Защитное действие нового антидота на основе карбоксима при отравлении фосфорорганическими соединениями

Панченкова, Ольга Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Защитное действие нового антидота на основе карбоксима при отравлении фосфорорганическими соединениями
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Защитное действие нового антидота на основе карбоксима при отравлении фосфорорганическими соединениями"

Санкт-Петербургский государственный университет

На правах рукописи

ООЗ^-000'-"-'

Панченкова Ольга Александровна

Защитное действие нового антидота на основе карбоксима при отравлении фосфорорганическими соединениями

03.00.13-физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2009

003465589

Работа выполнена на кафедре физиологии Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Валерий Григорьевич Скопичев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Игорь Ильич Кривой

доктор биологических наук Анатолий Николаевич Федин

Ведущее учреждение: Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН.

Защита состоится «/¿» 2009г. В «//» часов на заседании Совета

Д212.232.10 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, ауд.90

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. A.M. Горького Санкт-Петербургского государственного университета (Санкт-Петербург, Университетская наб.,7/9)

Автореферат разослан «_/"» ^u-ti^mt-1,2009г.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

Н.П.Алексеев

Общая характеристика работы.

Актуальность темы. Многие кровососущие насекомые и паукообразные являются переносчиками возбудителей целого ряда инвазионных, инфекционных и вирусных болезней животных и человека. Помимо этого, вкусовые качества мяса ухудшаются из-за резкого снижения содержания аминокислот, витаминов, макро- и микроэлементов (Филлипов и др.,1997; Гурьева и др.,1997; Miller et al.,1995; Ney et al.,1990). Поэтому ежегодно затрачиваются большие средства на организацию лечебно-профилактических мероприятий, направленных на борьбу с эктопаразитами. При арахноэтомозах применяют инсектоакарициды, которые обладая длительной перси-стентностью, способны убивать как взрослых насекомых клещей, так и их преимаги-нальные стадии. С этой целью, например, прикрепляются ушные бирки фирмы «Флек-трон», которые содержат перметрин, длительно защещающий животных от нападения членистоногих. Для профилактики эффективны ивомек и цидектин. Против гнуса и его отдельных компонентов высокоэффективна обработка крупного рогатого скота, лошадей и оленей водной эмульсией оксамата, терпиноидного репиллента и перитроидов различной концентрации. Инсектоакарициды защищают животных от нападения членистоногих и тем самым профилактируют заражение их возбудителями трансмиссивных болезней. Из большого числа рекомендованных для борьбы с эктопаразитами препаратов наиболее широкое применение получили аббат (дифос), байтекс, ДДВФ, дибром. Дурсбан, карбофос, метатион, которые применяют согласно действующей инструкции. Эффективен биопрепарат бактокулицид, а также аналоги ювенильных гормонов (альтозид, димилин). Применяют также аэрозоли, получаемые из 1-2 % масляных растворов или эмульсий ДДВФ, а также используются ХОС и ФОС, карбаматы. Все перечисленные выше инсектоакарициды не только спасают животных от эктопаразитов, но являясь в большинстве своем ХОС и ФОС, оказывают существенный вред, как организму животных, так и способствуют возникновению у человека как острого, так и хронического отравления (Ливанов и др., 1997).

Из-за высокой токсичности и химической стойкости большую потенциальную опасность представляют пестициды и инсектициды из группы ФОС. Накапливаясь в почве, воде и продуктах питания, они создают предпосылки для острых и хронических отравлений. ФОС обладают разносторонним действием на организм, которое охватывает многие органы и системы (Прозоровский и др.,1997). Поскольку в настоящее время лечебно-профилактических антидотов против фосфорорганических инсектицидов в сельском хозяйстве не существует, мы попытались создать модель лечебно-профилактического антидота, при этом в качестве основных его компонентов использовать достаточно дешевые и доступные отечественные препараты (такие как атропин и карбоксим), что существенно снизит себестоимость данного антидота.

Цели и задачи исследования^ Основной целью исследования являлось обоснование возможности использования нового реактиватора холинэстеразы карбоксима для создания модельного антидота предназначенного для лечебно-профилактического использования в животноводческой практике, а также определить его влияние на кровеносную систему, в частности, на скорость кровотока и деформацию эритроцитов. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи: 1.Определить летальные дозы (ЛД50) атропина и карбоксима оценить их эффективность при отравлении мышей фосфаколом.

2.Выяснить подпороговую по эффективности дозу карбоксима и атропина при профилактическом введвении которой мышам она обеспечивает выживаемость 50% животных, получивших фосфакол в дозе 2ЛД».

3.Оценить подобранные дозы в условиях профилактического и лечебного примене ния с целью сопоставления их преимуществ перед отдельными компонентами антидо та.

4.Выяснить влияние фосфорорганических инсектицидов (фосфакол и карбофос) на скорость кровотока в микрососудах аппендикса крыс.

5.0пределить причину деформации эритроцитов в опытах in vitro и in vivo при действии фосфорорганическими инсектицидами.

б.Изучить влияние созданного модельного лечебно-профилактического антидота на скорость кровотока и деформацию эритроцитов. Научная новизна работы.

Впервые карбоксим применяется в качестве одного из компонентов профилактического антидота в составе комплекса с атропином в подпороговых дозах. Изучены и представлены дополнительные свойства карбоксима, кроме известного свойства, как реактиватора холинэстеразы.

Показана эффективность подпороговых доз атропина и карбоксима при совместном их применении в качестве компонентов модельного лечебно-профилактического антидота.

Впервые атропин и карбоксим применяются в неэффективных (очень малых) дозах, что обеспечивает отсутствие токсического эффекта антидота а,следовательно, гарантирует его безопасность.

Впервые выявлена, деформация эритроцитов, связанная с появлением в крови «волны» выбрасываемого нервными окончаниями ацетилхолина, действующего на незащищенные холинэстеразой клетки.

Показано, что деформированные эритроциты образуют конгломераты, которые существенно нарушают микроциркуляцию крови и способствуют возникновению геми-ческой гипоксии.

Установлено, что применение лечебно-профилактического антидота приводит к нормализации скорости кровотока до физиологической нормы 158±15об/мин., а также к существенному снижению деформации эритроцитов при профилактическом применении антидота до 39,1±0,1**(%); при лечебном применении до 39,3±0,5** (%). Практическое значение работы. Созданный модельный антидот может быть принят за основу создания лечебно-профилактического антидота для работников сельского хозяйства, принимающих участие в обработке животных от эктопаразитов при помощи фосфорорганических инсектицидов. Выявлены преимущественно новые свойства карбоксима, как обратимого ингибитора холинэстеразы аллостерического действия, которые могут быть использованы для создания других антидотов, в том числе антидотов против фосфорорганических отравляющих веществ.

Созданный модельный лечебно-профилактический антидот может быть использован в дальнейшем для более подробного изучения его влияния не только на кровеносную, ной на другие системы организма. Положения, выносимые на защиту:

1. Карбоксим уже в дозе 1/100 способен потенцировать защитный эффект атропина при отравлении фосфорорганическими соединениями, что говорит о возможности использования карбоксима не только как реактиватора холинэстеразы, но как аллостерического обратимого ингибитора холинэстеразы.

2. Применение одного атропина и карбоксима в качестве самостоятельных средств защиты фактически оказалось не эффективным, тогда как совместное применение как лечебного, так и особенно профилактического комплекса атропина с карбоксимом обеспечивает выраженный профилактический и лечебный эффекты.

3.Создана модель лечебно-профилактического антидота, при этом его компоненты: атропин (5мг/кг) и карбоксим (5мг/кг) использовались в неэффективных (достаточно малых дозах), в результате этого полученная модель лечебно-профилактического антидота не является токсичной, следовательно, не вызывает опасности появления побочных эффектов.

4. Установлено, что применение лечебно-профилактического антидота приводит к нормализации скорости кровотока до физиологической нормы 158±15об/мин., атакже существенному снижению деформации эритроцитов при профилактическом применении антидота до 39,1±0,1 **(%); при лечебном применении до 39,3±0,5** (%). Апробация работы.

Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на научных конференциях профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов (Санкт-Петербург, СПбГАВМ, 2006, 2007, 2008), на 59-й, 60-й, 61-й, 62-й научных конференциях молодых ученых и студентов (Санкт-Петербург, СПбГАВМ, , 2006, 2007, 2008).

Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 7-х печатных работах.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка литературы. Работа содержит 14 таблиц и 16 рисунков. Список литературы включает 151 наименований, в том числе 35 иностранных авторов. Материалы и методы исследований

Опыты проводились на самцах белых лабораторных мышей массой 21 грамм, а также на белых беспородных крысах (самцах) массой 200-220г. Для исследований использовались в качестве модельных отравляющих веществ параоксон (фосфакол) и карбофос.

Кроме этого, в качестве компонентов модельного антидота использовался атропин и карбоксим. Атропин- М-холиноблокатор, представляющий собой белый кристаллический порошок без запаха. В наших опытах использовался 1% раствор атропина в ампулах по 1мл (Машковский,2002). Карбоксим является препаратом отечественной промышленности и впервые был синтезирован в Институте Токсикологии Минздрава России. Препарат относится к ряду бисчетвертичных соединений, содержащих одну оксимную группу.

Для достижения поставленной цели в ходе опытов использовались следующие методы: Табличный метод. (Прозоровский, 1998). В основе метода лежит предложение использовать испытуемые вещества в дозах (концентрациях или показателях времени), которые расположены по логарифмической шкале с интервалом 0,1, а все возможные достоверные результаты ЕД50 и их ошибки рассчитаны заранее по программе пробит-анализа на ЭВМ (Прозоровский, 1994).

При оценке веществ с высокой биологической активностью целесообразно использовать четыре последовательно расположенные дозы по 2, по 3 или по 4 объекта на дозу. Дозы могут располагаться в одном разряде или переходить из одного разряда в другой. В каждой группе опытным путем определяют число положительных результатов, например, число погибших животных, которые записываются как «последовательность реакций». Среднюю эффективную дозу и ее стандартную ошибку находят на пересечении строки с найденной «последовательностью реакций» со столбцом, соответствующим первой из испытанных доз. Естественно, что доз может быть испыта-

но больше, чем четыре, но выбор столбца определяется той дозой, которая входит в окончательно установленную четверку.

Метод накопления частот. Бывают ситуации, при которых испытаний вроде бы много, но кривая очень полога и несколько испытаний подряд дали результат около 50%, что никак не позволяет использовать даже и скользящую среднюю со всеми модификациями. Авторы предложили использовать метод накопления частот, считая, что животное погибшее при введении ему вещества в малой дозе должно было бы погибнуть и от большой, а животное выжившее при большой дозе выжило бы от малой. Такое накопление «виртуальных душ» получило название беренсирование, которое приводит к мнимому увеличению числа наблюдений и их сглаживанию. Появление красивого ряда цифр - летальностей не должно радовать, поскольку он не отражает истины. Беренсирование позволяет определить дозу JIJI50 с относительной точностью очень просто, даже в том случае, если разброс результатов очень велик. Метод скользящей средней. Кумулята, по результатам явно несимметричного распределения летальных доз, не только некрасива, но и явно не соответствует представлениям о кривых такого рода. Для сглаживания подобных кривых существует так называемый «метод скользящей средней». Суть его в том, что процент, соответствующий каждой отдельной дозе, исправляется путем его вычисления как средняя величина эффектов трех доз: предыдущей, данной и последующей. Метод постановки опыта по наблюдению за микроциркуляцией в сосудах мезо-аппендикса наркотизированных крыс при внутримышечном введении фосфа-кола в разных дозах. Задачей нашего исследования являлось наблюдение за микроциркуляцией в микрососудах мезоаппендикса наркотизированных крыс при внутримышечном введении фосфакола (параоксона) в разных до-зах(0,8ЛД50;0,9ЛД50;1ЛД50). Нарушение кровотока в артериолах и капиллярах оценивали в баллах, скорость кровотока определяли стробоскопическим методом. Пять баллов соответствовали норме и скорости кровотока 158 ± 15 об/мин, 4 — заметному снижению кровотока — 28 ± 2 об/мин, 3 — резкому снижению — 6 ± 1 об/мин, 2 — маятникообразному движению крови и 1 — стазу. Для определения деформации эритроцитов использовали 70-кратное увеличение микроскопа «Биолам». Метод определения активности ХЭ крови и деформации эритроцитов при введении фосфакола в летальной дозе. Фосфакол вводили внутримышечно в дозе ЛД50 = 0,82 ±0,12 мг/кг, а кровь получали путем декапитации через разные промежутки времени. Активность ХЭ цельной крови определяли методом потенциометрического титрования на автотитраторе фирмы «Radiometr», а эритроциты, осажденные на покровных стеклах, после высушивания и напыления золотом фотографировали, используя сканирующий вариант электронного микроскопа «Hitachi-300». Метод изучения влияния фосфакола на эритроциты в экспериментах in vitro. Для проверки раздельных и совместных эффектов фосфакола на эритроциты были проведены эксперименты in vitro. После декапитации интактных крыс полученную кровь разливали в 4 пробирки: № 1 оставляли для контроля, в № 2 добавлялся фосфакол в конечной концентрации 0,167 мг/г, чем достигалось угнетение ХЭ на 93%, в № 3 добавляли АХ в концентрации 10-4, 10-6или 10-8 моль, в № 4 вводили фосфакол, а после 15-минутной инкубации АХ в тех же концентрациях. Через 30 мин производили учет результатов эксперимента.

