Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональные особенности хроматина при блокировании ядерных деацетилаз

ВАК РФ 03.00.17, Цитология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональные особенности хроматина при блокировании ядерных деацетилаз"

По 9.0'

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ ЛИТОВСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

СТЯПОНАВИЧЮТЕ ДАНГУОЛЕ ВЛАДОВНА

УДК 691.392:677.218

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ХРОМАТИНА ПРИ БЛОКИРОВАНИИ ЯДЕРНЫХ ДЕАЦЕТИЛАЗ

03.00.17 - эмбриология, гистология и цитология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ВИЛЬНЮС -1990

Работа выполнена в ласотгртрин биотехнологии Института биохимии литовской Акалешц* наук.

Научный руководитель - доктор биологических наук

A.A. Гинеитяс

Официальные оповенты - доктор биологических наук.

профессор A.A. Нейфах. - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Й.А. Рачкус

Ведущая организация - институт цитологии АН СССР

&аяита состоится "tZ" июня 1990 г. в П часов на заседании специализированного совета К 011.05.01 в институте биохимии литовской Академии наук. 232021 г. Вильнюс, ул. мокс-лининку, 12.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института биохимии Литовской АН.

Автореферат разослан "42." мая 1990 г.

ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

rS S-

'V. cfvOL** ( _

/С В.Ф. SOBJiTE-БРАЖЕНЕНЕ

V и i'

и. З.г). ,1:цр;а <-тдел

г зглрлкти'нстшса 1'jibow

Астуальнозть теши Ваяной проблемой современной биологии является регулнрозаш« функционирования генома в эукариоти'жо -тм клетках. наряду оо апецифи'чеокшш факторами < регулятор« .«м езясшпь gepu,tira<st) значительную роль antuь играют отруктур-и;:? сяеп неточного ядро. Среди гкхшдипх »mwwwroa пютсш. (mwitrnz-'w :тк ыжхоя оаогтиттп ш&9евж.тяхтг>> гмс и •;H->ro4:"oJ:5H»if:i о<5рат!г«ю! ncaToiatTüTii'KíVHM« мрякзпшишпг* ; сьопотбл ut ноллсул. •

02KÓII ГГЛ c»J:fOB!lUX ПОЭТОИОТсПИУУК'ПС МОДЙДОСаЦКЛ пютовоь. ооохчвлкодгп. ooro» пу^госсжи. платан оорагл::о:? пцетш1'!гс;м-ufa. ; •пягагрупи опрздикшииж якзиноадк с^татпсч ологцооть. «ta :;r¡'¡ п утгаироальиость юханизмоа эдшгхфошиисУдешклшли-роштя гиотоаоа указывав? «а вагнуп роль »топ »кдавшнаи и Оушшионнровашш хроматина, ио иногис яооязяовашт ooimpyudj ивгаь гзтгп1лиров;пшл пистонов а ю^зкгшишл й структур® пук-íwocoiüí. компшсгнооти хроматина. а пераз это - и о рогулашкп 'фзнокршщиогшой активности опроделйнпых участкои- геногэ. однако даншз. получзннмв как т различных бкояогпчеокпх объектах. так и разшнш методами из тех г;з озтектах ввои'а кзодио-:'<}~:чии, и вопроо о рол! ашгшлпроэанля тотоноя в траискршши-<,:шоП яюттноотц и других процессах клеточного ;шра до сих пор чят&поя открутим. , ,

•Лля изучения роли ацспшфования пмтоиоз а отру.ктурио-Фунчшюизлы!'- и состоянии хронзтина целезообраэпо попользовать околсгйчйосиа спотеш. проходящие яиМерешшацию. так как при aro;.) нзшкггоя и структура, и фушадиошфование хронатшю. ü rvroíl связи з настоящей рзооте в качества биологической модели оил попользован ранний эмбриогенез морокого esa. одним из наголо», широко используемых в настоящее время длл исследования ацзтшшрования потопов, явл;стоя нарушение обмена ацетильных групп при помощи ингибитора ядеринх деаиетилаз бутирата натрия.

Диссертационная работа выполнена в рамках Всесоюзной h.'í-

учпО'ТешижхпюП прогршш 0,?Г).05 по темам, разрзоативг»мш в Институте биохимии Литовски« лн. я гоорепютрации которих 0Г.53.0 003991 i! 01.87«00-Í99I2 0.74.05.

Ноль работы: исследование Футпшионлрования и структуры хромэтша'зарБдйисП ¡.¡орского ею в условиях блокирован™ ядерных деанетшюз.

зядп'ш раооты»

ГГтоучить влияние на раннее развитие оарояышея морского ежа разных концентраций ингибитора ядерных лоацстилаз бутирота натрия » течение разного времени. Подобрать уоло&ия для даль-' нейпгего анализа влияния нарушенного обмана ацетильных групп гиотонов на функлионироааниг клеточного ядра;

определить уровень ацетшшровать пютоноэ зародывоп морского ска » условиях блокирования первичной дифференциации клеток «утиратом натрия:

3) последовать степень компактности гипераютлировашюго хроютииа зародышей морского esa;

4) последовать гаггеношшооть синтеза нуклеиновых киоло'- в уодолияг гипирэигпчш1ров.ишл пююнов зародышей морского ека;

ö) сравнить особенности оислрсоони генов, кодирующих ранние и пдадшю изофорыы гнотонов. шстгч и белки теплового шока, ß уолопиях нарушенного обмтз ацетильных групп о экопрссоисл nuix itiitoo во время нормального развития зародыкей.

