Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональный анализ каталитического антитела А.17. Каталитический механизм деградации фосфорорганического пестицида параоксон

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональный анализ каталитического антитела А.17. Каталитический механизм деградации фосфорорганического пестицида параоксон"

Учреждение Российской Академий Наук

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

4856727

на правах рукописи

/

Куркова Инна Николаевна

Структурно-функциональный анализ каталитического антитела А. 17. Каталитический механизм деградации фосфорорганического пестицида параоксон.

Специальность: 03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

-6 0НТ2011

Москва-2011

4856727

Работа выполнена в Учреждении РАН Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.Л. Овчинникова

Научные руководители:

доктор биологических наук Пономаренко Наталья Александровна кандидат химических наук Смирнов Иван Витальевич Официальные оппоненты:

Деев Сергей Михайлович

доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАН, заведующий лабораторией молекулярной иммунологии Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова (ИБХ РАН)

Демидкина Татьяна Викторовна

доктор химических наук, профессор, заведующая лабораторией химических основ биокатализа Института молекулярной биологии им. В. А. Энгель-гардта (ИМБ РАН).

Ведущая организация: Учреждение Российской Академий Наук Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится «¿6» СШ6№ 2011 года в 4$> часов на заседании диссертационного совета Д 002.019.01 при Учреждении РАН Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова по адресу: 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБХ РАН

Автореферат разослан С?Н7 , 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор физико-математических наук

В.А. Олейников

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Поиск эффективного антидота, способного нейтрализовать фосфорорганические токсины (ФОТ), остается актуальной проблемой молекулярной биологии и биотехнологии. Самыми многообещающими среди прочих в этой области являются разработки препаратов на основе ферментов. Ферменты, участвующие в метаболизме ацетилхолина, являются основными мишенями ФОТ в организме человека. На сегодняшний день бутерилхолинэстераза (BChE) считается перспективным средством антидотной профилактики и лечения отравлений ФОТ. Существующие в данный момент промышленные системы экспресии BChE дороги, недостаточно эффективны и требуют существенного улучшения. В настоящее время рекомбинантные антитела широко применяются как терапевтические агенты и имеют ряд преимуществ перед ферментами в качестве лекарственных средств. Потенциальный антидот на основе каталитического антитела (абзима) будет сочетать в себе свойство фермента - способность эффективно осуществлять катализ - с низкой иммуногенностью, продолжительным периодом циркуляции в кровотоке и действенными механизмами выведения из организма в составе комплекса антиген-антитело, характерными для молекул иммуноглобулинов. В связи с этим создание «каталитической» вакцины - каталитического антитела, способного нейтрализовать ФОТ, - актуально. Кроме того, изучение механизма катализа подобных искусственных ферментов представляет собой самостоятельную, весьма интересную с точки зрения фундаментальной науки проблему.

Цель работы. Цель настоящего исследования состояла в проведении структурно-функционального анализа каталитического антитела А.17, полученного ранее в лаборатории биокатализа методом фагового дисплея. Вариабельные домены данного антитела были отобраны из полусинтетической библиотеки генов одноцепочечных антител по принципу «механизм-зависимого» связывания с л-нитрофенил 8-метил-8-азабицикло[3.2.1]октан фенилфосфонатом (фосфонатом X), аналогом ФОТ по механизму действия на сериновые гидролазы. Кроме того, самостоятельной задачей представленной работы стало изучение каталитического механизма деградации ФОТ на примере фосфорорганического пестицида параоксон.

Научная новизна И практическая значимость работы. Полученные в результате работы данные позволили существенно продвинуться в понимании структурной организации активного центра искусственно полученного биокатализатора имму-ноглобулиновой природы. Впервые разрешена структура как Fab фрагмента каталитического антитела А.17 и его ковалентного аддукта с остатком фосфоната X. Комплекс-

3

ное физико-химическое исследование позволило предположить осуществление механизма индуцированного соответствия при взаимодействии А.17 с фосфонатом X. Изучение функциональной активности абзима позволило выявить его способность ускорять гидролиз фосфорорганического пестицида параохсон. Было показано, что данное превращение осуществляется по пути ковалентного катализа. Полученные результаты могут быть использованы как основа для рационального дизайна с целью улучшения каталитической эффективности имеющейся активности А.17 или при получении новых биокатализаторов. Полученные данные могут иметь биотехнологическое значение.

Апробация работы. Результаты данной работы были представлены на 3-ей международной конференции «Ранние события при патологиях человека» (Барбизон, Франция, 2010), 35-м конгрессе FEBS (Гетеборг, Швеция, 2010), 36-м конгрессе FEBS (Турин, Италия, 2011), 21-м IUBMB и 12-м FAOBMB Международном конгрессе Биохимии и Молекулярной биологии (Шанхай, Китай, 2009). По материалам работы вышли 3 статьи в рецензируемых журналах.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена страницах машинописного текста и состоит из разделов введение, обзор литературы, экспериментальная часть, включающая разделы «результаты и их обсуждение» и «материалы и методы», выводы, дополнительные материалы и список цитируемой литературы, содержащий 149 ссылок. В работе содержитсярисунка и .¿.таблицу бриц. V í ~ati}.

_ -i ïji&iv' LciwJiHoJMikcu- -л&г-гршиш..

Содержание работы о '

Одноцепочечное антитело А.17 взаимодействует с фосфорорганиче-ским пестицидом параоксон

Каталитическое антитело А.17 было отобрано из фаг-дисплейной библиотеки генов одноцепочечных антител по способности связывать механизм-зависимый ингибитор сериновых гидролаз и ацетилхолинэстеразы-фософнат X (Рис.1). Методом масс-спектрометрии MALDI было показано, что модификации подвергается аминокислотный остаток Туг37 легкой цепи (Reshetnyak et al, J Ara Chem Soc, 2007). Представлялось значимым и интересным проверить связывание и каталитические функции данного антитела по отношению к ряду ФОТ. На первом этапе настоящей работы было показано, что реакция одноцепочечного антитела А.17 с биотинилированным производным фосфоната X (Bt-X) ингибируется диизопропилфтор фосфатом (ДФФ), 4-(2-аминоэтил) бензилсульфонил фторидом (АЭБСФ) и

инсектицидом параоксон (Рис. 1). Детекцию взаимодействия проводили с помощью

Вестерн блот анализа, результаты приведены на рисунке 2.

Рис. 1. Химические структуры фосфорорга-нических соединений, использованных в работе: 1 /7-нитрофенил 8метил-8-азабицикло[3.2.11о1стил фенилфосфонат ([*=Н фосфонат X, биотин ВЬХ), 2 дии-зопропил фторфосфат (ДФФ), 3 4-(2-аминоэтил) бензилсульфонил фторид (АЭБСФ), 4 2-диэтоксифосфорилтиоэтил-триметиламмониум (экотиофат),5 0,0-диэтил 0-(4-нитрофенил) фосфонат (параоксон), 6 ¿>(4-нитрофенилфосфорил)холин.

Рис. 2. Вестерн блот анализ ингибирования связывания одноцепочечного антитела зсРу А.17 с биотинилированным фосфонатом X необратимыми ингибиторами. Во всех случаях концентрация активных центров антител составляла 1 мкМ, концентрация В(:-Х 100 мкМ, концентрация ингибиторов 1 мМ, реакция проходила в течение часа при 37°С, объем реакционной смеси 20 мкл. Предин-кубация осуществлялась при 37°С. Время прединкубации составляло 1 час для всех ингибиторов, кроме экотиофата и параоксо-на. Для последних время прединкубации составляло 12 часов. Визуализацию кова-лентного аддукта с ВЬХ осуществляли окрашиванием стрептавидином, конъюгиро-ванным с пероксидазой хрена (Б^ерМИРР). Концентрация антител нормирована по сравнительной окраске антителами, специфичными к с-тус эпитопу на аналогичной мембране. А.17У-1_37Р -отрицательный контроль - мутантное одноцепочечное антитело.

Создание эукариотической системы экспрессии полноразмерного антитела А.17

Для одноцепочечных антител известны проблемы экспрессии, протеолитической лабильности и фолдинга (в том числе склонность к агрегации). Полноразмерное антитело предпочтительнее использовать в качестве терапевтического агента в связи с большим периодом его циркуляции в кровотоке и его способностью запускать гуморальные и клеточные эффекторные механизмы выведения комплексов с антигеном. При перестановке конструкций одноцепочечных антител в полноразмерные иммуноглобулины класса в специфичность антиген связывающего центра обычно сохраняется, а аффинность может возрастает благодаря бивалентной природе

В продолжение работы вариабельные фрагменты легкой и тяжелой цепей А.17 были переклонированы в вектора для экспрессии в виде полноразмерных легкой и тяжелой цепей в эукариотической системе.

1 2

сн, р

V С

N02

5

¡1 г~ Ч г\я

- НО-Р-

V х-

"а

N02 ^^N02

ш шШ Ш шштшшт апи - с-тус

51гер1-Н!*Р

При этом вариабельный фрагмент легкой цепи А.17 был переклонирован для экспрессии в виде полноразмерной каппа 1 цепи иммуноглобулина человека под контролем иммуноглобулинового промотера.

Экспрессионный вектор с сайтами клонирования вариабельного фрагмента легкой цепи антитела (pSV40/Zeo2 Lch) был получен модификацией вектора pSV40/Zeo2 (Invitrogen). Фрагмент ДНК, кодирующий последовательность лидерного пептида для легких цепей антитела (L prom leader - MVSTPQFLVFLLFWIPASRG), был синтезирован методом ПЦР с использованием трех олигонуклеотидов с перекрывающимися последовательностями. Фрагмент ДНК, кодирующий последовательность константного региона каппа 1легкой цепи иммуноглобулина человека (kappa chain), был получен амплификацией с помощью ПЦР, используя геномную ДНК человека в качестве матрицы и пару специфических праймеров. Участок ДНК, кодирующий вариабельный фрагмент легкой цепи антитела А.17 (VI А.17), амплифицировали с помощью ПЦР с использованием плазмиды pHEN2, несущей нуклеотидную последовательность, кодирующую scFvA.17 (pHEN2A.17), в качестве матрицы и пары специфических праймеров.

