Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональный анализ гена speA, супрессирующего патогенность бактерий рода Erwinia

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональный анализ гена speA, супрессирующего патогенность бактерий рода Erwinia"

На правах рукописи

Чернышев Сергей Вячеславович

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ГЕНА5Р£4, СУПРЕССИРУЮЩЕГО ПАТОГЕННОСТЬ БАКТЕРИЙ РОДА

Емуті А

специальность 03.01.03 - молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

18 НОЯ 2013

ПУЩИНО - 2013

005541062

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии растений филиала Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН и Пущинском государственном университете

Научный руководитель: Мельников Анатолий Александрович

кандидат биологических наук

Официальные оппоненты: Железная Людмила Алексеевна

доктор биологических наук, главный научный сотрудник лаборатории кристаллофизики и рентгеноструктурных исследований с использованием синхротронного излучения, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Солонин Александр Сергеевич,

кандидат биологических наук, заведующий лабораторией молекулярной микробиологии, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии и биохимии микроорганизмов РАН

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт фундаментальных проблем биологии РАН

Защита диссертации состоится «19» декабря 2013 г. в 15 ч 30 мин на заседании совета Д.002.038.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142290, Московская обл., г. Пущино, ул. Институтская, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, Московская обл., г. Пущино, ул. Институтская, 3.

Автореферат разослан «_» ноября 2013 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета к.б.н.

Смолихина Татьяна Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Растения в природе сосуществуют с множеством микроорганизмов, рад из которых может либо вызывать различные заболевания растений, либо приносить им определенную пользу. Проблема взаимодействия микроорганизмов и растений в последнее время привлекает все большее внимание исследователей в различных областях биологии и сельского хозяйства. Возможность контроля процесса сосуществования микроорганизмов и растений представляется весьма интересной научной и актуальной в практической задачей и сулит немалые перспективы как в повышении продуктивности сельскохозяйственных растений, так и в борьбе с различными эпифитотиями в природе. Это, в свою очередь, предполагает более глубокое изучение различных этапов микробно-растительных взаимодействий, начиная с молекулярно-генетических механизмов распознавания в системе микроорганизм - хозяин, биохимии метаболитов, обеспечивающих этот процесс и заканчивая моделированием искусственных ассоциаций между растениями и бактериями. Бактерии рода Еп\>Ша являются представителями наиболее агрессивных фитопатогенов и способны вызывать различные заболевания у ряда растений. ЕгмШа сагоШога ввр. саго!о\юга, в частности, является возбудителем заболевания, называемого мягкая гниль. Эти бактерии поражают листья и стебли растений картофеля в период вегетации, а также клубни при хранении, чем наносят серьезный экономический ущерб. В связи с этим особую актуальность приобретает возможность контроля процесса патогенеза на разных его стадиях и изучение молекулярных механизмов супрессии патогенности, включая те из них, которые реализуются на уровне регуляции экспрессии генов.

Все имеющиеся на настоящий день подходы в защите растений от возбудителей различных заболеваний или вредителей можно подразделить на три основные группы: химические, биологические и аграрно-технические. Каждый из них имеет свои сильные стороны и недостатки как в плане эффективности борьбы с заболеваниями и вредителям, так и с точки зрения вредного воздействия на окружающую среду, человека и животных. Поэтому вопрос выбора более эффективного и дешевого метода защиты растений с наименьшими негативными последствиями для окружающей среды является актуальным. Достоинством биологических методов является специфичность и

длительность их воздействия на объект и возможность препятствовать размножению патогена. Исходя из этих соображений, внимание и научные интересы множества исследователей сосредоточены на поиске новых, более эффективных способов биологической борьбы с различными заболеваниями растений.

Цели и задачи исследования. Данная работа имела целью поиск, изучение и структурно-функциональный анализ генетической детерминанты, ответственной за супрессию патогенности бактерий рода Erwinia. В соответствии с поставленной целью решались следующие экспериментальные задачи:

1. Клонирование фрагментов геномной ДНК непатогенного вида Erwinia herbicola в различных бактериальных векторах и трансформация этими конструкциями клеток фитопатогенной бактерии Erwinia carotovora.

2. Скрининг, функциональная селекция и анализ трансформантов эрвиний.

3. Изучение in vitro и in vivo свойств селектированного штамма эрвиний. Исследование особенностей взаимодействия бактерий, утративших патогенность, с различными растениями.

4. Картирование и структурно-функциональный анализ элементов регуляции транскрипции и трансляции в составе плазмиды, супрессирующей патогенность.

Научная новизна. Результаты, полученные при выполнении данной работы, носят приоритетный характер. Получена плазмида рАМ28, которая супрессирует патогенность бактерий рода Erwinia при её введении в клетки фитопатогена. На плазмиде локализован ранее неизвестный ген speА, являющийся генетической детерминантой супрессии патогенности. Найдены и охарактеризованы регуляторные последовательности для транскрипции и трансляции гена. Обнаружен феномен одновременной инициации трансляции с использованием нескольких потенциальных последовательностей Шайна-Дальгарно и образованием белков разного размера. Впервые показано, что штамм Erwinia carotovora, содержащий плазмиду рАМ28 (штамм S14-13), способен не только колонизировать растения, но также менять их физиологическое состояние и защищать от действия фитопатогена. Практическая ценность работы. Полученные в работе новые данные о структуре промотора и сайтов связывания молекулы мРНК с рибосомой могут

быть применены для дальнейшего развития представлений о молекулярных механизмах регуляции экспрессии генов. Найденный на плазмиде рАМ28 сильный промотор РСН может быть использован для создания новых экспрессионных векторов с целью препаративного получения различных белков в бактериальной системе. При проведении исследований был модифицирован и усовершенствован тест на патогенность эрвиний, позволяющий за короткое время проводить скрининг большого количества трансформированных бактериальных клонов. Обнаруженный защитный эффект штамма эрвиний S14-13 позволяет начать разработку технологии защиты растений на основе их колонизации "обезоруженными " формами фитопатогенов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов, списка цитированной литературы. Работа изложена на 166 страницах машинописного текста, содержит 34 рисунка и 10 таблиц. Библиография включает 272 источника.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на II, III и XI Пущинских конференциях молодых ученых (Пущино, 1997, 1998, 2007); Отчетных конференциях Филиала института биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А Овчинникова (Пущино, 1997, 2001); VI и VIII чтениях, посвященных памяти академика Ю. А. Овчинникова (Пущино, 1998, 2006); открытом семинаре кафедры молекулярной биофизики Санкт-Петербургского университета (Санкт-Петербург, 2001); III съезде Биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002); международной научно-практической конференции "Перспективы и проблемы развития биотехнологии в рамках единого экономического пространства стран содружества" (Минск-Нарочь, 2005); конференции "Экология в меняющемся мире" (Екатеринбург, 2006); международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы биоэкологии" (Москва, 2008); Российской школе - конференции "Генетика микроорганизмов и биотехнология" (Москва-Пущино, 2008). Публикации. По материалам работы опубликовано 19 печатных работ, из них 3 статьи и 16 тезисов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Конструирование и свойства плазмиды рАМ28 1.1. Получение и фенотипический анализ первичных трансформантов

эрвиний

Геномную ДНК Египта ЬегЫсо1а АТСС 27155 (далее Е. ИегЫсо1а) гидролизовали рестриктазой ЕсоШ. Для клонирования использовали фрагменты неполного гидролиза размером более 20 т.п.н. Проводили дотирование полученного препарата ДНК с векторной плазмидой рБИРЮб и трансформировали лигазной смесью клетки Егм/Ша сагоШога Бвр. сагоШога АТСС 495 (далее Е. сагоШога 495). При селекции трансформанов на агаризованной среде ЬВ с тетрациклином были отобраны семь клонов, утерявших способность к деградации ткани клубней картофеля. Во всех клонах были обнаружены плазмиды, размер которых варьировал от 50 до 200 т.п.н. Клоны отбирали, используя разработанный метод анализа эрвиний на патогенность. Все клоны были протестированы на способность к мацерации ткани клубней, листьев и стеблей картофеля. Было показано, что все полученные трансформанты хорошо растут при 37° С, не обладают способностью к мацерации растительной ткани и по данным свойствам аналогичны донорному штамму Е. ИегЫсо1а. Кроме этого проводили испытания трансформантов, а также штаммов Е. сагоШога 495, Е. сагоШога Бвр. а/гг«ер//са В2 и Е. ИегЫсо1а на способность к автолизу в жидкой среде без аэрации, которую оценивали по десятибалльной шкале. Уже через 8 часов инкубации при температуре 28° С был заметен лизис клеток Е. с. ШгохерИса В2 и большинства трансформантов, в то время как клетки Е. с. с. 495 и через сутки не проявляли признаков автолиза. Лизис клеток Е. ЬегЫсо1а стал заметен лишь через 16 часов инкубации. При анализе фенилаланиндезаминазной активности было показано, что исследуемые клоны отличаются от донорного и реципиентного штаммов отсутствием таковой (Мельников с соавт., 1996).

1.2. Конструирование и рестрикционное картирование плазмиды рАМ28 ДНК плазмиды размером около 50 т.п.н. из невирулентного клона 27 гидролизовали рестриктазой ВатШ и полученые фрагменты лигировали с вектором рРСУ701. Трансформацию эрвиний осуществляли методом электропорации. Трансформанты отбирали по устойчивости к канамицину и тестировали их на патогенность. При проведении анализа двух

трансформантов, потерявших способность разлагать ткань клубней картофеля, выяснилось, что в клетках каждого из клонов содержится несколько плазмид различной молекулярной массы. Плазмидной ДНК, выделенной из одного клона, трансформировали клетки Е. carotovora 495. Среди трансформантов были отобраны несколько невирулентных клонов, несущих одну небольшую плазмиду размером около 2,7 т.п.н., названную нами рАМ28 (Мельников с соавт., 1996). Штаммы Е. carotovora 495и Е. carotovora В15, а также Е. с. atroseptica В2 неоднократно трансформировали плазмидой рАМ28. Во всех случаях бактерии при введении плазмиды теряли способность разлагать картофельные клубни. Таким образом, было сделано предположение о присутствии на плазмиде гена, супрессирующего патогенность эрвиний и названного нами speA (suppressing pathogenicity of Erwinia). Штамм E. carotovora 495, содержащий плазмиду pAM28, получил название S14-13. Секвенирование гена 16S РНК штамма S14-13 подтвердило его таксономическую принадлежность к виду Е. carotovora. При рестрикционном анализе плазмиды рАМ28 на ней были обнаружены уникальные сайты для рестриктаз: EcoiRl, SalI, Not\, Mfe\, Neil, Sphl, Dral, Seal.

Рис.2. Рестрикционная карта плазмиды рАМ28. На карте отмечены уникальные сайты. Численные значения обозначают координаты каждого сайта относительно сайта EcoSl, принятого за точку отсчета.

Для локализации взаимного расположения на плазмиде сайтов рестрикции и определения расстояний между ними осуществляли одновременный гидролиз двумя и тремя рестриктазами и проводили разделение продуктов гидролиза в агарозном и полиакриламидном гелях. В итоге была построена рестрикционная карта плазмиды рАМ28 (рис.1).

ЕсоШ (2)

Dra I (2022) Sph I (1961) SacП(1887^ Nor I (1881). 5д/1(1805).____

Nde I (573)

spe A

1. 3. Гибридизационный и ПЦР - анализы рАМ28

Для подтверждения происхождения плазмиды геномные ДНК штаммов Е. ЪегЫсо1а 271, Е. саго1о\юга 495, векторную плазмиду рБиРШб и плазмиду рАМ28, взятую в качестве положительного контроля, гидролизовали рестриктазой ЕсоШ, а плазмиду рРСУ701 рестриктазой ВатШ и фракционировали в 0,8 % агарозном геле. Затем образцы ДНК из геля были перенесены на нитроцеллюлозную мембрану. Перенесенные образцы ДНК гибридизовали с меченной [<ШТР-Ыо]-ДНК рАМ28, использованной в качестве зонда. Результаты гибридизации представлены на рис. 2А. Видно, что плазмида рАМ28 гибридизуется лишь с собой и геномной ДНК Е. кегЫсо1а, что является доказательством того, что источником генетического материала для конструирования плазмиды действительно послужила геномная ДНК Е. ЬегЫсо1а. Неожиданным оказалось отсутствие сигналов на дорожках, соответствующих векторным плазмидам. Это означало отсутствие их

Рис. 2. А. Саузерн блот-

Г1.11. г

гибридизация плазмиды рАМ28 с различными ДНК: 2000 " " 2-Е. ИегЫсо1а-,

1500 3 - Е. с. е.; 4 - р8ЦР106; 5 -1420 рРСУ701. Б. Проведение

1000 гщр с использованием 7>0

различных ДНК в качестве матрицы: 1 - геномная ДНК Е. с. с.\ 2 - геномная ДНК Е. ИегЫсо1а\ 3 - рАМ28;

материала в составе рАМ28. Следовательно, сайт инициации репликации на плазмиде ведет свое происхождение не из векторных плазмид, а из геномной ДНК Е. ИегЫсо1а. Этот факт мы объясняем процессами рекомбинации, происходящими при введении в клетки природного штамма эрвиний гетерогенного генетического материала.

В результате полимеразной цепной реакции, проведенной с праймерами, специфичными к последовательности плазмиды рАМ28, было также показано образование фрагмента ожидаемого размера при использовании в качестве

матрицы геномной ДНК Е. herbicola (рис. 2 Б). Секвенирование полученного ПЦР-фрагмента подтвердило его идентичность последовательности рАМ28.

1.4. Клонирование рАМ28 и ее фрагментов в клетках Е. coli

В то время как при трансформации клеток Е. coli векторными плазмидами pUC19 и pBluescriptKS+ мы наблюдали высокую степень компетенции, все наши попытки трансформировать эти клетки плазмидой рАМ28 оказались безуспешными. На этом основании были выдвинуто предположение о том, что либо ген speА, расположенный на плазмиде рАМ28, вызывает токсический эффект в Е. coli, либо механизм репликации плазмиды не пригоден для ее поддержания в клетках кишечной палочки. Однако нам удалось клонировать отдельные фрагменты плазмиды рАМ28 в различных векторах. Гидролиз рАМ28 рестриктазами Ecoitf и Sail приводил к образованию фрагментов размером 1,8 и 0,9 т.п.н., которые клонировали в векторе pBluescriptKS+ (плазмиды pD49 и pD18, соответственно). В этом векторе были также клонированы фрагменты рАМ28 размером 930 п.н. и 1770 п.н., образующиеся при ее расщеплении по сайтам Mfe\ и £соRI (плазмиды pD06 и pD15), и фрагмент размером 870 п.н., образующийся при гидролизе рестриктазами SalI и Mfe I (плазмида pD12). Всеми полученными генетическими конструкциями трансформировали клетки Е. carotovora. В15 и выяснили, что трансформанты при их тестировании на дисках клубней картофеля не утратили патогенности. Следовательно, целостность структуры гена, ответственного за супрессию патогенности эрвиний при клонировании фрагментов плазмиды либо нарушена, либо на ряде фрагментов он отсутствует.

1.5. Исследование способности клеточных лизатов эрвиний к мацерации

растительной ткани

Нами была исследована мацерирующая активность клеточных лизатов эрвиний разных штаммов в отношении ткани картофельных клубней. Клеточные лизаты Е. herbicola, Е. carotovora. 495, Е. carotovora S14-13, полученные путем разрушения бактериальных клеток ультразвуком и стерилизации через мембранные фильтры, наносили на диски клубней картофеля, помещенные в лунки иммунологического планшета. В качестве контролей использовали суспензионные клеточные культуры эрвиний. Отрицательным контролем служила микробиологическая среда LB.

Инкубацию дисков проводили при температуре 28° С в течение суток. Мацерирующую активность клеток и лизатов оценивали через 8, 16 и 24 часа. Проведенные исследования показали, что как клетки, так и клеточный лизат Е. сагоШога 495 способны разрушать ткань картофельных клубней. Полное разрушение картофельных дисков клетками происходило уже через 8 часов инкубации. Мацерирующая активность лизата была несколько ниже, и полное разрушение растительной ткани наступало в период от 16 до 24 часов инкубации. В отличие от Е. сагоШога 495 и клетки, и клеточный лизат Е. ЪегЫсо1а не проявляли мацерирущей активности. Аналогичным образом вели себя и препараты эрвиний Е. сагоШога 814-13. Было также показано, что клеточный лизат 814-13 не ингибировал мацерации ткани клубней картофеля лизатом патогенного штамма. На основании полученных данных был сделан вывод, что супрессия патогенности трансформантов происходит, вероятнее всего, из-за отсутствия одного или нескольких компонентов энзиматического аппарата, участвующего в деградации растительной ткани, и что ген .чреА может играть роль регулятора вторичного метаболизма при трансформации эрвиний плазмидой рАМ28.

2. Свойства штамма Е.сагоШога 814-13 2.1. Влияние бактерий Е.сагоШога 814-13 на изолированные листья табака и картофеля и целые растения Для изучения воздействия бактерий Е. сагоШога 814-13 на листья табака и картофеля изолированные листья обрабатывали суспензией клеток и культивировали на поверхности агаризованной среды М8 в чашках Петри в течение 10 дней в стандартных условиях для выращивания растений. За прошедший период времени не было замечено фенотипических изменений ни у контрольных листьев, ни у листьев, обработанных бактериальными клетками. При этом было показано, что клетки эрвиний способны оставаться в жизнеспособном состоянии на поверхности листьев табака в течение этого периода времени даже при отсутствии непосредственного контакта с питательной средой. Аналогичные исследования проводились также на целых растениях. Растения колонизировали бактериями Е. сагоШога 814-13 и через 3,5 - 4 недели инкубации проверяли на верхушечных листьях их наличие. Было показано, что клетки бактерий способны сохраняться и распространяться от места непосредственного контакта по всему растению по мере его роста и

образовывать с ним стабильную ассоциацию. С целью определения устойчивости растительно-микробной ассоциации в ряду поколений был проведен ряд пассирований колонизированных растений табака и картофеля. При этом растения, непосредственно обработанные бактериальной суспензией, принимались за растения 0-го поколения, растения, выращенные из их апикальных частей - за потомков 1-го поколения и так далее. Были проанализированы растения до 4-го поколения, и установлен факт сохранения ассоциации с микроорганизмами. Это позволяет говорить о способности штамма S14-13 к устойчивой колонизации растений. При подсчете плотности популяции бактериальных клеток нами была получена величина 7x102 - 103 КОИ/см2 листовой поверхности.

2. 2. Проявление защитного эффекта на растениях табака и картофеля, колонизированных E.carotovora S14-13 Поскольку бактерии Е. carotovora S14-13, заселяющие листья и исходно являвшиеся фитопатогенами, занимают некую экологическую нишу, было сделано предположение о возникновении конкурентных отношений между этими бактериями и патогенными эрвиниями и о проявлении в той или иной степени защитного эффекта. Для проверки этого проводили колонизацию листьев картофеля и табака бактериями Е. carotovora S14-13, затем обрабатывали их суспензией клеток патогенного штамма Е. carotovora В15 и культивировали на свежей среде MS. К концу вторых суток поражение контрольных листьев составляло 100%. В то же время колонизированные

листья оставались без фенотипических изменений (рис. 3) (Чернышов с соавт., 2007).

Рис. 3. Влияние колонизации на устойчивость к заражению патогенным штаммом эрвиний изолированных листьев: а) табака и б) картофеля.

Аналогичный эксперимент проводили и на целых растениях табака и картофеля, заражая их клетками Е. саго^ога.В15, спустя 4 недели после колонизации. Заражение осуществляли путем нанесения суспензии бактериальных клеток на срез листового

черешка одного из верхушечных листьев, а также накалывая листовую пластинку иглой, смоченной суспензией патогенных бактерий.

Рис. 4. Влияние колонизации на устойчивость к заражению патогеном целых растений: а) табака и 6) картофеля.

Уже через сутки на контрольных растениях табака на месте точечного укола на листе возникла зона мацерации мезофилла (рис. 4а). От черешка разрушение ткани также распространилась на стебель. Еще через сутки зона инфекции распространилась от места заражения вверх и вниз по стеблю и стала охватывать другие листья. На колонизированных растениях инфицированный черешок подсох, и распространения инфекции на стебель не произошло. На листе вокруг точки укола также образовалось небольшое (около 5 мм в диаметре) пятно некротического усыхания, в дальнейшем более не изменившееся в размерах. На третьи сутки контрольное растение было поражено наполовину, стебель побурел и надломился, а колонизированное сохранилось без дальнейших изменений вплоть до окончания вегетации. На контрольных растениях картофеля процесс развития патогенеза проходил с еще большей скоростью, чем на табаке. К концу третьих суток внутренние ткани всего растения оказались полностью разрушенными (рис. 4 б). Таким образом был продемонстрирован эффект защиты от патогена при колонизации растений бактериями Е. carotovora S14-13. На основании результатов проведенных исследований нами был предложен способ защиты растений путем их колонизации штаммами "обезоруженных" фитопатогенов (Чернышов с соавт., 2007).

2. 3. Изменение физиолого-морфологических характеристик колонизированных растений в период их вегетации

На начальных этапах индивидуального развития ни колонизированные, ни контрольные растения не проявляли между собой физиологических и морфологических различий. Однако позднее было замечено, что к окончанию вегетационного периода контрольных растений, когда у них началось увядание

и отмирание листьев и потемнение корней, колонизированные растения продолжали оставаться без видимых фенотипических изменений (рис. 5).

Рис. 5. Фенотипические различия надземных частей (а) и корневых систем (б) контрольных и колонизированных растений табака, наблюдаемые к концу вегетации контрольных растений.

Проявлять признаки старения они начали лишь спустя 40-45 суток после окончания вегетационного периода у контрольных растений. Вероятной причиной такого различия между колонизированными и неколонизированными растениями мог быть синтез микроорганизмами фитогормонов и вследствие этого изменение гормонального статуса растений. Проанализировав характер фенотипических различий между контрольными и колонизированными растениями табака, мы сделали предположение о действии вещества цитокининовой природы. Для проверки этого были проведены биотесты на цитокининовую активность культуральных жидкостей после культивирования различных штаммов эрвиний: Е. саШоуога 495, Е. саго1о\'ога 814-13 и Е. ИегЫсо1а 271. Наличие цитокининовой активности в культуральных жидкостях проверяли на проростках АтагапШ саийаШэ по спектрофотометрическому определению в них концентрации (3-цианинов. Было показано, что цитокининовая активность культуральной жидкости после выращивания Е. саго^ога 814-13 на 43% превышает активность в контроле, в качестве которого использовалась минимальная среда М9. Активности культуральных жидкостей после культивирования других эрвиний также были выше, чем контрольного образца, но существенно меньше, чем в случае с 814-13. Так для Е. ИегЫсо1а 271 эта величина составляла 13%, а для Е. сагоШога 495 - 16%. Тонкослойная хроматография суммарной фракции цитокининов, экстрагированных из культуральных жидкостей после выращивания различных эрвиний, выявила зоны низкомолекулярных соединений различной природы среди которых могут содержаться и вещества с цитокининовой активностью.

колонизированное не колонизированное

3. Структурно-функциональный анализ плазмиды рАМ28 3.1. Определение и анализ нуклеотидной последовательности плазмиды

рАМ28

Для дальнейшего изучения и локализации генетической детерминанты, отвечающей за супрессию патогенности эрвиний, было проведено определение полной нуклеотидной последовательности плазмиды рАМ28. Последовательность определяли по двум цепям с применением стратегии получения делеционных мутантов с взаимоперекрывающимися участками. Для получения делеционных мутантов использовали отобранные ранее конструкции, pD18 и pD49, содержащие клонированные фрагменты плазмиды. Плазмида рАМ28 оказалась состоящей из 2704 п.н. В ходе поиска потенциальных кодирующих участков на плазмиде удалось выявить несколько открытых рамок считывания (ОРС), среди которых две были наиболее протяженными. Одна из них длиной 906 п.н., несет информацию о белке, имеющем в своем составе 302 аминокислоты. Размер второй ОРС гена speА -1104 п.н., и она способна кодировать полипептид, состоящий из 368 аминокислотных остатков. Информация о размере продукта гена speА является уточненной. Ранее, основываясь на результатах частичного секвенирования плазмиды (Чернышов с соавт., 1999), мы полагали, что ОРС гена короче и кодирует белок, состоящий из 166 аминокислот. Данная ОРС локализована между сайтами рестрикции Neil и Sphl. ОРС гена меньшего размера располагается сонаправленно вслед за первой через 196 п.н. При анализе последовательности, разделяющей эти два гена, был обнаружен палиндромный участок, состоящий из 31 нуклеотида и способный к образованию шпилечной структуры. Это не единственная палиндромная последовательность на плазмиде рАМ28. Помимо него были найдены еще три такие структуры. Все они располагаются между сайтами £coRI и Neil на относительно небольшом расстоянии друг от друга. Был проведен биоинформационный анализ всех палиндромных последовательностей, который позволил определить термодинамические показатели устойчивости шпилек, образуемых этими палиндромами, а также их структуры. Все шпильки представляют собой петлю, образованную 4 или 5 неспаренными нуклеотидами на стебле из 10-13 пар нуклеотидов. В формировании стебля принимают участие как канонические пары, так и пары G - U, характеризующиеся не уотсон-криковским

взаимодействием. Смысловое значение наличия на плазмиде рАМ28 этих структур остается невыясненным. Они могут выполнять функцию, как терминаторов транскрипции, так и регуляторных элементов, участвующих в процессе репликации плазмиды и экспрессии, расположенных на плазмиде генов.

3.2. Картирование сигналов транскрипции на плазмиде рАМ28

Предварительный анализ нуклеотидных последовательностей межгенных участков плазмиды рАМ28 позволил выявить на одном из них, расположенном между сайтами рестрикции EcoR\ и Mfel, зоны, обладающие сходством с каноническим промотором. Здесь были обнаружены промотор-подобные последовательности, условно обозначенные как "А" и "В" (рис. 6) и имеющие значительное сходство с консенсусом в потенциальных "-35" (ТТСАСА)и "10" (ТАТААТ) областях. В обоих случаях размер спейсерного участка между областями"-35" и "-10" составлял 16 п. н. Хотя эта величина и отличается от оптимальной, спейсеры такого размера достаточно часто встречаются в выборке промоторов Е. coli (Lisser & Margalit, 1993).

- 35А

TCCCTATGC TiT С GACC С С С GG T G

двойной повтор -10А_-35В _

CAATATCAATATATGATAAAACT

_двойной повтор_- 10В

TGAAAACCGAAAATAATCCGCTA

| start

1IACTGGGTTATATGGGCTACCGG TTTATACACATTGAAA

Рис.6. Расположение и структура элементов потенциального промотора на плазмиде рАМ28.

Поскольку текстуальное соответствие консенсусу не является достаточным для функционирования элемента генома в качестве промотора, транскрипционный аппарат бактериальной клетки использует дополнительные сигналы, дискриминирующие подлинные промоторы от других последовательностей ДНК (Ozolin' et al., 2002). К их числу можно отнести А/Т-треки, способные к индукции изгиба двойной спирали (Marini et al, 1982), и легко деформируемые динуклеотиды TG, ТА, С A (Trifonov, 1991). Прямые и инвертированные повторы могут служить потенциальными сайтами

связывания с факторами регуляции транскрипции (Yagil, 1991). Проанализировав детально последовательность плазмиды рАМ28, мы обнаружили, что элемент "-35" промотор-подобного участка "В" ATGATA фланкирован слева А-Т богатым двойным прямым повтором с последовательностью СААТАТ. Еще один А-богатый двойной повтор GAAAA располагается в пределах спейсерной последовательности и затрагивает область "-10 В". Кроме того, имеется последовательность ТАААА, пересекающаяся с регионом "-35В". Вся проанализированная область ДНК богата динуклеотидами TG, ТА, CA. Таким образом, анализ нуклеотидной последовательности плазмиды показал, что участок, предваряющий ген speА, содержит большинство функциональных элементов, характерных для промотора. Теоретически вероятны две стартовые точки транскрипции. Одна для промотора "А", начинающаяся нуклеотидом G, на расстоянии 793 нуклеотида от сайта рестрикции EcoRl; другая для промотора "В", начинающаяся нуклеотидом А и отстоящая от этого сайта на 815 нуклеотидов. Известные данные о структуре промоторов Е. coli были ранее формализованы в виде компьютерного алгоритма поиска промоторов "PlatProm", использованного для картирования сигналов транскрипции в геномах Е. coli и Salmonella tiphymurium (Brock-Volchanski et al., 2004; Ozoline & Deev, 2006). "PlatProm" помимо консервативных элементов, распознаваемых основной сигма-субъединицей РНК-полимеразы, учитывает и ряд других, перечисленных выше, структурных особенностей промоторной ДНК и рассматривает ее как единую платформу для взаимодействия и с РНК-полимеразой, и с различными регуляторными белками. Мы воспользовались данной программой для сканирования последовательности плазмиды рАМ28 и поиска потенциальной стартовой точки транскрипции. Сканирование производилось по обеим цепям ДНК, начиная с первого нуклеотида сайта рестрикции EcoRl, и с разной степенью вероятности выявило на них несколько вероятных стартовых точек транскрипции. Точка с максимальной степенью соответствия старту транскрипции оказалась расположенной на одной из цепей на расстоянии 816 п. н. от этого сайта. Эти данные согласуются с данными, полученными ранее, поэтому наиболее вероятно, что транскрипция инициируется с промотора "В". Результаты компьютерного анализа последовательности плазмиды рАМ28, представлены на рис. 7.

L—

М/с 1

\

/ímRI

g -8-

o-

-9 -

-10

500 8|" 1000

1500

2000

2500

Gcnctic coordinates

Рис. 7. Графические результаты сканирования нуклеотидной последовательности плазмиды рАМ28 программой "PlatProm". Серым цветом обозначены места расположения потенциальных ОРС.

Видно, что помимо основного имеются и другие места возможной локализации потенциальных промоторных областей, но с меньшей вероятностью. Такие точки обнаружены как на кодирующей, так и на комплементарной цепи ДНК. Однако они не связаны с наличием протяженных открытых рамок считывания.

3.3. Анализ транскрипционной активности in vitro предполагаемого

Экспериментальное подтверждение активности предполагаемого промотора было получено нами при проведении транскрипции in vitro в реакции однократной инициации (Kajitani & Ishihama, 1983). Матрицей для синтеза РНК служили линеаризованная по сайту EcoRl плазмида рАМ28 и ее ПЦР-фрагмент размером 788 пар нуклеотидов, полученный при использовании праймеров SV1 и SV3. Праймеры для синтеза ДНК были подобраны таким образом, чтобы последовательность предполагаемого промотора отстояла от 5' конца кодирующей нити фрагмента не менее чем на 200 н., а размер синтезируемого транскрипта был удобен для идентификации после проведения электрофореза в полиакриламидном геле. При использовании в качестве матрицы линеаризованной плазмиды, расчетный размер транскрипта от старта до конца линейной молекулы должен составлять 1888 нуклеотидов. В эксперименте были получены два транскрипта. Размер одного из них, 1890 н., близок к расчетному. Размер второго был равен 870 нуклеотидам. Природа его

промотора

Рис. 8. Результаты проведения транскрипции in vitro. В левой части - электрофореграмма РНК-фрагментов, синтезированных с различных матриц: 1-я дорожка - маркеры мол. массы; 2-я дорожка - с ПЦР-фрагмента; 3-я дорожка — с линеаризованной плазмиды рАМ28. В правой части дано схематичное изображение матриц с промотором, обозначенным прямоугольником, и транскриптов, обозначенных серой линией. Приведены теоретически рассчитанные размеры транскриптов.

остается невыясненной. Возможно, что он является результатом неспецифической инициации транскрипции для данной матрицы в условиях in vitro. С ПЦР-фрагмента плазмиды синтезируется транскрипт размером 538 нуклеотидов при расчетной величине 530 (Рис. 8). Таким образом, сопоставление размеров синтезируемых в эксперименте при использовании различных матриц меченых 32Р транскриптов с их теоретически рассчитанными размерами указывает на то, что с промотора "В", обозначаемого далее как РСН, действительно может инициироваться транскрипция нижележащих генов.

3.4. Клонирование промотора РСН и проверка его функциональной активности в клетках бактерий Для тестирования функциональной активности in vivo обнаруженного промотора РСН нами была разработана и осуществлена схема клонирования репортерного гена зеленого флуоресцентного белка egfp под данным промотором. На первом этапе в векторе рЕТ28Ь был клонирован ген egfp по сайтам Ndel и NotI. На следующем этапе в полученной конструкции, рЕТ28-EGFP, Т7 промотор вместе с операторной областью был заменен промотором РСН, синтезированным методом IIÍ IP с плазмиды рАМ28. Полученной итоговой конструкцией pPCH-EGFP трансформировали клетки Е. coli трех различных штаммов и клетки Е. carotovora. В15 Отрицательным контролем в нашем эксперименте служила плазмида pET28-EGFP. Результаты трансформации для всех штаммов были одинаковы: бесцветные бактериальные колонии в контроле и колонии, имеющие флуоресцирующую окраску (рис. 9).

E. colilр PCI I - EG F Р £.co///pET28-EGFP

£.c.c.B15//;PCH-EGFP £.c.c.BI5/pET28-EGFP

Рис.9. Флуоресценция бактериальных клеток, содержащих генетические конструкции с геном е^р, стоящим под различными промоторами.

Так было установлено, что при клонировании репортерного гена флуоресцентного белка под промотором РСН экспрессия гена наблюдается как в клетках кишечной палочки, так и в клетках эрвиний и в обоих случаях носит конститутивный характер.

3.5. Клонирование потенциальных последовательностей Шайна-Дальгарно и проверка их функциональной активности

Структурная часть гена ¡ре А представляет собой протяженную открытую рамку считывания (ОРС), начинающуюся кодоном АТЄ в положении 826 и заканчивающуюся терминирующим кодоном ТАА в положении 1933 (рис. 10).

start 1 start 2 start 3 start 4 start 5 826 1009 1111 1135 1393 Ec¡m PCH J sDij JsmJ J start 6 1432 Stop SD3Í

SD2 \ \ SD3

G GAAG tagcaaaaATG GGAAGG;tATG AAG AG G tagctATG

start 2 start 4 start 6

Рис.10. Схематичное расположение потенциальных последовательностей Шайна-Дальгарно и стартовых точек трансляции гена speА.

В пределах данной ОРС имеются 6 кодонов ATG, потенциально претендующих на роль инициирующих. Перед тремя из них располагаются пурин-богатые участки, в большей или меньшей степени обладающие сходством с последовательностью Шайна-Дальгарно (SD). Три других кодона, в положениях 826 (start 1), 1111 (start 3) и 1393 (start 5) лишены последовательностей SD.

Нами была поставлена задача тестирования всех возможных участков инициации трансляции как изолированно, так и в нативном генетическом окружении плазмиды рАМ28 для экспрессии гена egfp. Для этого была разработана схема их совместного клонирования в векторе под промоторм РСН (рис. 11). Все семь полученных конструкций были использованы для трансформации клеток Е. coli и проверки функциональной активности in vivo различных последовательностей Шайна-Дальгарно. По флуоресценции трансформированных клеток было показано, что эффективная трансляция репортерного гена происходила лишь тогда, когда перед ним располагались

Bgm.

Bglп

Bglü

BgЛ1

Bgm

Bgm.

egfp

Noll

PCH

PCH

PCH

SD2

egfp

egfp

NotI

PCH SD1

PCH SD2

Bgm реи sd3

egfp egfp egfp egfp

Notl

Noll

pPCH-startö

pPCH-start4

pPCH-start2

pPCH-startl

pPCH-SDl

pPCH-SD2

pPCH-SD3

Рис. 11. Схема кассет, включающих в себя промотор РСН, репортерный ген е%[р и различные варианты потенциальных последовательностей ЭЭ.

последовательности 8П2 или 8БЗ, причем вне зависимости от наличия или отсутствия дополнительного генетического материала плазмиды рАМ28. Присутствие перед геном egfp последовательности ББ1 приводило к слабой его трансляции и свечению бактериальных клеток, заметному лишь под флуоресцентным микроскопом. Клетки Е. соИ, содержащие плазмиду рРСН-81аги, в которой между промотором РСН и геном egfp не было последовательностей Шайна-Дальгарно, не обладали способностью к флуоресценции. Таким образом, полученные экспериментальные данные свидетельствуют о различной функциональной активности всех трех

исследованных структур. На взаимодействие мРНК и рибосомы оказывают влияние и некоторые элементы 5'-нетранслируемой области, лежащие за пределами SD. К числу таких элементов относят трансляционные энхансеры, чаще всего A/U богатые последовательности мРНК, способные усиливать инициацию трансляции (McCarthy & Gualerzi, 1990). Анализ нуклеотидного состава последовательности плазмиды рАМ28 выявил между структурами SD1 и SD2 4 А/Т кластера, состоящие из 6 нуклеотидных остатков. Между SD2 и SD3 были найдены 6 А, Т или А/Т кластеров, состоящих из 5-8 нуклеотидов. В то же время перед SD1 обнаружено было всего 3 аналогичных кластера. Таким образом, последовательностям SD2 и SD3 в 5'-нетранслируемой области предшествует большее количество энхансер-подобных структур, чем SD1. Полученные данные не дают нам оснований утверждать, что эти повторы однозначно являются энхансерами трансляции, поскольку экспрессия гена egfp наблюдалась и при использовании изолированных SD2 и SD3. Вместе с тем мы не исключаем вероятности, что данные структуры могут оказывать влияние на инициацию трансляции.

3.6. Определение размеров GFP-содержащих химерных белков

Для ответа на вопрос - какая из трех последовательностей SD гена speА предпочтительно используется в клетке и, соответственно, с какого из потенциальных стартовых кодонов начинается трансляция гена - было решено определить размер GFP-содержащего химерного белка. Белок такой природы может синтезироваться в клетках Е. coli, трансформированных сконструированной ранее плазмидой pPCH-start6. В качестве отрицательного контроля служил белковый препарат, выделенный из клеток, трансформированных плазмидой pET28-EGFP. Эти клетки не синтезировали зеленого флуоресцирующего белка. Для положительного контроля были взяты образцы, полученные из клеток, трансформированных конструкциями рРСН-EGFP, pPCH-SD2 и pPCH-SD3. В первом случае размер GFP-содержащего белка равнялся 26,9 kDa, во втором и третьем случаях - 32 kDa. После проведения электрофореза клеточных белков в денатурирующих условиях была заметна флуоресценция в геле ряда белковых полос на дорожках, соответствующих тем пробам, которые не подвергались предварительному

А Б

1 23 4 5 М 1 234 5

Рис. 12. Электрофореграмма белков в препаратах из клеток Е. coli, трансформированных плазмидами: 1 - pPCH-SD2; 2 - pPCH-SD3; 3 - pPCH-EGFP; 4 - pPCH-start6; 5 - pET28-EGFP; M - маркеры молекулярной массы.

А. Флуоресценция в геле GFP-содержащих белков до их окрашивания Coomassie blue R-250. Б. Гель после фиксации и окрашивания Coomassie blue R-250.

прогреву перед нанесением (рис. 12 А). На дорожке, содержащей материал клеток, трансформированных плазмидой pPCH-start6, имеется дополнительная флуоресцирующая полоса белка более высокой молекулярной массы по сравнению с остальными пробами, что свидетельствует в пользу одновременного использования в этих клетках нескольких стартовых точек трансляции. После разделения тотальных клеточных белков тех же образцов, но уже подвергшихся термической обработке, было выявлено, что мажорная полоса у данного трансформанта располагается в районе маркерного белка с молекулярной массой 35 kDa, что соответствует преимущественному использованию в инициации трансляции последовательности SD3 (рис. 12 Б). В результате вестерн-блот анализа, проведенного с применением поликлональных антител к GFP, было показано, что помимо этого мажорного белка размером 32 kDa имеется ряд минорных сигналов, соответствующих белкам с молекулярными массами 44, 48 и 58 kDa (рис. 13). При сопоставлении численных значений теоретически рассчитанных молекулярных масс химерных GFP-содержащих белков, которые могут синтезироваться с использованием различных инициирующих кодонов, с массами, полученными в эксперименте, мы пришли к выводу об одновременном, но неравнозначном

12 3 4 5 6 7 8 кРа

58

48 44

32

Рис. 13. Вестерн-блот анализ с использованием поликлональных антител к ОБР препаратов клеток Е.соП, содержащих плазмиды: 1-маркеры молекулярной массы; 2 - рЕТ28-ЕОРР;

3 - рРСН-^аШ; 4 - рРСН-81ай2; 5- рРСП-ЕОРР; 6 - рРСН-ЭОЗ; 7- рРСН-БШ; 8 - рРСН^аПб.

участии в инициации трансляции всех трех последовательностей 80. Вопрос о происхождении высокомолекулярного продукта с массой 58 Ша остается открытым, поскольку неизвестно, является ли он димерной формой белка с молекулярной массой 32 к!3а, либо все же возможна инициация трансляции со стартовой точки 1, лишенной последовательности Вместе с тем на дорожке

4 обнаружились две полосы, соответствующие белкам с молекулярными массами 27 и 34 кОа. Согласно расчетам белок массой 27 Ша может синтезироваться при использовании стартового кодона, обладающего последовательностью 801. Неожиданным оказалось наличие второго, более интенсивного сигнала. Этот сигнал свидетельствует об инициации трансляции со стартовой точки 1. Причем для этого необходимо, по всей вероятности, присутствие нуклеотидной последовательности, расположенной между стартовыми точками 1 и 2, поскольку клонирование гена непосредственно под стартовую точку 1 не приводит к его экспрессии (рис. 13, дорожка 3). Таким образом, полученные данные позволяют говорить об одновременной инициации трансляции с использованием нескольких стартовых точек гена е^р, имеющего в своем составе 5'-концевую последовательность гена .чреА. При этом происходит синтез белковых молекул, различающихся между собой протяженностью и аминокислотной последовательностью М-копцевой части.

3.7. Клонирование и свойства гена speА

Ген spe А был клонирован в клетках Е. coli под собственным промотором в составе плазмид pPCHl-.speA и pPCffi-speA, сконструированных на основе вектора рЕТ28Ь. Полученными плазмидами трансформировали клетки Е. carotovora В15 и проводили проверку трансформантов на патогенность. Было показано, что все они, подобно штамму S14-13, потеряли способность к деградации ткани клубней картофеля. Тем самым была окончательно определена генетическая детерминанта супрессии патогенности эрвиний. Для подтверждения полученных ранее данных о стартовой точке инициации трансляции гена spe А и размере его белкового продукта проводили фракционирование в геле клеточных белков, выделенных из трансформантов Е. coli, экспрессирующих ген (рис.14 А). Видно, что на дорожках, соответствующих этим трансформантам, присутствуют несколько дополнительных по сравнению с контролем белков различной молекулярной массы. Однако наличие мажорной полосы белка размером 32 kDa означает, что трансляция мРНК гена spe А осуществляется в отличие от предыдущего эксперимента преимущественно с использованием последовательности SD2.

А I 2 М 3 Б М 1 2 3 4

Рис. 14. Электрофореграмма тотальных белков в препаратах,полученных из: А - клеток Е. соИ .трансформированных, плазмидами: 1- рРСН1-.5/5еА; 2- рЕТ28Ь;3- рРСН2-^еА; Б - клеток различных эрвиний: 1 -Е. сагового 814-13; 2 - Е. сагоГогога 495; 3-Е. сагоюуога В15; 4 - Е. ИегЫсо1а 271. М- маркеры молекулярной массы. Слева стрелками указаны белки, появляющиеся при экспрессии гена яре А и приведены численные значения их молекулярных масс.

Участие последовательности SD3 в инициации трансляции представляется, напротив, менее значительным. Усиление интенсивности полосы, соответствующей белку с массой 42 kDa может означать, что трансляция гена speА инициируется также и с первого кодона AUG. Таким образом, как и в экспериментах с GFP-гибридными белками, в данном эксперименте можно констатировать факт одновременной трансляции гена spe А с образованием белковых молекул разной молекулярной массы. На рис. 14 Б приведена для сравнения электрофореграмма клеточных белков эрвиний. На дорожке 1, где нанесен препарат белков штамма S14-13, заметна мажорная полоса белка с молекулярной массой 32 kDa. Вполне вероятно, что этот белок соответствует продукту гена speА.

Сравнение выведенной из нуклеотидной последовательности аминокислотной последовательности белка SpeA, состоящего из 368 остатков, с известными белками дает достаточно высокий процент его сходства (до 44%) с бактериальными белками семейства Pre (plasmid recombination enzyme). Характерно, что гомологию проявляет как раз N-концевая часть полипептида из 200 аминокислот. Напротив, С-концевая его часть не имеет заметного сходства с какими-либо белками. Предсказание вторичной структуры этой области белковой молекулы свидетельствуют о существенном преобладании в ее составе протяженных а-спиральных участков, до 77 %. Наиболее протяженный такой участок состоит примерно из 70 аминокислотных остатков. Дальнейший анализ последовательности при помощи программ "Coils" и "Multicoil" выявил, что именно этот участок может с максимальной вероятностью складываться в специфическую биспиральную, так называемую "coiled coil", структуру, ответственную за олигомеризацию белков (рис. 15).

1 _, Рис. 15. Результат анализа С-концевой

последовательности гена spe А, состоящей из 166 аминокислот, программой "COILS". Максимальная вероятность формирования

биспиральной (coiled coil) структуры показана для фрагмента

последовательности с 82-го до 153-го аминокислотного остатка

10 40 60 80 100 120 140 160 Г80

0.8 0.6 0.4 0.2

Этот факт может свидетельствовать в пользу предположения о регуляторном характере действия БреА, поскольку некоторые регуляторные белки, обладая подобной структурой, активны в виде димеров. Кроме того, как было также выявлено при анализе, белок 8реА обладает сильным положительным зарядом и может иметь сродство к ДНК.

Таким образом, хотя поиск гомологии и анализ структуры белка 8реА не дает прямого указания на возможный механизм его действия в супрессии патогенности эрвиний, можно предполагать, что он выступает в качестве регулятора экспрессии генов.

ВЫВОДЫ

1. Получена плазмида рАМ28, вызывающая подавление патогенности бактерий рода Египта. Селектирован штамм Егч/1та саггЯочога ввр. саШоуога 814-13, содержащий эту плазмиду и утративший патогенность.

2. Показана возможность колонизации растений табака и картофеля штаммом 814-13 и формирования устойчивой микробно-растительной ассоциации, сохраняющейся в ряду поколений при вегетативном размножении растений.

3. Продемонстрирована устойчивость колонизированных растений к заражению патогенным штаммом эрвиний и предложен альтернативный метод защиты растений при помощи "обезоруженных" штаммов фитопатогенов.

4. Выявлены физиолого-морфологические особенности колонизированных растений и увеличение их периода вегетации. Продемонстрировано наличие цитокининовой активности у бактерий-колонизаторов.

5. Локализована генетическая детерминанта, ответственная за супрессию патогенности эрвиний. Установлено, что это новый, ранее неизвестный ген ¡реА, предположительно выполняющий регуляторную функцию.

6. Обнаружены и исследованы в системах с репортерным геном зеленого флуоресцентного белка регуляторные элементы транскрипции и трансляции гена эреА. Определен промотор РСН гена, установлен факт множественности стартов трансляции с одновременным использованием нескольких последовательностей Шайна-Дальгарно и образованием с одной матрицы РНК белков различной молекулярной массы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в журналах

1. Мельников A.A., Бенц П., Чернышев C.B., Шалаи А. Конструирование и свойства плазмиды рАМ28, супрессирующей патогенность Erwinia carotovora. II Генетика. 1996. T. 32. С. 1167-1152.

2. Чернышев C.B., Мельников A.A., Бурьянов Я.И. Структура и функции гена speA Erwinia herbicola. II Молекулярная биология. 1999. Т. 33. С.165 - 169.

3. Чернышев C.B., Ермакова Ю.П., Захарченко Н. С., Георгиевская Е. Б., Бурьянов Я. И. Устойчивость к Erwinia carotovora растений, ассоциированных с модифицированными бактериями, утратившими патогенность. II Доклады РАН. 2007. Т. 416. С. 1-3.

Статьи в сборниках

1. Чернышев С. В., Ермакова Ю. П., Иванова Е. Г. Защита растений от фитопатогенов и изменение их физиолого-морфологических характеристик при колонизации модифицированными бактериями, утратившими патогенность. // Международная научно-практическая конференция "Актуальные проблемы биоэкологии". 2008. Москва. С. 184 - 187.

Тезисы докладов

1. Чернышев C.B., Мельников A.A., Бурьянов Я.И. Структура spe А гена Erwinia herbicola. II III Пущинская конференция молодых ученых. 1998. 27 -30 апреля. Пущино. С. 103 - 104.

2. Чернышев С. В., Мельников А. А., Бурьянов Я. И. Супрессия патогенности Erwinia carotovora. II IV чтения, посвященные памяти академика Ю.А.Овчинникова. 1998. 2- 12 ноября. Москва-Пущино. С. 81.

3. Чернышев C.B., Муранов A.B., Бурьянов Я.И. Особенности первичной структуры плазмиды рАМ28, несущей ген супрессии патогенности Erwinia carotovora. II Материалы открытого семинара кафедры молекулярной биофизики Санкт-Петербургского университета. 2001. 15 января. Санкт-Петербург. С. 46.

4. Чернышев C.B., Бурьянов Я.И. Структурно-функциональный анализ гена speA, супрессирующего патогенность Erwinia carotovora. // III съезд Биохимического общества. 2002. 26 июня - 1 июля. Санкт-Петербург. С. 418-419.

5. Чернышев C.B., Ермакова Ю.П., Бурьянов Я.И. Колонизирующий эффект бактерий рода Erwinia и его роль в защите растений от воздействия фитопатогена. // Конференция "Экология в меняющемся мире". 2006, 24 -28 апреля. Екатеринбург. С. 67 -68.

6. Чернышев C.B., Масулис И.С., Ермакова Ю.П., Бурьянов Я.И. Структурно-функциональный анализ промоторной области плазмиды рАМ28. // VIII чтения, посвященные памяти академика Ю.А.Овчинникова. 2006. Москва-Пущино. С. 54.

7. Ермакова Ю. П., Чернышев С. В. Новые данные о способности "обезоруженного" фитопатогена вступать в симбиоз с растениями и повышать их устойчивость к инфекции. // XIX зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". 2007. Москва. С. 70.