Научная новизна, при изучении структурно-функциотлышх »^гчуепноотей хроматика зародышей ыорокого esa при блокироаа-нин >ui>:pffU3c деацетнлаз бутнратом натрня показано, что низкие концепт рации (5-15 ыш этого ингибитора верных деацетилаз питонов не обладает общим шгготокоичеокиы действием. но п период высокой морфогензтипаокой активности клеточного ядра блокируют дифференциацию клеток и морфогенез зародышей. Бра-шшое воздействие бутирата' натрия в начале развития частично обратимо, так как вызывает.окзогаотруляцшо, а степень развития зародыша обратно пропорциональна концентрации и продолжительности присутствия в среде этого вещества.

Установлено, что при ингибировании ядерных деацетилаз бут тирзтом натрия в течение первых II-12'клеточных циклов практически все молекулы гиотона Н4 и большая чаоть молекул других ■ гиотонов зародышей морового ежа подвергаются .гиперацетилирова-тда до необнаруженного в природе уровня. 1 ' ' '

Показано, что птерппетшшрояашы потопов. индуцирован-нов буткратсм натрия, не приводит ¡с детшшшшцин хроматин?! аародикеп - морского еза.

Выявлено, что при блокировании обтш аиегильпш: групп потопов бутиратои натрия в зародшаг wojwKoro esa продолжают ®yjuc~ цпскировать юхаигаш клеточного ядра, рзгулируюиие экопрзаопгз рашвгх н поздних гистоиовых генов но оптогенэтическоп nporpsM-

вкшчзнкз и вшшочешге генов теплового пока. овозвргганиез шсяючешк гена аютща.

Практическая цеписать работы. Разработан !ггтод получв-солее 90% знзогастрзЩфовпннйх зарояшгеЯ морского еза. которые шгут енть иопояьзов1л* при исследовании кзхмишов яввзермшиации кяаток и морфогенеза. разработал штол получения хроматина. шкоштяьно птерацетилировадаого in vivo. Такой хроматин могот быть попользован в далыкпинх исолзло-ваяиях ыеяаииэиов Я1Ф5ергвдпашш кязток.н роли аютшлфовашиг гиотонов в Функционировании клеточного ядра.

Лашше мгтодтш внедрим в Институт шггояопш АН ссср и в институте 6Иохю!ИИ Литовской Alf. '

Результаты роботы попользуются при чтении лекция по молекулярной тактика для отуяэнтов V курса жтотеокего факультета гшьнмекого j'ooyinibepcimrra по специальности "бяооргвни'кокэя химия".

Апробация работа» материал» диссертационной: роботы были

иргдотевлсш! и докладывались иа IV оаезде бпохимякоп литом свильнет» 1350). из VI Сопетоко-итальяноко!» симпозиу»« "Макромолекулы фушегаюнируюией юягпш" (Ленинград. i960 г.). из плгелиоп встрече. Африканского обпеотва оиологов кдтгкн. Хьюстон. США. 1983 и на vi №2лу»яродном симпозиума "Биология развития морского esa" (Паоифйк Грув. сшл. 10Э0).

публикации. По теие диссертации опубликованы з статьи и тезисы 2 докладов.

i -

структура и объем ралотн. Диссертация состоит из введения. обзора л11тературиГ15когюртда!1тяль11оЯ части, изложения результатов. их обсуждения, выводов и списка цитируемой лиге-

' pirxypu fíAó" яотсшяков). работа ьыполкэна ta страницах мдшянопйййиго текста. иллюстрируется 24 ряоухисами и I

ор/шсг и ш2т0л.н доследования

, o<netff кослдования - зародыш • иороких еаай stronsylor '.wrottw droRí<ño?ü8f¿vls г? straisylpoentrouis intercsdlus. а тзккз »шююнгиш m nrn яуклеиювые кислоты и салки.

, ' , Уйрейьдаги короких вясИ выращивали по стандартной ызтодш г. фийь-rpüaaimo!] морской воде в приоуготвии определенных кои иентргш-ш гутирятд /'.атрия (подопытные зародыши) или без неп ucom {юлышк зародыш) при 7-9°С (Е^. clroefcaohlcnsls) и при l-Y'C :}с. 1п1егш«Нш). ■ '

¡{ара клеток зэродьшгй морежого саз выделяли по иэтоду Рй~ am» <¡ стр. /Enzín et м. 13?'э/. Гидролиз клеточных ядер мше-•■ткмкй' нуюм**ои мо'а/мг ядер) проеодг/лн при 07°с в оуфэрс ttítrí nwpo «m. оол<'рйат1'Иош са24 (0.25 м сахарозы« ю ми 1ГИЗ-НС1. рй Т,ъ, ю vil! nací, .1 caci2). а продукты гидро-экстрагировали раствором. оодэрташим по 0.7 Н НС104 з

N4.51.,

Общий гистон го кдэточтгк ядер экстрагировал« 0,4 и '*-¡50.. оевхкэли иа холодо &5'Л отшолом. выделенный овяш» пю

А

то-} фракционировали при пеиоая электрофореза в дашюкршикп 5¡fi;w лда в kiítiiohhdí; злгктрофорогичвокой еноте«. оодергаыол £ М м&чевчиы к б Ш тритона X-IOO /2v«:ldler, 1976/ или сгз ьтог г/герген'Гй /Panj'iM, сцэШеу, 1969/.

