Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональные особенности митохондрий при экспериментальной гипертонии различного генеза

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональные особенности митохондрий при экспериментальной гипертонии различного генеза"

На правах рукописи

ДОРОЩУК АЛЕКСАНДР ДМИТРИЕВИЧ

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ МИТОХОНДРИЙ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ГИПЕРТОНИИ РАЗЛИЧНОГО ГЕНЕЗА

03 00 04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2007

003161798

Работа выполнена в лаборатории артериальной гипертензии Института клинической кардиологии Федерального государственного учреждения «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Росмедтехнологий, г Москва

Научный руководитель

доктор медицинских наук

А ЕО Постнов

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор

кандидат биологических наук

А А Болдырев А В Воротников

Ведущая организация Институт биохимии им А Н Баха РАН

Защита состоится 12 ноября 2007 года в 11 часов на заседании диссертационного совета К 208 073 02 в ФГУ РКНПК Росмедтехнологий по адресу 121522, Москва, 3-я Черепковская улица, 15 А

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУ РКНПК Росмедтехнологий

Автореферат разослан 12 октября 2007 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Т.И Венгерова

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Артериальная гипертензия - распространенное заболевание сердечно-сосудистой системы имеющее две формы первичную, причины которой до сих пор не выяснены и вторичные, причины которых достаточно хорошо известны Первичная гипертензия человека проявляется в основном как «беспричинное» стойкое повышение артериального давления, могущее привести к тяжелым осложнениям таким как инфаркт миокарда, нарушение мозгового кровообращения (кровоизлияние в мозг), сердечная или почечная недостаточность О значении гипертензии говорит тот факт, что по данным ВОЗ в мире насчитывается до миллиарда больных АГ разной степени тяжести

Первичная (эссенциальная) гипертензия человека является прототипом спонтанной, генетически детерминированной гипертонии крыс SHR (Spontaneously Hypertensive Rats) Для вторичных форм гипертонии, экспериментальными аналогами являются циклоспориновая, ДОКА солевая (стероидная) гипертония, почечная и гипертиреодиная (тиреотоксическая) гипертензии Всем этим формам экспериментальной патологии присущи основные черты их клинических прототипов Именно эта схожесть экспериментальных форм с клиническими делает исследование на экспериментальных моделях правомерным и вполне обоснованным, давая возможность использовать экспериментальные формы для исследований патогенеза и этиологии различных клинических форм гипертензии

Отправным пунктом настоящего исследования были ранее полученные нашей лабораторией данные о наличии при первичной гипертензии нарушений ион транспортной функции клеточных мембран и нарушений распределения внутриклеточного кальция и появлении избытка свободного кальция в цитозоле клеток и кальциевой перегрузке энергообразующих структур - митохондрий клеток (открытие по медицине, зарегистрированное под № 183 в Реестре Открытий СССР за 1983 г) Выявленная при этом секвестрация кальция в митохондриях клеток при гипертензии позволила, по инициативе Постнова Ю В и в последующем Постнова А Ю , обратиться к изучению их энергообразовательной функции Предполагалось, что кальциевая перегрузка митохондрий, вызывая недостаточность митохондриального энергообразования, может быть причиной повышения системного артериального дая тения, как меры коррекции нарушений метаболизма, вызванного дефицитом образования АТФ Указанные отношения могут приобретать патогенетическую значимость, присутствуя в ткани головного мозга, очень чувствительного к недостатку

энергии, что проявляется, в частности, известным рефлексом Кушинга (повышение системного АД при ограничении кровоснабжения стволовой части мозга)

Описанные выше положения послужили обоснованием необходимости детального изучения функционирования митохондриального аппарата клеток при различных экспериментальных формах АГ, моделирующих АГ человека Выполнению именно этой задачи посвящено настоящее исследование

Цель и задачи исследования

Цель настоящего исследования - оценить функциональное состояние изолированных митохондрий печени и мозга крыс при спонтанной гипертензии крыс (ЭИИ) и ее вторичных формах (циклоспориновая и ДОКА-солевая) и изучить влияние внемитохондриального Са2+ на образование АТФ при этой патологии В работе были поставлены следующие задачи

1 Изучить скорость синтеза АТФ изолированными митохондриями печени и мозга крыс, с помощью люциферин-люциферазного метода и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) при первичной гипертензии

2 Оценить сопряжение окисления и фосфорилирования в митохондриях при первичной гипертензии крыс и ее вторичных формах (циклоспориновая и ДОКА-солевая) в зависимости от внемитохондриального кальция

3 Определить скорость поглощения и выведения кальция из митохондрий печени крысы при спонтанной гипертонии и в норме с помощью ион селективного электрода.

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые в данной работе анализируются три вида артериальных гипертензий (спонтанная, циклоспориновая, ДОКА-солевая) с позиции энергетического дефицита, наблюдаемого при этой патологии Впервые делается попытка найти возможное соответствие между повышением артериального давления при АГ и функциональной недостаточностью митохондрий (недостаток синтеза АТФ) Впервые оценивается влияние ионов кальция на выделенные митохондрии при данных видах гипертензиий и сравнения их с нормотензивным контролем Впервые из всего вышеперечисленного делается попытка оценить АГ с позиции недостатка митохондриального дыхания и окислительного фосфорилирования, а также связать это с развитием артериальной гипертензии у крыс

Результаты, полученные в ходе этой работы позволяют лучше понять патогенез эссенциальной гипертензии человека и связать его с функциональной недостаточностью митохондрий Полученные данные дают возможность рассматривать новые механизмы, которые участвуют в повышении и поддержке артериального давления у животных, а в

перспективе и у человека, при спонтанной (первичной) и вторичных системных гипертензиях По результатам этой работы может сформироваться новое понимание гипертонии как болезни при которой основную роль играет недостаток митохондриапьного энергообразования (синтез АТФ), что впоследствии может привести к новым взглядам на профилактику и терапию артериальной гипертензии и к созданию новых классов гипотензивных препаратов

Апробация работы

Материалы исследования были представлены на Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы артериальной гипертонии» (22-24 апреля 2003 г, Москва), Конгрессе ассоциации кардиологов стран СНГ (18-19 сентября 2003 г, Санкт-Петербург), на XIVom Международном конгрессе по артериальной гипертензии (13-17 июня 2004 г, Париж, Франция), а также 27 сентября 2007 г на межлабораторном семинаре НИИ экспериментальной кардиологии

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 9 работ

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы Работа изложена на 129 страницах машинописного текста, содержит 26 рисунков и 9 таблиц Список литературы включает более 150 источников

Материалы и методы

Экспериментальные животные

Исследования проводили на крысах самцах линии SHR (spontaneously hypertensive rats Okamoto - Aoki strain) и нормотензивных крысах линии WKY (Wister - Kyoto) в возрасте 20 недель (самцы, масса 260-300 гр , систолическое давление 180-200 мм рт ст и 90-120 мм рт ст соответственно) К моменту исследования животные в течение суток не получали пищу при свободном доступе к воде

Использованная в настоящем исследовании модель первичной (эссенциальной) гипертензии - спонтанная гипертензия крыс линии Okamoto-Aoki (spontaneous hypertension of rats, SHR) с достаточным основанием признана большинством исследователей наиболее близкой моделью этой формы патологии человека, повторяющей основные патогенетические характеристики и особенности своего клинического прототипа [Okamoto К , et а! , 1963, Yamon Y, ¡983]

Экспериме1гтальная модель циклоспорин-зависимой гипертонии

Моделирование циклоспорин - зависимой гипертонии у крыс проводилось по методу Геркенса [Gerkens J 1989] с небольшими изменениями Основное изменение, которое было внесено в эту модель состояло в том, что была увеличена доза циклоспорина в два раза Это позволило избежать нефротоксического эффекта, наблюдаемого при продолжительном применении циклоспорина как у экспериментальных животных так и у людей (в трансплантологии) Повышение АД у экспериментальных животных в нашем случае происходило уже через неделю после начала кормления

Для проведения эксперимента были взяты две группы по 5 крыс линии WKY в возрасте 11-12 недель Первая группа служила контролем, и относящиеся к ней животные получали по 0,5 мл оливкового масла в день Животные второй группы получали циклоспорин А, растворенный в 0,5 мл оливкового масла из расчета 20 мг CsA на килограмм веса животного в день в течение 7 дней После прошествия этого срока производили регистрацию давления у животного плетизмографическим методом на приборе "Мингограф" (Siemens, Швеция)

Экспериментальная модеть ДОКА-солевой гипертонии

Модель ДОКА-солевой гипертонии выполняли по методике ранее описанной следующими авторами [Sesoko S , et al 1984, Schenk J et al, 1992] с небольшой

модификацией, которая заключалась в увеличенной дозе действующего вещества для более быстрого появления высокого АД у экспериментальных животных

Для проведения эксперимента были взяты две группы крыс линии WKY в возрасте 11-12 недель Первая группа из 5 животных служила интактным контролем Вторая группа животных состояла из 10 крыс и все они получали ДОКА в концентрации 500 мг/кг веса животного Обе группы животных подвергались операции по удалению почки (нефроэктомия) После удаления почки экспериментальному животному вводили порошок ДОКА в подкожную жировую клетчатку (подкожный карман) в области лопатки в дозе 500 мг/кг массы тела и содержали на 1% водном растворе хлорида натрия

Через 10 дней посте операции по резутьтатам полученным после измерения АД животные распределялись на две группы В первую группу входили животные с давлением до 120 мм ртст Во вторую группу входили животные с давлением выше 140 мм рт ст

Измерение артериального давления у крыс

Измерение артериального давления у всех экспериментальных животных осуществляли плетизмографическим методом с помощью прибора Мингограф" (Siemens, Швеция) на хвостовой артерии крысы

Выделение митохондрий из печени крысы

Суспензию м!ггохондрий печени выделяли из голодающих один день при свободном доступе к воде крыс, при температуре 4 - 6 °С в буфере с сахарозой - ЭГТА (ЭДТА) с помощью ее гомогенизации (стекло - тефлон) и дальнейшего стандартного центрифугирования [Aringer L, et al, 1976, Johnson D, et al, 1967] Митохондрии выделяли как из паренхимальных, так и непаренхимальных клеток ткани печени

Крыс забитых путем декапитации, помещали на препаровальный столик, где вскрывали брюшную полость, а затем делали забор материала (печень) Кусок печени массой 3 грамма помещали в среду выделения, состоящей из 0,25 М сахарозы, 10 мМ HEPES, 0,1 мМ ЭДТА, pH = 7,4 и троекратно промывали в среде выделения и размельчали при помощи мясорубки Латапи из нержавеющей стали Размельченные фрагменты печени помещали в гомогенизатор Поттера (стекло-тефтон), где их гомогенизировали в течении 20 - 30 секунд до получения однородного гомогената Полученный гомогенат центрифугировали на центрифуге Joan 24 в течении 10 минут со скоростью 600 g в результате чего получали супернатант, содержащий митохондрии Супернатант центрифугировали 10 минут со скоростью 10 000 g Супернатант сливали, а осадок промывали средой не содержащей ЭДТА Затем к суспензии митохондрий добавляли 20

5

мл среды выделения и осаждали центрифугированием 10 минут, 10 ООО g еще дважды [Johnson D , et al, 1967]

Буферные растворы для выделения митохондрий

Для выделения митохондрий из печени были использованы два вида буферных растворов В состав первого входил Трис-HCI, а второго HEPES Следует отметить, что митохондрии выделенные из печени с помощью буфера HEPES отличались своей устойчивостью к воздействию ионов кальция по сравнению к митохондриям, выделенным при помощи буфера Tris-HCl примерно в 7 раз Возможно это различие объясняется тем, что рабочий диапазон pH для HEPES больше соответствовал условиям проводимых экспериментов, где использовали буфера со значением pH 7,4, а также повышенным содержанием ионов железа в буфере Tns-HCl

Выделение митохондрий из мозга крысы

Выделение митохондрий мозга крыс проводили по методу Симса [Sims N 1990] После вскрытия черепа декапитированной крысы мозг без мозжечка и подкорковых структур помещали в среду выделения, содержащую 0,32 M сахарозу, 1 мМ ЭДТА, и 10 мМ HEPES (раствор выделения находился на льду) Ткань мозга вручную гомогенизировали в гомогенизаторе Потгера (тефлон-стекло) Гомогенат центрифугировали на центрифуге Joan 24 при постоянном термостатировании 4 °С со скоростью 1330 g 3 минуты Супернатант центрифугировали 10 минут со скоростью 21200 g, а затем полученный осадок ресуспендировали в 15 % растворе PercoU Нижний слой градиента плотности содержал 40 % Percoll, средний слой 23 % Percoll, верхний слой смесь митохондрий разведенных в 15 % Percoll Градиент центрифугировали 15 минут со скоростью 30000 g на ультрацентрифуге Beckman Из полученных слоев разделенной суспензии митохондрий забирали самый нижний, разводили в буфере выделения в соотношении 1 4 и центрифугировали 10 минут 16700 g Супернатант сливали, а ресуспендированный осадок митохондрий использовали для эксперимента

Измерение скорости синтеза АТФ митохондриями люциферин лющиферазным методом

Измерение скорости синтеза АТФ проводили по методу Лемастера и Хлкенброка. Для этого использовали очищенную люциферазу и синтетический люциферин (ICN) Среда измерения содержала 155 мМ сахарозу, 5 мМ MgCh 5 мМ сукцинат калия, 11 мМ КН2РО4 -К2НРС>4, 7,1 мкМ люциферин и 1 мг/мл люциферазы [Lemasters J J , Hackenbrock CR, 1979]

Водные растворы адениновых нуклеотидов (АМФ, АДФ, и АТФ) были приготовлены в концентрации 0,1 M (рН = 7,4) Для измерения величины люминесценции использовался фотометр LKB Luminometer (Швеция) Измерение начинали с добавления митохондрий (0,2 мг/мл) в среду измерения, после этого в реакционную смесь добавляли смесь адениновых нуклеотидов АДФ/АМФ, соотношение концентраций 1 9 После того как интенсивность свечения начинала убывать или выходила на плато, делали контротьную добавку АТФ с известной концентрацией Скорость синтеза АТФ определяли по линейному участку полученной кривой

Определение концентрации белка методом Бредфорда

Определение концентрации митохондриального белка в пробе проводили методом Бредфорда [Bradford ММ, 1976, Spector Т, 1978] В этом методе используется кумасси бриллиантовый синий G-250 (100 мг) растворенный в 50 мл 95% этилового спирта, к которому затем добавляли 100 мл 85% (масса/объем) фосфорной кислоты и доводили общий объем раствора до 1 л дистиллированной водой

Для измерения к образцу, содержащему 10 - 100 мкг белка в 0,1 мл , добавляли 5 мл реагента-красителя и хорошо перемешивали Поглощение света с длинной волны 595 нм измеряли относительно чистого реагента не ранее, чем через 5 минут, и не позднее, чем через 1 час Калибровочный график строили с использованием БСА

Определение скорости погпощения кислорода электродом Кларка

Для регистрации митохондриального дыхания полярографическим методом использовали электрод Кларка [Chance В, Williams G R 1955, 1956] Измерение проводили в буфере следующего состава сахароза - 150mM КС1 - 75гпМ, КН2РО4- 5шМ, MgCh - 2,5шМ (рН 7,4) В среду измерения добавляли суспензию митохондрий (2 мг белка) Через 30-40 секунд, после стабилизации системы, добавляли сукцинат в конечной концентрации 10 мМ Регистрировали скорость поглощения кислорода и через 40-60 секунд добавтяли 200 мкМ АДФ После последовательного изменения скоростей дыхания добавляли 100 мкМ 2,4-динитрофенола. Регистрировали убыль кислорода до наступления анаэробиоза По потученной кривой рассчитывали коэффициент дыхательного контроля, коэффициент фосфорилирования Р/О и скорость дыхания митохондрий в состояниях 3 и 4 (по Чансу) Для изучения влияния кальция на перечисленные параметры в среду инкубации перед сукцинатом добавляли кальций в концентрации 5, 10,20, 30 или 50 мкМ

Определение скорости синтеза АТФ митохондриями печени с использованием ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография)

Для определения скорости синтеза АТФ митохондриями печени крысы применяли изократический обратно фазовый метод измерения, разработанный [Sellevold О F М, et al, 1986], с небольшими модификациями Разделение проводили на колонке Beckman Analytical Pack (США) С-18 (длинна 75 мм, диаметр 4,2 мм) Использовали ультрафиолетовый детектор (Kontron Uvikon LCD 725, Швейцария), длинна волны 254 им Мобильная фаза содержала 220 мМ дигидрофосфат калия, 2,3 мМ тетрабутил аммониумбромид и 3% ацетонитрил, рН 6,2

Синтез АТФ митохондриями печени измеряли в буфере, содержащем 0, 5 10, 20, 30 или 50 мкМ кальция В реакционный раствор добавляли сукцинат в конечной концентрации 10 мМ и препарат митохондрий (2 мг белка) Через минуту в этот раствор добавляли 200 мкМ АДФ и в момент перемешивания начинали отсчет времени Через заданные интервалы времени из реакционной смеси в пробирку с 5 М хлорной кислотой отбирались пробы После нейтрализации пробы 5 М гидроксидом калия и осаждения белка центрифугированием в супернатанте измеряли содержание адениннуклеотидов По результатам измерения строили график зависимости содержания АТФ от времени Скорость синтеза АТФ определяли по линейному участку полученной кривой

Определение скорости поглощения и выделения кальция митохондриями печени крысы

Скорость поглощения и выведения кальция митохондриями регистрировали с помощью кальциевого этектрода Опоп 93-20 и цифрового многоканального рН-метра-иономера Эконикс "Экотест-120" Измерение проводили в буфере следующего состава сахароза 155 Мм, MgClj 2,5 мМ, сукцинат калия 5мМ, К2НРО4/КН2РО4 2 мМ, рН 7,4 Начальная концентрация кальция в среде измерения Со задавалась добавлением раствора хлорида кальция Измерения проводили в диапазоне концентраций 10"М03 М Са2+ Поглощение кальция начинали в момент добавчения митохондрий в среду Концентрация белка митохондрий в пробе составляла 2,8 мг/мл На рис 1 приведена типичная кривая, характеризующая цикл входа и выхода кальция в митохондриях

Время, сек

Рисунок 1 Кривая, характеризующая цикл входа - выхода кальция в митохондриях С0 -начальная концентрация кальция в среде, Стш - минимальная концентрация ионов кальция в среде, Vi — скорость поглощения ионов кальция митохондриями V2 и V3 -скорости выброса кальция митохондриями, t| и ti - продолжительность быстрой и медленной фазы выброса, M - добавка митохондрий

Для количественного описания цикла скорости поглощения и выведения Ca2' митохондриями было введено 7 параметров, которые вычисляются из каждой индивидуальной кривой Параметры Со и Cmln соответствуют начальной и минимальной концентрациям ионов кальция в среде измерения, параметры ti и t2 характеризуют продолжительность цикла Скорость Vi соответствует фазе поглощения ионов кальция митохондриями из внешней среды, а скорости V2 и V3 - выбросу кальция митохондриями в среду

Статистическая обработка результатов

Данные по каждому раздсiy были получены в нескольких независимых экспериментах Математическая обработка результатов проводилась с использованием пакета программ ANOVA Результат выражали как среднее значение ± стандартная ошибка среднего Достоверность различия между средним определялась по непарному t-критерию Стьюдента Парные, множественные и частные коэффициенты корреляции вычислялись с помощью программы Microsoft Office (Excel)

Результаты и обсуждение

При спонтанной гипертензии снижены уровень синтеза АТФ митохондриями печени крыс (БНЮ. а также их функциональные параметры

Концентрация кальция в среде мкМ

Рисунок 2 Зависимость скорости синтеза АТФ в митохондриях печени крыс (п=8) и \ViiY (п=8) от концентрации кальция в среде инкубации

* - р<0 05, **- р<0 01, по сравнению с ХУКУ (среда выделения Тш-НСЦ Среднее ± стандартное отклонение

Результаты измерения скорости синтеза АТФ в митохондриях печени крыс 8НЯ и \VICY, а также зависимость скорости синтеза от концентрации кальция во внешней среде приведены на рис 2 Показано, что в митохондриях печени крыс БИЯ снижена скорость синтеза АТФ по сравнению с \VICY на 30% При последовательном повышении концентрации внешнего кальция до 50 мкМ скорость образования АТФ в митохондриях \VIiY снижается на 40% (р<0,05), в то время как в митохондриях 8НЯ скорость синтеза АТФ практически не изменяется При 50 мкМ кальция в среде инкубации различие в скорости синтеза АТФ в митохондриях печени крыс 8НК и \УКУ нивелируется

Можно предположить, что причиной уменьшения продукции АТФ митохондриями клеток при первичной гипертонии является снижение мембранного потенциала внутренней мембраны этих органелл, возможно вызванное кальциевой перегрузкой Это ведет к рассеиванию протонного электрохимического градиента внутренней

митохондриальной мембраны, уменьшению протонной движущей силы и как следствие к снижению синтеза АТФ

Таким образом, обнаруженное в настоящем исследовании снижение на 30% скорости синтеза АТФ в митохондриях печени крыс со спонтанной гипертензией (Рис 2) дает объяснение ранее выявленному (в сотрудничестве с лабораторией метаболизма сердца РК НПК рук О И Писаренко) уменьшению содержания АТФ в клетках печени ЭНН. по сравнению с таковым в контрольной группе - [Писаренко О И , и соавт, 1998] Одной из причин снижения синтеза АТФ в митохондриях печени и мозга гипертензивных крыс может являться перегрузка этих органелл кальцием, источником которой может быть избыток цитозольного кальция [Са2+]с, который как отмечалось ранее [Lehnlnger А Ь, й а1, 1967] может приводить к перегрузке митохондрий гипертензивных животных кальцием [Са2+]т [Постнов ЮВ, 2001], накопление которого наблюдается вследствие снижения мембранного потенциала из-за недостатка окислительного субстрата или увеличения протонной проводимости внутренней митохондриальной мембраны Потученные результаты согласуются с данными некоторых авторов [Оеуупск М А, е1 а1, 1981], ранее показавших уменьшение кальций связывающей способности плазматической мембраны гепатоцигов крыс 5 ПК., что может служить косвенным доказательством нарушения в клетках печени кальциевого баланса как одного из проявлений мембранопатии, характерной для первичной гипертензии

Таблица 1 Влияние концентрации ионов кальция в среде на показатели дыхания митохондрий печени и 5Н1*. (среда выделения Тгк-НС!)

Среда [Са2+1 мкМ Поглощение кислорода мкМ Ог/(мин чг белка) ДК Р/О

Состояние 3 Состояние 4

WKY 0 27,26±2,97 6,45±0,59 4,26±0,32 2,09±0,19

SHR 27,94±1,79 7,95±0,59* 3,58±0,22* 2,01±0,13

WKV 10 29,92±3,05 8,20±0,82 3,82±0,42 1,84±0,05

SHR 23,91±2,87 8,91±1,16 2,80±0,26* 1,94±0,26

WKY 20 27,52±2,23 8,41±1,78 3,49±1,00 1,63±0,13

SHR 28,29±7,82 13,4±2,21 2,07±0,24 1,46±0,09

WKY 30 25,17±3,07 9,88±1,5 2,71±0,40 1,89±0,16

SUR 14,94±4,40* 9,16±1,94 1,58±0,17* 1,60±0,16

* Р < 0,05, М ± м (по отношению к контролю WK.Y)

Состав среды измерения 0,15 М сахароза, 75 мМ KCl, 5 мМ фосфат калия, 2,5 мМ хлорид магния, 10 мМ сукцинат калия, pll = 7,4

В табл 1 приведены результаты измерения скоростей поглощения кислорода в митохондриях печени крыс 5НЯ и \V1CY в состояниях 3 и 4, а также их зависимость от концентрации кальция в среде измерения Показано, что при отсутствии кальция в среде измерения скорость поглощения кислорода в состоянии 3 в митохондриях печени крыс БНЯ и \VK-Y практически не различаются С повышением концентрации кальция в среде уровень дыхания митохондрий в состоянии 3 не изменяется Но при увеличении концентрации ионов кальция в среде до 30 мкМ наблюдается резкое снижение скорости дыхания в состоянии 3 в митохондриях БЖ в два раза, что статистически достоверно В тоже время, в бескальциевой среде скорость поглощения кислорода митохондриями в состоянии 4 у \¥КУ на 20 % меньше, чем у БНЯ (Р < 0,05) При увеличении концентрации ионов кальция в среде измерения, наблюдается постепенное увеличение скорости поглощения кислорода как митохондриями \УКУ, так и 8НЯ

Коэффициент фосфорилирования Р/О при увеличении концентрации ионов кальция в среде постепенно снижался как в митохондриях \УКУ, так и ЙНК Но при увеличении концентрации ионов кальция в среде измерения до 20 - 30 мкМ, в митохондриях БНР. это снижение было более выраженным по отношению к контрольным митохондриям \УКУ

10 20 Концентрация ионов кальция в среде (мкМ)

Рисунок 3 Влияние концентрации ионов кальция в среде инкубации на уровень ДК митохондрий печени крыс \УКУ и ЭНЯ

Состав среды измерения 0,15 М сахароза, 75 мМ КС1, 5 мМ фосфат калия 2,5 мМ хлорид магния, 10 мМ сукцинат калия, рН = 7,4

Дыхательный контроль (ДК) митохондрий отражает степень сопряжения дыхания и фосфорилирования в препаратах митохондрий На рис 3 приведена зависимость дыхательного контроля митохондрий от концентрации кальция в инкубационной среде В отсутствии ионов кальция в среде измерения ДК достоверно снижен в митохондриях БНк на 15 % по сравнению с нормотензивным контролем \УКУ С повышением концентрации кальция дыха!ельный контроль митохондрий снижается как у митохондрий \VK_Y, так и у БИЯ, и при 10 мкМ Са2+ разница между ними составляет уже 30 % Самая большая разница в уровне ДК митохондрий наблюдается при концентрации 20 мкМ кальция в среде и составляет 40 % Дальнейшее увеличение концентрации кальция в среде измерения до 30 мкМ вызывает продолжение снижения ДК как в митохондриях \\TCY, так и 5Н11, но статистически достоверная разница составляет 30 %

Индуцируемый выход кальция из митохондрий печени крыс при спонтанной гипертензии

6 0x10 п

5 0x10 -

4 0x10

3 0x10 -

га О

2,0x10

1 0x10 -

00

200

300

—I—

400

—1—

500

Время, сек

600

—I

700

Рисунок 4 Кривые циклов кальций индуцируемого выхода кальция митохондрий печени, 5НЯ (сплошная линия) и \¥КУ (пунктирная линия) при начальной концентрации Са2+ 55 мкМ Момент добавки митохондрий отмечен стрелкой и буквой М

Состав среды измерения 155 мМ сахароза, 5 мМ 2 мМ калий фосфатный буфер, 5

мМ сукцинат калия, 2,8 мг митохондриального белка

Все закономерности цикла поглощения и выведения кальция митохондриями, который описан в разделе «Материалы и методы», характерны для митохондрий ЭНЯ и \VfCY Однако выход кальция из митохондрий при спонтанной гипертензии имеет ряд особенностей На рисунке 4 приведена усредненная кривая циклов кальций-индуцируемого выхода кальция для митохондрий печени 5НК и \УКУ при концентрации 55 мкМ Са2' в среде измерения Из рисунка видно, что длительность цикла у митохондрий, выделенных из печени крыс 5НЯ на треть меньше, и митохондрии \УК.У способны снижать содержание кальция в среде до более низкой концентрации (на 30+5% ниже), чем митохондрии БНЯ

Одной из причин снижения емкости митохондрий для ионов кальция и как следствие синтеза АТФ в различных органах и тканях может быть изменение работы мега-пор то есть увеличение количества митохондрий работающих в режиме высокой проводимости [¿огаШ е! а1, 1995] Расположенные во внутренней митохондриальной мембране мега-поры осуществляют выведение повышенных количеств кальция из митохондриального матрикса, что может явтяться критическим фактором для возникновения кальциевой перегрузки митохондрий при первичной гипертензии Главной особенностью работы мега-пор является то, что они могут работать в двух режимах низкой и высокой проводимости В отдельной митохондрии окислительный стресс сначала запускает открытие поры на небольшое время (режим низкой проводимости), перед тем как происходит ее более продолжительное открытие (режим высокой проводимости), которое является причиной полного рассеивания А'Р и выхода содержимого митохондрии в клетку

Скорость синтеза АТФ митохондриями мозга снижается при спонтанной ШЩЕЕЗии крыс

(SHK), я также при циклпепоршюво» гипертепзии (CsAY

и

"pcd.os "Р<0,01

□ WKV

□ С&А Е ïhr

о

20

Концентрация ионов кальция а среде I ык I

+ Р < 0,05; M ± м (по отношению к контролю WKY) "* <0,01; М± м. (но отношению к контролю "WK7)

Рисунок. 5. Влияние иопов Ca*v на скорость синтеза АТФ митохондриями головного мозга крыс SUR и WKY, а также при цикле с пор я я обой гппертензии (лгоциферин -люг.шферазный метол).

Состав среды измерения; 155 мМ сахароза, 5 нУ MgCtj. 5 и M сукцинат калии, И чМ KHiPOj -К,.НРО.,: 7,1 мкМ .тюциферим и I мг/мл лкшиферззы

На рисунке 5 представлены результаты измерения скорости синтеза АТО митохондриями головного мозга крыс SHR и WK.Y, а также при цнклоспоркновой гипсртсизии CsA, 'За 100% была принята скорость синтеза АТФ митохондриями мозга крысы WKY в среде без кальция Показано, что в мтохондрнях головного мозга крыс SHR пи сравнению с WKY на 20% снижена скорость синтеза АТФ (р<0,01). В то время как в показателях скорости синтеза АТФ митохондриями головного мозга крыс с никлоепориновой гипертонией (CsA) по сравнению с контролем достоверные различия отсутствуют. Добавление в среду ионов кальция в концентрации 20 мкМ, значительно, более чем на 40 % и контроле (WKY) и на 60 % в опыте (SUR) снижает скорость синтеза АТФ в митохондриях мозга (р<0,01}_ й тоже время внесение в среду измерения митохондрий, выделенных из печени крыс с циклоепорнновой пшертетоивй CsA такого ;кс количества иопов C'a"", снижает скорость синтеза АТФ па 50% от уровня контроля,. При этой концентрации ионов кальция в среде инкубации, достоверных различий в

скорости синтеза АТФ между митохондриями мозга контрольных крыс \VICY и крыс с циклоспориновой гипертонией, выявлено не было Увеличение концентрации ионов кальция в среде измерения до 40 мкМ снижало в 2 раза скорость синтеза АТФ митохондриями У/К У по сравнению с предшествующим значением концентрации кальция в среде (р<0,01) Следует отметить, что увеличение концентрации кальция в среде измерения с 20 до 40 мкМ не оказывает существенного влияния на скорость синтеза АТФ митохондриями мозга БНЯ. Увеличение концентрации ионов кальция в среде до 40 мкМ снижает скорость синтеза АТФ митохондриями СбА на 80 % от начального уровня (среда без ионов кальция) и на 30 % от предыдущего уровня (20 мкМ кальция), при этом достоверность различий между \VICY и СвА отсутствовала Стсдует отметить, что влияние увеличивающихся концентраций ионов кальция на соответствующий тип митохондрий было достоверным (р<0,01) Прогрессивное увеличение концентрации кальция в среде измерения с 0 до 20, а затем до 40 мкМ вызывало уменьшение скорости синтеза АТФ митохондриями мозга контрольных крыс линии \УКУ и СзА (р<0,01), а также но не в точке 40 мкМ

