвдгялозы (Реахим), сорсллея - сспошзлер тере&тазевой кислоты с этиленгли-колем (Еисозя технслопгчесьзя скола, Прага).

Пратоодитическуи активность измеряли согласно додпЗтадерован-псму метолу Аисона, используя а 'сачестзе субстрата бычий снйоро-точкый альбумин (БСА).

Влглнле твердых и дзпптугнр^л^и агентов изучали следуп-с'разсч: к рвстесру {?г:м?н?а в 0,2 М уииверсзльнсм Cyg-eps до-Сздлкп годные р.»зтг-орн д^""тур:фу:сг;;х г.ге.чгсв ч разлпчп',':; rai, плку'::р-05:аз:! к точзлп? -1-5 :--гглут при 27 а зат^м дс j ^.'п*'! разтг.ср ГС А в 0,1 ;.! буфере с нуг'нгл рН. C;:?n-t-

гп-г-'Г"! ссглг.сга гзтодкне с"р?делен::п агеасростл.

¿ергшез изучали в на'^/ОацнолноА среде, содегязгдеЯ 0,27-0,GO ед/кл активности (а отдельных случаях х> ср?-П-з присутствовали дополнительно сорбенты, • этанол, жирпыэ шгелоты ii детергенты) и при температуре 37°, 45°, 50° и Е5 °С s С, 1 М универсальном буфере. Активности ферментов измеряли при 37 °С в 0,1 М буфере-; рН 2,3, ссдерлащгм 0,027-0,030 ед/нл активности и IX раствор БСА.

РЕЗУЛЬТАТЫ И 3!Х ОБСУЖДЕНИЕ

1. Адсорбционное и каталитическое состояние пепсина ¡1 кислых протеиназ в приграничных сдоях вода : твердан фаза.

В гетерогенных системах когда ферментативная реакция протекает на границе раздела фаз или в сложных субстратных е*:ес»х, где гетерогенность определяется многоксмпонентностью систе: ссдер-язпрй растворимые и нерастворимые' соединения, определенных ч^ст^ ферментов в среде находятся в связанно! состоянии на поверхнос я; нерветворитй фазы. При ятем Фггме-нты могут быть адсорбированы 1!с;г,рр:'чп0'1 ч суС-тур-ягт* «<-к-и с:от слсцп'япйских br-.'ct.iojjuiv.; -

вий, так и за счёт ионных ши гидрофобных взаимодействии с определенными rpynnai.fi! нерастворимой фазы. Кинетические закономерности та-лх систем, конечно, сильно отличается от тех, что наблюдаются в гомогенном растворе.

Обычно адсорбционная иммобилизация ферментов ка нерастворимых носителях сопровождается для большинства ферментов повышением их стабильности к факторам среды и изменением их каталитических свойств. Однако, эта закономерность не является общей: известны • случаи, когда адсорбция приводит к дестабилизации, хотя такие случаи достаточно редки.

На рис Л. показаны одсорбционные состояния кислых протеиназ и пенсика в растворе, когда в инкубационной среде присутствует твердая фаза-сорсилен. Из представленных данных видно, что за сч&1 адсорбционной иммобилизации содержание обчей активности кислых протеииаэ в растворе умеш-.саэтся, (после отделения сорбента цаитрг^угифов^зазаы) Т.е. ш »¡обладаем сшкение каталитической сюсобшсти нротеаэ. Лр>) этом, экспериментально показано, что эвдадхешшз ч-ьсть &ер«ентов находится в адсорбированное ссс«оя-шш из погерхиости сорсилева. Эго снижение особенно замгткэ яри киэк!з>; кокц-знтрацплх ферментов, когда адсорбция Солка ?:б.лл-полной. Пру этом ферменты из различны;: источников несколы» рал-личаэгся ыа«ду собой, хотя обшдп закоиошрность хорса:э иросвэлд-вается. Видно, что в наибольшей степени, снижение активности при адсорбции наблюдается в случае пепсина по сравнению с кислы;«! протеззами из Asp. awsnori и Asp. oryzae (рис.1, кривые 1 и 2). При концентрациях пепсина ниже 2 мг/мл в растворе практически протеолиза не происходит из-за полней адсорбции фермента при этих концентрациях белка активность пепсина в растворе после добавление сорсилена практически не обнаруживается. Адсор&цноннал емкость сорсилена по отношении к кислой протепказе из Asp. згжо: i меньше- и насыщение сорбента ферментом происходит при меньшей концентрации фермента (1 мг/мд). В случае кислой поотеплзш я? Asp. oryzae независимо от концентрации фермента только определенна^ часть фермента находится в адсорбированном состоянии. Кятояити-ческие способности адсорбированных кислых nrwnv.' гопк Так, пепсин сохраняет ляп» всего 7-8\ а'киоиг. 1~ь -лг-:

I 2 ü I -2 О I Концентрация фзрманта, в мг/ш.

1,0

и, а

0 3D (iL! 31) U Iii SO 4:5 ЬО О 30 60 90 ЗЬзмч пикубанда, в мин.

. РнсЛ Влияние ссрсилгаа из активность и стабильнее»

твёрдыми фазами (ссрелзеном) в зависимости от кск-цектрпцпи Фгрывйтг. а - клелая протекназз та Asp. огугае б - кислая протеиназа из Asp. awamori в - пгп-скн, 1 - Сйцза активность до добавления сорсагена , г - обс;зя активность после добавления ссреолена. Среда: 0,1 М буфер, pH 2,3, температура 37 °С.

- о -

• протеинаэа из Asp. awamori и Asp. oryzae 0,8-1,2 и 2,6-3%.

Добавление твердых фаз в инкубационную среду сопровождается изменениями в скорости протеолиза (активности), но при атом также наблюдаются существенные изменения в стабильности ферментов.

На рис.1, представлена иллюстрация влияния твёрдых фаз на каталитические свойства изучаемых ферментов. Сорсилен в наибольшей степени вызывает инактивацию пепсина (в течение 30 мин при 37 °С в присутствии сорсидена пепсин теряет 7БХ активности) Аналогично ведут себя кислые протеиназы из Asp. awamori и Asp. oryzae (они теряют 73% и Z4Z активности, соответственно).

Таким образом, нами экспериментально показано, что на определенных поверхностях ( в наших опытах - поверхность сорсилена) происходит не только снижение каталитической способности, что само по себе, снижает технологичность биокатализаторов, но наблюдается дестабилизация ферментов.

Результаты экспериментов, описанных выше, были получены в условиях, когда сорбции подвергались ферменты в отсутствие субстратов. Вместе с тем, в реальных технологических системах всегда присутствуют соединения, которые расщепляются кислыми протеиназа-. ми. Влияние таких соединений может быть самым'различным. Поэтому нами были проведены модельные опыты, в которых поверхность твердой фазы была предварительно покрыта альбумином. При этом предполагалось изучить вопрос о том, может ли субстрат предотвращать дестабилизирующий эффект твердой фазы. Предпосылками этому выступили две причины: с одной стороны, альбумин предохраняет активный центр фермента от неспецифических взаимодействий, а с другой, может блокировать те участки сорбента, которые приводят к конформа-ционно нестабильному состоянию кислых протеиназ.

Действительно, сорсилен импрегкированный альбумином обладает меньшим дестабилизирующим эффектом. Так, например, б случае кислой протеиназы из Asp. oryzae дестабилизирующш эффект сорсилена уменыаается почти в два раза (рис 1г, кривая 4), а в случае пепсина и кислой протеиназы из Asp. av;amori она незначит«лььо повышает стабильность (рис 1д,е, кривая 4).

Таким образом, в случае, когда сорсилен импрэгкнрсзан альбумином, только некоторая часть фермента связывается с суботратои, а значительна:-* часть ферментов, все ке, адсорбируется га поверхности сорсилг-па, но св»?чваясь с субстратом, в резу.-ил -wro

дестабилизирующий эффект сорсилена остаётся доминирующим. В наибольшей степени этот эффект проявляется в случае пепсина и в наименьшей степени в случае кислой протеиназы из Asp. awamori. Дестабилизирующий эффект характерен не только для сорсилена. Такие не эффекты сказывают сорбенты других типов! например, ДЭАЭ- и КМ-целлюлозы. Как известно, в кислых средах связи, образ/еыыэ белками с такими сорбентами очень слабые. Но, несмотря на это, в присутствии указанных сорбентов в среде значительно снижаются стабильность кислых протеиназ. Это видно на примере пепсина (рис.2). Так под влиянием температуры стабильность пепсина и присутствие КМ- и ДЭАЭ-целлюлоз меняется. Из представленных данних видно, что в присутствии указанных сорбентов она значительно уменьшается. Так например, при 37 °С в присутствии КМ-целлюлозы за 60 минут инкубации пепсин теряет 40-42% активности, а в присутствии ДЗАЭ-целлюлозы - 60-62*. В отсутствие этих сорбентов пепсин за это же время теряет всего лишь 12-145 от первоначальной активности. С повыиением температуры дестабилизирую:?!:! с!*фект сорбентов увеличивается. Использование ДЭАЭ- и КМ-цеддолосы, ша-регннроззнных альбумином, приводит к сняиш дестабилизирующих эф- ■ фектов.

На основании проведенных исследований, можно считать, что инактивация кислых проте!шаз в сложных системах может протекать г.омшо известных механизмов за счёт поверхностной денатурации, на поверхностях твердой фазы разЛтчны): типов, как незаряженных (сор-силен), так.и имеющих поверхностные заряды обоих типов (ДЭАЭ и ЮЛ- целлюлозы).

2. Регуляция активности и стабильности кислых протеиназ в системах с твердыми фазами.

Адсорбционное состояние и активность кислых протеиназ зависит от факторов среды. ' Б реальных технологических средах имеются определенные ¡сомпоненты, способные в значительной степени влиять на активность и степень лабильности ферментов. Среди т-•:•::< компонентов чаце всего выступают спирты, органические кисло1::-.', высокие концентрации солей, • псвыпенное содержание поверхностно- .-v;?;:-!"к в.-щоств и др. Изучение таких систем является сложным. Поэтому ш обратилiicii к молздътчд сястсшм. Прасо>'очност1, изученных зиэтш.,

Бремя, В ИЕ н.

Рис. 2. Влияние различных сорбентов на стабильность пепсина.

а - в отсутствие сорбентов, б - в присутствии КЩ, в - в присутствия ДЗАЭ-Ц. 1,2,3 и 4 - при температуре о7, 4а, 50 п 5о°С, соответственно.

мерностей были проверены в конкретном технологическом процессе рафинации хлопкового масла. Ниже представлены результаты модельных спытсз - действии различных соединении на эффективность юта-литического действия кислых протеиназ.

2.1. Влияние этанола на стабильность кислых протеиназ.

Удельные активности кислых протеиназ снижается в присутствии этанола. Снижение каталитической' активности фермента в водно- спиртовых растворах сопровождается также умэнькением устойчивости к действиям высоких температур. Tai, например, при &0°С в

0.1 Н универсальном буфере рН 2,3 арен;ч полуинективации кислой протеиназы из Asp. sssnóri в отсутствии этанола составляли 120 мин, а в присутствии 15* этанола всего 10 шш. Из испытанны« фэр-«ептов более устойчягку в всдногспиртовых pactcopas оказался пепсин, менее устойчивыми - кислые протеиадзы исследуемых микроорганизмов. В случае пепсина при низких температурах (ниже 50 °С) п водно-спиртовых средах термостгбихьность даче zuccm по срашенкэ с водно-буферной средой. Ts-ч наттри^ер, при 455 °С яремя полуинак-тивацпи пепсина при рН 2,3 составляет ICG минут, а в 15 об/.; этаноле за ICO мшут глП'губагтг,! crscresno активности фэрмгнта но иа5-аазаятся. При более васекгс: температур!«, напримзр, Б5 °С константы инактивщии пзпсянз а водЦо-спиртовых средах было равна

1,Б-1х10"г мшГ1, а годных растворах 1,11н10"г ияГ1, т.е. стабильность Такие снюалзсь.

Следует. отметить, что кнзктизацкя спиртом окаэкзэла неодинаковое влнятга на icsaetCTecraie константы пепсина и ккслон протеи-пази из Asp. £v?a~:cri. Згэдение а ср>еду различных концентрации этаколз в случае пепсина снижает величину. Утх» что естественно сказывается нз скорость процесса. Ухудпэние протекания реакции в случае кислой протеиназы из Asp. aifamori, напротив, связана с из-нзнекиш сродство фермента и субстрата т.к. в этом случае увеличивается величина Ки.

Изменен!» состава среды в системах с твердыми фазами-.может влиять к.-- на здсорЗцкояное так и на конфсрмационкое состояние фермента.

Как уже было показано, сорсилен, ДЭАЭ и КМ-целлвлоза способны адсорбировать кислые протбиназы из водного раствора и такая, абсорбция сопровождается уменьшением термостабильности ферментов.

Мокло одидать, что добавление этанола в среду с одной стороны могло приводить к десорбции фермента, а с другой, если пепсин прочно адсорбирован, к изменению кокформационно стабильного состояния адсорбированных ферментов. В итоге это обязательно должно сказываться на каталитических свойства;', ферментов. Действительно, как следует ' из результатов представленных ка рис 3, это хоросо подтверждается экспериментально.

В случае когда в качества твердой фазы использовали ДЗАЭ- и КМ-целлюлозы добавление этанола привод!1ло к десорбции пепсина, которая сопровождалась, как. и - следовало ожидать из предыдущих экспериментов,' уменьшением дестабилизирующего эффекта твердой фазы (рис 3). При использовании сорсидепа, напротив, пепсин довольно прочно адсорбирован на поверхности адсорбента и этанол не вызывает- десорбцию ферментов. Поэтому стабильность их в адсорбированном состоянии-практически не изменяется в присутствии этанола.

При испьгганш1 кислой протеипазы из Asp. sv<snori в тех.гш системах получена совсем иная картина. В отсутствие сорсилека с повышением концентрации этанола в указалиих условиях стабильность кислой протеиназы резко падает (рис 4а). Как было показано, в присутствии ссрсилена и сораиена 1щпрегнпроЕа;;иого альОуыкноы в водно-буферных растворах стабильность глслой протеиназы была низка. Так, например, без сорсклека в отсутствие этанола в течение 100 ии кислая прот'еиназа теряет исего 7-102 от обцэй активности, а в присутствии сорсшенз за 10 шш теряет Б02 активности (рис 4). Добавление в сроду этанола приводит к повышении стабильности ферментов в укззалаых условиях. Найадаеьай эффект стабилизации зависит от концентрации этанола к с его повышением время полуи-нактивацли кислых протекказ увеличивается. Л;? представленных данных видно, что стабильность кислой протеиназы из Asp. s.&T,ori при концентрации этанола Б,10,1Б и 20 ой~. составляет 160; ВО; 25. и 10 ы;:к, а в присутствии сорсилена 10,60,130 и 190 мин, соответственно (рис.45,). А в присутствии сорсилена шпрегнироаанного амьйу-шшом в среде содержащего БХ этанола время яелуинактивации ссй££ тавляет 60 мин, а при 10-20% фермент приобретает довольно стабильное состояние (рис.4в)..

Эффект стабилизации в случае кислой протеиназы из Asp. awa-vi.ori наблюдается при 37-42 °с. Здесь эффект стабилизации, по-видимому, достигается, во-первых, за счёт положительного влияния

- 13 -

А/А0 Л/ Aq

20 60 100 20 60 100

Вуеагс инкубации, n tenu

Рис.3. ПнактиЕзция пепсина з системах с адсорбентами.

а - КМЦ, б - ДЗАЭ-Ц, 1 - без добавок, 2 - 0,1 M NaCl, 3 - этанол, 15 обХ, 4 - то .т.е. что и 3, но тапрегкиро-ван альбумином.

Рис 4. Влияние этанола нз инактивацию кислой протеина?!! из Asp. asvancri в различных системах, а - в отсутствие твердой фазы, б - сорсилен в - сорсилен, импрегккреванньш альбумином 1 - контроль, 2-5 - концентрация этанола - 5,10,15 и 20 гб% этанола, соответственно.

этанола конформационно стабильного состояния фермента предохраняющую его от поверхностной денатурации, а во-вторых, за счёт защитного аффекта альбумина в приграничных слоях вода : твердая фаза стабильность фермента растйт ещё в большей степени. Если этанол способствовал бы десорбции кислой протеиназы с поверхности сорбента, тогда . кислая протеиназа должна была бы претерпевать сильную инактивацию. В случае пепсина, такое явление не обнаружено, так как взаимодействие пепсина с сорспленом настолько прочно, что даже при содержании этанола 20-25 об% не происходит его десорбции.

2.2.Влияние ионной силы раствора на стабильность кислых протеиназ.

Известно, что повышение ионной . силы раствора способствует усилению гидрофобных взаимодействий, но ослабляет ионные взаимодействия между ферментом и адсорбентом. Поэтому можно предполагать, что поверхностная денатурация, которая как было выше показано связано с ионными взаимодействиями должно быть чувствительна к концентрации соли. Действительно, коны хлористого натрия сказы-ваат влияние ка стабильность пепсина и кислой протеиназы из Asp. аяапог!. Так например, в система со сорсилэном при концентрации 0,1 Ы HaCl, константа инактивации пепсина составляло 0,05 мшГ1, а в отсутствии HsCl 0,011 «из-1. Аналогичные данные были получены и с ДЭАЭ и КМ-целлюлозаш." Хотя в кислых средах и в присутствии K'aCl вероятность нахождения ферментов в адсорбированном состоянии, с ДЭАЭ и КМ-целишэгой сомнительны, но как показывает экспериментальные данные снижение стабильности в системах с твердыми фазами происходит (рис 3, кривая 2). Причиной этому может быть изменение уровня поверхностной денатурации белкозой молекулы в приграничных слоях вода : твердая фаза.

Кислая протеиназа из Asp. oryzaa в присутствии сорсилена -незначительно снижает стабильность по сравнению с пепсином и кислой протеиназой из Asp. ашпог!. А добавление ионов хлористого натрия снимает дестабилизирующий эффект сорсилена и даке наблюдается повышение стабильности. Например, при концентрации 0,2 М NaCl константа инактивации кислой протеиназы из Asp. oryzae в от-, сутствие сорсилена составляло 0,91xl0"z мин-1, а в присутствии 0,62~z мин"1.

Таким образом, в отдельных случаях возможно с помощью ионной силы раствора (хлористого натрия) регулировать стабильность кис-

- 15çr

лых протеинаэ в гетерогенных системах с твердыми фазами.

2.3. Влияние различных детергентов на адсорбционное состояние 1'пслых протеинаэ.

Различные детергенты оказываэт значительное влияние на активность ферментов, действуй^ ira границ® радела фаз - чаще как ингибитора, реже как активаторы, 3 в некоторых случаях вез них ферментативный процесс невозможен (например, а случае ■ некоторых липаз, фосфолйпзз Аг, С и D).

Для исследуешх нами ферыеитов детергенты проявляли пнакти-вируюцее действие. . При этом природа детергентов не Играла зй.шт-ной роли - инактивацию еызыззля различные детергенты; катиояяой (aeTiiaTpiajsTHaa-aíoiníñ бромистый), гняшкоЛ (DDS-fîa) и нейтральной природы (тритон Х-100). В качестве ерггмзрз гтрт»-сг;гч данные для пепсина. Тек, термостабиль кость аеяейяз гадглз а прйсутствзт пе-рочкелешшх дэтгргеитов. Напбстаггй ràrsttxërysi^S c*$skt s ука-зазжи условиях ояазивал ЦТМАВ, Пр.ч рЯ 2,0 а 0,1 Я универсальном Oyjspe п температуре 37 °С ерзкз казугагжэегда пепскяа в присутствии ЦТМАБ составило 10 мгл (рис 53, иртгггя 4).

Из предстйззегспл дгзия ::а prie G ггдпо, что • с по^тапием ¡кнщентрация тритона X-10D з системе с сорсплэгтса агстпвгость пеп-екза угелкчпзгзтеа з 3-4 раза, т.е. фермент з citera» нахо-

дится з дессрбг.ровалпсм состоянии я поэтому впсстапазлтаэзтся его исходная удельная активность. При этом гссстаяозяггаавтся тагае его иопформацяонпо стабильное состояние. Из представленных дгзпмх на рис 86, кривая 2 видно, что за 50 ttini пнкубеция в указанных условиях пепсин теряет всего 20S своей первоначальной активности и эти данные совпадает с результатами, полученными при оценке стабильности пепсина водно-буферных средах (рис 2в, кривая 1). Аналогичные данныз получены и в случае, когда s качества ферментов использовали кислую протеиназу из Asp.awsfflori п Аар.сгугзе.

Таким образом, в отдельных случаях для регуляции адсорбцион-irbcí способностей и стабильности пепсина и кислых протеинаэ, в сложных системах с твердыми фазами могут быть использованы детергенты, в основном, для предотвращения ферментов от поверхностной денатурации.

о . 4о во о ' ао

Время инкубаци^, в мин.

Рис.5. Влияние детергентов на инактивации пепсина (а) и влияние сорсилена (б). ' 1 - контроль, 2 - тритон Х-100 (0,2%), 3 - ДЦС-Ыа (0,2 мг/мл), 4 - ЦТМАЕ (0,2 мг/ш).

0,1 0»2

Рис 6. Активирующее действие тритона Х-100'в присутствии тЕердой фазы (сорсилен) а - водная среда (Ао = 314 ед/г), б- еодно-спиртовая среда (а0 = 256 ед/г). 1 -контроль, 2 - сорсилен. (ас = 79 ед/г А0 = 52'ед/г)

- 17e-

3. Факторы снидгиг^яе активность и стабильноеть кислых протеи-наз в система-; вода: масло и пути их преодоления.

Влияние дирных кислот на стабильность кислых протеияаэ.

Инзктивкрущм и дестабклизвруягцм эффектами из кислые про-теиназн обладали тшие жирные кислоты. Тал, например, в течение 20 мин инкубации (БО °С, рН 2,3) в присутствии О,Б" валериановой кислоты кислая протепнага из Asp.siamori теряла БО" своей активности, в то ке время как в отсутствии валериановой кислоты активность фермента за это яе время снижалась лишь на 8Х. Показано, что по мере увелечения длины углеводородной части жирных кислот, иягябпруявдй и дзстгбгаязирукйзтй эффекты этих соединений усилива-птсп. Сами кнслпе протепнага 1акже различается по своей чувствительности к зиряш квйлотан. Так, в случае пепскяз Ира той д» гапцзптргч?п1 г'агзрггппст-'о:"! п::слоти, акггсшасть сгаслгзсь значительно (S5S), но дестгбплязпрутп^й не был заметкам.

Сютение стабильности кпслих протелязэ в присутствии .тгрннх кислот зпвисело от рН сргди и 5п-:ело о х±ь при ютлйх зигле-ппзгс рН ср?ды. При нейтральных и слаЗс!с::сл:д значениях рИ среда, напротив, в прясутсткаг хзриих кяслог нзблгпдало'сь .стсбпхя&гцга кислой пр0т?г.кз?н. При 8тсм ккгстглггз '¿.?.|й!1??2ц;г? при pll 0,0 для кислой протекаа-ш ,\зр. г."'гг.аг1 рааяа 8,6xl0~2 isia"*, а в'прксутс-тз:я1 кааряпсзсй гсюяла" (2 мг/t«, ' 301 этавоае) 3,?х10~г мин'1.

БОЛ«Э ЗСНТГПОЭ ДдЯзТВКЭ КИСЛО*' 1?&б.П:Д2Л0СЬ В СЛУЧЗЭ Й'КГСЯ-

на' j: кяслсй пратгжаги кз Агр.огуггэ. дет ипслой прото- '

гяаг:! из Лгр.огупаэ каксггяга яра рН 5,0 в отсутстпип

каргах жегся составила 9,3si0"2 iiraf1, а а прпсутотвго? 2,0х10"2 15Ш*1. Для пепсггпз в стсутсхззт яирисй кксйотн ncnctsnta шзяти-вацяи пргр'глаш 0,0 мпГ1, а я пр:тсутспгч г^рясй ппслотЦ она менялось в 4 раза (0,15 я:я~1). Апагоггг-йптэ розультати гслучепы и при рн 7,0. ГГредстапляя эти дсшо, сггдует отметить, что, если ьк-эсто лирной гсмлота кспольгойггь гзжд глфноЛ кисло*«, тогда аффект стабилизация кислой проте'йпзгй .nJ?H слсбйййлйх значениях рН среды пе наблюдается, что свидетельствует о ватной роли карбшс-сильпсй группы ингибитора для тагктизгцва ф&рчййта.

Следует отметить, что икгибйруйдяй аффект йнрнйх кислот проявляется в том случае, когда они находятся в растворимом состоя-

шш. Как известно, растворимость жирных кислот уменьшается с по-вышенпем длины гидрофобного хвоста и поэтому при исследовании пальмитиновой, миристиновок и стеариновой кислот сношение стабильности в реакционной среде (содержащей до 30 06Z этанола) не наблюдалось ингибирущего аффекта этих жирных кислот.

3-2. Влияние нейтральных липидов ка стабильность кислых протеинаэ.

При гидратации хлопкового масла ферментные препараты находятся в приграничных слоях ¿ода:масло. Адсорбция кислых протеинаэ на лнпиднш поверхностях также влияет на их каталитические свойства. v

Влияние нейтральных дипидов на некоторые свойства кислых протеинаэ изучали в двух системах. В первом случае исследовали влияние эмульгированного в 1%-ком растворе тритона Х-100 хлопкового масла на активность к стабильность кислых протеинаэ. Во-вто-ро.м случаз изучали каталитическое состояние кислых протеинаэ адсорбированных из сорбента;; покрытыми дкпидана.

Проведенный исследования показали, что эмульгированные тритоном Х-100 нейтральные лкпвды существенного влияния на активность и стабиль кость кислых протеинаэ но оказывает. Это не означает, что дла данного фермента 'лшщды нэ оказывали' влияния н<г. ка-гавитнческме евойстяа. В гекнх системах используемый детергент для 8мульгмро?£Шке йндаов одновременно препятствует образованна белок-липидиого $га1Шдейст»ин в ие'оказывается на стабш&йость фермента.' Поэтому в дай>кейз;ж акспершсютагс т йсследовали каталитическое it адсорбцяомгоэ состояния кислая протеинаэ па сорбентах покрытых давдзда. В качестве твердой £ззы использовал;: сор-силен.

Проведенные исследования показали, что адсорбированные протекши на липадиих Слоях имели'низкую кьталитичоску» активность и стабильность. Наиболее'.сшако яяактйвиру&зкЯ и дестабилизирующей эффекты проявлялись в случае пепсина.

Адсорбирование кислые протеиназы из Asp.awarori и Asp.oryzae ка лгащных слоях, хотя и щели низку» каталитическую активность, но существенного влияния адсорбции на стабильность* ко было обнаружено. В водно-спиртовых средах оказалось возможным восстановить стабильность и активность кислых протеинаэ'.

Суммируя вышеизложенное, можно,сделать заключение, что в

сложных гетерогенных системах при соблюдении соответствующих условий можно значительно повысить эффективность ферментативных процессов. При этом удаётся существенно увеличить активность ферментов за счёт уменьшения влияния ингибирущих факторов, а самое главное, повысить стабильность ферментов, в результате чего ката-лптический процесс можно осуществлять более эффективно. При этом, при правильном подборе природы поверхностных групп твердой фазы биотехнологический процесс можно проводить более длительно и при более высокой температуре.

Таким образом, нами впервые рассмотрены основные закономерности поведения кислых протеиназ в гетерогенных системах, содержала твердые фазы и найдены оптимальные условия проведения ферментативных реакций.

3.3.Использование кислых протеиназ при очистке хлопкового масла.

При производстве растительного масла одним из наиболее ответственных технологических процессов является рафинация масла. Содержащиеся в масле различные биополимеры, в том числе гидрофобные белки, создант диффузионную область на границе раздела масло-вода, что значительно препятствует процессу рафинации. Известны многочисленные пути очистки растительных масел, которые можно разделить на физические (отстаивание, центрифугирование и фильтрация), физико-химические (адсорбционная рафинация, дезодорация и дистилляция, рафинация при помощи селективных растворителей, гидратация) и химические методы (сернокислотная рафинация, отделение госсипола, щелочная рафинация и др).

Нами были показана возможность использования кислых протеаз для гидролиза белков хлопкового масла.

Как было показано выше, в приграничных слоях вода:масло, а также в присутствии в среде различных органических соединений кислые протеиназы претерпевают поверхностную инактивацию и дестабилизацию. Для предотвращения отрицательных эффектов обработку хлопкового масла проводили в водных и водно-спиртовых средах, содержащих кислые протеиназы из различных источников. Р-;?ультаты полученных данных приведены в таблице.

Обработка хлопкового масла кислыми протеиназами в различных системах

Время гидролиза, в мин.

Количество прогндролизованного белка, мкмоль тирозина на 1 г масла

Пепсин (при 37 °С)

Кислая протеиназа из Азр.аиатог! (при 45 °С)

водная среда

водно-спирто-:водная вая среда :среда

водно-спиртовая среда

0 0 0 0 О

30 0,02 0,045 0,035 (0,47) 0,090 (0,73)*

60 0,043 .0,115 0,066 (0,115) 0,152 (0,154)

90 0,063 0,15?,- 0,075 (0,124) 0,160 (0,173)

120 0,082 ■ 0,212 ' 0,080 (0,143) 0,182 (0,199)

- В скобках указаны результаты полученные с кислой прогеинаэы Аар.огугае

Условия: 0,1 К) универсальный буфер, рН 2,3. Содержание этанола в водной фазе 15 об7.. Соотнесение масло: вода 1:1.

Технологический узел рафинирования хлопкоеого масла с применением кислых протеиназ.

1 - приемная емкость для черного хлопкового масла, 2 - насос, 3- емкость для гидратации, 4 - емкость для подкисленного водно-спиртового растБора, 5 - емкость для ферментного раствора, 6 - центрифуга, 7 - нейтрализатор

Из представленных данных видно, что скорость гидролиза гидрофобных белков в хлопковом масле независимо от источника фермента Бсегда выше в средах, содержащие спирты. Добавление этанола способствует предохранению фермента главным образом от поверхностной дензтурации. Это приводит к повышении информационно стабильного состояния кислых протеиназ э гетерогенных системах и увеличения глубины превращения ферментативных реакций.

Определены оптимальные условия ферментации и состав реакционной- смеси. Показано, что из испытанных ферментов кислая протеина-за из Аэр.огугае является наиболее устойчивой к поверхностной денатурации.

На основании полученных результатов из модельных экспериментов разработан способ повышения эффективности применения кислых протеиназ для ускорения процесса рафинации хлопкового масла. Это было достигнуто за счёт ферментативного расщепления гидрофобных белков, растворимых в маслах и препятствующих рафинация. Применение кислых протеиназ из Агр.огугае для предварительной обработки хлопковых масел способствовало повышения Еыхода рафинированного мяслз и снижению расхода щелочи при нейтрализация.

ВЫВОДЫ

1. Изучены адсорбционные и каталитически*» свойства пепсина и кислых протеиназ из микроорганизмов Азр. аяагюг! и Азр.огугае в приграничных слоях вода:твердая фаза. Показано, что в зависимости от природы поверхностных групп твердой фазы адсорбционная способность и каталитическая активность ферментов различны. Обалрудояэ корреляция между активностью и адсорбционной •-пск'сЗнсстьо пепсина и микробных гаслкх протеиназ в зависимости от природы поверхностных групп твердой фазы.

\ Изучена кинетика ин,активации кислых протеиназ в различных сис-т"»«эк с твердыми фазами, -используя в качестве сорбентов: сор-силен (сополимер тярефталевой кислоты и этиленгликоля), ДЭАЭ и Ш-целлелозь*. а тает.? эти же сорбенты кмпрегнирозанные альбу-!К:иои или летцдом. Показано, что пепсин и кислая протэиказа из Д-р. гг'.'стггт! г'П'-в-. лестг^'гл^.'ирутотся когда в качестве твердой

фазы используют сорсиден и КМ-целлюлозу. Использование сорбентов импрегнированных альбумином значительно сшыает дестабилизирующий эффект твердой фазы и зависит от комплементарности участков ферментной молекулы к поверхностным участкам сорбента или альбумина.

3. Определены факторы регуляции адсорбционных и каталитических свойств пепсина и кислых протеиназ в приграничных слоях ео-да:твердая фаза. Термостабильность кислых протеиназ в зависимости от источника фермента может быть изменена повышением ионной силы раствора, путем введение в среду органических растворителей и различных детергентов. Наблюдаемые эффекты стабилизации зависели от рН среды, концентрации органического растворителя, вида сорбента и природы групп, локализованных на поверхности твердой фазы. Пр1шедены данные, свидетельствуйте о том, что эффект стабилизации в присутствии твердой фазы в значительной степени связаны с явлением концентрирования субстрата и фермента на границе раздела фаз.

4. Изучено влияние жирных гаслот и нейтральных дипидов на активность и стабиль кость кислых протеиназ Азр. аналог х и Агр.огугао и пепсина. Показачо, что по мере увеличения длины углеводородной части жирных кислот ингибирущнй и дестабилизируйся.! эффект жирных Кислот повышается. Дестабилизирующее эффекты нейтральных Л5шидов сильнее проявляются в случае пепсина, а касгш протеиназы микроорганизмов Солее стабильны, котя пк уде^ьнел активность снижается.

й. Разработан эффективный способ применения кислых протеиназ при переработке многокомпонентного сырья, в процесса рафинации хлопкового масла.

6. Показано, что путем подбора твёрдых фаз можно проводить биотехнологический процесс более длительно и при более высокой температуре.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Хасанов Х.Т., Ирматов А.И. Стабилизирующие и инак-гивирущие эффекты разл1!чных сорбентов при -очистке кислых протеи-

наэ.//I'/-Республиканская научно-теорет конф. молодых ученых и специалистов микробкол. "Биология, культивирования и биотехнология микроорганизмов" Тезисы докл. Ташкент, 24-25 мая 1999, с. 4g.

2. Хасачов К.Т., Ирматов Л.И., Дбдуллаевз Ф.Н. Повышение эффективности действия ферментов при производстве белковых гидроли-зэтов. //Тезисы докл. П-Всесоюзн. кокф. "Катализ и каталитические процессы химфзрмпроизводств", Москва, 1989, 15-15 ноябрь, ч, 2, с.16-18.

3. Ирматов А.И. Стабилизирующие и инактивирущие эффекты различных сорбентов при очистке кислых протеиназ.//Актуальные вопросы физиологии, бис'имии и биотехнологии. Сборник научных трудов ТашГУ, Ташкент 1990, -с.15-20.

1. Хясякоэ X.Т., Ахмэдноджяев Д., Ирматов А.Ч., Сзгатога O.A. Стабилизация лкпаз и кислых протеиназ з пригрпппчннх слоях вода: трерлая фага. '/Т«??исн докл. VII Рсесс>?Рсго сдал. "Иетенер-

'л^г-гу'1 чоп'.я". г. i/оскрз, "'.''^^ть 1901. о.

■; Ki-.-r--T'0" 'rh.T., AkTr.vihcri.-^v д. "h., Irrstov A.I., Srcratow г.л. rt.ibilJzatlon of lipases rr.d '<cid proteases at the liqu-¡'"i'rrlM ;:.' ! •>"•• // Г1;?,!"!'" Вк'лп & Biotechnology. -

11. - V.l. ЕУЯ. - p.p.',.

/.чт>«оь .'".т., Лряпхов А.Ч., 'Э.А. Регуляция адссрб-

зяслшык и кзгаяилгсоскпх <*т"гтз некоторых протеиназ в системах с твердыми фазами.//Тезипч догл. науч.конф. ТатГУ "Современные прейяемн Сголлиги зтгогля". Ташкент. -1995. 18-18 •1ч-г>г--л;. С. 104.

*. Чрапст. Л.И.. Хп'-глс-з X. Т. Ferrum каталитических свойств гт-отеинч? в гетерогенных скстеичх./Ah.Улугбек номидагн u-яТ/ -ж олгмлрри га щтидорлп та!збаазрапгнг ил>чш маколалари тучл&т. тохк53г, 1997 й. !! 1, 95-S3 б.

" йрмзтоа а."., Ху-сзков X,Т. Регуляция каталитических свойств протё-ян.тэ р гетерогенных скстсмах.//"Оргачпзм^аги модда -•. ' ."Л'^ун:; дера^нлг-г.нга физик ва кимовий омилларзгпкнг таюи-,•;•'*. пл;.т,й а мумач мзт^-^-тугарл. 2 кпсм, Аядчяон. 1997

- 24 -

KJ1CJIDTAM .».üOiiTflA TAT£51P STyOTl IPOTB1HA3AJIAPHJ1 M/PAKKAE CYECTPATJIH APAJIAIli.tAJIAPflA EAPKAPÖPJIAIIITHPII121 BA KiUIATJlUI HpuaioB Ajwm HpiicMaTOBiw KMCKA^A M A 3 M y H

Asp.aj'fasrcri ca Asp.oryzae MiiKpooprajinsMaapimau oaimraa ichc-aoTami Myjpiifla Taiciip OTysuH npoTeHHa3aaapuii Ba nencitHHii hsttiü-, CHpwai cHciewaiapaa Ba EsacH aaj>6yMim Ba jfinj« emaa K^njcatiran copöeHTüapaa (copcimeH, J53A3- Ba Wi-usamaoaajiapfla) sacopSuiioH Ea rcaTanuTiiK xycyci;aTJiap;:ii!i jterapiEHi yprauimraH. F^tikk, cnpT losacii-aarn rpynnaaapEit xmiHBi'u TaSitaTitra Kapaö ^spweuTaapuE 6apv;apop-zjinniii KecKHH Kaiiaicani Ba Cy Kypcamw iepueHTim TypJira eoFünsvais-ru aiaiivaanraa. Byuaafl cuciewaaspRa iepueiixaapHii aacopCiyioH Ea k&-TaasrniK xycycwaMapiuui ysrapTirpyMi: cmiiLsap Tonmran. Uy>;htiiii ¡:gh kymnm ooaipaS, x;ap xsu cup? skxhb i,:o^a,iap örai opraam opjiryjsya-aap k^ekö, _§3pM£HTzapHH Capnapop-snrj:;»! ysrapTiipssa uyuKuiutarn ea >;np Cup fep:/.9HT yyyii ysnra xoc ei£osr/B sapypajira lrJpcaTJtaraji.

Oaunraa KaTissazep acocii/ia 6Faa;i«i OKpjinjiapaai ;03a2aa tni^a nroTennasa'aPrtaH foä^asaas! K/I.WCHLSITK Ea pses&sa Tcs^rKaa ouapra ycxyöaapjj Esnatsaarsn. Eyuinir HanssaoKsa eraapini ¿ii^Lipza-ii!ci Te3JEi:rü £a nsiiij-jeayjni flapaitacii oejisji, y.a^a VHKi'HfliUiapiii! Ka-uajiKssi Kypcaraxran.

STABILIZATION AHD APPLICATION OF THE ACIDIC PROTEINASES IN THE HETEROGENIC SUBSTRATE MIXTURES

Innatov Alim Irismatovich

Adsorption and catalytic properties of pepsin and acid proteinases from Asp.awamori and Asp.oryzae have been studied in the liquid/solid interface in the presence of sorbents (sorsilen, CUand DEAE-cellulose) coated by albuipin and lipids. It has been shown that in dependence on the type of the solid phase and the nature of the surface groups the acidic protease has occurs sur-

- 29 gj

face inactivaticn and depended cn type acidic proteinases.

The factors of the. influence on adsorption end catalytic properties of acidic proteinase in the systems with solid phases pas studied.

It has been shown that increasing of ionic strength, concentration of organic solvents and detergents can regulate stability and activity acidic proteinases in the heterogenic systems.

On the baseof results the method of protein reStovin» from cotton oil and optimal conditions of the raflnation have been elaborated. It has been shown that in optimal ccnditcn3 the rate of filtration, the degree of clearing and yield of refinated oil increase.