Метод постановки опыта по наблюдению за кровотоком в пиальных сосудах крыс при введении карбофоса в дозе ЛД50 и определению деформации эритроцитов при введении карбофоса в разных дозах (1/3;1/10 и ЛД50). Нарушение кровотока в артериолах и капиллярах оценивали в баллах, скорость кровотока опре-

деляли стробоскопическим методом. Пять баллов соответствовали норме и скорости кровотока 158 ± 15 об/мин, 4 — заметному снижению кровотока — 28 ± 2 об/мин, 3

— резкому снижению — 6 ± 1 об/мин, 2 — маятникообразному движению крови и 1

— стазу. Кровь получали путем декапитации через разные промежутки времени. Активность ХЭ цельной крови определяли методом потенциометрического титрования на автотитраторе фирмы «Radiometr», а эритроциты, осажденные на покровных стеклах, после высушивания и напыления золотом фотографировали, используя сканирующий вариант электронного микроскопа «Hitachi-ЗОО». Дополнительно исследовали зависимость между торможением ацетил-ХЭ крови и частотой регистрации деформированных эритроцитов у крыс после внутрибрюшинного введения карбофоса в дозе ДД50.

Метод постановки опыта по наблюдению за микроциркуляцией в сосудах мезо-аппенднкса наркотизированных крыс при применении модельного лечебно-профилактического антидота (в составе атропина 5 мг/кг и карбоксима 5 мг/кг).

Задачей нашего исследования являлось наблюдение за микроциркуляцией в микрососудах мезоаппендикса наркотизированных крыс при введении антидота как с лечебной, так и с профилактической целью при внутримышечном отравлении крыс фос-факолом в дозе близкой к удвоенной ЛД99. Скорость кровотока определяли стробоскопическим методом. Нарушение кровотока в артериолах и капиллярах оценивали в баллах. Пять баллов соответствовали норме и скорости кровотока 158 ± 15 об/мин, 4

— заметному снижению кровотока — 28 ± 2 об/мин, 3 — резкому снижению — 6 ± 1 об/мин, 2 — маятникообразному движению крови и 1 — стаз.

Метод постановки опыта по изучению влияния модельного лечебно-профилактического антидота (в составе атропина 5 мг/кг и карбоксима 5 мг/кг) на деформацию эритроцитов. Опыты выполнены на белых беспородных крысах с массой тела 200-220г. Для проведения эксперимента были сформированы 4 группы крыс (по 20 животных в каждой группе). В данном исследовании мы в качестве ФОС использовали фосфакол.

Первая группа животных - физиологический контроль.

Крысам второй группы за 15 минут до введения фосфакола (n/к в дозе близкой к удвоенной ЛД99) вводили одновременно атропин в дозе 5мг/кг в/бр и карбоксим в дозе 5мг/кг.

Крысам третьей группы вводили фосфакол п/к в дозе близкой к удвоенной ЛД99, а через 1 минуту вводили одновременно атропин в дозе 5мг/кг в/бр и карбоксим в дозе 5мг/кг.

Крысам четвертой группы вводили фосфакол без антидотной терапии. Через 30 минут после проведения детоксикационной терапии животных забивали и оценивали морфологические изменения эритроцитов. Полученные данные обрабатывали статистически с использованием t-критерия Стьюдента.

Результаты исследования. Определение летальной дозы атропина при введении его самцам мышей внут-рибрюшино. Опыты выполнены с использованием 5 животных на дозу (расположены по арифметической шкале) с последующей обработкой материала по методу скользящей средней. Доза ЛД16, ДЦ50 и ЛД84 определины графически. Результаты эксперимента и их обработка приведены в таблице № 1.

Таблица№1 Определение ожидаемых величин летальности с использование* метода скользящей средней при оценке токсичности атропина внутрибрюшинн в опытах на белых мышах. Использовано 5 особей на дозу.

Дозы атропина в мг/кг Число погибших Летальность в процентах

эмпирическая исправленная летальность

100,0 0 0 13

200,0 2 40 40

300,0 4 80 60

400,0 3 60 80

500,0 5 100 87

Согласно построенному, на основании полученных данных, графику по исправлен ным процентам летальности величина ЛД50 равна 250 мг/кг. ПН=194 : 250= 0,8. Согласно принятому мнению, вещества ядовитые в своем большинстве имеют крутой наклон кривой (0,2 и менее), тогда как вещества мало ядовитые имеют наклон кривой 0,4 и более. Таким образом, из произведенных вычислений следует, что атропин является веществом мало ядовитым для мышей, поэтому он и используется в качеств одного из компонентов антидота, хотя следует учесть, что атропин является ядовитым для человека и относится к группе А.

Определение летальной дозы фосфакола при подкожном введении. Летальная до за фосфакола была определена с помощью табличного экспресс- метода разработанного Прозоровским В.Б.(Прозоровский,1998). Для определения ЛД50 фосфакола были использованы четыре последовательно расположенные дозы(0,5; 0,6; 0,8; 1,0) по два животных на каждую дозу. В результате проведенного опыта были получены следующие эмпирические показатели летальности (0; 0; 2; 2). Средняя эффективная доз и ее стандартная ошибка была найдена по пересечению строки с найденной «последовательностью реакций» со столбцом, соответствующим первой из испытанных доз. Таким образом, ЛД50 была найдена равной М±т=0,74±0,06. После определения ЛД50 был произведен расчет кривой доза летальность при отравлении мышей фосфаколом методом скользящей средней, представленным табл_№2.

Таблнца№2.Определение ожидаемых величин летальности с использованием метода скользящей средней при оценке токсичности фосфакола подкожно в опытах на белых мышах. Использовано 2 особей на каждую дозу.

Дозы фосфакола в мг/кг Летальность в процентах

эмпирическая первое исправление второе исправление

0,5 0 0 11

0,6 0 33 37

0,8 100 67 67

1,0 100 100 89

Согласно данным таблицы был построен график. На основании построенного графика определили ПН=0,25. Согласно принятому мнению, вещества ядовитые в своем большинстве имеют крутой наклон кривой (0,2 и менее). Таким образом, из произведенных вычислений следует, что фосфакол достаточно ядовит, а поэтому в проведенных нами опытах был использован в качестве модельного отравляющего вещества. Определение ДД50 карбоксима для мышей при внутрибрюшинном введении. Для определения ЛД50 карбоксима с помощью «Табличного экспресс-метода» были ис-

пользованы четыре дозы, расположенные через две на третью (39,8; 79,4; 158,0; 317,0) по два животных на каждую дозу. В результате проведенного опыта были получены следующие эмпирические показатели летальности (0; 0; 1; 2). Таким образом, ЛД50 карбоксима была найдена равной М±ш=159,3±47,6. После определения ЛД50 был произведен расчет кривой доза-летальность методом скользящей средней, показанный наглядно в таблице № 3 и в дальнейших расчетах.

Таблица№3 Определение ожидаемых величин летальности с использованием метода скользящей средней при оценке токсичности карбоксима внутрибрюши-но в опытах на белых мышах. Использовано 2 особей на каждую дозу.

Дозы карбоксима в мг/кг. Летальность в процентах

эмпирическая первое ис- второе ис- третье ис-

правление правление правление

40,0 0 0 6 9

80,0 0 17 22 26

160,0 50 50 50 50

300,0 100 83 78 76

Согласно данным таблицы был построен график. На основании построенного графика в дальнейшем был определен показатель наклона кривой ПН= 0,8. Такой наклон кривой мал, что позволяет, во-первых, признать карбоксим малотоксичным для практического использования, а во-вторых, предполагать отличие распределения летальных доз карбоксима от нормального (типичны коэффициенты в пределах 0,15 - 0,3). Такой наклон характерен для веществ, вызывающих более чем одну первичную токсическую реакцию. Действительно, согласно литературным данным (Прозоровский и др., 1976), можно отметить, что карбоксим обладает, по меньшей мере холинолитиче-ским и антихолинэстеразным действием.

При определении токсичности карбосима в случае его введения в сублетальной дозе отмечено возникновение фасцикуляций (вздрагивание конечностей), что является типичным для токсического действия ингибиторов холинэстеразы и наблюдается как при отравлении фосфаколом, так и при отравлении близким по строению к карбокси-му обратимым бисчетвертичным ингибитором холинэстеразы оксазилом Оценка эффективности защиты атропина (10 мг/кг в/бр) при его профилактическом применении. В данном опыте были изучены возможности одного атропина при его профилактическом применении в дозе 10 мг/кг введенного внутрибрюшин-но, с последующим введением через 30 минут модельного отравляющего вещества -фосфакола. Величину ЛД50 определяли табличным методом. Для определения ЛД50 атропина с целью профилактики были использованы четыре последовательно расположенные дозы (1,3; 1,6; 2,0; 2,5) по два животных на каждую дозу. В результате проведенного опыта были получены следующие эмпирические показатели летальности (0; 1; 2; 2). Следовательно, ЛД50 была найдена равной M±m=l,66 ± 1,6. После определения ЛД50 был произведен расчет кривой доза-летальность методом скользящей средней, представленной в табл.№4.

Таблица №4. Определение ожидаемых величин летальности с использованием метода скользящей средней при оценке эффективности защиты атропина (внутрибрюшннно) при его профилактическом применении в опытах на белых мышах. Использовано 2 особи на дозу.

Доза фосфакола в мг/кг Летальность %

эмпирическая первое исправление второе исправление

1,3 0 17 22

1,6 50 50 50

2,0 100 83 78

2,5 100 100 94

Согласно данным таблицы был построен график. С помощью построенного графика было произведено вычисление ИЗ (индекса защиты)=2,2. Производим вычисление показателя наклона кривой П№=0,3. ИГЗ (индекс гарантированной защиты) ЛД) опыт: ЛД99 контроль = 0,81: 1,24 = 0,6. Следовательно, И3=2,2, а ИГЗ=0,6. Отсюда очевидно, что один атропин не гарантирует защиту животных от гибели при отравлении фосфаколом. Из вышеперечисленного можно сделать вывод, что применение атропина в качестве самостоятельного профилактического, тем более лечебного препарата не достаточно эффективно. Из всего сказанного очевидно, что необходимо применение атропина в сочетании с каким-либо другим компонентом антидота (например, с карбоксимом).

Определение эффективности защиты карбоксима в рекомендованной для мышей дозе (15 мг/кг) при отравлении фосфаколом п/к. До испытания атропина с карбоксимом в комплексе было проведено испытание одного карбоксима. Дозу карбоксима брали рекомендованную лечебную, которая равна 1/10 ЛД50. Величину ЛД5о определяли табличным методом. Были использованы четыре последовательно расположенные дозы (2,0; 2,5; 3,0; 4,0) по два животных на каждую дозу. При этом предварительно за 30 минут до введения фосфакола в вышеуказанных дозах был введен кар-боксим в дозе 15 мг/кг внутрибрюшино. В результате проведенного опыта были получены следующие эмпирические показатели летальности (0; 0; 2; 1) . ЛД50 была найдена равной М±ш=33,4±5,7мг\кг. После определения ЛД50 был произведен расчет кривой доза-летальность методом скользящей средней (таб.№5). Таблица №5 Определение ожидаемых величин летальности с использованием метода скользящей средней при оценке эффективности защиты карбоксима (внутрибрюшинно) при его профилактическом применении в опытах на белых мышах. Использовано 2 особи на дозу.__

Доза фосфакола Летальность %

в мг/кг эмпирическая первое исправ- второе исправ-

ление ление

2,0 0 0 11

2,5 0 33 28

3,0 100 50 50

4,0 50 83 78

Согласно данным таблицы строим график. При помощи графика производим вычисление ИЗ =4,7 .Затем производим вычисление показателя наклона кривой ПН= 15,9. Таким образом, ПНЮ,5. ИГЗ (индекс гарантированной защиты) ЛД^пыт: ЛД^контроль = 1,60: 1,24 = 1,3. Следовательно, И3=4,7, а ИГЗ=1,3. Отсюда следует, что карбоксим гарантирует защиту животных от действия отравляющего вещества, но ИГЗ=1,3 при его профилактическом применении (т.е. не достаточно высокий), оче-

видно, что при его лечебном применении ИГЗ будет гораздо ниже. Поскольку у атропина ИГЗ=0,6, что свидетельствует об отсутствии гарантированной защиты одного атропина, а у карбоксима ИГЗ=1,Э , то есть довольно низкий, все это послужило поводом для оценки возможности потенцирования защитного действия атропина с помощью карбоксима.

Определение времени возникновения судорог и смерти при 2 ЛД99.=2,5 мг/кг. Для оценки возможности потенцирования защитного действия атропина с помощью карбоксима предварительно необходимо было определить такую дозу атропина при которой животные погибали, но время возникновения судорог и время смерти выходило бы за контрольные 20. В предварительном эксперименте определили время возникновения судорог и время возникновения смерти при 2ЛД99=2,5 мг/кг (см. табл.№6).

Таблица №6. Определение времени возникновения судорог и смерти при 2 ЛДаг*

2,5мг/кг.

М б 2а

Время возникновения судорог 5,3 2,6 2,2-7,4

Время возникновения смерти 8,2 2,55 5,7—10,8

Был проведен опыт, в ходе которого предварительно за 30 минут до введения отравляющего вещества (фосфакола в дозе 2,5мг\кг, что соответствует 2 ЛД99) , вводили атропин в дозе 5мг/кг, под влиянием которого отодвигалось время смерти животных после ведения фосфакола на 10 минут по сравнению с нормой с последующей гибелью. Таким образом, на основании проведенного опыта доза атропина равная 5 мг/кг была выбрана как действующая, но сублетальная.

Определение средней эффективной дозы карбоксима (в/б) в сочетании с атропином в дозе 5 мг/кг при отравлении фосфаколом. Расчет по методу Беренса. Затем был произведен расчёт средней эффективной дозы карбоксима (в/бр) в сочетании с атропином в постоянной подпороговой дозе (5 мг/кг) как средства профилактики отравления мышей фосфаколом в дозе 2ЛД99 (п/к). Всего животных - 21. Расчет по Бе-ренсу (табл.№7).

Таблица №7. Летальность белых мышей самцов в % при подкожном введении фосфакола в дозе 2ЛДэ9 (п/к) с предварительным (за 15 минут) введением атропина в дозе 5мг/кг н карбоксима внутрибрюшинно. Всего животных-21._

Доля ЛД50 Эмпнр ические Накопленные % леталь-

карбоксима данные частоты Всего ности

погибло выжило погибло выжило по Беренсу

1/12 0 3 0 11 11 0

1/25 1 2 1 8 9 11

1/50 2 1 3 6 9 33

1/100 2 1 5 5 10 50

1/200 1 2 6 4 10 60

1/400 1 2 7 2 9 78

1/800 3 0 10 0 20 100

Итак, согласно расчету по методу Беренса, средняя эффективная доза карбоксима при его использовании с атропином в подпороговой дозе составляет 1/100 его ЛД50, то есть 1,59 мг/кг. ЕД50 одного карбоксима равно 159,3 мг/кг. Согласно полученным

данным, а именно наличию 7доз, одна из которых ЛД50, было произведено вычерчивание кривой летальности и графически определены ЛД50=1,59±0,7, ПН=2,1. Следовательно, в данном опыте доказано, что карбоксим проявляет потенцирующее действие на эффект атропина. Этот эффект выражен в 4 раза слабее, чем в случае использования оксазила, но достаточно убедителен. Причиной этому является существенно меньшая антихолинэстеразная активность карбоксима по сравнению с оксазилом. Оценка защитного действия атропина (5 мг/кг в/бр) и карбоксима (5 мг/кг в/бр) в качестве модели профилактического антидота против фосфорорганических инсектицидов. Для определения ЛД50 с помощью «Табличного метода» были использованы четыре дозы, расположенные через две на третью (5,0; 10,0; 20,0; 40,0) по два животных на каждую дозу. В результате проведенного опыта были получены следующие эмпирические показатели летальности (0; 0; 1; 2). Таким образом, ЛД50 была найдена равной М±ш=20,0±5,97. После определения ЛД50 был произведен расчет кривой доза-летальность методом скользящей средней (таб.№8). Таблица№8. Определение ожидаемых величин летальности с использованием метода скользящей средней при оценке защитного действия карбоксима (внут-рибрюшинно в дозе 5 мг/кг) и атропина (внутрибрюшинно в дозе 5 мг/кг) в качестве модели профилактического антидота в опытах на белых мышах. Использовано 2 особи на дозу._ __

Дозы фос- эмпириче- первое исправ- второе ис- третье ис-

факола ская ление правление правление

в мг/кг

5,0 0 0 6 9

10,0 0 17 22 26

20,0 50 50 50 50

40,0 100 83 78 76

Согласно полученным данным, было произведено вычерчивание кривой летальности и графически определены ИЗ (индекса защиты) = 28. Затем производим вычисление коэффициента наклона кривой (КН)= 16,5. Таким образом, КН=16,5: 20,0= 0,8. ИГЗ (индекс гарантированной защиты) ЛД;Опыт: ЛД99контроль = 2,35: 1,24 = 1,9. Следовательно, И3=28, а ИГЗ=1,9. Исходя из произведеных вычислений следует, что совместное применение карбоксима с атропином при их предварительном введении гарантирует выживание при поражении ядом в дозе близкой удвоенной ЛД99, что обеспечивает сверхгарантию. Из проведенного опыта следует, что предложенная модель антидота обладает высоким профилактическим эффектом. При этом следует учесть, что компоненты лечебно-профилактического антидота атропин (5 мг/кг) и карбоксим (5 мг\кг) использовались в неэффективных (достаточно малых) дозах, вследствие этого не являются токсичными и не вызывают опасности проявления побочного эффек-та.Оценка защитного действия атропина (5 мг/кг в/бр) и карбоксима (5 мг/кг в/бр) в качестве модели лечебного антидота против фосфорорганических инсектицидов. Для определения ЛД50 с помощью «Табличного метода» были использованы четыре дозы, расположенные через две на третью (5,0; 10,0; 20,0; 40,0) по два животных на каждую дозу. В результате проведенного опыта были получены следующие эмпирические показатели летальности (0; 0; 1; 2). ЛД50 была найдена равной М±ш=17,7±6,4. После определения ЛД50 был произведен расчет кривой доза-летальность методом скользящей средней (таб. №9).

Таблица№9.Определение ожидаемых величин летальности с использованием метода скользящей средней при оценке защитного действия карбоксима (внут-рибрюшино в дозе 5 мг/кг) и атропина (внутрибрюшино в дозе 5 мг/кг) в качестве модели лечебного антидота в опытах на белых мышах. Использовано 2 осо-

Дозы фосфакола в мг/кг эмпирическая первое исправление второе исправление третье исправление

5,0 0 0 11 15

10,0 0 33 33 37

20,0 100 67 67 63

40,0 100 100 89 85

С помощью графика определяем ИЗ (индекса защиты)= 24 . Затем производим вычисление коэффициента наклона кривой КН =1,0. ИГЗ (индекс гарантированной защиты) ЛД1ОПЫТ: ДД^контроль = 2,1:1,24 = 1,7. Следовательно, И3=24, а ИГЗ=1,7. Из произведенных вычислений следует, что совместное применение карбоксима с атропином при их последующем введении гарантирует выживание при поражении ядом в дозе близкой удвоенной ЛД99, что обеспечивает высокую гарантию. Из проведенного опыта следует, что предложенная модель антидота обладает достаточно высоким лечебным эффектом. При этом следует • учесть, что компоненты лечебно-профилактического антидота атропин (5 мг/кг) и карбоксим (5 мг\кг) использовались в неэффективных (достаточно малых) дозах, вследствие этого не являются токсичными и не вызывают опасности проявления побочных эффектов. Результаты наблюдения за микроциркуляцией в мезоаппендиксе наркотизированных крыс при внутримышечном введении фосфакола (параоксона) в разных дозах. Изменения кровотока при отравлении фосфаколом регистрировались в узком диапазоне доз: снижение кровотока до 4-х баллов, отмечено лишь при введении ФОИ в дозе, равной 0,8 ЛД50, до 3-х — при дозе 0,9 ЛД50. При дозе, равной 1 ЛД50, кровоток снижается до 2-х и даже до 1-го балла. Артериальное давление при этом быстро снижается, и половина животных погибает. При используемом 70-кратном увеличении микроскопа «Биолам» существенной деформации эритроцитов не отмечали. Результаты определения активности ХЭ крови и деформации эритроцитов при введении фосфакола в летальной дозе. В результате проведенного эксперимента было установлено, что уже через 15 минут после введения фосфакола активность ХЭ подавляется на 100%, причем это подавление сохраняется в течение 4-х часов наблюдения. Через 24 часа подавление активности ХЭ составляло 58 ± 9%. Существенные изменения поверхности эритроцитов отмечены через 15 минут после затравки. Обнаруживается формирование многочисленных выростов клеточной поверхности, в результате чего часть клеток приобретает форму эхиноцитов. Одновременно происходит достоверное увеличение размеров эритроцитов с утратой их типичной двояковогнутой формы. Значительное количество клеток имеют дефекты плазмолеммы, сопровождающиеся их разрушением (Васильев и др.,1995). Спустя 1 час после начала отравления можно отметить существенную нормализацию клеточной поверхности с одновременным восстановлением их размеров и формы. Через 4 часа на фоне сохранения угнетения активности ХЭ происходит практически полная нормализация морфологии клеток. Эти данные дают основание предполагать, что начальная и относительно кратковременная деформация эритроцитов связана не столько с подавление активности ХЭ, сколько с появлением в крови «волны» выбрасываемого нервными

окончаниями АХ, которая заканчивается к 4 часам за счет опустошения его запасов или аутоторможения его выделения за счет активации пресинаптических М-ХР. Результаты опыта по изучению влияния фосфакола на эритроциты в экспериментах in vitro. Через 30 мин после воздействия фосфаколом отмечали уменьшение размеров клеток с 5,1 до 4,0 мкм (статистически, однако, не значимые из-за большого разброса результатов) и незначительные изменение поверхности клеток. Один АХ даже в больших (порядка 10"6 моль) концентрациях был не эффективен, в то время как его прибавление к эритроцитам, не защищенным ХЭ, вызывало все эффекты, описанные в опытах in vivo. Деформацию отмечали, начиная с концентрации 10"12 моль, и с ее повышением она встречалась все чаще и была более выражена С течением времени все описанные изменения оставались без изменений. Таким образом было доказано, что даже значительное угнетение ХЭ без АХ вызывает лишь незначительные изменения. Один АХ вызывал эффекты лишь в очень больших концентрациях. Но самые существенные эффекты вызывает АХ, действующий на незащищенные ХЭ клетки. Причем их выраженность имеет четкую концентрационную зависимость. Результаты наблюдения изменения кровотока в пиальных сосудах при введении карбофоса в дозе ЛД50 и определения деформированных эритроцитов при введении карбофоса в разных дозах. В опытах на крысах при наблюдении кровотока в микрососудах аппендикса установлено, что при введении карбофоса в дозе ЛД50 уже через 20 минут возникают явления стаза. В просвете сосудов наблюдается множество конгломератов, состоящих из форменных элементов. С помощью сканирующей электронной микроскопии установлено, что введение карбофоса в дозах ЛД50, 1/3 и 1/10 ЛД50 вызывает дозозависимые множественные грубые нарушения рельефа поверхности эритроцитов, ведущие к образованию конгломератов. Восстановление нормальной формы клеток напрямую зависело от дозы карбофоса.

Результаты опыта по наблюдению за микроциркуляцией в сосудах мезоаппен-дикса наркотизированных крыс при применении модельного лечебно-профилактического антидота (в составе атропина 5 мг/кг и карбоксима 5 мг/кг).

Изменение кровотока при введении атропина в дозе 5мг/кг в/бр и карбоксима в дозе 5мг/кг за 15 минут до введения фосфакола (п/к в дозе близкой к удвоенной ЛД99) регистрировалось в 5 баллов, что соответствует норме и скорости кровотока 158±15об/мин.

Изменение кровотока при введении фосфакола п/к в дозе близкой к удвоенной ЛД99, а через 1 минуту одновременном введении атропина в дозе 5мг/кг в/бр и карбоксима в дозе 5мг/кг, регистрировалось также в 5 баллов, что соответствует норме, но скорость кровотока при этом незначительно замедлялась до 146±15об/мин. Артериальное давление при этом существенно не изменялось.

Результаты опыта по изучению ' влияния модельного лечебно-профилактического антидота (в составе атропина 5 мг/кг и карбоксима 5 мг/кг) на деформацию эритроцитов. Количество деформированных эритроцитов в группе крыс, травленных фосфаколом и не получавших антидотной терапии, выросло в 5 раз по сравнению с группой интактных животных.

Количество деформированных эритроцитов в группе крыс, получавших атропин в дозе 5мг/кг в/бр и карбоксим в дозе 5мг/кг за 15 минут до введения фосфакола (п/к в дозе близкой к удвоенной ЛД99) выросло в 2,26 раза. В группе крыс, которой вводили фосфакол п/к в дозе близкой к удвоенной ЛД99, а через 1 минуту вводили одновременно атропин в дозе 5мг/кг в/бр и карбоксим в дозе 5мг/кг, количество деформированных эритроцитов увеличилось в 2,27 раза (табл.№10).

Таблица №10. Соотношение деформированных эритроцитов у крыс в остром

опыте при отравлении фосфаколом.

Группа животных Деформированные эритроциты, % Нормальные эритроциты,0/»

1 17,3±0,9 82,7±1,1

2 39,1±0,1** 60,9±1,5**

3 39,3±0,5** 60,7±1,7**

4 87,6±1,1** 12,4±0,3**

*-р<0,05 по отношению к физиологическому контролю, руппы животных:

1-Физиологический контроль (интактные крысы), -крысы, получавшие атропин в дозе 5мг/кг в/бр и карбоксим в дозе 5мг/кг за 15 ми-ут до введения фосфакола (п/к в дозе близкой к удвоенной ЛД99).

- крысы, получавшие атропин в дозе 5мг/кг в/бр и карбоксим в дозе 5мг/кг через 1 инуту после введения фосфакола п/к в дозе близкой к удвоенной ЛД99.

- крысы, травленные фосфаколом (без антидотной терапии).

Выводы:

1.При анализе токсических эффектов ФОС наряду с нарушением синаптической пе-едачи, установлена деформация эритроцитов, связанная с появлением в крови аце-лхолина, действующего на незащищенные холинэстеразой клетки. При отравлении арбофосом выявлена более интенсивная деформация эритроцитов (образование онгломератов), которая резко нарушает микроциркуляцию крови и вызывает геми-ескую гипоксию.

.Применение одного атропина и карбоксима в качестве самостоятельных средств актически оказалось не эффективным (при отравлении фосфаколом) по показателям 3=4,6; ИГЗ=1,3 карбоксима и И3=2,2; ИГЗ=0,6 атропина.

.Установлено, что карбоксим в дозе 1/100 способен потенцировать защитный эффект тропина, что сходно с аналогичным эффектом оксазила.

.Совместное применение как лечебного, так и особенно профилактического ком-лекса атропина с карбоксимом в субэффективных дозах обеспечивает выраженный рофилактический (И3=28; ИГЗ=1,9) и лечебный (И3=24; ИГЗ=1,7) эффекты. .Компоненты модели лечебно-профилактического антидота: атропин(5мг/кг) и кар-оксим (5мг/кг) использовались в неэффективных (достаточно малых дозах), в ре-ультате этого полученная модель лечебно-профилактического антидота не является оксичной, следовательно, не вызывает опасности появления побочных эффектов. .Установлено, что применение лечебно-профилактического антидота приводит к ормализации скорости кровотока до физиологической нормы 158±15об/мин., а также ущественному снижению деформации эритроцитов при профилактическом приме-ении антидота до 39,1±0,1**(%); при лечебном применении до 39,3±0,5** (%).

Заключение.

Нами было показано совместное применение атропина с карбоксимом в качестве одельного ЛПА как с профилактической, так и с лечебной целью. В результате про-еденых опытов было выявлено существенное возрастание индекса защиты (ИЗ) ри совместном применении атропина с карбоксимом с профилактической (И3= 28) с лечебной целями (И3= 25), по сравнению с индексом защиты карбоксима (И3= ,7) и атропина И3= 2,2, применяемых в качестве самостоятельных антидотов. Не-мотря на увеличение показателя кривой индекс гарантированной защиты (ИГЗ) то-е существенно возрастает при совместном применении атропина с карбоксимом с рофилактической (ИГЗ= 1,9) и с лечебной целями (ИГЗ= 1,7) по сравнению с индек-

сом гарантированной защиты карбоксима (ИГЗ= 1,3) и атропина ИГЗ= 0,6, используемых в качестве самостоятельных антидотов. Таким образом, задачи поставленные исследованием были решены и цель, которая была сформулирована как разработка модельного лечебно-профилактического антидота, предназначенного для рабочих сельского хозяйства, в целом достигнута. Помимо всего вышеперечисленного был произведен ряд исследований по наблюдению за микроциркуляцией при отравлении мышей фосфаколом. В результате проведенных опытов было установлено, что при отравлении ФОС происходит существенное снижение скорости кровотока, деформация эритроцитов с образованием многочисленных конгломератов, что существенно усугубляет патологию. В свою очередь при изучении влияния разработанного модельного ЛПА на кровеносную систему было установлено существенное уменьшение деформации эритроцитов (при профилактическом применении до 39,1±0,1**в %; при лечебном применении до 39,3±0,5** в %), а также нормализация скорости кровотока до физиологической нормы 158±15об/мин.

Список основных работ по теме диссертации:

1. Панченкова O.A., Жичкина Л.В. Влияние отравлений фосфорорганическими ингибиторами холинэстеразы на процессы ПОЛ// Материалы междунар. науч. конф. профессорско-преподавательского состава, науч. Сотрудников и аспирантов СПбГАВМ.-СПб., 2007.-С.64-66.

2. Панченкова O.A. Гипоксия- фактор, усугубляющий течение патологического процесса при отравлении ингибиторами холинэстеразы// Материалы 61-й науч. конф. молодых ученых и студентов СЙбГАВМ/ СПбГАВМ - СПб., 2007.-С.71-72.

3. Панченкова O.A. Применение обратимых ингибиторов для профилактики и лечения отравлений фосфорорганическими инсектицидами // Материалы юбилейной междунар. науч. конф., посвящ. 200-летию высш. ветеринарного образования в России и 200-летию СПбГАВМ/ СПбГАВМ,- СПб., 2008.-С.75-76.

4. Жичкина Л.В., Скопичев В.Г., Панченкова O.A. Разработка новых методов детоксикации при отравлении ФОС-ингибиторами холинэстеразы // Уч. записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э.Баумана. -2006, т. 185. - С. 267 - 270. (рец. ж-л)

5. Жичкина Л.В., Скопичев В.Г., Касумов М.К., Панченкова O.A. Влияние острых отравлений фосфорорганическими соединениями на процессы ПОЛ // Мат. XV Московского Межд. ветеринарного конгресса по болезням мелких домашних животных. - Москва, 2007. - С. 126 - 127.

6. Скопичев В.Г., Жичкина Л.В., Панченкова O.A. Состояние перекисного окисления липидов при отравлении фосфорорганическими ингибиторами холинэстеразы //Актуальные проблемы современной медицины. Республиканский межвузовый научно-практический сборник,- Великий Новгород,2007.-Т.9.-С.322-324.

7. Прозоровский В.Б., Скопичев В.Г., Панченкова O.A. Оценка карбоксима реактиватора холинэстеразы, как средства профилактики отравлений фосфорорганическими ингибиторами холинэстераз.// Ветеринарная Практика. -СПб, 2008.-№ 4(43).-С.46-51.

Подписано в печать 03.03.2009 г. Формат 148X210. Бумага офсетная. Печать ризография. Усл. печ. л.1,1. Тираж 100 экз.

Заказ №03. Отпечатано в ИП Хинейко 198095, Россия, Санкт-Петербург, ул. Розенштейна д. 21, тел./факс: 445-27-42 е-таЦ:апоп8@ре1егИпк.ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Панченкова, Ольга Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1 .ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Состояние проблемы.

1.1.1 Появление инсектицидов, их распространение и выявление антихолинэстеразного действия.

1.1.2. Характеристика фосфорорганических инсектицидов применяемых в сельском хозяйстве и отравления, возникающие в результате их применения.

1.1.3. Атропин, как универсальный препарат для лечения отравлений ФОС.

1.1.4.Реактиваторы холинэстеразы (ХЭ) и попытка их комбинации с атропином.

1.2. Выбор направления исследований.

1.2.1.Создание новых антидотов против фосфорорганических инсектицидов.

1.2.2. Конкурентное и неконкурентное действие обратимых ингибиторов холинэстеразы.

1.2.3.Аллостерический эффект ингибиторов холинэстеразы.

1.3.Физиологические аспекты микроциркуляции.

1.3.1.Значение деформируемости эритроцитов.

1.3.2.Факторы, определяющие деформируемость эритроцитов.

1.3.3. Деформируемость эритроцитов при нарушениях кислородного обеспечения.

1.3.4. Дистантное действие в патогенезе отравлений ФОИ.

2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Табличный метод.

2.2. Метод накопления частот.

2.3. Метод скользящей средней.

2.4.Метод постановки опыта по наблюдению за микроциркуляцией в сосудах аппекса наркотизированных крыс при внутримышечном введении фосфакола в разных дозах.

2.5.Метод определения активности ХЭ крови и деформации эритроцитов при введении фосфакола в летальной дозе.

2.6.Метод изучения влияния фосфакола на эритроциты в эксперименте in vitro.