В свою очередь, вариабельный фрагмент тяжелой цепи А.17 был переклонирован для экспрессии в виде полноразмерной гамма 1 цепи иммуноглобулина человека также под контролем иммуноглобулинового промотера.

Экспрессионный вектор с сайтами клонирования вариабельного фрагмента легкой цепи антитела (pcDNA.1.3.HygroHch) был получен модификацией вектора pcDNA.1.3.Hygro (Invitrogen). Фрагмент ДНК, кодирующий последовательность лидерного пептида для тяжелых цепей антитела (Н prom leader MERHWIFLSLLSVIAGVHS), был синтезирован методом ПЦР с использованием трех олигонуклеотидов с перекрывающимися последовательностями. Фрагмент ДНК, кодирующий последовательность константного региона гамма 1 тяжелой цепи иммуноглобулина человека (gamma chain), был амплифицирован с помощью ПЦР, используя в качестве матрицы геномную ДНК человека и две пары специфических праймеров. ПЦР-амплификацию фрагмента ДНК, кодирующего вариабельный фрагмент тяжелой цепи антитела А.17 (Vh А.17), осуществляли с использованием в качестве матрицы pHEN2A.17 и специфических праймеров.

Схема полученных генетических конструкций pSV40/Zeo2 Lch А.17 и pcDNA.1.3Hygro Hch А.17 представлена на рис.3.

Рис. 3. Схема генетических конструкций для экспрессии полноразмерных легкой и тяжелой I цепей антитела А.17 в эукариотическои системе.

Полученными генетическими конструкциями была проведена ко-трансфекция клеточных линий СНО-К1 и миеломы NSObcl2. В результате селекции с использованием антибиотиков зеоцин и гигромицин были получены 5 стабильно продуцирующих кло-I нов трансфектом. Уровень продукции рекомбинантных антител оценивали методом _ ИФА по схеме sandwich ELISA. Для каждого клона были подобраны оптимальные условия экспрессии. Для лучшего клона 2В5 из трансфектом клеток линии СНО-К1 среда DMEM, содержащая 2% фетальной сыворотки, и среда Рго-СН04 (Lonza) являются оптимальными, концентрация человеческих антител в культуральной среде достигает максимума на 8 день и составляет 10 мг/мл. Для лучшего клона 2G3 из трансфектом I клеток линии NSO-bcl2 оптимальной является среда DMEM-RPMI (Gibco) 50% на 50%, содержащая 2% фетальной сыворотки. Концентрация человеческих антител в этой культуральной среде достигает 18 мг/мл на 8 день.

Затем была разработана система экспрессии антитела а.17 в препаративных количествах. Для этого были использованы культуральные флаконы большой площади (175 и 225 см2), роллеры (1700 см2) и спиннеры с микроносителями. Оптимальной по соотношению «выход целевого белка - затраты» и чистоте финального продукта была признана экспрессия в культуральных флаконах площадью 225 см" на бессывороточной среде Рго-СН04, в процессе культивирования удалось добиться уровня экспрессии 10 мг антитела с литра для клона 2В5 клеточной линии СНО.

Культуральную среду собирали, центрифугировали, супернатант фильтровали через бумажные фильтры. Осветленную культуральную среду подвергали ультрафильтрации на приборе Pellicon (Millipore) на мембранах 300 кДа. При этом отделяли остатки клеточного дебриса и высокомолекулярные соединения. Далее фильтрат концентриро-I вали на мембранах 30 кДа в 10-20 раз по объему и переводили под буферный раствор PBS. Полученный концентрат был последовательно очищен методом аффинной хроматографии на колонках с иммобилизованным белком А и иммобилизованными антите-

лами козы, специфичными к иммуноглобулинам человека, после чего осуществляли гель-фильтрацию на колонке Superdex 200 (Amersham). Выход целевого белка оценивался методом ИФА и составил 70%. Чистоту полученного продукта оценивали с использованием денатурирующего электрофореза в 12% ПААГ в восстанавливающих условиях с последующей окраской Кумассии синим R250, чистота достигала 95% (Рис.

4).

А Б

кд М

116 ' ■ W»«

бь.2 анти-Fc-HRP

45.0 ~ 35.0

25.0 — •» <а

18 4 14.4

Рис. 4. Элеетрофореграмма денатурирующего 12% ПААГ в восстанавливающих условиях с последующей окраской Кумассии синим R250 (А) и Вестерн-блот анализ (Б) очищенного препарата полноразмерного рекомбинантного антитела А.17 из среды культивирования трансфектомы 2В5 кле-анти-k-HRP точной линии СНО. Визуализацию осуществляли с использованием антител козы, специфичных к Fc фрагменту (верхняя панель) и каппа цепи (нижняя панель) антител человека, конъюгированных с пероксидазой хрена. М -маркер молекулярных весов.

Сравнение функциональной активности одноцепочечного и полноразмерного антитела А.17

Анализ реакционной способности показал, что вариабельные фрагменты легких и тяжелых цепей А.17, экспрессированные в составе полноразмерного антитела человека, сохранили способность взаимодействовать с небиотинилированным фосфонотом X. Оценка кинетических параметров этого взаимодействия с использованием схемы Кит-ца-Вилсона показала, что реакционная способность полноразмерного антитела значительно выше по сравнению с опубликованными ранее данными для одноцепочечного антитела (таблица 1).

Таблица 1. Кинетические параметры реакции одноцепочечного и полноразмерного антитела А.17 с фосфонатом X (по схеме Китца-Вилсона). Измерение проводили при 37°С, концентрация активных центров А.17 1 мкМ, концентрацию фосфоната X варьировали от 10 до 100 мкМ.

Абзим

к2, мин"1 Кдис, мкМ Шдио.шт'Ы'

бсРУ А.17 0.32± 0.05 151±21 0.21± 0.03

А.17 |дб 0.25 ±0.02 6.2 ± 0.4 4.0 ± 0.6

При этом эффективность модификации полноразмерного антитела увеличилась более чем в 10 раз по сравнению с одноцепочечным А.17. Такое увеличиние эффективности модификации достигается за счет образования более прочного нековалентного комплекса антитела с фосфонатом X, что, по всей видимости, связано с лучшей стабилизацией антиген-связывающего участка полноразмерного антитела. Незначительное

снижение к2, т.е. скорости перехода обратимого комплекса с ингибитором в ковалент-ный, возможно связано с тем, что константные участки легких и тяжелых цепей ограничивают подвижность вариабельных участков молекулы в активном центре.

Методом масс-спектрометрии МА1Л51 было установлено, что ковалентная модификация полноразмерного антитела А. 17 фосфонатом X происходит по тому же пептидному участку легкой цепи иммуноглобулина, что и в случае одноцепочечного антитела.

Было показано, что полноразмерное антитело сохранило способность взаимодействия с биотинилированным производным фосфоната X и субстратную специфичность по отношению к аналогам ФОТ, сравнимую с одноцепочечным А.17. В обоих случаях модификация фосфонатом ВЬХ ингибируется ДФФ, АЭБСФ и параоксоном, тогда как ингибирование отсутствует в случае экотиофата (Рис.5). Интересно, что химические структуры экотиофата и параоксона довольно схожи. Отсутствие взаимодействия с экотиофатом может быть объяснено различными свойствами химических связей Р-Э и Р-О. По-видимому, нуклеофильная атака со стороны гидроксила боковой группы Туг37 легкой цепи антитела оказывается более эффективной в случае более поляризованной связи Р-О. Возможно также, что продуктивному позиционированию молекулы экотиофата в активном центре А.17 мешает его заряженная боковая группа. Полученные данные демонстрируют субстратную селективность активного центра изучаемого искусственного биокатализатора.

5С(=УА,17+В1-Х

-

Рис. 5. Вестерн блот анализ ингибирования свяЛ л ^ зывания одноцепочечного (scFvA.l/) и полно-ч-4- rs 0+с° размерного антитела А.17 с биотинилированным

фосфонатом X необратимыми ингибиторами. Во всех случаях концентрация активных центров ан-шттшшт ага-с-шус тител составляла 1 мкМ, концентрация Bt-X 100 мкМ, концентрация ингибиторов 1 мМ, реакцию _ ..... strept-HRp проводили в течение часа при 37°С, объем реакционной смеси 20 мкл. Прединкубация осуществлялась при 37°С. Время прединкубации составляло 1 час для всех ингибиторов, кроме экотиофата A.i7+Bt-x и параоксона. Для последних время прединкуба---ции составляло 12 часов. A.1/Y-L37F -отрицательный контроль - мутантное одноцепочечное л л- антитело. Визуализацию ковалентного аддукта с _ ^/г jr Bt-X осуществляли окраской стрептавидином, 03 <рг конъюгированным с пероксидазой хрена. Концен-

_______ ^, трацию антител нормировали по сравнительной

** ' •" окраске антителами, специфичными к с-тус эпи-

топу, на аналогичной мембране в случае scFv и ииг -„яг_- streot-HRP антителами, специфическими к Fc фрагменту тяжелой цепи антитела человека, на той же мембране в случае полноразмерного антитела.

Для изучения молекулярных основ механизма катализа абзима перспективным представлялось проведение рентгеноструктурного анализа Fab фрагмента этого антитела.

Структурный анализ антитела А.17

Кристаллизация осуществлялась в лаборатории П. Массона в Гренобле, Франция. Детальный анализ структуры был произведен в сотрудничестве с профессором А. Тра-монтано (Дэвис, Калифорния), профессором А. Фрибуле (Компьень, Франция) и лабораторией профессора А.Г. Габибова в рамках проекта НАТО «Наука для мира». Структуры Fab фрагмента антитела А.17 и его аддукта с остатком фосфоната X были установлены с разрешением 1.5 А и 1.36 А соответственно. Координаты атомов и экспериментальные структурные факторы депонированы в Банк белковых структур (Protein Data Bank) с идентификационным кодом 2XZA и 2XZC.