Изучение АТФ продуцирующей способности митохондрий мозга при циклоспориновой гипертензии не выявило заметной разницы по сравнению с контролем в бескальциевой среде (Рис 5) Но с увеличением концентрации ионов кальция в буфере измерения были выявлены те же тенденции, характерные для митохондрий печени при этом виде патологии Было обнаружено выраженное снижение АТФ продуцирующей функции митохондрий, которое также наблюдаемое при спо1гтанной гипертензии крыс ЙНЯ

функционапьные параметры митохондрий печени крыс при спонтанной (5НЯ) и циклоспориновой (С$А) гипертензии

Для более детальною изучения участия мега-поры в патогенезе артериальной гипертензии была воспроизведена циклоспориновая гипертензия (СбА) Как широко известно первичной мишенью циклоспорина А является белок циклофилин А (СурА), названный так именно из-за своей способности взаимодействовать именно с циклоспорином А [НаЫсЬитасИег е1 а1, 1984] Циклофилин А, входя в состав мега-поры, которая расположена во внутренней митохондриальной мембране и участвующая в кальциевом обмене клетки, подвергается воздействию СзА и вызывает блокировку мега-поры Это вызывает способность митохондрий накапливать большее количество ионов Са2+, чем в норме (Рис 6)

Таблица 2 Втияние концентрации ионов кальция на показатели дыхания митохондрий печени \ViCY и БНЯ, а также при циклоспориновой гипертензии (СбА) (среда выделения НЕРЕБ)

Среда [Ca2+1 мкМ Поглощение кислорода мкМ Ог/(мин мг белка) ДК Р/О

Состояние 3 Состояние 4

WKY 0 29,47±2,84 7,65±0,6 3,83±0,12 1,95^0,09

SHR 33,32±2,06 9,92±0,93* 3,43±0,24* 2,19±0,15

CsA 20,22±3,43* 6,25±0,81 3,12±0,2** 1,97±0,18

WKY 100 16,82±2,4 6,91±0,74 2,43±0,19 1,9±0,14

SHR 19,32±2 43 8,76±0,88 2,18±0,08 1,88±0,1

CsA 10,87±1,66 4,5±0,84* 2,68±0,41 2,22±0,42

WKY 200 15,19±1,48 7,37±0,62 2,07±0,14 1,83±0,13

SIIR 14 59± 1,41 8,06±0,61 1,8±0,01 1,6±0,07

CsA 8,39±1,44** 3,94±0,61** 2,11±0,12 2,87±0,77**

** Р < 0,01, * Р < 0,05, M ± м (по отношению к контролю WKY)

Состав среды измерения 155 мМ сахароза, 5 мМ MgCh 5 мМ сукцинат калия, 7,5 мМ КН2РО4 -К2НРО4, 75 мК хлорид калия, 25 мМ HEPES

В табт 2 показано, что при отсутствии кальция во внешней среде скорости поглощения кислорода в митохондриях печени крыс SHR и WKY достоверно не различаются, что также наблюдалось при выделении в буфере Tris-HCl (табл 2) Митохондрии CsA обладали сниженной на 30 % скоростью поглощения кислорода в состоянии 3 по отношению к контролю Добавление 100 мкМ ионов кальция в среду измерения, скорости поглощения кислорода снижались у всех типов митохондрий у SHR и WKY на 40 %, а у CsA на 50 % (Р<0,05) При дальнейшем увеличении концентрации внемитохондриального Са2' до 200 мкМ, скорость дыхания в состоянии 3 снижалась еще бопее значительно У митохондрий SHR и CsA это снижение было на 25 % по отношению к предыдущему значению концентрации кальция в среде, и на на 10 % у митохондрий WKY

При измерении скорости поглощения кислорода митохондриями в состоянии 4 было обнаружено, что митохондрии SHR на 25 % быстрее поглощают кислород, чем митохондрии WKY (Р<0,05), тогда как в митохондриях CsA скорость поглощения кислорода была на 20 % ниже, чем в контроле Внесение 100 и 200 мкМ кальция в среду измерения не вызывало достоверных изменений в дыхании митохондрий SHR и WKY, в то время как CsA снижали свой уровень дыхания на 30 и 40 % соответственно

При измерении дыхательного контроля (ДК) митохондрий печени крыс линий WK.Y, SHR и циклоспориновой гипертензии CsA в среде без кальция, было обнаружено достоверное снижение ДК митохондрий SHR и CsA на 10 и 20 % rio отношению к контролю соответственно Внесение в среду кальция в концентрации 100 мкМ снижает ДК у митохондрий WKY и SHR на 40% от исходного уровня, тогда как в CsA митохондриях ДК всего на 15 % При увеличении концентрации ионов кальция в среде до 200 мкМ, ДК в митохондриях, выделенных из различных крыс (SHR, WKY, CsA) снижался на 15 % от своего предыдущего уровня (100 мкМ Са2+ в среде инкубации)

Коэффициент фосфорилирования Р/О был примерно равен двум в бескальциевой среде у всех типов исследуемых митохондрий что характерно при использовании сукцината как субстрата окислительного фосфорилирования Добавление ионов кальция в среду измерения сначала в концентрации 100 мкМ, а затем 200 мкМ вызывало недостоверное снижение этого коэффициента у контрольных митохондрий WKY В митохондриях SHR происходило постепенное снижение соотношения Р/О с возрастанием концентрации кальция в среде на 15 % (Р<0,05) В митохондриях CsA, наоборот происходило увеличение коэффициента фосфорилирования на 10 и 30 процентов соответственно при увеличении концентрации кальция в среде

Из выше приведенных результатов следует, что ионы Са2+ влияют на митохондриальное дыхание всех экспериментальных групп При этом увеличение концентрации внемитохондриального Са2+ вызывает прогрессирующее уменьшение дыхания в состоянии 3 и увеличение в состоянии 4 митохондрий SHR и WKY, тогда как в митохондриях CsA снижались оба эти показателя

Почучеиные в работе результаты подтверждают предположение об участии митохондрий в развитии циклоспориновой гипертензии крыс, но по несколько другому механизму, чем при спонтанной гипертензии Данные представленные в таблице 2 показывают достоверное снижение по отношению к контролю дыхания митохондрий печени в состоянии 3 (Р<0,05), а также дыхательного контроля митохондрий (Р<0,01) в бескальциевой среде, что говорит о недостаточности АТФ продуцирующей функции митохондрий при циклоспорин А зависимой гипертензии Надо отметить, что введение ионов кальция в среду инкубации вызывало достоверное снижение дыхания митохондрий в состоянии 4, что говорит о снижении тока электронов через электронпереносящую цепь внутренней митохондриальной мембраны с увеличением концентрация кальция в среде

£ 0,35

Рисунок (>. Количество ионов кййщня необходимых для вывода митохондрий печени крыйН в неконтролируемое состояние (норма и цикл ос пори ¡юная гипертония),

Исходя из полученных на рисунке 6 результатов можно сделать вывод, что митохондрии, подвергшиеся влиянию СйА, способны аккумулировать и 2 больше ионов Са'"*, чем митохондрий \\'КУ, Сходные данные были получены и другими авторами в частности [СЬа1тегз Я. е! а]. 2003]. но в их экспериментах циклоспорин Л добавлялся непосредственно к суспензию митохондрий, тотда как к нашем случае животные получали его иерорально, что в свою очередь вызывало подъем артериального давления.

Существование нарушений в митохондриях КНК. и при циклоспорин о вой гипертеизнн в механизме нынеденин кальция через мета-норы позволяет объясни! !, йолес выраженное. чей у и'КУ (т.е. при меньших концентрациях кальция в инкубационной среде), снижение дыхания в состоянии 3 (присутствие АДФ) и в состоянии 4 (отсутствие АДФ). Подобный тип разобщения при перггрузках шпокопдрия кальцием подроЬжг оггасан А. 1_е1тт§ег и соавт. [[.сЬгннцег е! а!., 19671 " интенсивно изучается в плане участия в нем мет-пор [Нчйег м &\„ 1999, [Зпико-ецку с: а!.. 20001- Можно предположить, что в условия* продолжительного окислительного стресса или перегрузке клетки Са*', работа поры в режиме низкой проводимости может служить защитным механизмом. Позволяющим частично рассеять АЧ', быстро освободиться от аккумулированного Са-1 и снизить образование эндогенных кислородных радикалов. Напротив, потеря содержимого ма'фикса, набухание я другие структур вые нарушения митохондрий, вызванные длительным открытием мега-поры ведут к повреждению митохондрий и клетки в целом. Из выше сказанного можно сделать вывод, что циклоспорин Л, блокируя мега пору митохондрии, тем самым лишает ее защитного механизма (режим низкой про водимо сги), вызывая чрезмерное накопление кальция в матрнксе.

При ЛОКА-сотсвой гипертензии наблюдается снижение ДК и увеличение дыхания в состоянии 4 митохондрий печени

Данные полученные на экспериментальных моделях первичной (эссенциальной) гипертензии спонтанно-гипертензивных крыс и ее вторичной форме - циклоспориновой гипертензии, используя изолированные митохондрии печени и головного мозга крыс заставили предположить наличие возможных мембранных нарушений и связанного с ними митохондриального энергообрзования при ДОКА-солевой гипертензии Результаты исследования, приведенные в таблице 3, говорят о снижении скорости дыхания митохондрий в состоянии 3 при ДОКА-солевой под влиянием ионов кальция, которое наблюдалось при первичной гипертензии крыс линии БНЯ Также обнаружилось увеличение дыхания митохондрий в состоянии 4 при обоих видах гипертензии в бескальциевой среде по сравнению с нормотензивным контролем, что может говорить о нарушенной протонной проводимости внутренней митохондриальной мембраны при данных видах экспериментальных гипертензий При последующем увеличении концентрации ионов кальция в среде измерения это различие исчезало

Таблица 3 Влияние концентрации ионов кальция в среде на показатели дыхания митохондрий печени при ДОКА-сотевой гипертензии и в контроле (животные не давшие давление) (среда выделения Тпз-НС1)

Среда [Са2+| мкМ Поглощение кислорода мкМ ОУ(мин мг белка) ДК Р/О

Состояние 3 Состояние 4

контроль 0 19,10±5,11 8,52±2,10 2,21±0,14 2,39±0,47

ДОКА 24,70±3,31 11,05^1,55 2,24±0,10 2,12±0,13

контроль 20 20,80±2,71 10,47±1,61 2,01 ±0,15 2,29±0,24

ДОКА 16,50±1,06* 9,43±0,63 1,75±0,08* 1,98±0,06

контроль 50 18,42±1,09 10,78±2,67 1,79±0,34 1,61±0,10

ДОКА 18,90±0,65 11,1±1,96 1,75±0,25 2,17±0,09*

* Р < 0,05, М ± м (по отношению к контролю WKY)

Состав среды измерения 0,15 М сахароза, 75 мМ KCl, 5 мМ фосфат калия, 2,5 мМ хлорид магния, 10 мМ сукцинат калия, pH = 7,4

При анализе поглощения митохондриями кислорода в состоянии 3 (присутствие АДФ) в бескальциевой среде достоверных отличий в уровне этого параметра обнаружено не было (табл 3) Внесение в среду 20 мкМ кальция вызывало следующие изменения дыхание контрольных митохондрий в состоянии 3 оставалось на прежнем уровне, тогда как у опытных снижалось на 30 % (р<0,05) Дальнейшее увеличение концентрации ирнов

кальции к среде до 50 мкМ уменьшает скорость дахания в состоянии 3 к контроле, по почти Езе влияет на митохондрии, которые были выделены из опытных животных.

Анализ скс)рос™ дыхания митохондрий в состоянии 4 обнаружил недостоверное увеличение на 20 % его уровня в опытных митохондриях но сравнению с контролем в бес кальки свой среде. Увеличение концентрации ионов кальция в среде измерения вызывало увеличение скорости поглощения кислорода контрольными митохондриями до уровня опы тных.

В отсутствии ионов кальция в среде измерения дыхательный контроль (ДК) между двумя группами животных не различался. Внесение в среду измерения ионов кальция в концентрации 20 мкМ вызывало Снижение ДК в обоих типах митохондрий, но более выраженное падение (20 %) наблюдалось в митохондриях выделенных из печени животных с ДОКА-еолевой тшерТензией (р<0,05>. Дальнейшее увеличение до 50 мЩ вызывало дальнейшее снижение ДК в контрольных митохондриях, тогда как ДК опытных митохондрии оставался на предыдущем уровне.

100 110 120 130 140 150 Величина АД (мм.рт.ст.)

160

170

180

О 0 мкМ Са2+ в среде О 20 мкМ Са2+ е среде Д 50 мкМ Са2+ в среде

— Linear (0 мкМ Са2+ s среде)

' ™ Linear (20 мкМ Са2+ в среде)

— Linear (50 мкМ Са2+ в среде)

pHi-vHOh" 7. Зависимость ДК даишйшгрий печени крысы от концентрации ионов кальция с среде измерения и уровня ДД животного при ДОКА-еолевой гинертензии. Состав среды измерения: 0,15 М сахароза, 75 мМ KCl, 5 мМ фосфат Калия, 2,5 мМ хлорид магния, 10 мМ сукиинат калия, pt 1 = 7.4,

На рисунке 7 изображена взаимосвязь между ДК митохондрий и уровнем АД при различных концентрациях ионов кальция в среде измерения у животных после введения дезоксикортикостерона Из рисунка следует, что в отсутствии ионов кальция и при концентрации Са2+ 50 мкМ в среде измерения ДК митохондрий слабо зависел от уровня АД животного Тогда как при концентрации 20 мкМ Са2* связь между уровнем АД животного и ДК митохондрий была значительной

Результаты представленные на рисунке 7 подтверждают предположение о наличии связи между уровнем артериального давления животного, дыхательным контролем митохондрий (ДК) и их кальциевой загрузкой Как показано на рисунке 7 ДК митохондрий был явно ниже у митохондрий нагруженных кальцием (50 мкМ) и имел тенденцию к снижению с увеличением АД животного Самые интересные данные были получены при нагрузке митохондрий ионами кальция в концентрации 20 мкМ В этом случае наблюдалось выраженное снижение уровня ДК митохондрий с увеличением АД животного

Клеточный энергодефишп как причина артериальной гипертензии

Данные, впервые представленные настоящим исследованием, свидетельствуют в пользу того, что клеточный энергетический дефицит, проявления которого ранее обнаружены в различных тканях при первичной и некоторых вторичных формах гипертензии, является следствием разобщения окисления и фосфорилирования в митохондриях клеток из-за кальциевой перегрузки последних (Табл 1, 2, 3, Рис 3, 7) и как следствие снижение их мембранного потенциала

В свете полученных данных повышение системною артериального давления при первичной гипертензии приобретает черты механизма компенсации недостаточности клеточно-тканевого (митохондриального) образования АТФ [Постнов Ю В , 1998] Таким образом, основываясь на биоэнергетической концепции артериальной гипертензии можно заключить, что при этом заболевании наблюдаются нарушение синтеза АТФ во всех органах и тканях организма, в том числе и в гладких мышцах сосудов и капилляров Отсюда можно предположить гипотетический механизм развития АГ, который выглядит следующим образом Запускающим звеном этого процесса может является нарушение аккумулирующей способности митохондрий для ионов кальция, что вызывает их накотение во внемитохондриальном пространстве, ведущее к недостаточному расслаблению гладкомышечной мускулатуры сосудов и микро капиллярного русла Локальное увеличение давления сначала на уровне капиллярного русла вызывает его

разрежение в тканях и органах, что ведет к стойкому увеличению системного АД всего организма в целом

Вся совокупность данных, впервые полученных в этом исследовании, говорит о том, что изменения функционирования митохондриального аппарата клетки, те снижение образования АТФ и кальций аккумулирующей способности митохондрий, увеличение дыхания в состоянии 4 могут лежать в основе развития артериальной гипертензии вне зависимости от ее этиологии

Полученные данные позволяют лучше понять патогенез гипертонии Результаты открывают новые механизмы, определяющие повышение и поддержание артериального давления при спонтанной (первичной) и вторичных системных гипертензиях В результате этого формируется новое понимание гипертонии как болезни, при которой существует недостаток митохондриального образования АТФ, что со временем может привести к созданию нового класса гипотензивных препаратов, а также методов лечения АГ Впервые это предположение было высказано в работах [Постнов Ю В, 1998 ,2000, 2002, 2004]

Подводя тог приведенным в данной работе результатам, можно сказать, что уровень митохондриального энергообразования играет важную роль в патогенезе артериальной гипертензии Особенно ярко это выражалось при изучеиии функциональных особенностей митохондрий, выделенных из печени и мозга крыс линии БНЯ, которая является моделью эссенциальной гипертензии человека

Выводы

1 Установлено снижение АТФ-продуцирующей способности митохондрий головного мозга и печени спонтанно гипертензивных крыс (ЭИИ.) в сравнении с контрольными животными (\¥КУ)

2 Показано, что внутриклеточный энергетический дефицит митохондрий печени, обнаруженный при первичной гипертензии крыс (ЭНЯ), выражается в снижении ДК митохондрий и увеличении потребления Ог в состоянии 4 в бескальциевой среде, а дополнительная загрузка кальция в митохондриальный матрикс вызывает постепенное снижение ДК и усиление дыхания как в митохондриях \VICY, так и БНЯ, но более выражено в последим

3 У крыс при циклоспориновой гипертонии (СбА) обнаружено снижение ДК и дыхания митохондрий печени в состоянии 3 по сравнению с нормотензивными животными (\УКУ), а также снижение АТФ-продуцирующей функции митохондрий мозга крыс под воздействием ионов кальция наблюдаемое при спонтанной гипертензии крыс линии (5НК)

4 Выявлено что, при ДОКА-солевой гипертензии под воздействием ионов кальция происходит снижение ДК митохондрий печени крысы также как и при других видах экспериментальной гипертонии (спонтанная и циклоспориновая)

5 Результаты, полученные в данном исследовании, свидетельствуют о том, что нарушение работы митохондрий (снижение ДК и синтеза АТФ, а также увеличение дыхания в состоянии 4) усиленное влиянием Са2+ лежит в основе развития рассмотренных выше видов экспериментальной гипертензии

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Е Ю Будников, А Ю Постнов, А Д Дорощук, Г В Афанасьева, Ю В Постнов Сниженная АТФ-синтезирующая способность митохондрий печени спонтанно гипертензивных крыс (SHR) роль кальциевой перегрузки митохондрий Кардиология, 2002, №12, с 47-50

2 А Ю Постнов, Е Ю Будников, А Д Дорощук, О П Фомина Доклад «Дефицит клеточно-тканевого энергообразования при экспериментальной форме первичной гипертензии» Всероссийская научно-практическая конференция «Современные проблемы артериальной гипертонии» Москва, 22-24 апреля 2003

3 A Postnov, A Doroschuk, Y Budnikov, G Afanasjeva, A Pykhtina Features of calcium induced uncoupling of oxidative phosphorylation in SHR mitochondria Thirteenth European Meeting on Hypertension, Milan (Italy), June 13-17,2003

4 Y Budnikov, A Postnov, A Doroschuk, G Afanasjeva, Yu Postnov Decreased ATP Synthesis Ability of Liver Mitochondria in Spontaneously Hypertensive Rats Thirteenth European Meeting on Hypertension, Milan (Italy), June 13-17, 2003

5 Постнов А Ю, Будников E Ю , Дорощук А Д, Фомина О П Доклад «Новое в патогенезе первичной гипертонии нарушение синтеза АТФ митохондриями клетки» Конгресс ассоциации кардиологов стран СНГ, Санкт-Петербург, 18-19 сентября 2003

6 Дорощук А Д , Постнов А Ю , Афанасьева Г В , Будников Е Ю , Постнов Ю В Сниженная АТФ-синтезирующая способность митохондрий клеток головного мозга крыс со спонтанной гипертензией (SHR) Кардиология, 2004, т 44, №3, с 64-65

7 A Doroshchuk, A Postnov, G Afanasjeva, Y Budnikov Decreased ATP-synthesis ability of brain mitochondria in spontaneously hypertensive rats Fourteenth European Meeting on Hypertension, Paris (France), June 13-17,2004, S338 (P3 160)

8 Y Y Budnikov, A D Doroshchuk, G V Afanasjeva, A Y Postnov, Y V Postnov Decreased Ca2+ accumulation ability of liver mitochondria in spontaneusly hypertensive rats Fourteenth European Meeting on Hypertension, Paris (France), June 13-17, 2004, S340 (P3 171)

9 Будников E Ю, Постнов A IO , Афанасьева Г В , Дорощук А Д, Бусько Е В , Постнов Ю В Особенности кальций-индуцируемого выхода кальция из митохондрий печени сгюнтанно-гнпертензивных крыс Кардиология, 2005, т 45, №7, с 49-53

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД Х° 1-00007 от 25 09 2000 г Подписано в печать 12 10 07 Тираж 100 экз Уел пл 1,56 Печать авторефератов (495) 730-47-74, 778-45-60

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дорощук, Александр Дмитриевич

Список сокращений

I Введение

Цель работы

Задачи работы

II Обзор литературы

Артериальная гипертензия: история изучения, классификация, распространенность 9 Биоэнергетика: дыхательная цепь митохондрий, строение ЬГАТФ синтазного комплекса, транспорт кальция через внутреннюю митохондриальную мембрану

Биоэнергетическая модель АГ

Структурно-функциональные особенности митохондрий при АГ

Состояние клеточно-тканевой энергетики при АГ

III Материалы и методы и методы исследования

Экспериментальные животные

Выделение митохондрий из печени крысы

Выделение митохондрий из мозга крысы

Моделирование циклоспорин-зависимой гипертонии крыс

Моделирование ДОКА-солевой гипертонии крыс 70 Измерение скорости синтеза АТФ люцеферин-люциферазным методом

Определение концентрации белка методом Бредфорда

Определение скорости поглощение кислорода электродом Кларка 74 Определение скорости синтеза АТФ митохондриями печени с использованием ВЭЖХ 75 Определение скорости поглощения и выделения кальция митохондриями печени крысы

Статистическая обработка результатов

IV Результаты 80 Скорость синтеза АТФ митохондриями печени крыс линии БНЯ и ЖУ 80 Скорость дыхания митохондрий в состояниях 3 и 4, дыхательный контроль и отношение Р/О в митохондриях печени и ТОТ 82 Скорость дыхания митохондрий в состояниях 3 и 4, дыхательный контроль и отношение Р/О в митохондриях печени при ДОКА-солевой гипертензии 85 Скорость синтеза АТФ митохондриями головного мозга крыс линии БЬШ. и \УКУ, а также при циклоспориновой гипертензии СбА

Скорость дыхания митохондрий в состояниях 3 и 4, дыхательный контроль и отношение Р/О в митохондриях печени SUR и WKY, а также при циклоспориновой гипертензии СбА

Индуцируемый выход кальция из митохондрий БНЯ и \ViCY

V Обсуждение результатов

VI Выводы

VII Литература

Список сокращений

АГ - артериальная гипертензия

ГБ - гипертоническая болезнь

ЭГ - эссенциальная гипертензия

ПГ - первичная гипертензия (синоним ЭГ)

АД - артериальное давление

АМФ - аденозинмонофосфат

АДФ - аденозиндифосфат

АТФ - аденозинтрифосфат

ДК - дыхательный контроль

Р/О - коэффициент, равный числу молекул поглощенного фосфата к кислороду

SHR - Spontaneously Hypertensive rats (линия крыс со спонтанной гипертензией)

WKY - Wistar-Kioto rats (линия крыс с нормальным давлением, служащая контролем для SHR).

НАД4 - никотинамидадениндинуклеотид окисленный

НАДН - никотинамидадениндинуклеотид восстановленный

CsA - циклоспорин А

ДОКА - дезоксикортикостерона ацетат

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хромотография

CICR - calcium induce calcium release (кальций индуцируемый выход кальция)

MPT - mitochondrial permeability transition (переходная проницаемость)

АцН* - протонный электрохимический потенциал

А\|/т - митохондриальный мембранный потенциал

АрН - pH градиент на внутренней митохондриальной мембране

Ар - протон движущая сила

Ca ]с - концентрация свободного кальция в цитоплазме

Ca ]м - концентрация свободного кальция в митохондрии

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Дорощук, Александр Дмитриевич

5. Результаты работы свидетельствуют о том, что нарушение работы митохондрий (снижение ДК и синтеза АТФ, а также увеличение дыхания в состоянии 4) участвует в развитии рассмотренных выше видов экспериментальной гипертензии.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дорощук, Александр Дмитриевич, Москва

1. Бакеева J1.E., Ясайтис A.A. Изменения структуры митохондрий в ответ на функциональные воздействия. В кн.: Митохондрии. Молекулярные механизмы ферментативных реакций. М: Наука 1972; 56 - 64.

2. Бакеева JI.E., Зоров Д.Б., Мохова E.H. Функциональные особенности и ультраструктура митохондрий диафрагмы. Сб.: Регуляция энергетического обмена. М: Наука 1978; 103 112.

3. Болдырев A.A. Роль активных форм кислорода в функциональной активности нейронов. Успехи физиологических наук. 2003, Июль-Сен.; 34(3): 21-34.

4. Будников Е.Ю., Дорощук А.Д., Афанасьева Г.В. и др. Сниженная АТФ-синтезирующая способность митохондрий печени спонтанно гипертензивных крыс (SHR): роль кальциевой перегрузки митохондрий. Кардиология 2002; 12: 47-50.

5. Дорощук А.Д., Постнов А.Ю., Афанасьева Г.В., Будников Е.Ю., Постнов Ю.В. Сниженная АТФ-синтезирующая способность митохондрий клеток головного мозга крыс со спонтанной гипертензией (SHR). Кардиология, 2004, 3, 64-65.

6. Емелина Л.П., Некоторые фосфорно-энергетические показатели крови у больных гипертонической болезнью. Врач дело 1972; 8: 10 13.

7. Котык. А., Яначек К., Мембранный транспорт. Москва. Мир. 1980. с.147.Л I

8. Кравцов Г.М., Покудин Н.И., Орлов С.Н. Са аккумулирующая способность митохондрий сарколеммы и саркоплазматического ретикулума сердца крысы. Биохимия 1979; 44: 2058-2065.

9. Кушаковский М.С. Гипертоническая болезнь. Санкт-Петербург: СОТИС, 1995.-311.

10. Ланг Г. Ф. Гипертоническая болезнь. М.: Медгиз,1950.

11. Леви Н., Сикевиц Ф. Структура и функция клетки. М., «Мир», 1971.

12. Левицкий Д.О. Кальций и биологические мембраны. Москва. Высшая школа. 1990. с. 45.

13. Мясников А. Л. Гипертоническая болезнь и атеросклероз. М.: Медицина, 1965.

14. Орлов С.Н., Покудин Н.И., Кравцов Г.М. Механизм регуляцииЛ 1внутриклеточного распределения Са в жировой ткани. Биохимия, 1980; 45: 408-416.Л |

15. Орлов С.Н, Покудин Н.И., Постнов Ю.В. Са -аккумулирующая способность мембран миокарда и гладкой мускулатуры крыс со спонтанной генетической гипертензией. Кардиология 1980; 2: 94-100.

16. Писаренко О.И., Студнева И. М., Постнов А.Ю., Особенности энергетического состояния тканей при спонтанной гипертензии крыс (8НЯ). Кардиология 1998; 12:37 40.

17. Постнов Ю.В., Орлов С.Н., Покудин Н.И. Данные о нарушении аккумуляции и связывании кальция мембранами клеток жировой ткани у крыс со спонтанной гипертензией. Кардиология 1980; 1: 64 68.

18. Постнов Ю.В., Орлов С.Н. Первичная гипертензия как патология клеточных мембран. М. Медицина, 1987.

19. Постнов Ю.В. К истокам первичной гипертензии: подход с позиции биоэнергетики. Кардиология 1998; 38: 12: 41-48.

20. Постнов Ю.В. К развитию мембранной концепции патогенеза первичной гипертензии (нарушенная функция митохондрий и энергетический дефицит). Кардиология 2000; 10: 4-12.

21. Постнов Ю.В., Бакеева Л.Е., Цыпленкова В.Г., Постнов А.Ю. Нарушение ультраструктуры митохондриального аппарата кардиомиоцитов крыс со спонтанной гипертензией (БИЛ). Кардиология 2000; 1: 55 63.

22. Постнов Ю.В. О роли кальциевой перегрузки митохондрий и энергетического дефицита в патогенезе первичной артериальной гипертонии. Арх. пат 2001; 3:3-12.

23. Постнов Ю. В. Недостаточность образования АТФ в связи с кальциевой перегрузкой митохондрий как источник повышения артериального давления при первичной гипертензии. Кардиология 2005; 10: 4 11.

24. Постнов Ю. В. О роли недостаточности митохондриального энергообразования в развитии первичной гипертензии: нейрогенная составляющая патогенеза гипертензии. Кардиология 2004; 6: 52 58.

25. Al Nasser I., Crompton M. The reversible Ca -induced permeabilization of rat liver mitochondria. Biochem. J. 239:19-29,1986.

26. Aringer L., Eneroth P., Nordstrom L. Side chain hydroxylation of cholesterol, campesterol and beta-sitosterol in rat liver mitochondria. J Lipid Res. 1976 May;17(3):263-72.

27. Babcock D. F., Herrington J., Goodwin P, C., Park Y. B., Hille B. Mitochondrial participation in the intracellular Ca network. J. Cell Biol. 136: 833— 844,1997.I

28. Becker G. L., Fiskum G., Lehninger A. L. Regulation of free Ca by liver mitochondria and endoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 255: 9009-9012,1980.

29. Bernardi P., Basso E., Colonna R., Costantini P., Di Lisa F., Eriksson O., Fontaine E., Forte M., Ichas F., Massari S. Perspectives on the mitochondrial permeability transition. Biochim. Biophys. Acta 1365: 200-206,1998.

30. Bernardi P., Petronilli V. The permeability transition pore as a mitochondrial calcium release channel: a critical appraisal. J. Bioenerg. Biomembr. 28: 131-138, 1996.

31. Boldyrev A.A. Protection of proteins from oxidative stress: a new illusion or a novel strategy? Annals of the New York Academy of Sciences. 2005 Dec.; 1057: 193-205.

32. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.Anal Biochem. 1976 May 7;72:248-54.

33. Brand M. D., De Selincourt C. Effects of glucagon and Na+ on the control ofIextramitochondrial free Ca concentration by mitochondrial from liver and heart. Biochem. Biophys. Res. Commun. 92:1377-1382,1980.

34. Braun Menendez E., Fasciolo J. C., Leloiz J. C. et al. La substancia hipertensora de la sangre del rinon isquem iado. Rev. Soc. Argent. Biol., 1939, vol. 15, p. 420-425.

35. Brustovetsky N., Dubinsky J. Dual responses of CNS mitochondria to elevated calcium. J. Neuroscience, 2000; 20(1): 103-113.

36. Budd S. L., D. G. Nicholls D. G. A re-evaluation of the role of mitochondria in neuronal calcium homeostasis. J. Neurochem. 66: 403-411,1996.

37. Chalmers S., Nicholls D. G. The Relationship between Free and Total Calcium Concentrations in the Matrix of Liver and Brain Mitochondria. J. Biol. Chem. Vol. 278, No. 21, Issue of May 23, pp. 1 9062-19070, 2003

38. Camus J.P. Goutte, diabete, hyperlipemia un trisyndrome metabolique. Rev Rhumat 1966; 33:10-14.

39. Chance B., Williams G.R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. I. Kinetics of oxygen utilization. J. Biol. Chem. 1955; 217, 383-393.

40. Chance B., Williams G.R. Respiratory chain and oxidative phosphorylation. Advanc. Enzymol. 1956; 17, 65-134.

41. Chappell J.B. The effects of 2,4-dinitrophenol on mitochondrial oxidations .Biochem J. 1964 Feb;90(2):237-48.

42. Christe M.E., Rodgers R.L. Altered Glucose and Fatty Acid Oxidation in Hearts of the Spontaneously Hypertensive Rat. J Mol Cell Cardiol 1994; 26:1371 1375.

43. Crompton M., Moser R., Ludi H., Carafoli E. The interrelations between the transport of sodium and calcium in mitochondria of various mammalian tissues. Eur. J. Biochem. 82: 25-31, 1978.

44. Cutilleta A.F., Benjamin M., Culpepper W.S., Oparil S. Myocardial hypertrophy and ventricular performance in the absence of hypertension in spontaneously hypertensive rats. J Mol Cell Cardiol 1978; 10: 689 703.

45. Das A.M., Harris D.A., Mitochondrial ATP syntase regulation in heart: defects in hypertension are restored after treatment with captopril. Cardioscience 1992; 3(4): 227-232.

46. DelucaM. Firefly luciferase. Enzymol Relat Areas Mol Biol. 1976; 44:37-68.

47. Devynck M.A., Pernollet M.G., Nupeg A.M. et al. Calcium binding alteration of plasma membrane from various tissues of spontaneously hypertensive rats. Clin. Exp. Hypert., 1981:4; 798-808.

48. Duchen M. R. Ca -dependent changes in the mitochondrial energetics in single dissociated mouse sensory neurons. Biochem. J. 283:41-50,1992.

49. Emmel E.A., Verweij C.L., Durand D., Higgins K.M., Lacy E., Crabtree G., Cyclocporin A specifically inhybits function of nuclear protein involved in T cell actibation. // Science 1989, 246:1617-1620.

50. Erecinska M., Nelson D., Deas J., Silver I. A. Limitation of glycolysis by hexokinase in rat brain synaptosomes during intense ion pumping. Brain Res. 726: 153-159, 1996.

51. Erecinska M., Nelson D., Silver I. A. Metabolic and energetic properties of isolated nerve ending particles (synaptosomes). Biochim. Biophys. Acta 1277: 1334,1996.

52. Ferrannini E., Buzzigoli G., Bonadonna R. et al. Insulin resistance in essential hypertension. N Engl J Med 1987; 317: 1595-1607. ■

53. Folkow B. Mental stress and its importance for cardiovascular disorders; physiological aspects, "from-mice-to-man". Scand Cardiovasc J. 2001 Jul; 35(3): 163-72.

54. Friel D. D., Tsien R. W. An FCCP-sensitive Ca21 store in bullfrog sympathetic neurons and its participation in stimulusevoked changes in Ca .i. J. Neurosci. 14: 4007-4024,1994.

55. Gerkens J. F. Cyclosporin treatment of normal rats produces a rise in blood pressure and decreased renal vascular responses to nerve stimulation, vasoconstrictors and endothelium dependent dilators. J. Pharmacol Exp. Ther. 1989 Sep; 250(3): 1105-12.

56. Gunter T. E., Gunter K. K., Sheu S.-S., Gavin C. E. Mitochondrial calcium transport: physiological and pathological. Am. J. Physiol. 267 (Cell Physiol. 36): 313 — 339,1994.

57. Halestrap A. P., Kerr P. M., Javadov S., Woodfield K. Y. Elucidating the molecular mechanism of the permeability transition pore and its role in reperfusion injury of the heart. Biochim. Biophys. Acta 1366: 79-94,1998.

58. Handchumacher R.E., Harding M.W., Rice J., Drugge R.J. Cyclophilin: a specific cytosolic binding protein for cyclosporin A. // Science 1984,226:544-547.

59. Hansford R. G., Castro F. Role of Ca2+ in pyruvate dehydrogenase interconversion in brain mitochondria and synaptosomes. Biochem. J. 227: 129— 136,1985.I

60. Hansford R. G. Physiological role of mitochondrial Ca transport. J. Bioenerg. Biomembr. 26: 495-508,1994.

61. Harris R. A., Williams C. H., Caldwell M., Green D. E., Valdivia E., Science, 165. pp 700 -703. 1969.

62. Herrington J., Park Y. B., Babcock D. F., Hille B. Dominant role of mitochondria in clearance of large Ca2+ loads from rat adrenal chromaffin cells. Neuron 16: 219-228,1996.

63. Hertz L., Drejer J., Schousboe A. Energy metabolism in glutamatergic neurons GABAergic neurons and astrocytes in primary cultures. Neurochem. Res. 13: 605610,1988.

64. Hoek J. B., Rydstrom J. Physiological roles of nicotinamide nucleotide transhydrogenase. Biochem. J. 254:1-10,1988.

65. Hunter D. R., Haworth R. A. The Ca -induced membrane transition in mitochondria. I. The protective mechanisms. Arch. Biochem. Biophys. 195: 453— 459,1979.

66. Hunter D. R., Haworth R. A., Southard J. H. Relationship between configuration, function, and permeability in calciumtreated mitochondria. J. Biol. Chem. 251: 5069-5077,1976.

67. Huser J., Rechenmacher C. E., Blatter L. A. Imaging the permeability pore transition in single mitochondria. Biophys. J. 74: 2129-2137,1998.

68. Huser J., Blatter L.A. Fluctuations in mitochondrial membrane potential caused by repetitive gating of the permeability transition pore. Biochem J. 1999; 343; 311317.

69. Ichas F., Jonaville L.S., Mazat J.P. Mitochondria are excitable organelles capable of generating and conveying electrical and calcium signals. Cell, 1997; 89: 1145-1153.

70. Jalicks L.A., Gupta R.K. Intracellular free magnesium and high energy phosphates in the perfuses normotensive and spontaneously hypertensive rat heart -a PNMR study. Am J Hypertension 1991; 4: 131 136.

71. Johnson D., Lardy H. Isolation of liver or kidney mitochondria//Methods of Enzymology//R.Estabrook, M. Pullmam eds. Acad. Press. N. Y.; L., 1967. Vol. 10.

72. Kauppinen R. A., Nicholls D. G. Synaptosomal bioenergetics: the role of glycolysis, pyruvate oxidation and responses to hypoglycaemia. Eur. J. Biochem. 158:159-165, 1986.

73. Krasinskaya I.P., Marshansky V.N., Dragunova S.F., Yaguzhinsky L.S. Relationships of respiratory chain and ATP-synthetase in energized mitochondria. FEBS Letters. 1984 February; 167(1): 176-180.

74. Kravtsov G.M., Orlov S.N., Pokudin N.I., Postnov Y.V. Calcium transport in synaptosomes and subcellular membrane fractions of brain tissue in spontaneously hypertensive rats. Clin. Sci., 1983, 65:127-135.

75. Lehninger A.L., Carafoli E., Rossi C.S. Energy-linked ion movements in mitochondrial systems. Advances in Enzymology and Related Areas, 1967; 29: 259-320.

76. Lehninger A. L. Role of phosphate and other proton-donating anions in respiration-coupled transport of Ca2+ by mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71:1520-1524,1974.

77. Lemasters J.J., Hackenbrock C.R. Continuous measurement of adenosine triphosphate with firefly luciferase luminescence. Methods in enzymology. 1979; Vol. LVI, 530 544.

78. Lemasters J.J., Hackenbrock C.R. Adenosine triphosphate: continuous measurement in mitochondrial suspension by firefly luciferase luminescence. Biochem Biophys Res Commun. 1973 Dec 19; 55(4): 1262-70.

79. Maechler P., Wang H., Wollheim C.B., Continuous monitoring of ATP levels in living insulin secreting cells expressing cytosolic firefly luciferase. FEBS Lett. 1998 Feb 6; 422(3):328-32.

80. Maurer G., Loosli H., Schreuer E., Keller B. Disposition of cyclosporine in several animal spicies and man. I. Structural elucidation of its metabolites. // Drug Methab. Dispos. 1984,12:120-126.

81. McCormack J. G., Halestrap A. P., Denton R. M. Role of calcium ions in regulation of mammalian intramitochondrial metabolism. Physiol. Rev. 70: 391— 425,1990.

82. Meyer S., Noisommit-Rizzi N., Reuss M., Neubauer P. Optimized analysis of intracellular adenosine and guanosine phosphates in Escherichia coli. Anal Biochem. 1999 Jun 15;271(l):43-52.

83. Miller R.J. Mitochondria - the kraken wakes! Trends in Neurosciences, 1998, 21:95-97.

84. Mitchell P. Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemi-osmotic type of mechanism. Nature. 1961 Jul 8; 191: pp. 144-8.

85. Mitchell P., Moyle J. Estimation of membrane potential and pH difference across the cristae membrane of rat liver mitochondria. Eur. J. Biochem. 7: 471-484, 1969.

86. Mitchell P: Keilins respiratory chain concept and its chemiosmotic consequences. Science 206: 1148-1159; 1979.

87. Modan M., Halkin H., Almog S. et al. Hyperinsulinemia: a link between hypertension, obesity and glucose intolerance. J Clin Invest 1985; 75: 809-817.

88. Munn E. A., The structure of mitochondria. Academic press. New York. 1974.

89. Nedergaard J., Cannon B., Overview preparation and properties of mitochondria from different sources. Methods in enzymology. Vol. 55; 3 - 28.

90. Nicholls D. G. The influence of respiration and ATP hydrolysis on the proton electrochemical potential gradient across the inner membrane of rat liver mitochondria as determined by ion distribution. Eur. J. Biochem. 50: 305-315, 1974.

91. Nicholls D. G. Hamster brown adipose tissue mitochondria: the control of respiration and the proton electrochemical potential by possible physiological effectors of the proton conductance of the inner membrane. Eur. J. Biochem. 49: 573-583,1974.

92. Nicholls D. G. The effective proton conductances of the inner membrane of mitochondria from brown adipose tissue: dependency on proton electrochemical gradient. Eur. J. Biochem. 77: 349-356, 1977.A I

93. Nicholls D. G. The regulation of extra-mitochondrial free Ca by rat liver mitochondria. Biochem. J. 176: 463-474,1978.

94. Nicholls D. G., Scott I. D. The regulation of brain mitochondrial calcium-ion transport: the role of ATP in the discrimination between kinetic and membrane-potential-dependent Ca efflux mechanisms. Biochem. J. 186: 833-839,1980.

95. Nicholls D. G., Akerman K. E. 0. Mitochondrial calcium transport. Biochim. Biophys. Acta 683: 57-88,1982.

96. Nobes C. D., Brown G. C., Olive P. N., Brand M. D. Non-ohmic proton conductance of the mitochondrial inner membrane in hepatocytes. J. Biol. Chem. 265:12903-12909,1990.

97. Okamoto K., Aoki K. Development of a strain of spontaneously hypertensive rats. Jpn. Circ. J., 1963,27: 282-293.

98. Ouhabi R., Boue-Grabot M., Mazat J.P., Mitochondrial ATP synthesis in permeabilized cells: assessment of the ATP/O values in situ. Anal Biochem. 1998 Oct 15; 263(2): 169-75.

99. Page I., Helmer O. A crystalline pressure substance (angiotensin) resulting from the reaction between renin and rennin activator! -J. Exp. Med., 1940, vol. 71, p. 29-42.

100. Page I. H. The mosaic theory of arterial hypertension: its interpretation. -Perspect. Biol. Med., 1967, vol. 10, p. 325-333.

101. Packer L., Worthington L. In: The biogenesis of mitochondria (A. M. Kroon and C. Saccone, eds.), pp. 537-540. Academic press. New York. 1974.

102. Pauwels P. J., Opperdoes F. R., Trouet A. Effects of antimycin, glucose deprivation, and serum on cultures of neurons, astrocytes, and neuroblastoma cells. J. Neurochem. 44:143-148,1985.

103. Petrukhina V.A., Zaretsky D.V., Postnov A.Y. et al. Vectrocardiographic investigation of SHR x WKY intercross F hybrids. European Meeting on Hypertension, 9-th: Abstracts. Milan 1999; 271.

104. Pickering G. W. Systemic arterial hypertension. In: Circulation of the blood. Men and ideas/Ed. A. P. Fishman, D. W. Richards. London, 1964, p. 487 - 541.

105. Pisarenko O.I., Studneva I.M., Postnov A.Y., Postnov Y.V. Alteration of cellular energy state in tissues of spontaneously hypertensive rats. European Meeting on Hypertension, 9-th: Abstracts. Milan 1999; 105 106.

106. Postnov Y.V., Orlov S.N. Features of intracellular calcium distribution in the adipose tissue of spontaneously hypertensive rats. Experientia 1979; 35:1480-1481.

107. Postnov Y.V., Orlov S.N. Evidence of altered calcium accumulation and calcium binding by the membranes of adipocytes in spontaneously hypertensive rats. Pflugers Arch 1980; 380: 85-89.

108. Postnov Y.V., Orlov S.N., Pokudin N.I. Alteration of intracellular calcium distribution in adipose tissue of human patients with essential hypertension. Plugers Arch., 1980: 388; 98-91.

109. Postnov Y.V., Orlov S.N., Pokudin N.I. Alteration of the intracellular calcium pool of adipose tissue in spontaneously hypertensive rats: no effect of peripheral immunosympathectomy. Pfltig. Arch., 1981; 390: 256-259.

110. Postnov Y.V., Orlov S.N. Alteration of cell membranes in primary hypertension. In: Hypertension Physiopathology and Treatment (2 Ed.) Eds. J. Genest et al. New York Toronto: McGrow Hill Company 1983; 95-108.

111. Postnov Y.V., Orlov S.N. Cell membrane alteration as a source of primary hypertension. J.Hypertens., 1984; 2:1-6.

112. Resnick L.M., Gupta R.K., Barbagallo M., Laragh J.H. Is the higher incidence of ischemic disease in patients with hypertension and diabetes related to intracellular depletion of high energy metabolites? Am J Med Sci 1994; 307: Suppl 1:66-69.

113. Rizzuto R., Bastianutto C., Boni M. et al. Mitochondrial Ca homeostasis in intact cells. J Cell Biol 1994; 126:1183-1194.

114. Robb-Gaspers L. D., Burnett P., Rutter G. A., Denton R. M., Rizzuto R., Thomas A. P. Integrating cytosolic calcium signals into mitochondrial metabolic responses. EMBO J. 17: 4987-5000,1998.

115. Rolfe D. F., Brand M. D. The physiological significance of mitochondrial proton leak in animal cells and tissues. Biosci. Rep. 17: 9-16,1997.

116. Ronquist G., Soussi B., Frithz A. et al. Disturbed energy balance in skeletal muscle of patients with untreated primary hypertension. J Int Med 1995; 238: 167 -174.

117. Rosing J., Slater E. C. The value of delta-Go for the hydrolysis of ATP. Biochim. Biophys. Acta 267: 275-290,1972.

118. Rossi C. S., A. L. Lehninger A. L. Stoichiometry of respiratory stimulation, accumulation of Ca2+ and phosphate and oxidative phosphorylation in rat liver mitochondria. J. Biol. Chem. 239: 3971-3980,1964.

119. Rydstrom J., Cruz A. T., Ernster L. Factors governing the kinetics and steady state of the mitochondrial nicotinamide nucleotide transhydrogenase system. Eur. J. Biochem. 17: 56-62,1970.

120. Schenk J., McNeill J.H. The pathogenesis of DOCA-salt hypertension. J. Pharmacol Toxicol Methods. 1992 May; 27 (3): 161 70.

121. Sellevold O.F.M., Jynge P., Arstad P. High performance liquid chromatography: a rapid isocratic method for determination of creatine compounds and adenine nucleotides in myocardial tissue. J Mol Cell Cardiol 1986; 18: 517-527.

122. Sesoko S., Pegram B. L., Willis G. W., Fröhlich E. D. DOCA-salt induced malignant hypertension in SHR. J. Hypertension 1984 Feb.; Vol. 2 (1): 49 54.

123. Sims N. Rapid isolation of metabolically active mitochondria from rat brain and subregion using percoll density gradient centrifugation. J Neurochem 1990; 55: 698 707.

124. Skulachev V. P. Role of uncoupled and non-coupled oxidations in maintenance of safely low levels of oxygen and its one-electron reductants. Q. Rev. Biophys. 29: 169-202,1996.

125. Spector T. Refinement of the coomassie blue method of protein quantitation. A simple and linear spectrophotometry assay for less than or equal to 0.5 to 50 microgram of protein. Anal Biochem. 1978 May;86(l): 142-6.

126. Stumpf D. A., Haas R., Eguren L. A., Parks J. K., Eilert R. E. Protonmotive force in muscle mitochondria. Muscle Nerve 5: 14-19, 1982.r

127. Svichar N., Kostyuk P., Verkhratsky A. Mitochondria buffer Ca entry but not intracellular Ca2+ release in mouse DRG neurones. Neuroreport 8: 3929-3932, 1997.

128. Tew W. P., Mahle C., Benavides J., Howard J. E., Lehninger A. L. Synthesis and characterization of phosphocitric acid, a potent inhibitor of hydroxylapatite crystal growth. Biochemistry 19:1983-1988,1980.

129. Thayer S. A., Miller R. J. Regulation of the intracellular free calcium concentration in single rat dorsal root ganglion neurons in vitro. J. Physiol. (Lond.) 425:85-115,1990.

130. Van Berkel T.J., Kruijt J.K. Different types of mitochondria in parenchymal and non-parenchymal rat-liver cells.Eur J Biochem. 1977 Feb 15;73(l):223-9.

131. Vickers A., Fischer V., Connors S., Fisher R., Baldeck J., Maurer G., Brendel K. Cyclosporin A metabolism in human liver, kidney, and intestine slices. Comparison to rat and dog slices and human cell lines. // Drug Methab. Dispos. 1992,20(6):802-809.

132. Vinogradov A.D. Respiratory complex I: structure, redox components, and possible mechanisms of energy transduction. Biochemistry (Mosc). 2001 Oct.; 66(10): 1086-97.

133. Wainio W. W., The mammalian mitochondrial respiratory chain. Academic press. New York. 1970.

134. Welborn T.A., Breckenridge A., Rubinstein A.H. et al. Serum Insulin in essential hypertension and in peripheral vascular disease. Lancet 1966: i: 1 13361337.

135. Werth J. L., Thayer S. A. Mitochondria buffer physiological calcium loads in cultured rat dorsal root ganglion neurons. J. Neurosci. 14: 346-356,1994.

136. Whelton P.K. Epidemiology of hypertension. // Lancet, 1994. - V. 344. - 101 -106.

137. White R. J., Reynolds I. J. Mitochondria and Na+/Ca2+ exchange buffer glutamate-induced calcium loads in cultured cortical neurons. J. Neurosci. 15: 1318-1328,1995.

138. Wibom R., Lundin A., Hultman E. A sensitive method for measuring ATP-formation in rat muscle mitochondria. Scand J Clin Lab Invest. 1990 Apr;50(2): 143-52.

139. Yamori Y. Physiopathology of the various strains of spontaneously hypertensive rats. In: J. Genest et al (Eds.). Hypertension: physiopathology and treatment (2nd Edit). Mc Graw Hill Comp., N-Y-Toronto, 1983, p. 556-581.

140. Zakaria M., Brown P.R. High-performance liquid chromatography of nucleotides, nucleosides and bases. J Chromatogr. 1981 Dec ll;226(2):267-90.

141. Zhang L., Summers K.M., West M.J. Analysis of linkage of the ACE locus with measures of cardiac hypertrophy in the spontaneously hypertensive rat. Clin Exp Pharmacol Physiol 1996;.23:.6-7:597-599.

142. Zoccarato F., Nicholls D. G. The role of phosphate in the regulation of thefyiCa efflux pathway of liver mitochondria. Eur. J. Biochem. 127: 333-338, 1982.

143. Zoratti M., Szabo I. The mitochondrial permeability transition. Biochim Biophys Acta 1995; 1241; 139-176.

144. Zoratti M., Szabo I. Electrophysiology of the inner mitochondrial membrane. J. Bioenerg. Biomembr. 26: 543-553, 1994.