2.7.Метод постановки опыта по наблюдению за кровотоком в пиальных сосудах крыс при введении карбофоса в дозе ЛД50 и определению деформации эритроцитов при введении карбофоса в разных дозах.

2.8.Метод постановки опыта по наблюдению за микроциркуляцией в сосудах аппекса наркотизированных крыс при применении модельного лечебно- профилактического антидота (в составе атропина 5мг/кг и карбоксима 5мг/кг).

2.9.Метод постановки опыта по изучению влияния модельного лечебно-профилактического антидота (в составе атропина 5мг/кг и карбоксима 5 мг/кг) на деформацию эритроцитов.

3 .СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Определение летальных доз фосфакола, атропина и карбоксима.

3.1.1. Определение летальной дозы атропина при введении его самцам мышей внутрибрюшинно.

3.1.2. Определение летальной дозы фосфакола при подкожном введении.

3.1.3. Определение ЛД50 карбоксима для мышей при внутрибрюшинном введении.

3.2. Оценка эффективности зашиты атропина и карбоксима при их профилактическом применении.

3.2.1.Оценка эффективности защиты атропина (10 мг/кг в/бр) при его профилактическом применении.

3.2.2. Определение эффективности защиты карбоксима (15 мг/кг п/к) при отравлении мышей фосфаколом.

3.3. Оценка возможности потенцирования защитного действия атропина с помощью карбоксима.

3.3.1.Определение времени возникновения судорог и смерти при 2ЛД99=2,5 мг/кг.

3.3.2. Определение средней эффективной дозы карбоксима (в/бр) в сочетании с атропином в дозе (5 мг/кг) при отравлении фосфаколом. Расчет по методу Беренса.

3.4. Оценка защитного действия атропина и карбоксима при их совместном применении в качестве модели лечебно-профилактического антидота против фосфорорганических инсектицидов.

3.4.1 .Оценка защитного действия атропина (5 мг/кг в/бр) и карбоксима (5 мг/кг в/бр) в качестве модели профилактического антидота против фосфорорганических инсектицидов.

3.4.2. Оценка защитного действия атропина (5 мг/кг в/бр) и карбоксима (5 мг/кг в/бр) в качестве модели лечебного антидота против фосфорорганических инсектицидов.

3.5.Физиологические аспекты микроциркуляции при действии ФОИ.

3.5.1.Результаты наблюдения за микроциркуляцией в сосудах аппекса наркотизированных крыс при внутримышечном введении фосфакола в разных дозах.

3.5.2. Результаты опыта по определению активности ХЭ крови и деформации эритроцитов при введении фосфакола в летальной дозе.

3.5.3.Результаты опыта по изучению влияния фосфакола на эритроциты в эксперименте in vitro.

3.5.4.Результаты постановки опыта по наблюдению за кровотоком в пиальных сосудах крыс при введении карбофоса в дозе ЛД50 и определению деформации эритроцитов при введении карбофоса в разных дозах.

3.5.5.Результаты опыта по наблюдению за микроциркуляцией в сосудах аппекса наркотизированных крыс при применении модельного ЛПА (в составе атропина 5 мг/кг и карбоксима 5 мг/кг).

3.5.6.Результаты опыта по изучению влияния модельного ЛПА (в составе атропина 5 мг/кг и карбоксима 5 мг/кг) на деформацию эритроцитов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Защитное действие нового антидота на основе карбоксима при отравлении фосфорорганическими соединениями"

Актуальность темы. Многие кровососущие насекомые и паукообразные являются переносчиками возбудителей целого ряда инвазионных, инфекционных и вирусных болезней животных и человека. Помимо этого, вкусовые качества мяса ухудшаются из-за резкого снижения содержания аминокислот, витаминов, макро- и микроэлементов (Филлипов и др.,1997; Гурьева и др., 1997; Miller et al.,1995; Ney et al.,1990). Поэтому ежегодно затрачиваются большие средства на организацию лечебно-профилактических мероприятий, направленных на борьбу с эктопаразитами. При арахноэтомозах применяют инсектоакарициды, которые обладая длительной персистентностью, способны убивать как взрослых насекомых клещей, так и их преимагинальные стадии. С этой целью, например, прикрепляются ушные бирки фирмы «Флектрон», которые содержат перметрин, длительно защищающий животных от нападения членистоногих. Для профилактики эффективны ивомек и цидектин. Против гнуса и его отдельных компонентов высокоэффективна обработка крупного рогатого скота, лошадей и оленей водной эмульсией оксамата, терпиноидного репиллента и перитроидов различной концентрации. Инсектоакарициды защищают животных от нападения членистоногих и тем самым профилактируют заражение их возбудителями трансмиссивных болезней. Из большого числа рекомендованных для борьбы с эктопаразитами препаратов наиболее широкое применение получили аббат (дифос), байтекс, ДЦВФ, дибром. Дурсбан, карбофос, метатион применяют согласно действующей инструкции. Эффективен биопрепарат бактокулицид, а также аналоги ювенильных гормонов (альтозид, димилин). Применяют также аэрозоли, получаемые из 1-2 % масляных растворов или эмульсий ДДВФ., а также используются ХОС и ФОС, карбоматы.

Все перечисленные выше инсектоакарициды не только спасают животных от эктопаразитов, но являясь в большинстве своем ХОС и ФОС, оказывают существенный вред, как организму животных, так и способствуют возникновению у человека как острого, так и хронического отравления (Ливанов и др., 1997).

Отравления ФОИ как в бьпу, так и в сельском хозяйстве, в том числе на животноводческих фермах встречаются достаточно часто. В России в 1990 г пострадавшие от интоксикации ФОС составляли 9-15% от общего числа госпитализированных по поводу отравлений. В 1996г летальность при отравлении ФОИ в разных годах и областях России колебалась от 7% в Кемеровской области до 25% в Екатеринбурге. В первые годы двадцать первого века во всем мире ФОИ на производстве, в бьпу, на полях и на животноводческих фермах вызывали до 3000 ООО отравлений в год (Прозоровский,1969; Махмудов и др.,2004).

Первые сообщения о фосфорорганических отравляющих веществах (ФОВ) появились в литературе лишь после окончания второй мировой войны. Из-за высокой токсичности и химической стойкости большую потенциальную опасность представляют пестициды и инсектициды из группы ФОС. Накапливаясь в почве, воде и продуктах питания, они создают предпосылки для острых и хронических отравлений. ФОС обладают разносторонним действием на организм, которое охватывает многие органы и системы (Прозоровский и др.,1997). Это связано с тем, что ФОС, как нервные яды избирательного холинэргического действия, оказывают влияние на все нервные структуры, в которых передача импульсов осуществляется посредством медиатора ацетилхолина (ЦНС, секреторные железы, гладкая мускулатура бронхов, кишечника, сосудов; сердце, ганглионарные и нервно-мышечные синапсы, мозговое вещество надпочечников) (Кривой и др.,1987). Первой и ведущей токсической реакцией является связывание и инактивация фермента холинэстеразы (Голиков,1970). В результате в процессе интоксикации наступают нарушения центральной гемодинамики, выраженные изменения свёртывающей системы крови и её реологических свойств, нарушения микроциркуляции крови и др. явления, протекающие на фоне стресса. Т.о., ацетилхолин (АХ) накапливается и вызывает сначала гиперэффекгы внутри синапса, а затем поступает в кровь, осуществляя околосинаптическое и дистантное действие (Скопичев и др., 2000). В результате высвобождения шстамина базофилами повышается проницаемость стенок мелких сосудов, развивается спазм гладкой мускулатуры и другие общие нарушения в организме, которые еще более утяжеляют состояние организма.

Поскольку в настоящее время лечебно-профилактических антидотов против фосфорорганических инсектицидов в сельском хозяйстве не существует, мы попытались создать модель лечебно-профилактического антидота, при этом в качестве основных его компонентов использовать достаточно дешевые и доступные отечественные препараты (такие как атропин и карбоксим), что существенно снизит себестоимость данного антидота. Помимо прочего, компоненты антидота применялись в достаточно малых (неэффективных) дозах, поэтому полученный модельный ЛПА является не токсичным, а следовательно не вызывает повторного отравления самим противоядием.

Цели и задачи исследования. Основной целью исследования являлось обоснование возможности использования нового реактиватора холинэстеразы карбоксима для создания модельного антидота предназначенного для лечебно-профилактического использования в животноводческой практике, а также определить его влияние на кровеносную систему, в частности, на скорость кровотока и деформацию эритроцитов.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1 .Определить летальные дозы (ЛД50) атропина и карбоксима оценить их эффективность при отравлении мышей фосфаколом.

2.Выяснить подпороговую по эффективности дозу карбоксима и атропина при профилактическом введении которой мышам, она обеспечивает выживаемость 50% животных, получивших фосфакол в дозе 2ЛД99.

3.Оценить подобранные дозы в условиях профилактического и лечебного применения с целью сопоставления их преимуществ перед отдельными компонентами антидота.

4.Выяснить влияние фосфорорганических инсектицидов (фосфакол и карбофос) на скорость кровотока в сосудах аппекса крыс.

5.Определить причину деформации эритроцитов в опытах in vitro и in vivo при действии фосфорорганическими инсектицидами. б.Изучить влияние созданного модельного лечебно-профилактического антидота на скорость кровотока и деформацию эритроцитов.

Научная новизна работы. Впервые карбоксим применяется в качестве одного из компонентов профилактического антидота в составе комплекса с атропином в подпороговых дозах. Изучены и представлены дополнительные свойства карбоксима, кроме известного свойства, как реактиватора холинэстеразы.

Впервые атропин и карбоксим применяются в неэффективных (очень малых) дозах, что обеспечивает отсутствие токсического эффекта антидота, а, следовательно, гарантирует его безопасность.

Показано, что деформированные эритроциты образуют конгломераты, которые существенно нарушают микроциркуляцию крови и способствуют возникновению гемической гипоксии.

Практическое значение работы. Созданный модельный антидот может быть принят за основу создания лечебно-профилактического антидота для работников сельского хозяйства, принимающих участие в обработке животных от эктопаразитов при помощи фосфорорганических инсектицидов. Выявлены преимущественно новые свойства карбоксима, как обратимого ингибитора холинэстеразы аллостерического действия, которые могут быть использованы для создания других антидотов, в том числе антидотов против фосфорорганических отравляющих веществ.

Созданный модельный лечебно-профилактический антидот может быть использован в дальнейшем для более подробного изучения его влияния, не только на кровеносную, но и на другие системы организма.

Положения, выносимые на защиту:

2.Применение одного атропина и карбоксима в качестве самостоятельных средств защиты фактически оказалось не эффективным, тогда как совместное применение как лечебного, так и особенно профилактического комплекса атропина с карбоксимом обеспечивает выраженный профилактический и лечебный эффекты.

4. Установлено, что применение лечебно-профилактического антидота приводит к нормализации скорости кровотока до физиологической нормы 158±15об/мин., а также существенному снижению деформации эритроцитов при профилактическом применении антидота до 39,1±0,1 **(%); при лечебном применении до 39,3±0,5** (%).

Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на научных конференциях профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов (Санкт-Петербург, СПбГАВМ, 2006, 2007, 2008), на 59-й, 60-й, 61-й, 62-й научных конференциях молодых ученых и студентов (Санкт-Петербург, СПбГАВМ,, 2006, 2007, 2008).

Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 7-х печатных работах.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Панченкова, Ольга Александровна

Выводы:

1 .При анализе токсических эффектов ФОС наряду с нарушением синаптической передачи, установлена деформация эритроцитов, связанная с появлением в крови ацетилхолина, действующего на незащищенные холинэстеразой клетки. При отравлении карбофосом выявлена более интенсивная деформация эритроцитов (образование конгломератов), которая резко нарушает микроциркуляцию крови и вызывает гемическую гипоксию.

