Иммобилизованные биокатализаторы на основе полигистидинсодержащих производных органофосфатгидролазы: получение и свойства

Лягин, Илья Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Иммобилизованные биокатализаторы на основе полигистидинсодержащих производных органофосфатгидролазы: получение и свойства
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Иммобилизованные биокатализаторы на основе полигистидинсодержащих производных органофосфатгидролазы: получение и свойства"

□□3484797

На правах рукописи

ЛЯГИН ИЛЬЯ ВЛАДИМИРОВИЧ

ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ БИОКАТАЛИЗАТОРЫ НА ОСНОВЕ

ПОЛИГИСТИДИНСОДЕРЖАЩИХ ПРОИЗВОДНЫХ ОРГАНОФОСФАТГИДРОЛАЗЫ: ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСТВА

03.00.02 - биофизика 03.00.23 - биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

2 С КОП

Москва - 2009

003484797

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН

Научные руководители:

Варфоломеев Сергей Дмитриевич

доктор химических наук, профессор член-корреспондент РАН

Ефременко Елена Николаевна

кандидат технических наук

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Шишкина Людмила Николаевна доктор химических наук, профессор Зубов Виталий Павлович

Защита состоится « 9 » декабря 2009 года в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.039.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Косыгина, д.4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Институте химической физики им. H.H. Семёнова РАН.

Автореферат разослан « i » ноября 2009 года.

Учёный секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук М.А. Смотряева

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт физиологически активных веществ РАН

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Деградация токсичных веществ, привносимых человеком в окружающую среду, формирует комплекс научных, технических, экологических, социальных и экономических проблем. Решение задачи разложения нейротоксичных фосфорорганических соединений (ФОС), к числу которых относятся применяемые в сельском хозяйстве пестициды, а также фосфорорганические отравляющие вещества (ФОВ), имеет большое значение и весьма актуально, поскольку сотни тысяч тонн этих веществ подлежат детоксификации.

В настоящее время разложение ФОС осуществляется путём их сжигания при 700°С или обработкой щелочными агентами, что является неэкологичным решением проблемы. Запасы ФОВ, которые, согласно Международной конвенции об уничтожении химического оружия, должны быть уничтожены на территории России, составляют 32,3 тыс. т, половина из которых представлена наиболее токсичным веществом типа Ух (15,5 тыс. т). Согласно принятым в РФ методам уничтожения ФОВ, остаточные концентрации ФОВ в получаемых реакционных массах (РМ) достигают 0,1 мас.%, кроме того, продукты разложения ФОВ также являются токсичными для человека. Дальнейшая детоксификация образующихся РМ является крайне важной задачей, поскольку конечный продукт разложения должен соответствовать нормативам токсикологической и экологической безопасности, а это означает, что разложение фосфонатов, как наиболее токсичных компонентов РМ, должно быть максимальным.

Детоксификация различных ФОС с помощью биокаталитических систем имеет ряд преимуществ, а именно: она проходит в мягких условиях, и продукты гидролиза, как правило, являются биологически деградируемыми. В связи с этим особый интерес представляют ферменты, гидролизующие ФОС. Было установлено, что на сегодняшний день наиболее активным ферментом, осуществляющим биодеструкцию ФОС, является органофосфатгидролаза (ОРН, ЕС 3.1.8.1), катализирующая гидролиз Р-О, Р-Б и Р-Б связей в производных ортофосфорной и фосфоновой кислот.

Актуальной научно-практической задачей представляется разработка иммобилизованных ферментных препаратов с ОРН-активностью для детоксификации ФОС в проточных системах на муниципальных и сельскохозяйственных очистных сооружениях. Использование металл-хелатирующих носителей не столько для выделения и очистки, сколько для иммобилизации ферментов, содержащих дополнительно введённую аминокислотную последовательность, вступающую в аффинное взаимодействие с носителем, может стать перспективным способом для получения иммобилизованных препаратов ОРН. Прочное координационное связывание фермента с носителем делает такую систему удобной для использования её в проточных режимах в процессах разложения ФОС, что в технологическом плане, несомненно, имеет важное значение.

Известно, что ферментативный гидролиз ФОВ может осуществляться в составе РМ. Однако до сих пор остаётся неизученной возможность гидролиза

фосфорсодержащих продуктов разложения ФОВ в составе РМ под действием ОРН, используемой в свободной или иммобилизованной форме.

Целью данной работы была разработка биокатализаторов для разложения фосфорорганических пестицидов, ФОВ и продуктов химической нейтрализации ФОВ, на основе ОРН, модифицированной полигистидиновыми (polyHis-) последовательностями и иммобилизованной на макропористых металл-хелатирующих носителях, представляющих собой полиакриламидный криогель (криоПААГ), модифицированный остатками иминодиуксусной кислоты (IDA) и заряженный ионами металлов (Си2+ или Со2+).

Для достижения основной цели в работе необходимо было решить ряд основных задач:

- определить влияние длины polyHis-последовательности, введённой на N-конец молекулы ОРН, на свойства белка в свободном и иммобилизованном виде на примере ОРН, модифицированной последовательностями, содержащими шесть (His6-OPH) и двенадцать (His12-OPH) остатков гистидина;

разработать и исследовать физико-химические и каталитические характеристики биокатализаторов на основе иммобилизованных полигистидинсодержащих производных ОРН для детоксификации ФОС в проточных системах;

- исследовать возможность гидролиза метилфосфоновой кислоты (МФК) и её эфиров, являющихся продуктами химического разложения ФОВ, взятых в чистом виде, а также в составе РМ, полученных в результате химического уничтожения отравляющего вещества типа Vx, под действием His6-OPH в свободном и иммобилизованном состоянии.

Научная новизна работы. Впервые показано влияние длины polyHis-последовательности, вводимой на N-конец молекулы ОРН, на каталитические и физико-химические характеристики белка; выявлена склонность к олигомеризации фермента, содержащего Шз^-последовательность.

Показана возможность высокоэффективной иммобилизации ОРН, содержащей генетически введённую polyHis-последовательность различной длины на N-конец молекулы белка, на металл-хелатирующих носителях за счёт координационных взаимодействий, и исследованы их каталитические характеристики в проточной системе.

Впервые установлена гидролитическая активность His6-OPH в отношении моно- и диэфира МФК, а также самой МФК, и определены каталитические константы действия фермента в реакциях с этими субстратами. Предложен механизм действия His6-OPH в реакции разрыва С-Р связи в МФК.

Предложена кинетическая модель, адекватно описывающая поведение His6-ОРН в процессах детоксификации фосфонатов в РМ, получаемых после уничтожения ФОВ химическими методами и представляющих собой многосубстратные смеси.

Новизна и практическая значимость полученных результатов подтверждена 3 Патентами РФ и 1 Заявкой на Патент РФ.

Практическая значимость работы. Разработаны высокоэффективные иммобилизованные биокатализаторы на основе polyHis-производных ОРН и IDA-

криоПААГ, позволяющие гидролизовать различные фосфорорганические субстраты в широком диапазоне рН (7-12) и температуры (20-55°С) при скорости протока до 480 мл/ч.

Показано, что иммобилизованные биокатализаторы могут длительно храниться (как минимум 900 сут.) и применяться (как минимум 500 сут.), многократно регенерироваться, а также возможно масштабирование объёмов получаемых образцов иммобилизованных биокатализаторов.

Установлена высокая эффективность разложения производных МФК в составе РМ, получаемых в результате химического уничтожения вещества типа Vx, под действием фермента His6-OPH в свободной и иммобилизованной форме.

Разработанные иммобилизованные биокатализаторы могут найти практическое применение: а) в системах очистки питьевой и речной воды, а также сельскохозяйственных сточных вод от фосфорорганических пестицидов; б) в биотехнологических схемах по уничтожению запрещённых к использованию или устаревших фосфорорганических пестицидов; в) в процессах биоразложения токсичных фосфорорганических компонентов РМ, полученных после химического уничтожения вещества типа Vx.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Увеличение длины polyHis-последовательности в молекуле ОРН приводит к появлению у белка склонности к олигомеризации, что существенно влияет на каталитические характеристики растворимой формы фермента.

2. Иммобилизованные биокатализаторы на основе polyHis-производных ОРН, полученные за счёт их координационного связывания с металл-хелатирующим носителем ША-криоПААГ, заряженным ионами Си2+ или Со2+, могут быть использованы для гидролиза ФОС в проточных системах.

3. Фермент His6-OPH в растворимой и иммобилизованной форме проявляет каталитическую активность в отношении МФК, а также её моно- и диэфиров.

Связь работы с крупными научными программами и проектами. Представленные результаты были получены в 2005-2009 гг. в рамках следующих программ и проектов, участником которых был соискатель: Госконтракты с Федеральным управлением по безопасному хранению и уничтожению химического оружия МО РФ «Исследование возможности использования метода биодеградации для переработки реакционных масс, образующихся при уничтожении отравляющих веществ», шифр «Богема» (2004-2006); «Оптимизация технологических параметров процесса переработки реакционных масс, образующихся при уничтожении фосфорорганических отравляющих веществ, методом биодеградации», шифр «Биозащита» (2007-2008); Госконтракт с Федеральным агентством по науке и инновациям «Ферменты и биокаталитические системы для ремедиации окружающей среды» (2005-2006); НАТО грант CBP.NRCLG.981752 «Химерные белки для разложения фосфорорганических нейротоксинов» (2005-2007); грант РФФИ 08-04-12050-офи «Новый тип высокоэффективных биокатализаторов для обнаружения и обезвреживания фосфорорганических токсикантов» (2008-2009).

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на: Между нар. конф. «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, Россия, 2005); VI Междунар. конф.

«Проблемы загрязнения окружающей среды» (Пермь-Казань-Пермь, Россия, 2005); 5-й, 7-й и 8-й Ежегод. междунар. конф. ИБХФ РАН - ВУЗы (Москва, Россия, 2005, 2007, 2008); Inter. Conf. «Environmental Biocatalysis: From remediation with enzymes to novel green processes» (Córdoba, Spain, 2006); Междунар. конф. «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва-Пущино, Россия, 2006); 10-й, 12-й Междунар. Пущин, конф. молод, учен. «Биология. Наука XXI века» (Пущино, Россия, 2006, 2008); Inter. Workshop «New technologies in medicine and experimental biology» (Pattaya-Bangkok, Thailand, 2007); 4-м Москов. междунар. конгр. «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, Россия, 2007); Междунар. конф. «Биокатализ - 2007: структура, функции, применение» (Москва-Санкт-Петербург, Россия, 2007); XV Inter, workshop on Bioencapsulation (Vienna, Austria, 2007); XVIII Менделеев, съезде по общ. и прикл. хим. (Москва, Россия,

2007); 1-й, 2-й и 3-й Междунар. науч. конф. «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, Россия, 2007, 2008, 2009); III Междунар. конф. «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал» (Пермь-Н.Новгород-Пермь, Россия, 2008); 4-й Науч.-практ. конф. «Научно-технические аспекты обеспечения безопасности при уничтожении, хранении и транспортировке химического оружия» (Москва, Россия,

2008); 6-й Междунар. конф. «Сотрудничество для решения проблемы отходов» (Харьков, Украина, 2009); Inter. Conf. «Biocatalysis-2009: Fundamentals & Applications» (Arkhangelsk, Russia, 2009); XVII Inter, workshop on Bioencapsulation (Groningen, Netherlands, 2009).

Личный вклад автора. Автору принадлежит планирование экспериментов, непосредственное участие в них, анализ и обобщение полученных результатов, а также подготовка научных публикаций.

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 7 статей, в том числе 2 обзора и 5 экспериментальных статей, из них 4 включены в список ВАК; 3 Патента РФ; 1 заявка на получение Патента РФ и 24 тезиса докладов на международных конференциях, конгрессах и симпозиумах.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 152 страницы печатного текста, 77 рисунков, 26 таблиц, 155 ссылок.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Экспериментальная часть

Объекты исследования. В работе использовались следующие штаммы бактерий Е. coli: DH5a, SG13009[pREP4] и W3110, как продуценты генетически модифицированных производных ОРН.

Методы исследования. Носители ША-криоПААГ были предоставлены сотрудниками компании «Протиста» (Швеция), а также лабораторией ИНЭОС им.А.Н.Несмеянова РАН (проф. В.И. Лозинский). Их синтез проводился свободнорадикальной сополимеризацией Д'./У-диметилакриламида, Л^'-метилен-бис-акриламида и аллилглицидилового эфира при пониженных температурах, которые затем модифицировали IDA-лигандами.

Перед иммобилизацией проводилась ультразвуковая дезинтеграция клеток-продуцентов ферментов. Далее при необходимости клеточный дебрис осаждался центрифугированием. Ферментные растворы пропускались через носитель, который далее отмывался от не связавшихся белков.

Активность растворимых ферментов определялась спектрофотометрически (Agilent UV-853, Германия) по накоплению продукта 4-нитрофенолят аниона (£=18500 М"'см"', рН 10,5, >.=405 нм). Для этого использовались следующие буферы: 50 мМ фосфатный (рН 7,0-8,0; 11,0-12,0), 50 мМ CHES (рН 8,5-10,0), 0,1 М карбонатный (рН 9,5-11,0), 50 мМ КС1 (рН 12,0-13,0). В качестве запасного раствора субстрата использовались 10 мМ водный раствор Параоксона, 10 мМ спиртовой раствор Паратиона и 10 мМ спиртовой раствор Метил-паратиона. За единицу ферментативной активности принималась концентрация фермента, осуществляющая гидролиз 1 мкмоля субстрата за 1 мин при 25°С. Определение температурного оптимума очищенного белка проводилось внесением аликвоты раствора белка (5 мкл) в прогретый до определённой температуры (в диапазоне 25-95°С) буферный раствор, содержащий субстрат (2 мл). Для определения термостабильности образцы растворов очищенных белков с одинаковой начальной концентрацией выдерживались при температурах в диапазоне 25-70°С в течение 15 мин. в 0,1 М карбонатном буфере (рН 10,5). После этого при 25°С измерялась их остаточная ферментативная активность.

В случае с иммобилизованным биокатализатором определение активности проводилось путём пропускания запасного раствора субстрата, разбавленного буфером, через носитель при определённой температуре. Термостабильность иммобилизованных биокатализаторов исследовалась путём термостатирования образцов при температурах в диапазоне 25-70°С в течение 15 мин. в 0,1 М карбонатном буфере (рН 10,5). После этого при 25°С определялась их остаточная активность. Дегидратация иммобилизованных биокатализаторов проводилась при атмосферном давлении и 8°С.

Концентрация белков, фосфатов и формальдегида определялась спектрофотометрически, концентрация муравьиной кислоты, МФК и фосфатов -методом ВЭЖХ, концентрация метана - методом ГХ, концентрация метанола -методом ВЭГХ, концентрация различных фосфонатов - методом хромато-масс-спектрометрического анализа.

Все работы с моно- и диэфиром МФК, а также с РМ вещества типа Vx проводились в 27 НЦ МО РФ (г.Москва) и ГосНИИОХТ (г.Москва).

Результаты и их обсуждение 1. Белок Hisj2-OPH и его свойства в свободном и иммобилизованном состоянии 1.1. Биосинтез и иммобилизация белка His12-OPH

В работе использовалась плазмида, кодирующая биосинтез HiSi2-OPH, полученная согласно известному методу [Патент РФ №2255975, 2005]. Исследовалось влияние штамма-продуцента на уровень синтеза растворимой, каталитически активной формы фермента Hisn-OPH. Было установлено, что, как и в случае с His6-OPH [Вотчицева, 2006], наиболее подходящим штаммом для экспрессии активной формы HiSi2-OPH являлись клетки E.coli SG13009[pREP4],

В процессе исследования влияния концентрации индуктора на накопление максимальной ОРН-активности в клетках при биосинтезе Hisi2-OPH, концентрация изопропил-Р-О-тиогалактопиранозида (ИПТГ) варьировалась в диапазоне 0,25-0,75 мМ (Табл.1). Было установлено, что максимальный уровень накопления активной формы His|2-OPH в клетках может быть получен при использовании 0,25 мМ ИПТГ. Увеличение концентрации индуктора приводило к снижению выхода активной формы фермента. При этом максимум накопления активности в клетках наблюдался через одно и то же время после внесения в среду индуктора (через 1920 ч).

Таблица 1. Характеристики роста различных штаммов клеток E.coli, синтезирующих Hise-OPH и Hisi2-OPH при различных концентрациях индуктора (ИПТГ) в среде.

Штамм E.coli ИПТГ, мМ Удельная скорость роста клеток, ч"1 Концентрация биомассы клеток с максимальной удельной ОРН-активностью, г/л

His6-OPH HisirOPH His6-OPH Hisi2-OPH

SG13009[pREP4] 0,25 0,33 0,17 17,6 3,1

0,50 0,31 0,16 17,4 2,4

0,75 0,27 0,15 16,8 1,9

DH5a 0,25 0,35 0,21 17,5 1,3

0,50 0,37 0,21 16,8 1,3

0,75 0,37 0,21 16,4 1,4

W3110 0,25 0,50 0,20 7,2 0,31

0,50 0,48 0,21 6,8 0,35

0,75 0,47 0,21 5,1 0,31

Сравнение концентрации биомассы клеток с максимальной удельной ОРН-активностью в случае Шб^-ОРН с аналогичным параметром для Швб-ОРН [Вотчицева, 2006] показало её снижение в 5-8 раз при увеличении длины ро1уШз-последовательности, введённой на И-конец молекулы ОРН (Табл.1). Сравнение удельных скоростей роста клеток одних и тех же штаммов, трансформированных плазмидами, кодирующими синтез Ш^ОРН и НПб^-ОРН, показало, что в случае Шв^-ОРН этот параметр был ниже до 2,5 раз в сравнении с ГПяб-ОРН.

Для получения иммобилизованных препаратов ро1у№8-производных ОРН было решено использовать ЮА-криоПААГ, который был заряжен различными ионами металлов (Со2+ и Си2+), и на который наносились образцы ферментных препаратов Шбй-ОРН и Шв^-ОРН, представляющие собой:

1) клеточные дезинтеграты с неотделённым клеточным дебрисом;

2) супернатанты, полученные после удаления клеточного дебриса из дезинтеграта;

3) предварительно очищенные препараты ферментов.

Анализ концентраций имидазола, при которых наблюдалось элюирование белков с металл-хелатирующих носителей, показал, что прочность связывания модифицированных форм ОРН, содержащих разные по длине ро1уН1з-последовательности, различалась, и связывание Шв^-ОРН с носителем было сильнее, чем в случае Н^б-ОРН. Установлено, что связывание ОРН, содержащей

как Hisö-, так и Шэ^-последовательность, было более прочным с носителем, заряженным ионами Со2+.

Электрофоретический анализ состава белков в элюатах в денатурирующих условиях показал, что состав белков, иммобилизованных на Си-ЮА-криоПААГ носителе как для His6-OPH, так и для Hist2-OPH заметно зависел от способа предварительной подготовки образцов, содержащих ферменты. При проведении предварительной очистки ферментных препаратов, используемых для иммобилизации, количество балластных белков, связывающихся с носителем, заряженным Си2\ существенно снижалось.

Обработка результатов белкового электрофореза с помощью программы «Sigma Gel» показала (Табл.2), что Со-ГОА-криоПААГ для иммобилизации polyHis-производных ОРН являлся более специфичным носителем, и иммобилизованный препарат с постоянным и максимальным для этого носителя содержанием фермента мог быть получен при использовании исходного ферментного препарата различной степени очистки. Наиболее привлекательной в этом случае являлась иммобилизация ферментов из дезинтегратов клеток без предварительного удаления из них клеточного дебриса. В этом случае в одном процессе объединялись иммобилизация фермента и его эффективная очистка.

Таблица 2. Характеристики белковых препаратов, содержащих His6-OPH и ilis^-OPH, иммобилизованных на ЮА-криоПААГ, заряженном разными ионами металлов.

Определяемые характеристики Си2+ Со2+

клеточный гомогенат супернатант после отделения клеточного дебриса препарат, очищенный на Со-IDA колонке клеточный гомогенат супернатант после отделения клеточного дебриса препарат, очищенный на Со-IDA колонке

Доля Ш$б-ОРН в белковом элюате, % 73 ±3 81 ±3 98 ±4 93 ±3 94 ±3 97 ±3

Ёмкость носителя по целевому белку, мг/мл 1,03 ±0,05 1,10 ±0,06 1,22 ±0,06 0,19 ±0,01 0,22 ±0,01 0,20 ±0,01

Доля Шв^-ОРН в белковом элюате, % 82 ±3 87 ±3 98 ±4 98 ±3 99 ±3 99 ±4

Ёмкость носителя по целевому белку, мг/мл 0,94 ±0,05 1,01 ±0,05 1,09 ±0,06 0,20 ±0,01 0,21 ±0,01 0,18 ±0,01

В случае использования того же носителя, заряженного Си2+, обеспечивалась в 5 раз большая концентрация связывающегося с носителем белка, что позволяло получить высокоактивные иммобилизованные ферментные биокатализаторы, но доля фермента в сумме связанных белков в таком иммобилизованном биокатализаторе зависела от чистоты исходно используемого для иммобилизации ферментного препарата. Тем не менее, доля целевого белка даже в случае использования клеточного гомогената с не удалённым клеточным дебрисом составляла не менее 70 и 80% для Швб-ОРН и Шб^-ОРН, соответственно (Табл.2).

Исследовалось влияние состава носителя на характеристики иммобилизованных биокатализаторов. Варьирование исходного мольного соотношения мономеров Л^Л'-диметилакриламид : аллилглицидиловый эфир (АГЭ) в диапазоне от 9,5:0,5 до 7:3 показало, что увеличение в составе полимера содержания АГЭ, по которому производилась модификация носителя ША-лигандами, приводило к увеличению ёмкости носителя по иммобилизуемому белку. В то же время при увеличении доли АГЭ в полимере ферментативная активность иммобилизованных биокатализаторов снижалась, и максимальное значение наблюдалось при соотношении мономеров 9:1. Данное соотношение мономеров было признано оптимальным для получения высокоактивных иммобилизованных биокатализаторов.

1.2. Влияние рН и температуры на каталитические характеристики Шяп-ОРН в растворимой форме

Была исследована зависимость ферментативной активности Шб^-ОРН от рН, и проведено сравнение с аналогичными зависимостями для ОРН и Шэб-ОРН, известными из литературы (Рис.1). Растворимый фермент Шв^-ОРН был активен в

диапазоне рН от 7,0 до 12,5. При этом наблюдалось ярко выраженное плато в области рН 7,5-9,5.

Сравнение температурного

оптимума действия фермента Шэ^-ОРН с аналогичной характеристикой, известной для ОРН и Н18б-ОРН, показало (Рис.2), что в широкой области температур (45-60°С) для свободной формы Шбп-ОРН наблюдалось плато. Это плато было отмечено там, где нативный фермент проявлял максимум активности (45-50°С). Заметным было смещение температурного максимума активности растворимой формы Шб^-ОРН по сравнению с ОРН в область высоких температур (Рис.2).

Несмотря на высокую активность, обнаруженную у Мб^-ОРН при температурах выше 60°С, стабильность фермента была невысокой, и определение активности проводилось по начальным скоростям реакции в течение первых 5 минут. Более длительная экспозиция белка при столь высоких температурах приводила к его инактивации.

Образцы одинаковых по концентрации растворов ферментов Н1з6-ОРН и Н1э12-ОРН были подвергнуты термоинактивации в течение 15 мин. при

рН

Рис.1. рН-оптимум действия ОРН (Л), Ш56-ОРН (■) и Шэп-ОРН (о).

Рис.2. Температурный оптимум действия ОРН (Л), Иэб-ОРН (■) и Мэи-ОРН (о).

различных температурах при рН 10,5, тогда как известные данные по остаточной активности для ОРН ранее были получены при рН 9,0, так как именно это значение рН является оптимальным для каталитического действия этого фермента. Более того, согласно литературным данным, увеличение рН до 9,5 с одновременным увеличением температуры значительно ускоряет процесс инактивации ОРН.

|пп а—__ ® ходе экспериментов была

получена зависимость остаточной активности иэб-орн и шв^-орн от температуры (Рис.3), из которой

^......У\ следовало, что при её увеличении в

интервале от 25 до 47-50°С \ \ \ термоинактивация ро1у№5-производных

\ V \ ОРН происходила быстрее по сравнению

\ с ОРН. При этом ферменты можно

20 25 30 35 40 45 50 55 бо 65 7о расположить в следующий ряд в порядке температура,°с уменьшения термостабильности: ОРН >

Рис.3. Остаточная активность ОРН (Д) (рН №з6-ОРН > №з12-ОРН. Видимо, это 9,0), Ивб-ОРН (■) и Шэ^-ОРН (о) (рН 10,5) связано с тем, что в данном ряду после термоинактивации. увеличивалась их склонность к

олигомеризации, что являлось результатом присутствия ро1уШз-последовательности в структуре белка. По всей видимости, олигомеризация происходила за счёт возникновения комплексных соединений между ро1у№з-последовательностями и ионами металлов, присутствующими в растворе. Шэ^-последовательность способна образовывать большее число связей с ионами металла, и поэтому олигомеры, образованные белками с такими последовательностями, проявляли повышенную стабильность при более высоких температурах. В результате этого полная инактивация ОРН наблюдалось при 57°С, тогда как ро1уШз-производные ОРН сохраняли при этой температуре ~ 50% своей активности. Вместе с этим фермент с Шэ^-последовательностью сохранял до 37% остаточной активности при 60°С, где Шз6-ОРН характеризовался вдвое меньшей остаточной активностью.

Таким образом, Шб^-ОРН проявлял себя как более термостабильный фермент при высоких температурах (50-65°С) по сравнению с ОРН и Н1б6-ОРН.

1.3. Каталитические характеристики Шэ^-ОРН в растворимой форме

Для растворимых форм ферментов Швб-ОРН и Шв^-ОРН были исследованы зависимости начальной скорости гидролиза от концентрации субстратов. Катализируемые реакции описывались односубстратной схемой Михаэлиса-Ментен. Полученные каталитические характеристики приведены в Табл.3, из которой следует, что Н!з6-ОРН активнее, специфичнее и эффективнее гидролизует Параоксон по сравнению с Шв^-ОРН и ОРН.

В то же время в сравнении с ОРН и №з6-ОРН наблюдалось существенное улучшение эффективности каталитического действия Шв^-ОРН по отношению к субстратам, содержащим связь Р=Б (Паратион, Метил-паратион). Причём это достигалось за счёт уменьшения величины Кт и увеличения Утах /Е0.

Таблица 3. Каталитические характеристики растворимых форм ОРН, Шэб-ОРН и Шви-ОРН, катализирующих гидролиз различных ФОС (в 0,1 М СНЕ8-буфере (рН 9,0) для ОРН и в 0,1 М карбонатном буфере (рН 10,5) - для Кэб-ОРН и Шв^-ОРН).

Характеристика Фермент Субстрат

Параоксон Паратион Метил-паратион

Утах /Е0, С ОРН 4900± 100 620 ±40 75 ±5

Шв^-ОРН 5100 ±)00 530 ±30 310 ± 20

Шб12-ОРН 4320 ±100 1850 ±30 1230 ±20

Кт, мкМ ОРН 16 ±0,5 60 ±1,0 210 ± 10

Шз6-ОРН 10 ±0,5 15 ±0,5 73 ±2,0

Ш812-ОРН 60 ± 0,5 7 ±0,5 47 ± 2,0

У,шх/(Е0хКт), М-' с-1 ОРН (3,0 ± 0,2)х108 (8,8±0,4)х10б (3,5 ± 0,2)х105

Шэ^ОРН (5,1 ±0,3)х108 (5,0 ± 0,3)* 107 (4,2 ± 0,2)х106

Ш81г-ОРН (7,2±0,3)хЮ7 (2,6 ± 0,3)х108 (2,6±0,2)хЮ7

Электрофоретический анализ раствора очищенного белка Шв^-ОРН, имеющего большую концентрацию (350 мкг/мл), в неденатурирующих условиях позволил установить присутствие олигомерных форм (Рис.4).

Анализ данных электрофореза с помощью программы «81§таСе1» показал, что -80% белка находилось в виде тетрамеров с молекулярной массой -148 кДа. Кроме того, в растворе присутствовали додека-, диокта- и икосамеры с молекулярными массами -444, ~592 и -740 кДа, соответственно. Данные формы составляли -17% анализируемого белка.

Таким образом, увеличение длины ро1уШ8-последовательности, введённой в молекулу ОРН, существенно изменило свойства фермента. Склонность белка к олигомеризации как положительно, так и отрицательно отразилась на таких каталитических характеристиках фермента, как рН- и температурный оптимум действия, термостабильность, а также на каталитических константах по отношению к различным субстратам.