8. Ермакова Ю. П., Чернышев С. В., Масулис И. С., Бурьянов Я. И. Изучение регуляторных элементов гена speА. // 11-я Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века". 2007. Пущино. С. 79-80.

9. Ермакова Ю. П., Чернышев С. В., Масулис И. С., Бурьянов Я. И. Поиск и анализ регуляторных элементов трансляции и транскрипции гена speA, супрессирующего патогенность Erwinia carotovora. // XX зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". 2008. Москва. С. 38.

10.Чернышев С. В., Ермакова Ю. П., Иванова Е. Г. Защита растений от фитопатогенов и изменение их физиолого-морфологических характеристик при колонизации модифицированными бактериями, утратившими патогенность. // Международная научно-практическая конференция "Актуальные проблемы биоэкологии". 2008. Москва. С. 184 - 187.

11.Чернышев С. В., Масулис И. С., Гороховатский А. Ю., Бурьянов Я. И. Структура гена speА, супрессирующего патогенность Erwinia carotovora, и возможность альтернативной его трансляции. // Российская школа -конференция "Генетика микроорганизмов и биотехнология". 2008. Москва-Пущино. С. 94.

Подписано в печать 15.11.2013г. Печать лазерная

Заказ № 4793 Тираж: 75 экз.

Типография «І-'іхРгіМ» ИНН 503900523316 142290, Пущино, м-н «АБ», 22 (4967) 75-97-84 www.fix-print.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чернышов, Сергей Вячеславович, Пущино

ФИЛИАЛ ФЕДЕРАЛЬНОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО БЮДЖЕТНОГО

УЧРЕЖДЕНИЯ НАУКИ ИНСТИТУТА БИОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. АКАДЕМИКОВ М.М. ШЕМЯКИНА И Ю.А. ОВЧИННИКОВА РАН

На правах рукописи

04201451608

\

Чернышов Сергей Вячеславович

Структурно-функциональный анализ гена 5реА, супрессирующего патогенность бактерий рода Егтта

03.01.03 - молекулярная биология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук А.А. Мельников

Пущино - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ..........................................................................................6

ВВЕДЕНИЕ.......................................................................................7

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..........................................................10

1.1. Общая характеристика взаимодействий микроорганизмов с

другими организмами в природе..........................................................10

1.2. Фитопатогенные микроорганизмы.....................................................12

1.2.1. Общие сведения о фитопатогенах и симптоматике вызываемых

ими заболеваний........................................................................12

1.2.2. Классификация фитопатогенных микроорганизмов..............................14

1.2.3. Динамика патогенеза, обусловленного эрвиниями, вызывающими мягкие гнили...............................................................................16

1.3. Факторы вирулентности фитопатогенных бактерий...............................17

1.3.1. Экстраклеточные полисахариды эрвиний..........................................18

1.3.2. Экстраклеточные ферменты эрвиний, участвующие в деградации клеточной стенки растений...........................................................23

1.3.2.1. Эндопектатлиаза Pell.................................................................29

1.3.2.2. Экзо-полигалактуронатлиаза PelX.................................................30

1.3.2.3. Экзо-полигалактуронатлиаза PelW.................................................32

1.3.2.4. Олигогалактуронатлиаза Ogl........................................................33

1.3.2.5. Эндо-пектатлиаза PelZ................................................................34

1.3.2.6. Зависимость энзиматической активности пектиназ от двухвалентных катионов............................................................35

1.3.3. Харпины как факторы вирулентности бактерий..................................35

1.3.4. Структурная организация и регуляция экспрессии генов деполимеризующих ферментов......................................................40

1.3.4.1. Репрессор KdgR........................................................................41

4

1.3.4. 2. Репрессор PecS........................................................................42

1.3.4. 3. Репрессор РесТ........................................................................44

5 1.3.4. 4. Белок-активатор H-NS................................................................44

1.3.5. Секреция экстраклеточных факторов вирулентности

фитопатогенами, вызывающими мягкие гнили..................................46

1.3.5.1. Система секреции I типа.............................................................46

1.3.5.2. Система секреции II типа............................................................47

1.3.5.3. Система секреции III типа...........................................................48

1.4. Методы защиты растений от патогенов и вредителей.............................49

1.4.1. Химические методы защиты...........................................................49

1.4.2. Биологические методы защиты........................................................50

1.4.2.1. Создание трансгенных растений, устойчивых к фитопатогенам............50

1.4.2.2. Колонизация растений ассоциативной микрофлорой...........................52

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...................................................................................54

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ............................56

2.1. МАТЕРИАЛЫ...............................................................................56

2.1.1. Оборудование.............................................................................56

2.1.2. Реактивы и ферменты...................................................................56

2.1.3. Бактериальные штаммы плазмиды и праймеры...................................57

2.1.4. Среды и основные буферы.............................................................60

2.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ...........................................................63

2.2.1. Быстрое выделение небольших количеств плазмидной ДНК

методом щелочного лизиса...............................................................63

2.2.2. Модифицированный метод выделения плазмидной ДНК по Бирнбойму и Доли......................................................................63

2.2.3. Модифицированный метод скрининга плазмид в геле..........................64

2.2.4. Выделение геномной ДНК из бактериальных клеток...........................65

2.2.5. Приготовление электрокомпетентных клеток Е. coli и

Е. carotovora и процедура трансформации методом электропорации.......65

2.2.6. Проведение реакций модификации ДНК...........................................66

2.2.7. Получение делеционных производных плазмид..................................66

2.2.8. Определение и анализ первичной последовательности ДНК...................67

2.2.9. Приготовление ДНК-зондов и блот-гибридизация по Саузерну...............67

2.2.10. Определение патогенности эрвиний...............................................68

2.2.11. Определение фенилаланиндезаминазной активности..........................69

2.2.12. Получение клеточных лизатов эрвиний..........................................69

2.2.13. Тестирование мацерирующей активности клеточных лизатов

эрвиний.................................................................................69

2.2.14.Разделение тотальных клеточных белков путем электрофореза в SDS-денатурирующем полиакриламидном геле.................................70

2.2.15. Проведение иммуноблотинга......................................................70

2.2.16. Тестирование транскрипционной активности in vitro..........................71

2.2.17. Выделение тотальной РНК из клеток бактерий.................................72

2.2.18. Культивация растений табака и картофеля in vitro..............................73

2.2.19. Определение титра бактериальных клеток в суспензии.......................73

2.2.20. Биотестирование цитокининов......................................................74

2.2.21. Экстракция цитокининов............................................................74

2.2.22. Идентификация цитокининов.......................................................74

2.2.23. ПЦР-амплификация и секвенирование гена 16S рРНК........................75

2.2.24. Филогенетический анализ............................................................75

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.............................................76

3.1. Конструирование и свойства плазмиды рАМ28....................................76

3.1.1. Получение и фенотипический анализ первичных трансформантов эрвиний....................................................................................76

3.1.2. Конструирование и рестрикционное картирование плазмиды

рАМ28.....................................................................................77

3.1.3. Гибридизационный и ПЦР-анализы рАМ28.......................................80

3.1.4. Клонирование рАМ28 и ее фрагментов в клетках Е. coli........................81

3.1.5. Испытание различных штаммов эрвиний и трансформантов на устойчивость к антибиотикам........................................................82

3.1.6. Исследование свойств клеточных лизатов.........................................84

3.2. Свойства штамма S14-13.................................................................87

3.2.1. Влияние бактерий E.carotovora SI4-13 на изолированные листья

табака и картофеля..........................................................................87

3.2.2. Колонизация бактериями Е. carotovora S14-13 целых растений...............91

3.2.3. Проявление защитного эффекта на растениях табака и картофеля, колонизированных E.carotovora SI4-13............................................95

3.2.4. Изменение физиолого-морфологических характеристик колонизированных растений в период их вегетации............................98

3.3. Структурно-функциональный анализ плазмиды рАМ28........................101

3.3.1. Определение и анализ первичной последовательности

пл азмиды р АМ2 8......................................................................101

3.3.2. Картирование сигналов транскрипции на плазмиде рАМ28..................104

3.3.3. Анализ транскрипционной активности in vitro предполагаемого промотора...............................................................................109

3.3.4. Определение стартовой точки транскрипции гена egfp........................Ill

3.3.5. Клонирование промотора РСН и проверка его функциональной активности в клетках бактерий......................................................112

3.3.6. Клонирование потенциальных последовательностей Шайна-

Дальгарно и проверка их функциональной активности........................115

3.3.7. Определение размеров GFP-содержащих химерных белков...................121

3.3.8. Клонирование и свойства гена speА................................................126

3.3.9. Компьютерный анализ выведенных аминокислотных последовательностей, кодируемых генами rep и spe А.........................129

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.................................................................................135

ВЫВОДЫ........................................................................................141

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................142

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

РНК - рибонуклеиновая кислота

АФК - активные формы кислорода

ИСУ - индуцированная системная устойчивость

УФ - ультрафиолетовое излучение

ЭПС - экстраклеточные полисахариды

ЛПС - липополисахариды

РОФМ - розовоокрашенные факультативные метилобактерии

ПЦР - полимеразная цепная реакция

сАМР — циклический аденозин монофосфат

АТФ — аденозин трифосфат

п.н. - пар нуклеотидов

т.п.н. — тысяч пар нуклеотидов

QS — "quorum sensing", система контроля численности популяции микроорганизмов

CCI, CCII, CCIII - системы секреции I, II и III типа, соответственно PGA - полигалактуроновая кислота CMC - карбоксиметил целлюлоза MUC - метилумбиферил целлобиоза

HR - hypersensitive reaction, реакция гиперчувствительности

KDG - 2-кето-З-дезоксиглюконат

SD - последовательность Шайна-Дальгарно

RBS - ribosome binding site, сайт связывания с рибосомой

NAP — нуклеоид-ассоциированные белки

LB - микробиологическая питательная среда Лурия-Бертани

SDS, ДСН - додецилсульфат натрия

MS — растительная питательная среда Мурасиги и Скуга

EDTA - этилендиаминтетраацетат натрия

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Растения в природе сосуществуют с множеством микроорганизмов, ряд из которых может либо вызывать различные заболевания, либо приносить растениям определенную пользу. В связи с этим проблема взаимодействия микроорганизмов и растений в последнее время привлекает все большее внимание исследователей в различных областях биологии и сельского хозяйства. Возможность контроля процесса сосуществования микроорганизмов и растений представляется весьма интересной научной и актуальной практической задачей и сулит немалые перспективы как в повышении продуктивности сельскохозяйственных растений, так и в борьбе с различными эпифитотиями в природе. Это, в свою очередь, предполагает более глубокое изучение различных этапов микробно-растительных взаимодействий, начиная с молекулярно-генетических механизмов распознавания партнеров в системе микроорганизм - хозяин, биохимии метаболитов, обеспечивающих этот процесс и, заканчивая моделированием искусственных ассоциаций между растениями и бактериями.

Бактерии рода Е™\п\а являются представителями наиболее агрессивных фитопатогенов и способны вызывать различные заболевания у ряда растений. Егмша саго{о\юга эиЬзр. саго(оуога, в частности, является возбудителем заболевания, называемого мягкая гниль. Эти бактерии поражают листья и стебли растений картофеля в период вегетации, а также клубни при хранении, нанося тем самым серьезный экономический ущерб сельскому хозяйству. В связи с этим особую актуальность приобретает возможность контроля процесса патогенеза на разных его стадиях и изучение молекулярных механизмов супрессии патогенности, включая те из них, которые реализуются на уровне регуляции экспрессии генов.

Все имеющиеся на настоящий день подходы в защите растений от возбудителей различных заболеваний или вредителей можно подразделить на три основные группы: химические, биологические и аграрно-технические.

Каждый из них имеет свои сильные стороны и недостатки как в плане эффективности борьбы с заболеваниями и вредителям, так и с точки зрения вредного воздействия на окружающую среду, человека и животных. Помимо этого существует еще и экономическая составляющая. Часто для повышения результативности борьбы практикуют применение комбинированных методов. Поэтому в практическом сельском хозяйстве всегда является актуальным вопрос выбора более эффективного и дешевого метода защиты растений с наименьшими негативными последствиями для окружающей среды после или в процессе его применения. Биологические методы в отличие от химических всегда рассматривались как наиболее специфичные в отношении объекта воздействия и наименее вредные в отношении человека. Кроме того, их достоинством является длительность воздействия на патогены и возможность препятствовать их размножению. Исходя из этих соображений, внимание и научные интересы множества исследователей сосредоточены на поиске новых, более эффективных способов биологической борьбы с различными заболеваниями растений.

Цели и задачи исследования. Данная работа имела целью поиск, изучение и структрно-функциональный анализ генетической детерминанты, ответственной за супрессию патогенности бактерий рода Erwinia, а также возможность на ее основе создания технологии защиты растений от фитопатогена. В соответствии с поставленной целью решались следующие экспериментальные задачи:

1. Клонирование фрагментов геномной ДНК непатогенного вида Erwinia herbicola в различных бактериальных векторах и трансформация этими конструкциями клеток фитопатогенной бактерии Erwinia carotovora.

2. Скрининг, функциональная селекция и анализ трансформантов эрвиний.

3. Изучение in vitro и in vivo свойств селектированного штамма эрвиний. Исследование особенностей взаимодействия бактерий, утративших пато-генность, с различными растениями.

4. Картирование и структурно-функциональный анализ элементов регуляции транскрипции и трансляции в составе плазмиды, супрессирующей патогенность.

Научная новизна. Результаты, полученные при выполнении данной работы, носят приоритетный характер. Получена плазмида рАМ28, супрессирующая патогенность бактерий рода Егшта при её введении в клетки фитопатогена. На плазмиде локализован ранее неизвестный ген яре А, являющийся генетической детерминантой супрессии патогенности. Найдены и охарактеризованы регуляторные последовательности для транскрипции и трансляции гена. Обнаружен феномен одновременной инициации трансляции с использованием нескольких потенциальных последовательностей Шайна-Дальгарно и образованием белков разного размера. Впервые показано, что штамм Егшта сагоГоуога, содержащий плазмиду рАМ28 (штамм 814-13), способен не только колонизировать растения, но также менять их физиологическое состояние и защищать от действия фитопатогена.

Практическая ценность работы. Полученные в работе новые данные о структуре промотора и сайтов связывания молекулы мРНК с рибосомой могут быть применены для дальнейшего углубления представлений о молекулярных механизмах регуляции экспрессии генов. Найденный на плазмиде рАМ28 промотор РСН, являясь сильным промотором, может быть использован для создания новых экспрессионных векторов с целью препаративного получения различных белков в бактериальной системе. При проведении исследований был модифицирован и усовершенствован тест на патогенность эрвиний, позволяющий за короткое время проводить скрининг большого количества трансформированных бактериальных клонов. Обнаруженный защитный эффект штамма эрвиний 814-13 позволяет подойти к разработке технологии защиты растений на основе их колонизации "обезоруженными " формами фитопатогенов.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Общая характеристика взаимодействий микроорганизмов с другими организмами в природе

Мир микроорганизмов представляет собой огромную буферную систему планетарного масштаба, в которой происходит обмен веществом между живой и неживой природой. В естественных условиях любые живые организмы находятся в постоянном контакте с микроорганизмами на протяжении всей своей жизни. В одном случае эти взаимоотношения носят антагонистический характер и приводят к возникновению тех или иных инфекционных заболеваний, в других, диаметрально противоположных, наблюдается ярко выраженное взаимовыгодное сосуществование партнеров, которое позволяет им выживать в среде обитания.

Симбиотические ассоциации, которые микроорганизмы образуют с растениями и животными, широко варьируют по степени их взаимной близости. В широком научном понимании симбиоз охватывает все формы тесного продолжительного сожительства организмов разных видов, включая и паразитизм (Стейни-ер, 1979). При мутуалистическом (взаимовыгодном) симбиозе оба партнера выигрывают от ассоциации; при паразитическом симбиозе выгоду извлекает лишь один партнер. Природа симбиоза может находиться в зависимости от условий окружающей среды и изменяться при смене этих условий. Взаимоотношения, начавшиеся как взаимовыгодные, могут стать паразитическими, и наоборот. Если говорить о микроорганизмах, ассоциированных с растениями, то по характеру взаимоотношений с хозяевами их можно условно подразделить на пять групп (Kado, 1992): эпифиты, эядофиты, эктосимбионты, эндосгшбионты и фитопа-тогены. Растения обеспечивают им предпочтительную нишу, в которой эти бактерии могут наиболее эффективно конкурировать с другими микроорганизмами

Многие эпифитные бактерии образуют ассоциации с растением, заселяя поверхность их листьев или корней, и зависят от выделяемых растением питательных веществ. Эпифиты, обитающие на листовой поверхности представляют собой пигментированные грам-отрицательные микроорганизмы (Graham and Hodgkiss, 1967; Lund, 1969). Пигменты эпифитов выполняют защитную функцию и служат в качестве протекторов от солнеч