2.Применение одного атропина и карбоксима в качестве самостоятельных средств фактически оказалось не эффективным (при отравлении фосфаколом) по показателям И3=4,6; ИГЗ=1,3 карбоксима и И3=2,2; ИГЗ=0,6 атропина.

3.Установлено, что карбоксим в дозе 1/100 способен потенцировать защитный эффект атропина, что сходно с аналогичным эффектом оксазила.

4.Совместное применение как лечебного, так и особенно профилактического комплекса атропина с карбоксимом в субэффективных дозах обеспечивает выраженный профилактический (И3=28; ИГЗ=1,9) и лечебный (И3=24; ИГЗ=1,7) эффекты.

5.Компоненты модели лечебно-профилактического антидота: атропин(5мг/кг) и карбоксим (5мг/кг) использовались в неэффективных (достаточно малых дозах), в результате этого полученная модель лечебно-профилактического антидота не является токсичной, следовательно, не вызывает опасности появления побочных эффектов.

6.Установлено, что применение лечебно-профилактического антидота приводит к нормализации скорости кровотока до физиологической нормы 158±15об/мин., а также существенному снижению деформации эритроцитов при профилактическом применении антидота до 39,1±0,1**(%); при лечебном применении до 39,3±0,5** (%).

Практические предложения

Материалы диссертации рекомендуется использовать:

1.При дальнейшей разработке и усовершенствовании существующих лечебно-профилактических антидотов против фосфорорганических инсектицидов.

2.В ходе разработок новых современных лечебно-профилактических антидотов против фосфорорганических инсектицидов.

3.Для профилактики и лечения острых и хронических отравлений фосфорорганическими ингибиторами холинэстеразы в сельском хозяйстве и животноводстве.

4.Созданный модельный лечебно-профилактический антидот может быть использован в дальнейшем для изучения его влияния на кровеносную и другие системы организма.

Заключение

В настоящее время в России лечебно-профилактических антидотов (ЛПА) для сельского хозяйства не существует, а разработка сложных лечебно-профилактических антидотов приведет к резкому увеличению цены на него, было предложено испытать реально существующие препараты отечественной промышленности.

Распространенным антидотом является атропин, который до настоящего времени сохраняет свое значение, как в нашей стране, так и за рубежом. Однако атропин, являясь токсичным и малоэффективным, требовал существенного повышения эффективности за счет какой- либо добавки.

Последовательное испытание и определение защитного действия атропина в реальной для мышей дозе, привело к убеждению, что один атропин не гарантирует защиту животных от гибели при отравлении фосфаколом. Таким образом, применение атропина в качестве самостоятельного профилактического, тем более лечебного препарата не достаточно эффективно. Казалось бы, выход можно было найти в повышении дозы атропина, но за повышением дозы автоматически увеличивается его токсический эффект, следовательно, происходит отравление самим противоядием.

Среди извесных реактиваторов холинэстеразы карбоксим, на сегоднешний день, является одним из наиболее эффективных. Карбоксим был синтезирован в Институте токсикологии Минздрава России и сочетает в себе как свойства реактиваторов холинэстеразы, так и свойства неконкурентных обратимых ингибиторов холинэстеразы, то есть годен как для лечебного, так и для профилактического применения.

По результатам работы И.И.Кривого и В.Б. Прозоровского на нервно-мышечном препарате крысы, в условиях блокирования ХЭ фосфаколом был подтвержден выраженный лечебный реактивирующий эффект карбоксима и обнаружен его профилактический эффект, предположительно связанный с обратимым анти-ХЭ действием карбоксима. Исходя из сходства строения молекулы карбоксима с молекулой неконкурентного ингибитора оксазила -бисчетвертичного аммониевого производного(Кривой,1998; Кривой и др.,1987).

Превышение профилактического действия карбоксима над лечебным, позволяет предполагать, что в его защитном эффекте, наряду с реактивирующим, принимает участие также и способность предохранять ХЭ от ее необратимой связи с фосфаколом.

Последовательно было испытано и определено защитное действие карбоксима в рекомендованной для мышей дозе, что привело к убеждению о том, что карбоксим гарантирует защиту животных от отравляющего вещества (ИГЗ =1,3) при его профилактическом применении. Полученный индекс гарантированной защиты сам по себе является не достаточно высоким. Тогда как, очевидно, что при его лечебном применении ИГЗ будет гораздо ниже.

Таким образом, все вышесказанное привело к убеждению в недостаточности лечебно- профилактического применения препаратов (атропина и карбоксима) в отдельности. Все это послужило поводом для создания модели лечебно-профилактического антидота состоящего из комплекса препаратов.

В заключительной главе было представлено совместное применение атропина с карбоксимом как с профилактической, так и с лечебной целью.

Для этого был проведен ряд опытов, в которых травили мышей фосфаколом п/к в условиях предварительного ( последующего ) введения( за 15 минут и через одну минуту после отравления ) атропина в дозе 5 мг/кг в/бр и карбоксима 5 мг/кг в/бр. В результате проведенных опытов было выявлено, существенное возрастание индекса защиты (ИЗ) при совместном применении атропина с карбоксимом с профилактической

И3= 28) и с лечебной целями (И3= 25) по сравненшо с индексом защиты карбоксима (И3= 4,7) и атропина И3= 2,2 , применяемых в качестве

106 самостоятельных антидотов. Несмотря на увеличение показателя кривой индекс гарантированной защиты (ИГЗ) тоже существенно возрастает при совместном применении атропина с карбоксимом с профилактической (ИГЗ= 1,9) и с лечебной целями (ИГЗ= 1,7) по сравнению с индексом гарантированной защиты карбоксима (ИГЗ= 1,3) и атропина ИГЗ= 0,6, используемых в качестве самостоятельных антидотов.

Таким образом, задачи поставленные исследованием были решены и цель, которая была сформулирована как разработка модельного лечебно-профилактического антидота, предназначенного для рабочих сельского хозяйства, в целом достигнута.

Помимо всего вышеперечисленного был произведен ряд исследований по наблюдению за микроциркуляцией в сосудах аппекса наркотизированных крыс при внутримышечном введении фосфакола (параоксона) в разных дозах. В результате проделанных опытов было выявлено, что изменения кровотока при отравлении фосфаколом регистрировались в узком диапозоне доз: заметное снижение кровотока отмечалось лишь при введении фосфорорганических инсектицидов в дозе равной 0,8 ДД5о , резкому снижению — при дозе 0,9 ДД50. При дозе, равной 1 ЛД50 , кровоток снижается до маятникообразного движения и даже до стаза. Артериальное давление при этом быстро снижается и половина животных погибает.

Естественно возникла необходимость проверить отсутствие влияния фосфакола в летальной дозе при большем увеличении и одновременном определении активности ХЭ крови.

Существенные изменения поверхности эритроцитов отмечены через 15 минут после затравки. Обнаруживается формирование многочисленных выростов клеточной поверхности, в результате чего часть клеток приобретает форму эхиноцитов. Одновременно происходит достоверное увеличение размеров эритроцитов с утратой их типичной двояковогнутой формы. Значительное количество клеток имеют дефекты плазмолеммы.

107 сопровождающиеся их разрушением. Эти данные дают основание предполагать, что начальная и относительно кратковременная деформация эритроцитов связана не столько с подавлением активности ХЭ, сколько с появлением в крови «волны» выбрасываемого нервными окончаниями АХ, которая заканчивается к 4 часам за счет опустошения его запасов или аутоторможения его выделения за счет активации пресинаптических М-ХР.

Для проверки раздельных и совместных эффектов фосфакола на эритроциты были проведены эксперименты in vitro. В результате проделанной работы, было доказано, что даже значительное угнетение ХЭ без АХ вызывает лишь незначительную деформацию эритроцитов (видимо за счет фосфорилирования клеточных мембран). Один АХ вызывал эффекты лишь в очень больших концентрациях. Но самые существенные эффекты вызывает АХ, действующий на незащищенные ХЭ клетки. Причем их выраженность имеет четкую концентрационную зависимость.

Полученные данные свидетельствуют о реальной возможности нарушения рельефа и целостности эритроцитов при воздействии ФОИ за счет прогрессирующего разрушения цитоскелета, что является также и одной из причин развития гемической гипоксии. Возникновение изменений цитоскелета возникают значительно раньше сдвигов рН крови, что свидетельствует о независимости этих процессов.

Полученные результаты позволяют утверждать, что установленная деформация клеток крови под воздействием АХ в условиях устранения защитной роли ХЭ происходит в значительной мере за счет деформации и разрушения цитоскелета (Masuda et al.,1995).

Все проделанные серии опытов выполнены с использованием в качестве эталонного ФОИ препарата фосфакола (параоксона). Реальных отравлений этим веществом не происходит. Это обстоятельство послужило причиной проведения дополнительных экспериментов другими веществами. Поэтому в наших дальнейших опытах мы обратились к карбофосу.

Из всех сравниваемых препаратов карбофос менее других, в том числе и высокотоксичных, при сравнении в равных условиях применения, поддается терапии. Даже при увеличении доз антидотов их эффективность почти не возрастает. Для нас важно, что антидотная терапия при отравлении карбофосом фактически в 5 раз менее эффективна, чем при отравлении хлорофосом и даже ДФФ. То есть с учетом реального запаздывания помощи отравленным она фактически неэффективна. Очевидно, тому должна быть причина.

В результате проделанных опытов стало очевидно, что одной из причин малой эффективности лечебного применения антидотов при отравлении карбофосом служит более интенсивная деформация эритроцитов (образование конгломератов), которая может резко нарушить микроциркуляцию крови и вызвать гемическую гипоксию (McKenzie et al., 1996).

В свою очередь, при изучении влияния модельного ЛПА на кровеносную систему, наблюдалось существенное уменьшение деформации эритроцитов (при профилактическом применении до 39,1±0,1**в %; при лечебном применении до 39,3±0,5** в %), а также нормализация скорости кровотока до физиологической нормы 158±15об/мин.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Панченкова, Ольга Александровна, Санкт-Петербург

1. Авдонин П.В., Ткачук В.А. Рецепторы и внутриклеточный калыщй.-М. :Наука,1994.-С.285.

2. Агаджанян Н.А., Чижов А. Я. Гипоксические, гипоканнические и гиперкапнические состояния.- М.: Медицина, 2003.- С.96.

3. Анатомия крысы (Лабораторные животные) /Под ред. Академика А.Д. Ноздрачева. СПб., Изд-во «Лань»,2001.- С.120-121.

4. Антонов Н.С. Химическое оружие на рубеже двух столетий. М.: Прогресс, 1994.-С.77-79.

5. Ашибель С. И., Хиль Р.Г. Об отдаленных последствиях хронической интоксикации ртугьорганическими соединениями у работников, занятых в производстве граназана. // Гигиена и токсикология новых пестицидов и клиника отравлений.- М., 1962,С.430-439.

6. Бадюгин И.Г.- Токсикология синтетических ядов.- Казань ,1974.-С.67-99.

7. Бажин Е.Ф. Атропиновые комы.-Л.: Медицина, 1984.-С.35-38.

8. Балашова Е.К., Певзднер Д.Л., Розенгарт В.И. и др. Исследование особенностей распределения в тканях, заряженных фосфорорганических ингибиторов холинэстеразы и их незаряженных аналогов// Укр. Биохим. Журн.-1975.-Т.47,№6.-С.734-738.

9. Береклоу С. Регулирование эндотелием растяжимости артерий и хроническая сердечная недостаточность. //РМЖ.- 1996.-Т.З,№6.-С.124.

10. Бингам Ф.Г., Коста М.,Эйхенберг Э.и др. Некоторые вопросы токсичности ионов металлов.-М.:Медицина,1993.-С.368.

11. Бресткин А. П., Струков С.К., Кашина Е.Д. и др. Комбинированное торможение холинэстеразы из сыворотки крови лошади эфирами дефинилфосфиновой и дифенилтиофосфиновой кислот.// «Докл. АН СССР», М., 1911.- №1.- С.103.

12. Васильев А.В. Закономерности перехода радионуклидов и тяжелых металлов в системе почва-растение-животное-продукция животноводства// Химия в сельском хозяйстве. М., 1995.-№4.-С.245-247.

13. Васильев Ю.М. Клетка как архитектурное чудо.// Натяжения цитоскелета контролируют архитектуру клетки и тканей./ Саратовский Образовательный Журнал. Саратов,2000.-№8.-С. 18-23.

14. Беликова В.Д. Сравнительная оценка аминостигмина как средства лечения острых отравлений препаратами холинолитического действия // Автореф. дис.канд.мед.наук.- СПб,1994.-С.44-56.

15. Военная токсикология, радиология и медицинская защита. / Под ред. Н.В. Саватеева. — Л., 1987.-С.63-70.

16. Военная токсикология, радиология и медицинская защита./ Под ред. С.А. Куценко. — СПб., Фолиант, 2004.-С.135.

17. Глухан Е.Н., Сметанин А.В., Казаков П.В.и др. Вероятная оценка риска как показатель экологической безопасности на примере объекта по уничтожению химического оружия.// Рос.хим.ж. (Ж. Рос.хим.об-ва им.Д.И.Менделеева) -2007.-Т.51 ,№2.-С.52-54.

18. Годухин О.В. Модуляция синаптической передачи в мозге. — М.: Наука, 1987.-С.141-155.

19. Голиков С.Н. Общие механизмы токсического действия.- Л.: Медицина, 1986.-С.64-72.

20. Голиков С.Н. Профилактика и терапия отравлений фосфорорганическими инсектицидами. —М.: Медицина, 1968.-С.165.

21. Голиков С.Н., Заутольников С.Д. Реактиваторы холинэстераз.- М.: Медицина,1970.-С.341-366.

22. Голиков С.Н., Кузнецов С.Г., Зацепин Э.П. Стереоспецифичность действия лекарственных веществ.- Л.: медицина,1973.-184 с.

23. Голиков С.Н., Розенгарт В.И. Холинэстеразы и антихолинэстеразные вещества. — Л.: Медицина, 1964.-С.66-89.

24. Гольцов А.Н., Каданцев В.Н. Исследование влияния липидного состава клеточных мембран на доменную структуру биослоя и латеральный транспорт//Физиология человека.-1995.- Т.21, №6.-С.113-125.

25. Гурьева JI.M., Дубровская Л.В., Мусийчук Ю.И. и др. Гигиена применения, токсикология пестицидов и клиника отравлений.// Медицина труда и пром. экология.-1997.-№6.-С.7-8.

26. Гуськова Т.А. Токсикология лекарственных средств.- М.: Русский врач,2003 .-С. 154.

27. Данилов А.Ф., Иванов Ю.А. Механизм блокады и восстановления нервно-мышечной проводимости при действии армина в опытах на кошках // Фармакол.и токсикол.-1972.-№5.-С.571.

28. Ершов Ю.А., Плетнева Т.В. Механизмы токсического действия неорганических соединений.- М.: Медицина,1989.-С.272.

29. Закрытый эксперимент (Париж) // Зарубежная военная медицина —1997-№1.- С.32-33.

30. Зинчук В.В. Деформируемость эритроцитов: физиологические аспекты.-Гродно,2001.-С.56-71.

31. Зинчук В.В., Борисюк М. В., Корнейчик В. Н., Бушма Т. В. Анализ изменений основных параметров перекисного окисления липидов и кислородтранспортной функции крови при пирогеналовой лихорадке // Физиол. журнал.- 1995. -Т.41, №3-4.-С. 103-108.

32. Зинчук В.В., Борисюк М.В. Роль кислородсвязывающих свойств крови в поддержании прооксидантно-антиоксидантного равновесия организма//Успехи физиол. Наук.-1999.-Т.30,№3.-С.38-48.

33. Каган Ю.С. Общая токсикология пестицидов. — Киев.: Здоровья, 1981.-С.75.

34. Каган Ю.С.- Токсикология фосфорорганических пестицидов.— Москва.: Медицина, 1977.-С.66-83.

35. Караете В.М. Кривые индивидуальной чувствительности в фармакологическом анализе. // Успехи совр. биологии. — 1944.-Т.17 , №1 . С.71-86.

36. Кассирский И. А., Алексеев Г.А. Клиническая гематология.- М.: Медицина,1970. -С.799.

37. Катц Б. Нерв, мышца и синапс.- М.:Мир,1968.-220 с.

38. Катюхин JI.H. Реологические свойства эритроцитов. Современные методы исследования // Росс.физиол. ж. им.И.М. Сеченова.—1995.— Т.81, №6-С. 122-129.

39. Кибяков А.В. Химическая передача нервного возбуждения.- JL: Наука, 1964.-208 с.

40. Козаков В.П., Куценко С.А., Маркин Б.А. и др. Проблемы создания средств оказания первой помощи на объектах уничтожения химического оружия // Рос.хим. журн. им. Д.И.Менделеева. — 1993. — Т.З, № 3. — С. 99—101.

41. Козлов М.М., Маркин В.С.Мембранный скелет эритроцита. Теоретическая модель // Биол. мембраны.— 1986. —Т.З, № 4. —С.404—422.

42. Конев С.В. Структурная лабильность биологических мембран и регуляторные процессы. — М.: Наука и техника, 1987. — 240 с.

43. Коржу ев П. А. Проблема оксигенации гемоглабина // Успехи физиол. наук — 1973 — Т.4, № 3. — С.69—112.

44. Кривой И.И. Холинергическая модуляция нервно-мышечной передачи //Автореф.дис.д.биол.н.-СПбД998.-С.32.

45. Кривой И.И., Драбкина Т.М., Кулева Н.В. От разнообразия молекулярных форм к функциональной специализации олигомерных белков.- СПб.: Ника,2003.- 56 с.

46. Кривой И.И., Кулешов В.И., Матюшкин Д.П. Нервно-мышечный синапс и антихолинэстеразные вещества. — JL: ЛГУ, 1987. — С.240.

47. Крылов С.С., Ливанов Г.А. Клиническая токсикология лекарственных средств. Холинотропные препараты.- СПб.:Лань,1999.- 160 с.

48. Куприянов В.В. Микроциркуляторное русло. — М.: Медицина, 1975. 99 с.

49. Левтов В.А., Регирер С.А., Шадрина Н.Х. Реология крови. — М.: Медицина, 1982. — 272 с.

50. Ливанов Г.А., Калиансон М.Л., Прозоровский В.Б. Острые отравления фосфорорганическими соединениями.- Cn6.:Hideo СПб ШЛО, 1997.-С.19.

51. Литвинов Я.Я., Остапенко Ю.Я., Казачко В.И. и др. Анализ зарубежных и отечественных статистических данных по острым химическим отравлениям. // Токсикологический вестник. — 1997 — №5, — С. 5—12.

52. Лос К. Синтетические яды.- М.: Медицина, 1963. 56 с.

53. Лужников Е.А. Клиническая токсикология.- М.: Медицина, 1994,- 3254 с.

54. Лукьянова Л.Д. Молекулярные механизмы гипоксии и современные подходы фармакологической коррекции гипоксический нарушений // Мат.

55. Всерос. науч. конф. «Фармокотерапия гипоксии и ее последствий при критических состояниях» . — СПб., — С. 36—39.

56. Лукьянова Л.Д. Современные проблемы гипоксии // Вестник РАМН.-2000.- № 9. — С.З—12.

57. Людевик Р., Лос К.- Острые отравления М.: Медицина, -1983.- 560 с.

58. Маркова И.В., Абезгауза А. М. Отравления в детском возрасте.— Л.: Медецина, 1971.- С.132.

59. Махмудов К.А., Гутникова А.Р., Абеляева Н.Х., и др. Сравнительная оценка разных методов при пестицидной интоксикации организма // Токсикол. Вестник.-2004.-№2.-С.9-12.

60. Машковский М. Д. Лекарственные средства М.: Новая волна, 2002. -206-208 с.

61. Медведь Л.И. Проблемы гигиены в связи с применением пестицидов в с/х.//Влияние ядохимикатов на внешнюю среду.- Кишинев, 1972. 5-6 с.

62. Мельников Н.Н., Новожилов К.В., Белан С. Р. — Справочник по пестицидам. М.: Химия, 1985.- с.352.

63. Михельсон М.Я., Зеймаль Э.В. Ацетилхолин. — Л.: Наука, 1970. 53-87с.

64. Наточин Ю.В., Немцов В.И. Эмануэль В.Л. Биохимия крови и диагностика. — СПб.: Лань, 1993.- 90 с.

65. Осадчий П.В., Сигал В.Л. Изменение деформируемости эритроцитов в процессе хранения донорской крови // Гематол. трансфузиол. — 1987. — №3. —С. 31—34.

66. Петров А. Н., Софронов Г.А., Нечипоренко С. П. и др.- Антидоты ФОВ. Рос. Хим. Ж.(Ж. Рос. Хим. Об-во им. Д.И. Менделеева). -2004.-T.XLVIH,№2.-C. 110-115.

67. Плохинский Н. А. —Биометрия.- Новосибирск.: АНСССРД961 .-364с. с.

68. Прозоровский В. Б. Лечебные и профилактические антидоты ФОВ.//

69. Актуальные вопросы профилактики и терапии интоксикаций. /Сб. научно117практ. Мед центра. «Нейрон» и НИИИЦ (МБЗ) ГОСНИИИ военной мед.-Спб.: Астрон.- 2005.-С.9-16.

70. Прозоровский В.Б. Вопросы механизма действия и возрастной токсикологии антихолинэстеразных средств.// Автореф. дисс. докт.мед. н. -Л., 1969.-С.32.

71. Прозоровский В.Б. Табличный экспресс-метод определения средних эффективных мер воздействия на биологические объекты.// Токсикол. Вестник,- 1998- №1. С. 21-32.

72. Прозоровский В.Б. Практическое пособие по ускоренному определению средних эффективных доз и концентраций биологически активных веществ.- Байкальск,1994.-С.46.

73. Прозоровский В.Б., Владеева Н.В., Хромова О.Н.и др. Изучение антимиорелаксантного эффекта холинопотенциирующих средств. //БЭБМ.-1970.-№6.- С.51.

74. Прозоровский В.Б., Гладышева Н.И. Влияние изменения температуры на реактивность мышц к ацетилхолину //Физиол. Журн. СССР.-1973.-№1.-С.82.

75. Прозоровский В.Б., Ливанов Г.А. Некоторые теоретические и клинические проблемы токсикологии фосфорорганических инсектицидов // Токсикол. Вестн. — 1997. — № 3. -С. 2—11.

76. Прозоровский В.Б., Ливанов Г.А., Калмансон М.Л. Острые отравления фосфорорганическими соединениями. — СПб.: СПбМАПО, 1997. — 22с.

77. Прозоровский В.Б., Саватеев Н.В. — Неантихолинэстеразные механизмы действия антихолинэстеразных средств.- JL: Медицина, 1976.23-70 с.

78. Прозоровский В.Б., Скопичев В.Г. Дистантное действие в патогенезе отравлений фосфорорганическими соединениями. // Обзоры по клин.фармакол.и лекарств.терапии.- 2004.-T.3,№3.-C.56-67.

79. Прозоровский В.Б., Скопичев В.Г., Ардабьева Т.В. и др. Структурные изменения эритроцитов как возможная причина низкой эффективности специфической терапии отравлений карбофосом. // Морфология. — 1997. — Т. 116, № 6. С. 60—64.

80. Прозоровский В.Б., Скопичев В.Г. Морфологические изменения эритроцитов мышей и крыс при воздействии фосфорорганических ингибиторов холинэстераз // Бюл. эксперим. биол. и мед. — 1993. — Т.115, № 45. — С.443—445.

81. Прозоровский В.Б., Скопичев В.Г., Петров В.В. и др. Структурные изменения эритроцитов крыс при отравлении фосфаколом // Бюл. эксперим. биол. и мед. — 1995. — Т. 119, № 5. — С. 517—520.

82. Прозоровский В.Б., Тонкопий В.Д., Суслова И.М. и др. Взаимодействие обратимых ингибиторов с каталитическими и аллостерическими участками холинэстераз.// Бюлл. Экстрим. Биол. и мед. — 1976.- Т. 82, №8.- С. 947-949.

83. Прозоровский В.Б., Хромова О.Н., Гладышева Н.И. Реактивность изолированного кишечника крысы к холинопотенцирующим средствам. //Фармакол. и токсикол.-1971 .-№ 1 .-С.54.

84. Прозоровский В.Б., Чепур С.В. Новое в эффектах фосфоророрганических ингибиторов холинэстеразы // Токсик. Вестн. — 2001.—№4. —С. 2—7.

85. Ракова А.П., Сосюкина А.Е. Военно-полевая терапия.- СПб, 2003. 368 с.

86. Резван С.Г., Стародубцева Н.А., Жданова О.А. и др. Структурные нарушения мембран эритроцитов крови больных различными формами нефропатий // Сб. тр. П Рос. конф. «Физика в биол. и мед.» Воронеж: ВГУ, 2001.-С.543.

87. Риган В.Дж. Атлас ветеринарной гематологии.- М.: Аквариум,2000.-136 с.

88. Садыков А.С., Розенгард Е.В., Абдувахабов А.А. Холинэстеразы. Активный центр и механизм действия.- Ташкент.: ФАН, 1976.-205 с.

89. Салтыков Б.Б., Пауков B.C. Диабетическая микроантиопатия. — М.: Медицина, 2002 . —240 с.

90. Селезнев С.А., Назаренко Г.И., Зайцев В.С.Клинические аспекты микрогемоциркуляции. — Л.: Медицина, 1985. — 208с.

91. Сергеев П.В., Шимановский Н.Л., Петров В.И. Рецепторы физиологически активных веществ. -М.:Волгоград,1999.- 43-89 с.

92. Серов В.В. Общепатологические подходы к познанию болезни. М.: Колос, 1994.-45с.

93. Скок В.И. Физиология вегетативных ганглиев.- Л.: Лань, 1970.- 151с.

94. Скопичев В.Г., Прозоровский В.Б. Участие дистантного холинергического механизма в реакциях сосудистого русла на интоксикацию фосфорорганическими ингибиторами холинэстераз // Морфология.- 2000.- Т.115,№ 4.-С.321.

95. Скопичев В.Г., Минаев В.Н., Лалаева Т.М. Поверхностная архитектоника эритроцитов и их цитоскелет в условиях модуляции адренореактивной системы при бронхиальной астме // Межд.конгр.Ыега81ша-98, СПб.- 1998. — С. 1—2.

96. Сторожок С.А., Санников А.Г., Захаров Ю.М. Молекулярная структура мембран эритроцитов и их механические свойства. — Тюмень.: ТГУ, 1997. — 140 с.

97. Сторожок С.А., Санников А.Г., Белкин А.В. Зависимостьстабильности деформабельности мембран эритроцитов от120межмолекулярных взаимодействий белков цитоскелета // Науч. Вестник ТГУ.-2000.- T.3.-C.34-76.

98. Струков М.А. Кислородтранспортные системы при различных методах реанимации больных с тяжелым экзотоксическим шоком// Токе. Вестник.- 1999.-№2.- С.11-16.

99. Тараканов И.А., Курамбаев Я.К., Хусинов А.А. и др. Нарушения дыхания и кровообращения при экспериментальном отравлении пестицидом из группы фосфорорганических соединений // БЭБМ.-1994.-№5.-С.471-475.

100. Тихоненко В.М. Влияние прозерина и физостигмина на гипотензивный эффект ганглиолитиков // Фармакол. и токсикол. Респ. межведомств, сб.- Киев,1972.-№.7.-С.9.

101. Тухватулин Р.Т. Адаптивные изменения обратимой агрегации эритроцитов //Автореф. Дисс. д.б.н.-Томск, 1996 -С.29.

102. Уилсон Д. Т. Молекулярная биология клетки М.: Мир.-1994.- 318-319с.

103. Указания по военной токсикологии МО РФ./ Под. ред. Чижа И.М.

104. М.: ГВКГ им. Н.Н. Бурденко, 2000.- 57с.

105. Филлипов В.Л., Шумакова К.М., Цимбал Ф.А.// Медицина труда и пром. экология.-1997.-№6.-С.11-16.

106. Черницкий Е.А., Воробей А.В. Структура и функция эритроцитарных мембран.- М.: Наука и техника, 1981 .-216 с.

107. Чернух А. М. Микроциркуляция. — М.: Медицина, 1984.- С.350.

108. Шахламов В. А. Капилляры. М.: Колос, 1971. 234 с.

109. Шинкаренко B.C. Количественный анализ нарушений микроциркуляции при разных видах патологии и пути их коррекции // Автореф. дис. докт. мед. наук.- М.Д992.-С.576.

110. Шиффман Ф.Дж. Патофизиология крови.- М.:БИНОМ,2000.- 448 с.

111. Шицкова А.П., Рязанова Р.А.— Гигиена и токсикология пестицидов — М.: Медицина, 1975.-20-23 с.

112. Шошенко К.А. Кровеносные капилляры.- Новосибирск, 1975.- 38-45с.

113. Ярыгин Н.Е., Николаева Т.Н., Кораблев А. В. Капилляротрофическая недостаточность системы микрогемоциркуляции как одно из проявлений общей патологии.//Арх. Пат. — 1996.-№1. С. 41-46.

114. Anderson J.W. Physiological and metabolic effects of dietary fiber //Fed. Proc.,-1985-V.44,№14.-P.2902-2906.

115. Ardill В., Fentem P., Finley R. et al. Some effects on the blood vessels of the human forearm of local exposure to pressure below sub atmospherica//.J. Physiol.-1969.-V.80.-P.31.

116. Ariens E. J. Kureinfiihrung in die pharmakologische. Terminologie und Wirkungsmechanismen autonomer. Pharmaka.// «Int.J. Clin. Pharmacol. Ther. A. Toxical». 1972. - V6, Suppl. 4.- P 3.

117. Asaba H. Accumulation and exertion of middle molecules //Clin. Nephrol.-1983 .-V. 19, №3.-P. 116-123.

118. Asp N. G. Definition and analysis of dietary fider //J. Cin. Invest. -1987.-№129.-P. 16-20.

119. Barnard E. A, Wicekowski J., Chiu Т. H. Cholinergic receptor molecules and cholinesterase molecules at mause skeletal muscle junctions.-//«Nature».-1971.-V.234.-P.207.

120. Benz E. J. The erythrocyte membrane and cytoskeleton: structure, function and disorders.- Philadelphia: W.B. Saunders.- 1994. — P. 257—292.

121. Bunn H.F. Sickle hemoglobin and other hemoglobin mutants. The molecular basis of blood diseases.-Philadelphia: W.B.Saunders.-1994. P. — 207—256.

122. Ciliv G, Orand P. Human erythrocyte acetylcholinesterase purification, properties and kinetic behavior.//«Biochim. Biophys. Asta».-1972.-V.284. -P.136

123. Changeux J. P, Kasai M, Lee C.Y.-Use of Suane Nenom Toxin to characterize the cholinergic receptor protein //« Proc. Nat. Acad. Sci. USA».-1970.- V.67.- P.1241.

124. Chimical find biological defence program // Annal report to congrese merch 2005 .Department of defence (USA). 2005 .-P. - 62.

125. Colman W.R. et al. Hemostasis and Thrombosis.-Philadelphia: J.B.Lippincott. 1994 — P. 3—18.

126. Duncan J.R., Prasse R.W., Mahaffey E.A. Veterinary laboratory medicine: Clinical Pathology. // Ames: Iowa State University Press.-1994. — P.230—245.

127. Dunn M A Sidell F R Progres in medical difence against nerve agents.// N J Am Med.Assjc.—1989 —Vol.262. №5—P. 649-652.

128. Eyer P In 4th Chemikal Medikal Defenece Conference by the German Ministri Defence Munich. 1998.-P.51.

129. Furchgott R.F., Zawadski A. The obligatory role of endothelial cells in relaxation of arterial muscle dy cetylcholine // Nature. — 1980. — Vol. 288, № 5780. — P. 373—376.

130. Karlin A. The acetylcholine receptor in the electoplax. //«Abstrs.5th Int. Congr. Pharmacol.- S-Francisco. Bethesda.-1972.- P .3.

131. Kato G. NMR Studies ou drug-receptor interactions// «Intern. Z. Klin. Pharmakol. Ther. U. Toxicol».-!971.-Bd.5. P. 12.

132. Kieler J .R., Hurst Ch .G., Dunn M. A. Pyrridostigmine Used as a nerve agent pretritment under wartime conditions // JAMA —1991—Vol.266.№5.P. 693-695.

133. Lullmann H, Ohnesorge F, Tonner H et al. Influence of alkan — bisonium compounds upon the activity of the ACHE and upon its ingibition by DFP.// Biochim Pharmakol 1971 —Vol.20, №10.-P. 2579-2586.

134. Masuda N., Takatsu M., Monad H., Ozawa T. Sarin poisoning in Tokyo subway // Lanset. — 1995. — № 8962. — P. 1446—1447.

135. McKenzie J.E., Scandling D.M., Ahle N.A. et al. Effects ofsoman on coronary blood and cordial functijn in swine // Fundam. Appl. Toxicol. — 1996. — Vol. 29, № 1. — P. 140—146.

136. Miller R.A., Britigan B.E. The formation and biologic significance of phagocytederived oxidants. //J.Invest.Med.-1995.- P.39-49.

137. Ney P.A., Christopher M.M., Nebbel R.P. Blood. 1990, №75. - 1192 p.

138. Paglia D.E. Enzymopathies, Hoffman R.H. et al. Hematology: Basic Principles and Practice / Ed. New York: Churchill Livingstone.-1995.-P.656-667.

139. Palevsky H.I. Pulmonary hypertension and right heart failure. /Ed. Philadelphia: W.B.Saunders.-1993.-P.838-849.

140. Platoff G. E., Baskin S. I., Madsen J. M. In Occupational Industrial and Environmental Toxikologi Sec / Ed. M. I. Greenberg Philadelphia, 2003 .-P. 258-273.

141. Reagan W.J., Sanders T.G., DeNicola D.B. Veterinary Hematology. / Atlas of Common Domestic Spesies. — Iowa State University Press: Ames, 2000. —P.135.

142. Riker W., Oramoto M. Pharmacology of motor nerve terminals //Ann. Rev. Pharmacol., 1969.-V.9.-P.173.

143. Roufogalis В D, Quist E. F. Relative binding sites of pharmacologically active ligands on bovine erythrocyte acetylcholinesterase // « Mol.Pharmacol».-1972.-V8.- P.41.

144. Walker R.I., Porvaznik M.Association of bacteria and endotoxin with post trauma events. —Baltimore: Univ. Park Press, 1983.—P.l-15.

145. West J.B. Ventilation/ Blood Flow and Gas Exchange. Philadelphia: J.B. Lippincott, Oxford Blackwell Scientific Publications, 1990. — 37—67 p.

146. West J.B. Gas transport to the periphery. — Baltimore: Willisms and Wilkins, 1990. — 69—85 p.

147. Wombacher H, Wolf H. U. Regulation of membrane bound acetilcholinesterase activity by bisqueternary nitrogen compounds// «Mol. Pharm». - 1971. - V.7.-P. 554.

Информация о работе

Панченкова, Ольга Александровна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2009
ВАК 03.00.13

Диссертация

Защитное действие нового антидота на основе карбоксима при отравлении фосфорорганическими соединениями - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы