Структурно-функциональные основы уникальной специфичности энтеропептидазы

Лихарева, Виктория Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурно-функциональные основы уникальной специфичности энтеропептидазы
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональные основы уникальной специфичности энтеропептидазы"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. АКАДЕМИКОВ М.М. ШЕМЯКИНА И Ю.А. ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи

ЛИХАРЕВА ВИКТОРИЯ ВЛАДИМИРОВНА

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСНОВЫ УНИКАЛЬНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ

ЭНТЕРОПЕПТИДАЗЫ

03.00.04-БИОХИМИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2005

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и ЮЛ. Овчинникова РАН

Научный руководитель:

кандидат химических наук, старший научный сотрудник Михайлова Анна Григорьевна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Цетлин Виктор Ионович

доктор химических наук, старший научный сотрудник Еремеев Николай Леонидович

Ведущая организация- Институт молекулярной генетики РАН

Защита диссертации состоится -¿^¡рЛ. 2005 года в .часов на заседании

Специализированного совета Д 002.019.01 при Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу. 117997, ГСП-7, г. Москва, , В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С текстом диссертации можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор химических наук, профессор

zvtsm

КЪЧГ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Важная роль в организме принадлежит высокоспецифическим протеиназам, которые имеют ограниченное число физиологических субстратов, гидролизуюгцихся по определенной пептидной связи. Примерами подобных фермент-субстратных пар являются ренин и ангиотензин, химозин и казеин, плазмепсин (аспартатная протеиназа из малярийного плазмодия) и гемоглобин, тромбин и фибриноген, энтеропептидаза и трипсиноген. В связи с развитием методов генной инженерии большое значение приобретает использование высокоспецифических протеиназ в качестве инструмента для точечного расщепления химерных белков по определенной пептидной последовательности (линкеру), отвечающей специфичности соответствующей нротеиназы. Подобные высокоспецифические протеиназы мы назвали "белковыми рестриктазами".

Высокоспецифические протеиназы характеризуются сложной сгруктурной организацией и содержат помимо каталитического и первичною субстрат-связывающего центра, многочисленные домены с определенными функциями. Исключительно важным является изучение регуляции активности таких ферментов и понимание сложного механизма, по которому удаленные друг от друга домены согласованно определяют высокую эффективность и селективность катализа.

Энтеропептидаза (энтерокиназа) (КФ 3.4.21.9) была открыта в 1899 году в лаборатории И.П. Павлова, который особо подчеркнул ее значение для организма [Schepowalnikov, 1902, Pavlov, 1902].

Энтеропептидаза - высокоспецифическая протеиназа процессинга - находится в начале каскада реакций активации проферментов пищеварительного тракта, состоит из двух цепей - тяжелой и легкой, соединенных дисульфидной связью (рис. 1) Энтеропептидаза активирует трипсиноген, отделяя N-концевой активационный пептид, основной детерминантой которого является последовательность -(Asp),(Lys-специфическая для энтеропептидазного гидролиза. Нарушение нормального течения пищеварительного каскада может приводить к преждевременной активации проферментов в поджелудочной железе, что, в свою очередь, приводит к тяжелейшему заболеванию панкреатиту.

Высокая специфичность энгеропептидазы сделала ее важным инструментом современной

Цель работы: заключалась в изучении структурной оргашвации и функциональных особенностей энтеропептидазы, как основы (;'' высокой сШШфи иости.

»Ов^РК

Рис. 1. Схематическая структура энтеропептидазы быка. (Авр981) - первичный субстрат-связывающий центр; (Ьу$889) - вторичный субстрат-связывающий центр; дополнительный вторичный субстрат-связывающий центр (названный нами БП), расположенный на участке 118-465 тяжелой цепи энтеропептидазы.

В ходе выполнения работы были поставлены следующие задачи:

1. Изучение неспецифического энтеропептидазного гидролиза на примере ряда синтетических модельных пептидов, содержащих Lys/Arg в положении PI и менее четырех остатков Asp/Glu в положениях Р2-Р5.

2. Изучение специфичности энтеронептидазы в сравнении с трипсином.

3. Исследование согласованности и взаимодействия трех субстрат-связывающих центров в ферментативном катализе.

4 Определение лимитирующей стадии гидролиза синтетических субстратов энтеропептидазой.

5. Исследование влияния ионов кальция на гидролиз синтетических субстратов полноразмерной и укороченными формами энтеропептидазы.

6 Выяснение возможной физиологической роли кальций-зависимого автолиза энтеропептидазы.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые проведено систематическое исследование субстратов с укороченным линкером - содержащих в положениях Р2-Р5 1-3 остатка глутаминовой или acnapai иновой кисло ш вместо 4-х у типичного энтеропептидазного субстрата.

Продемонстрировано, что в процессе функционирования эшеропепгидаза проявляет строгую иерархию субстрат-связывающих центров Установлено, что энтеропептидазный гидролиз высокоэффективных субстратов происходит с лимитирующей стадией деацилирования (кг > кз) Изучено влияния кальция на гидролиз пептидных субстратов с полной (-D4K-) и укороченной (-DK- и -ЕЕК-) последовательностью природной энтеропептидазой быка (118-1035), автолизованной энтеропептидазой (466-1035) и легкой цепью этого фермента (784-1035). Результаты демонстрируют возможность регуляции с помощью ионов кальция нежелательного побочного гидролиза ири использовании энтеропептидазы (полноразмерного природного фермента) для процессинга химерных белков

Обнаруженные свойства и особенности "неспецифического" энтеропептидазного гидролиза дают возможность использовать энтеропептидазу в структурных исследованиях для фрагментирования природных белков. При этом, в отличие от трипсинового гидролиза, ведущего к интенсивной деградации молекулы белка, использование энтеропептидазы приведет к крупным пептидным фрагментам, и, более того, как раз после тех остатков Lys или Arg, где трипсиновый гидролиз менее благоприятен из-за наличия отрицательно заряженных аминокислотных остатков в Р2-Р5-положениях.

Апробация работы и публикации. Основные материалы диссертационной работы были представлены на школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино-на-Оке, Россия, 2000), XIV зимней международной молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биолоши и биотехнологии" (Москва, Россия, 2002), V Симпозиуме "Химия протеолитических ферментов" (Москва, Россия, 2002), Всероссийской конференции "Проблемы медицинской этимологии" (Москва, Россия, 2002), Международной конференции "Biocatalysis - 2002: fundamentals & applications" (Москва, Россия, 2002), 27 Европейском Пептидном Симпозиуме (Сорренто, Италия, 2002), VI и VII чтениях, посвященных памяти академика Ю.А Овчинникова (Москва - Пущино-на-Оке, Россия, 2002, 2004), Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Москва, Россия, 2003), XII Международной конференции и дискуссионном научном клубе "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии" (Ялта-Гурзуф, Крым, Украина, 2004), 30 Конгресс FEBS - 9 Конференция IUBMB (Будапешт, Венгрия, 2005).