Пространственная структура Fab фрагмента антитела А.17

Антигенсвязывающий центр антитела образован тремя Р-тяжами вариабельного фрагмента легкой и четырьмя Р-тяжами вариабельного фрагмента тяжелой цепи. Совместно они образуют глубокую полость, в формировании стенки которой так же участвует петля Leu99-Glyll0 тяжелой цепи. Полость пространственно разделена на две «камеры» (Рис.бА-В). В составе верхней камеры выделяется группа ароматических аминокислотных остатков, в том числе пять тирозинов (Туг-НЗЗ, 53, 59; Tyr-L33, 50) и триптофан Trp-L92. Подобные кластеры тирозиновых аминокислотных остатков являются характерной чертой антител, специфичных к ДНК и другим фосфорным эфирам. Нижняя камера содержит ароматические аминокислотные остатки Phe-L100, Тгр-Н48 и Тгр-Н109, формирующие гидрофобный карман, и Tyr-L37, находящийся на дне полости (Рис.бГ). Боковая цепь Tyr-L37 ориентирована в сторону CDR3 тяжелой цепи. Такое глубинное, скрытое от растворителя, расположение реакционного тирозина согласуется с его повышенной нуклеофильностью. Суммарная глубина антигенсвязывающего кармана составляет 15 А. Столь глубокий активный центр нетипичен для каталитических антител и более характерен для каталитических центров холинэстераз, в частности бу-тирилхолинэстеразы (Рис. 7).

Петля Leu99 - GlyllO тяжелой цепи, содержащая остатки His-H104, Asn-H105 и Тгр-Н109, представляет собой неупорядоченную структуру с В-фактором 40 - 50 А2, в сравнении со средним В-фактрором 19 А2. Низкий уровень упорядоченности, по-видимому, связан со слабым взаимодействием аминокислотных остатков этой петли с коровыми структурами.

Рис.7. Сравнение глубин полостей активных центров биокатализаторов различной природы. ТЕРС-15 и 49G7 - эстеролитических антител, 33F12 - альдолазное антитело, AChE и BChE -ацетил- и бутерил- холин эстеразы. В каждом случае глубина активного центра соответствует высоте пирамиды, вписанной в полость активного центра таким образом, что ее вершина совпадает с реакционным остатком, а основание лежит в плоскости, проведенной через три аминокислотных остатка ближайших ко входу в активный центр биокатализатора.

Пространственная структура Fab фрагмента антитела А.17, модифицированного фосфонатом X

Рис. 6. Структурный анализ Fab А.17. Активный центр антитела состоит из двух камер. Изображение а-цепи, на фоне которой выделены верхняя (А) и нижняя (Б) камеры и образованный ими совместно сигмовидный карман (В). Легкая цепь показана голубым, тяжелая - зеленым цветом (А-В). Вид сверху с отображением ароматических аминокислотных остатков, формирующих стены верхней и нижней камер, а так же тирозина 37 легкой цепи в Fab-фрагменте А.17 (Г). Легкая цепь показана серым, тяжелая цепь - сиреневым, петля 3CDR тяжелой цепи - малиновым.

При анализе структуры ковалентного аддукта Fab фрагмента антитела А.17 с остатком фосфоната X было установлено, что длина связи Р-0 составяет 1.6 А. Фенильная группа фосфоната направлена к поверхности вариабельного участка легкой цепи, в то время как его тропинольная группа обращена к поверхности вариабельного участка тя-

желой цепи. Абсолютная конфигурация аддукта P(S). Учитывая, что фосфонилирование может осуществляться только в одном направлении (подход фосфоната X к реакционному тирозину возможен только в единственной пространственной ориентации из-за конфигурации активного центра), каталитическое антитело обладает стереоспецифич-ностью по отношению к его P(R) энантиомеру. Таким образом, вероятнее всего при взаимодействии А.17 с фосфонатом X реализуется SN2 механизм реакции. Фенольное кольцо фосфоната в составе ковалентного аддукта погружено в карман, образованный основной цепью Gly-L90 - Thr-L91 и боковыми цепями Ser-L35, Trp-L92, Pro-L98, Phe-L100, и при этом осуществляет Т-стэккинг взаимодействие с Trp-L92 и Phe-L100 (Рис. 8А). Одновременно с модификацией тирозина индуцируется вращение фенильной группы фосфоната на угол %2 равный 20°, сдвиг Trp-L92 на 0.4 А и вращение вокруг Phe-LlOOCa на 10°. Благодаря этим изменениям угол, образованный Ca-Cß-Cy боковой цепи Tyr-L37, уменьшается на 5° по сравнению с исходной позицией. Высвобождение этого напряжения может являться движущей силой при дефосфорилировании Tyr-L37.

Атом азота тропинольного кольца фосфоната формирует сильную водородную связь (2.79 А) с атомом кислорода основной цепи аминокислотного остатка Asn-H105 (Рис. 8А). За счет этого сильного взаимодействия петля CDR3 варибельного участка тяжелой цепи стабилизируется в уникальной конформации, B-фактор становиться равным 15 - 25 А2. Атом кислорода связи Р-0 прочно соединен водородной связью с молекулой воды w614 (2.55 А). Таким образом, связь Р-0 оказывается сильно поляризованной, следствием чего является повышенная электрофильность атома фосфора. Сгусток электронной плотности непосредственно за фосфонилированным тирозином смоделирован как кластер молекул воды. Этот кластер располагается на расстоянии меньшем, чем 5 А от атома фосфора, и представляется потенциальным участником возможной гидролитической атаки аддукта тирозина. Туг-Н34 так же может играть значительную роль при фосфорилировании за счет стекинг-взаимодействия между его ароматическим кольцом и и-нитрофенольной уходящей группой.

Сайт-направленный мутагенез антитела А.17. Функциональный анализ антитела А.17 и его мутантов

Основываясь на данных, полученных в результате структурного анализа, был проведен рациональный дизайн вариантов мутагенеза абзима с целью детализации особенностей его каталитического механизма.

А

Б

J

Рис.8. (А) Наложение активных центров Fab А.17 (зеленый цвет) и его ковалентного аддукта с остатком фосфоната X (синий), иллюстрирующее изменения в положении аминокислотных остатков Tyr-L37, Trp-L92, Phe-L100 и петли CDR3 тяжелой цепи (His-H104, Asn-H105, А1а-Н107 и Тгр-Н109). Остаток фосфоната показан красным. (Б) Кластер молекул воды в активном центре фосфонилированного Fab А.17. Молекула воды w614 образует прочную Н-связь с кислородом ■ Р=0 фосфонила. В свою очередь Туг-Н34 стабилизирует группу из б молекул воды, формирующих сеть Н-связей. Легкая цепь антитела показана серым цветом, тяжелая - голубым, остаток фосфоната - зеленым. Водородные связи обозначены пунктирными линиями.

Было предложено провести замену на аланин аминокислотных остатков петли СЭЯЗ тяжелой цепи Шэ-НКМ и Азп-Н105. участвующего в формировании Н-связи с азотом тропинольного кольца в структуре модифицированного фосфонатом РаЬ-фрагмента. В данном случае стабилизация обеспечивается формированием водородной связи между основной цепью 105-го остатка и азотом тропинольного кольца, тем не ме-

нее, замена боковой цепи этого и соседнего аминокислотных остатков может опосредованно повлиять на стабилизации за счет вторичных взаимодействий. Мутагенез 33 и 37 ^ тирозинов легкой цепи антитела с заменой на фенилаланин для одноцепочечного анти. тела был осуществлен ранее (Reshetnyak et al., J Am Chem Soc, 2007). Позиции для замены были определены аминокислотными остатками, модифицирующимися фосфона-I том X в реакционных клонах (Y-L33 - во всех клонах, кроме а.17, Y-L37 в клоне а.17), отобранных из библиотеки scFv. В настоящей работе эти мутантные варианты легких цепей а.17 были переклонированы в виде полноразмерных легких и тяжелых цепей для экспрессии в эукариотической системе.

Мутагенез аминокислотных остатков петли CDR3 тяжелой цепи осуществляли, i используя в качестве матрицы последовательность одноцепочечного антитела а.17 в ' фагемиде pHEN2. Фрагменты ДНК, содержащие замены аминокислотных остатков, получали методом удлинения перекрывающихся ПЦР-продуктов. Далее вариабельные фрагменты мутантных легких и тяжелых цепей были переклонированы в виде полно- ¡

размерных легких и тяжелых цепей для экспрессии в эукариотической системе анало-

гично цепям дикого типа антитела А.17. Полученными генетическими конструкциями была проведена ко-трансфекция клеточной линии СНО-К1. Селекцию и отбор стабильно продуцирующих клонов трансфертом осуществляли аналогично описанной выше процедуре для трансфектом, продуцирующих антитело А.17 дикого типа. Для каждого клона были подобраны оптимальные условия экспрессии. Уровень продукции рекомби-нантных антител в культуральных флаконах площадью 225 см2 для лучших клонов, экс-прессирующих A.I7H-HI04A, составил 6 мг с литра бессывороточной среды Рго-СН04 на 8 день экспрессии, для A.17N-H105A - 2 мг/литра, для A.17D-H106A - 0,6 мг/литра, для A.17Y-L33F и A.17Y-L37F - 6 и 8 мг/литра соответственно. Для очистки целевых белков использовали протокол, разработанный ранее для полноразмерного антитела А.17 дикого типа. Выход целевого белка варьировался в пределах 60-70%, чистота препаратов мутантных полноразмерных антител составляла 95% (оценивали с использованием денатурирующего электрофореза в 12% ПААГ в восстанавливающих условиях с последующей окраской Кумассии синим R250).

Результаты Вестерн блот анализа взаимодействия мутантных антител с BtX и ин-гибирования ковалентного мечения в присутствии ингибиторов демонстрируют сходный характер модификации с абзимом дикого типа (Рис.9). Замена тирозина 37 легкой цепи на фенилаланин приводит к полной потере способности каталитического антитела ковалентно модифицироваться фосфонотом X и его биотинилированным аналогом (Рис.9, таблица 2). Анализ кинетики взаимодействия мутантных антител с фосфонатом по схеме Китца-Вилсона (таблица 2) показал, что в случае мутанта А.17Н-Н104А, эффективность модификации снизилась в два раза. При этом константа Кдж практически не изменилась, т.е. замена боковой цепи 104 остатка практически не сказывается на стадии формирования обратимого комплекса антитела с субстратом. В то же время k¡ снизилась почти в два раза. Следует отметить, что в немодифицированном активном центре боковая цепь HÍS-H104 электростатически взаимодействует с боковой группой Asp-Н106 (расстояние 3.2 А, мостик через молекулу воды). Из анализа структурных данных известно, что в нативном Fab петля H-CDR3 находится в разупорядоченном состоянии, т.е. указанное взаимодействие не фиксирует положение петли в целом. После модификации индольное кольцо гистидина разворачивается, разрывая контакт со 106 остатком. В то же время возникает новое взаимодействие с Thr-HlOO, которое, наряду с заякори-ванием тропинольного кольца фосфоната основной цепью 105 остатка и стабилизацией фенильной группы за счет стэккинг-взаимодействий в гидрофобном кармане активного центра, вносит вклад в стабилизацию петли CDR3. Вероятно, невозможность формиро-

ваний этой связи в случае замены боковой цепи His на короткую алифатическую группу

затрудняет переход обратимого комплекса в ковапентный по сравнению с диким типом.

Рис.9. Вестерн блот анализ ингибирования

___связывания полноразмерного антитела

А.17 и его мутантов с биотинилированным фосфонатом X необратимыми ингибиторами. Во всех случаях концентрация активных центров антител составляла 1 мкМ, концентрация Bt-X 100 мкМ, концентрация ингибиторов 1 мМ, реакцию проводили в a-Fc-HRp течение часа при 37 С, объем реакционной

А.17 wt

А.17 Н-Н104А

А.17 V-L33F

f------

смеси 20 мкл. Прединкубация осуществлялась при 37°С. Время прединкубации со-ттт —- агермюр ставляло 1 час для всех ингибиторов, кро-

ме экотиофата и параоксона. Для послед-т них время прединкубации составляло 12

г г шт—» - а-Рс-няр часов. Визуализацию ковалентного аддукта

с ВЬ-Х осуществляли окраской стрептави-дином, конъюгированным с пероксидазой ж, тшт агер1-нрр хрена. Концентрация антител нормировали

по сравнительной окраске антителами; специфичными к Рс фрагменту тяжелой цепи антитела человека, на той же мем-

-г

бране.

А.17 N-H105A

к —

Strept-HRP

Таблица 2. Кинетические параметры реакции А.17, его мутантов и ВСИЕ с фосфонатом X (по схеме Китца-Вилсона).

Абзим/фермент к2, мин"

Кдис , мкМ

кЖди. мин ^ М х10

А.17 wt 0.25 + 0.02 6.2 ±0.4 4.0 ± 0.6

А.17 Y-L37F Полностью неактивен

А.17 Н-Н104А 0.14 ±0.01 8.5±2.5 1.6 ± 0.6

А.17 N-H105A 0.32 ±0.01 7.7 ±1.8 4.2 ±1.1

BChE*

0.066 ± 0.006 24 ± 6

0.3 ±0.1

•Данные, полученные для BChE согласуются с ранее опубликованными (Tramontano A et al. Appl Biochem Biotechnol. 2000).

Как отмечалось ранее, в стабилизации остатка фосфоната участвует основная цепь 105 аминокислотного остатка тяжелой цепи. При замене его боковой цепи на Ala Кд„с практически не изменилась, в то время как константа k¡ возросла по сравнению с диким типом. Анализ структуры показал, что в немодифицированном активном центре боковая цепь Asp-H105 сетью водородных связей взаимодействует с реакционным Тут-

L37. Разрыв этого взаимодействия должен облегчить перестановки, необходимые для позиционирования субстрата в активном центре абзима и формирования ковалентного комплекса. В активном центре мутантного A.17N-H105A такая сеть контактов отсутствует. Кроме того, замена боковой цепи на метальную должна стерически облегчить перестройки, необходимые для формирования контакта основной цепи с тропинольным кольцом фосфоната.

Эффективность модификации А.17 фосфонатом X на порядок выше таковой для BChE и сравнима с тем же параметром для других сериновых гидролаз. Этот факт весьма примечателен, учитывая примитивность устройства активного центра искусственного фермента в сравнении с каталитическим аппаратом сериновых гидролаз.

Анализируя данные структуры Fab А.17, можно предположить, что активный центр этого каталитического антитела должен обладать значительной степенью подвижности. Одним из подходов к изучению конформационных изменений при взаимодействии белковых молекул с лигандами различной природы является измерение термодинамических характеристик исследуемого взаимодействия методом изотермальной микрокалориметрии (метод ITC -Isothermal Titration Calorimetry). Измерения производились В.Миткевичем в институте молекулярной биологии им. Энгельгарта РАН, Москва на приборе MicroCal iTC2oo (MicroCal, Northampton, MA) как описано (Mitkevich et al. Nucleic Acids Res. 2006).

Нами была изучена термодинамика взаимодействия антитела А.17, двух его мутантов и BChE с фосфонатом X. Реальная (для А.17 Y-L37F) и наблюдаемые (для всех прочих белков) Кдт, а также стехиометрия взаимодействия и изменение энтальпии системы были установлены методом нелинейной регрессии. Экспериментальные данные наилучшим образом описываются моделью «один лиганд - один лиганд-связывающий центр». Расчеты производились с учетом того, что за время проведения эксперимента фосфонилирование проходит количественно. Термодинамические параметры взаимодействия А.17 фосфонатом X представлены в таблице 3.

Из приведенных данных видно, что реакция модификации антитела А.17 фосфонатом X является термодинамически выгодной. Полученные значения термодинамических параметров сопоставимы с соответствующими значениями, полученными методом ITC для связывания других антител с гаптенами. Кроме того, порядок величин совпадает с кинетически рассчитанными значениями.

Таблица 3. Термодинамические параметры взаимодействия антитела А.17, его мутантов и BChE с фосфонатом X, установленные методом ГТС.

Абзим/фермент Т.°С Кдис", мкМ АН\ ккал/моль тдг0, ккал/моль AG", ккал/моль

А.17 wt 10 2.9 -0.91 6.26 -7.17

15 3.5 -1.18 6.02 -7.20

20 2.8 -1.45 6.00 -7.45

25 2.3 -1.89 5.78 -7.67

37 1.7 -2.78 5.43 -8.21

А.17 Y-L37F 10 1.4 -1.49 6.08 -7.57

15 3.2 -1.37 5.88 -7.25

25 1.0 -1.50 6.65 -8.15

37 0.72 -1.35 7.28 -8.63

А.17 Н-Н104А 25 3.8 -3.6 3.72 -7.32

BChE 15 7.9 -2.40 4.29 -6.69

37 6.1 -4.35 2.93 -7.28

комплекса А.17У-1_37Р с фосфонатом X и кажущаяся КДх для комплекса других белков с фосфонатом; сЛ/у- изменение энтальпии; стандартное отклонение не превышало ±15%; "ТД5- изменение энтропии; рассчитано из уравнения изменение свободной энергии; рассчитано из уравнения

Сравнение данных, полученных для полностью неактивного мутанта А.17У-137Р, с результатами для антитела дикого типа и ВСЬЕ, обнаруживает сходство термодинамических параметров взаимодействия названных белков с фосфонатом X. В связи с этим можно предположить, что вклад ковалентной стадии взаимодействия, отсутствующей в случае А.17У-Ь37Р, в интегральную величину изменения энтальпии невысок. Очень малое изменение энтальпии системы при фосфонилировании может объясняться тем, что энергия, необходимая для разрушения связи Р-ОАр, компенсируется энергией, высвобождающейся при образовании сходной по природе связи с остатком тирозина (серина 198 в случае ВСЬЕ). При реакции модификации антитела А.17 фосфонатом вклад в изменение энергии системы так же вносят нековалентная стабилизация субстрата и энергия отхода уходящей группы. Последней составляющей можно пренебречь как незначительной, что было установлено в контрольных экспериментах измерения термодинамики связывания А.17 и его фосфонилированного фосфонатом X производного с «-нитрофенолом. Таким образом, можно заключить, что наблюдаемые изменения термодинамических параметров системы относятся в основном к нековалентной стадии взаимодействия абзим-фосфонат и отражают конформационные изменения абзима при

17

первичном связывании с молекулой фосфоната, поддерживая гипотезу использования антителом А.17 механизма индуцированного соответствия.

Снижение температуры измерения от 37 до 10°С приводит к уменьшению величины изменения энтальпии реакции модификации А.17 фосфонатом X в три раза. На основании анализа температурной зависимости ДН было рассчитано изменение теплоемкости ДСр, равное -70 кал*моль-1 К"1. По изменению теплоемкости можно рассчитать изменение площади белковой поверхности, доступной растворителю, используя эмпирическую формулу:

ДСр = 0.27ААар + 0.4ДАнеар где ДАар и ДАнеар" площади закрытых от растворителя гидрофобных и гидрофильных участков белковой молекулы, измеренные в А2.

Полученное по формуле значение находиться в пределах (175 - 260) А2 и совпадает с величиной, рассчитанной по кристаллической структуре (240 А2).

В отличие от абзима дикого типа, изменение энтальпии при взаимодействии полностью неактивного мутанта A.17Y-L37F с фосфонатом X не зависит от температуры. Близкое к нулю значение ДСр для реакции модификации мутантного абзима свидетельствует о несущественных изменениях площади поверхности антитела, доступной растворителю, что полностью согласуется с данными об отсутствии ковалентного взаимодействия A.17Y-L37F с фосфонатом X.

Для мутанта А.17Н-Н104А наблюдаемая методом ITC Кд„с при взаимодействии с фосфонатом X оказалась близкой по значению к той же величине для белка дикого типа (кинетические Кд„с также совпадают), однако, вклад ДН отличается. В случае мутантного антитела реакция модификации более энтальпийно выгодная. Как отмечалось ранее, боковая цепь Н-Н104 стабилизирована связью с D-H106 в немодифицированном активном центре и с Т-Н100 в фосфонилированном А.17 посредством Н-связей. При замене гистидина на аланин энергетический вклад этих связей отсутствует, что приводит к наблюдаемому эффекту.

Взаимодействие антитела А.17 с пестицидом параоксон

Как отмечалось ранее, модификация антитела А.17 фосфонатом X ингибируется в присутствии параоксона. Изучение взаимодействия с параоксоном представляется интересным, поскольку он является распространенным пестицидом и существует проблема профилактики отравлений этим соединением.

Наличие и-нитрофенольной уходящей группы в молекуле субстрата позволяет оценить кинетику взаимодействия антитела с параоксоном спектрофотометрически. Было показано, что скорость реакции линейно зависит от количества добавленного аб-

зима (Рис. 10). Скорость реакция значительно ниже, чем в случае фосфоната X. За время наблюдения (трое суток) не происходит выхода экспериментальной кривой на плато, и продукт образуется в количестве, превышающем число активных центров антитела, оттитрованных в реакции с фосфонатом X. Кроме того, скорость реакции антитела А. 17 с параоксоном линейно возрастает с увеличением концентрации добавленного гидрокси-ламина (Рис. 11). Гидроксиламин, обладая большей нуклеофильностью, конкурирует с водой на стадии дефосфорилирования. Приведенные факты свидетельствуют о том, что реакция А.17 с параоксоном является каталитической и проходит через стадию образования ковалетного интермедиата.

время, мин время, мим

Рис.10. Кинетические кривые взаимодействия параоксона и фосфоната X антителом А.17. (А) Различные концентрации антитела инкубировали с 200 мкМ параоксона. (Б) Одинаковая концентрация антитела инкубировалась с 200 мкМ параоксона или фосфоната X. Все реакции проводили в 0.1 М фосфатном буфере, рН 7.4, содержащем 0,02% азида натрия, при 37°С. За ходом реакций следили спектрофотометрически по высвобождению ^нитрофенола. Каждая кривая построена за вычетом фонового распада субстрата в растворе того же состава, но без добавления антитела. Количество /i-нитрофенола, образующегося при инкубации антитела А.17 с параоксоном, превышает число активных центров антитела, оттитрованных в реакции с фосфонатом X.

Общую схему катализы для абзима можно представить следующим образом 1. КДис 2. к2 3. кз (Nu)

Ат-Туг + ОРХ - [Ат-Туг * ОРХ] — Ат-Туг-ОР + X" -» Ат-Туг-ОН + OP-Nu, где Ат - антитело, ОРХ - фосфорорганическая молекула, X - уходящая группа, Nu -нуклеофил.

Элементарные константы взаимодействия антитела А.17 с параоксоном приведены на Рис. 11. Таким образом, стадия дефосфорилирования является скорость-лимитирующей для всего процесса. Следовательно, ковалентный интермедиат должен накапливаться в процессе реакции. Присутствие ковалентного интермедиата, доказы-

вающее, что гидролиз параоксона антителом А.17 проходит по механизму ковалентного катализа, было подтверждено методом масс-спектрометрии (Рис.12). После инкубации антитела с параоксоном в течение 16 часов на масс-спектре полноразмерного антитела появлялся пик, разница массы которого с массой пика немодифицированного абзима составляет 135Да, что соответствует весу остатка параоксона. Интересно отметить, что дефосфонилирование антитела, модифицированного фосфонатом X, при инкубации с гидроксиламином в тех же условиях не происходит.

к2 = 1.1 ¿0.1 хЮ'* mitr1 k3 = 1.6 ± 0.2 х10г min-1 k4 = I^SiO.OOxIO^min"1

20 25

c[nh2OH]'MM

Рис.11. Определение кинетических констант гидролиза пестицида параоксон антителом А.17 в присутствии гидроксила-мина.

1.25 1.00 0.7S Q 60 0.25 0.00 -

1578.5

ПЪ:2=30

( кат/вкый FabA.17)

jryv--)

1 (ФесФ«<к''М«еаним<».РаЬА.17)

Рис. 12. ЕБЬтСЛ-МБ масс-спектр полноразмерного антитела А.17, модифицированного параоксоном. Молекулярная масса первого пика соответствуют нативному полноразмерному антителу. Второй пик появляется после инкубации антитела с параоксоном в течение 16 часов, разница его массы с массой пика нативного антитела составляет 135 Да, что соответствует весу остатка параоксона.

200 400 Б00

Рис.13. Кинетические кривые гидролиза параоксона антителом A.17wt, его кова-лентным аддуктом с остатком фосфоната X и неактивным мутантом A.17Y-L37F. 30 мкМ антитела инкубировали с 200 мкМ параоксона в 0.1 М фосфатном буфере, рН 7.4, содержащем 0,02% азида натрия, при 37°С. За ходом реакции во всех случаях следили спектрофотомет-рически по высвобождению п-нитрофенола. Каждая кривая построена за вычетом фонового распада субстрата в растворе того же состава, но без добавления антитела.

800 1,000 1,200 1.400 1600 время, мин

Так же не удалось реактивировать фосфонилированное фосфонатом антитело в присутствии классического реактиватора холин эстераз моноизонитрозоацетона (MINA).

Несмотря на свою химическую схожесть, эти два фосфоэфира обладают различной стабильностью Р-0 связи, причем активный центр А. 17 способствует гидролизу только Туг-ОР производного параоксона. Антитело, нацело модифицированное фосфонатом X, и неактивный по отношению к фосфонату мутант A.17Y-L37F не взаимодействуют с параоксонам (Рис. 13), указывая на участие в катализе гидролиза параоксона того же реакционного остатка, что и в случае фосфонилирования фосфонатом.

Таким образом, каталитическое антитело, полученное отбором по способности ковалентно связываться с одним фосфорорганическим веществом, фосфонатом X, демонстрирует способность к каталитическому гидролизу другого, близкого к нему соединения, параоксона.

Детализация механизма катализа абзима А.17

Основываясь на данных структурного анализа и изучении термодинамики реакции, можно предположить, что каталитическое антитело А.17 преимущественно использует принцип индуцированного соответствия при взаимодействии с фосфонатом X и другими фосфорорганическими веществами. В качестве альтернативной модели взаимодействия для большинства изученных каталитических антител доказан механизм выбора одного из предсуществующих конформеров. Современный взгляд на проблему описания механизма взаимодействия белок-лиганд сводится к тому, что для подавляющего большинства белков одновременно осуществляются обе модели, но с различными вкладами.

Для детализации каталитического механизма антитела А.17, наряду со стационарной, была изучена предстационарная кинетика его взаимодействия с фосфонатом X. Измерения проводились Н. Кузнецовым в Институте химической биологии и фундаментальной медицины Сибирской отделения РАН, Новосибирск на приборе SX. 18MV (Applied Photophysics, Великобритания). Для детекции элементарных стадий взаимодействия абзима с субстратами использовали метод «остановленного потока». За реакцией следили по изменению внутренней флуоресценции триптофана в молекуле абзима при длинах волн ас,280 нм и Лет330 нм. Количественную обработку результатов кинетических экспериментов осуществляли с помощью пакета программ DynaFit software (BioKin, США). Полученные данные представлены на рисунке 14,Во всех расчетах фосфонат X рассматривался как полностью P(R) энантиомер.

Из представленных экспериментальных данных видно, что при взаимодействии антитело - фосфонат X наблюдались значительные изменения внутренней флуоресценции абзима, которые могут быть оценены количественно как функция от времени (Рис. 14Б, В). Каждая экспериментальная кривая была независимо аппроксимирована к виду кривой с одной экспонентой для получения значения наблюдаемой константы скорости кнаВл. Зависимость наблюдаемой константы скорости £„а6л имела гиперболический вид и описывалась уравнением (1) соответствующим механизму индуцированного соответствия:

Кдис к2

Ат + ОРХ о (Ат-ОРХ)1 о (Ат«ОРХ)2.

к-г

А-набл = к.2 + Кц„*[ОРХ]*кг / (*дЛОРХ]+1), уравнение 1

где ОРХ-лиганд.

~ (АЬ-ОРХ),«^«(АЬ-ОРХ)"

200 400 600 800 1,000 1.2001,400 1,600 <.800 время, сек

Ка я 17,4±3.3 мкМ Лг = 54.9±2.7 сек-1 ке = 12.1±1.эсек-1

10 20 X 40 50 |ОРХ),мкМ

Рис.14. Описание механизма модификации антитела А.17 фосфонатом X. А - экспериментальные и расчетные кривые взаимодействия А.17 и фосфоната X. Качество выбранной модели оценивалось статистически (врезки). Б - эксперимантальная кривая изменения триптофа-новои флуоресценции антитела А.17 в зависимости от концентрации добавленного фосфоната X, полученная в условиях предстационарной кинетики. В - зависимость наблюдаемой константы взаимодействия А.17 с фосфонатом X коы от концентрации субстрата и элементарные константы взаимодействия.

Представленная схема включает стадии связывания субстрата и перестройку комплекса абзим/субстрат. Стадии образования ковалентного комплекса и отхода п-нитрофенола по изменению флуоресценции триптофана разрешить не удалось. Для подтверждения правомерности выбранного механизма модель взаимодействия абзима с

субстратом, представленная на схеме, была подвергнута статистической проверке, выявившей, что представленная модель действительно содержит минимально возможное число стадий, и представленные кинетические данные не могут быть описаны более простой схемой.

Таким образом, анализ предстационарной кинетики взаимодействия А.17 с фос-фонатом X наряду с данными структурного анализа и изучением термодинамики процесса указывает на реализацию антителом механизма индуцированного соответствия. Тем не менее, полученные результаты не исключают возможности осуществления модификации абзима по альтернативному пути взаимодействия.

Пример каталитического антитела А.17 раскрывает альтернативный способ решения проблемы реорганизации белковой структуры для выполнения каталитической функции. В его структуре повышенная нуклеофильность остатка У-137 обеспечивается скрытым от растворителя положением в глубоком активном центре с гидроксильной группой. Наличие длинной подвижной петли НСБЯЗ А.17 обеспечивает эффективные перестройки в полости активного центра в непосредственной близости от боковой цепи реакционного тирозина. Неупорядоченная структура этой петли, образуя своего рода

гибкую стену кармана активного центра, облегчает миграцию лиганда в нижнюю камеру-

Уникальные свойства примитивного активного центра антитела А.17, способного к катализу, являются моделью сочетания белковой динамики и реактивности. Сама по себе иммуноглобулиновая структура абзима накладывает строгие границы подвижности его структуры. Однако принцип получения искусственного фермента может быть приложен сходным образом к любой другой белковой матрице.

Полученные результаты могут быть использованы как основа для рационального дизайна с целью улучшения каталитической эффективности имеющейся активности А.17 или при получении новых биокатализаторов. Полученные данные могут иметь биотехнологическое значение.

Выводы

1. На основе последовательностей вариабельных доменов одноцепочечного антитела А.17 создано и проэкспрессировано в клетках линии СНО-К1 полноразмерное антитело. Показано, что полученное полноразмерное антитело способно ковалентно связываться с л-нитрофенил 8-метил-8-азабицикло[3.2.1]октан фенилфосфонатом (X) и гидролизовать пестицид параоксон.

2. Произведен структурный анализ Fab фрагмента каталитического антитела А.17 и его ковалентного аддукта с остатком фосфоната X. Основываясь на структурных данных, был осуществлен мутагенез ряда аминокислотных остатков антитела с целью выявления их роли в каталитической активности абзима. Показано, что замены аминокислотных остатков, участвующих в стабилизации CDR-H3, влияют на скорость реакции фосфонилирования антитела фосфонатом X и слабо сказываются на стадии связывания субстрата.

3. По совокупности данных структурного анализа, изучения термодинамики и быстрой кинетики показано, что взаимодействие А.17 с фосфонатом X осуществляется по механизму индуцированного соответствия.

4. Установлено, что гидролиз пестицида параоксон антителом А.17 проходит через стадию образования фосфотирозинового ковалетного интермедиата с аминокислотным остатком Y-L37. Показано, что стадия дефосфорилирования является ско-рость-лимитирующей.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи

1. Smirnov Г , Carletti Е*, Kurkova I*, Nachon F, Nicolet Y, Mitkevich V , Débat H, Avalle B, Belogurov A, Kuznetsov N, Reshetnyak A, Masson P, Tonevitsky A, Ponoma-renko N, Makarov A, Friboulet A, Tramontane A, Gabibov A. Reactibodies generated by kinetic selection couple chemical reactivity with favorable protein dynamics. Proc Natl Acad Sci USA. Опубликовано онлайн Сентябрь 2011.

* авторы внесли равный вклад в работу

2. Захаров А.В., Смирнов И.В., Серебрякова М.В., Дронина М.А., Казначеева А.В., Куркова И.Н., Белогуров А.А., Фрибуле А., Пономаренко Н.А., Габибов А.Г., Бобик Т.В. Экспрессия каталитических антител в эукариотических системах. Молекулярная биология (Моек), том 45, № 1, Январь-Февраль 2011, С. 86-95.

3. Куркова И.Н., Решетняк А.В., Дурова О.М., Кнорре В.Д., Трамонтано А., Фрибуле А., Пономаренко Н.А., член-корр. РАН Габибов А.Г., Смирнов И.В.. Антитела-антидоты для нейтрализации фосфорорганических соединений. Доклады Академии Наук, том 425, № 4, Апрель 2009, С. 549-552.

Опубликованные материалы конференций и доклады

1. Kurkova I, Carletti Е, Smirnov I, Fribulet A, Tramontano A, Gabibov A. A17 catalytic antibody converting P-0 bonds. Ill International meeting "Early events in human patolo-gies" 29 May-1 June 2010, Barbizone, France

2. Smirnov IV, Kurkova IN, Carletti E, Masson P, Belogurov AA Jr, Ponomarenko NA, Tramontano A, Friboulet A, Gabibov AG. Promiscuity of binding/catalysis of antibodies -antidotes toward chemical weapons. 35th FEBS Congress June 26-July 1, 2010, Goteborg, Sweden

3. Smirnov I.V., Ilushin D.G., Durova O.M., Kurkova I.N., Masson P., Ponomarenko N.A. and Gabibov A.G. Biological scavengers of organophosphorous poisons. 21st IUBMB and 12th FAOBMB International Congress of Biochemistry and Molecular Biology, July 30-August 7, 2009, Shanghai, China.

Методические аспекты работы рассмотрены в статьях

1. Belogurov AA, Kurkova IN, Friboulet A, Thomas D, Misikov VK, Zakharova MY, Such-kov SV, Kotov SV, Alehin AI, .Avalle B, Morse HC 3d, Gabibov AG, Ponomarenko NA

Recognition and degradation of myelin basic protein peptides by serum autoantibodies: novel biomarker for multiple sclerosis. J Immol. 2008 Jan 15;180(2):1258-67.

2. Белогуров AA, Куркова ИН, Мисиков BK, Сучков СВ, Телегин ГБ, Алехин АИ, Гончаров НГ, Кнорре ВД, Габибов АГ, Пономаренко НА. Субстратная специфичность каталитических аутоантител при нейроденегеративных процессах, in neurodegenerative processes. Доклады Академии Наук, том 425, № 2, Март 2009, С. 251-255.

3. Ponomarenko NA, Durova ОМ, Vorobiev II, Belogurov AA, Kurkova IN, Petrenko AG, Telegin GB, Suchkov SV, Kiselev SL, Lagarkova MA, Govorun VM, Serebryakova MV,.Avalle B,.Tornatore P,.Karavanov A, Morse HC 3d, Thomas D, Friboulet A, Gabi-bov AG. Autoantibodies to myelin basic protein catalyze site-specific degradation of their antigen. Proc Natl Acad Sci USA. 2006 Jan 10;103(2):281-6.

Подписано в печать:

22.09.2011

Заказ № 5948 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Куркова, Инна Николаевна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

КАТАЛИТИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА.

1.1. Каталитические антитела как часть иммунной системы.

1.2. Каталитические антитела как искусственные ферменты.

ПРОБЛЕМА АНТИДОТНОЙ ТЕРАПИИ ОТРАВЛЕНИЙ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИМИ ТОКСИНАМИ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Одноцепочечное антитело А. 17 взаимодействует с фосфорорганическим пестицидом параоксон.

2. Создание эукариотической системы экспрессии полноразмерного антитела А. 17.

3. Сравнение функциональной активности одноцепочечного и полноразмерного антитела А. 17.

4. Структурный анализ антитела А.17:.

5. Сайт-направленный мутагенез антитела А.17.

Функциональный анализ антитела А.17 и его мутантов.

6. Взаимодействие антитела А.17 с пестицидом параоксон.

7. Детализация механизма катализа абзима А.17.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

ХИМИЧЕСКИЕ РЕАКТИВЫ И СОПУТСТВУЮЩИЕ МАТЕРИАЛЫ. реактивы и материалы. ферменты. ингибиторы протеаз. маркеры. антитела и конъюгаты. плазмиды. штаммы Е. coli.

ЭУКАРИОТИЧЕСКИЕ КЛЕТКИ ЛИНИИ

РАСТВОРЫ.

БАКТЕРИАЛЬНЫЕ СРЕДЫ.

АНТИБИОТИКИ.

МЕТОДЫ.

1. РАБОТА С НУКЛЕИНОВЫМИ КИСЛОТАМИ.

АМПЛИФИКАЦИЯ ФРАГМЕНТОВ ДНК МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ.

РЕСТРИКЦИЯ.

ЛИГИРОВАНИЕ.

ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК.

ВЫДЕЛЕНИЕ ГЕНОМНОЙ ДНК.

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ДНК В АГАРОЗНОМ ГЕЛЕ.

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ДНК В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ.

ЭЛЕКТРОЭЛЮЦИЯ.

СЕКВЕНИРОВАНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК.

САЙТ-НАПРАВЛЕННЫЙ МУТАГЕНЕЗ ОДНОЦЕПОЧЕЧНОГО АНТИТЕЛА А.17.

2. МЕТОДЫ РАБОТЫ С БАКТЕРИЯМИ ESCHERICHIA СОИ.

ПОЛУЧЕНИЕ ЭЛЕКТРОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК.

ТРАНСФОРМАЦИЯ КЛЕТОК ЕСОПМЕТОРРМ ЭЛЕКТРОПОРАЦИИ.

ПЦР С КОЛОНИЙ.

НОЧНАЯ КУЛЬТУРА.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ МУЗЕЙНОГО ШТАММА.

3. РАБОТА С БЕЛКАМИ.

ДЕНАТУРИРУЮЩИЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ.

ОКРАШИВАНИЕ ПААГ.

ИММУНОБЛОТГИНГ.

ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ*АНАЛИЗ (ИФА) ПО СХЕМЕ SANDWICH ELISA.

ОЧИСТКА РЕКОМБИНАНТНЫХ ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫХ АНТИТЕЛ (SGFV).

ОЧИСТКА ПОЛНОРАЗМЕРНЫХ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ.

ПОЛУЧЕНИЕ FAB ФРАГМЕНТА АНТИТЕЛА.

КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ FAB*ФРАГМЕНТА АНТИТЕЛА А.17 И РЕНТГЕНОСГРУКТУРНЫЙАНАПИЗ.

ИЗУЧЕНИЕ ТЕРМОДИНАМИКИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ АБЗИМОВ/ФЕРМЕНТОВ С ФОСФОНАТОМ X МЕТОДОМ 'ГГС.

ТРИПТИЧЕСКИЙ ГИДРОЛИЗ ДЛЯtМАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОГО АНАЛИЗА.

МАСС-СПЕКТРОМЕГРИЯ MALDI.

МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ ELECTROSPRAY IONIZATION FOURIER TRANSFORM ION, CYCLOTRON RESONANCE MASS SPECTROMETRY ESI-FTICR-MS (TOP-DOWN).

ИЗМЕРЕНИЕ ЭСТЕРОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ.

КАТАЛИЗ ГИДРОЛИЗА АМИДНОЙ СВЯЗИ.

МОДИФИКАЦИИ РЕКОМБИНАТНЫХ АНТИТЕЛ ФОСФОНАТОМ X.

ИЗУЧЕНИЕ КАТАЛИЗА ГИДРОЛИЗА ПАРАОКСОНА.

ПРЕДСТАЦИОНАРНАЯ КИНЕТИКА ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ АНТИТЕЛО-СУБСТРАТ МЕТОДОМ ОСТАНОВЛЕННОГО ПОТОКА.

4. МЕТОДЫ РАБОТЫ С ЭУКАРИОТИЧЕСКИМИ КЛЕТКАМИ.

ПОДДЕРЖАНИЕ В КУЛЬТУРЕ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК ЛИНИИ СНО.

ПОДДЕРЖАНИЕ В КУЛЬТУРЕ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК ЛИНИИ ПЪО ВСИ.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ МУЗЕЯ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК.

ВЫВЕДЕНИЕ ЛИНИИ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК ИЗ ЗАМОРОЗКИ.

ТРАНСФЕЦИРОВАНИЕ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК МЕТОДОМ ЛИПОФЕКЦИИ.

ВЫВОДЫ.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-функциональный анализ каталитического антитела А.17. Каталитический механизм деградации фосфорорганического пестицида параоксон"

Существование живых организмов - это сложный комплекс биохимических процессов, значительная часть которых представлена биокатализируемыми превращениями.

В последние три* десятилетия в связи с обнаружением каталитической активности молекул РНК (рибозимов) и антител (абзимов) основополагающие представления о биокатализе существенно изменились. В основе концепции индукции каталитического' ответа антител (абзимов) лежат классические работы Полинга и Дженкса [1, 2]. В ответ на введение в организм природных или синтетических антигенов иммунная система способна вырабатывать антитела, связывающиеся со своими антигенами с высокой аффинностью и исключительной специфичностью. Взаимодействие антигена и связывающего участка антитела осуществляется за счет большого числа нековалентных взаимодействий - водородных связей, гидрофобных и электростатических взаимодействий, точно так же, как при образовании фермент-субстратного комплекса [3]. Полинг постулировал, что фундаментальным отличием антител от ферментов является то, что антитела с высокой специфичностью связывают стабильную форму антигена,- а ферменты проявляют максимальную аффинность к высокоэнергетическому переходному состоянию катализируемой ими реакции [2]. Таким образом, можно было предположить, что иммуноглобулины, способные связывать переходное состояние реакции, могут проявлять каталитическую активность.

Идея Полинга получила блестящее практическое подтверждение в работах Лернера и Шультца [4, 5]. К настоящему моменту известно значительное число абзимов, катализирующих более 30 химических реакций. В начале 90-х годов пионерские работы Паула [6] и Габибова [7] впервые показали спонтанное образование этих биокатализаторов при аутоиммунных патологиях.

На сегодняшний день показано существование природных абзимов при целом ряде аутоиммунных патологий, доказана принципиальная возможность возникновения каталитических антител практически к любому аутоантигену [8]. Обнаружение способности молекул иммуноглобулинов катализировать образование активных форм кислорода, обусловленное специфическим фолдингом этих белковых молекул, существенным образом расширило представление о функции антител в иммунной системе [9]. Разработка методов получения искусственных абзимов с заданной субстратной специфичностью, в том числе способных осуществлять биокаталитические превращения, для которых нет соответствующих природных аналогов, имеет важное фундаментальное и прикладное значение. Низкая иммуногенность и высокая стабильность антител в кровотоке открывает широкие перспективы использования абзимов в качестве лекарственных средств. Так исследования кокаин-гидролизующих абзимов были доведены до стадии in vivo. Значительный прогресс, достигнутый в этом направлении исследований, привел к формированию отдельного области знания в энзимологии -абзимологии.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. КАТАЛИТИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Куркова, Инна Николаевна

выводы.

1. На основе последовательностей вариабельных доменов одноцепочечного антитела А. 17 создано и проэкспрессировано в клетках линии'СНО-К1 полноразмерное антитело. Показано, что полученное полноразмерное антитело способно^ ковалентно связываться с /7-нитрофенил# 8-метил-8-азабицикло[3.2.1]октан фенилфосфонатом (X) и гидролизовать пестицид параоксон.

2. Произведен структурный* анализ Fab фрагмента каталитического антитела А. 17 и его ковалентного аддукта с остатком фосфоната X. Основываясь на структурных данных, был осуществлен мутагенез ряда аминокислотных остатков антитела* с целью выявления* их роли в каталитической активности абзима. Показано, что замены аминокислотных остатков, участвующих в стабилизации* CDR-H3, влияют на. скорость реакции фосфонилирования* антитела фосфонатом Х и слабо сказываются на-стадии связывания субстрата.

3. По совокупности данных структурного анализа, изучения термодинамики и быстрой кинетики показано, что взаимодействие А. 17 с фосфонатом X осуществляется по механизму индуцированного.соответствия.

4. Установлено, что гидролиз пестицида параоксон антителом* А.17 проходит через стадию образования фосфотирозинового ковалетного интермедиата с аминокислотным остатком Y-L37. Показано, что стадия дефосфорилирования* является скорость-лимитирующей.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Куркова, Инна Николаевна, Москва

1. Jenks, W.P., Catalysis in Chemistry and Enzymoiogy. New York: McGrawj . Hill., 1969.1 2. Pauling, L., Chem Eng News, 1946: 36: p. 1375-77. '

2. Tramontano, A., K.D. Janda, and R.A. Lerner, Catalytic antibodies. Science,

3. J 1986. 234(4783): p. 1566-70.

4. Paul, S., et a I;, Catalytic hydrolysis of vasoactive intestinal peptide by humanautoantibody. Science, 1989. 244(4909): p. 1158-62.

5. Shuster, A.M.', et al., DNA hydrolyzing autoantibodies. Science, 1992.256(5057): p. 665-7. .

6. Belogurov, A., Jr., et al., Catalytic antibodies: balancing between Dr. Jekyll1.and Mr. Hyde. Bioessays, 2009. 31(11): p. 1161-1171.

7. Wentworth, P., Jr., et al., Evidence for antibody-catalyzed ozone formationin bacterial killing.and inflammation. Science, 2002.-298(5601): p; 2195-9.

8. Janeway, C., Immunobiology : the immune system in health and. disease.5th ed. 2001, New York: Churchill Livingstone; Garland, xviii, 732 p.

9. Planque, S., et al., Ontogeny of proteolytic immunity: IgM serine proteases.

10. J BiohChem, 2004. 279(14): p. 14024-32. ■

11. Tawfik, D.S., et al., Unexpectedly high occurrence of catalytic antibodies in• MRL/lpr and SJL mice immunized with a transition-state analog: is there alinkage to autoimmunity? Proc Natl Acad Sci USA; 1995. 92(6): p. 2145-9:,

12. Lacroix-Desmazes, S., et al., High levels of catalytic antibodies correlate withfavorable outcome in sepsis. Proc Natl Acad Sci USA, 2005. 102(1-1): p.f 4109-13. ’

13. Gao, Q.S., et al., Molecular cloning of a proteolytic antibody light chain. J

14. Biol Chem, 1994. 269(51): p. 32389-93.

15. Sun, M., et al., Proteolytic activity of an antibody light chain. J Immunol,t 1994. 153(11): p. 5121-6.s*

16. Thiagarajan, P., et al., Monoclonal antibody light chain with prothrombinasej activity. Biochemistry, 2000. 39(21): p. 6459-65.

17. Thiagarajan, P. and S. Paul, Prothrombin cleaving antibody light chains.

18. J Chem Immunol, 2000. 77: p. 115-29.

19. Nardi, M., et al., Complement-independent, peroxide-induced antibody lysis of platelets in HIV-l-related immune thrombocytopenia. Cell, 2001. 106(5): p. 551-61.

20. Paul, S.,.et al., Characterization of thyroglobulin-directed and poiyreactive catalytic antibodies in autoimmune, disease. J Immunol, 1997. 159(3): p. 1530-6.

21. Lacroix-Desmazes, S., et al., The prevalence of proteolytic antibodies against ' factor VIII in hemophilia A. N Engl J Med, 2002. 346(9): p. 662-7.

22. Ponomarenko, N.A., et al., Catalytic antibodies in clinical and experimental pathology: human and mouse models. J Immunol Methods, 2002. 269(1-2): p. 197-211.

23. Ponomarenko, N.A., et al., On the catalytic'activity of autoantibodies in multiple sclerosis. Dokl Biochem Biophys, 2004. 395: p. 120-3.

24. Gololobov, G.V., et al:, DNA-protein complexes. Natural targets for DNA-hydrolyzing antibodies. Appl Biochem Biotechnol, 1994. 47(2-3):.p. 305-14; discussion 314-5.

25. Baranovskii, A.G., et al., Catalytic heterogeneity of polyclonal DNA-hydrolyzing antibodies from the sera of patients with multiple sclerosis. Immunol Lett, 2001.-76(3): p. 163-7.

26. Breusov, A.A., et al., Comparison of the Level of DNA-Hydrolyzing Polyclonal IgG Antibodies in Sera of Patients with Hashimoto's Thyroiditis and Nontoxic NodaiGoiter. Russ J Immunol, 2001. 6(1): p. 17-28.

27. Nieva, J. and P. Wentworth, Jr., The antibody-catalyzed water oxidation pathway-a new chemical arm to immune defense? Trends Biochem Sci,2004. 29(5): p. 274-8.

28. Zhu, X., et al., Probing the antibody-catalyzed water-oxidation pathway at atomic resolution. Proc Natl Acad Sci USA, 2004. 101(8): p. 2247-52.

29. Khersonsky, O. and D.S. Tawfik, Enzyme promiscuity: a mechanistic and evolutionary perspective. Annu Rev Biochem. 79: p. 471-505.

30. Fiehn, O., D.K. Barupal, and T. Kind, Extending biochemical databases by metaboiomicsurveys. J Biol Chem. 286(27): p. 23637-43.

31. Khersonsky, O., C. Roodveldt, and D.S. Tawfik, Enzyme promiscuity: evolutionary and mechanistic aspects. Curr Opin Chem Biol, 2006. 10(5): p. 498-508.

32. Tawfik, D.S., Biochemistry. Loop grafting and the origins of enzyme species. Science, 2006. 311(5760): p. 475-6.

33. Breslow R., O.L.E., An 'Artificial Enzyme' Combining a Metai Catalytic Group and a Hydrophobic Binding Cavity. J. Am. Chem. Soc., 1970. 92(4): p. 10751077.

34. Gouverneur, V.E., et al., Control of the exo and endo pathways of the Die/sAlder reaction by antibody catalysis. Science, 1993. 262(5131): p. 204-8.

35. Ulrich, H.D., E.M. Driggers, and P.G. Schultz, Antibody catalysis of pericyciic reactions. Acta Chem Scand, 1996. 50(4): p. 328-32.

36. Socolich, M., et al., Evolutionary information for specifying a protein fold. Nature, 2005. 437(7058): p. 512-8.

37. Russ, W.P. and R. Ranganathan, Knowledge-based potential functions in protein design. Curr Opin Struct Biol, 2002. 12(4): p. 447-52.

38. Minshull, J., et al., Predicting enzyme function from protein sequence. Curr Opin Chem Biol; 2005. 9(2): p. 202-9.

39. Russ, W.P., et al., Natural-like function in artificial WW domains. Nature,2005. 437(7058): p. 579-83.

40. Hilvert, D., Critical analysis of antibody catalysis. Annu Rev Biochem, 2000. 69: p. 751-93.

41. Stewart, ID. and SJ. Benkovic, Transition-state stabilization as a measure of the efficiency of antibody catalysis. Nature, 1995. 375(6530):-p. 388-91.

42. Raso, V. and B.D. Stollar, The antibody-enzyme analogy. Comparison of enzymes and antibodies specific for phosphopyridoxyltyrosine. Biochemistry, 1975. 14(3): p. 591-9.44: Kohen, F., et al., Antibody-enhanced hydrolysis of steroid esters. Biochim

43. Biophys Acta, 1980. 629(2): p. 328-37.

44. Kohen, F., et al., Monoclonal immunoglobulin G augments hydrolysis of an ester of the homologous hapten: an esterase-like activity of the antibody-containing site? FEBS Lett, 1980.-111(2): p. 427-31.

45. Shokat, K.M. and P.G. Schultz, Catalytic antibodies. Annu Rev Immunol, 1990. 8: p. 335-63.

46. Schultz, P.G., The interplay between chemistry and biology in the design of enzymatic catalysts. Science, 1988. 240(4851): p. 426-33.

47. Napper, A.D., et al., A stereospecific cydization catalyzed by an antibody. Science, 1987. 237(4818): p. 1041-3.

48. Hilvert, D., et al., Catalysis of concerted reactions by antibodies: the Ciaisenrearrangement. Proc Natl Acad Sci USA, 1988: 85(14): p. 4953-5. *

49. Jackson D. Y., J.H.W., Sugasawara R., Reich S. H., Bartlett P. A., Schultz P.G., An Antibody-catalyzed Ciaisen Rearrangement. J. Am: Chem. Soc., 1988. 110: p. 4941-42.

50. Bencovic S. J., N.A.D., Lerner R. A., Catalysis of a Stereospecific Bimolecular Amide Synthesis by an Antibody. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1988. 85(5355-8).

51. Braisted A. C., S.P.G., An Antibody-catalyzed Bimolecular Diefs-Alder Reaction. J. Am. Chem. Soc., 1990. 112: p. 7430-1.

52. Hilvert D., H.K.W., Nared K. D., Auditor M. T. M., Antibody Catalysis of a Diels-AlderReaction. J. Am. Chem. Soc., 1989. Ill: p. 9261-9262.

53. Mundorff, E.C., et al., Conformational effects in biological catalysis: an antibody-catalyzed oxy-cope rearrangement Biochemistry, 2000. 39(4): p. 627-32.

54. Reshetnyak, A.M., et al., Routes to covalent catalysis by reactive selection for nascent protein nucleophiles. J Am Chem Soc, 2007. 129(51): p. 16175-82.

55. Tawfik, D.S., et al., Efficient and selective p-nitrophenyl-ester-hydrolyzing antibodies elicited by a p-nitrobenzyl phosphonate hapten. Eur J Biochem, 1997. 244(2): p. 619-26.

56. Suzuki, H., et al., A catalytic antibody that accelerates the hydrolysis of carbonate esters. Prediction of the binding-site structure of the substrate. J Protein Chem, 1998. 17(3): p. 273-8.

57. Janda, K.D., et al., Induction of an antibody that catalyzes the hydrolysis of an amide bond. Science, 1988. 241(4870): p. 1188-91.

58. Miyashita, H., et al., Prodrug activation via catalytic antibodies. Proc Natl Acad Sci USA, 1993. 90(11): p. 5337-40.

59. Landry, D.W., et al., Antibody-catalyzed degradation of cocaine. Science, 1993. 259(5103): p. 1899-901.

60. Landry, D.W., Immunotherapy for cocaine addiction. Sci Am, 1997. 276(2): p. 42-5.

61. Mets, B., et al., A catalytic antibody against cocaine prevents cocaine's reinforcing and toxic effects in rats. Proc Natl Acad Sci USA, 1998. 95(17): p. 10176-81.

62. McKenzie, K.M., et al., Identification and characterization of single chain anti-cocaine catalytic antibodies. J Mol Biol, 2007. 365(3): p. 722-31.

63. Benkovic, S.J., et al., The enzymic nature of antibody catalysis: development of multistep kinetic processing. Science, 1990. 250(4984): p. 1135-9.

64. Janda, K.D., C.G. Shevlin, and R.A. Lerner, Antibody catalysis of a disfavored chemical transformation. Science, 1993. 259(5094): p. 490-3.

65. Gruber, K., et al., Structural basis for antibody catalysis of a disfavored ring closure reaction. Biochemistry, 1999. 38(22): p. 7062-74.

66. Shabat, D., et al., Antibody catalysis of a reaction otherwise strongly disfavoured in water. Nature, 1995. 374(6518): p. 143-6.

67. Baca, M., et al., Phage display of a catalytic antibody to optimize affinity for transition-state analog binding. Proc Natl Acad Sci USA, 1997. 94(19): p. 10063-8.

68. Takahashi, N., et al., In vitro abzyme evolution to optimize antibody recognition for catalysis. Nat Biotechnol, 2001. 19(6): p. 563-7.

69. Lerner, R.A. and C.F. Barbas, 3rd, Using the process of reactive immunization to induce catalytic antibodies with complex mechanisms: aldolases. Acta Chem Scand, 1996. 50(8): p. 672-8.

70. Wirsching, P., et al., Reactive immunization. Science, 1995. 270(5243): p. 1775-82.

71. Barbas, C.F., 3rd, et al., Immune versus natural selection: antibody aldolases with enzymic rates but broader scope. Science, 1997. 278(5346): p. 2085-92.

72. Sinha, S.C., C.F. Barbas, 3rd, and R.A. Lerner, The antibody catalysis route to the total synthesis of epothilones. Proc Natl Acad Sci USA, 1998. 95(25): p. 14603-8.

73. Shabat, D., et al., Multiple event activation of a generic prodrug: trigger by antibody.catalysis. Proc Natl Acad Sci USA, 1999. 96(12): p. 6925-30.

74. Shamis, M., H.N. Lode, and D. Shabat, Bioactivation of self-immoiativedendritic prodrugs by catalytic antibody 38C2. J Am Chem Soc, 2004; 126(6): p. 1726-31. .

75. Sinha, S.C., et al:, Prodrugs of dynemicin analogs for selective chemotherapymediated by an aldolase catalytic Ab. Proc Natl; Acad Sci U S A, 2004. 101(9): p. 3095-9. . .

76. Shabat, D., et al., In vivo activity in a catalytic antibody-prodrug system: Antibody catalyzed:etoposide prodrug activation for selective chemotherapy. Proc Natl Acad Sci USA, 2001. 98(13): p. 7528-33.

77. Poignard; P., et a W,gpl20:: Biologic.aspects of structural features. An n u Rev1.munol, 2001. 19: p. 253-74. ;

78. Burton, D.R., A vaccine for HIV type 1: the antibody perspective. Proc Natl

79. Acad:Sci U S.A; 1997. 94(19): p. 10018-23; .

80. Burton, D.R. and P.W. Parren, Vaccines and the induction of functionalantibodies: time to look beyond the molecules of'natural infection? Nat Med, 2000. 6(2): p. 123-5. '

81. Pollard; S.R.,.et al., CD4-binding regions of human immunodeficiency virusenvelope glycoprotein gp!20 defined by proteolytic digestion. Proc Natl Acad Sci USA, 1991.88(24): p. 11320-4. . . .

82. Moore, J.P. and D.D. Ho; Antibodies to discontinuous or conformationaHysensitive epitopes on the gpl20 glycoprotein of human immunodeficiency.

83. Smith, G.P. and V.A. Petrenko, Phage Display. Chem Rev, 1997: .97(2): p.391.410: . ' :

84. Winter, G., et al., Making antibodies:by phage display technology. Annu Rev1.munol, 1994. 12: p. 433-55., .

85. Smith, G.P., Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface.Sz\ex\ce, ,1985. 228(4705): p. 1315-7.91.