Анализ собственных и литературных данных, связанных с модификацией белков путём введения ро1уШ5-последовательностей в структуру белка и свидетельствующих об увеличении склонности белков с увеличенной ро1уШэ-последовательностью к олигомеризации, позволило заключить, что данная тенденция, по-видимому, является общей.

740 кДа ■592 кДа

4 -444 кДа

-148 кДа

-74 кДа

Рис.4. Электрофоретический анализ в неденатурирующих условиях:

1 - маркёры молекулярного веса,

2 - очищенный препарат Шв^-ОРН.

Рис.5. рН-оптимум действия растворимой ОРН (Д) и иммобилизованных форм Шэб-ОРН (ш) или 1&12-ОРН (о).

2. Свойства иммобилизованных биокатализаторов на основе Швб-ОРН и Швп-ОРН

2.1. Зависимость активности иммобилизованных биокатализаторов от рН

Было установлено, что активность иммобилизованных форм Н186-ОРН и Шб^-ОРН (Рис.5) проявлялась в интервале рН от 7,0 до 12,0 не зависимо от типа носителя, использованного для иммобилизации. При этом рН-оптимумы оказались существенно расширены по сравнению с рН-оптимумами растворимых форм ферментов в области значений рН, близкой к нейтральной (Рис.1). рН-оптимумы действия иммобилизованных ферментов

практически совпадали между собой, что, в свою очередь, свидетельствовало о том, что каталитические свойства ферментов, иммобилизованных за счёт ро1уН1з-последовательностей, имели одинаковую тенденцию в изменении активности от рН вне зависимости от длины тех последовательностей, с помощью которых осуществлялась их иммобилизация на ША-криоПААГ.

Наблюдавшийся сдвиг рН-оптимума в область значений рН, близких к нейтральным, является несомненным преимуществом иммобилизованных ферментов Швб-ОРН и Шв^-ОРН перед их растворимыми формами, поскольку обеспечивает возможность проведения гидролиза ФОС, присутствующих в проточных системах в составе различных реальных сточных вод.

2.2. Влияние температуры на свойства иммобилизованных биокатализаторов

Температурные оптимумы действия иммобилизованных биокатализаторов на основе Шб-ОРН и Шп-ОРН (Рис.6) оказались сильно расширенными по сравнению с их растворимыми формами (Рис.2). К тому же для иммобилизованной Шэн-ОРН наблюдалось существенное смещение температурного оптимума в область более низких температур по сравнению с её растворимой формой (Рис.2).

Температурные оптимумы действия иммобилизованных №з6-ОРН и Шб^-ОРН практически совпадали, следовательно, при нековалентной иммобилизации ферментов за счёт ро1уН15-последовательности влияние последней на каталитические характеристики ферментов практически исчезает.

40 45 50 55 Температура, "С

Рис.6. Температурный оптимум действия растворимой ОРН (Д) и иммобилизованных форм Н15б-ОРН (ш) и Иэп-ОРН (о).

35 40 45 50 55 Температуря, "С

Определение остаточной

активности иммобилизованных

ферментов при разных температурах показало (Рис.7), что иммобилизация увеличивала их термостабильность. При этом самым термостабильным ферментом был Ибй-ОРН.

Характер снижения активности иммобилизованных препаратов Шз6-ОРН и РПб^-ОРН при разных температурах был аналогичен тенденции, известной

Рис.7. Термоинактивация ОРН (Д) и для 0РН" Это свидетельствовало о том,

иммобилизованных форм Шзг.-ОРН (■) что механизм термоинактивации для них

и Шэп-ОРН (о). в принципе совпадает, в отличие от

механизма инактивации свободных форм

Н156-ОРН и Шэ^-ОРН.

2.3. Каталитические характеристики иммобилизованных биокатализаторов в отношении различных субстратов

Изучение влияния скорости протока на степень конверсии Параоксона показало, что исследуемый параметр оставался постоянным при скорости потока 12-60 мл/ч. Столь широкий интервал скоростей протока с постоянной степенью конверсии субстрата свидетельствовал об отсутствии диффузионных ограничений со стороны носителя. Согласно данным производителей, размер пор носителя составляет 10-80 мкм, а сами они занимают 93% объёма.

Степень разложения субстрата, выраженная через единицы активности, приходящейся на 1 мл носителя, линейно зависела от количества иммобилизованного на носителе фермента.

Из полученных данных по зависимости степени разложения субстрата от его концентрации при фиксированных скоростях протока и используемых объёмах иммобилизованных биокатализаторов, полученных с использованием исходных образцов РЛвб-ОРН и Иб^-ОРН с разной степенью очистки, были рассчитаны их каталитические характеристики (Табл.4). В предположении, что система с иммобилизованным биокатализатором функционирует как проточный реактор полного вытеснения, для расчёта констант использовалось следующее уравнение:

У [5] К. у

где и - скорость протока, мл/мин; V - объём носителя, мл; 8 - концентрация субстрата, мкМ; Кт - эффективная константа Михаэлиса, мкМ; Утах - эффективная максимальная скорость реакции, мкМ/мин, 80 - концентрация субстрата, вводимого в колонку, мкМ.

Сравнение величин Ушах/Е0, установленных для иммобилизованных Ш56-0РН и Н]3|2-ОРН, показало, что чем чище был исходно наносимый на носитель фермент, тем меньшее количество балластных белков иммобилизовалось на носителе, и тем выше было значение обсуждаемого параметра.

Таблица 4. Эффективные каталитические характеристики препаратов Н1з<гОРН и Шви-ОРН, иммобилизованных на Си- и Со-ГОА-криоПААГ, в отношении Параоксона.

Шзб-ОРН

Наносимый препарат белка Си-ГОА-криоПААГ

С Кт, мкМ Утах/(Е„хКт), М-'с"1

Клеточный гомогенат 714 ±31 536 ±23 (1,3 ± 0,1)х10б

Супернатант 1480 ±50 544 ± 18 (2,7 ± 0,1)х 106

Очищенный фермент 1530 ±50 543 ±21 (2,8 ± 0,1)х 106

Ш«12-ОРН

Наносимый препарат белка Си-ЮА-криоПААГ

С Кт, мкМ УтаДЕоХК^М-'с-'

Клеточный гомогенат 65,8 ±3,1 500 ± 20 (1,3±0,1)хЮ5

Супернатант 108 ±4 510 ± 25 (2,1 ±0,1)хЮ5

Очищенный фермент 119±5 508 ±18 (2,3 ± 0,1)*105

Ш56-ОРН

Наносимый препарат белка Со-ГОА-криоПААГ

Утах/Е0, с Кт, МкМ Утах/(Е„хКт), М-'с"1

Клеточный гомогенат 118 ± 3 536 ±28 (2,2 ± 0,1)х105

Супернатант 123 ±5 534 ±21 (2,3 ± 0,1)хЮ5

Очищенный фермент 122 ±6 533 ± 24 . (2,3 ± 0,1 )х 105

Н18,2-ОРН

Наносимый препарат белка Со-ША-криоПААГ

^тах/Е0, С Кт, мкМ Утах/(Е„хКт), М-'с"1

Клеточный гомогенат 110 ± 5 505 ± 25 (2,2 ± 0,1 )х 105

Супернатант 104 ±3 514 ± 19 (2,0 ± 0,1)х105

Очищенный фермент 110±6 511 ±21 (2,1 ±0,10)хЮ5

При этом не зависимо от выбранного для зарядки носителя иона металла значения Кш для иммобилизованных препаратов оставались одинаковыми вне зависимости от количества балластных белков, связавшихся с носителем. Таким образом, посторонние белки не ограничивали доступ субстрата к связывающему центру иммобилизованных ро1уШз-содержащих ферментов.

Для иммобилизованной Шэб-ОРН были определены каталитические константы действия по отношению к разным субстратам (Табл.5).

Таблица 5. Каталитические характеристики фермента Н^б-ОРН, иммобилизованного на Си-ГОА-крноПААГ, по отношению к различным субстратам.

Субстрат Ущах/Ео , С Кт, мкМ Утах/(Е„хКт), М-'с"1

Параоксон 630 ±30 46 ±2 (1,4±0,1)х107

Метил-паратион 380 ±20 241 ±11 (1,6 ± 0,2)х Юл

Хлорпирифос 660 ±30 503 ±21 (1,3±0,1)хЮб

Эффективность каталитического действия разработанного иммобилизованного биокатализатора по отношению к ним уменьшалась в ряду

Параоксон > Метил-паратион > Хлорпирифос, и эта тенденция была аналогична известной для растворимого фермента Н1зб-ОРН [Е)тетепко Е., 2005].

Тип используемого носителя оказывал влияние на каталитические характеристики получаемого иммобилизованного биокатализатора. Так, иммобилизация фермента Шз6-ОРН на №-МТА-агарозе приводила к существенному ухудшению его каталитических характеристик: Кт = 1530 ± 100 мкМ, Утах/Е0 = 0,76 ± 0,04 с"1, Утах/(Е0хКт) = (5,0 ± 0,6)х102 М"'с"'. Вероятно, это было вызвано сильными затруднениями для диффузии субстрата к ферменту через слой носителя, частицы которого под воздействием высоких скоростей жидкости образовывали очень плотный слой. Этот факт вкупе с низкими максимально возможными скоростями протока для этого носителя не позволил рекомендовать известный коммерческий носитель ЪП-ЫТА-агарозу для получения и эффективного применения иммобилизованных ро1у№з-содержащих производных ОРН.

2.4. Стабильность иммобилизованных биокатализаторов при хранении и периодическом использовании

Иммобилизованные биокатализаторы, полученные на основе Н156-ОРН и Шэ^-ОРН, использовались в ходе выполнения данной работы многократно. Они проявляли высокую операционную стабильность при непрерывном использовании, позволяя подвергнуть полному гидролизу 10800 л раствора 10 мкМ Параоксона с помощью 1 мл биокатализатора за период его полуинактивации. Длительное использование иммобилизованного биокатализатора в условиях проведения процесса не приводило к элюированию фермента с носителя.

Сохранение высокой активности иммобилизованных биокатализаторов наблюдалось при их длительном хранении в 0,1 М карбонатном буфере (рН 10,5). Аппроксимация данных Рис.8 позволила рассчитать период полуинактивации иммобилизованного биокатализатора, который при хранении во влажной форме составил 1000 сут.

Было показано, что

иммобилизованные биокатализаторы можно многократно регенерировать в случае их инактивации путём элюирования фермента с носителя с помощью растворов имидазола или ЭДТА, что нельзя сделать в случае ковалентной иммобилизации, используемой для получения аналогичных биокатализаторов.

2.5. Получение сухих форм иммобилизованных биокатализаторов

Было показано, что иммобилизованные биокатализаторы на основе ШБб-ОРН и Н^г-ОРН могут быть высушены до остаточной влажности 4,5±0,5% и регидратированы с минимальными потерями активности (не более 3±0,5%).

100-

ЧГ

0 10 20 300 310 320 Время хранения, сут

Рис.8. Остаточная активность иммобилизованного биокатализатора, полученного на основе Н^-ОРН и Си-ША-криоПААГ, после длительного хранения.

Результаты длительного хранения сухих форм иммобилизованных биокатализаторов позволили рассчитать их период полуинактивации, который составил 900 сут. Подобные характеристики биокатализаторов открывают возможность широкого их применения для биотехнологических целей.

2.6. Исследование возможности масштабирования объёма иммобилизованного биокатализатора

Было исследовано влияние линейных размеров иммобилизованного биокатализатора на основе His6-OPH на его каталитические свойства. Не зависимо от линейных размеров в постоянном режиме функционирования все образцы характеризовались одинаковой каталитической активностью.

Была наработана партия образцов носителей, каждый из которых имел объём 20 мл. Применение полученных образцов иммобилизованных биокатализаторов для разложения Параоксона в протоке с хорошей воспроизводимостью обеспечивало 100%-ный гидролиз 1 мМ раствора субстрата при скорости протока 480 мл/ч.

Таким образом, была показана возможность успешного 5-кратного масштабирования объёмов полученных биокатализаторов для последующего их применения в процессах разложения ФОС в проточных системах с хорошей воспроизводимостью.

В сравнении с другими иммобилизованными биокатализаторами, созданными на основе ОРН для использования в проточных системах, разработанные в этой работе иммобилизованные биокатализаторы, как минимум, не уступают им по своим характеристикам, а чаще всего и превосходят их. Новизна и очевидные преимущества над аналогами разработанных биокатализаторов были подтверждены Патентом РФ № 2315103 (2008).

3. Применение растворимой и иммобилизованной форм His6-OPH в процессе гидролиза фосфонатов

3.1. Растворимая форма His6-OPH в реакциях гидролиза фосфонатов

3.1.1. Каталитические характеристики гидролиза ИБЭМФК и ДИБЭМФК под

действием His6-OPH

В ходе проводимых экспериментов была впервые выявлена каталитическая активность фермента His6-OPH в отношении таких субстратов, как ИБЭМФК и ДИБЭМФК, которые являются продуктами химического разложения вещества типа

Vx. При этом катализируемые реакции описывались

односубстратной схемой Михаэлиса-Ментен.

Каталитические константы гидролиза обоих эфиров оказались почти одинаковыми, что объяснимо ввиду сходства уходящей группы у данных субстратов (Табл.6). В то же время рассчитанные значения Кт для двух эфиров более чем на два порядка

Таблица 6. Каталитические характеристики гидролиза ИБЭМФК и ДИБЭМФК под действием His6-OPH.

Каталитические характеристики Субстрат

ИБЭМФК ДИБЭМФК

VmM/E0, мин"1 24,0 ± 0,8 26,0+1,1

Km, ММ 1400 + 100 4,6 + 0,3

Vmax/(E„-Km), М-'мин1 17,1+0,7 5650±130

отличались друг от друга. По-видимому, увеличение Кт для ИБЭМФК было вызвано несимметричностью молекулы, в результате чего был затруднен процесс связывания субстрата с ферментом с образованием продуктивного фермент-субстратного комплекса.

3.1.2. Каталитические характеристики гидролиза МФК под действием Шхб-ОРН

В ходе исследований была выявлена каталитическая активность ШБб-ОРН в отношении МФК, которая является одним из продуктов гидролиза ИБЭМФК и ДИБЭМФК, а следовательно, и вещества типа Ух. Катализируемая реакция описывалась односубстратной схемой Михаэлиса-Ментен. Были рассчитаны каталитические константы действия Швб-ОРН в отношении МФК.

Поскольку фермент РПзб-ОРН специфичен к субстратам с объёмными радикалами, то небольшая молекула МФК не являлась хорошим субстратом для данного фермента. Однако не зависимо от этого, величина Кт для МФК составляла 2,1 ± 0,2 мМ и оказалась меньше, чем соответствующие константы для ИБЭМФК и ДИБЭМФК (Табл.6). По-видимому, небольшая по размерам молекула МФК легче проникала в активный центр фермента и образовала фермент-субстратный комплекс. Каталитические константы для ИБЭМФК и ДИБЭМФК оказались больше, чем в случае МФК, для которой она составила 1,3 + 0,1 мин"1 (Табл.6). Это объяснялось тем, что фермент Шэб-ОРН специфично катализирует гидролиз Р-О, Р-Б и Р-Б связей и не является высокоспецифичным по отношению к С-Р связи.

3.1.3. Кинетическая модель процесса ферментативного гидролиза различных ФОС в составе РМ, полученных после химической детоксификации вещества типа Ух

Для описания каталитического действия ШБб-ОРН в отношении различных ФОС, входящих в виде сложной смеси в состав РМ, полученных после химической детоксификации вещества типа Ух, была предложена кинетическая схема, представленная на Рис.9.

РМ вещества типа Ух, с точки зрения каталитического действия Н1з6-ОРН, являются сложной многосубстратной системой, так как в состав РМ одновременно входят четыре ферментных субстрата: Б] - вещество типа Ух, Бг - ДИБЭМФК, 83 - ИБЭМФК, Б« - МФК. При этом продукты гидролиза вещества типа Ух, ДИБЭМФК и ИБЭМФК также являются субстратами Шз6-ОРН. В данной кинетической модели также учтено возможное ингибирование фермента конечным продуктом гидролиза - фосфатом.

Для модели была составлена система дифференциальных уравнений, учитывающих изменение концентрации фермент-субстратных комплексов для всех

Рис.9. Кинетическая схема, описывающая поведение ШЭ(,-ОРН в сложной смеси ФОС в составе РМ, полученных после детоксификации вещества типа Ух.

субстратов во времени. Данная система дифференциальных уравнений была решена в условиях стационарности методом детерминант. Уравнение для скорости реакции образования фосфата выглядело так: ир к,. • У,

К...

1 + -

К.„

К.,

+ Кр-Р

'«(1) ''»1(2) "»(3)

Таким образом, ингибирование процесса разными субстратами имело сложный характер, сходный с полным конкурентным ингибированием. При этом константы ингибирования для субстратов Б], Бг и Бз были равны константам Михаэлиса для односубстратных реакций гидролиза каждого из субстратов. С использованием данного уравнения были получены зависимости изменения концентраций всех субстратов от времени.

3.1.4. Ферментативный гидролиз ФОВ в составе РМ, полученных после химической детоксификации вещества типа Ух

Была проведена обработка ФОВ в составе РМ, полученных после химической детоксификации вещества типа Ух и разбавленных в 50 и 100 раз, с использованием растворимой формы Квб-ОРН (Рис.10). С течением времени наблюдалось глубокое разложение вещества типа Ух.

Время,ч

Рис.10. Гидролиз вещества типа Ух в составе РМ под действием ЬШб-ОРН.

3.1.5. Ферментативный гидролиз ФОС в составе РМ, полученных после химической детоксификации вещества типа Ух

Было установлено, что фермент ШЗб-ОРН успешно осуществляет гидролиз ИБЭМФК (Рис.11), ДИБЭМФК, а также МФК в составе РМ. Факт разложения ферментом продуктов деструкции ФОВ в сложных по составу РМ был установлен впервые. Процент разложения отдельных компонентов РМ под действием фермента Шве-ОРН составил (%): 63,5 ± 3,2, 63,2 ± 2,0 и 45,0 ± 2,5 (от концентрации, максимально накапливающейся при разложении эфиров) для ИБЭМФК, ДИБЭМФК и МФК, соответственно.

Подбором условий для проведения процесса разложения ФОС в составе РМ удалось достигнуть большей степени разложения субстратов: она составила 83, 97 и 65% (от максимально

ьв

в 40

= 20

100 120

60 80 Время, ч

Рис.11. Аппроксимация экспериментальных данных для ИБЭМФК с использованием полученного уравнения.

накапливающейся при разложении эфиров) для ИБЭМФК, ДИБЭМФК и МФК, соответственно.

Применение описанной выше кинетической модели и полученных уравнений для аппроксимации экспериментальных данных по разложению различных ФОС в составе РМ с использованием метода наименьших квадратов выявило хорошую корреляцию выражений, выведенных аналитически, с результатами экспериментов с коэффициентом детерминации >0,95 (Рис.11). Кроме того, был подтверждён результат, полученный ранее аналитически (п.п.3.1.3), согласно которому в системе с исследованными субстратами наблюдалось полное конкурентное ингибирование с константами ингибирования, равными константам Михаэлиса для односубстратных реакций. При этом наибольший вклад вносил ИБЭМФК, присутствующий в РМ.

3.1.6. Механизм реакции гидролиза МФК под действием Н!х6-ОРН

Для установления возможного механизма разложения МФК под действием Шэб-ОРН был исследован путь превращения метальной группы МФК в ходе реакции. Среди продуктов не были идентифицированы ни метан, ни метанол. Другим возможным продуктом реакции являлся формальдегид. Однако его присутствие не было установлено. Тем не менее, в реакционной среде была обнаружена муравьиная кислота, которая, по всей видимости, образовывалась из формальдегида. Предлагаемый механизм подтверждался тем, что при интенсивной подаче воздуха в реакционную среду (200 млВОЗд/лСреДы/ч) гидролиз МФК под действием Шэб-ОРН проходил в ~5 раз быстрее, чем в отсутствие подачи воздуха.

С учётом полученных результатов был предложен механизм реакции гидролиза МФК под действием Швб-ОРН.

При связывании МФК один ион кобальта, находящийся в активном центре фермента (Рис.12), координируется с кислородом фосфора (Р=0), при этом из координационной сферы металла вытесняется мостиковая молекула воды, а на другом ионе кобальта из воды генерируется нуклеофил (ОН"), способный атаковать

форме МФК образуется частичный положительный заряд на атоме углерода (5+) за счёт индуктивного эффекта присоединённых ОН-групп. На атоме фосфора также имеется нескомпенсированный положительный заряд (8+) за счёт смещения электронной плотности на атомы кислорода. В результате этого С-Р связь становится напряжённой, поскольку рядом возникают два одноимённых заряда, и она гидролизуется согласно классическому механизму действия ОРН [Ефременко Е., 2004]. В результате этого образовывались неорганический фосфат и муравьиная

фосфорный центр.

Далее происходит

НСОО-+ НР042-

Рис.12. Предполагаемый механизм разложения МФК под действием ШБб-ОРН.

ЧСо-Н,з6-ОРН ^

и? ,,

активация С-Р связи, осуществляемая за счёт окисления СНз-группы кислородом воздуха с образованием одной или двух гидроксильных групп.В активированной

кислота.

Зависимость активности Н1з6-ОРН в отношении МФК от рН была аналогична подобной зависимости в отношении Параоксона. Небольшие различия наблюдались в температурном оптимуме действия ШБб-ОРН в реакции гидролиза МФК: с повышением температуры наблюдалось более быстрое увеличение активности (Рис.13), происходившее, по-видимому, за счёт ускорения процесса окисления метальной группы МФК. Таким образом, предложенный механизм гидролиза С-Р связи в МФК под действием Шз6-ОРН совпадал с известным гидролитическим механизмом действия фермента.

3.2. Иммобилизованная Н^-ОРН в реакциях разложения фосфонатов

3.2.1. Иммобилизованная Швб-ОРН в составе защитного материала

Фермент ШБб-ОРН был абсорбирован в полиметакрилатный гидрогель, на основе которого был получен защитный материал. Его верхний слой представлял собой полиамидхлопчатобумажную ткань с полифторолефиновой мембраной. В средний слой помещался сорбент с иммобилизованным ферментом. Нижний гигиенический слой был выполнен из тканого или нетканого целлюлозосодержащего материала.

Не зависимо от чистоты применяемого ферментного препарата, рН и температуры, время самодегазации образца защитного материала уменьшалось с 7 до 3 ч при увеличении концентрации фермента Шз6-ОРН. Минимальное время самодегазации (3 ч) наблюдалось для материалов, содержащих 0,0076 и 0,22 масс.% для очищенного и неочищенного препарата Шз6-ОРН, соответственно.

При самодегазации защитного материала наряду с гидролизом вещества Ух, наблюдалось разложение этилового и диэтилового эфира МФК, а также самой МФК. Гидролитическая активность иммобилизованного фермента в составе защитных материалов в отношении указанных субстратов была обнаружена впервые. Оригинальность и практическая значимость разработанного иммобилизованного биокатализатора были подтверждены Патентом РФ № 2330717 (2008).

3.2.2. Разложение фосфонатов в проточных системах под действием иммобилизованных биокатализаторов

Были определены каталитические константы реакции гидролиза различных фосфонатов под действием Швб-ОРН, иммобилизованной на Си-ША-криоПААГ, в проточной системе при скорости протока 6 мл/ч (Табл.7).

Было показано, что после иммобилизации Шз6-ОРН сохраняла каталитическую активность в отношении всех исследуемых субстратов, а в случае

Температура, "С

Рис.13. Зависимость активности Н^г.-ОРН от температуры в реакциях гидролиза Параоксона (•) и МФК (□).

МФК наблюдалось увеличение параметра Vmax/E0 в 7,8 раз в сравнении с растворимой формой фермента.

т , _ ,, ... „шт Степень разложения

1 аблица 7. Каталитические константы HiS6-OrH, . ^ _ г

иммобилизованной на Cu-ША-криоПААГ, в различных ФОС в РМ,

отношении различных фосфонатов. полученных после уничтожения

вещества типа Vx и разбавленных в 50 раз, составила 100, 9, 100 и 100%, соответственно, для ФОБ, ИБЭМФК, ДИБЭМФК и МФК (накапливающейся при

разложении всех других субстратов) под действием иммобилизованной His6-OPH при скорости протока 3 мл/ч. Более глубокое разложение остаточных концентраций ИБЭМФК было продемонстрировано в случае комбинированной обработки РМ иммобилизованным ферментным биокатализатором и иммобилизованным биокатализатором на основе клеток-деструкторов МФК (Pseudomonas sp. 78Г) или клеток E.coli SG13009[pREP4], трансформированных плазмидой pTES-His6-OPH и синтезирующих фермент His6-OPH. В результате подобной двухстадийной обработки степень разложения ИБЭМФК и МФК в составе РМ увеличилась до 91 и 90%, соответственно. Новизна и очевидные преимущества подобного подхода к обработке РМ были подтверждены Патентом РФ № 2360967 (2009), а также отражены в заявке на получение Патента РФ на изобретение № 2009104506 (2009).

Субстрат V /F v max' L-o, мин'1 Km, ММ Vma*/(E0xKm), М"'мин"'

ИБЭМФК 6 ±0,4 3500 ±200 1,7 ±0,2

ДИБЭМФК 6,2+0,4 13,8 + 0,3 450 + 40

МФК 10,1 ±0,6 4,4 ± 0,2 2300 ± 240

ВЫВОДЫ

1. Впервые получен фермент Шэ^-ОРН и проведён сравнительный анализ свойств ро1у№з-производных ОРН. Показано, что длина ро1уН1з-последовательности существенно влияет на каталитические и физико-химические характеристики растворимой формы фермента, а её увеличение приводит к появлению у белка склонности к олигомеризации.

2. Разработаны новые иммобилизованные биокатализаторы на основе ро1уШБ-производных ОРН за счёт их координационного связывания с металл-хелатирующим носителем ША-криоПААГ, заряженным ионами Си2+ или Со2+. Проведено совмещение процесса иммобилизации с очисткой фермента при использовании для получения иммобилизованных биокатализаторов ферментных препаратов разной степени очистки.

3. Определены каталитические характеристики иммобилизованных биокатализаторов в отношении различных фосфорорганических субстратов при их использовании в проточной системе. Показано существенное расширение температурного (20-60°С) и рН-оптимума действия (рН 7-12) иммобилизованных ферментных препаратов, а также увеличение их термостабильности по сравнению с растворимой формой ОРН. Разработанные биокатализаторы существенно

превосходят известные аналоги по стабильности каталитических характеристик, по возможной к применению скорости протока и по каталитической активности.

4. Получена сухая форма иммобилизованных биокатализаторов, способная длительно храниться (свыше 3 лет) в таком состоянии и в дальнейшем регидратироваться без существенных потерь ферментативной активности. Показана возможность масштабирования объёмов образцов разработанных иммобилизованных биокатализаторов.

5. Впервые установлена каталитическая активность His6-OPH в отношении МФК, а также её моно- и диэфиров, определены каталитические константы в отношении данных субстратов. Предложен механизм действия His6-OPH в реакции разрыва С-Р связи в МФК. Впервые установлена возможность проведения этой реакции при участии фермента His6-OPH как в растворимой, так и в иммобилизованной форме.

6. Впервые установлена возможность разложения под действием HÎS6-OPH основных фосфорорганических компонентов в составе реакционных масс, получаемых после химического уничтожения вещества типа Vx и представляющих собой многосубстратные смеси. Предложена кинетическая модель, описывающая поведение His6-OPH в РМ. На основании данной модели выведены уравнения, устанавливающие зависимость концентраций каждого фосфорорганического компонента от времени действия фермента His6-OPH с учётом всех входящих в данную смесь субстратов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи:

1. Ефременко Е.Н., Лягин И.В.. Завьялов В.В., Варфоломеев С.Д., Завьялова Н.В., Холстов В.И. Ферменты в технологии уничтожения фосфорорганических отравляющих веществ Л ЖРХО, 2007, V.LI(2), с.24-29.

2. Efremenko Е., Lyagin I., Votchitseva Y., Sirotkina M., Varfolomeyev S. Polyhistidine-containing organophosphorus hydrolase with outstanding properties.// Biocatal. Biotransfor., 2007, V.25(l), p.103-108.

3. Efremenko E., Lvagin I.. Gudkov D., Varfolomeyev S. Immobilized biocatalysts for detoxification of neurotoxic organophosphorus compounds.// Biocatal. Biotransfor., 2007, V.25(2-4), p.359-364.