По материалам диссертации опубликовано 18 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах, состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающего наименований. Диссертация содержит /У рисунков и <Т таблиц

Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ № 99-04-48362, № 02-04-48553; № 03-04-06472-мас.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. СТРУКТУРА И ИЕРАРХИЯ СУБСТРАТ-СВЯЗЫВАЮЩИХ ЦЕНТРОВ ЭНТЕРОПЕПТИДАЗЫ

Первичная и вторичная специфичность энтеропептидазы в сравнении с трипсином

Для анализа первичной и вторичной специфичности энтеропептидазы проведено исследование гидролиза нескольких серий синтетических модельных субстратов, которые можно условно разделить на две группы:

А-(А8р/01и)„-Ьуз(А^)4-В, (I-))

где А и В - защитные группы или различные аминокислотные остатки; п = 1-4;

А-(А8рЛ31и)„-Хаа-Ьу з(А^)"1--В, (1-2)

где А и В - защитные группы или различные аминокислотные остатки; Хаа Ф Asp, Glu; n = 0-3.

Кинетические константы гидролиза синтетических субстратов энтеропептидазой и трипсином получены с помощью ВЭЖХ-мегода, а также параллельно спектрофотометрическим методом для субстратов, содержащих остаток F(N02)' (рис. 2). Использование субстратов, содержащих F(NC>2), для спектрофотометрического определения активности энтеропептидазы предложено впервые.

Показано, что энтеропептидаза обладает способностью с достаточно высокими скоростями гидролизоватъ субстраты по связям, образованным карбоксильными группами остатков лизина или аргинина, если в положениях Р2-Р5 субстрата находи гея менее четырех отрицательно заряженных аминокислотных остатков (табл. 1)

Азю

Рис. 2. Кривая гидролиза субсграта G5DKF(N02)G энтеропептидазой при рН 8,0; 37°С. [S] = 3,3 10"4 M, [Е] = 13 нМ Во врезках приведены результаты ВЭЖХ гидролиза субстрата GsDKF(N02)G энтеропептидазой (а) в начальный момент времени (t = 0); (б) через 15 мин инкубации; (в) через ~ 3 ч инкубации. Колонка Luna Cl8 (2x250 мм); градиент ацетонитрила 0-60% в 0,1-ной TFA; скорость элюции 0,3 мл/мин. Во врезках указано время выхода пика (мин).

Первичная специфичность

Исследование первичной специфичности энтеропептидазы проводили на примере гидролиза двух пар Lys- и Arg-пептидов- типичных субстратов энтеропептидазы (2 и 3),

1 Список сокращений' F(N02) - остаток л-нитро-£-фенилапанина; GD<K-Nfa - р-нафтиламид глицил-тетра-£-аспартил-Ь-ли"зина, Z-Lys-S-Bz! - тиобензиловый эфир а-АМ5ензоилоксикарбонил-£-лизина.

содержащих четыре остатка Asp в Р2-Р5 положениях (п - 4) и субстратов 10 и 1!, для которых п = 2 (табл. 1). Для двух последних пептидов не обнаружено какого-либо различия в эффективности энтеропептидазного гидролиза Lys- или Arg-содержащих субстратов (табл 1) Однако в случае полноразмерных субстратов замена остатка Lys на Arg в Р1-положении приводит к двухкратному повышению эффективности энтеропептидазного гидролиза В случае же трипсина эффективность гидролиза аргинин-содержащего субстрата 3 на порядок превышает эффективность гидролиза лизинового субстрата 2, что полностью соответствует литературным данным.

Таким образом, первичная специфичность энтеропептидазы сходна с первичной специфичностью трипсина, однако предпочтение остатка Arg над Lys в положении PI значительно менее выражено.

Таблица 1. Константы гидролиза ряда субстратов полноразмерной энтеропептидазой быка (ЭП 118-1035) и трипсином (Тр) при рН 8,0; 37°С

№ субстрат Km, MM kcat, мин'1 kcat/ Km, мМ"' мин"1

ЭП Tp ЭП Tp ЭП Tp

1 GD4K-F(N02)G* 0,160 10,0 1070 50 6700 5,0

2 APFDJi-IVGG* 35,3 - 1420 - 4020 42

3 APFD4R-IVGG* 14,7 - 1205,5 - 8210 310

4 DR-VYIHPF 3,3 - 24,0 - 7,3 -

5 G5DK-F(N02)G* 0,437 1,95 1040 47,2 2380 24,2

6 LTAEEK-A 4,2 8,9 29,4 74,2 7,0 8,4

7 MLTAEEK-A - - - - 7,0 -

8 MLTAEEK-AA 4,0 1,7 1510 2900 378 1700

9 LTAEEK-AAV - - - - 400 -

10 WDDK-G 1,6 - 32,6 - 19,9 -

11 WDDR-G 2,1 - 40,6 - 19,5 -

12 VLSAADK-GNVK-AAWG 1,726 - 524 - 303,6 20000

13 APFD3GK-IVGG* 0,3031 957,85 31,6 150

14 15 LEEELKP Ac-LEEELKPLEE Не гидролизуются

16 LWMR-FA - - - - 14 200000

17 TSK-Y - - нет гидролиза 140

*- 50 мМ Са1+

Вторичная специфичность

С целью изучения вторичной специфичности энтеропептидазы проводили гидролиз синтетических субстратов, соответствующих формулам (1-1 и 1-2) (табл 1). Были рассмотрены как крайние случаи (п = 4 и п = 0), так и промежуточный случай (п < 4). Для оценки профиля субстратной специфичности энтеропептидазы но сравнению с трипсином, обладающим широкой вторичной специфичностью, введена величина селективности гидролиза каждого субстрата (ЭП /Тр). отношение значений к^/К^ энтеропептидазного и трипсинового гидролиза (рис. 3).

|£ЭПЛ'р 0—-*

V ' " V ' V' * *

\ ^ ч

Рис. 3. Селективность гидролиза некоторых субстратов типа А-(Азр/аи)п-Ьуь(АгБ)4-В энтеропептидазой (ОП) и трипсином (Тр): отношение значений каа/Кщ энтеропептидазного и трипсинового гидролиза каждого субстрата. Нумерация субстратов как в табл. 1

В результате проведенного исследования показано, что энтеропешидаза, подобно другим сериновым протеиназам, обладает протяженным вторичным центром, взаимодействующим с 6-7 аминокислотными остатками, расположенными по обе стороны от расщепляемой пептидной связи (РЗ/4-РЗ'). Однако эти вторичные взаимодействия проявляются лишь в случае субстратов с укороченным линкером, содержащих 1-2 остатка АкрЛ31и, предшествующих Ьуз/А^ гидролизуемой связи; при этом вторичная специфичность энтеропептидазы отличается от вторичной специфичности трипсина (рис. 3). В случае типичных субстратов энтеропептидазы, содержащих четыре отрицательно заряженных остатка Азр/Ии в положениях Р2-Р5, превалирующим фактором эффективности гидролиза является электростатическое взаимодействие этих остатков с вторичным (82) субстрат-связывакмцим центром (1^889) легкой цепи энтеропептидазы. Эффективность энтеропептидазы

Для оценки "работоспособности" первичного субстрат-связывающего центра 81 (Авр1 89) и каталитического центра природной полноразмерной энтеропептидазы (ЭП 118-

1035) использован субстрат г-Ьуз-З-Вг!, взаимодействующий лишь с первичным субстрат-связывающим и каталитическим центром фермента Получены значения кинетических констант гидролиза Х-Луз-Б-ЕЫ при рН 8,0 и 25°С для полноразмерной энтеропептидазы (ЭП 118-1035), легкой цепи фермента с С-концевым фрагментом 784-800 тяжелой цепи (ЭП 7841035). Показано, что эффективность гидролиза г-Ьув-в-Вг! легкой цепью энтеропептидазы в = 4 раза меньше соответствующей величины для трипсина (табл. 2).

Таблица 2. Кинетические параметры гидролиза г-Ьув-в-Вг! полноразмерной энтеропептидазой (ЭП 118-1035), легкой цепью фермента, содержащей С-концевой фрагмент 784-800 тяжелой цепи (ЭП 784-1035) и трипсином

Фермент Кт-105,м ксщ мин"1 мкМ''мин"'

ЭП 118-1035 5,96 6660 111,0

ЭП 784-1035 17,69 6694 37,84

Трипсин 5,60 8280 147,9

Для оценки "работоспособности" первичного субстрат-связывающего центра 57 и каталитического центра природной полноразмерной энтеропептидазы (ЭП 118-1035) и ее укороченных вариантов по отношению к трипсину мы ввели величину эффективности гидролиза, приняв за 100% эту величину для трипсинового гидролиза г-Ьув-Б-Вг! (рис. 4А, Б, В).

§ $ ш £

•е- с

•е-! !

100 80 60 40 20 0+

Ь г?

Рис. 4. Эффективность гидролиза ряда субстратов (А) - легкой цепью энтеропептидазы (ЭП 784-1035); (Б) -полноразмерной энтеропептидазой (ЭП118-1035); (В) - автолизованной энтеропептидазой (ЭП 466-1035). (I) -за 100% взята эффективность гидролиза субстрата г-ЬуБ-З-Вг! трипсином

Введение остатка Lys889 в легкую цепь энтеропептидазы сделало этот трипсиноподобный фермент высокоспецифичным, однако при этом пострадала работоспособность первичного (S1) трипсинового центра Добавление же к легкой цепи тяжелой в значительной степени компенсировало это неблагоприятное влияние, что заметно не только при гидролизе природного субстрата, трипсиногена, но также и высокоактивного тиобензилового эфира Z-Lys-SBzl, где наблюдается 3-х кратное повышение эффективности гидролиза полноразмерной энтеропептидазой (рис. 4Б) Эффективность гидролиза Z-Lys-S-Bzl препаратом автолизованной энтеропептидазы (ЭП 466-1035) по нашим данным не отличается от эффективности полноразмерного фермента (ЭП 118-1035 (рис. 4В). То есть в отличие от трипсиногена, на гидролизе Z-Lys-S-Bzl не сказывается отсутствие участка 118465 тяжелой цепи.

Вторичный субстрат-связывающий центр S2 легкой цепи энтеропептидазы (Lys889) понижает, по меньшей мере, на четыре порядка активность первичного центра S1 (Asp981) и каталитического центра (триады His841, Ser981 и Asp892), таким образом, что энтеропептидаза не может гидролизовать полипептидную цепь по трипсиновому типу -после всех остатков аргинина и лизина (рис. 3). Лишь при "блокировке" S2-центра отрицательно заряженными остатками Asp/Glu в Р2-Р5-положениях субстрата активность энтеропептидазы по отношению к таким субстратам резко повышается Максимальное предпочтение при этом для субстратов с четырьмя отрицательно заряженными остатками, минимальное требование (эффективность и 10-кратно меньше) - один остаток в Р2-положении (рис 3). Поэтому мы назвали S2-uenTp центром специфичности именно он определяет селективность гидролиза полипептидной цепи Однако максимальное повышение активности даже для субстратов с п = 4 - два порядка (kcat/K m ю6 М'1 мин") - не компенсирует общее падение потенциальной эффективности каталитического и S1-центра (четыре порядка). Недостающие два порядка эффективности предоставляет дополнительный субстрат-связывающий центр Sil тяжелой цепи фермента, однако, лишь для природам о субстрата энтеропептидазы, трипсиногена. Этот центр обеспечивает высокую эффективность специфическому гидролизу природного субстрата (рис. 4). Только в случае своего физиологического субстрата, трипсиногена, энтеропептидаза реализует весь заложенный в ее молекулу запас эффективности гидролиза- значение kcal/Km для активации трипсиногена составляет 3-Ю8 M''-мин'1, что соответствует стандартной эффективности гидролиза сериновыми протеиназами их полипептидных субстратов. Следовательно, одной из составляющих энтеропептидазного катализа является строгая иерархия вторичных субстрат-связываюгцих центров: первый (S2) обеспечивает специфичность, второй (Sil) -эффективность гидролиза.

Модификация трипсина и трипсиногена для обнаружения доменов субстрата, взаимодействующих с SII-центром энтеропептидазы

Ранее было установлено, что N-концевой участок тяжелой цепи энтеропептидазы содержит дополнительный субстрат-связывающий сайт (названный SII), обеспечивающий повышение эффективности гидролиза физиологичного субстрата энтеропептидазы, трипсиногена, на два порядка по сравнению с искусственными низко- и высокомолекулярными субстратами, содержащими последовательность -(Asp^Lys- Сделана попытка идентификации участков молекулы трипсиногена, участвующих в этом взаимодействии.

ДФФ-трипсин

На первом этапе была поставлена задача, оценить взаимодействует ли SII субстрат-связывающий центр тяжелой цепи энтеропептидазы с участками молекулы трипсиногена, одинаковыми как для самого трипсиногена, так и для трипсина.

Для этого по методу [Robinson et al., 1973] был получен полностью инактивированный диизопропилфторфосфатом (ДФФ) препарат трипсина и проверено влияние эгого белка, сохраняющего третичную структуру активного трипсина, на процесс активации трипсиногена эн геропептидазой Однако даже в присутствии достаточно высоких концентраций ДФФ-трипсина (2 10"6-2-10"3 М) не обнаруживалось какого-либо заметного изменения скорости активации трипсиногена (410"6 М) энтеропептидазой, Как в стандартных условиях определения энтеропептидазной активности (рН 5,0), так и при физиологическом значении рН (8,0). Полученные результаты указывают на то, что искомый фршмент расположен в той части молекулы трипсиногена, которая отлична от молекулы трипсина. Такие участки достаточно точно определены: по данным рентгеноструктурных исследований третичная структура трипсиногена отличается от третичной структуры трипсина в области "актявационного домена" - участков 142-152, 184-193 и 216-233 [Fehlhammer et al, 1977]. Поэтому можно предположить, что ответственным за связывание трипсиногена вторичным центром SII является участок "активационного домена" трипсиногена (142-152, 184-193, 216233).

Ацетилированный трипсиноген

Однако дальнейшие эксперименты поставили под сомнение наше предположение о локализации участка трипсиногена, связывающегося с тяжелой цепью энтеропептидазы С помощью ацетилирования уксусным ангидридом [Kay et al., 1971] получен препарат трипсиногена (рис. 5), ацетилированный по остатку Lysl5, не способный к отделению активационного пептида VD4K и образованию активного трипсина, как при действии

энтеропептидазы, так и при автоактивации Ацетил-трипсиноген сохраняет нативную третичную структуру; полученный по такой же методике ацетил-трипсин полностью активен [Kay et al., 1971].

«Да М

50 —

Рис. 5. ЭОЗ-электрофорез 1) ацетилиро-ванного трипсиногена бьпса; 2) природного трипсиногена быка. 12% ПААГ, восстанавливающие условия. Приведены молекулярные массы маркеров (М).

Установлено, что ацетил-трипсиноген, лишенный положительно заряженного остатка PI и не взаимодействующий с первичным трипсиновым субстрат-связывающим центром энтеропептидазы (Asp981), оказался неспособным к взаимодействию с ферментом, несмотря на присутствие тетрааспартильной последовательности и сохранение третичной с]руктуры [Kay&Kassel, 1971] и, соответственно, фрагмента, отвечающего за связывании нативною трипсиногена с вторичным центром тяжелой цепи энтеропептидазы.

Таким образом, предполагаемая нами иерархия субстрат-связывающих центров энтеропептидазы оказалась более строгой, и взаимодействие обоих вторичных центров с субстратом возможно лишь при одновременном взаимодействии субстрата с первичным центром. Кроме того, по-видимому, для функционирования центра эффективности (Sil), по крайней мере, при гидролизе соответствующего белка, необходимо правильное взаимодействие субстрата с центром специфичности (S2).

2. ОСОБЕННОСТИ ЭНТЕРОПЕПТИДАЗНОГО КАТАЛИЗА

Лимитирующая стадия

До последнего времени на основании классических работ [Bender et al, 1969] было принято общее положение, что в случае гидролиза сложноэфирных субстратов лимитирующей стадией является деацилирование (к2 » кз), а гидролиз амидных и пептидных субстратов происходит с лимитирующей стадией ацилирования (к3 » к2). Однако в последнее время было окончательно опровергнуто представление о том, что лишь в

случае эфиров, в т.ч. тиобензиловых эфиров, к« = к3, а Кт(1!!ш) = К^кз/кг Высокоэффективные амидные субстраты химотрипсина и трипсина также имеют, как правило, лимитирующую стадию деацилирования, или, по крайней мере, величины констант к3 и к2 сравнимы.

Для определения лимитирующей стадии энтеропептидазного гидролиза применяли метод регистрации первого продукта гидролиза в условиях насыщения фермента субстратом ([Б]» Кт(Каж)) в присутствии метанола как добавочного нуклеофила.

Однако первые полученные результаты по влиянию МеОН на гидролиз ООдК-Жа в 0,1 М Тпв-НС! буфере, рН 8,0 оказались неоднозначными (рис. 6)

Рис. 6. Влияние МеОН на гидролиз GD4K-Nfa энте-ропептидазой. [S] = 5,11 мМ; 0,1 М Tris-HCl буфер, pH 8,0.

[МеОН], М

При малых концентрациях метанола наблюдалось уменьшение скорости гидролиза субстрата. С увеличением концентрации нуклеофила скорость опять увеличивалась, и при [МеОН] = 2М скорость гидролиза превышала контроль (без метанола.) По-видимому, метанол действует двояко' как нуклеофил, линейно увеличивает скорость гидролиза по схеме, соответствующей лимитирующей стадии деацилирования: Утах = [Е](кз + к4р<]). Одновременно добавление метанола приводит к инактивации энтеропептидазы (уменьшению [Е]). При [МеОН] < 1М процесс инактивации превалирует, однако при увеличении содержания этого нуклеофила начинает возрастать противоположный процесс, и при [МеОН] > 1,5 М наблюдается ускорение

Чтобы доказать, что в присутствии метанола действительно происходит инактивация энтеропептидазы, изучено влияние метанола на энтеропептидазный гидролиз субстрата 7-Ьув-З-Вй, который так же, как все сложноэфирные субстраты, гидролизуется с лимитирующей стадией кз

Для оценки только лишь степени инактивации фермента изучено влияние метанола при [8] « Кт В этом случае скорость гидролиза v0 = [Е][8]кса1/Кт(каж) = [Тг][3]к2/Кк и добавление нуклеофила не должно ее увеличивать Действительно, оказалось, что при [Б] =

6,67 мкМ (Гв] « Кщ) (рис. 7, кривая 1) в присутствии метанола происходит инактивация энтеропептидазы, возрастающая при увеличении концентрации МеОН.

1 2 [МеОН], M

Рис. 7. Влияние МеОН на гидролиз Z-Lys-S-Bzl энтеро-пептидазой. [S] = (1) - 6,67 мкМ; (2) - 0,667 мМ, (3) - 66,7 мкМ, (4) - 6,67 мкМ + 50 мМ СаС12; 0,1 M Tris-HCl буфер, рН 8,0.

Эта инактивация настолько велика, что даже при [Э] - 0,667 мМ ([8] = Кт) также при всех использованных концентрациях МеОН наблюдалось лишь уменьшение скорости гидролиза г-Ьув-в-Вг! (рис. 7, кривая 2) - противоположный эффект активации гидролиза нуклеофилом не может преодолеть этот отрицательный эффект и приводит лишь к меньшей степени уменьшения у0 по сравнению с кривой 1. При [Э] = 66,7 мМ ([Б] » Кт) (рис 7, кривая 3) для субстрата г-Ьув-Б-Вг! получена точно такая же зависимость, как для ОЭ4К-№а на рис. 4: уменьшение скорости при 0,5 М МеОН и увеличение скорости гидролиза при больших концентрациях метанола (1-2 М). Таким образом, суммарный наблюдаемый эффект действительно равен ускорению за счет действия нуклеофила, пропорциональному концентрации МеОН, минус инактивация при данной концентрации МеОН

Обычно гидролиз г-Ьуз-8-Вг1 проводят в 0,1 М Тиэ-НСЛ буфере, рН 8,0, без ионов кальция. Однако, как будет показано ниже, 50 мМ СаСЬ в инкубационной смсси не влияет на скорость гидролиза 2-Ьуз-8-Вг1 при отсутствии метанола, и более того, увеличивает стабильность энтеропептидазы в присутствии метанола При [в] = 6,67 мкМ ([Б] <"< Кт) в присутствии 50 мМ СаС12 инактивации фермента метанолом не происходит, и скорость реакции не зависит от концентрации добавленного нуклеофила, как теоретически и должно происходить (рис. 7, кривая 4)

С учетом проведенных экспериментов, обнаруживших инактивацию энтеропептидазы метанолом и противодействие этому процессу иопов кальция, повторили исследование влияния МеОН на энтеропептидазный гидролиз субстрата ОБ^-КТа в 0,1 М Тп5-НС1 буфере, рН 8,0, содержащем 50 мМ СаСЬ при [в] = 5 мМ ([8] » Кш). Обнаружено увеличение скорости реакции, линейно зависящее от концентрации внесенного метанола (рис.8, кривая 1).

При [в] = 21,3 мкМ ([8] « Кш) (рис. 8, кривая 2), так же, как в аналогичном случае гидролиза 2-Ьуз-8-Вг1 (рис 5, кривая 4) скорость реакции не зависит от добавления нуклеофила.

Рис. 8. Влияние МеОН на гидролиз GDíK-Nfa энте-ропептидазой. [S] = (1) - 5 мМ; (2) - 21,3 мкМ; 0,1 M Tris-HCl буфер, рН 8,0, содержащий S0 мМ СаСЬ.

Таким образом, отсюда следует, что гидролиз типичного субстрата энтеропептидазы ОВ,(К-№а происходит с лимитирующей стадией деацилирования

Для подтверждения полученных данных нами был использован другой нуклеофил -0,01 М - 0,43 М Тп5-НС1 буфер, рН 8,0 [ШпЬе^&^сИег, 1972]. При этом в интервале 0,050,43 М Тпв-На рН сохраняется и наблюдается ускорение максимальной скорости гидролиза субстрата, пропорциональное молярности Тле-НС! буфера (рис 9, кривая 1)

0 1

0.2 0.3 [Трис], M

04 0.5

Рис. 9. Влияние концентрации Tris-I ICI буфера, рН 8,0, на гидролиз GD4K-Nfa и пептида 1-15 a-цепи НЬ VLSAADKGNVKAAWG энтеропептидазой. [GD4K-Nfa] = 5 мМ - (1); [Hb 115] = 10,8 мМ - (2)

Использованный подход в определении стадийности катализа проверен на низкоэффективном субстрате энтеропептидазы с укороченным линкером УЬвААОК-0?УКАА>Л'0 (субстрат 12). С помощью ВЭЖХ регистрировали первый продукт гидролиза GNVKAAWG. При [в] = 10,8 мМ (> Кщ) скорость Утах) гидролиза этого пептидного субстрата в 0,1-0,4 М Тпв-НО буферах, рН 8,0, оставалась постоянной независимо от молярности буфера, служившего дополнительным нуклеофилом (рис. 9, кривая 2).

Эффективность гидролиза этого пептида энтеропептидазой (к^/Кт^)) составляло менее 10% от эффективности гидролиза типичных субстратов энтеропептидазы 004К-Р(Ы02)0 (субстрат 1) и 004К-№а.

Таким образом, в результате серий экспериментов с использованием в качестве нуклеофилов метанола и Тпб-НО буфера показано, что лимитирующей стадией гидролиза амидных (и пептидных) высокоэффективных субстратов энтеропептидазы, содержащих последовательность -(А5р)Д.у5-, является деацилирование: кг> кз. Эффект ионов кальция

Энтеропептидаза является в определенном смысле трипсиновым ферментом, для которого, как известно, ионы кальция играют важную регуляторную роль. Поэтому представлялось интересным изучить влияние ионов кальция на энтеропептидазный катализ. Кроме того существуют противоречивые литературные данные о влиянии ионов кальция на гидролиз различных субстратов энтеропептидазой Проведено систематическое изучение влияния ионов кальция на гидролиз ряда синтетических субстратов- ОБдК-Жа, субстратов 1, 5, 6 и 9 природной энтеропептидазой быка (ЭП 118-1035), укороченной в результате автолиза формой фермента (ЭП 466-1035), а также рекомбинантной легкой цепью энтеропептидазы, содержащей семнадцать С-концевых аминокислотных остатков тяжелой цепи (ЭП 784-800) (табл. 3).

Автолизованная форма энтеропептидазы (ЭП 466-1035) была получена обработкой полноразмерного фермента 2 мМ ЕвТА в 10 мМ НЕРЕБ-КОН буфере, рН 6,5, с последующим многократным диализом в Сеп1псоп-100 в том же буфере без ЕОТА для удаления хелатора и доведением значения рН до 8,0 (рис. 10) Полученные результаты (табл 3) на примере двух субстратов энтеропептидазы, содержащих четыре остатка аспарагиновой кислоты в положениях Р2-Р5: 004К-№а и 0П4К-Р(ТГО2)0 (субстрат 1) свидетельствуют, что ион кальция в концентрациях, превышающих 10 мМ, является активатором их гидролиза (примерно в 3 раза).

