Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новая секретируемая металлоэндопептидаза Bacillus intermedius

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Новая секретируемая металлоэндопептидаза Bacillus intermedius"

На правах рукописи УДК 577.151

РУДАКОВА НАТАЛЬЯ ЛЕОНИДОВНА

НОВАЯ СЕКРЕТИРУЕМАЯ МЕТАЛЛОЭНДОПЕПТИДАЗА ВАСНХив ИЧТЕЯМЕОШв

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 5 НОЯ 2010

Казань -2010

004613963

Работа выполнена в лаборатории биосинтеза и биоинженерии ферментов кафедры микробиологии биолого-почвенного факультета ГОУ ВПО «Казанский государственный университет им. В.И. Ульянова-Ленина».

Научный руководитель: Кандидат биологических наук, старший научный

сотрудник

Балабан Нэлли Павловна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

старший научный сотрудник лаборатории биохимии РЦПБ СПИД Коксин Владимир Петрович

Доктор ветеринарных наук, профессор Федерального центра токсикологии и радиационной безопасности Фаизов Тагир Хадиевич

Ведущая организация: Казанский институт биохимии и биофизики РАН г. Казань

Защита диссертации состоится «25» ноября 2010 г. в 13.00 часов на заседани диссертационного совета Д.212.081.08 при Казанском (Приволжском) федерально университете по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18, главное здани

ауд ~£од

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И. Лобачевско! Казанского (Приволжского) федерального университета

Автореферат разослан октября 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

З.И. Абрамова

Актуальность проблемы: Протеолитические ферменты представлены в геномах всех живых организмов: от прокариот и вирусов до высших эукариот. Они важны для жизни и здоровья человека, о чем свидетельствует тот факт, что в геноме человека обнаружены более 640 генов, кодирующих пептидазы или их гомологи [Sterchi et al., 2008]. Интересно, что по результатам сиквенса генома человека не отмечено существенного возрастания количества генов, кодирующих сериновые протеиназы, но заметно увеличено количество генов, кодирующих матриксные металлопротеиназы семейства метцинкинов по сравнению с геномами низших эукариот [Хофманн, 2001]. В свою очередь, уровень экспрессии этих ферментов в бактериальных геномах составляет менее 1% от общей протеолитической активности клеток [Шарипова с соавт., 2000,2002].

Метцинкины - один из кланов цинкзависимых эндопептидаз, отличающийся от других представителей металлопротеиназ наличием продленного мотива активного центра фермента HEXXHXXGXXH и консервативной структурой Met-поворота в молекуле белка. Метцинкины обнаружены у многих организмов от прокариот до млекопитающих. Выяснение роли и функций этих белков в биологических процессах способствовало развитию исследований их структуры, физико-химических свойств и функциональных особенностей. Выделение и изучение бактериальных метцинкинов стало возможным с развитием постгеномных технологий и методов генной инженерии, позволяющих клонирование генов на основе знания геномных последовательностей бактерий и создания эффективных векторов экспрессии. До сих пор одной из главных научных задач остается выяснение роли этих белков в физиологии про- и эукариот. Установлено, что метцинкины в эукариотических клетках принимают участие как в различных деструктивных процессах, так и высоко специфичном и ограниченном протеолизе, осуществляя регуляторные функции на посттрансляционном уровне. Повреждение регуляторных механизмов может привести к возникновению и развитию патологических процессов [Gomis-Rüth, 2003]. Эукариотические и бактериальные метцинкины ответственны за возникновение таких патологий как воспалительные процессы, тканевая деструкция, неврологические болезни, кардиозаболевания, обширное метастазирование при онкологических заболеваниях [Gomis-Rüth, 2003, 2009]. Важная роль, которую метцинкины играют в жизни и здоровье человека, ведет к необходимости исследования структурных и функциональных особенностей этих ферментов и механизма их действия in vitro и in vivo.

Ранее показано, что бактерии Bacillus Mermedius 3-19 секретируют в среду протеиназы, среди которых доминируют сериновые: субтилизиноподобная протеиназа и глутамилэндопептидаза [Шарипова с соавт., 2000], Гены ферментов клонированы и секвенированы, последовательности зарегистрированы в Международной базе данных (AN A Y 754946 и AN YI5136). Изучена экспрессия обоих генов в рекомбинантных штаммах В. subtilis [Sharipova et al., 2007, 2008]. Соответствующие белки выделены в гомогенном состоянии и подробно охарактеризованы [Михайлова с соавт., 2007, Шамсутдинов в соавт., 2008]. Наряду с сериновыми протеиназами бактерии В. intermedius выделяют в среду металлоэндопептидазу, последовательность гена которой установлена и занесена в Международную базу данных (AN 75740.2)

Целью работы явилась разработка эффективного способа очистки и получения гомогенного препарата металлоэндопептидазы В. ШегтесИт 3-19, секретируемой рекомбинантным штаммом В. виЫШз, определение первичной структуры фермента, его классификация и исследование физико-химических свойств.

В работе решались следующие задачи:

1. Оптимизация среды культивирования рекомбинантного штамма В. яиЬИПз для максимальной продукции металлоэндопептидазы МргВь

2. Разработка условий выделения и очистки гомогенного препарата металлоэндопептидазы из культуральной жидкости рекомбинантного штамма.

3. Определение и анализ первичной структуры эндопептидазы МргВ1 и установление классификационной принадлежности фермента.

4. Определение субстратной специфичности металлоэндопептидазы.

5. Исследование энзиматических свойств рекомбинантного белка.

Научная новизна: впервые выделена и очищена до гомогенного состояния

секретируемая щелочная цинкзависимая металлопротеиназа МргВк Разработан простой и эффективный способ выделения и очистки фермента из культуральной жидкости рекомбинантного штамма В. зиЬНШ. Определена аминокислотная последовательность фермента, его субстратная специфичность, кинетические характеристики и энзиматические свойства. Получены приоритетные данные о том, что новая эндопептидаза бацилл является гомологом эукариотических адамализиноподобных эндопептидаз клана метцинкинов. Фермент является первым и единственным представителем семейства адамализиноподобных эндопептидаз у бацилл.

Практическая значимость результатов.

Оптимизированы условия биосинтеза металлопротеиназы МргВ 1 рекомбинантным штаммом В. яиЬИШ. Разработан эффективный способ очистки фермента, позволяющий получить 4-5 мг гомогенного белка из 1 л культуральной жидкости. Новая бациллярная металлопротеиназа является гомологом эукариотических адамализиноподобных эндопептидаз клана метцинкинов, многие представители которого являются ферментами, ответственными за возникновение и развитие заболеваний.

Положения, выносимые на защиту:

1. Среда культивирования рекомбинантного штамма для получения максимальной продукции металлоэндопептидазы МргВ! имеет повышенное содержание пептона и неорганического фосфата в качестве основных компонентов и включает казеин и казаминовые кислоты в качестве дополнительных источников питания.

2. Получение гомогенного препарата металлоэндопептидазы МргВ! осуществляется с помощью хроматографии на гидрофобном носителе бутил-сефарозе с минимальным количеством стадий очистки.

3. На основании сравнительного анализа первичной структуры металлопротеиназы В. ШегтесИш с другими цинкзависимыми металлопротеиназами МргВ! классифицирована как гомолог семейства

эукариотических адамализиноподобн ых металлоэндопептидаз клана метцинкинов.

4. Металлопротеиназа MprBi является термостабильным щелочным ферментом, чувствительным к ионам двухвалентных металлов и обладающим широкой субстратной специфичностью.

Апробация работы: Материалы диссертации доложены и обсуждены на международных и региональных конференциях: IV научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета «Материалы и технологии XXI века» (Казань, 2004), Всероссийской научной конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2004), XLII международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» секция биология (Новосибирск, 2004) (Диплом III степени), V республиканской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Наука. Инновации. Бизнес.» (Казань, 2005), VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 2007), Международной конференции аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2007, 2009), IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009) (грамота за лучший доклад), Российской школе молодых ученых «Актуальные проблемы современной биохимии и молекулярной биологии» (Казань, 2010).

Публикации; По теме диссертации опубликовано 15 научных работ.

Место выполнения работы и благодарности. Работа выполнениа на кафедре микробиологии Казанского (Приволжского) федерального университета. Автор зыражает глубокую признательность научному руководителю к.б.н., с.н.с. Н.П. Валабан за внимательное отношение к работе и обсуждение полученных результатов; профессору М.Р. Шариповой и к.б.н., доц. A.M. Мардановой за постоянные консультации и обсуждение результатов; д.х.н., профессору Г.Н. Руденской за предоставление специфических хромогенных субстратов, сорбента бацитрацин-силохрома и возможность проведения части экспериментов в лаборатории Химии природных соединений химического факультета МГУ (Москва), профессору C.B. Кострову (ИМГ РАН) за предоставление плазмиды рСМ4, профессору Günter Lochnit (Гиссен, Германия) за помощь в определении N-концевой последовательности методом Эдмана и MALDI-TOF спектрометрии; профессору Eugenio Ferrari (Genencor Int. Inc., США) за предоставление протеазо-дефицитного штамма В. subtilis BG2036. Автор выражает искреннюю благодарность заведующей кафедрой микробиологии Казанского университета проф. О.Н. Ильинской и сотрудникам кафедры микробиологии за помощь и доброжелательную рабочую атмосферу.

Структура и объем диссертации,- Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела экспериментальных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 111 страницах машинописного текста, включает 14 таблиц, 22 рисунка. Библиография содержит 117 наименований российских и зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы и плазмиды. Объектом исследования являлся рекомбинантный эритромициноустойчивый штамм Bacillus subtilis. Он получен путем трансформации плазмиды pSAl в протеазо-дефицитный штамм В. subtilis BG2036, из хромосомы которого делегированы гены внеклеточных протеиназ (штамм любезно предоставлен проф. Eugenio Ferrarri, Genencor Int. Inc., USA). Мультикопийная плазмида pSAl, сконструированная на основе экспрессионного вектора рСВ22 [Sorokin et al., 1990], несет полный ген металлопротеиназы В. intermedins mprB'i под собственным промотором. Ген субклонирован с 6 кб фрагмента геномной ДНК В. intermedius (рСМ4) (рСМ4 получена в ИМГ РАН и предоставлена для работы проф. C.B. Костровым). Нуклеотидная последовательность гена mprBi занесена в Международную банк генов «GeneBank» с кодом доступа EU678894. Трансформацию клеток В. subtilis плазмидной ДНК проводили по методу [Anagnostopolous et al., 1961].

Условия культивирования рекомбинантного штамма В. subtilis. Для культивирования клеток рекомбинантного штамма В. subtilis BG2036 (pSAl) были использованы среды следующего состава (г/л): бактериологический пептон (Sigma, США) - 17, дрожжевой экстракт (Sigma, США) - 10, NaCl - 3, СаС12 - 0,1, MgS04 -0,1, MnS04 - 0,1, NH4CI - 0,1, pH 7,7 (пептон-содержащая среда) [Шакиров с соавт., 2000]; L-бульон (среда LB, Лурия-Бертани) (г/л): триптон -10; дрожжевой экстракт - 5; NaCl - 5; pH 7,7 [Sambrook et al., 1989].

Перед посевом в среды добавляли стерильный раствор Na2HP04 и антибиотик вносили 1 мкг/мл. Среды стерилизовали при 1 атм.

Культивирование проводили на вибростенде (В.Вгаип, Германия) при 37°С в течение 30 ч (200 об/мин). Культуральную жидкость освобождали от клеток центрифугированием.

Количество биомассы определяли на фотоэлектрокалориметре КФК-2 при 590 нм и выражали в единицах оптической плотности.

Образование спор Bacillus subtilis определяли с помощью подсчета клеток и спор на окрашенных по Пешкову препаратах в режиме микроскопии (микроскоп Carl Zeiss Jena, Германия) при увеличении 1600 раз в 4 полях зрения. Количество свободных спор выражали в процентах от общего числа вегетативных и спорулирующих клеток. Для оптимизации питательной среды варьировали содержание пептона от 10 до 30 г/л и неорганического фосфата от 0,8 до 1,6 г/л. Казеин и казаминовые кислоты вносили в среду стерильно перед посевом в концентрациях от 0,1 до 2 г/л. Соли двухвалентных металлов в конечных концентрациях: Zn2+ 0,5 - 3,0 мМ, Mg2+ 3,0 - 9,0 мМ, Са2+ 4,0 - 18,0 мМ, Мп2+ 2,0 -6,0 мМ и Fe2+ 0,5 - 2,0 мМ вносили в питательную среду перед посевом в виде стерильных растворов.

Определение локализации фермента. Локализацию металлопротеиназы определяли измерением уровня протеолитической активности по гидролизу азоказеина в клеточных фракциях. Клетки после 24, 30 и 36 часов культивирования отделяли от культуральной жидкости центрифугированием (5 мин при 10 тыс. об/мин) и отмывали 0,85% раствором NaCl. Клеточную суспензию инкубировали с лизоцимом (1 мг/мл) (Sigma, США) в 10 мМ трис-HCi буфере (Sigma, США) pH 8,5 в присутствии 20% сахарозы (Реахим, Россия) в течение 25 мин при комнатной

температуре. Образование протопластов контролировали микроскопированием. Протопласты отделяли центрифугированием при 10 тыс.об/мин в течение 15 мин. Полученный супернатант содержал белки клеточной стенки. Солюбилизацию мембраносвязанных ферментов проводили обработкой протопластов раствором детергента 0,1% Тритон Х-100 (FERAK BERLIN, Германия) в 0,1 М трис-НС1 буфере pH 8,0 с 50 мМ NaCl, а также IM NaCl с добавлением 20 % сахарозы. После инкубации в течение 20 мин при комнатной температуре смесь центрифугировали (13 тыс. об/мин, 20 мин). Супернатант содержал белки мембраны. Для получения фракции внутриклеточных белков протопласты разрушали осмотическим шоком при добавлении 5 мМ трис-HCl буфера pH 7,8 при 4°С. К смеси добавляли ДНКазу (1 мг/мл) (Koch-Light Limited, Великобритания), инкубировали 30 мин при комнатной температуре и центрифугировали 30 мин при 15 тыс. об/мин. Супернатант содержал фракцию внутриклеточных белков. Чтобы исключить влияние сериновых лротеиназ, активность металлопротеиназы во всех фракциях определяли в присутствии 5 мМ PMSF (Serva, Германия). При определении протеолитической активности металлопротеиназы в клеточных фракциях активность выражали в ед/мг биомассы.

Определение белка. Белок определяли спектрофотометрически, считая, что концентрация белка 1 мг/мл соответствует A^so - 1 оптической единице (опт. ед.) в кювете толщиной 1 см, а также по методу Брэдфорд [Bradford, 1976].

Определение протеолитической активности по гидролизу азоказенна. Протеолитическую активность металлопротеазы определяли по гидролизу азоказенна (Sigma, США) [Charney et al., 1947, Demidyuk et al., 2004] и по гидролизу казеина (Serva, Германия) [Каверзнева, 1971]. За единицу активности принимали количество фермента, гидролизующего в условиях эксперимента 1 мкг субстрата за 1 мин.

Продуктивность культуры определяли как отношение величины протеолитической активности к оптической плотности культуральной жидкости и выражали в % или в усл. ед. При очистке фермента удельную активность определяли как отношение протеолитической активности к единице белка и выражали в ед/мг белка.

Выделение и , очистка протеиназы рекомбинантного штамма. Сульфатаммонийную фракцию 0,2-0,7 насыщения диализовали против 0,05М трис-HCl буфера pH 7,3 с 5 мМ Са2+ и проводили очистку на колонке с бацитрацин-силохромом, уравновешенным тем же буфером. ' Элюцию проводили тем же буфером, содержащим IM NaCl и 7% изопропанола. '

Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе.Ферментный раствор после бацитрацин-силохрома диализовали против 0,01М трис-HCl буфера pH 8,0 с 5 мМ Са2+ и проводили хроматографию на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой (Sigma, США), уравновешенной тем же буфером. Элюцию проводили аналогичным буфером, содержащим 0,6 М NaCl.

Очистка фермента на гидрофобном носителе бутил-сефарозе. На колонку с бутил-сефарозой HiTrap (Pharmicia, США), уравновешенной 0,05 М трис-HCl буфером pH 7,3 с 5 мМ Са2+, содержащим 35% сульфата аммония, помещали фермент, отдиализованный против того же буфера. Элюцию проводили тем же

буфером с понижением концентрации сульфата аммония до 20-15%. Полученные фракции диализовали против 0,05М трис-HCl буфера рН 7,3 с 5 мМ Са2+.

Электрофорез в ПААГ. Степень чистоты полученных препаратов и молекулярную массу определяли методом электрофореза в 12,5%-ном ПААГ в присутствии SDS по методу Лаэммли [Laemmli, 1970]. Гель окрашивали Кумасси ярко-голубым (Serva, Германия), а также раствором 0,3 М ZnCb с предварительной обработкой 0,2 М имвдазола.

Влияние ингибиторов на активность металлопротеиназы MprBi. Использовали ингибитор PMSF, ЭДТА, 1,10-фенантролин, рСМВ, HgCl2 и белковый ингибитор трипсина. Остаточную активность выражали в процентах относительно контроля, активность которого принимали за 100 % в отсутствие ингибиторов в реакционной смеси.

Масс-спектрометрический анализ (MALDI-TOF)

Раствор фермента обрабатывали трипсином по методике, изложенной на сайте (http://vvww.bioc.uzh.ch). Полученные пептиды различной молекулярной массы идентифицировали на масс-спектрометре Vision 2000 TOF (ThermoBioanalysis, Великобритания). Спектры пептидов обрабатывали с помощью программ Peptide Mass Fingerprint (http://www.matrixscience.com.) и Peptide Mass (http://cn.expasv.org).

Определение N-концевой последовательности белка. N-концевую аминокислотную последовательность белка определяли методом Эдмана на приборе Model 816 Protein Sequences (Гиссен, Германия) с использованием анализатора 120А РТН (Applied Bíosystems, США).

Определение субстратной специфичности. Субстратную специфичность металлопротеиназы определяли по гидролизу синтетических субстратов Dnp-Ala-Ala-Leu-Arg-NH2, Dnp-Gly-Gly-Phe-Arg, Dnp-Gly-Gly-Ile-Arg, Dnp-Gly-Gly-Lys, Dnp-Gly-Gly-Leu-Arg, Dnp-Ala-Ala-Val-Arg по методу Люблинской [Люблинская с соавт., 1987], а также по гидролизу природных субстратов: В-цепи окисленного инсулина, казеина по Гаммерстену и яичного альбумина (Sigma, США). Анализ полученных после гидролиза В-цепи пептидов проводили с помощью метода масс-спектрометрии MALDI-TOF (http:\expasy.net\tools). Специфичность металлопротеиназы по гидролизу казеина по Гаммерстену (Sigma, США) и яичного альбумина (Sigma, США) определяли по методу Каверзневой как описано выше.

Каталитические и энзиматические свойства металлопротеиназы MprBi.

Кинетические константы. Кт определяли по гидролизу азоказеина. Расчеты проводили по графику в координатах Лайнуивера-Берка в программной среде «Excel». Каталитическую константу km рассчитывали по формуле к^, = Утах/[Е], где [Е] - концентрация фермента-Изоэлектрическую точку фермента определяли с использованием ресурса http://www.expasy.net/tools/.

рН-оптимум и рН-стабильность. рН-Оптимум активности фермента определяли по гидролизу азоказеина в 0,05 М трис-HCl буфере с 5 мМ Са2+ в интервале значений рН от 7,2 до 9,5. Для определения рН-стабильности фермент предварительно инкубировали в 0,05 М трис-HCl буфере при значениях рН от 7,2 до 9,5 в течение 24 ч при комнатной температуре, после чего определяли активность по стандартной методике.

Температурный оптимум и термостабильность. Температурный оптимум фермента определяли по гидролизу азоказеина в 0,05 М Трис-HCl буфере рН 8,0 с 5

мМ Са2\ инкубируя реакционную смесь при температурах 22, 37, 45, 50, 55, 60, 65, 70° С. При изучении термостабильности растворы фермента предварительно инкубировали 40 мин при температурах от 22° до 70° С и затем определяли активность металлопротеиназы по гидролизу азоказеина по стандартной методике.

Влияние ионов металлов на активность металлопротеиназы. Использовали хлориды кальция, магния, кобальта, меди и никеля в конечной концентрации от 1 до 20 мМ, хлорид цинка - в конечной концентрации от 0,01 до 20 мМ. К ферментному раствору добавляли растворы двухвалентных металлов и выдерживали при комнатной температуре в течение 15 мин, затем определяли активность фермента по гидролизу азоказеина и выражали в процентах относительно контроля. Контролем (100 %) служил уровень активности фермента в отсутствие ионов металлов.

Математическая обработка результатов. Результаты двухфакторных экспериментов по оптимизации питательной среды обрабатывали с помощью программы STATGRAPHICS. Для статистического анализа экспериментальных данных использовали программу Microsoft Excel. Для описания и сравнения признаков использовали построения 95%-ных доверительных интервалов для средних.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Среды для культивирования .рекомбинантного штамма В. subtilis

Для культивирования рекомбинантного штамма B.subtilis было выбрано две среды: среда LB и пептон-содержащая среда. Среда LB, в состав которой входит триптон и дрожжевой экстракт, была выбрана как оптимальная для культивирования рекомбинантных штаммов, а пептон-содержащая среда являлась исходной для культивирования клеток рекомбинантного штамма В. subtilis в экспериментах по оптимизации среды для увеличения продукции сериновых протеиназ [Балабан с соавт., 2004]. Сравнение эффективности двух сред проводили на 30-й ч роста по показателям роста культуры продуцента (ODj9q), активности металлопротеиназы, а также продуктивности культуры.

Установлено, что рост и продуктивность культуры, а также активность металлопротеиназы на пептон-содержащей среде превышали таковые на среде LB. В связи с этим для дальнейшей работы использовали пептон-содержащая среда.

Динамика роста и накопления металлопротеиназы MprBi в культуральной жидкости рекомбинантного штамма В, subtilis, BG2036 (pSAl)

После трансформации плазмиды pSAl с геном металлопротеиназы mprBi в протеазодефицитный штамм В. subtilis. BG2036 изучали экспрессию гена в рекомбинантном штамме. Отсутствие у штамма-реципиента собственных внеклеточных протеиназ позволяет получить модельный штамм для изучения экспрессии ;, индивидуального гена металлопротеиназы и корректно провести процесс выделения и очистки соответствующего ему индивидуального белка. Полученный модельный рекомбинантный . штамм позволил нам во всех экспериментах проводить определение протеолитической активности металлопротеиназы по гидролизу неспецифического субстрата азоказеина.

При исследовании динамики роста и накопления протеолитической активности металлопротеазы \lprBi установлено, что активность фермента появляется в культуральной жидкости на 17-й час роста, её уровень достигает максимума на 2931 ч роста, что соответствует стационарной фазе роста культуры. Протеолитическая активность контрольного беспротеазного штамма В. зиЫШя ВО 2036 обнаруживалась в следовых количествах по сравнению с уровнем активности рекомбинантного штамма (рис. 1).

Исследование динамики спорообразования рекомбинантного штамма В. хиЬМи показало, что появление свободных спор в среде наблюдается спустя 6 часов после максимума протеолитической активности фермента. Эти данные свидетельствуют, что металлопротеиназа МргВ1 является секретируемым ферментом, а не накапливается в результате массового лизиса клеток.

Споры. %

ООеш

часы

Рис. 1. Динамика роста и накопления протеолитической активности

1 - рост беспротеазного штамма

2 - рост рекомбинантного штамма

3 - протеолитическая активность рекомбинантного штамма

4 - протеолитическая активность беспротеазного штамма

5 - количество свободных спор

Локализация металлопротеиназы МргВ1 в клетках рекомбинантного штамма В. ьиЬШ'я

Сравнение динамики накопления протеолитической активности рекомбинантным и бесплазмидным штаммами указывает на то, что встроенный на плазмиде р8А1 ген тргВ\ кодирует секретируемый белок.

Для определения локализации металлопротеиназы МргВ! был исследован уровень протеолитической активности в различных клеточных фракциях рекомбинантного штамма В. лиМ/м (табл.1).

Таблица 1

Активность металлопротеиназы в культуральной жидкости и клеточных

Фракция . Активность, ед/мг биомассы «10'

на 24 час роста на 30 час роста на 36 час роста

зекомбинантн. штамм бесплазмидн. штамм зекомбинантн штамм бесплазмидн. штамм зекомбинантн, штамм бесплазмидн. штамм

Культуральная жидкость 715. '32 1324 39 910 45

Клеточная стенка 4,6 3,1 5,0 ' , 3,4 6,0 5,5

Мембрана ■ 7,8 8,2 8,7 8,1 9,2 9,0

Цитоплазма 3,4 3,7 5,0 4,8 6,9 7,0

При сравнительном исследовании протеолитической активности в клеточных фракциях максимальную активность обнаружили во фракции культуральной жидкости рекомбинантного штамма В. ¡иЫШх. В клеточных фракциях этого штамма, а также в клеточных фракциях и культуральной жидкости бесплазмидного штамма уровень протеолитической активности не превышал 3% от уровня активности в культуральной жидкости рекомбинантного штамма. Полученные данные подтверждают, что протеиназа МргЕН является секретируемым ферментом.

Подбор компонентов питательной среды для максимальной продукции металлоэндопептидазы Мрг1М рекомбинантного штамма ВлиЫШэ

Для получения максимального выхода фермента проводили двухфакторный эксперимент. С его помощью исследовали влияние соотношению двух основных компонентов питательной среды - пептона и неорганического фосфата на биосинтез металлоэндопептидазы МргВь Концентрации указанных факторов варьировали на трех уровнях: пептон - 10, 20 и 30 г/л, неорганический фосфат - 0,8, 1,2 и 1,6 г/л (рис. 2А, Б).

30

птон, г/л 26

1.2 М 1.« 0.8 1 1.2 1.4

фосфат, г/л фосфат, г/л

Рис. 2. Влияние концентрации пептона и неорганического фосфата на активность (А) металлопротеиназы МргВ1 и продуктивность культуры (Б)

Установлено, что максимальная активность металлопротеиназы наблюдается при концентрации в среде пептона 19 г/л и неорганического фосфата 1,3 г/л и максимальная продуктивность культуры - при концентрации пептона 20 г/л и неорганического фосфата 1,45 г/л.

Таким образом, в дальнейшей работе при проведении процедуры очистки белка из культуральной жидкости использовали пептон-содержащую среду с установленными концентрациями пептона и неорганического фосфата 20 г/л и 1,4 г/л соответственно. Известно, что присутствие в питательной среде сложных органических субстратов оказывает стимулирующий эффект на биосинтез фермента. Мы вносили в среду культивирования, содержащую пептон в концентрации 20 г/л и неорганический фосфат 1,4 г/л, белковые субстраты -желатин, альбумин и казеин в концентрациях от 0,1 до 2 I г/л. Присутствие в питательной среде желатина и альбумина не увеличивало активность фермента и продуктивность рекомбинантного штамма В. ¡иЫ1Ш в отношении синтеза металлопротеиназы. Внесение в среду казеина в концентрации 1 г/л увеличивало активность фермента в 3,9 раз и продуктивность культуры в 5 раз, что также подтверждено данными двухфакторного эксперимента, поэтому мы ввели казеин в среду культивирования. Добавление в среду культивирования рекомбинантного штамма казаминовых кислот в концентрации 0,1 г/л увеличивало активность фермента вдвое, продуктивность возрастала в 4,5 раза. Положительный эффект объясняется тем, что казаминовые кислоты являются более доступным дополнительным источником азота и фосфора и для продукции металлопротеиназы МргВь

Благодаря оптимизации питательной среды удалось повысить уровень активности фермента и продуктивности культуры в 4 раза по сравнению с исходной средой (табл.2).

Таблица 2

Продукция металлоэндопептидазы МргВ1 на исходной и оптимизированной средах____1 ■

Среда культивирования ОО,» Активность, ед/мл Продуктивность, усл.ед.

Исходная 0,28 0,31 1,1

Оптимизированная 0,31 1,37 4,4

В результате проведенных исследований нами подобрана оптимальная питательная среда, позволяющая получить максимальную продукцию металлопротеиназы МргВ1 рекомбинантным штаммом В. яиЫИй. Состав среды (г/л): пептон - 20, неорганический фосфат - 1,4, казеин - 1, казаминовые кислоты -0,1.

Разработка способа очистки металлопротеиназы МргВ|, электрофорез и молекулярная масса белка

Для изучения свойств металлопротеиназы МргВ1 получали гомогенный белок. Основным методом выделения и очистки металлопротеаз 'из культуральной жидкости является использование аффинного сорбента. Другим'распространенным способом является осаждение фермента из культуральной жидкости с помощью сульфата аммония. Преимуществом этого способа является возможность получения концентрированной фракции белка из большого объема культуральной жидкости, поэтому он широко применяется для многих гидролитических ферментов, в том числе и для металлопротеаз: при очистке нейтральной протеазы В. атуЫ'щие/аает

NPR 68 [Cho et al.,2003], металлопротеазы В. cereus ТСЕС 945 [Feder et al., 1971], В. subtilis [Хазиев с соавт., 2002; 2003.] и др.

Первым этапом выделения фермента было проведение дробного фракционирования сульфатом аммония. Были исследовании 4 интервала насыщения культуральной жидкости сульфатом аммония: 0,2 - 0,8; 0,2 - 0,7; 0,3 - 0,7 и 0,3 - 0,8. В результате было установлено, что оптимальным является интервал насыщения 0,2 - 0,7, при котором достигался максимальный выход белка - около 54%, при этом степень очистки составляла 20. В дальнейшей работе мы использовали фракцию фермента, полученную при насыщении сульфатом аммония в интервале 0,2 - 0,7.

В качестве следующего этапа была использована хроматография на гидрофобном носителе бацитрацин-силохроме. В отношении металлопротеиназы MprBi сорбент не проявил аффинных свойств, степень очистки повысилась в 50 раз по сравнению с культуральной жидкостью, выход составил 19,2%.

SDS-электрофорез фракции, полученной после хроматографии на бацитрацин-силохроме показал наличие 4-х белковых полос (рис. 4, дорожка 3).

Для получения гомогенного фермента использовали три способа.

1-й способ - ионообменная хроматограф™ белка на ДЭАЭ-целлюлозе. Полученный после бацитрацин-силохрома и диализа высокоочшценный раствор фермента подвергали хроматографической очистке на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой. Это позволило увеличить степень очистки в 4 раза по сравнению со степенью очистки фермента на бацитрацин-силохроме и в 180 раз по сравнению с культуральной жидкостью, однако гомогенный белок не был получен.

SDS-электрофорез показал наличие 3-х белковых полос (рис.4, дорожка 4).

2-ой способ - хроматография MprBi на бутил-сефарозе после очистки на бацитрацин-силохроме. Используемый для хроматографии гидрофобный носитель бутил-сефароза показал высокое сродство к ферменту и позволил получить гомогенный препарат металлопротеиназы со степенью очистки 254 по сравнению с культуральной жидкостью, удельная активность составила 12,7 ед/мг, выход белка по активности - 8,7% (табл.3).

SDS-электрофорез показал наличие одной белковой полосы (рис.4, дорожка 5).

Таблица 3

Хроматография на бутил-сефарозе MprBi, полученного после очистки на бацитрацин-силохроме__

Стадии очистки V, мл А28о общ., мг Активность общ., ед. акт. Удельная активность, ед/мг Степень очистки Выход, %

по активн. по белку

Культуральная жидкость 760 11400 . 595 0,05 1 100 100

Диализат

сульфатаммонийной 24 312 322 1,03 20,6 54 2,74

фракции

Хроматография на 149 47,5 114,3 2,41 48,2 19,2 0,42

бацитрацин-силохроме

Хроматография на

бутил-сефарозе 82,5 4,1 52,0 12,7 254 8.7 0,036

3-й способ - хроматография на бутил-сефарозе диализата сульфатаммонийной фракции фермента.

Поскольку в результате предыдущего способа очистки на бутил-сефарозе был получен гомогенный препарат белка, задачей третьего способа стало уменьшение количества стадий с целью сокращения потерь чистого фермента в процессе очистки. Хроматографии на бутил-сефарозе был подвергнут диализат сульфатаммонийной фракции, в результате удалось получить за 2 стадии очистки хроматографически гомогенный препарат металлопротеиназы МргЕН (рис.4, дорожка б). Степень очистки составила 300, выход - 12%. Выход по активности был на 3 % выше, чем при очистке вторым способом (табл.4, рис.3).

Рис.3. Хроматографическая очистка металлопротеиназы \iprBi на бутил-сефарозе

Таблица 4

Хроматография на бутил-сефарозе диализата сульфатаммонийной фракции белка

Стадия очистки V, мл Белок общ., иг Активность общ., ед. акт. Удельная активность, ед/мг Степень очистки Выход, %

по активн ПО белку

Культуралыш жидкость 760 11400 595 0,05 1 100 100

Диализат

сульфатаммонийной 24 312 322 1,03 20,6 54 2,74

фракции

Хроматография на бутил- 70 4,8 72,1 15,0 300 12,1 0,042

сефарозе

В результате хроматографии на гидрофобном носителе бутил-сефарозе диализата сульфатаммонийной фракции белка удалось получить за 2 стадии очистки хроматографически гомогенный препарат металлопротеиназы МргВ1 (рис.4, дорожка 6). Степень очистки составила 300, выход - 12%. Выход по активности был на 3 % выше, чем при очистке вторым способом (табл.4, рис.3).

Молекулярная масса металлопротеиназы, определенная электрофоретически, составляет 19 кДа (рис. 4).

12 3 4 5 6

Рис. 4. SDS-эяектрофорез в ПААГ

1 - маркеры. BSA (66 кДа), альбумин (45 кДа), папаин (21 кДа), лизоцим (14,4

кДа)

2 - фракция белка после осаждения сульфатом аммония

3 - фракция белка после очистки на бацитрацин-силохроме

4 - фракция белка после ионообменной хроматографии (1 способ)

5 - фракция белка после очистки на бутил-сефарозе (2 способ)

6 - фракция белка после очистки на бутил-сефарозе (3 способ)

Влияние ингибиторов на активность металлопротеиназы MprBi

Изучение влияния различных ингибиторов на активность гомогенной металлопротеиназы показало, что фермент не ингибируется PMSF и белковым ингибитором трипсина, но практически полностью ингибируется 1,10-фенантролином, а также высокими концентрациями ЭДТА, что подтверждает принадлежность фермента к классу металлопротеиназ (табл. 5). Высокие концентрации рСМВ почти полностью ингибируют активность фермента, что позволило предположить наличие остатка цистеина в молекуле белка.

Таблица 5

Влияние ингибиторов на активность металлопротеиназы MprBi

Ингибитор Остаточная активность, %

Концентрация ингибитора

0,5 мМ 5 мМ

PMSF 93,9 91,2

ЭДТА 96 5,7

1,10-фенантролин 5,8 0

рСМВ 94,2 1,9

HgCl, 51,1 39,7

Белковый ингибитор трипсина 97 100

Масс-спектрометрический анализ структуры металлопротеиназы МргВь Определение ^концевой последовательности

Аминокислотная последовательность гомогенного препарата металлопротеиназы МргВ1 была определена с помощью метода МАЬБ1-ТОР - масс-спектрометрии (рис. 5).

_1353.7_

АЗТСвркН'ТУУАУАВАдУк'А

955.4 _1604.9_____

KiУSDWQTR1[VSIffiQADVTFNRbнDV

__3218,6

ЗГБОКаУВРУТСРТАМРМФАОИАУ УТОБАРБОБАРАУШЭООТАНТАКАА

УЗУТТОГЕБААНК^тЖА^Ута

££00 8000 ЗЮО т

Рис.5. МАЬБЬТОР масс-спектрометрия пептидов, полученных в результате обработки металлопротеиназы МргВ1 трипсином. Показана аминокислотная последовательность металлопротеиназы. Стрелками отмечены связи, гидролизуемые трипсином. Над стрелками указаны массы полученных пептидов (Да). Полужирным отмечены первые 10 аминокислот на М-конце зрелого белка (А8ТС8(2КУГУ). Рамками выделены продленный мотив активного центра (сплошная линия) и Мй-поворот (пунктирная линия)

Итак, впервые установлена первичная последовательность аминокислот зрелой металлопротеиназы, секретируемой рекомбинактным штаммом в культуральную жидкость. По результатам определения фермент включает в себя 174 аминокислотных остатка. Рассчитанная молекулярная масса препарата металлопротеиназы составила 19050 Да, что соответствует молекулярной массе

гомогенного фермента, полученной в результате SDS-электрофореза. MALDI-TOF масс-спектрометрия не позволила корректно установить N-концевую аминокислотную зрелой молекулы металлопротеиназы MprBi. Для её определения был использован метод Эдмана. N-концевая последовательность белка, установленная данным методом, содержит 10 аминокислот ASTGSQKVTV с N-концевым аланином. Установлено, что аминокислотная последовательность металлопротеиназы идентична последовательности аминокислот, полученной на основании последовательности нуклеотидов секвенированного гена mprBi.

Совокупность данных анализа структуры белка позволили нам внести уточнения в организационную структуру гена mprBi (AN 75740.2): он включает последовательность, кодирующую сигнальный пептид из 30 аминокислотных остатков, пропептидную последовательность из 66 аминокислотных остатков и последовательность зрелого белка, которая включает 174 аминокислотных остатка (рис.5).

Сравнительный анализ первичной структуры металлопротеиназы MprBi с ферментами клана метцинкинов

В аминокислотной последовательности MprBi мы идентифицировали фрагмент с консервативными аминокислотными остатками HEVGHNFGLPHD (выделены полужирным шрифтом), В этом фрагменте содержатся три гистидиновых остатка Hisl26, Hisl30 и Hisl36, остаток глутамата Glul27, расположенный рядом с первым гистидином, и остаток глицина Glyl33 между вторым и третьим гистидиновыми остатками. Все они характерны для продленного мотива активного центра семи семейств клана метцинкинов [Gomis-Rüth et al., 2009]. Это позволяет нам отнести металлопротеиназу MprBi к клану метцинкинов класса цинкзависимых металлопротеиназ (рис. 6).

Кроме того, в аминокислотной последовательности эндопептидазы MprBi обнаружен единственный остаток Metl47, а также остатки Cysl45 и Туг149. Наличие этих остатков в зрелой молекуле MprBi позволяет предположить, что содержащий их фрагмент CLMNY представляет собой структуру Met-поворота, локализованного на расстоянии 8 аминокислотных остатков от С-конца продленного мотива активного центра. Этот фрагмент с единственным метионином в аминокислотной последовательности белка указывает, что полученная нами цинкзависимая металлоэндопептидаза MprBi относится к клану метцинкинов, для которого структура Met-поворота является консервативной. Анализ структуры мотива активного центра и структуры Met-поворота позволяет определить семейство, к которому принадлежит протеиназа MprBi. Консервативный Asp, расположенный в мотиве активного центра после третьего His, а также Cys в структуре Met-поворота указывают на принадлежность MprBi к семейству адамализинов/репролизинов. Наличие в структуре Met-поворота тирозина в положении, характерном для «тирозинового переключателя» в совокупности с N-концевым расположением сигнальной последовательности сближает исследуемый нами фермент с семейством астацинов. Другой особенностью MprBi, сближающей его с астациноподобными эндопептидазами является N-концевой Alai в зрелой молекуле белка. В семействе астацинов имеется единственный представитель бактериальных белков - это флавастацин грамотрицательной бактерии Flavobacterium meningosepticum [Pfteiderer et al., 1967] (рис. 6). Остальные члены

семейства астациноподобных эндопептидаз являются эукариотическими белками. В семействе адамализинов/репролизинов представлены ферменты высших зукариот (змеи и млекопитающие). : Мы относим металлопротеиназу MprBi к адамализинам/репролизинам на основании того, что в последовательности мотива активного центра металлопротеиназы MprBi после третьего гистидина (His 136) расположена аминокислота А$р, а не Glu, которая необходима при стабилизации молекулы зрелого астацина в процессе активации [Yiallouros et al., 2002, Bode et al., 1992,1993, Guevara et al., 2010J.

Метцинкиновые мотив активного центра Met-поворот

металлопротеиназы

АСТАЦИНЫ

Астацин(краб) H E h M H A I G F Y H E S i M H Y

о-МЕР (мышь) H E 1 L H A L G F F H E S 1 M H Y

Р-МЕР (крыса) H E F L H A L G F W H E S V M H Y

BMPl/проколлаген С- H E L О H V V G F W H E S I M H Y

протеиназа(человек)

SPAN/BP 10 H E I G H A I G F H H E S I M H Y

(морской 2ж)

Толлоид-протеиказа H E L G H T 1 G F H H E s 1 M H Y

(Dr. melanogaster) .

Флавзстацин H E I M H S M G I M H E s V M M Y

(F. meningosepticum)

СЕРРАЛИЗИНЫ

Протеина» Serratia H E 1 G H A L G L s H P s L M S Y

Протеиназа В H E 1 G H A L G L s H P s I M S Y

(Е. Chrysanthemi)

Протеиназа P. aeruginosa [43] H E I G H T L G L s H P s V M S Y

МАТРИКСИНЫ

MMP-1 (коллагеназа 1 H E L G H S L G L s H S A L M Y P

фибробластоэ человека)

MMP-3 (человеческий H E I G H S L G L F H S A L M Y P

стромелизин-1)

ММР8 (иетрофильная H E F G H s L G Ь A H S A L M Y P

коллагеназа 2)

РЕПРОЛИЗИНЫ

Адамализин II H E L G H N L G M E H D С I MRP

(C.adamantem)

Атролвзин С H E L G H N L G M E H D С I MRP

Тримерелизин H E L G H N L G M E H D С 1 M S D

Акуголизин А [39] H E M A H N L G V S H D С I MSP

ТЕРМОЛИЗИН

Термолизин

(В. ihermoproteolyticus) [42] H E L T H A V T D Y T A нет

126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 145 146 147 14S 149

MprBi (В. Intermedias) H E Y G H N F G L P H D С L M N Y

Рис.6. Мотив активного центра и Met-поворот метцинкиновых металлоэндопептидаз. Выдел«ны консервативные аминокислоты активного центра и метионин в Met-повороте [Jiang et al., 1992b, Gong et al., 1998, Bode et al., 1992, 1993]

Так как остаток Glu 103 характерен только для членов астацинового семейства (рис. 6), некоторые исследователи считают, что Glu 103 также относится к мотиву

HELMHAIGFYH£ активного центра астацина [Bode et ab, 1992, Jiang et al, 1992, Gomis-Rüth et al., 1993].

Структура Met-поворота MprBi является более противоречивой: остаток Туг 149, характерный для всех представителей семейства астацинов и играющий важную роль в каталитическом акте, присутствует в структуре MprBi параллельно с Cysl45, характерным для всех ферментов семейства ADAMs. Отметим, что Туг в этой позиции характерен для ферментов семейства серрализинов. Все серрализины синтезируются без сигнального пептида, его роль выполняет С-домен фермента [Gomis-Rüth, 2003]. Для MprBi показано N-концевое расположение сигнальной последовательности (AN 75740.2), что не соответствует семейству серрализинов. В отличие от Tyrl49, Cysl45 в структуре MprBi указывает на принадлежность MprBi к семейству адамалтоинов/репролизинов. Таким образом, каталитически значимый остаток Туг149 является особенностью структуры бациллярной адамализиноподобной эндопептидазы MprBi, сближающей её с ферментами семейства астацинов. Субстратная специфичность MprBi

Была исследована специфичность металлопротеиназы MprBi по гидролизу синтетических хромогенных субстратов (табл. 6). Металлопротеиназа MprBi гидролизует синтетические тетрапептиды интенсивнее, чем трипептиды. Вероятно, более длинные субстраты быстрее связываются с активным центром фермента [Воюшина с соавт., 1991, Stöcker et al., 1990]. Металлопротеиназа не проявляет строгой субстратной специфичности, так как спектр аминокислотных остатков, образующих гидролизуемую пептидную связь, достаточно широк.

Таблица 6

Специфичность металлопротеиназы по гидролизу синтетических субстратов

Субстрат Активность, ед/мг * КГ1

Dnp-Gly-Gly-Phe-Arg 51,48

Dnp-Gly-Gly-Leu-Arg 36,52

Dnp-Ala-AIa-Leu-Arg-NH; 28,16

Dnp-Gly-Gly-Ile-Arg 26,4

Dnp-Ala-Ala-Val-Arg 14,52

Dnp-GIy-Gly-Lys 5,72

Исследована специфичность металлопротеиназы по гидролизу В-цепи окисленного инсулина. Данные масс-спектрометрии при изучении продуктов расщепления подтвердили, что фермент не проявляет предпочтения к определенным аминокислотам расщепляемой пептидной связи (рис. 7), что свидетельствует о широкой субстратной специфичности протеиназы MprBi. Известно, что ферменты клана метцинкинов проявляют узкую субстратную специфичность, а многие ферменты семейства MMPs (матриксинов) и адамализинов осуществляют ограниченный протеолиз природных субстратов. Показано, что эндопептидаза PrtA из патогенного насекомого Photorhabdus luminescens, относящаяся к семейству серрализинов, гидролизует B-цепь отеленного инсулина только по связям Val, Ala и Leu [Marokhazi et al., 2007]. Активность астацина Astacus astacus L - одного из характерных представителей семейства - определяется по гидролизу казеина, азоказеина, желатина, коллагена, B-цепи окисленного инсулина при нейтральном

19

значении рН. При расщеплении пептидных связей В-цепи окисленного инсулина астацин проявляет предпочтение к аминокислотным остаткам с короткими боковыми цепями (Ala, Thr, Ser, Gly) в положении РГ, к пролину в положении Р2 и РЗ и к гидрофобным остаткам в положении РЗ' и Р4', что говорит о более строгой субстратной специфичности, чем у MprBi. Меприн ¡3 предпочитает отрицательно заряженные остатки глутаминовой и аспарагиновой кислот, в то время как меприн а гидролизует связи по остаткам алифатических и ароматических аминокислот. Кроме того, меприн а проявляет предпочтение к пролину, отстоящему на несколько аминокислот от разрезаемой связи [Веупоп et al., 1981].

PrtA 1 i i

F VNQHL CGS HLVE AL YLVCGERGFF YTPK A

MprBi t t T t fT t * T T T 11 t T t 11 t t Рис.7. Гидролиз В-цепи инсулина металлопротеиназой MprBi и эндопептидазой

PrtA

Флавастацин Flavobacterium meningosepticum - нейтральная эндопептидаза, осуществляющая ограниченный протеолиз пептидов по остаткам аспарагиновой кислоты в РГ положении [Bond et al., 1995]. Репролизины осуществляют ограниченный протеолиз природных субстратов по одной-двум пептидным связям [Matsui et al., 2000]. При гидролизе белковых субстратов эндопептидазой MprBi показано, что фермент с предпочтением расщепляет казеин (уд. акт. 32,9 ед/мг) по сравнению с альбумином (уд. акт. 5,5 ед/мг).

Сравнивая специфичность MprBi с другими ферментами клана метцинкинов. отметим, что структура активного центра, общая для этого клана, по-видимому,' определяет минимальную длину гидролизуемого пептида - не менее 4; аминокислотных остатков, но не влияет на спектр аминокислот, участвующих в! образовании расщепляемой связи. Интересным является тот факт, что MprBi, в отличие от других хорошо изученных метцинкинов, не обладает выраженной субстратной специфичностью.

Были определены кинетические параметры и энзиматические свойства MprBi (табл. 7).

Таблица 7

Физико-химические свойства металлоэндопептидазы MprBi

Физико-химические свойства металлоэндопептидазы MprBi

Кт, мМ 0,06

кш, с"1 1213

Pi 5,4 .

рН-ОгГгимум 8,0

рН-Стабяльность 7,2-9,0

Температурный оптимум, "С 55

Термостабильность, °С .22-55

Константа Михаэлиса Кт по гидролизу азоказеина составляет 0,06 мМ. Каталитическая константа &са( равна 1213 с"1. Изоэлектрическая точка металлопротеиназы р1 составляет 5,4.

рН-оптимум и рН-стабнльность МргВ!

Установлено, что рН-оптимум металлопротеиназы в 0,05 М трис-НС1 буфере с 5 мМ Са2+ соответствует 8,0 (рис. 8).

7,2 7,4 7,6 7,8 в 8,5 9 9,5

РН

Рис. 8. pH-Оптимум и pH-стабильность металлопротеиназы. 1 - рН-оптимум металлопротеиназы; 2 - pH-стабильность металлопротеиназы

Это указывает на то, что исследуемый фермент относится к группе щелочных металлопротеаз. Белок стабилен в интервале pH от 7,2 до 9,0. Температурный оптимум и термостабильность

При исследовании влияния температуры на активность металлопротеиназы установлено, что температурный оптимум фермента соответствует 50-55 С. Белок проявляет стабильность в интервале температур от 22 до 55 С (рис. 9).

температура, °С

Рис. 9. Влияние температуры на активность металлопротеиназы. 1 - температурный оптимум фермента; 2 - термостабильность металлопротеазы

Влияние ионов двухвалентнных металлов на активность металлопротеиназы МргВ»

Изучение влияния ионов двухвалентных металлов на активность фермента показало, что ионы Са2+ гёМ^ в концентрации 10 мМ повышают активность белка на 30 и 20% соответственно. Ионы Со2+, Си2+ и №2+ в концентрациях от 1 до 20 мМ

21

снижают активность металлопротеиназы, причем, с увеличением концентрации это снижение более значительно. Низкие концентрации ионов Хп2" (0,01 мМ) практически не влияют на активность фермента, увеличение же его концентрации приводит к резкому снижению активности (рис. 10)

160 ^

0,01 0,1 1 s 10 20

мМ

Рис. 10. Влияние ионов двухвалентных металлов на активность металлопротеиназы MprBi. За 100% принимали активность белка в отсутствии в реакционной смеси ионов металла. 1 - Zn2+; 2- Са2+; 3 - Mg2+; 4 - Со2+; 5 - Си2+; 6 - Ni2+;

Таким образом, в результате проведенной работы был получен гомогенный препарат металлоэндопептидазы MprBi, секретируемой рекомбинантным штаммом В. subtilis BG 2036 (pSAl). На основании определения и анализа первичной структуры MprBi установлено, что исследуемая нами рекомбинантная металлопротеиназа относится к семейству адамализинов/репролизинов клана метцинкинов класса цинкзависимых протеиназ и является первым представителем данного семейства у прокариот в целом и у бацилл в частности. Однако, структурные особенности этого фермента (Туг в Met-повороте и N-концевой Alai) сближают его с зндопептидазами астацинового семейства. Возможно, подобное смешение признаков является ключевой особенностью бациллярных адамализиноподобных эндопептидаз.

выводы

1. Подобран состав питательной среды, обеспечивающий высокий уровень продукции металлоэндопептидазы В. intermedias в культуральной жидкости рекомбинантного штамма В. subtilis.

2. Выделена и очищена гомогенная металлоэндопептидаза MprBi со степенью очистки. 350 и выходом 11,3%. Молекулярная масса металлоэндопептидазы составляет 19 kDa.

3. Методом MALDI-TOF спектрометрии установлена аминокислотная последовательность MprBi, определена N-концевая последовательность зрелого фермента. Фермент классифицирован как металлоэндопептидаза семейства адамализинов/репролизинов клана метцинкинов цинкзависимых металлопротеиназ.

4. Установлено, что металлопротеиназа MprBi обладает широкой субстратной специфичностью по гидролизу синтетических и природных субстратов.

5. Установлено, что металлоэндопептидаза MprBi является щелочным термостабильным ферментом, активность которого зависит от присутствия ионов двухвалентных металлов. pH-Оптимум действия фермента лежит к области pH 8,0, интервал стабильности MprBi 22-55 °С.

Работы, опубликованные по теме диссертации

1. Mikhailova, Е.О. Purification of a subtilisin-like serine proteinase from recombinant Bacillus subtilis during different phases of growth / E.O. Mikhailova, N.P. Balaban, A.M. Mardanova, N.L. Rudakova, O.N. Ilyinskaya, G.N. Rudenskaya, A.A. Rizvanov, M.R. Sharipova // Annals of Microbiology, - 2009 -V.59,№2, - P.301-307.

2. Балабан, Н.П. Металлоэндопептидазы клана метцинкинов: классификация, свойства, структурные особенности / Н.П. Балабан, НЛ. Рудакова, А.Р. Сабирова, О.Н. Ильинская, М.Р. Шарипова // Учен. зап. Казан, ун-та. Сер. Естеств. науки. - 2010. - Т.152, кн.2. - С. 57-77.

3. Рудакова, Н.Л. Секретируемая металлоэндопептидаза Bacillus intermedins: получение гомогенного препарата фермента и исследование физико-химических свойств / Н.Л. Рудакова, А.Р. Сабирова, А.Р. Каюмов, A.M. Марданова, Н.П. Балабан, М.Р. Шарипова // Учен. зап. Казан, ун-та. Сер. Естеств. науки. - 2010. - Т.152, кн.2. - С. 145-154.

4. Рудакова, НЛ. Характеристика цинкзависимой эндопептидазы Bacillus intermedius / Н.Л. Рудакова, Н.П. Балабан, Ю.В. Данилова, Г.Н. Руденская, М.Р. Шарипова // Биохимия. - 2010. - Т.75,№10. - С.1462-1470.

5. Рудакова, НЛ. Протеиназы Bacillus intermedius 3-19 на поздних стадиях роста / Н.Л. Рудакова, Е.А. Соколова, Н.П. Балабан // Тезисы докладов IV научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета «Материалы и технологии XXI века». - Казань, 2004. - С.66.

6. Соколова, Е.А. Каталитические и биологические свойства субтшшзинов Bacillus intermedius 3-19 / Е.А. Соколова, НЛ. Рудакова, Е.Л. Ицкович, Н.П.

Балабан, М.Р. Шарипова // Материалы научной конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии». - Казань, 2004. -С.24.

7. Рудакова, H.JI. Влияние компонентов питательной среды на продукцию субтилизина Bacillus intermedins 3-19 поздней стационарной фазы роста / H.JI. Рудакова, Е.А. Соколова, Н.П. Балабан, A.M. Марданова, М.Р. Шарипова // Материалы научной конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии». - Казань, 2004. -С.73.

8. Рудакова, Н.Л. Протеиназы Bacillus intermedins 3-19 на поздних стадиях роста / Н.Л. Рудакова, Е.А. Соколова // Материалы XLII международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс». -Новосибирск, 2004. - С.ЗЗ. (Диплом III степени)

9. Рудакова, Н.Л. Среда для биосинтеза металлопротеиназы Bacillus intermedius рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis / Н.Л. Рудакова, Е.А. Соколова, Н.П. Балабан, М.Р. Шарипова // Материалы V республиканской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Наука. Инновации. Бизнес». - Казань, 2005. - С.66.

10. Рудакова, Н.Л. Получение металлопротеиназы Bacillus intermedius из культуральной жидкости рекомбинантного штамма Bacillus subtilis / Н.Л. Рудакова, Н.П. Балабан, М.Р. Шарипова // Тезисы докладов и стендовых сообщений VI симпозиума «Химия протеолитических ферментов». - Москва, 2007.-С.76.

11. Рудакова, Н.Л. Гетерологичная экспрессия гена нейтральной протеазы Bacillus intermedius в клетках Bacillus subtilis / Н.Л. Рудакова, А.Р. Сабирова, Н.П. Балабан, М.Р. Шарипова // Материалы конференции «Ломоносов-2007». -Москва, 2007.-С.18.

12. Рудакова, Н.Л. Выделение и очистка металлопротеиназы В. intermedius из культуральной жидкости рекомбинантного штамма В, subtilis BG 2036 I Н.Л. Рудакова, Ю.В. Данилова // Материалы конференции «Ломоносов-2009». -Москва, 2009.-С.11.

13. Рудакова, Н.Л. Новая металлопротеиназа Bacillus intermedius / Н.Л. Рудакова, А.Р. Сабирова, Ю.В. Данилова, Н.П. Балабан, М.Р. Шарипова // Тезисы докладов IV Российского симпозиума «Белки и пептиды». - Казань, 2009. ~ С.298. (Грамота за лучший доклад).

14. Шарипова, М.Р. Особенности регуляции функциональной активности и экспрессии генов протеиназ в условиях стресса у бацилл / М.Р. Шарипова, A.A. Тойменцева, А.Р. Каюмов, А.Р. Сабирова, Н.Л. Рудакова, Н.П. Балабан // Тезисы докладов IV Российского симпозиума «Белки и пептиды». - Казань, 2009.-С.96.

15. Рудакова, Н.Л. Новая секретируемая металлоэндопептидаза Bacillus intermedius / Н.Л. Рудакова, Н.П. Балабан // Тезисы докладов Российской школы молодых ученых «Актуальные проблемы современной биохимии и молекулярной биологии». - Казань, 2010.-С.50.

Отпечатано в ООО «Печатный двор», г. Казань, ул. Журналистов, 1/16, оф.207

Тел: 272-74-59, 541-76-41, 541-76-51. Лицензия ПД №7-0215 от 01.11.2001 г. Выдана Поволжским межрегиональным территориал ьным управлением МПТР РФ. Подписано в печать 19.10.2010 г. Печ.л.1,6 Заказ Же К-6955. Тираж Шла. Формат 60x841/16. Бумага офсетная. Печать - ризография.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рудакова, Наталья Леонидовна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Современные аспекты классификации протеолитических ферментов

2. Характеристика ферментов клана метцинкинов

2.1 Астациноподобные эндопептидазы

2.2 Серрализины

2.3 Матриксные металлоэндопептидазы

2.4 Адамализины/репрализины

3. Структурные особенности метцинкиновых эндопептидаз

4. Функциональная роль и перспективы применения метцинкинов в медицинской практике

Введение Диссертация по биологии, на тему "Новая секретируемая металлоэндопептидаза Bacillus intermedius"

Актуальность проблемы. Протеолитические ферменты представлены в геномах всех живых организмов: от прокариот и вирусов до высших эукариот. Они важны для жизни и здоровья человека, о чем свидетельствует тот факт, что в геноме человека обнаружены более 640 генов, кодирующих пептидазы или их гомологи ^егсЫ et а1., 2008]. Интересно, что по результатам сиквенса генома человека не отмечено существенного возрастания количества генов, кодирующих сериновые протеиназы, но заметно увеличено количество генов, кодирующих матриксные металлопротеиназы семейства метцинкинов по сравнению с геномами низших эукариот [Хофманн, 2001]. В свою очередь, уровень экспрессии этих ферментов в бактериальных геномах составляет менее 1% от общей протеолитической активности клеток [Шарипова с соавт., 2000, 2002].

Метцинкины - один из кланов цинкзависимых эндопептидаз, отличающийся от других представителей металлопротеиназ наличием продленного мотива активного центра фермента НЕХХНХХОХХН и консервативной структурой Ме^поворота' в молекуле белка. Метцинкины обнаружены у многих организмов от прокариот до< млекопитающих. Выяснение роли и функций этих белков в биологических процессах способствовало развитию * исследований их структуры, физико-химических свойств и функциональных особенностей. Выделение и изучение бактериальных метцинкинов стало возможным с развитием постгеномных •технологий и методов генной инженерии, позволяющих клонирование генов на основе знания геномных последовательностей бактерий и создания эффективных векторов экспрессии. До сих пор одной из главных научных задач остается выяснение роли этих белков в физиологии про- и эукариот. Установлено, что метцинкины в эукариотических клетках принимают участие как в различных деструктивных процессах, так и высоко специфичном и ограниченном протеолизе, осуществляя! регуляторные функции на посттрансляционном уровне. Повреждение регуляторных механизмов может привести к возникновению и развитию патологических процессов [Gomis-Rüth, 2003]. Эукариотические и бактериальные метцинкины ответственны за возникновение таких патологий как воспалительные процессы, тканевая деструкция, неврологические болезни, кардиозаболевания, обширное метастазирование при онкологических заболеваниях [Gomis-Rüth, 2003, 2009]. Важная роль, которую метцинкины играют в жизни и здоровье человека, ведет к необходимости исследования структурных и функциональных особенностей этих ферментов и механизма их действия in vitro и in vivo.

Ранее показано, что бактерии Bacillus intermedins 3-19 секретируют в среду протеиназы, среди которых доминируют сериновые: субтилизиноподобная протеиназа и глутамилэндопептидаза [Шарипова с соавт., 2000]. Гены ферментов клонированы и секвенированы, последовательности зарегистрированы в. Международной, базе данных (AN AY 754946 и AN Y15136). Изучена^ экспрессия обоих генов1 в рекомбинантных штаммах В. subtilis [Sharipova et al., 2007, 2008]. Соответствующие белки выделены в гомогенном состоянии и подробно охарактеризованы [Михайлова с соавт., 2007, Шамсутдинов в соавт., 2008]. Наряду с сериновыми протеиназами бактерии В. intermedins выделяют в среду металлоэндопептидазу, последовательность гена которой установлена и занесена в Международную базу данных (AN 75740.2)

Целью работы явилась разработка эффективного способа очистки и получения гомогенного препарата металлоэндопептидазы В. intermedins 3-19, секретируемой рекомбинантным штаммом В. subtilis, определение первичной структуры фермента, его классификация и исследование физико-химических свойств. 4

В работе решались следующие задачи:

1. Оптимизация среды культивирования рекомбинантного штамма В. subtilis для максимальной продукции металлоэндопептидазы MprBi

2. Разработка условий выделения и очистки гомогенного препарата металлоэндопептидазы из культуральной жидкости рекомбинантного штамма

3. Определение и анализ первичной структуры эндопептидазы МргЕИ и установление классификационной принадлежности фермента

4. Определение субстратной специфичности металлоэндопептидазы

5. Исследование энзиматических свойств рекомбинантного белка Научная новизна: впервые выделена и очищена до гомогенного состояния секретируемая щелочная цинкзависимая металлопротеиназа МргЕИ. Разработан простой и эффективный способ выделения и очистки фермента из культуральной жидкости рекомбинантного штамма В. быЫШз. Определена аминокислотнаяшоследовательность фермента, его субстратная специфичность, кинетические- характеристики и энзиматические свойства. Получены приоритетные данные о том, что новая эндопептидаза бацилл является гомологом эукариотических адамализиноподобных эндопептидаз клана метцинкинов. Фермент является первым и единственным представителем семейства адамализиноподобных эндопептидаз у бацилл. Практическая значимость результатов.

Оптимизированы условия* биосинтеза металлопротеиназы МргВ! рекомбинантным штаммом В. БиЬИШ. Разработан эффективный- способ очистки фермента, позволяющий получить 4-5 мг гомогенного белка из 1 л культуральной жидкости. Новая бациллярная металлопротеиназа является гомологом эукариотических адамализиноподобных эндопептидаз клана метцинкинов, многие представители которого являются ферментами, ответственными за возникновение и развитие заболеваний. Положения, выносимые на защиту:

1. Среда культивирования рекомбинантного штамма В. быЫШб для получения максимальной продукции металлоэндопептидазы МргВ! имеет повышенное содержание пептона и неорганического фосфата в качестве основных компонентов, и включает казеин и казаминовые кислоты в качестве дополнительных источников питания

2. Получение гомогенного препарата металлоэндопептидазы MprBi осуществляется с помощью хроматографии на гидрофобном носителе бутил-сефарозе с минимальным количеством стадий очистки

3. На основании сравнительного анализа первичной структуры металлопротеиназы В. intermedins с другими цинкзависимыми металлопротеиназами MprBi классифицирована как гомолог семейства эукариотических адамализиноподобных металлоэндопептидаз клана метцинкинов

4. Металлопротеиназа MprBi является' термостабильным щелочным ферментом, чувствительным к- ионам двухвалентных металлов и обладающим широкой субстратной специфичностью

Апробация работы: Материалы» диссертации доложены и обсуждены, на международных и региональных конференциях:. IV научной конференции молодых ученых, аспирантов и> студентов научно-образовательного ■ центра Казанского государственного университета «Материалы, и технологии XXI века» (Казань, 2004), Всероссийской, научной конференции* «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2004), XLII международной научной студенческой' конференции1 «Студент и научно-технический прогресс» секция биология (Новосибирск, 2004) (Диплом III степени), V республиканской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Наука. Инновации. Бизнес.» (Казань, 2005), VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 2007), Международной конференции аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2007, 2009), IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009) (грамота за лучший доклад), Российской школе молодых ученых «Актуальные проблемы современной' биохимии и молекулярной биологии» (Казань, 2010).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 16 научных работ.

Структура и объем диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела экспериментальных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 111 страницах машинописного текста, включает 14 таблиц, 22 рисунка. Библиография содержит 117 наименований российских и зарубежных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Рудакова, Наталья Леонидовна

выводы

1. Подобран состав питательной среды, обеспечивающий высокий уровень продукции металлоэндопептидазы В. ШегтесИш в культуральной жидкости рекомбинантного штамма В. быЬНШ

2. Выделена и очищена гомогенная металлоэндопептидаза МргВ1, со степенью очистки 350 и выходом 11,3%. Молекулярная масса металлоэндопептидазы составляет 191сОа

3. Методом МАЦЛ-ТОБ спектрометрии установлена аминокислотная последовательность МргВ1, определена 1Ч-концевая последовательность зрелого фермента. Фермент классифицирован как металлоэндопептидаза семейства адамализинов/репролизинов клана метцинкинов цинкзависимых металлопротеиназ

4. Установлено, что металлопротеиназа МргВ1 обладает широкой субстратной специфичностью по гидролизу синтетических и природных субстратов

5. Установлено, что металлоэндопептидаза МргВ1 является щелочным термостабильным ферментом, активность которого зависит от присутствия ионов двухвалентных металлов. рН-Оптимум действия фермента лежит к области рН 8,0, интервал стабильности МргВ1 22-55°С

5. Заключение

Классификация, цинкзависимых металлоэндопептидаз (цинкинов) построена на4 основе' структуры активного центра1 с учетом сходства пространственной структуры их каталитических доменов и энзиматических свойств. Анализ большого количества работ позволяет сделать. несколько обобщающих выводов: модификация существующей классификации цинкинов позволяет четко, распределить эти ферменты по кланам в зависимости от аминокислотных остатков в мотиве активного центра; клан метцинкинов включает несколько семейств эндопептидаз, имеющих общие характерные структурные признаки (продленный мотив активного центра .протеазного домена, МЫ-поворот в структуре белка, пространственную структуру протеазного домена), но отличающихся по происхождению, некоторым энзиматическим свойствам (оптимум рН, субстратная специфичность), механизмам секреции и активации предшественников ферментов; физиологическая роль ферментов метцинкинового клана связана не только с важной пищеварительной функцией, но и с регуляторными механизмами, нарушение которых может привести к возникновению и развитию патологических процессов; разработка новых лекарственных препаратов связана с необходимостью глубокого изучения структурных особенностей, физико-химических свойств и функциональной роли фермента в конкретном патологическом процессе и с созданием высокоселективных синтетических ингибиторов для индивидуальных метцинкиновых эндопептидаз.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Штаммы и плазмиды

В работе использовался рекомбинантный эритромициноустойчивый штамм В. Subtilis, который получен путем трансформации плазмиды pSAl с геном металоэндопептидазы в протеазо-дефицитный штамм В. subtilis BG2036 (предоставлен проф. Eugenio Ferrarri, Genencor Int. Inc., USA). Мультикопийная плазмида pSAl, сконструированная на основе экспрессионного вектора рСВ22 [Sorokin et al., 1990], несет полный ген металлопротеиназы В. intermedins mprBi под собственным промотором. Ген •субклонирован с 6 кб фрагмента геномной ДНК В. intermedins, локализованного на плазмиде рСМ4 (вектор рСМ4 получен в ИМГ РАН и предоставлен для работы проф. C.B. Костровым). Нуклеотидная последовательность гена4 mprBi1 хранится' в Международном банке генов «GeneBank» с кодом доступа, АСЕ75740.2. Трансформацию клеток В. subtilis плазмидной ДНК проводили по методу [Anagnostopolous, Spizizen et al., 1961].

2. Условия культивирования рекомбинантного штамма,

Для культивирования клеток рекомбинантного штамма В. subtilis 'BG2036 (pSAl) использованы, среды следующего состава (г/л): бактериологический пептон (Sigma, США) - 1'7, дрожжевой экстракт (Sigma, США) - 10, NaCl - 3, СаС12 - 0,1, MgS04 - 0,1, MnS04 - 0,1, NH4C1 - 0,1, рН 7,7 (пептон-содержащая среда) [Шакиров с соавт., 2000]; L-бульон (среда LB, Лурия-Бертани) (г/л): триптон -10; дрожжевой экстракт - 5; NaCl - 5; рН 7,7 [Sambrook et al., 1989].

Перед посевом в среды добавляли стерильный раствор Na2HP04 из расчета 0,35 г/л. Для увеличения активности металлопротеиназы и продуктивности культуры проводили оптимизацию питательной среды, 'варьируя содержание пептона от 10 до 30 г/л и неорганического фосфата от 0,8 до 1,6 г/л. С этой же целью исследовали влияние казеина, растворенного в дистиллированной воде, и казаминовых кислот, которые стерилизовали отдельно, в конечных концентрациях от 0,1 до 2 г/л, и вносили их в питательную среду перед засевом культуры. Соли двухвалентных металлов в конечных концентрациях: Zn2+ 0,5 - 3,0 мМ, Mg2+ 3,0 - 9,0 мМ, Са2+ 4,0 - 18,0 •мМ, Мп2+ 2,0 - 6,0 мМ и Fe2+ 0,5 - 2,0 мМ вносили в питательную среду перед посевом в виде стерильных растворов. Антибиотик вносили стерильно перед посевом в концентрации 1 мкг/мл. Среды стерилизовали при 1 атм.

Культивирование рекомбинантного штамма проводили на вибростенде (B.Braun, Германия) с интенсивностью качания 200 об/мин при 37°С в течение 30 ч. Соотношение объема среды к объему колбы составляло 1:5. Посевным материалом служил 16-часовой инокулят (1% v/v). Культуральную жидкость освобождали от клеток центрифугированием в течение 20 мин при 8 тыс. об/мин.

Рост бактерий контролировали по изменению оптической плотности культуры, которую измеряли нефелометрически на фотоэлектрокалориметре КФК-2 при 590 нм. Количество биомассы выражали в единицах оптической плотности.

Образование спор Bacillus subtilis определяли с помощью подсчета клеток и спор на окрашенных по Пешкову препаратах в режиме микроскопии (микроскоп Carl Zeiss Jena, Германия) при увеличении 1600 раз в 4 полях зрения. Количество свободных спор выражали в процентах от общего числа вегетативных и спорулирующих клеток. •3. Определение локализации фермента

Локализацию металлопротеиназы определяли измерением уровня протеолитической активности по гидролизу азоказеина в клеточных фракциях. Клетки после 24, 30 и 36 часов культивирования отделяли от культуральной жидкости центрифугированием (5 мин при 10 тыс. об/мин) и отмывали 0,85% раствором NaCl. Клеточную суспензию инкубировали с лизоцимом (1 мг/мл) (Sigma, США) в 10 мМ трис-HCl буфере (Sigma, США) pH 8,5 в присутствии 20% сахарозы (Реахим, Россия) в течение 25 мин при комнатной температуре. Образование протопластов контролировали микроскопированием. Протопласты отделяли центрифугированием при 10 тыс.об/мин в течение 15 мин. Полученный супернатант содержал белки клеточной стенки. Солюбилизацию мембраносвязанных ферментов проводили обработкой протопластов раствором детергента 0,1% Тритон X-100 (Ferak Berlin, Германия) в 0,1 М трис-HCl буфере pH 8,0 с 50 мМ NaCl, а также IM NaCl с добавлением 20 % сахарозы. После инкубации в течение 20 .мин при комнатной температуре смесь центрифугировали (13 тыс. об/мин, 20 мин). Супернатант содержал белки мембраны. Для получения фракции внутриклеточных белков протопласты разрушали осмотическим шоком при добавлении 5 мМ трис-HCl буфера pH 7,8 при 4°С. К смеси добавляли ДНКазу (1 мг/мл) (Koch-Light Limited, Великобритания), инкубировали 30 мин при комнатной температуре и центрифугировали 30 мин при 15 тыс. об/мин. Супернатант содержал фракцию внутриклеточных белков. Чтобы исключить влияние сериновых протеиназ, активность металлопротеиназы во всех фракциях определяли в присутствии 5 мМ PMSF (Serva, Германия). При .определении протеолитической активности металлопротеиназы в клеточных фракциях активность выражали в ед/мг биомассы.

4. Определение белка

Белок определяли спектрофотометрически (Экспериментальные методы исследования белка и нуклеиновых кислот, 1985), считая, что концентрация белка 1 мг/мл соответствует A2so = 1 оптической единице (опт. ед.) в кювете толщиной 1 см, а также по методу Брэдфорд [Bradford, 1976].

5. Определение протеолитической активности

Определение протеолитической активности по гидролизу азоказеина

Протеолитическую активность металлопротеазы определяли по расщеплению азоказеина (Sigma, США) [Charney et al., 1947, Demidyuk et al., 2004]. К 100 мкл субстрата (раствор азоказеина в концентрации 10 мг/мл в 0,05 М трис-HCl буфере pH 7,3 с 5 мМ Са2+) добавляли 50 мкл белка и инкубировали при 37 °С в течение 1 ч, затем реакционную смесь осаждали

10% трихлоруксусной кислотой и выдерживали 10 мин на ледяной бане. Далее пробы центрифугировали 7 мин при 13 тыс. об/мин, отбирали 250 мкл супернатанта и добавляли 50 мкл 4 н NaOH. В качестве контроля использовали субстрат, к которому сначала добавляли ТХУ, выдерживали вместе с опытными пробами в течение 1 ч при 37 °С, а затем добавляли 50 мкл фермента. Против данного контроля проводили измерение на спектрофотометре (Bio-Rad, США) при длине волны 450 нм. За единицу активности принимали количество фермента, гидролизующего в условиях эксперимента 1 мкг субстрата за 1 мин.

Продуктивность культуры в отношении синтеза металлопротеиназы определяли как отношение величины протеолитической активности к величине биомассы и выражали в % или в усл. ед. Удельную активность определяли как отношение протеолитической активности к единице белка и выражали в ед/мг белка. Определение казеинолитической активности

Протеолитическую активность определяли по методу Каверзневой, используя в качестве субстрата казеин (Serva, Германия) [Каверзнева, 1971]. Казеин в концентрации 2% растворяли в 0,1 М Трис-HCl буфере, pH 9,0. Смесь из 1 мл казеина и 1мл культуральной жидкости инкубировали 15 мин при 37°С, осаждали 2 мл 5%-ной ТХУ и инкубировали при той же температуре еще 20 мин, затем фильтровали через бумажный фильтр. К 1 мл фильтрата добавляли 5 мл 6%-ной Na2C03 и 1 мл реактива Фолина. Смесь ставили на 20 мин в темноту для полного проявления окраски, а затем измеряли оптическую плотность при длине волны 670 нм на ФЭКе. Параллельно ставили контроль на свободный тирозин следующим образом: смешивали- 1 мл культуральной жидкости и 2 мл 5%-ной ТХУ и инкубировали 20 мин при 37°С, после чего добавляли 1 мл 2%-ного казеина и выдерживали еще 15 мин при той же температуре. С фильтратом поступали, как описано выше. Протеолитическую активность рассчитывали по формуле:

TrA (£>„ -Dk)-28 Р

ПА = —-к—-, где

15

Do-Dk — разность поглощения опытной и контрольной пробы при 670 нм;

28 - коэффициент, учитывающий разведения в процессе определения активности,

Р — предварительное разведение ферментного раствора,

15 - время инкубации, мин.

По калибровочной кривой, предварительно построенной для тирозина, определяли количество тирозина (мкг) для величины D0 — D^ затем по формуле рассчитывали казеинолитическую активность. Для перевода в мкМ расщепленного субстрата полученную величину делили на 181 (1 мкМ тирозина = 181 мкг).

За единицу казеинолитической активности принимали количество фермента, необходимое для образования 1 мкМ тирозина за 1 мин на 1 мл 'ферментного раствора.

6. Выделение и очистка протеиназы рекомбинантного штамма

Для выделения фермента использовали бацитрацин-силохром, синтезированный на химическом факультете МГУ г. Москва [Stepanov et al., 1983], ДЭАЭ-целлюлозу (Sigma, США), бутил-сефарозу HiTrap (Pharmacia, США).

Выделение фермента

Выделение металлопротеиназы В. intermedius из 1 л культуральной жидкости рекомбинантного штамма В. subtilis проводили с помощью 'дробного фракционирования сульфатом аммония с разными интервалами насыщения: 0,3-0,8; 0,2-0,8; 0,3-0,7 и 0,2-0,7. Сульфатаммонийную фракцию диализовали против 0,05М трис-HCl буфера рН 7,3 до исчезновения следов сульфата аммония (контроль - 5%-й раствор ВаС12). Очистку диализата сульфатаммонийной фракции проводили на колонке (1x13 см) с бацитрацин-силохромом, уравновешенным 0,05М трис-HCl буфером рН 7,3, с 5 мМ Са2+ Элюцию проводили тем же буфером, содержащим 1М NaCl и 7% изопропанола. Фракции с высокой протеолитической активностью объединяли и диализовали против 0,05 М трис-НС1 буфера рН 7,3 с 5 мМ Са2+.

Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе

Полученный после очистки на бацитрацин-силохроме и диализа против 0,01М трис-НС1 буфера рН 8,0 с 5 мМ Са ферментный раствор помещали на колонку (1x7см) с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной тем же буфером. Элюцию проводили тем же буфером, содержащим 0,6 М №С1. Активные фракции белка объединяли и диализовали против 0,05 М трис-НС1 буфера рН 7,3 с 5 мМ Са2+.

Очистка фермента на гидрофобном носителе бутил-сефарозе

Для осуществления связывания металлопротеиназы с гидрофобным сорбентом в раствор фермента необходимо внести, сульфат аммония до концентрации, близкой к той, при" которой фермент теряет активность^ и выпадает в осадок. Экспериментально установлено^ что такой концентрацией является концентрация^ сульфата аммония* 35%. На колонку с бутил-сефарозой объемом 1 мл, уравновешенной 0,05 М трис-НС1 буфером рН7,3 с

Л I

5 мМ Са , содержащим 35% сульфата! аммония, помещали фермент, отдиализованный против 0,05 М трис-НС1 буфера рН 7,3 с 5 мМ Са2+, содержащим 35% сульфата аммония. Элюцию проводили тем же буфером с понижением концентрации сульфата аммония до 20-15%.

Полученные после ионообменной хроматографии на бутил-сефарозе фракции собирали и диализовали против 0,05М трис-НС1 буфера рН 7,3 с 5 мМ Са2+.

7. Электрофорез в ПААГ

Степень чистоты полученных препаратов и молекулярную массу определяли методом электрофореза в 12,5%-ном ПААГ в присутствии БОБ по методу Лаэммли [ЬаешгпН, 1970]. Концентрация акриламида в геле составляла 12,5%, бис-акриламида - 0,12%. Электродный буфер содержал 20,6 мМ трис-НС1 и 0,24 М*глицина, рН 8,3 -8,4. В верхний буфер добавляли

SDS до концентрации ОД %. Пробу готовили следующим образом: к раствору белка добавляли равный объем раствора, содержащего 24% глицерина, 4% SDS, 10% меркаптоэтанола и инкубировали 5 мин при 100°С. Оптимальное количество белка, наносимого на одну дорожку геля, равно 5 мкг. Электрофорез проводили в следующем режиме: первые 30' мин сила тока была равна 20 мА, затем силу тока увеличили до 40 мА. Фиксировали гель в растворе, содержащем 45 % этанола и 10% уксусной кислоты в течение часа. Затем гель окрашивали Кумасси (Serva, Германия) ярко-голубым (0,2% Кумасси 45% метанола или этанола, 10% уксусной-кислоты) в течение 15-20 мин, после чего отмывали в 7% уксусной- кислоте и высушивали. В качестве маркеров использовали: BSA (66 кДа), альбумин (45 кДа), папаин (21 кДа), лизоцим (14,4 кДа) (Sigma, США).

Также проводили окраску геля раствором ZnCk (http://www.molbiol.ru/protocol/l7 03.html). Чувствительность.данного метода составляет 30 нг белка. В последнем случае гель предварительно-выдерживали в течение 10 ми& в 0,2 M растворе имидазола, а затем переносили в 0,3 M раствор ZnCb- В результате^ наблюдалось негативное окрашивание белковых полос. Для» приготовления растворов1, использовали деионизированную воду.

Молекулярную массу фермента определяли электрофоретически, используя маркерные белки, а также на основании последовательности гена mprBi с использованием ресурса http://www.expasv.net/tools/. 8. Влияние ингибиторов на'активность металлопротеиназы MprBi

Для выяснения влияния' ингибиторов на активность металлопротеиназы фермент выдерживали в присутствии реагента в течение 1 ч при комнатной температуре, после чего определяли остаточную активность по гидролизу азоказеина. Остаточную активность выражали в процентах относительно контроля, активность которого принимали за 100 % в отсутствие ингибиторов в реакционной смеси. В работе использовали: специфический ингибитор сериновых протеиназ PMSF, ингибиторы металлопротеиназ ЭДТА и 1,10-фенантролин, а также рСМВ, HgCb и белковый ингибитор трипсина. Ингибиторы добавляли к раствору фермента в конечных концентрациях 0,5 мМ и 5 мМ.

9. Масс-спектрометрический анализ (MALDI-TOF)

Фракцию гомогенного препарата металлопротеиназы анализировали с •помощью метода масс-спектрометрии. Метод основан на расщеплении белка трипсином с последующей идентификацией полученных при расщеплении пептидов различной молекулярной массы. Раствор фермента обрабатывали трипсином по методике, изложенной на сайте ("http://www.bioc.uzh.сЮ. Полученные пептиды различной молекулярной массы идентифицировали на масс-спектрометре Vision 2000 TOF («ThermoBioanalysis», Великобритания). Полученные данные обрабатывали с помощью программ Peptide Mass Fingerprint (http://www.matrixscience.com.) и Peptide Mass (http ://cn. expasy.org).

10^ Определение N-концевой последовательности белка

N-концевую аминокислотную последовательность белка определяли методом Эдмана на приборе Model 816 Protein Sequences (Гиссен, Германия) с использованием анализатора 120А PTH (Applied Biosystems, GUIA). 11. Определение субстратной специфичности фермента Субстратную специфичность металлопротеиназы определяли по гидролизу синтетических субстратов Dnp-Ala-Ala-Leu-Arg-NH2, Dnp-Gly-Gly-Phe-Arg, Dnp-Gly-Gly-Ile-Arg, Dnp-Gly-Gly-Lys, Dnp-Gly-Gly-Leu-Arg, Dnp-Ala-Ala-Val-Arg по методу Люблинской [Люблинская с соавт., 1987]. К 200 мкл •раствора субстрата в 0,05М Трис-HCl буфере pH 7,0, содержащем 10 мМ СаСЬ, прибавляли 200 мкл этого же буфера и 50 мкл раствора фермента, инкубировали 30 мин при 37 °С, останавливали реакцию прибавлением 40 мкл 50% уксусной кислоты. Для отделения нерасщепленного субстрата от продуктов гидролиза реакционную смесь разделяли на микроколонке с SP-сефадексом С-25 (Pharmacia, Швеция), промывали 400 мкл 1 М уксусной кислоты, элюировали 1,2 мл 1 М уксусной кислоты и измеряли поглощение на спектрофотометре (Bio-Rad, США) при 360 нм в кювете толщиной 1 см. Протеолитическую активность рассчитывали по формуле:

ПА = —--, где

15 ■ а

1,2 - объем измеряемой пробы (мл),

15 - коэффициент молярной экстинкции Dnp-группы при 360 нм, t — время инкубации (мин), а - количество фермента в пробе (мл), в - разведение раствора фермента.

За единицу активности принимали активность такого количества фермента, которое в данных условиях гидролизует 1 мкМ субстрата за 1 мин.

Специфичность металлопротеиназы определяли также по гидролизу природных субстратов: B-цепи окисленного инсулина, казеина по Гаммерстену и яичного альбумина (Sigma, США). Анализ полученных после гидролиза B-цепи пептидов проводили с помощью метода масс-спектрометрии MALDI-TOF (http:\expasy.net\tools). Специфичность металлопротеиназы по гидролизу казеина по Гаммерстену (Sigma, США) и 'яичного альбумина (Sigma, США) определяли по методу Каверзневой как описано выше.

12. Каталитические и энзиматические свойства металлопротеиназы MprBi

Кинетические константы

Кт для металлопротеиназы В. intermedins, секретируемой В. subtilis, определяли по гидролизу азоказеина. Расчеты проводили при помощи графика, построенного в координатах Лайнуивера-Берка в программной среде «Excel». Каталитическую константу £кат рассчитывали по формуле: ^кат Vmax/[E] , где [Е] — концентрация фермента.

I 52

Изоэлектрическую точку фермента определяли на основе аминокислотной последовательности с использованием ресурса http://www.expasy.net/tools/. рН-оптимум и рН-стабипъностъ рН-Оптимум активности фермента определяли по гидролизу азоказеина в 0,05 М трис-НС1 буфере с 5 мМ Са2+ в интервале значений рН от 7,2 до 9,5. Для определения рН-стабильности фермент предварительно инкубировали в 0,05 М трис-НС1 буфере при значениях рН от 7,2 до 9,5 в течение 24 ч при комнатной температуре, после чего определяли активность по стандартной методике.

Температурный оптимум и термостабильность

Температурный оптимум фермента определяли по гидролизу азоказеина в 0,05 М Трис-НС1 буфере рН 8,0 с 5 мМ Са , инкубируя реакционную смесь при температурах 22, 37, 45, 50, 55, 60, 65, 70° С.

При изучении термостабильности растворы фермента предварительно инкубировали 40 мин при температурах от 22° до 70° С и затем определяли активность металлопротеиназы по гидролизу азоказеина по стандартной методике.

Влияние ионов металлов на активность металлопротеиназы

При изучении влияния ионов двухвалентных металлов на активность металлопротеиназы использовали хлориды кальция, магния, кобальта, меди и никеля в конечной концентрации от 1 до 20 мМ, хлорид цинка - в конечной концентрации от 0,01 до 20 мМ. К ферментному раствору добавляли растворы двухвалентных металлов и выдерживали при комнатной температуре в течение 15 мин, затем определяли активность фермента по гидролизу азоказеина и выражали в процентах относительно контроля. Контролем (100 %) служил уровень активности фермента в отсутствие ионов металлов.

13. Математическая обработка результатов

Результаты двухфакторных экспериментов по оптимизации питательной среды обрабатывали с помощью программы STATGRAPHICS, позволяющей выводить на экран уравнение регрессии, степень достоверности модели и графические изображения поверхности отклика.

Для статистического анализа экспериментальных данных использовали программу Microsoft Excel. Для описания и сравнения признаков использовали построения 95%-ных доверительных интервалов для средних.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Среды для культивирования рекомбинантного штамма В. subtilis

Для культивирования рекомбинантного штамма В.subtilis выбрали две среды: среда LB как оптимальная для культивирования рекомбинантных штаммов и пептон-содержащая среда, ранее разработанная для получения максимальной продукции сериновых протеиназ Bacillus intermedius [Шакиров с соавт., 2000, Габдрахманова с соавт., 2002, Balaban et al., 2004, Частухина с соавт., 2004, 2005, Кириллова с соавт., 2006а, Маликова с соавт., .2006, 2007, Балабан с соавт., 2008]. Сравнительное культивирование рекомбинантного штамма на средах проводили по показателям роста культуры продуцента (OD590), активности металлопротеиназы, а также продуктивности культуры (рис. 6).

1,6 п СЮ590 ш активность ■ продуктивность

Рис. 6. Сравнение эффективности двух сред - среды ЬВ и пептон-содержащей среды - для получения максимальной продукции металлопротеиназы МргВ1 рекомбинантного штамма В. 8иЫШ$

Показано, что рост и продуктивность культуры, а также активность •металлопротеиназы на пептон-содержащей среде превышали таковые на среде ЬВ. В связи с этим для дальнейшей работы была выбрана пептон-содержащая среда.

2. Динамика роста и накопления металлопротеиназы Мрг1И в культуральной жидкости рекомбинантного штамма В. быЫШб

При исследовании* динамики роста и накопления протеолитической активности металлопротеазы МргВ1 рекомбинантного штамма В. яиЫШя на пептон-содержащей среде показано, что активность фермента появляется в культуральной жидкости на 17-й час роста, её уровень достигает максимума на 29-31 ч роста, что соответствует стационарной фазе роста культуры. Протеолитическая активность беспротеазного штамма зиЬйШ обнаружена в культуральной жидкости в следовых количествах по сравнению с уровнем активности рекомбинантного штамма (рис. 7).

В культуральной жидкости рекомбинантного штамма протеолитическая активность фермента ингибируется 5 мМ 1,10-фенантролина, в то время как 5 мМ РМ8Р не оказывает влияния, что свидетельствует о принадлежности протеиназы к классу металлопротеиназ (табл. 1).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рудакова, Наталья Леонидовна, Казань

1. Габдрахманова, JI.A. Среда для биосинтеза глутамилэндопептидазы Bacillus intermedins рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis Текст. / Л. А. Габдрахманова, Е.В. Шакиров, Н.П. Балабан и др. // Микробиология. 2000. - Т. 69,№ 5. - С. 653-659.

2. Демидюк, И.В. Молекулярные механизмы стабилизации протеолитических ферментовю Модель термолизиноподобных микробных металлопротеиназ Текст. / И.В. Демидюк, М.В. Заболотская, Д.Р. Сафина, C.B. Костров // Биоорг. Химия. 2003. - Т.29, No5. -С.461-469.

3. Ицкович, Е.Л. Биосинтез щелочной внеклеточной протеиназы Bacillus intermedins Текст. / Е.Л. Ицкович, Л.В. Знаменская, Н.П. Балабан, Т.А. Ершова, И.Б. Лещинская // Микробиология. 1995. - Т.64,№.5. - С. 623 -629.ь

4. Люблинская, JI.A. р-Нитроанилиды пироглутамилпептидов -хромогенных субстратов сериновых протеиназ Текст. / JI.A. Люблинская, Т.Л. Воюшина, В.М. Степанов // Биоорганическая химия. -1987. Т. 13,№ 6. - С. 748-753.

5. Маликова, Л¿A. Условия биосинтеза внеклеточной субтилизиноподобной протеиназы Bacillus pumilus КММ 62 Текст. / Л.А. Маликова, A.M. Марданова, Е.А. Соколова, Н.П. Балабан, Г.Н. Руденская, М.Р. Шарипова // Микробиология. 2007. - Т.76,№3. -С.313-320.

6. Морозова, И.П. Выделение и характеристика металлопротеиназы Bacillus megaterium Текст. / И.П. Морозова, Г.Г. Честухина, М.Е.

7. Борматова, М.Ю. Гололобов, Н.М. Иванова, Е.Н. Лысогорская, И.Ю.Филиппова, О.М. Ходова, Е.А. Тимохина, В.М. Степанов. // Биохимия. 1993. - Т.58,№6. - С. 896 - 907.

8. Сафонова, М.Е. Особенности роста и продукции внеклеточных протеиназ Lactobacillus plantarum ИМ-9/138 Текст. / М.Е. Сафонова, Н.И. Астапович, И.А. Буряко // Микробиология. 1999. - Т.68,№ 4. - С. 396-403.

9. Хазиев, А.Ф. Изучение эффективности методов очистки металлопротеазы, продуцируемой Bacillus subtilis Текст. / А.Ф. Хазиев, Н.А. Михайлова, М.М. Алсынбаев // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2002. - №6. - С. 75 - 77.

10. Хазиев, А.Ф. Изучение свойств высокоочищенной металлопротеазы, продуцируемой Bacillus subtilis Текст. / А.Ф. Хазиев, Н.А. Михайлова, М.М. Алсынбаев // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2003. - №3. - С. 91 - 93.

11. Хофманн, Э. Что может дать медицине секвенирование генома человека Текст. / Э. Хофманн // Биохимия, 2001, Т.66, №10, С. 1415-1424.

12. Шакиров, Е.В. Влияние компонентов питательной среды на накопление глутамилэндопептидазы в культуральной жидкости Bacillus intermedius99