4. Efremenko E.N., Lyagin I.V., Senko O.V., Stepanov N.A., Spiricheva O.V., Azizov R.E. Modern trends in application of immobilized cells for environmental bioremediation.// N.-Y.: Nova Science Publishers Inc., "Leading-Edge Environmental Biodégradation Research" (Ed. Pawley L.E.), 2007, p. 11-51.

5. Efremenko E.N., Lvagin I.V.. Votchitseva Yu.V., Gudkov D.A., Peregudov A.A., Aliev Т.К., Varfolomeev S.D. The influence of length and localization of polyhistidine tag in the molecule of organophosphorus hydrolase on the biosynthesis and behavior of fusion protein.// N.-Y.: Nova Science Publishers Inc., "Biotechnology: State of the Art and Prospects for Development" (Ed. Zaikov G.E.), 2008, p.87-101.

6. Efremenko E., Lyagin I.. Senko O., Gudkov D., Varfolomeev S. Application of gel systems with various biocatalysts detoxifying neurotoxic agents for pollution control, water

purification, and self-defense.// Netherlands: Springer, "Sol-Gel Methods for Materials Processing: Focusing on Materials for Pollution Control, Water Purification, and Soil Remediation" (Ed. Innocenzi P., Zub Y.L., Kessler V.G.), 2008, p.77-89.

7. Efremenko E.N., Lyagin I.V.. Plieva F.M., Galaev I.Y., Mattiasson B. Dried-reswollen immobilized biocatalysts for detoxification of organophosphorous compounds in the flow systems.// Appl. Biochem. Biotechnol., 2009, V.159, p.251-260.

Патенты РФ:

8. Ефременко E.H., Лягин И.В.. Гапаев И.Ю., Плиева Ф.М., Варфоломеев С.Д., Маттиассон Б. Способ получения биокатализатора и биокатализатор для детоксикации фосфорорганических нейротоксичных соединений в проточных системах.// Патент РФ № 2315103 (20.01.2008), бюл. №2.

9. Ефременко Е.Н., Завьялов В.В., Завьялова Н.В., Гореленков В.К., Гудков Д.А., Лягин И.В.. Варфоломеев С.Д., Холстов В.И. Фильтрующесорбирующий самодегазирующийся материал для средств индивидуальной защиты от воздействия фосфорорганических соединений.// Патент РФ № 2330717 (10.08.2008), бюл. № 22.

10. Ефременко Е.Н., Завьялова Н.В., Сенько О.В., Лобастое С.Л., Лягин И.В.. Аксенов А.В., Варфоломеев С.Д. Биокатализатор на основе иммобилизованных клеток бактерий для разложения метилфосфоновой кислоты.// Патент РФ № 2360967 (10.07.2009), бюл. № 19.

11. Ефременко Е.Н., Завьялова Н.В., Лягин И.В.. Сенько О.В., Гудков ДА., Аксенов А.В., Степанов Н.А., Сироткина М.С., Спиричева О.В., Иванов Р.В., Лозинский В.И., Варфоломеев С.Д., Кондратьев В.Б., Холстов В.И. Способ биоразложения фосфорорганических соединений в составе реакционных масс, получаемых после химического уничтожения вещества типа Vx.// Заявление на патент РФ № 2009104506, приоритет от 11.02.2009.

Тезисы докладов:

12. Лягин И.В.. Гудков Д.А., Вотчицева Ю.А., Ефременко Е.Н. Биокатализаторы на основе генетически модифицированной органофосфатгидролазы для гидролиза фосфорорганических пестицидов в проточных системах.// Междунар. конф. «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды», 2005, Саратов, 14-16 сентября, с.33-34.

13.Gudkov D.A., Lyagin I.V.. Efremenko E.N. Development of soluble and immobilized preparations of organophosphate hydrolase to solve the issues of environmental pollution with organophosphorus compounds.// VI Int. Conf. on Environ. Pollut. - ICEP 2005, 2005, Perm-Kazan-Perm, September 20-25, p. 149.

14.Лягин И.В., Ефременко E.H., Варфоломеев С.Д. Разработка новых гибридных белков со свойствами органофосфатгидролазы для гидролиза фосфорорганических соединений.// V Ежегод. междунар. конф. ИБХФ РАН-ВУЗы, 2005, Москва, 14-16 декабря, с. 165-166.

15.Лягин И.В., Ефременко Е.Н., Варфоломеев С.Д. Иммобилизация органофосфатгидролазы как подход к детоксикации фосфорорганических соединений в проточных системах.// 10-я Пущин, конф. молод, уч., 2006,17-21 апреля, с.382.

16. Efremenko Е., Lyagin I., Gudkov D., Peregudov A. Immobilized biocatalysts for detoxication of neurotoxic organophosphorus compounds.// «Environmental Biocatalysis: From remediation with enzymes to novel green processes», 2006, Córdoba, Spain, April 23-26, p.63.

17. Гудков Д., Лягин И.. Верхуша В., Ефременко Е. Подходы к увеличению выхода растворимой органофосфатгидролазы: получение гибридных аналогов и рефолдинг белка из телец включения.// Междунар. конф. «Генетика микроорганизмов и биотехнология», 2006, Москва - Пущино, 28 ноября - 1 декабря, с.45.

18. Лягин И.В., Ефременко Е.Н., Варфоломеев С.Д. Влияние генетически введенной додекагистидиновой последовательности на N-конец молекулы органофосфатгидролазы на свойства фермента.// Междунар. конф. «Генетика микроорганизмов и биотехнология»,

2006, Москва - Пущино, 28 ноября - 1 декабря, с. 143-144.

19.Gudkov D., Lyagin I.. Sirotkina M., Verkhusha V., Efremenko E. Chimeric proteins based on organophosphorus hydrolase.// 4th Moscow Int. Congr. «Biotechnology: State of the Art and Prospects of Development», 2007, Moscow, March 12-16, p.279.

20. Lyagin Г.У.. Gudkov D.A., Verkhusha V.V., Efremenko E.N. Molecular messengers for organophosphorous toxins presence in the body cells.// Int. Works, and Scien. Discus. Club «New technologies in Medicine and Experimental Biology», 2007, Pattaya - Bangkok, Thailand, February 26 - March 8, p.43-44.

21. Lyagin I.V., Efremenko E.N., Varfolomeyev S.D. Enzymetic hydrolysis of organophosphorous compounds in flow-through system.// Int. Conf. «Biocatalysis - 2007. Structure, functions, applications». 2007, Moscow - St.-Petersburg, Russia, June 17-22, p. 111112.

22. Lyagin I.. Ivanov R., Lozinsky V., Efremenko E. Design of immobilized biocatalysts for degradation of neurotoxic organophosphorous compounds.// XV Int. Conf. on Bioencapsulation,

2007, Vienna, Austria, September 6-8, P2-13.

23. Lyagin I.V., Sirotkina M.S., Efremenko E.N., Varfolomeyev S.D. Enzymatic cleavage of C-P bond in organophosphorous compounds.// XVIII Mendeleev Congress on General and Applied Chemistry, 2007, Moscow, Russia, September 23-28, p.2084.

24. Лягин И.В., Иванов P.B., Лозинский В.И., Ефременко Е.Н. Иммобилизации полигистидин-содержащих белков на новом макропористом металл-хелатирующем носителе.// Междунар. науч.-практ. конф. «Новые технологии в экспериментальной биологии и медицине», 2007, Ростов-на-Дону, Россия, 10-12 октября, с.145-146.

25.Лягин И.В., Иванов Р.В., Ефременко Е.Н., Лозинский В.И. Влияние состава мономеров в полимерном металл-хелатирующем носителе на эффективность иммобилизации полигистидин-содержащей органофосфатгидролазы.// VII Ежегод. междунар. конф. ИБХФ РАН-ВУЗы, 2007, Москва, 12-14 ноября, с.184-185.

26.Сенько О.В., Лягин И.В.. Иванов Р.В., Лозинский В.И., Ефременко Е.Н. Разложение ферментативных гидролизатов фосфорсодержащих пестицидов при помощи иммобилизованных клеток мицелиальных грибов.// III Междунар. конф. «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал», 2008, Пермь-Н.Новгород-Пермь, 28 сентября - 5 октября, с.95.

27. Ефременко Е.Н., Лягин И.В.. Сенько О.В., Лобастое С.Л., Завьялова Н.В., Варфоломеев С.Д., Холстов В.И. Иммобилизованные гетерогенные биокатализаторы для разложения С-Р связи в продуктах уничтожения фосфорорганических отравляющих веществ.// 4-я Науч.-практ. конф. «Научно-технические аспекты обеспечения безопасности при уничтожении, хранении и транспортировке химического оружия», 2008, Москва, 6-10 октября, с.20-21.

28. Лягин И.В., Гудков Д.А., Верхуша В.В., Ефременко Е.Н. Получение и свойства рекомбинантных гибридных белков для детекции нейротоксичных фосфорорганических соединений.// 2-я Междунар. науч. конф. «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины», 2008, Ростов-на-Дону, 8-10 октября, с.136.

29.Сенько О.В., Лягин И.В., Иванов Р.В., Лозинский В.И., Ефременко Е.Н. Разложение фосфорорганических пестицидов под действием ферментных и микробных иммобилизованных биокатализаторов.// 2-я Междунар. науч. конф. «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины», 2008, Ростов-на-Дону, 8-10 октября, с.140-141.

30. Лягин И.В.. Сенько О.В., Иванов Р.В., Лозинский В.И., Ефременко Е.Н. Комбинированное применение ферментативного и микробного иммобилизованных биокатализаторов в процессе биодеградации фосфорорганических пестицидов.// 12-я Междунар. Пущин, конф. молод, уч. «Биология: наука XXI века», 2008, 10 ноября - 14 ноября, с.213.

31. Лягин И.В.. Иванов Р.В., Лозинский В.И., Ефременко Е.Н., Варфоломеев С.Д. Иммобилизованные биокатализаторы на основе гексагистидин-содержащей органофосфатгидролазы и их каталитические характеристики.// VIII Ежегод. междунар. конф. ИБХФ РАН-ВУЗы, 2008, Москва, 11-13 ноября, с.136-137.

32. Сенько О.В., Лягни И.В.. Ефременко Е.Н. Биокатализатор на основе мицелиальных грибов для разложения токсичных продуктов гидролиза пестицидов.// VIII Ежегод. междунар. конф. ИБХФ РАН-ВУЗы, 2008, Москва, 11-13 ноября, с.203.

33. Лягин И.В.. Гудков Д.А., Сенько О.В., Сироткина М.С., Ефременко Е.Н., Верхуша В.В. Разложение токсичных фосфорсодержащих соединений под действием ферментативных и микробных иммобилизованных биокатализаторов.// 6-я Междунар. конф. «Сотрудничество для решения проблемы отходов», 2009, Харьков, 8-9 апреля, с.54-56.

34.Lyagin I.V.. Senko O.V., Ivanov R.V., Lozinsky V.I., Efremenko E.N., Varfolomeyev S.D. Biodestruction of neurotoxic organophosphorous pesticides in aqueous systems using heterogeneous biocatalysts.// Int. Conf. «Biocatalysis-2009: Fundamentals & Applications», 2009, Arkhangelsk, Russia, June 19-24, p. 104-105.

35.Lyagin I., Ivanov R., Lozinsky V., Efremenko E., Varfolomeyev S. Increase in stability of organophosphorus hydrolase by immobilization procédure.// XVII Int. Conf. on Bioencapsulation, 2009, Groningen, Netherlands, September 24-26, p. 146-147.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ:

ФОС - фосфорорганические соединения;

ФОВ - фосфорорганические отравляющие вещества;

ОРН - органофосфатгидролаза;

Hisi-OPH, Hisi2-OPH - ОРН, содержащая HiS(,- или His ^-последовательность на N-конце молекулы белка;

РМ - реакционные массы, полученные после химического уничтожения ФОВ;

вещество типа Vx - О-изобутил 8-(2-[бис-М,М-этил-амино]этил) метилфосфонотиоат;

МФК - метилфосфоновая кислота;

ИБЭМФК - О-изобутиловый эфир МФК;

ДИБЭМФК - О.О'-диизобутиловый эфир МФК;

криоПААГ - полиакриламидный криогель;

Со- или Cu-ША-крио-ПААГ - криоПААГ, модифицированный остатками иминодиуксусной кислоты (IDA) и заряженный ионами Со2+ или Си2";

АГЭ - аллилглицидиловый эфир;

ИПТГ - изопропил-р-О-тиогалактопиранозид.

Заказ № 153-а/10/09 Подписано в печать 28.10.2009 Тираж 150 экз. Усл. п.л. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; e-mail:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Лягин, Илья Владимирович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Каталитические характеристики и субстратная специфичность ОРН.

1.2. Полигистидинсодержащие белки и носители для их иммобилизации.

1.2.1. Полигистидинсодержащие белки.

1.2.2. Полигистидинсодержащие производные органофосфатгидролазы.

1.2.1. Носители для иммобилизации ро1уН1з-содержащих белков.

1.3. Биокатализаторы на основе иммобилизованной ОРН и её производных.

1.4. Фосфонаты и методы их деструкции.

1.4.1. Химическая детоксификация ФОВ: проблема и методы её решения.

1.4.2. Деструкция С-Р связи в фосфоновых кислотах и их производных.

1.4.2.1. Щелочной и кислотный гидролиз.

1.4.2.2. Деструкция С-Р связи в фосфонатах с использованием металл о комплексов

1.4.2.3. Окислительное разрушение С-Р связи в фосфонатах.

1.4.2.4. Термическое разложение метилфосфоновой кислоты.

1.4.2.5. Биодеструкция С-Р связи в фосфонатах.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Реактивы.

2.1.2. Используемые бактериальные штаммы.

2.1.3. Питательные среды.

2.1.4. Составы растворов.

2.1.5. Приборы.

2.2. Методы.

2.2.1. Трансформация компетентных клеток.

2.2.2. Биосинтез фермента Шэ^-ОРН.

2.2.3. Биосинтез фермента Шэб-ОРН.

2.2.4. Получение носителей для металл-хелатирующей хроматографии.

2.2.5. Получение иммобилизованных препаратов органофосфатгидролазы, модифицированных полигистидиновыми последовательностями.

2.2.6. Электрофоретический анализ белков в ПААГ.

2.2.7. Определение концентрации белка.

2.2.8. Кинетические исследования реакции гидролиза Параоксона, катализируемой ро1уЬКз-аналогами ОРН в растворимой форме.

2.2.9. Кинетические исследования реакции гидролиза Параоксона, катализируемой ро1уШз-аналогами ОРН в иммобилизованной форме.

2.2.10. Исследование температурного оптимума действия ро1уЬП$-аналогов ОРН в растворимой и иммобилизованной формах.

2.2.11. Термоинактивация растворимых и иммобилизованных ро1у№$-аналогов ОРН

2.2.12. Изучение операционной стабильности биокатализагоров на основе иммобилизованных ро1уШБ-аналогов ОРН.

2.2.13. Получение и регидратация сухих иммобилизованных препаратов ро1уШз-аналогов ОРН.

2.2.14. Электронная микроскопия криоПААГ.

2.2.15. Кинетические исследования реакций гидролиза фосфонатов, катализируемых ЭДэб-ОРН в растворимой форме.

2.2.16. Кинетические исследования реакций гидролиза фосфонатов, катализируемых №б6-ОРН в иммобилизованной форме в защитном материале.

2.2.17. Кинетические исследования реакций гидролиза фосфонатов, катализируемых ИБб-ОРН в иммобилизованной форме в проточной системе.

2.2.18. Определение концентрации фосфат-ионов.

2.2.19. Определение концентраций МФК и муравьиной кислоты.

2.2.20. Определение концентрации формальдегида.

2.2.21. Определение концентрации метана.

2.2.22. Определение концентрации метанола.

2.2.23. Определение концентрации фосфонатов.

2.2.24. Определение концентрации вещества типа Ух.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Белок Шб12-ОРН и его свойства в свободном и иммобилизованном состоянии.

3.1.1. Биосинтез и иммобилизация белка Иб^-ОРН.

3.1.2. Влияние рН и температуры на каталитические характеристики Иб^-ОРН в растворимой форме.

3.1.3. Каталитические характеристики Шб^-ОРН в растворимой форме.

3.2. Свойства иммобилизованных биокатализаторов на основе №Бб-ОРН и Н1812-ОРН.

3.2.1. рН-зависимость активности иммобилизованных биокатализаторов.

3.2.2. Влияние температуры на свойства иммобилизованных биокагализаюров.

3.2.3. Каталитические характеристики иммобилизованных биокатализаторов в отношении различных субстратов.

3.2.4. Стабильность иммобилизованных биокатализаторов при хранении и периодическом использовании.

3.2.5. Получение сухих форм иммобилизованных биокатализаторов.

3.2.6. Исследование возможности масштабирования объёма иммобилизованного биокатализатора.

3.3. Применение растворимой и иммобилизованной форм His6-OPH в процессе гидролиза фосфонатов.

3.3.1. Растворимая форма His6-OPH в реакциях гидролиза фосфонатов.

3.3.1.1. Каталитические характеристики гидролиза ИБЭМФК и ДИБЭМФК под действием His6-OPH.Ill

3.3.1.2. Каталитические характеристики гидролиза МФК под действием Швб-ОРН

3.3.1.3. Кинетическая модель процесса ферментативного гидролиза различных ФОС в составе РМ, полученных после химической детоксификации вещества типа

3.3.1.4. Ферментативный гидролиз ФОВ в составе РМ, полученных после химической детоксификации вещества типа Vx.

3.3.1.5. Ферментативный гидролиз ФОС в составе РМ, полученных после химической детоксификации вещества типа Vx.

3.3.1.6. Механизм реакции гидролиза МФК под действием His6-OPH.

3.3.2. Иммобилизованная His6-OPH в реакциях разложения фосфонатов.

3.3.2.1. Иммобилизованная His6-OPH в составе защитного материала.

3.3.2.2. Разложение фосфонатов в проточных системах под действием иммобилизованных биокатализаторов.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Иммобилизованные биокатализаторы на основе полигистидинсодержащих производных органофосфатгидролазы: получение и свойства"

Деградация токсичных веществ, привносимых человеком в окружающую среду, связана с необходимостью решения комплекса важных научных, экологических, социальных и экономических проблем. Задача разложения нейротоксичных фосфорорганических соединений (ФОС), к числу которых относятся применяемые в сельском хозяйстве пестициды (Кумафос, Метил-паратион, Малатион и др.), а также фосфорорганические отравляющие вещества — ФОВ (Зарин, Зоман, УХ), имеет большое значение и весьма актуальна, поскольку сотни тысяч тонн этих веществ, произведённых в последние полвека, представляют серьёзную экологическую угрозу при хранении, а в случае пестицидов - и при использовании. Так, в США ежегодно производится 620 тыс. т пестицидов, в странах Европейского Союза - 320 тыс. т, в России - 100 тыс. г [1], в то же время не существует эффективной и приемлемой для окружающей среды технологии разложения этих веществ. Фосфорорганические пестициды применяют при возделывании самых разнообразных сельскохозяйственных культур, и, как правило, в избыточных количествах, что приводит, с одной стороны, к сохранению и увеличению урожая, а с другой — к накоплению фосфорсодержащих пестицидов в почве, грунтовых водах и растениях. Проникновение ФОС в организм человека может происходить перрорально вместе с водой и продуктами питания, ингаляторно — при дыхании, а также трансдермально при непосредственном контакте с ними. ФОС оказывают на организм человека нейротоксичное воздействие, которое в зависимости от концентрации ФОС может быть острым или отдалённым. Также ФОС являются мутагенами, вызывающими 1 хромосомную аберрацию, при этом негативный эффект, как правило, носит кумулятивный характер. В связи с этим разработка высокоэффективных средств детоксификации ФОС является весьма актуальной задачей.

Стоит отметить, что в настоящее время уничтожение запасов ФОС осуществляется путём их сжигания или обработкой щелочными агентами [2], что помимо всего прочего является малоэффективным и неэкологичным решением проблемы. Так, после обработки щёлочью часть ФОС остаётся негидролизованной, а следовательно, конечный продукт разложения является токсичным для человека [3].

Гораздо проблематичнее обстоят дела с ФОВ, которые должны быть уничтожены согласно Международной конвенции о запрещении разработки, производства, хранения и использования химического оружия [4]. Запасы ФОВ на территории России составляют 32,3 тыс. т, половина из которых представлена наиболее токсичным веществом типа Ух (15,5 тыс. т) [5]. Согласно принятым в РФ методам уничтожения ФОВ [6], остаточные концентрации ФОВ в получаемых реакционных массах (РМ) достигают 0,1 мас.%, кроме того, продукты разложения ФОВ также являются токсичными для человека [7]. Дальнейшая детоксификация образующихся РМ является -крайне важной задачей, поскольку конечный продукт разложения должен соответствовать нормативам токсикологической и экологической безопасности [7], а это означает, что разложение фосфонатов, как наиболее токсичных компонентов РМ, должно быть максимальным.

Детоксификация различных ФОС с помощью биологических систем имеет ряд преимуществ, а именно: она проходит в мягких условиях, и продукты гидролиза, как правило, являются биологически деградируемыми. Под мягкими условиями здесь понимается то, что детоксификация проводится при слабощелочных или нейтральных значениях рН и температуре 20-25°С. В связи с этим особый интерес представляют ферменты, гидролизующие ФОС, и возможность использования генов, кодирующих их биосинтез, для интенсификации процессов их продуцирования, последующего выделения и применения для решения задач уничтожения ФОС. Было установлено, что на сегодняшний день наиболее активным ферментом, осуществляющим биодеструкцию ФОС, является органофосфатгидролаза (ОРН, ЕС 3.1.8.1, арилдиалкилфосфатаза), катализирующая гидролиз эфирной связи в производных ортофосфорной и фосфоновой кислот.

Направленная генетическая модификация фермента, обеспечивающая существенное упрощение процедуры выделения фермента, является одним из основных направлений исследований учёных во всем мире, цель которых освоение промышленного производства ОРН для решения задач деградации ФОС [8]. Так, например, созданная генетическая конструкция, кодирующая синтез рекомбинангной ОРН, содержащей гексагистидиновую последовательность на 1ч1-конце молекулы белка (№зб-), позволяет проводить очистку и выделение такого фермента в одну стадию за счёт образования множественных координационных связей между молекулой гибридного белка и металл-хелатирующими носителями [9].

Актуальной представляется разработка иммобилизованных ферментных препаратов с ОРН-активностью для детоксификации ФОС в проточных системах на муниципальных и сельскохозяйственных очистных сооружениях. Присутствие ФОС показано в речных и грунтовых водах [10-11], при этом их содержание существенно превышает ПДК [3]. Очевидно, что актуальной научной задачей является поиск и создание каталитически активных иммобилизованных препаратов ОРН, которые в ближайшее время смогли бы найти широкое применение на практике. Использование металл-хелатирующих носителей не столько для выделения и очистки, сколько для иммобилизации ферментов, содержащих дополнительно введённую аминокислотную последовательность, вступающую в аффинное взаимодействие с носителем [9], может стать перспективным способом для получения иммобилизованных препаратов ОРН. Прочное координационное связывание фермента с носителем делает такую систему удобной для использования её в проточных режимах в процессах разложения ФОС, что в технологическом плане, несомненно, имеет огромное значение.

Как было отмечено выше, ФОВ также являются субстратами ОРИ [12]. Известно, что их ферментативный гидролиз может осуществляться не только когда ФОВ взяты в виде чистых веществ, но и когда они находятся в составе РМ [13]. Однако до сих пор остаётся неизученным вопрос о возможности гидролиза других фосфорорганичееких компонентов РМ с помощью ОРН в свободном и иммобилизованном виде. В связи с этим глубокое разложение данных ФОС с помощью биокатализаторов на основе ОРН для детоксификации РМ позволит решить важную актуальную задачу.

В связи с этим целью данной работы была разработка биокатализаторов для разложения фосфорорганичееких пестицидов, ФОВ и продуктов химической нейтрализации ФОВ, на основе ОРН, модифицированной полигистидиноными (polyHis-) последовательностями и иммобилизованной на макропористых металл-хелагирующих носителях, представляющих собой полиакриламидный криогель (криоПААГ), модифицированный остатками иминодиуксусной кислоты (IDA) и заряженный ионами металлов (Си2+ или Со2+).

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Биотехпологцческий подход к решению многих природоохранных задач в настоящее время привлекает к себе всё большее внимание. Основой эффективных биотехнологических процессов может стать применение иммобилизованных ферментов, поскольку иммобилизация, с одной стороны, позволяет стабилизировать ферменты по отношению к воздействию различных факторов: органических растворителей, высоких температур, рН среды и др., а с другой стороны, с помощью иммобилизации получают ферментные биокатализаторы, которые можно многократно использовать без существенных изменений их исходных свойств. Особый интерес для проведения иммобилизации представляют металл-хелатирующие носители, позволяющие совмещать выделение, очистку и иммобилизацию ро1уШз-содержащих белков в одну технологическую стадию [14].

Основным действующим компонентом данных биокатализаторов мог бы стать фермент ОРН. который на сегодняшний день достаточно хорошо охарактеризован. Его широкая субстратная специфичность и высокая каталитическая активность по отношению к ФОС позволяет рассчитывать на его использование для их эффективной детоксификации.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Лягин, Илья Владимирович

ВЫВОДЫ

1. Впервые получен фермент шбп-орн и проведён сравнительный анализ свойств ро1у№з-производных ОРН. Показано, что длина ро1уН1*8-последовательности существенно влияет на каталитические и физико-химические характеристики растворимой формы фермента, а её увеличение приводит к появлению у белка склонности к олигомеризации.

2. Разработаны новые иммобилизованные биокатализаторы на основе ро1у№з-производных ОРН за счёт их координационного связывания с металл-хелатирующим носителем ГОА-криоПААГ, заряженным ионами Си2+ или Со2+. Проведено совмещение процесса иммобилизации с очисткой фермента при использовании для получения иммобилизованных биокатализаторов ферментных препаратов разной степени очистки.

5. Впервые установлена каталитическая активность Шэб-ОРН в отношении МФК, а также её моно- и диэфиров, определены каталитические константы в отношении данных субстратов. Предложен механизм действия шзй-ОРН в реакции разрыва С-Р связи в МФК. Впервые установлена возможность проведения этой реакции при участии фермента ИБб-ОРН как в растворимой, так и в иммобилизованной форме.

6. Впервые установлена возможность разложения под действием ШБб-ОРН основных фосфорорганических компонентов в составе реакционных масс, получаемых после химического уничтожения вещества типа Ух и представляющих собой многосубстратные смеси. Предложена кинетическая модель, описывающая поведение Швб-ОРН в РМ. На основании данной модели выведены уравнения, устанавливающие зависимость концентраций каждого фосфорорганического компонента от времени действия фермента ШБб-ОРН с учётом всех входящих в данную смесь субстратов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Лягин, Илья Владимирович, Москва

1. Юфит С.С. .Яды вокруг нас. Вызов человечеству.// М.: «Классике стиль», 2002, 368 с.

2. Лобачева Г.К., Желтобрюхов В.Ф., Прокопов И.И., Фоменко А.П. Состояние вопроса об отходах и современных способах их переработки.// Волгоград: Изд-во ВолГУ, 2005, 176 с.

3. Вредные вещества в промышленности. // М.: «Химия», под ред. Лазарева Н.В., 1977, 3, 605 с.

4. Конвенция о запрещении разработки, производства, накопления и применения химического оружия и о его уничтожении.// Организация по запрещению химического оружия, 2005, 179 с.

5. Белецкая И.П., Новиков С.С. Химическое оружие в России.// Вести. РАН, 1995, 65(2), с.99-111.

6. Сборник инструктивно-методических документов по проблеме уничтожения химического оружия. Часть II. Фосфорорганические отравляющие вещества.// М.: ФУ «Медбиоэкстргш», 2001,1, 208 с.

7. Munro N.B., Talmage S.S., Griffin G.D., Waters L.C., Watson A.P., King J.F., Hauschild V. The sources, fate, and toxicity of chemical warfare agent degradation products.// Environ. Health Persp., 1999,107(12), p.933-974.

8. Ефременко E.H., Вотчитцева Ю.А., Алиев Т.К., Варфоломеев С.Д. Рекомбинантная плазмидная ДНК pTES-His-OPH и продуцент олигогистидинсодержащей органофосфатгидролазы. // Патент РФ № 2255975, 2005.

9. Lambropoulou D.A., Albanis T.A. Application of hollow fiber liquid phase microextraction for the determination of insecticides in water.// J. Chromatogr. A, 2005, 1072(1), p.55-61.

10. Pesticide residues in food and the environment.// WHO andFAO report, 2004, 383 p.

11. Ефременко E., Варфоломеев С. Ферменты деструкции фосфорорганических нейротоксинов.// Усп. биол. хим., 2004, 44, с.307-340.

12. Ефременко Е.Н., Вотчицева Ю.А., Курочкин И.Н., Варфоломеев С.Д., Гачок И.В., Завьялова Н.В., Капашин В.П., Холстов В.И. Способ ферментативного гидролиза боевых отравляющих веществ.// Патент РФ № 2296164, 2007.

13. Terpe K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems.// Appl. Microbiol. Biot., 2003, 60, p.523-533.

14. Dumas D.P., Caldwell S.R., Wild J.R., Raushel F.M. Purification and properties of the phosphotriesterase from Pseudomonas diminuta.il J. Biol. Chem., 1989, 264(33), p. 1965919665.

15. W.J. Donarski, D.P. Dumas, D.P. Heitmeyer, V.E. Lewis, F.M. Raushel. Structure-activity relationships in the hydrolysis of substrates by the phosphotriesterase from Pseudomonas diminuta.ll Biochemistry, 1989,28(11), p.4650-4655.

16. Benning M.M., Kuo J.M., Raushel F.M., Holden H.M. Three-dimensional structure of phosphotriesterase: an enzyme capable of detoxifying organophosphate nerve agents.// Biochemistry, 1994, 33, p.15001-15007.

17. Benning M.M., Kuo J.M., Raushel F.M., Holden H.M. Three-dimensional structure of the binuclear metal center of phosphotriesterase.// Biochemistry, 1995, 34, p.7973-7978.

18. Vanhooke J.L., Benning M.M., Raushel F.M., Holden H.M. Three-dimensional structure of the zinc-containing phosphotriesterase with the bound substrate analog diethyl 4-methylbenzylphosphonatc.// Biochemistry, 1996, 35, p.6020-6025.

19. Omburo G.A., Kuo J.M., Mullins L.S., Raushel F.M. Characterization of the zinc binding site of bacterial phosphotriesterase.// J. Biol. Chem., 1992, 267(19), p. 13278-13283.

20. Chae M.Y., Omburo G.A., Lindahl P.A., Raushel F.M. Utilization of copper as a paramagnetic probe lor the binuclear metal center of phosphotriesterase.// Arch. Biochem. Biophys., 1995,316(2), p.765-772.

21. Hong S.-B., Raushel F. Stereochemical constraints on the substrate specificity of phosphotriesterase.// Biochemistry, 1999, 38(4), p. 1159-1165.

22. DiSioudi B., Grimsley J., Lai K., Wild J. Modification of near active site residues in organophosphorus hydrolase reduces metal stoichiometry and alters substrate specificity.// Biochemistry, 1999,38(10), p.2866-2872.

23. Sergeeva V., Efremenko E., Kazankov G., Varfolomeyev S. Double effect of organic amines (activation and inhibition) on the phosphotriesterase.// J. Mol. Catal., B Enzym , 2000,10(6), p.571-576.

24. Ефременко Е., Сергеева В. Органофосфатгидролаза фермент, катализирующий деградацию фосфорсодержащих отравляющих веществ и пестицидов.// Изв. АН Сер. хим., 2001,10, с.1743-1749.

25. Wu C.-F., Cha H.J., Valdes J.J., Bentlcy W.E. GFP-visualized immobilized enzymes: degradation of PX by OPH in a packed column.// Biotechnnol. Bioeng., 2002, 77(2), p.212-218.

26. Вотчицева Ю., Ефременко E., Алиев Т., Варфоломеев С. Свойства гексагистидинсодержащей органофосфатгидролазы.// Биохимия, 2006, 71(2), с.216-222.

27. Hoffman A., Roedeer R.G. Purification of his-tagged proteins in non-denaturing conditions suggests a convenient method for protein interaction studies.// Nucleic Acids Res., 1991, 19(22), p.6337-6338.

28. Hochuli E., Dobeli H., Schacher A. New metal chelate adsorbent selective for proteins and peptides containing neighbouring histidine residues.// J. Chromatogr., 1987, 411, p.177-184.

29. Stiiber D., Matile H„ Garotta G. Immunological Methods.// Orlando, FL: Academic Press, Lefkovits I. (eds), Pernis B. (eds), 1990, 4, p.121-152.

30. Reznik G., Yu Y., Tarr G., Cantor C. Native disulfide bonds in plasma retinol-binding protein are not essential for all-trans-retinol-binding activity.// J. Proteome Res., 2003, 2(3), p.243-248.

31. Ma H.H., Yang L., Yang X.Y., Xu Z.P., Li B.L. Bacterial expression, purification, and in vitro N-myristoylation of fusion hepatitis В virus preSl with the native-type N-terminus.// Protein Expr. Purif., 2003,27(1), p.49-54.

32. Hung M., Gibbs C.S., Tsiang M. Biochemical characterization of rhinovirus RNA-dependent RNA polymerase.// Antivir. Res., 2002, 56(2), p.99-114.

33. Fujihara A., Tomatsu H., Inagasaki S., Tadaki Т., Utshida C., Himeno H., Muto A. Detection of tmRNA-mediated trans-translation products in Bacillus subtilis.ll Genes Cells, 2002, 7(3), p.343-350.

34. Chen H.-M., Chen K.-T. Production and characterization of glutathione-S-transferase fused with a poly-histidine tag.// Enzyme Microb. Tech., 2000,27, p.219-226.

35. Kowolik C.M., Hengstenberg W. The lactose transporter of Staphylococcus aureus: overexpression, purification and characterization of the histidine-tagged domains 1IC and 1IBЛ Eur. J. Biochem., 1998, 257(2), p.389-394.

36. Goel A., Colcher D., Koo J. Booth В., Pavlinkova G., Batra S. Relative position of the hexahistidine tag effects binding properties of a tumor-associated single-chain Fv construct.// Biochim. Biophys. Acta, 2000,1519, p. 13-20.

37. Yang S.J., Park N.H., Lee Т.Н., Cha J. Expression purification and characterization of recombinant levan fructotransferase.// Biotechnol. Appl. Biochem., 2002, 35, p. 199-203.

38. Woestenenk E.A., Hammarstrom M., van den Berg S., Hard T., Berglund H. His tag effect on solubility of human proteins produced in Escherichia coli: a comparison between four expression vectors.//./. Struct. Funct. Genomics, 2004, 5(3), p.217-229.

39. Mohanty A.K., Wiener M.C. Membrane protein expression and production: effects of polyhistidine tag length and position.// Protein Exprès. Purif, 2004, 33, p.311-325.

40. Гудков Д. А., Вотчицева Ю.А., Ефременко E.H. Гидролиз иараоксоиа, катализируемый оргаиофосфатгидролазой. содержащей полигистидиновую последовательность на С-конце молекулы белка.// Вестн. Моск. Ун-та, Сер. 2 Химия, 2006, 47(1), с. 15-19.

41. Березин И.В., Клячко H.JL, Левашов А.В., Мартинек К., Можаев В.В., Хмельницкий Ю.Л. Иммобилизованные ферменты.// М.: «Высшая школа», 1987, 7, 157 с.

42. Вотчицева Ю. Органофосфатгидролаза: получение генетически-модифицированных аналогов и анализ каталитических характеристик.// М.: Дисс. на соиск. степени к.х.н., 2006,165 с.

43. Gaberc-Porekar V., Menart V. Perspectives of immobilized-mctal affinity chromatography.// J. Biochem. Bioph. Meth., 2001, 49, p.335-360.

44. Porath J. Immobilized metal ion affinity chromatography.// Protein Expr. Purif., 1992, 3(4), p.263-81.

45. Методическое руководство к плазмиде pQE фирмы "Qiagen", 1991.

46. Lipopovâ P., Cemusovâ L., Spiwok V., Krâlovâ B. Immobilization of cold-active beta-galactosidase from Arthrobacter sp. C2-2.// XII Int. Workshop on Bioencapsulation, 2004, p.158-161.

47. Chaga G., Bochkariov D.E., Jokhadze G.G., Hopp J., Nelson P. Natural poly-histidine tag for purification of recombinant proteins on cobalt(Il)-carboxymethylaspartate crosslinked agarose.// J. Chromatogr. A, 1999, 864(2), p.247-256.

48. Lozinsky V., Galaev I., Plieva F., Savina I., Jungvid H., Mattiasson B. Polymeric cryogels as promising materials of biotechnological interest.// TRENDS Biotechnol., 2003, 21(10), p.445-451.

49. Plieva F.M., De Seta E., Galaev I.Yu., Mattiasson B. Macroporous elastic polyacrylamide monolith columns: processing under compression and scale-up.// Sep. Purif. Technol., 2009, 65(1), 110-116.

50. Bernaudat F., Btilow L. Rapid evaluation of nickel binding properties of His-tagged lactate dehydrogenases using surface plasmon resonance.// J. Chromatogr. A, 2005, 1066, p.219-224.

51. Efremenko E., Peregudov A., Kildeeva N., Perminov P., Varfolomeyev S. New enzymatic immobilized biocatalysts for detoxification of organophosphorus compounds.// Biocatal. > Biotransfor., 2005, 23(2), p. 103-108.

52. LeJeune K.E., Russell A.J. Covalent binding of a nerve agent hydrolyzing enzyme within polyurethane foams.// Biotechnol. Bioeng., 1996, 51(4), p.450-457.

53. LeJeune K.E., Mesiano A.J., Bower S.B., Grimsley J.K., Wild J.R., Russell A.J. Dramatically stabilized phosphotriesterase: polymers for nerve agent degradation.// Biotechnol. Bioeng., 1997, 54(2), p.105-114.

54. Dosoretz C., Armon R., Starosvetzky J., Rothschild N. Entrapment of parathion hydrolase from Pseudomonas spp. in sol-gel glass.// J. Sol-Gel Sci. Techn., 1996, 7, p.7-11.

55. Ackerman E.J., Liu J., Chenghong L. Proteins in a porous support.// Patent WO No. 02/068454 A2, 2002.

56. Lei C., Shin Y., Magnuson J.K., Fryxell G., Lasure L.L., Elliott D.C., Liu J., Ackerman E.J. Characterization of functionalized nanoporous supports for protein confinement.// Nanotechnology, 2006,17, p.5531-5538.

57. Lei C„ Shin Y., Liu J., Ackerman E.J. Entrapping enzyme in a functionalized nanoporous support.// J. Am. Chem. Soc., 2002,124, p.l 1242-11243.

58. Lei C., Soares T.A., Shin Y., Liu J., Ackennan E.J. Enzyme specific activity in fiinctionalized nanoporous supports.// Nanotechnology, 2009. doi: 10.1088/0957-4484/19 /12/125102.

59. Wang J., Bhattacharyya D., Bachas L.G. Orientation specific immobilization of organophosphorus hydrolase on magnetic particles through gene fusion.// Biomacromolecules, 2001, 2, p.700-705.

60. Shimazu M., Mulchandani A., Chen W. Thermally triggered purification and immobilization of Elastin-OPH fusions.// Biotechnnol. Bioeng., 2003, 81(1), p.74-79.

61. Tirrell D.A. Fusion protein microarrays and methods of use.// Patent US No. 7462463, 2008.

62. Gill I., Ballesteros A. Degradation of organophosphorous nerve agents by enzyme-polymer nanocomposites: efficient biocatalytic materials for personal protection and large-scale detoxification.// Biotechnol. Bioeng., 2000, 70(4). p.400-410.

63. Caldwell S.R., Raushel F.M. Detoxification of organophosphate pesticides using a nylon based immobilized phosphodiesterase from Pseudomonas diminuta.il Appl. Biochem. Biotechnol., 1991, 31(1), p.59-73.

64. Munnecke D.M. Properties of an immobilized pesticide-hydrolyzing enzyme.// Appl. Environ. Microb., 1977. 33(3), p.503-507.

65. Munnecke D.M. Hydrolysis of organophosphate insecticides by an immobilized-enzyme system.// Biotechnol. Bioeng., 1979, 21, p.2247-2261.

66. McDaniel C.S., Woskow M.Z., Kalis B. Method and apparatus for the treatment of fluid waste streams.// Patent US No. 2006/0286006, 2006.

67. Komives C., Osborne D., Russell A.J. Degradation of pesticides in a continuous-How twoiphase microemulsion reactor.// Biotechnol. Progr., 1994,10, p.340-343.

68. Forrest S.R., Elmore B.B., Palmer J.D. Activity and lifetime of organophosphorous hydrolase (OPH) immobilized using layer-by-layer nano self-assembly on silicon microchannels.// Catal. Today, 2007,120, p.30-34.

69. Caldwell S.R., Raushel F.M. Detoxification of organophosphate pesticides using an immobilized phosphodiesterase from Pseudomonas diminuta.il Biotechnol. Bioeng., 1991, 37, p.103-109.

70. Daunert S., Bachas L.G., Schauer-Vukasinovic V., Gregory K.J., Schrift G., Deo S. Calmodulin-mediated reversible immobilization of enzymes.// Colloid. Surface B, 2007, 58(1), p.20-27.

71. Richins R.D., Mulchandani A., Chen W. Expression, immobilization, and enzymatic characterization of cellulose-binding domain-organophosphorus hydrolase fusion enzymes.H Biotechnol. Bioeng., 2000, 69(6), p.591-596.

72. Mansee A.H., Chen W., Mulchandani A. Detoxification of the organophosphate nerve agent coumaphos using organophosphorus hydrolase immobilized on cellulose materials.// J. Ind. Microbiol. Biot., 2005, 32, p.554-560.

73. Andreopoulos F.M., Roberts M.J., Bentley M.D. Harris J.M., Beckman E.J. Russell A.J. Photoimmobilization of organophosphorus hydrolase within a PEG-based hydrogel.// Biotechnol. Bioeng., 1999, 65(5), p.579-588.

74. McDaniel C.S., McDaniel J., Wales M.E. Wild J.R. Enzyme-based additives for paints and coatings.// Prog. Org. Coat., 2006, 55, p. 182-188.

75. Singh A., Lee Y., Stanish E., Chang E., Dressick W.J. Method of making bioactive catalytic material.// Patent US No. 7348169, 2008.

76. Singh A., Dressick W.J., Lee Y. Method for making catalytic enzyme-modified textiles for active protection from toxins.// Patent US No. 7501259, 2009.

77. Chang E.L., Singh A., Lu Q., Hartshorn C. Immobilized metalchelate complexes for catalysis and decontamination of pesticides and chemical warfare nerve-agent.// Patent US No. 0054949, 2003.

78. Meng Z., Yamazaki T., Sode K. Enhancement of the catalytic activity of an artificial phosphodiesterase using a molecular imprinting technique.// Biotech. Letters, 2003, 25, p. 1075-1080.

79. Freedman L.D., Doak G.O. The preparation and properties of phosphonic acids.// Chem. Rev., 1957, 57(3), p.479-523.

80. Horiguchi M., Kandatsu M. Isolation of 2-aminoethane phosphonic acid from Rumen protozoa.// Nature, 1959,184(4690), p.901-902.

81. Hilderbrand R.L., Henderson T.G. The role of phosphonates in living system.// London: C.R.C. Press, 1989, p.5-30.

82. Small M.J. Compounds formed from the chemical decontamination of HD, GB, and YX and their environmental fate.// Fort Detrick, MD: U.S. Army Medical Bioengineering research and Development Laboratory, Tech rpt 8304, 1984, DTIC accession no. AD-A149515.

83. Handbook of Toxicology of Chemical Warfare Agents.// London: Academic Press, Gupta R.C. (eds), 2009, 1147 p.

84. Уткин А.Ю., Либерман Б.М., Кондратьев В.Б., Капашин В.П., Холстов В.И. Математическое описание процессов детоксикации фосфорорганических отравляющих веществ Л ЖРХО, 2007, LI(2), с.12-18.

85. Капашип В.П., Назаров В.Д., Голышков Д.В., Комиссаров А.В., Никифоров Г.Е., Судаков A.IO. Практические аспекты переработки реакционных масс после детоксикации фосфорорганических веществ.// Вести. ВАН, 2004, 4, с. 14-20.

86. Бардов В.В., Кунцевич А.Д., Петрунин В.А., Поляков B.C., Шелученко В.В. Способ уничтожения отравляющего вещества.// Патент РФ № 2042368, 1995.

87. Rabinowitz R. Synthesis of monoesters of phosphonic acids.// J. Am. Chem. Soc., 1960, 82, p.4564-4567.

88. Christol H., Marty C. Hydrolyse basique de phosphonates. II. Etude quantitative.// J. Orgonometal. Chem. 1968,12, p.471-478.

89. Ember L.R. Chemical weapons deadline as risk.// Chem. Engineer. News, 2006, 84(16). p.27-30.

90. Huggins M. Bond energies and polarities.// J. Am. Chem. Soc., 1953, 75(17), p.4123-4126.

91. Michaelis A., Benzinger E. Ueber das verhalten der phosphorsaure und nitrophosphenylsaure beim erhitzen mit natronkalk.// Bcrichte der deutschen chemischcn Gesellschaft, 1876, 9(1), p.517-518.

92. Griffin C.E., Peller R.P., Peters J.A. Phosphonic acids and esters. VIII. Facile hydrolytic cleavage of carbon-phosphorus bonds in pyrrylphosphonates and phosphine oxides.// J. Org. Chem., 1965, 30(1), p.91-96.

93. Bell V.L., Kosolapoff G.M. Synthesis of aromatic phosphonic acids and their derivatives. III. Some amino and hydroxy substituted acids.// J. Am. Chem. Soc., 1953, 75(20), p.4901-4903.

94. Doak G.O., Freedman L.D. 2-Hydroxy-4-aminobenzenephosphonic acid, an analog of p-aminosalicylic acid.//./. Am. Chem. Soc., 1953, 75, p.6307-6308.

95. Boduszek B. The acidic cleavage of pyridylmethyl(amino)phosphonatcs: formation of the corresponding amines.// Tetrahedron, 1996, 52(38), p.12483-12494.

96. Boduszek B., Halama A., Zon J. The cleavage of l-amino-2'-nitrobenzylphosphonates in a basic medium. Formation of the 3-amino-2,l-benzisoxazole derivatives.// Tetrahedron, 1997, 53(33), p.l 1399-11410.

97. Boduszek B., Halama A. A cleavage of some hydroxybenzil(a-amino)-phosphonates in a basic medium.// Phosphorus, Sulfur, and Silicon, 1998,143(1), p.l 51-158.

98. Doskocz M., Roszak S., Majumdar D., Doskocz J., Gancarz R., Leszczynski J. Theoretical studies on the mechanism of C-P bond cleavage of a model a-aminophosphonate in acidic condition.// J. Phys. Chem. A, 2008, 112, p.2077-2081.

99. Yakubovich A.Ya., Ginsburg Y.A., Makarov S.P. // Doklady Akad. Nauk S.S.S.R., 1950. 71, p.303.

100. Bengelsdorf I.S. An alkaline hydrolysis of trichloromethylphosphonic esters.// ./ Am. Chem. Soc., 1955, 77(24), p.6611-6612.

101. Pickard R.H., Robinson R., Kenner J. Organic chemistry.// Annu. Rep. Prog. Chem., 1920, 17, p.98.

102. Abramov V.S., Semenova L.P., Semenova L.G. // Doklady Akad. Nauk S.S.S.R., 1952, 84, p.281.

103. Berlin K.D., Taylor H.A. The reactions of aroyl halides with phosphates: esters of aroylphosphonic acids.//./. Am. Chem. Soc., 1964, 86(18), p.3862-3866.

104. Vichard C., Kadcn T.A. Phosphate and phosphonate ester hydrolysis promoted by dinuclear metal complexes.// Jnorg. Chim. Acta, 2002, 337, p. 173-180.

105. Mikolajczyk M., Midura W., Grzejszczak S. Synthesis of mono-and 1,4-dicarbonil compounds based on the oxygenation of phosphonate carbanions. Synthesis of dihydrojasmone, allethrone and methylenomycin.// Tetrahedron Lett., 1984, 25(23), p.2489-2492.

106. Drag M., Jezierski A., Kafarski P. First example of the chemical, oxidative cleavage of the C-P bond in aminophosphonate chemistry. The oxidation of 1-amino-1-(3,4-dihydroxyphenyl)methylphosphonic acid by NaI04.// Chem. Commun., 2004, 9, p. 11321133.

107. Sullivan P.A. Oxidation kinetics of methylphosphonic acid in supercritical water.// Massachusetts, IL: Thesis for the degree of Doctor of Philosophy in Chemical Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2003, 219 p.

108. Moniodis J.J., Webb J., Mathys G., Rose H., Mathews R. Catalytic Degradation of methylphosphonic acid using iron powder/iron oxides.// Australia: Commonwealth of Australia, Defence Science and Technology Organisation, 2005, 37 p.

109. Using supercritical water oxidation to treat hydrolysate from Vx neutralization.// Washington, DC: The National Academies Press, 1998, 82 p.

110. Zeleznick L.D., Myers T.C., Titchener E.B. Growth of Escherichia coli on methyl- and ethylphosphonic acids.// Biochim. Biophys. Acta, 1963, 78, p.546-547.

111. Dumora C., Marche M., Doignon F., Aiglc M., Cassaigne A., Crouzet M. First characterization of the phosphonoacetaldehyde hydrolase gene of Psendomonas aeruginosa.// Gene, 1997,197(1-2), p.405-412.

112. Quinn J.P., Peden J.M.M. Dick R.E. Carbon-phosphorus bond cleavage by gram-positive and gram-negative soil bacteria.// Appl. Microbiol. Biotechnol., 1989, 31, p.283-87.

113. Ternan N.G., McMullan G. The utilization of 4-aminobutylphosphonate as sole nitrogen source by a strain of Klayveromyces fragilis.ll FEMS Microbiol. Lett., 2000,184(2), p.237-240.

114. Krzysko-Lupicka T., Strof W., Kubs K., Skorupa M., Wieczorek P., Lejczak B., Kafarski P. The ability of soil-borne fungi to degrade organophosphonate carbon-to-phosphorus bonds J I Appl. Microbiol. Biotechnol., 1997, 48, p.549-552.

115. Wackett L.P., Shames S.L., Venditti C.P., Walsh C.T. Bacterial carbon-phosphorus lyase: products, rates, and regulation of phosphonic and phosphinic acid metabolism.// J. Bacteriol., 1987,169(2), p.710-717.

116. Scliowanek D., Verstraete W. Phosphonate utilization by bacterial cultures and enrichments from environmental samples.// Appl. Environ. Microbiol., 1990, 56. p.895-903.

117. Ternan N.G., Quinn J.P. In vitro cleavage of the carbon-phosphorus bond of phosphonopyruvate by cell extracts of an environmental Burkholderia cepacia isolate.// Biochem. Biophys. Res. Comm., 1998, 248(2), p.378-381.

118. LaNauze J.M., Rosenberg H., Shaw D.C. The enzymic cleavage of the carbon-phosphorus bond: Purification and properties of phosphonatase.// Biochim. Biophys. Acta, 1970, 212, p.332-350.

119. McMullan G., Quinn J.P. In vitro charactcrization of a phosphate starvation-independent carbon-phosphorus bond cleavage activity in Pseudomonas fluorescens 23F.// J. Bacteriol., 1994,176(2), p.320-324.

120. Metcalf W.W., Wanner B.L. Mutational analysis of an Escherichia coli fourteen-gene operon for phosphonate degradation, using Tnpho A elements.// J. Bacterial., 1993, 175, p.3430-3442.

121. Frost J.W., Loo S. Cordeiro M.L., Li D. Radical-based dephosphorylation and organophosphonate biodégradation.// J. Am. Chem. Soc., 1987,109. p.2166-2171.

122. Cordeiro M.L., Pompliano D.L., Frost J.W. Degradation and detoxification of organophosphonates: cleavage of the carbon-phosphorus bond.// J. Am. Chem. Soc., 1986, 108, p.332-334.

123. Avila L.Z., Draths K.M., Frost J.W. Metabolites associated with organophosphonate C-P bond cleavage: chemical synthesis and microbial degradation of 32P.-ethylphosphonic acid.// Bioorg. Med. Chem. Lett., 1991,1(1), p.51-54.

124. Avila L.Z., Bishop P.A., Frost J.W. Hydrocarbon and phosphate triester formation during homolytic hydrolysis of organophosphonium ions: an alternate model for organophosphonate biodégradation.// J. Am. Chem. Soc., 1991,113(6), p.2242-2246.

125. Cassaigne A., Lacoste A.-M., Neuzil E. Transamination non enzymatique des acids amines.// Biochim. Biophys. Acta, 1971, 252, p.506-515.

126. Martell A.E., Langohr M.F. Metal ion- and pyridoxal-catalysed transamination and dephosphonylation of 2-amino-3-phosphonopropionic acid. A new phosphonatase model.// J. Chem. Soc. Chem. Comm., 1977, 10, p.342-344.

127. Avila L.Z., Loo S.H., Frost J.W. Chemical and mutagenic analysis of aminomethylphosphonate biodégradation.// J. Am. Chem. Soc., 1987, 109(22). p.6758-6764.

128. Metealf W.W., Wanner B.L. Involvement of the Escherichia coli phn (psiD) gene cluster in assimilation of phosphorus in the form of phosphonates, phosphite. Pj esters, and P,.// J. Bacteriol., 1991.173(2), p.587-600.

129. Matys S.V., Laurinavichius K.S., Krupyanko V.l., Nesmeyanova M.A. Optimization of degradation of methylphosphonate analogue of toxic pollutants with direct C-P bond by Escherichia coli.ll Process Biochem., 2001, 36, p.821-827.

130. Matys S.V., Kuzmina N.M., Laurinavichius K.S., Nesmeyanova M.A. Effect of environmental factors on degradation of the C-P bond of methylphosphonate by Echerichia coli cells Л Process Biochem., 2004, 39, p. 1063-1071.

131. Jeong K.J., Lee S.Y. Enhanced production of recombinant proteins in Escherichia coli by filamentation suppression.// Appl. Environ. Microbiol., 2003, 69(2), p.1295-1298.

132. Glynou K., Ioruiou P.C., Christopoulos Т.К. One-step purification and refolding of recombinant photoprotein aequorin by immobilized metal-ion affinity chromatography.// Prot. Expr. Purif., 2003, 27, p.384-390.

133. Неорганическая биохимия.// M.: «Мир», под ред. Г. Эйхгорна, 1978,1, 711 с.-) | Л I

134. Rochu D„ Beaufet N., Renault F., Viguie N., Masson P. The wild type bacterial Co" /Co -phosphotriesterase shows a middle range thermostability.// Biochim. Biophys. Acta, 2002, 1594, p.207-218.

135. Amor-Mahjoub M., Suppini J.-P., Gomez-Vrielyunck N., Ladjimi M. The effect of the hexahistidine-tag in the oligomerization of HSC70 constructs.// J. Chromatogr. B, 2006, 844, p.328-334.

136. Wu J. Filutowicz M. Hexahistidine (His^-tag dependent protein dimerization: A cautionary tale.// Acta Biochim. Pol, 1999, 46(3), p.591-599.

137. Liu H.-L., Ho Y., Hsu C.-M. Molecular simulations to determine the chelating mechanisms of various metal ions to the Ilis-tag motif: a preliminary study.// J. Biomol. Struct. Dyn., 2003,21(1), p.31-41.

138. Marangoni A.G. Enzyme kinetics: a modern approach.// Hoboken, NJ: John Wiley & Sons, Inc., 2002, 229 p.

139. Ghanem E., Li Y., Xu C., Raushel F.M. Characterization of a phosphodiesterase capable of hydrolyzing EA 2192, the most toxic degradation product of the nerve agent VX.// Biochemistry, 2007, 46, p.9032-9040.

140. Taylor K.B. Enzyme kinetics and mechanisms.// New York: Kluwer Academic Publishers, 2002, 227 p.

141. Sunden H., Engqvist M., Casas J., Ibrahem I., Cordova A. Direct aminoacid catalyzed asymmetric a-oxidation of ketons with molecular oxygen.// Angew. Chem. Int. Ed., 2004, 43, p.6532-6535.

142. Резниченко С., Гореленков В., Шубина О., Шашков С., Шмидт Н., Барбулев С. Перцовский Г., Барбулев Д., Ананьев В. Сквозь огонь, кислоты, непогоду.// Химия и бизнес, 2007,1(80), с.47-49.

Информация о работе

Лягин, Илья Владимирович
кандидата химических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.02

Диссертация

Иммобилизованные биокатализаторы на основе полигистидинсодержащих производных органофосфатгидролазы: получение и свойства - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Иммобилизованные биокатализаторы на основе полигистидинсодержащих производных органофосфатгидролазы: получение и свойства - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы