Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование гена металлопротеиназы Bacillus cereus и сравнительный анализ экспрессии ряда клонированных генов металлопротеиназ бацилл

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Клонирование гена металлопротеиназы Bacillus cereus и сравнительный анализ экспрессии ряда клонированных генов металлопротеиназ бацилл"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГГ КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИ1 1Т ТОНКОЙ ХИМИЧЕСКОЙ ТЕХИ'Л'.ГИИ им. И.В.ЛОМОНОСОВА

Специализирован ый совет Д 063.41.01

на правах рукописи

АКИНКИНА Татьяна. Викторовна

КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНА МЕТАЛЛОПРОТЕКНАЗН ВАСИШ СЕ1Ш15 И СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ РЯДА КЛ0НИР0ПАП1ШХ ГЕНОВ ИЕТМЛ0ПР0ТЕИНАЗ БАЦИЛЛ.

( 03.00.23 - биотехнология )

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

АВТОРЕФЕРАТ

Москва - 1992

Работа выполнена в лаборатории белковой инженерии института молекулярной генетики Российской Академии Наук совместно с кафедрой биотехнологии МИТХТ' им.М.В.Ломоносова.

Научные руководители: Доктор химических наук В.И.Ввец кандидат биологических наук Костров C.B.

Официальные оппоненты доктор химических наук Мясоедов 11.Ф. доктор биологических наук Манко С.П.

Ведуцаа организация Институт биоорганической химии им.Иемякина М.М.

Запита диссертации состоится

в часов на заседании специализированного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Московском институте тонкой химической технологии им. И.В.Ломоносова по адресу: 117571.г.Москва,проспект Вернадского,д.Об.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им.М.В.Ломоносова 11983.1 Москва,ул.Малая Пироговская.д.1

Автореферат разослан "_ "¿/Щ6&- 1992г.

Учений секретарь специализированного совета,

кандидат химических наук Л.И.Лтик

»

(

Актуальность теми. „ *

• Одной из актуальны)! проблем современной молекулярной биологии является анализ структурно-функциональных соотношений и выявление, районов последовательности белков, модификация которых приводила бы к изменении физико-химических и/или функциональных свойств молекулы в целом. Одной из удобных экспериментальных моделей являптся секреторные мсыллопротеиназы бацилл -формеиты. интенсивно изучаемые в течение ряда лет и представлявшие также значительный интерес для практики благодаря широкому использовании в микробиологической и пищевой промышленности. При этом наибольшее практическое значение имепт ферменты, сохраняющие активность при повышенных температурах и позволявшие провести оптимизацию ряда технологических процессов. В связи с этим возникает необходимость получения штаммов -продуцентов природных термостабильных протеиназ или повышения термостабильности используемых ферментов методами белковой иняенерии. В последнем случае необходимо предварительное выяснения молекулярных основ термостабильност;: белка. Следует подчеркнуть, что. прояснение механизмов термостабильности на модели мсталлопротеинаэ имеет большое теоретическое значение и выявленные закономерности в дальнейшем могут быть распространены на широкий круг белков.

Одним из наиболее вероятных механизмов. вовлеченных в стабилизации белковых молекул является усиление мевдонешшх взаимодействий. . Как было показано на основе анализа аминокислотных последовательностей рада металлопротси.наз бацилл, наиболее перспективным обьектом для дальнейших исследований в этой направлении является металлопротекназа В.сегбиз. Это определяет актуальность работы по клонировании гена этой металлопротеиназы.

Необходимо отметить, что при секреции реципнентным втзыыоы белка - продукта клонированного гена, особенности секреторных механизмов клеток хозяина могут оказывать значительное влияние на структурно функциональные характеристики синтезируемого белка. Возможно это происходит пследствие нарушений, возникавших в его пространственной организации. Возникновение подобных нарушений наиболее вероятно с случае клонирования' и экспрессии гена термофильного Оелкп в клетках мезофилышго роципиинтного

лтамма. В свази с втиц, изучение особенностей экспрессии в клетках итамыа-реципиента клонированных генов ыеталлопротеиназ с различной терыостабильностьи представляется необходимый для получения штамма-суперпродуцента термостабилышх протеиназ.

Работа по клонирование) гена металлопротеиназы В.сегеиз и изучении особенностей экспрессии ряда клонированных генов ыеталлопротеиназ выполнялась в райках научно-исследовательской программы "Новейшие методы бноннкенерии".

Цель работы.

Цельи данной работы является иммунологическая и физико-химическая характеристика ряда ыеталлопротеиназ бацилл, клонирование гена металлопротеинази В.сегеиг н изучение особенностей экспрессии клонированного гена, а также генов нпр В.аву1а11чиеГас1епз и нпр . В.ЬгеИг в клетках В.зиЫШг.

Научная новизна.

Разработан метод количественной оценки имыунохимического родства металлопютеиназ бацилл,установлена степень антигенной гомологии среди этих ферментов. Проведено клонирование гена нпр В.сегеиз.построена его рестриктная карта. Исследована динамика биосинтеза и накопления металлопротеиназ В.сегеиэ, В.Ьгеу1ь- и В.апу1оЩиеГас1епз - продуктов клонированных генов. Показано, что при экспрессии клонированного в составе плазмидного вектора гена нпр В.Ьгеу1з в клетках В.зиЬМШ происходит секреция малоактивной 'формы фермента.. Его дальнейяая активация осуществляется, по-видимому, вследствие ряда колформационных Перестроек и не сопровождается дополнительным расцеплением или процессингои фермента.

Практическая значимость.

Полученные в работе результаты могут быть использованы для конструирования птаынов-продуцентов металлопротеиназ бацилл и оптимизации условий их внрацивания с целью повышения продукции целевого белка.

Половения выноскиие на защиту.

1. Разработан метод количественной оценки степени антигенной гомологии ыеталлопротеиназ бацилл. Показано,что по сравнению; с

тбрмплиэином протоинапы D.corouC. D.theraononlIquefacionr,

. B.efSyloliquefaciens сохранят около ¿0, 6 и 0,5 % антигенно токологии.соответственно, что подтрс(мдает предлоаеннуп ране схему зволвционного пути этих'фермент а. • •

2.. Клонирован ген нпр D.cereus. Показана возмойность его экспрессии в клетках fl.subtilis п&д конторолем собственного • промотора гена. . а такае дополнительного промотора E[))f03e . локализованного- на векторной ыолекуле.

3.- Показано, что при экспрессии гена нпр B.brevis в клетках B.subtllis происходит секреция малоактивной формы фермента, дальнейшая активация которой осуществляется вследствие ряда конформационных перестроек.

4. Показана возмояность * трансформации •. клеток JJ.cereus плазмидой pUBUO, .получен мутантный втамм D.cereus 1274 с пониаенным уровнем секреторных протеолитических ферментов.

Структура работ». * Диссертация пбктрое'на по стандартному плану и состоит из разделов: "Введение". "Обзор литературы". "Материалы и методы", ■ "Результаты и • обсуаденне". "Выводи", "Список литературы"..

Апробация работы. • . "

Иатериалы работы били' долояенн на всесовзиой конференции "Новейзие методы биоинаенерии" (Пучино,1909,1990 и 1991 г.) и на семинаре лаборатории белковой инженерии ИНГ АН СССР (Иосква 1992г.) • . . • .

МАТЕРИАЛЫ И МЕТ0Д11 ИССЛЕДОВАНИЯ ■

В ' работе использованы «ташш D.subtiljs 2036, Bac.cereus '1274, полученные из коллекции" культур, микроорганизмов ВНИИгенетика.

Плазнида с 'клонированный геном нпр B.aayloliquefaclens ( р 1 Ml [Свг ]) лвбезно предоставлена D. D. Ноыантасом (ВНИИгенетика). Плазыида с клонированныы'геном нпр Bac.brevlsCpTM 201 1Еаг1) и векторная плазыида рСВ22' лябезно предоставлены -сотрудниками . ВНИИгенетика Сорокиным А.В., Болотишш Л.П., Аваковим А.П.. . Казаком В.Э . '

В экспериментах бил использован коммерческий препарат

термолизина (Signa,CSA). .Очищенные металлопротеиыази B.aiylollquefacicas ' и B.theriono'nliquefaciens лвйезно предоставлены сотрудникам^ ВНИИгенетика Климовой O.Û. и Изотовой Я.С. Протеиназа B.brevls получена от. Цабернта H.D. (Институт хим. и биал.физики № ЗССРГ. В качестве препарата нейтральной протеинази Вас.сегеиа использовали культураль^ув «идкость природного > «тайма-продуцента. Содераеише нпр B.cereus. определенное электрофоретичесциц анализом с ■ носледувщим сканированием геля па денситометре "Becknan CDS-20" составляет 162 от суммарного белка едяьтуральной видкости. ' •

Определение протсол'итичеакоД активности ферментов проводили по гидролизу О,!) z азоказеина (Si esa) в 10 u)á ^рис-буфере pli 7.2 в-течении 6(> мин. по«стандартной методике. Ингибиторы протеиназ добавляли о следующих концентрациях: «ЭДТА - 2 мМ. ФМСФ - 1 мИ.

В работе использовани ослиные антитела к иммуноглобулинам кролика, коньвгированние. с пероксидазой хрена (Atershaa. Англия).- Кроличьи антитела к термолиэииу и ' нпр В. aaylollquefaclejis получены от Черновиков Т.В. (ВНИИГенетика).

Для количественного определения степени антигенной гомологии 'металлолротеиназ'бацилл в лунки-'пол^хлорвиниловой панели для иммунологических реакций (Dinatech, CIA) вносили от 0.01 до 100 нг различных металлолротеиназ в 100 мкл 0.2 Ц. боратного ' буфера ' pli 7,2 и инкубировали 12 ч. при 4°. Лупки промывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ) pli 7,2 в присутствии 0.05% Твин-20. после чего в кавдув лунку вносрли по 200 мк'л 27. раствора человеческого сывороточного альбуцииа (ЧСА) в ФСБ и инкубировали 1 ч. при 37°. Раствор ЧСА удаляли,, в лункЪ вносили -по 100 мил кроличьих антител к термолизину либо нпр Bac.aayloliquefaciens в ФСБ S 1 У. ЧСА и. инкубировали 3,5 ч. при 4°. Послё инкубации лунки промывали ФСБ с 0,05% Твин-20. Затем ¿.лунки вносили по 0,3 икг коньюгированных с пероксидазой хрена ослиных антител к иммуноглобулинам кролика в 100 мкл ФСБ с IX ЧСА и инкубировали 1 ч. при 37®. Раствор коньвгата удаляли, лунки промывали 7-10 раз ФСБ с 0,052 Твин-20 и 3-5 раз ФСБ, прсле чего вносили по 200 икл 0,04% раствора о-фенилеИдиамина в 0,15 И цитратном буфере рН 5,0, содериацем 0,006% перекиси водорода. Панель инкубировали 30 мин. при 20° в темноте. Реакции останавливали добавлением в ка«дув лунку 50 мкл 2 li H2S04 и определяли оптическув плотность образцов при длине волны 493 ни. ',

В предварагехыгах эксперимента:' ила проверена сорбц х Сериептсв на стеаках лунок. Доказь >г, что сорбцнонная емкое пдасткяа достаточла для количествен!!.' о удервануя 70-100 нг mil па ядпяд пакеял. ■ .

Два создания банка генов B.cereus выделеннуи по стандартной вгтвдтнтз Вгятериаяъпуп ЛШ! .обрабатывали рестриктазой Sau3A в г?оявгзатея>по подобранных условиях. Средняя длина образуоцихся Срагнептсз• сествзяала около 4'тис. нуклеотидных пар. Полученный пабвр рсстзпягцисэтгая срагнентов лигировали с. предварительно рзсцгягстпоД ко уникальному Dgl II сайту плазмидой рСВ 22 в езотпззгига пряперно 1 нкг фрагментов/! акг вектора при • ясяпгатращта 1.00 г.^г вектора/ил.. Полученной лнгазной сыесьв тггясугриярорагл яяятди B.subtills 2036 по традиционной методике. .'Ят5тст Епссзаап па агариэованную среду, содераацуо Ж/, (по oSic^j) еЗязгнренпого молока и 20 ыкг/ил. эритромицина и чтйграга вгастптга. еЗразгизи зону гидролиза казеина.

йла сгдедаясязя хжгаа зкспрсссии клонированного гена клетки B.sC&ms 2DI1. r.t;c!j';-:2 сотзтвгтствуозув плазмиду, выращивали в L-fijibczi о тэт-с-пн 23 азтг.ерзз оятичеекдп плотность я

сКХгуя грэЗа са разстягя етатяз радта сзгьтс?я.

• • ГгзЗЯМШ Я ютасапз

Гдтагстпаа гокологая n pnyi з^ехаяд'стгаотетаэ бат;яяя.

{"острот) Z.Q. <я яр.. -ПТ5Т5 "".'Г ГЛ (СИР9 бяяа предаотстз zr.fzn етоязцптаттго этутп для «етаялопротеаз Згвдяа. зеневгпяза п сйтзгслпоЗ гоиэяогня аапнокислотных тгасясдоватгяытостеа « стесгга пттегттзапзиа оункциопалъло-значтшх районов этот беякоз «fc.ts.

Стягаглятеггмип! • подходок, используемым при - анализе сязтагсявтячесяого родства белков. отлается исследование «х етяаполсгяческих свойств. Для подтверядетгся тт^сдяогетшой orpwj зволгцкя нггр -бацилл яааа бал яепояьзгтчл давдакакичесякЛ подход» тюзгоглвггй приблизительно ^гепзпь агтггешшП

гоаология 'СсггтТ'ОВ В.-aayloU quefaciras. D-cereus. DJ.-revis, B.thcraononlirpjEifa'cik'Tis и B.tiiernoproteoSz'tS<c:ss <( хер^олиэ-инаh Для этого различию (количества •иеталло.пгтетпгаз '(опт '0..-03 ао 300 нг.) адсорбировали з лунках ИВ-ьтутгзтгля папелеЛ лля иынуиологических реакций. с9обод!!ие -саПга кгзяятатшя иа ¡пяастяке бликировалч избытком аль'бумима и .ипmjUzgarnxxsi ¡аясцр'бдровашшй

фермент в присутствии избытка кроличьих антител к* термолизину. Образовавшийся иммунологический комплекс Ьыявляяи последующей обработкой ослиными антителами 'к 'иммуноглобулинам кролика, коньюгированными с пероксидазой хрена. D. результате были получены кривые, отражающие зависимость связывания антител от количества адсорбированного а лунках фермента (Рис.2). Б основе использованного метопа левит определение таких количеств индивидуальных ферментов, которые способны связать одинаковое количество антител. Так, ■ в линейной части кривых одинаковый уровень связывания айтител выявляется для адсорбированных в лунках 0,28 нг"термолизина. 1.4 иг нпр B.cereus. 5 нг нпр • ' B.thernononliquefacienS. и 80 нг нпр B.aayloliquefaciens. Принимая реакционную способность термолизина, к. Которому били 'получена антитела, за 10GX." мовно рассчитать, что молекула няр' B.cereus сохранила око,ло 26 У., характерных для . термолизина антигенных детерминант, нор-B.theruononliquefaclens - 6 X.' нпр B.asyloliquefaciens менее 0,5%.' Очеридло. что использованный метод позволяет линь приблизительно оценить алтигеннув гомологии нпр. Однако, полученные результаты сдвпадавт с предлохенныы Филогенетическим деревом и пезволаат отнести недавно описанную металлопротеиназу B.thera\monliquefaciens . с неизвестной аминокислотной последовательностью к эволюционной ветви, включающей такие ферменты B.stearotherfiophilus. B.cereus и термолизив (Рйс.1). В то не бремя, несмотря на высокий уровень. . токологии Первичных структур,не" удаетсы выявить взаимодействие нпр B.brevfs с антителами к термолизину, В дополйнтельных экспериментах было показано, что этот фермент не реагирует такие с антителами к. unp B.atyilollquefaclens. Таким Образом, антигенная структура нпр B.b'reuis по-видимому является достаточно уникальной. Вероятно.это связано с ранкиа отделением нпр B.brevls от соответствувцей эволюционной группы ("Рис-. 1) и последувцим накоплением аминокислотных замен, локализованных на поверхности белковой молекулы. • •

Для неталлопротеиназы B.cereus. характеризующейся побольней гомологией антигенной .■ структуры с терволизинок из проанализированных ферментов, установлено,что антитела к термолизину достаточно эффективно подавляет ее активность. Полученный результат свидетельствует о той, " что среди использованных поликлоналышх антител к териолнзшщ присутствует

Тсрнзлизин

Sa с. itezrothírrnsphiiu.3 Üac.tertus

эас. thereonbnHqueíaciens Bac: brtwis

Вас. subtiLis

zi^yloUqucfaticns

°'0/ 1,0 . . 10

KimitzcmBi срермснпа ¡ npiïe,»

Рис. i Предполагае/ша

'««S5™3 Риг. г юа™„Мот«„ rera„™„ ,„ „

антитола. Способные сввэыватьса с функционально существенными районами белка, а также о высокой гомологии .этих районов в молекулах .термолизина и ыеталлопротеиназы B.cereus.

Ранее было показано, что относительно • пониженная, термостабильность металлоп&отеиназы B.cereus, занимавшей промежуточное положение по термостабильности между .протеиназами двух ветв.ей, может быть связана. с нарушением междомешшх взаимодействий в молекуле этого фермента.. Для последующей проверки этой .гипотезы методами белковой инженерии и возможного прояснения молекулярнмх' механизмов. • определяющих термостабильность металяопротеийаз мы предприняли работу по клонированию и экспрессии г-ела нейтральной протеиназы B.cereus в клетках B.subtllis. • .

Клонирование металлопротеиназы. B.cëreus в клетках D.subtills

Предваряя клонирование, .был проведен анализ особенностей биосинтеза протеолитических ферментов исходным штаммом B.cereus* 1274. Для этого • ночную культуру B.cereus 1274 разводили в соотношении 1/100 L-бульоном.и проводили выращивание в течении. 14 час.. анализируя накопление .в культуральноА жидкости нейтральной и сериновой протеиназ. Было показано, что добавление в культуральную жидкость ФНСФ практически не влияет на уровень протеолитической активное™. В то же время ■ обработка ЭДТй полностью ингибирует присутствующие в растворе Лротеиназы.. Эти данные • свидетельству!^ о том, что .использованный . штамм секретицует в "культуральную .жидкость .'только металлопротеин'азу ( рис.'Э ).

Сконструированной библиотекой генов.трансформировали клетки" дбфектного. по секреторным протеиназам штамма B.subtllis 2036 и отбирали колонии, образующие зоны гидролиза 1&зеина- на молочном агаре в присутствии эритромицина. Было показано',, чй около 60Z 'вырастающих колоний содержат плрзииды. несущие дополнительные вставки по Bgl II сайту, а в ос{альных случаях в клетках присутствует исходный вектор. При анализе <20 ООО клонов были обнаружены 3 колонии (соответствующие плазмиды обозначены' как pli. рЗО и рЗ,!) с различающимися по размеран зонами гидролиза. При выращивании' в жидкой среде все эти клоны синтезировали металлопротеиназу, что'соответствует приведенным выве данным об отсутствии секреторной сериновой протеиназы у итамма B.cereus 1274. •

' IIa Рис.3 приведены результаты реакционного картирован»• фрагментов.ДНК.,'клониррваннах в сост зе плазмид'рП, рЗО и рЗ<Г. Как видно ..из ' рис. во' всях случ ях в клонированной ДНК присутствует идентичные- по# рестриктной карт;е ^участки, длиной около 2000 н.п..которые, как было показано нами, и кодирувт металлопр.отеиназу' B,cereus. Необходимо отметить. что для 'кодирования последовательности пре^про района и зрелой части нейтральных протеиназ бацилл требуется фрагмент ДНК. размером не менее 1700 н.п. Для локализации г.ена "на клонированных последовательностях ДНК мы удаляли Bullí фрагмент из состава, плазмндч р32. • Введение такой делеции- полностьв подавляло экспрессии металлопротенназы. В то «е время. встраивание дополнительных про'тявешшх фрагментов ДНК по сайтам Sal I и Sty I плазииды р32 не влияло на биосинтез фермента, а реклонирование Bgl II фрагмента плазииды р 32 в исходный вектор рСВ 22 не приводило к биосинтезу нейтральной протеиназы соответствувцими плазыидсодергазнаи ' клетками] Полученные, данные позволяет локализовать область, кодирувцуп иеталлопротеиназу B.cereus на больвом Ban HI - Sal I фрагменте-вставши плазмиды р32.

. Необходимо отметить, что последовательность, кодирувцая иеталлопротеиназу. располояена на плазмиде р32 в иной чем на плазмидах рЗО и pll ориентации по отноиенив к сильному промотору ЩЬю)« . локализованному на векторе и обеспечивавшему инициации транскрипции в направлении вставки. Это монет объяснять. более высокий уровень экспрессии фермента, обеспечиваемого плазмидой ,р32. '

Для проверки .этого предполовсния в плазмидах рЗО и р32» изменяли • ориентации Ван HI фрагыентов на протнвоположнув. Полученные плазмиды- были обозначены как p30R и p32R. 'Данные о накоплении нейтральной протеиназы в культуральной видкостн соответствувцих атаымов - продуцентов представлены' на Рис. 4. Как виЪно из- полученных результатов.' изменение ориентации вставок в «плазмидах р32 и рЗО приводит к понияешш уровня зкспрессин фермента в первом случае и соответствув*ему повывенив во. втором. Это позволяет определить направление транскрипции локализованного на копированном фрагменте гена нейтральной протеиназы (Рис.3). Таким образом, повышенная продуктивность, обеспечиваемая плазмидой р32, очевидно связана с действием промотора EU|»0]«. i) то in время экспрессия металлопротеиназы

1 ' I

2 3 4

I Ik I

P?2

<e>

13 2 I V I- I

рЭО

13

:-> t

ЛЪ II

pi I

1500K.n.

-i

3000«.п. 4500л.n.

6000k.n.

Рис.З Рестриктное napTitpoDaiiite Фрогиентоп бактериальной Хромосомы В.свгвиа 1274,' KJIOllHpODOllHUX и состой« ппаочиц Pi 1 , рЭО, р32.' Циф'ра'-У указами са.ити рестрикции! -1 -Вот IM, 2 - Pvull! 3 - Del П ,4 - Sol Cl .5 - Styl . <^~11вПрпвлеиио экспрессии.с промотора EUi»o>»- Струнками обозначено поправление тронскршшиЪ relio нейтральной протеиивои.

440.

0.6

0.4

0.2

0

4.0 12

• Вреил ферментации,ч

16

590

Jo

Рис.4 Накопление метоллопротениази В.се гайв и

НУЛЬТУРОЛЬНОП ЖИДКОСТИ U + OHMOD П.sub tills

2036,содержащих рейомОиншггиие плоямиди pll(l), |>30 ( 2 ) , р32П(3). p30R(4) Цр32(5) l&) - рост клеточпоп культур". • 10

клетками, |1осщими плаэмяди рЗО и р32й, по-видимому, • .свидетельствует о «функционировании в клетках В.БиЫШэ собственного промотора гена нейтральной протеиназы В.сегеил..

По-видимому,особенности секреторных механизмов штамма-реципиента "могут оказывать существенное .влияние на процесс выхода в культ'уральнуи жидкость продукта клонированного гена,а такжа . на' структуру и вследствие, 'этого функциональные характеристики . секретируемого белка. При этом.возможно,чт'о клонирование генов нейтральных протеаз в клеткйх изогенных или • близкородственных. втаммов позволит значительно повысить продукции целевого белка и ' приблизить его структурно-функциональные особенности к характерным для природного аналога. •В связи с . этим- нами было проведено исследование особенности экспрессии'ряда клонированных генов металлопротеаз в клетках .различных рецйпиентных штаммов.

• Особенности э^спресйий клоци'рйванщух генов металлопрогеиназ.

Экспрессия, нпр Р.ЬгеУ15 и нпр* В.аму.1оНдиеГас1еп5 в клетках ■ . В.биЫИ^. .

Сушественный интерес представляет' изучение особенностей •экспрессии клонированного гетерологичного гена ПНР В.Ьгеу!з в клетках мезофильного ■'гамма В.йиЫШя.так как ме.таллоп^отеинази из указанных втаммйв относлт'ся.й&к лредполагаётся, к двум различны» ветвям эволюционной .дерева и вильно различавтся по те'рмостабильности. Для сравнения-в клетках того'же реципиентного втамМа. В.зиЬЬПЬ исследовали экспрессии гена эволоционно : близкой йпр В^ажу1й11(1иеГас¡еп5.

-• Известно, что оптимальной для вырацивадия. использованного штамма В.ЬгеуЧэ является темпе^атцра' 52°. . Таким образом, биосин.тез: . .секреция и формирование пространственной структуры нпр В.Ьгеи1з происходит прй повышенной температуре.Перенос соответств'упдего гена в . клетки .гетеролвгичного мезофильного итамма' В.гиЬЫПз м'опет быть использован для-выявления влияния температуры на* формирование Функционально активного белка.

Изучение . экспрессии клонированного в составе пла.змидного вектора гена- нпр' Е;Ьгеи1 з в клетка^ В.5иЬШ!5'.2030 проводили, выращивая нлазмидсодержацие клетки в I - бульоне в присутствии эритромицина. Па Рис.5 представлена кривая' ряста клеточной культуры и динамика' накопления нпр В.Ьге^ в культуральной

'И

среде, а также . аналогичные данные дли контрольного «танка -В.5иЫП15 2036. несущего на плазмидном векторе- клонированный ген нпр В.аву1о11диеГас1еп5. Как видно из Рис.. крнёые роста микробных штаммов практически совпадает. При этом биосинтез нпр В.аау]оЩиеГас1епг начинается на поздней логарифмической стадии роста клеточной культуры . (7-6 часов ферментации). что соответствует литературным данным. "В то ве время динамика накопления нпр В.Ьгеу15 носит иной характер.Заметная активность этого фермента в кулыуральной среде обнаруживается ливь на 1920 часу ферментации.

• При сравнении термостабильности" нпр В.Ьге^б- и нпр В.аву1оГ1диеГас1епз. синтезированных р -клетках В.гиЫ! Нг в качестве источника ферментов использовали пробы культуральной видкости. полученные при внрацивании'атаммо'в - продуцентов нпр В.аву1о11диеГар1еп5 и В.Ьг.еу15, отобранные .соответственно на В и 19 часах ферментации.: йликвоты растворов Ферментов прогревали 30 . мин. при температур? от 30° до 80е . охлаждали и анализировали изменение ферментативной активности ■протеиназ ' по гидролизу азоказеина при- 37° ... В случае нпр В.а?у1оПчиеГас1еп5 была . получена традиционная кривая термоинактивации .(Рис.6), характерная для данного фермента. В то ве время -для нпр В.Ьгеудэ выявлена совершенно иная динамрка изменения лротеолитической активности. Прогревание образцов при температуре свуве 40° приводит к значительному повывенип'ферментативной активности, достигавшей максимума после прогрева при ' 70е. Выраженная активация нпр . О.ЬгеИз под действием Повыкенной температуры в совокупности с необычно поздними сроками появления -активности данного фермента в процессе культивирования позволили предположить, что ипр В.Ьгсу1з синтезируется и секретируется клетками В.гиЫШз на ранних стадиях ферментации, »однако присутствует в культуральной яидкости в. неактивной форме. Для проверки этого предположения* на 11 часу ферментации., после перехода клеточной "культуры вгамма-продуцента нпр . В.ЬгеУ15 в стационарную фазу роста, по до выявления активнос.ти фермента, клеточную суспензию разделяли на 2 аликвоты .Из первой аликвота микробные клетки -были удалены центрифугированием и пол'гченный супернатант продолжали культивировать параллельно" с исходной клеточной суспензией. Определение активности нейтральной протеиназы проводили, отбирая пробы культуральной видкости* из

ДО

1Н Врен» ферментации,*

]'|ц;. в 1'осг кмегок Вас. тЬИН: . 2(Й6, несущих клоинроиаиные 1'сны 11Пр Вис. Ьгсу15 (I) н Вас. ■атуШ'щие[ас1ст (2) и измените дктниностм соотистстиующнх фсрмсигои {!' II 2') и культураль-

|1<.>И ЖИДКОСТИ '"

1'пс. б Изменение актишюстн ЦПр Вас. ЬгеУ1! (1) II Вас. а>пу1ои<!ие[ас1еп! ¡2)' н результате 1ц>огрст,|тл и течение 30 мни при различных температурах

обоих колб на различных сроках ферментации. Было риаолено (Рис. 7) одинаковое .повышение активности нпр B.hrevis в .культуральцой среде, на. поздних стадиях : ферментации в обоих вариантах. Прогревание проб выявляет присутствие неактивной протеиназы уже на-'ранних стадиях культивирования. При этом электрофоретический анализ в 1ШГ в присутствии ДДС-На образцов культуралыюй жидкости,отобранных как. на ранней, так и на поздней стадиях Ферментации плазмидс'одержаших клеток B.subtilis 2036. выявляет примерно рапные 'но интенсивности . окрашивания зоны, соответствуете нпр B.brevis и .совпадающие .¡о. злектроф.оретической подвижности как между собой, 'так и со зрелым ферментом, выделенным из природного штамма продуцента. В то же время не удается выявить дополнительной-зоны, которая могла бы сооветствовать непроце.ссированпому ферменту.. Полученные результаты • подтверждают предположение о биосинтезе . клетками B.subtilis неактивной, но процессированной формы нпр B.brevis,' которая активируется в ходе дальнейшей инкубации в культуралыюй среде. При этом эффективность процесса активации в значительной степени . • определяется температурой инкубационной cuet^i. Зависимость активации нпр .B.brevis от температуры, а также ' нормальная, динамика би.осинтеза этого фермента природным штаммом позволяет предположить, что причиной продукции неактивной, фцрмы Фермента может являться^ культивирование клеток B.subtilis при более ниокой температуре по сравнению с условиями роста природного продуцента. По-види'моиу. при 37° пептидная цепь imp . B.brevis не способна быстро сформировать1" на,тивнуп пространственную структуру, которая реализуется при 50°.. Вследствие этого образуется фермент с искаженной, третичуой структурой, который затеи пршшнает активную форму путей ряда конформационных перестроек.

Таким образоу.полученные рез.ультатц свидетельствуют о том. . что клонирование фермента термофильного микроорганизма.в клетках • ыезофильного втаиыа-реципиента может приводить к суцестветшм изменениям в динамике укладки полипептидной цепи и образованию продукта с искаженной пространственной структурой.

' Экспрессия нпр Dlcereus в клетках B.subtilis. ;

Динамика ■ накопления металлопротеинази B.cereus в культуралыюй пидкости как реципиентного итанма B.subtilis 2036,

посу&его плазмиду р32, так и природного итаыма О.согг-ш; 1274 значительно отличается от приводимих в литературе данных для металлопротеиназ других видйв бацилл.

Как правило . биосинте,з' этн1( ферментов связан с поздней логарифмической .фазой-роста клеточной культуры. Однако в случае В.сегеда эффективное* накопление. нейтральной прот^иназы наблвдается непосредственно с начала • логарифмического роста культура. По-вйдииоыу, в исходном втаыме В.сегеи$ 1274 щюцесс биосинтеза секреторной «вталлопро-тейназы Пе . подлевит фазозависиыой регуляции соответ^твувцими клеточными механизмами, в то время как это характерно для .клеток В.гиЬиПз. В то ве время ранний биосинтез- металдопрдтеиназы В.сегеи5 в- клетках .В.зпЬиИв в случае плазмиды р32 шлет бить ' объяснен тем, что экспрессия ' клони|?овашюго гена в значительной- • степени определяется функционированием дополнительного нерегулируемого промотора' ЕИ|?оэ<». Однако, тл зе динаника накопления продукта клонированного на плазыиде рЗО Г*ена реталлопротеиназы . В.сегеиз. экспрессия которого определяется собственным промотором гена , свидетельствует о том. что данный промотор не подлеант * регуляции, коррелирующей со стадиями роста клеток.

1!а 'более поздних сроках ферментации С8-10час.) отмечается падение гфотеолитической активности металлопротеинази в культуралышх эидкостях природного продуцента,а .такае реципиентного ятаыма с рекоыбинантныии плазыидаыи, .которое, как бйло показано, иознга предотвратить добавлением 2 м11 СаС12 (Рис. 9) в культуральнуп зидкость в процессе ферментации. Полученный результат указывает на то, что фермент В.сегеиэ, аналогично некоторый другин металлопротеиназаа. обладает повыпенной чувствительностью к протеолизу.

Анализ тер;Гпстабилы1ости металлопротеиназ Р.Ьге'Ль- и В.'сегеча.

В свяли .с наличием процесса тенпературо-зависимой активации мсталлопрйтеимази О.Ьгсу1з •- продукта клонированного гена, исследование термостабильности этого фермента проводили, используя неталлопротенназу, виделеннуи из природного итаина-продуцента. Прогревание образцов при различных тенпературах осуществляли. используя для разведения Фермента 10 м!1 трнс-буоер р!! 7.2,- содерзазиЛ 2 нИ СаС1. и 1- и!1 ОиСФ. льоо [.-бульон с 2 н« СаС1 и 1 нМ у'1СФ. Как видно из Рис.Я, при прогревании в I

"ш 1,0

0,0

0,6

0,1

0,2

IS 13

Время ¡ptpneiimaniiu.,4

23

l'iic. 7 Пэмиисшю актнинисгн !1И|> Вас. brcvís и кудыуралишП жидкости при щюпсдсннн фсрмипашш и прнсутсгшим клеток нгтамма-нроцуиснта <1). и Случае их удаления (2) и после ирсциарнгалыюго нрогрсиалцл оСрпэиои (3)

Гис. 8. Тчрт.'1'шшач<и,'ивюгя ИИр -Вис. Ьпст три 'нрогр-енэпин и L-буньоггс Щ si ТрэдсСуфсрс К - <сЙ,ра5ШЛЧ1с подвергавшиеся'

up ся шф-итсгсшому

4 8 12 16 Ерсия фериентадии,«

рис. 9 *

Рост клеток в. сегеиз 1274 (1) я изменение

протелоттпрской агсп;ипости в, кудьтуралыгой

жидкости при еирдшлвагош в присттств;п! (2) й

отсутстеки (3,4,5) попов Са соответственно.

(4', 5) - Измерение активности в присутствии ФНСФ

и элта.

Рис. 10

Териогашептвляия нейтральной протеивазы В. сегеиз 1274 (1) и продукта клонированного яа апазкиде р32 гена (2.3,4} в пр^сутсте«'* 1 альбумина (3) и 2иИ СаСИ2» (4) соответственно.

бульоне незначительная инактивации протеиназы наблпдае.тся лиаь при 80®. что свидетельствует' о' высокой • термостабильности. Фермента. В то же время ЗТ) мин. прогревания в трис-буфере "при 50е приводит к уменввению активности нпр Dac.brevis на 50%.' а при 70° - к практически полной инактивации фермента. Вероятно, это объясняется процессом ' автолиза, характерным для многих ' протеолитических ферментов. Пр-видимому, присутствующие в Lr бульоне пептиды подавляют автолиз, выступая в качестве ■ конкурирующего субстрата. " •

Для определения уровня термостабильности металлопротеиназы B.cereus. ' экспрессируемой клетками B.subtilis. и сравнения, с аутентичным природным белком.' ' из проб, полученных ^ри , культивировании.B.cereus 1274 и B.subtilis 2036 (р.32) .отбирали аликвоты и прогревали их в течении 30 . мин. при .различных .температурах. После этого измеряли остаточную активность ферментов по гидролизу .азоказеина. Как видно цз полученных результатов (Рис.10). динамики температурной инактивации нейтральной протеиназы" B.cereus и продукта клонированного гена совпадают. При этом эффективное подавление ферментативной активности, обнаруживается уже при 50°, а прогревание при 601 практически полностью инактивирует. металлопротеиназы. По-видимому, инактивация фермента не связана с процессом автолиза, поскольку добавление ионов Са1+ или 1 У. альбумина крупного рогатого скота (Serva) (Рис.10) не оказывает стабилизирующего действия. ...

Прогревание аликвот ферментов, в • присутствии ■ субстрата показывает. что оптимум протеолитической активности как природной металлопротеиназы B.cereus. так и синтезированного. B.subtilis продукта клонированного гена соответствует 50°. ..

Таким образом, клонированный нами - фермент по своей термостабильностн несколько уступает описанным ранее мезофильным металлопротеипазаы B.cereus, и D.br'evis . и наиболее близок по этому параметру к ферментам B.anyloliqyefíiciens и B.subtilis

Трансформация и мутагенез клеток B.cereus.

Несмотря на наличие дополнительного промотора и амплификацию клонированного гена на плазмидном векторе. ; экспрессия нейтральной протеиназы B.cereus в клетках реципиентного нтамма B.subtilis (р32) осуществляется менее эффективно,, чем'в клетках

природного хозяина ( Рис.4 ). Всвязи с этим представлялось перспективным осуществить экспрессию клонированного гена металлопротеинази D.cereus в клетках исходного штамма -продуцента D.cereus. В то же время-, благодаря эволюционной близости нпр D.cereus и термостабильних прлтеиназ, втамм D.cereus мог явиться оптиналышы реципиентным штаммов для экспрессии генов металлопротеиназ термофильной ветви. В связи с этим возникла необходимость осуществить трансформации зтамма D.cereus и получить соответствупчие отаммы с пониженным уровней биосинтеза собственной протеиназы. Для трансформации штамма D.cereus 1274 был использован ряд плазмидных векторов. Была: показана возможность трансформации компетентных клеток D.cereus плазмидой широкого круга хозяев pUB 110, что позволило использовать втамм D.cereus в качестве реципиента. При этом" компетентные клетки,полученные как по традиционной методике, так и по модифицированной нами,' трансформировались с эффективностью 500 колоний/мкг ДНК вектора.

С цельп получения атамма D.cereus 1274 с пониженной актгзностьи секреторной неталлопротеиназы были проведены эксперименты по ЯФ-индуцированному и химическому му;агенезу. Отбор осуществляли по образованию уменьшенной зоны гидролиза казеина вокруг колоний на чашках с молочным агаром по сравнению с исходным втаммои D.cereus 1274. В результате были отобраны 3 колонии со значительно уменьпенной зоной гидролиза. Однако было показано,что при росте в жидкой среде все они продуцировали металлопротеиназу, . хотя и в меньшей количестве, чем исходный втамм D.cereus 1274. Это позволило предположить, что отобранные пани варианты, по-видииоыу, не содержат мутаций в структурном части гена неталлопротеиназы. Синтезирувций наименьшее количество металлопротеинази втанн D.cereus NG8 характеризовался почти вдвое пониженный урознеи протеолитической активности по сравнении с исходным птаыыом B.cercus 1274 и при этом трансформировался с больней эффективностью. Полученный штамм ыоает быть использован для дальнейших экспериментов по экспрессии чуверодних генов.

Вивода.

' 1.Разработан твердофазный инцунохииический метод количественной оценки степени антигенной гомологии металлопротеиназ бацилл. Показано.что по иравг мшп с териолизиноы протеиназы B.cereus. B.theraononl Iquefaclens. B.aayloliquefaciens сохраняют около 20. 6 и 0.5 У. антигенной

19

гомологии соответственно. Это подтверждает предложенную ранее схему эвплшционного пути этих ферментов.

2.В • составе плазмидного вектора рСВ22 клонирован ген нпр ß.cereus. построена его рестриктная карта и определено направление траискрипции. Показана возможность экспрессии гена нпр Ii.cere'us в клетках B.subtilis под конторолем собственного промотора гена, а также дополнительного промотора EUitoa« , локализованного на векторной молекуле.

3. Показано, что при экспрессии клонированного в составе плазмидного вектора рТМ 261 гена нпр B.brevis в клетках B.subtilis. при 3?°С происходит секреция малоактивной формы фермента, дальнейшая активация осуществляется вследствие ряда конформационных перестроек.

л. Показана возможность трансформации клеток ß.cereus плазмидой pOSllO. получен мутантный «таим . B:cerejs 1274 с пониженным уровнем протсолитических ферментов.

Список работ.опубликованных автором по теме диссертации.

1 Кайдалова II.В.. Акимкина Т.О., Ходова О.Д.." Костров C.B.. Стронгин А.Я. Анализ структуры нейтральной протеиназы Bacillus brevls и ее биосинтез в клетках Baci1 lus .subtllis. // Молекулярная биология. - 1990. - T. 24. -- С.1301-Г392.

2 Kostrov S.U.. Akiakina T.U.. Kaydalova N.U.. Stronßin A.Ya. . Teaperature dependent activation, of Bacillus brevis netalloprotease expressed In aesophilic Bacillus subtihs. // FEHS Letters. - Í990. - U.71.- P. 129-132.'

3 Акимкина T.D., Носовская E.A.. Костров C.B."Клонирование и экспрессия гена нейтральной протеиназы ß.cereus в клетках В. subtilis."// Молекулярная биология.-19^2.- Т.20,- С.179-184

4' Акимкина Т.В.. Кайдалова Н.В., Климова O.A., Изотова Л.С,, Костров C.B.. Стронгин А.Я. Иммунохимическая характеристика нейтральных протеинах бацилл.// Иатериалы конференции "Новейние методы биоинженерии". - Пуцино. 1989. - С.2Б. 5 Акимкина Т.В.. Кайдалова 11.В.. Костров C.B. Анализ экспрессии ыеталлопротеиназы Bacillus brevls клетках Bacillus subtilis и клонирование гена ыеталлопротеиназы Bacillus cereus.// Тезисы доклада. Всесопзная конференция "Генная и клеточная инженерия". - Пуцино. 1990. - С.4-5. Автор выражает благодарность Кайдалсвой II.В.. совместно с которой были проведены эксперименты по изучении биосинтеза ыеталлопротеиназы В.brevis в клетках B.subtilis.

20

S3K.L28 тирад; IOO экз.Ротапринтная 1ШХТ им.Ломоиосолч пироговская ул.,д.i