освш сеток зародышей <ш фракшилшрован при помощи эла тро^чргаг) в полигкрилашдном то в анионн- ti элоктрофоретичэо к"В сиотйш. содержащей додешшульфат натрия /ЬаешшИ. 19/0/, ДНК го зародышс-я. .визированных в растворе, содс-ркапг o.t>% дотитульфат натрия» I шл wsci, ю мм rpiw-Hci. рн а, с I мм здта, выделяли зянолыю-хлороформной экстракцией.

Ос-шу» piffl выделяли по ыодафицированноиу ызтоду Кравенз соавл /Kravetz Ы al. 1986/. впоследствии ота PítK была фрак нйоялровчна при п.моии электрофореза в денатурирующих уолоы в згэрезпом sí по.гкакрилам:гшоы гелях /Маниаткс и др.. 1Э8Д-РНК tn гел(лП эдектро-зоретичвдки йзреносшш на шмбрада "Zeta

ft • Frobs". и долее проводили ев слот-гибридизацию о пробам« ДНК.

•VI

шчешшми р метолом ншс-траполлпии /Нз"натйс и др.,

Радиоактивность нуклеиновых кислот в раствора отделяли s спинтилляционной хндкости рсз при mmm яидкостно -оцшгтя -ляшкншого спектрометра, Радиоактивности Фракция селкоз п нуклеиновых кислот в вноушгндах гелях и на. мембранах посла-' блот-гибридизации сыла определена нвтодом радиоав-щ-рафщ»

Зародыши для электронной микроскопии сит, фиксированы 2.5% растворен глутзроаого адыгегпда в O.I M фосфатной oyííepu, pli 7.4. "а зате!^ и том zs буфера, содерзэдец 1% ОзОг Нале« .' препараты бнаи обезвошш в этанояо, добавлялся ургшкчацчтат. После окончательного обезвовиваюы этанолом ацетоноы, препараты былл залиты смолой оион- вк. Поояэ шшляризашш смолы ультратонкка срезы окрашивались . цитрагеи свшша и просцзтршмшиь при помощи электронного микроокола.

результаты ис&щкшшп и, их озеуждштя

I. морфология зародышей морского е», подвергнутых воодейотаию оутирата натрия ;

Для выяснения условия, при которых ингибитор'. ядерных деацетилда сутират натрия мнизгг на фушагаокироаагои клеточного ядра, но окдьяо да нарушает процессы, протечоса»? в цитоплазм. проводились исследования норфолопш зародыша!! чгоро-кого еаа ЗЫгосЬасМегШз. Разнш концентрации бу"трзта натрия (й. 15. &') и 100 иш снли добавлена в среду, цккубпро-рэния знродшея в критичяомз момэтгм их развития по отношению к функционированию геногиг в начале развели» на отади раштей бластулы. сразу иооде зылуляенкя и ад стадии ькзснхншоЯ бластулы (ооотвстогййщхо 30 ыин.; Г9. 31 ¡1 30 я развития),

суда по иорс&ологий зародышей, небольшие концентрации (.5. 13 мМ) бутирата натрия практически не препятствовали развитию зародышей в препод дробления, отогаваниэ подопытных зародышей .в развитии стадо сильно увеличиваться только после вилупяения. ¿ольшие концентрации (йо. 100 иш этого ингибитора деацетилаз действовали нитотокоически. сильно понижая аизикопоообноотЬ зародышей. Но дазв в зтоы случае деления клиток не еыло пол-

ноотыо остановлено.

При дооэвлзшш в о роду 5-15 им бутирата натрия до ранней-орсдиеп бластулы (30 шш, 13 1) дифференциация клеток зародышей. нголголинля для гаструляпш. окелетогетза и дальнейшего , морФогшгваа. была блокирована (хотя, в вегетативной части блас-тоиеля накапливались клетки, напоминающие клотки первичной ш-зеюшии). развития останавливалось на стадии поздней бластулы»

Когда бпнрэт натрия сил добавлен посла вылушюшш (31 п 80 1). гоотруллпил при всех попользованных коннзиграшшх ухо тчшвдаоь» а стопгиь развитая архэптсрона обратно> зависела от

ó "Tí"' ío ' <b во jo

ti.- ijva:

«i ЧМлЛ ЧЪ&ЬЛ { ив! ату-'л

О" 120 fe

Pi:a. I. влияв ic радиационной инактивации и оутирата натри:; т раннее развитие зародышей морского esa st. droabajhl-erais. Ha сои вбсуиоо - врет и. отаяш развития ззро-джеги На ооп ординат - начало воздействия на зародыши. Ломанная линия представляет данные. получении при исследовании периодов ыорфогвштнческой активности яде? клеток зароддаеп морского- esa ютодом радиационной инакпшашш /А.A, mncax. 1960/, гор1оснгашк.з шпш - коечные стадия развития зарояызеп. к -контрольное зародыши*. 5. 15. 50. 100 - зародцгн. рззвивзмзиеая в присутотви.' осот-

ыгтетвук-шх копне ктраш-.я енш бутирата натрия.

концентрации бутирата натрия и пряко - от врешш его дооавяз-¡ил. Однако окелетогенез. и дальнеяпее раэвитш зародыиеп била полноотыо блокированы.

На рно. I представлены конгчныз отадш развития, доотиг-нутыг зародысаии при высеолисагашх опытах (горизонтальные т-шш>. эти результаты сопоставлены о mmmi о пзриодах иор*о-гснгтпчмкоп активности клеточных одяр-ззрошгеЯ морского en 3t.' drosbaohlíjnsls (ломанная лгагоя). яолукшшш при педаш рздшшюпноп инактивации /ü,h» Т&йфах. юво/. fíeos,ип» покэ-БЫЕзот» что фу.ггсциошфсвашй íasTotaíur ядгр зародыгей ыорокогс-ста пзрнодичпекое. т.е., ьюгду I-I4 и £0-42 чг-сыгл разшгпи тракокркпши нз оказнвазт возяеоотэвл. уваянчпвггегуго опоосб-вооть зарояыагя к развитию. сопоотвадгжю результатов использования бутирата натрия в радиационной «нзктившш! овндотедь-отэугт. что степень воздействия этого шяг1й!ггора дезцзтшш зависит от периода- норфогелвтичеокоп атгвкооги клеточных ядер зароднееп» Генетической инзориации. накопляйся при нормт :пЯ ипр.гояоппз»коя активности ядер в течгкие 5 часов '.14-19 ч). v.".недостаточно для гаогрудяцшь ííPíS. иорголыю ошггеэиро-* взинкз до выдугагения tai ч) и стадии иззенхимкой о.'катуди (30 Ч>. угз обеспечивают этот процесс!. но irt кзаоотзточно для скйяотогвнезз и дальнейиего морфогенеза.

Так как ингиоиро&аяиэ бутиратом натрия ядаргшх леацети-л«и озратико. о или проведены опыты о целый выяснить, вооота-лшвлиьгнотоя ли фунхши клеточного ядра зародышей морского егз. необходимые для дифференциации клеток и морфогенеза, посла эреьшшого воздействия 15 мм бутиратфатрия. конечные стадии, достигнутые подопытными эиродыиами» представлены на рта. 2. В течение периода отсутствия морфогелетичеокок активности неточных ядер и короткого прсмехутка после fiero влияние бутирата патрия было практически полностью обратимо и ив нарушало дальнейшего развития. Более продо'лзлтельное присутствия этого вешнотва вызывало экэогаотрулящю более чей 90% зародышей. а степень развития архэнтерона и первичного скелета была обратно пропорциональна продолжительности воздействия.

Следовательно, влипши; бутирата натрия на развитие зародышей морского esa полностью обратимо только о том олуча?, когда транскрипция еще ив способствует развитию зародышей. Во время высюкод ыорфогенетичеокой активности клеточных ядер воз-

Яробл. итогу ли

со

Гасгрула

призма

i-г

100 110 (Ч>

пл>-т.

■"я-:, 2. Влитие на развитие зародышей морского esa st. droe-¡/■асЛйегсз!:; 15 tóí оуткрата натр roí. добавлзнного в инкубационную среду ь начале развития н удаленного из гоя пер«:> рЕз\ша промежутки времени, На оси абсцисс ~ стадии развития ¡зародышей» На оси ординат - время удзжшлл бугирэт» натрия. I. 2 - стадии развития соответственно контрольных и инкубированных в присутствии оутирата натрия оародыаей к момгьгу удаления , агента; з - отэдии разви>тия. достигнутые подопытными зародышами за НО часов, с л )- нормальные зародыши? (А ) - вародыии с вывернутым архэнтероноы.

донотви'» ©утирата натрия та лиМ&еренрцмацию кдаток и морфоге-гт ойратшо таль частично. • ■ ;

основываясь на результатах морфологических наблюдений, моано заключить, что шокйз концентрации (Г-15 мм> ингибитора ядерных яеацетилаз оутирата н?.грил не обладают осшим цитоток| оическим действием, но в то хе Броня препятствуют .дифферянпи--' атт клеток, зависящей </г функционирования генома'зародыша юрского ею. поэтому лла дальнейшего исследования структуры и функционирования-хроматина при нарушенном обмене ацетильных груш; гиотонов о^па использована 15 мм концентрация бутирата натрия, гфиоутотвующего в инкубационной среде с начала развития. При анализе тлученннк данных следует иметь в виду отстг*-

ваше юшубировашшх в присутствии оутирата натрид зародышей в развитии от контрольных (оравн. кривые I я 2 т рис. 2). На ; стадии о род ней-поздней геструлы разница з развитии нршлши' тельно равна одному клеточному циклу. ,

. 2. Ацетшгарованка гистоцов в приоугсвтии оутирата иатиря'

Чтобы ответить из вопрос, какие изшшния в ацетщцрова-шш питонов зародышяй морского еш вызывает 15 т концентрация бутирата натрия.подноогьм кнпиируюиая гаструляцнр и дальнейшее развитие эародысеи. бим провадзн анэлга ацетияированши форм гиотонов зародышей Bt. йгоеЪаоЫяпгАч при помоии'электрофорезе в катиощюп система (pito.' 4). Потопы. ашптаировашпге в тачешш 2 последних часов инкубирования. сила шгвчснц [ 14С) -ашгаокиол^гаw{ с14С).

При нормальном.раннем развитии зар 1ыыеЯ знятптель.шя часть новосантезировашшх молекул гиотонов (ооосзкно И4) зцатилированы до три- и тетраацвтильиых ®орм ta. 11С). при созревании,хроматина происходит- постепенное'их деацетаяиро-яание, вследствие «юго в сгнием хроматгаэ питоны шацетили-, рованы или модифицированы ливь до моно- или диацктилышх Форм (а. ЭФ). О ojr/'iае зародышей» инкубированных о начала развития в присутствии бутирата натрия (б), на эдектроФоркгрэкиах отсутствует молекулу гистона 114 в форма^ мю и лет. Это. в отличил от контрольных варояиаей 'а). относится как к. "новооинтсзнрованньш {.юлгкулаи (б. 14С). так и к осщеп оушз тжлс/п. »того гнотона (с.ЭФ), что указывает на блокирования процессов дгапетклирования гиотонов.

Следовательно, присутствие is Ш1 бутирата натрия с начала развития действительно нарушает правильны!! обман ацетильных групп и за II-12 клеточных циклов вызывает гигарацетилирове гиотонов практически всего хроматина эзродышай морского osa,

з. структура гишраиетилированного хроматина.

для выяснения степени компактности хроматина контрольных зародышей и гипсрацитилированного хроматина ячродишеи. плку-бироряннчх в присутствии бутирата натрия, была (I) исследована чувотвитрльнооть хроматина к микрокожоьой нукяча?« и Ш про-

ведана »Лчктротгая микроскопия срезов клеточных ядер зародывзЯ iropeicoro era St. droebaoutónsls. ' -

,, Чувствительность хроштииа ядер клаток зародышей ыорокого St. di-см-ítoobletis 1з ic микрококковоп нумеазв иослздовалаоь. коп;а контрольные эародоти гахояилиоь на стадии (1) кезенхиы-ной бластулы и Ш поздний гаотрулы. По кривым гидролиза (рш.

построенным .la основании количготва кислотораотворишх Фрагментов игос. отлепленных за определенное время о начала реакции. но ото судить, что на обеих стадиях гиперацетилиро-

хроуатин зародышей. инкубированных в присутствии бутн-рата ,натрия (-х-) лишь в назшнитсльноп отепзни болез чувс-

■ тттдан к юпфококковой нуклеазе. чем контрольный (-о-). В шшм случав, учитывая ототаввтою в развитии, следовало бы

■ сравнивать хроматин инкубированных в присутствии бутирата нмрия эаролыпей (Б. -х-) о xpotumhiou контрольных зародысгй. находящихся на более раинеа стадии развития (А. -о-), так как с рбзвитЬгм ко:«енстносггь хроматина растет. а оошая чувствительность к нуклказ&м падает. В та »сои случае очевидно, что

Рис. 3. Кинетика гидролиза

иикрококковоя ну1Ш-азои нормального и гнперзцетйлированно-го хроиатшш ядер <" клеток зароды шея 1

морского эха 31. <1гоеЬааМепз1з. Контрольные зародыш на стадии мезен-хлмной олаотуда (А) и поздней гаструяы | (Б). (-о—) - копт- ' рольные продыши; (-Х-) - зародыши, инкубированные с начала развития в присутствии 15 им бутярата натрия, па оси абсцисс - продолжительность гидролиза* на оси ординат - часть ДНК. перешедшая в киолоторастворниую фракции.

ткг&ж

птерзцетшшрсвашп :: хроьатин пя декомпактизировя» этот вывод подтверждают и дашз электронной микроскопии.

Следовательно, гиперэцетилировагаю гиотонсо. шшуштро-ванноз оутиратон натрия, не декогшактизировало хроматин зэро-дыгей морского esa.

4. синтез нуклеиновых киолот при блокировашга леэистилпо ;

Синтез ДНК и РНК исследовался,в контрольных п ютсуопро-вашшх в присутствии оутирата натрия зародышах морского егл St. droebachlensis, когда первые достигли стадии поздгой бластулы и поздней гаструл! с в последнем Случае исследовался только сшгпзз шло. Результаты по включению радиоактивных предсеотвенников в Нуклеиновые кислоты, оинотезированшз в течение 2 последних часов. предотавлены в табл. I. Видно, что. несмотря на отсутствие эаштшх изменений в струюуре хроматина инкубированных в присутствии оутирата натрия ээродывеП» синтез ДНК в них уменьшен примзрно на 20% (на обеих иссдэдо-ванных стадиях), а синтез РНК <иа стадии олвстулн) - на. Судя по морголопга зародышей ссрзвн. кривые I л 2 на рио. 2). бутират натрия в концентрации 15 нМ начинает izvH'nm влиять на синтез дшс. когда продолжительность клеточного цикла в иормз начинает расти (прикерно о 8-9 клеточных циклов), снигягага синтеза ДШС на 207, в течет© поодедних 5 репликаций и привело бы к наблюдаемому отставанию-подопытных зароды? ей на I шуточный цикл. Но так как на исолздусных стадиях синхронность деле-

Таолзша I

Интенсивность синтеза нуклеиновых киолот в контрольных и инкубировашшх с начала развития в присутствии is мм буnipava натрия зародышах морского esa 5t. droebachlensis

Стадия Нуклеиновая Контрольные Подопытные синтез по

развития кислота зародыши. зародыши. сравнению

имп./мин. имп./мин. ' о контро-_на i мгк ' на I мкг льм. %

Бластула ДНК 15300

РНК ' 21060

Гэотрула ДНК IOIOO

12500 12780 8160

61,7

60.7

80.8

ния клеток полностью утрачена. оотаетоя неясным, о чзи связано сшгапшй ьг.чюттп «¿¡тки в ЯНК.

lia 40% скиданное включение «атки в РНК (табл. I) в гилер• ацетшшро&аннои хроматине. вероятнее всего, связано о общин подавлением интемоивнооти транскрипции в клетках (в основном рР1Ш. Но это да исключает наличия оолке оиутимых различий в транскрипции отдельных генов.

Только количественными изменениями транскрипции при блокировании ядерных деацетилаз сутиратон натрия нельзя обменить наояздаиша морфологические ¡иьйНйнпя зародышей морского еда. поэтому оледуюаим этапов наотояаей работы было сравнение экспрессии ряда генов в кош'рсльшх зародышах и и условиях нарушенного обдана ацетильных груш гистоное.

5. Экопреооия некоторых ixjhob при нарушенном обызда ацетильных грутш пютонов

В условиях блокирования деацетилаз б приоутстшш 15 mi оуткрата 'натрия о начала развития проводились доследования вкспресски трех групп генов зародышей иорокого esa! (d j ¡hos< кодирующих ранние и<> и поздние {(?. г. «5} взофорш гкотоиов» (2) га№ теплового шока и (3> акпшовыг гъноз.

5Л.Зкс;-.реосия гштононых генов

Ооооекноспи з'копреооии генов. кодирующих ранние и поздний гоофо. ш гш'плюв. в нориа ц при нарусеннои обшнв ацетильных групп пистонов ир<иштннз исследовали на зародышах иорокого esa St. droebaotilansis. Общий гиотон. выделанный из .сот-рольных и подопытных зародышей, когда первые достигли стадии гаот-рулы» был фракционирован в катионной »лекгрофоретическор система (ряо. 4). Общая картина молекул гиотоиов отрадна на адакгрофореграше (ЗФ). а гиот-сш. ошлхаированныс в тетании 2 последних часов инкубации ••¡ародыш^и, - на апторадииграмьи (14С) этой злегтрофореграмш. Наиболее четко ¡гззлпчнш изофор-вд гиотона ¡кд.

В норш на отаяии ранней- средней гаструды происходит переключение экопреоо:ш ранних пштонивнх генов на поздние.. Но злектрофореграше <а. ЭФj moshu oywm». что к контрольных

Fürt. 4. опгтез гиотоно» в ззроды-aar st. droijtewhlensls. ЭлЕХТрофорегргммы (ЭФ) и автораляограшн (1,4С) гистоиов. выделятых из контрольных («) и инку-бировздпш с начала развития в присутствии 15 т бутирата натрет соз зчроди-ией» когда первые достигни стадии гзсгрулы. гиотоиы. оютяироватшв в течение ?. посдяяних часов инкуоиро-впнии зародышей, мечены f -ашнокиолотатами. Электрофорез проведен В катиоштой системе« содераяисй о.О И уксусной кислоты. 6 mW тритона X-IOO и 8 м мочевины. Ацетилированные £юркн гиотснов (Ас) обозначены цифрами. соответствующими числу присоединенных ацетильных групп. ß, у, & - "эоформы пю-тоиов.-

зародышах, достигай* стадии псэддап гаструли. еще прлхмадалп на стадии ранней елаотухы синтезированный. молекулы рашгего (-*) гистонл кал. Но звторалиограша <а» 140) свидетельствует. что yzxi произошло -переключение синтеза ранних изофорц этого пюто -на нэ поздние? синтез первых сильно сюлаблвд. а последних -очень интенсивен. В инкубированных в присутствии сутирата натрия зародышах, отстающих в развита от контрольных пршерно на один клеточный цикл, та гак превалирует « нз&юркз молекул ' гистонэ Н2А (б. эф к по по авторадиогрзмме (б. 14С) можно сулить, что переключение экспрессии ранних гиотоновнх генов на поздние произошло и в этом случае.

Для более прямого подтверждения переключения экспрессии гистонооых генов 1сак в контрол. .гаг. так и в подопытных зародышах мо}>ского еда оыл проведен сравнительный анализ транскрипции этих генов молодом слот-гибридизации общеП РНК. выделенной на разкиi (¡талиях. с г 32pj -меченными пробами ЯНК.

1ШД

u

l n o

1 ^ Г

2 g &

oí

1

JBWf

i.

(шд кйЖ

ьаоддо кШЕ

их —

нэ _

U 2A.il 21 « MÍ--

B2Ü

fit

IT*

ó

Fno. s.- Трзшкршгадш гиотоновых геноь ь эародшах St. ймеЬа-

OlÚBllSlS. Вдот-пизридизьцш CíQSSli РШС. ВЫД&ЕиННОГГ

контрольных (а) к ш/куоировашшх а качая* ризыпш; a присутствии 15 ш оутяратз натрия «о эзроаивей ta разных стадиях развития, о [32Р]-«.данной ДНК, о одер-пащзй последовательности ранних пытоногшх гонов 31. droetecMensls.

содержащий;; последовательности ранних гиотоновых генов st. droebachlensis. Сначала на солома- различно!'! стабильности гибридов РШС. считанной о рлижгх и поздних гитоновыж генов, и ДНК ранних гиотоновых генов были идентифицированы ырнк ранних и поздних гиотоновых генов контрольных гюришсей. Результата блот-гибридизации обаей рик. выдешшоа то контрольных (а) в подопытных (б) зародышей, с пробами ДНК ранних гиотоновых пзнов представлены на рио. 5. В ос mis случаях на стадии 120 листеров произошло уаи&лкк транскрптиш рашшх гиотоновых

генов, а мзялу стадиями'ранная олзотулы и ранней гаструлы включились поздние птотоиовнз гены. что наиболее очевидно па npm:?pe ирнк птотона п4.

Следовательно, нарушение ибтт ацетильных групп гистопов качаотоенно на шнявт экспрессии гяотоновых генов raí на уровда-трзнскрипцин. ни на уровне трансляции.

5.2. экспрессия генов теплового-шока

Экоггеритпи по включении и рчюгочению окопресоии генов теплового пока в случае нормального и птторацет онрованиого под воздействием 15 ми бутиртга натрия хроматина проводились на зароднгаах морского esa st., 1л terne-rilas. когда контрольшз зпродыип достигли отадш1 гйзенхимноя олгет/лы-рэнней гаструлы. Озродши в течений I часа инкубировались при 28°с, а затем были возврапапы в обычннэ для них температурные условия (18°С). гда инкубировались в течзшгэ еги 7 часов. Новосшгпз-знровашшз салют были попзтени [ -аминокислотами.

яДа:

;

I.»

6Э-

зэ—

м-

, nffi ю 18 , ®с

" п и п '¡п Г! п П

Ц' V ! ' • •

' ** *"<••, L; '4?.; ' -V.

и ■ И

. А (*-} •• í ft V* 5 ? tr

-Рис. в. Сгаггзз белксв теплового шока в зз-родцвах 31. 1л-ЧегтИнз. Авто-раднограч»а ?.-??•;-трофорсграм»ы еелков. внделен-ннх из контроль -ни■/. (а) и тпсусп-ровзнных о начала . развития в присутствии 15 ИМ бутирата натрия (б) зародышей. Вежи фрзгашони-роваш в анионной элеетрсфорзтичгс -

коп спстеие. ссдергащей ДСП. О - перед тепловым аоком; I - непосредственно после теплового йога: 3. 5. в -зародыши поолз теплового шока шпсуоированн при Ш°с в течение ооответотвамо 2. 4 и ? часов.

¡I", И <Ц "

4 % i 'h

?! h t f! ^ МДааЙ

0 13 5 ■ &

0 0 1

з 5 a Й

' дМк—J* К и Сс

0 x 3 5 s

0 12 5 е

Рио, 7, транскрипция гена теплового шока в зародышах St.

Intercedí us. влот-гибридизация общей РЖ. выделенной из контрольных (а) и инкубированных о начала развития в нриоутотвш 15 ш оутирата натрия (б> зародышей. о [ 32?1 -печенной ДНК. содержащей поодздогп-тёльности гена шр 70 дрозофилы. 0. I. 3. 5, 8 - как в рио, 6. 1

на рио. 6 представлены авторадиограымы электрсфореграю! обаэго белка контрольных (а) и инкубированных в приоугогвкл бут^ата натрия (б) зародышей. По нш цопю судить, что посла теплового шока в клотках зародышей синтезировались несколько белков о молекулярными маоо&ни в интервале 20-ао па и ыеньшз ■ (Г. 3. 5). отсутствовавших до теплового шоке (0). через г ча-' ооз при нормальной температуре (8) их синтез прекратился,' Такая картина видна как в случае контрольных (а), так и инку -бированных в присутствии оутирата натрия to) зародышей. Отоу. отвиа на электрофореграи-й ¡в случае ооеих типов зародышей) одного из основных белков теплового сока - Hsp 70. по-видимому. в данном случае связано о дегралаииай новое ингезировашшх молекул нэр 70, так как транскрипция гена hsp 70 была индуци рована (ом, rose).

•. ■ Для подтверждения ъшпочьния и выключения генов тепловогс

шока в исследуга« зародышах морского гжэ бия провиден прав-ныелышн анализ тргяскришии одного из генов теплового пока hsp 70 кктодом бл от-гибридизации обдап PIK заромшча о l32PJ-печенными пробами ДНК» содрржзщиии последовательности ГЕЮ h"p 70 ДрОЗОфШШ. АВТ'Ор?ЯИ0ГрГ)№1Ы полученных. гибридов НРШС и ДНК гена top 70 представлены на рис. 7, Как и в случw синтеза ряда белков теплового шока, транскрипция гаю fisp 70 отсутствовала до теплового иска (О), включалась во вреня того (Т. 3. 5) и выключалась чзрез иi?or<vpo® рршя шгкуозшп1 При нормальной температур? 1в) так п котродмшя (ч >. гак и и инкубированных в присутствии бутирагч натрия (б> зпрмыгт морского вга St.. intr-rnallus. подтверждая вывод, что олоклро-ваиио обмгиа яттиямш/ гиуип гиотлков во нарушает 'лкопрадоию генов теплового пока. -

5.3. экспрессия Устиновых генов

Юшя/шг сутират-м« натрия вызванного нарушения обмен а ¿¡»к тнлыгнх групп гиотснюв на экспрессии зктгаюпых геысв иоследо-

з. 8. Транскрипция гена актинА п заролкгавх St. droebachlen-sls. Влот-гибриди • заиия обшеП РНК, выделенной m коп -тродьннт <а) и ин кубиропзнных о на чэла развития в присутствии Ii) ММ бутирзта натрия (61 зародышей на разных стадиях развития, с f32pj-мкченаой ДНК. со-дерзетпей последовательности и актина St. purpu-rattis.

Рис

rt 4 р

§ i I ч

И р> р. р р

г,г кб г?

>о

ьалн ius зародышах иорокого esa St. 'droabaoliiensis штодои ояот-гисридшаци оошеП РНК зародышей па разных стадиях развития о í 3"тJ - ыичешшии' пробами дшс. содержащими последовательности гена и акгит морского esa St. purpuratus. Авторадио-rpasi-.:u (рио. 8) свидетельствуют. что экспрессия актшювого гена в зародышах st. drcebachlensls происходит по определенной онтогенетической программе (а), а нарушение обшха адатпльных групп пистонов хроматина не внесло занзтнш: изменений (б)'.

суммируя ыожно сказать, что блокирование обшзна ацетильных групп гиотонов хроматина не влияет на ряд механизмов регуляции экспрессии генов. Судя по морфологии подопытных зародышей, »копресоия отдельных генов в таких условиях ыохет быть нарушена, но ацтшфование/деацетилированиз гиотонов не являемся рываюйим фактром в регуляции транскрипционной ак~чвнооти генома, по крайней мере, в случае исследованных оеазпотв генов.

виьоди

1. Присутствие 5-15 ьй! ннгабитора мерных деадогалаэ бу-тнрата натрИл в инкубационной ор-еяе о начала развития зародышей иорокого ега не препятствует их разаитиф период дробления, когда используется только ооГепет>г;еская информация. В то «л время 60-хсю мн этого веаеотва действуют цитотокоичшки.

2. Бутират натрия в концентрации 5-15 ыИ йнгибирувт первичную дифференциацию клзток зародшей морского ша, зависшую от функционирования геном зародим. и останавливает развитие на стадии поздней бластулы шит средней-поздней гас-труды, конечная стадия развития находится в прямой эавютшоо-ти от времени начала воздействия и в обратной зависимости - от концентрации оутир&та натрия и продолжительности его воздействия.'

3. Влияние бутирата натрия на процессы дифференциации клеток зародышей морского ежа обратимо, однако'эта обратимость лишь частичная, так как временное присутствие агента в период высокой морйот?етичеокой активно'ти клеточного ядра вызывает экзогзотру ляии» и неполное развитие кпк архонте-рою. так и первичного окрдета зародыша.

•i, П-Wflîpopamrî ae.mia гмитодгаа грутгп пютнов 13 мм

ЙУТИРЗТЛ НЭТрИЯ В ТС'ГРГПТО II-12 ЮГГГОЧт« ПШСЛОВ ПРИВОДИТ 1С

гиппраиетилиропат® практически вояж молекул гпстона п: и части молекул других пютнов остова нуклсосош. - *

5. Л я innre электронной »лткроскошш и устойчивость хроматина к ляПотпгпо михрскокковоП нуклэззн свидетельствуют о том. что пшерэнетилироваште гпотогюв. вызванное буткратом натрнл. m приводит к деконпгпгптиии zpon-jTmin зпроднп 'П морского

0X1.

в. НарупглпшП ос■';!{ ацетильных групп гистлшв пол воз-лрйотвиеи ингибитора ядерпых деап'гтилзз бутнрата натрия качпо-твешю пз влияет на зкспросси» ранних и поздних пгатоповнх ггпов по оитогештп'П'скоП программе не препятствует вклпчшпго и вшелочпни» экспрессии генов теплового пока и овсевргмчшочу шелячгнкю транскрипции гнетннового гена.

7. Предполагается, что слолшЯ лттаннческий и npain ически для везх эукарпотнческих ктлток универсальный атавизм ооигна ацетильных групп гистонов остова iiyiuicoco«) из является реяап-пим Фашгором в регуляции транскрипционной аюгивности исолело-вашшх едкзйатв генов.

ОсповноП ютергпл дкосертсция -опубликован в следушнг • работах:

1. Стяпонавичюте Д.В.. Клршулитс Д.Р.. Ясипскзс -л.Л.-Э.. Гяпейткс A.a. зкспр.сосют генов ггрц блокировать обгага ацетильных групп в екзриоиальном развитии морского сг,а / тсзисп к IV сгезду яиогичшеов Литовской ССР.- Вильнюс. 1980,- С. 135-135.

2. стяпонавичюте Д.В.. ГинеЯтис A.A. Исследование влияния бутирата натрия на рашгее развитие зародышей морского ежа Stronsylooentrotœ droebachlensls // Депонирована,«! рукопись. ВИНИТИ.,.« 698Э-В68. 1988,- С. 1-23.

3. Стяпонавичюте Д.В.. Кяршулите Я.Р.. Ясинскас А.Л.. ГинеПтис A.A. Влияние сутирата натрия на структурно-Функциональное состояние клеточного ядра в раннем развитии морского еза // Депонированная рукопись. ВИНИТИ. В 6930-BS8.- С. 1-27.

4. Glneitis A.A., Kersulyte D.H., Steponavlciule Б.v., Ja-sinr.Xas A.b. A study or gene expression 1л the sea urchin

оЬгииНп ии^аг МП!)!.(А1 тгнбувд' и/ иЫипч ас«1у1 Й1ч<Щ>:> и Маомж^ШснИи»' 1н Ь'шюНОПХЬЙ Са11 / ШлШ йоу|и1 НЫ1;;и 1*;и1и&гьс1. ШШ. •• •- Р.

!>. 1Пп-.ИЬ. Л.. аЦфоиаУЮИПО В., КигаШу'и» !>■. А.

'¡¡1.1 иИ'лЯ:; оХ и Ыауга1и дп далгШиЦоа ЫзК/ил

им 111г сипа йигАп,: иаг.у (.клгЮр^ли од

ЩЧЯйИ // АИШКД 11изШ1о ОГ «и .и^ПОйП £5со1й1у 0(

оси Ыокиу. ■ По;июп, н-д;..;, Г.ок^ил* £>-У, 1^3,- р..

институт ИЮгШМШ! /впшскол академии наук спшопаничытк дашуолк владовна

структурно-фуншюналыие особенности хро/ча71ша при блокировании кдкрных цеац1л11лаз

КУД1ЛГЛ ТИПОМ •ЛЧСКАЯ в0*£4 1/10. ТИРАХ* ЮО ОКЗ. ЗАКАЗ 016. УСЛЛИЧ.П. 1.00. ОТПЕЧАТАНО РОТАПИШТОМ Б ШТП РН НАУЧНО- I ТНХПИЧРСКОП ИНФОРМАЦИИ И ПАТ'РНТНиХ УСЛУГ.2Л20иО.В1!Л1ИЮС,

тстчч!' :»7. .