Однако Са2+ выступает активатором лишь в случае природной, полноразмерной энтеропептидазы быка, содержащей последовательность 118-800, соответствующую тяжелой цепи зрелого фермента. В случае же двух других, укороченных вариантов энтеропептидазы, содержащих лишь С-концевую половину тяжелой цепи (ЭП 466-1035), или же только семнадцать С-концевых аминокислотных остатков тяжелой цепи (ЭП 784-1035), эффект аютгеации не наблюдается. Субстрат 5, содержащий замену трех остатков аспара! иновой кислоты в РЗ-Р5 на остатки глицина, гидролизовался всеми гремя вариантами энтеропептидазы, включая природный полноразмерный фермент, практически с одинаковой эффективностью, как в присутствии, так и в отсутствие ионов кальция

Таблица 3. Эффективность гидролиза субстратов (кса1/Кт; икМ^-мин"1) природной энтеропептидазой (ЭП 117-1035), автолизованной энтеропептидазой (ЭП 466-1035) и легкой цепью энтеропептидазы (ЭП 784-1035) в присутствии и в отсутствие Са2+; рН 8,0; 37°С.

Субстрат ЭП 118-1035 ЭП 466-1035 ЭП 784-1035

rCa-1 [Ca'] _ [CO

50 мМ 0 50 мМ 0 50 мМ 0

k«, мин"' мМ k,./Km, мкМ"' мин"' kcai, МИН ' К|П> мМ kcM^m, мкМ"'мин"' WKm, мкМ'мин ' kc/K,„, мкМ' мин"' kcatt МИН"' Km; мМ kcai'Km, мкМ1 мин"' мкМ"' мин"'

GD4K-Nfa 1000 1698 1446 1782 0,200 0,280 0,220 0,270 5,570 5,000 6,064* 6,573*" 6,600"" 1290 0,525 1,830 1,660 2,457" 1,660 1,704 1494 0,600 1,530 2,490"* 2,040

GD„K-F(N02)G (1) 1070 0,160 5,640 6,700 1,425 2,290 1,590 1,130 1,280 2,270 1,585

G5DK-F(N02)G (5) 1040 0,437 1,870 2,380 1,980 1,230 1,380 1,410 1,600 2,090

LTAEEK-A (6) 4,930-10"' 4,20 29.40 7,00-10J [15] 3 6,4810

LTAEEK-AAV (9) 0,293 0,332 0,400 [15] 0,452

10 мМ Са2+; pH 8,4; энтеропептидаза человека [Grant & Hermon-Taylor, 1979]. *0,1 мМ Са2+; pH 8,4; энтеропептидаза человека [Grant & Hermon-Taylor, 1979]. "10 мМ Са2+; pH 8,4 [Lu et al„ 1997].

"Полноразмерная энтеропептидаза быка (природная); 10 мМ Ca2+; pH 8,4 [Lu et al., 1997] ""'Полноразмерная энтеропептидаза быка (рекомбинантная) 10 мМ Са2+; pH 8,4 [Lu et al., 1997].

Рис. 10. ЗБЗ-электрофо-рез 1) полноразмерной энтеропептидазы 1181035; 2) автолизованной энтеропептидазы 4661035. 10% ПААГ, восстанавливающие условия. Приведены молекулярные массы маркеров (М)

И, наконец, в случае энтеропептидазного гидролиза субстратов 6 и 9, содержащих два остатка аспарагиповой кислоты, наблюдалось 24-30%-ное игибирование гидролиза 50 мМ СаСЬ, как и для субстрата 5.

Таким образом, для субстрата общего вида -(Авр^Ьуз- при п = 0 как в присутствии, так и в отсутствие Са2+, и п = 4 в присутствии 50 мМ Са2+ обнаружена одинаковая трехкратная разница в эффективности ЭП 118-1035 и ЭП 784-1035. В случае же п = 1-2 и всех трех вариантов энтеропептидазы (ЭП 118-1035, ЭП 466-1035 и ЭП 784-1035), а также п - 4 н двух укороченных вариантов фермента (ЭП 466-1035 и ЭП 784-1035) наблюдается одинаковый характер влияния ионов кальция: 20-30%-ное ингибирование 50 мМ СаСЬ.

3. ПЕПТИДНЫЕ СУБСТРАТЫ КАК МОДЕЛИ ПРИРОДНЫХ И ИСКУССТВЕННЫХ БЕЛКОВЫХ СУБСТРАТОВ ЭНТЕРОПЕПТИДАЗЫ. КАЛЬЦИЙ-ЗАВИСИМЫЙ АВТОЛИЗ ЭНТЕРОПЕПТИДАЗЫ.

Благодаря высокой специфичности энтеропептидаза широко применяется в генноинженерных исследованиях для процессинга химерных белков, содержащих линкер -(Азр^Ьув- между белком-носителем и целевым белком. Однако, как было показано выше, способность энтеропептидазы гидролизовать субстраты, содержащие последовательность (-(А£р/01и)п-Ьу8(Аг£)-, где п = 1-3) может привести к нежелательной деградации химерного белка Несмотря на то, что эффективность "неспецифического гидролиза" не превышает, как мы здесь показали, 10% от эффективности гидролиза специфической последовательности -(Азр^Ьув-, при длительной инкубации химерного белка с достаточно высокими концентрациями энтеропептидазы такой нежелательный гидролиз был в некоторых случаях обнаружен. Результаты проведенных нами экспериментов позволяют в случае природной двухцепочечной энтеропептидазы регулировать этот нежелательный гидролиз' ионы кальция

кДа М кДа

J ___1 тяжелая цепь

250150 ' — _ т т

75 -

— 1-68

— - 5«

легкая цепь

-47

обладают свойством 3-кратной активации гидролиза свели -(Asp^Lys-, однако вызывают 20-30%-ное ингибирование нежелательного гидролиза связей -(Asp/Glu)„-Lys(Arg)-, где п = 1-3.

Напротив, при широко распространенном в настоящее время использовании рекомбинантной легкой цепи энтеропептидазы для процессинга химерных белков, содержащих энтеропептидазный линкер -(Asp^Lys- между белком-носителем и целевым продуктом, добавление Са2+ не требуется - он ингибирует гидролиз.

С другой стороны, обнаруженные нами свойства и особенности такого "неспецифического" гидролиза дчкгг возможность использовать энтеропептидазу в структурных исследованиях для фрагментирования природных белков. При этом, в отличие от трипсинового гидролиза, ведущего к интенсивной деградации молекулы белка, использование энтеропептидазы приведет к крупным пептидным фрагментам, и, более того, как раз после тех остатков Lys или Arg, где трипсиновый гидролиз менее благоприятен из-за наличия отрицательно заряженных аминокислотных остатков в Р2-Р5-положсниях

Потенциальные и экспериментально обнаруженные центры автолиза энтеропептидазы

Исследованные субстраты - пептиды (4-15), были выбраны по структурным соображениям в качестве модели процесса автолиза энтеропептидазы Количество и расположение потенциальных центров автолиза тяжелой цепи энтеропептидазы (типа, представленного формулами 1-1 и 1-2; в положении Р2-Р5 содержится хотя бы один остаток Asp/Glu) определены по ее первичной структуре. Показано, что потенциальные центры автолиза сконцентрированы, в основном, на N-конце тяжелой цепи фермента Кроме того, распределение потенциальных сайтов автолиза координируе! с известным из литературы подразделением тяжелой цепи на домены, гомологичные различным белкам [Kitamoto et al., 1984]

Первый фрагмент (118-243) содержит семь таких центров, согласующихся с общими формулами (1-1 и 1-2); лишь два из них содержат, однако, остаток Glu или Asp в ключевом для возможного автолиза положении Р2 Кроме того, фрагмент 199-240 является богатым цистеином доменом, юмологичным различным белкам системы комплемента и рецепторам липопротеинов низкой плотносга. Семь цистеиновых остатков расположены в этой области Безусловно, концентрация остатков цистеина на каком-либо небольшом участке повышает вероятность существования S-S-связей и образования компактной структуры, что, в общем, должно препятствовать автолизу на этом участке молекулы

Вторая область - это фрагмент 359-465, гомологичный мембранносвязанной металлопротеазе меприну Из шести потенциальных центров автолиза четыре имеют в Р2-положении остаток Glu. Именно в этих четырех центрах экспериментально обнаружен

кальций-зависимый автолиз:, -NNYEK360-INCN-, -NEWER384-TQGS- -GRRER422-VGLL- и -QNMEK465-TTFQ- fMikhailova, Rumsh, 2000] Эта средняя часть тяжелой цепи, наиболее подверженная автолизу, содержит всею три остагка цистеина

Полученные данные позволяют также несколько уточнить расположение дисульфидных связей в молекуле энтеропептидазы По аналогии с другими сериновыми ферментами, предполагается локализация четырех внутренних дисульфидных связей легкой цепи: Cys826-Cys842, Cys926-Cys993, Cys957-Cys972, Cys983-Cysl011, а также межъединичной дисульфидной связи Cys788-Cys912 [Lu et al, 1999]. О локализации остальных, внутренних дисульфидных связей тяжелой цепи, ничего не известно, однако разделение с помощью гель-фильтрации продукта автолиза (466-1035) и нативной молекулы энтеропептидазы (118-1035) свидетельствует, по крайней мере, об отсутствии дисульфидной связи между N- и С-концевыми половинами тяжелой цепи фермента.

С-концевая половина тяжелой цепи (492-800) содержит всего два потенциальных центра гидролиза низкой эффективности (не содержащих остатков Asp/Glu в положении Р2), а легкая цепь (801-1035) - шесть потенциальных центра гидролиза, из которых только один содержат остаток Glu в Р2-положении В этих областях молекулы энтеропептидазы автолиз не обнаружен.

Очевидно, что гидролиз в таких местах белковой молекулы может происходить лишь в случае доступности их активному центру энтеропептидазы Часто химерные белки, даже содержащие полную линкерную последовательность, не гидролизуются этим ферментом или же гидролизуются очень медленно Доступность соответствующих сайтов для гидролиза определяется укладкой белковой глобулы. Вероятно, обнаруженный автолиз после остатков Lys360 и 465, а также Arg384 и 422 становится возможным из-за разрыхления белковой глобулы после удаления из нее ионов кальция

Физиологическая роль кальций-зависимого автолиза трипсина и тяжелой цепи энтеропептидазы

В настоящей работе показано, что энтеропептидаза обладает свойством специфически (и в некоторых случаях даже эффективно) гидролизовать in vitro наряду со своим уникальным природным субстратом трипсиногеном некоторые биологически активные пептиды, а также, при определенных условиях, собственную тяжелую цепь

Полученные в ходе проведения работы данные о разном профиле селективности энтеропептидазы и трипсина при гидролизе систематическою ряда пептидов обиден формулы (1-1) и (1-2) являются точным этимологическим обоснованием возникновения в ходе эволюции позвоночных N-концевых активационных пептидов, содержащих последовательность -Asp-Asp-Asp-Asp-Lys [Roach et al, 1997, Chen et al., 2003]

Действительно, такие изменения в структуре канонического активационного пептида, как замена остатка Lys на Arg, или того или иного остатка Asp на незаряженный аминокислотный остаток (особенно в Р2-положении) неизменно приводят к повышению эффективности трипсинового гидролиза, что повышает вероятность автоактивации соответствующих трипсиногенов, и, в свою очередь, возможность преждевременной активации их в ацинарных клетках панкреаса Это неизбежно увеличивает риск возникновения панкреатита.

Изучение особенностей кальций-зависимого автолиза энтеропептидазы позволило провести аналогию этого процесса с автолизом трипсина. Схожесть процессов автолиза этих тесно взаимосвязанных ферментов в среде с пониженным содержанием Са2+ позволяет предположить, что существует общий защитный механизм, регулирующий таким образом нежелательную преждевременную активацию трипсиногена в ацинарных клетках панкреаса, приводящую к панкреатиту.

Выводы

1. Исследован гидролиз ряда серий синтетических модельных субстратов и показано, что энтеропептидаза обладает способностью гидролизовать субстраты по связям, образованным карбоксильными группами остатков лизина или аргинина, если в положениях Р2-Р5 субстрата находится менее четырех отрицательно заряженных аминокислотных остатков.

2. Показано, что энтеропептидаза обладает протяженным вторичным центром, взаимодействующим с 6-7 аминокислотными остатками, расположенными по обе стороны от расщепляемой пептидной связи (РЗ/4-РЗ').

3. Установлено, что уникальные свойства энтеропептидазы обусловлены существованием трех субстрат-связывающих центров. При этом один из вторичных центров (S2) обуславливает специфичность, а другой вторичный центр (Sil) - эффективность энтеропептидазного гидролиза Одной из важных составляющих энтеропептидазного катализа является строгая иерархия субстрат-связывающих центров- взаимодействие обоих вторичных центров с субстратом возможно лишь при одновременном взаимодействии субстрата с первичным центром.

4. Исследован гидролиз синтетических субстратов энтеропептидазы и показано, что полноразмерные субстраты (п = 4) гидролизуются энтеропептидазой с лимитирующей стадией деацилирования (кг > кэ).

5. Показано, что ионы кальция активируют гидролиз полноразмерной энтеропептидазой субстратов с п = 4, ингибируя, одновременно, гидролиз субстратов с 1 < п

< 4S «то имеет важное значение для применения энтеропептидазы в процессинге химерных белков.

6. Высказано предположение о возможной физиологической роли кальций-зависимого автолиза энтеропептидазы как составной части обшего защитного механизма от преждевременной активации трипсиногена, приводящей к панкреатиту

Основные материалы диссертации представлены в следующих работах:

1 Likhareva V.V , Mikhailova A G , Vaskovsky B.V., Garanin S.K., Rumsh L D Synthetic mode! and bioactive peptides as potential substrates for enteropeptidase. Letters in peptide science, 2002, v. 9, p. 71-76;

2 Лихарева В В., Михайлова А.Г., Румш Л.Д Гидролиз энтеропептидазой неспецифических (модельных) пептидных последовательностей и возможная физиологическая роль этого явления. Вопросы мед химии, 2002, т. 48 (6), с. 561-569;

3. Лихарева В.В., Васьковский Б.В., Шепель Н Э , Гаранин С.К., Михайлова А.Г , Румш

Л.Д. Новые субстраты энтеропептидазы I Биологически активные гепта-нонапептиды. Биоорган, химия, 2003, т. 29 (2), с. 129-134;

4 Likhareva V.V., Mikhailova A G., Vaskovsky B.V., Garanin S.K., Rumsh L.D. Bioactive peptides as potential substrates for enteropeptidase. Peptides 2002: Proceeding of the twenty-seventh European Peptide Symposium. Sorrento, Italy, 2002, p. 796;

5 Михайлова А Г , Лихарева В В., Васьковский Б В., Гаранин С К , Оноприенко Л В., Прудченко И.А., Чикин Л.Д., Румш Л.Д. Исследование вторичной специфичности энтеропептидазы в сравнении с трипсином. Биохимия, 2004, т. 69 с. 1118-1128;

6. Михайлова А Г., Лихарева В В., Прудченко И А., Румш Л Д Эффект ионов кальция на энтеропептидазный катализ. Биохимия, 2005, т. 70 (10), с. 1367-1375;

7. Лихарева В.В., Михайлова А.Г., Румш Л.Д. Высокоспецифические ферменты как продукт эволюции: от трипсина к энтеропептидазе. Тезисы докладов школы-конференции "Горизонты физико-химической биологии". Пущино-на-Оке, 2000, т. 2, с 46,

8. Лихарева В.В., Васьковский Б.В., Гаранин С К., Михайлова А.Г, Румш Л Д. Исследование нетипичных субстратов энтеропептидазы Тезисы докладов VI чтений, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова. Москва, 2002, с. 18;

9. Mikhailova A G., Likhareva V V , Rumsh L D Means of realization of absolute specificity and efficicncy of proteases International conference "Biocatalysis - 2002: fundamentals &. applications". Russia, Moscow, 2002, Abstracts, - p. 27,

10. Лихарева ВВ, Шепель Н.Э. Новые субстраты энтеропептидазы. Тезисы докладов

XIV зимней международной молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". Москва, 2002, с. 37;

11 Михайлова А.Г., Лихарева В.В, Румш ЛД Пути реализации абсолютной

специфичности и эффективности протеиназ. Труды Всероссийсикой конференции "Проблемы медицинской энзимологии" "Современные технологии лабораторной диагностики нового столетия" Международный симпозиум" Москва, 2002, с. 161,

12. Likhareva V.V., Mikhailova A.G., Rumsh L D , Garanin S.K , Vaskovsky B.V Bioactive peptides as potential substrates for enteropeptidase. 27th European peptide symposium. Sorrento, Italy, 2002, Abstracts, - p. 167,

13 Михайлова А Г., Лихарева В В, Румш Л Д. Пути реализации абсолютной специфичности и эффективности протеиназ, V симпозиум "Химия протеолитических ферментов", Москва, 2002, с. 16

14 Лихарева В.В , Васьковский Б В , Гаранин С К , Михайлова А.Г , Румш Л Д Исследование нетипичных субстратов энтеропептидазы V симпозиум "Химия прортеолитических ферментов", Москва, 2002, с. 65;

15 Лихарева В В., Михайлова А.Г , Васьковский Б В , Гаранин С К., Румш Л.Д Изучение субстратной специфичности энтеропептидазы на примере синтетических модельных пептидов. Тезисы докладов Российского симпозиума по химии и биологии пептидов. Москва, 2003, с. 33;

16. Лихарева В.В, Михайлова А.Г, Румш Л.Д Поиск специфических ингибиторов энтеропептидазы путем химической модификации трипсина и трипсиногена I езисы докладов VII чтений, посвященных памяти академика Ю А Овчинникова Москва, 2004, с 77;

17. Лихарева В.В, Михайлова А.Г., Румш Л Д. Изучение специфичности энтеропептидазы на примере химически модифицированных трипсина и трипсиногена Тезисы докладов XII Международной конференции и дискуссионного научного клуба "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии" Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 2004, с. 74;

18. A.G. Mikhailova, V.V. Likhareva, LD. Rumsh, N Teich Regulation of enteropeptidase activity by calcium ions. 30th FEBS Congress and 9lh IUBMB Conference Budapest, Hungary, 2005, Abstracts, - p. 171.

Принято к исполнению 08/09/2005 Заказ № 1029

Исполнено 09/09/2005 Тираж: 75 экз

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш., 36 (095) 975-78-56 (095) 747-64-70 www.autoreferat.ru

РНБ Русский ф

2007-4 1345

1 :'0Я 2005

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Лихарева, Виктория Владимировна

Список сокращений

Введение 6 I. Литературный обзор

1.1. Локализация энтеропептидазы

1.2. Структура энтеропептидазы

1.3. Активация проэнтеропептидазы

1.4. Трипсиноген - физиологический субстрат энтеропептидазы 14 1.4.1 Структурные модификации в процессе активации трипсиногена

1.5. Специфичность энтеропептидазы

1.6. Использование энтеропептидазы для процессинга химерных белков

1.7. Вторичная специфичность сериновых протеиназ

1.8. "Энтеропептидазный линкер" -(Asp)4Lys- в составе природных ' белков

1.9. Роль ионов кальция в энтеропептидазном катализе

1.9.1. Кальций-зависимый автолиз энтеропептидазы

1.9.2. Эффект ионов кальция на энтеропептидазный гидролиз 32 II. Результаты и обсуждение

Глава 1. Структура и иерархия су'бстрат-связывающих центров энтеропептидазы 38 1.1 Первичная и вторичная специфичность энтеропептидазы в сравнении с трипсином

1.1.1. Первичная специфичность

1.1.2. Вторичная специфичность 41 1.2. Эффективность энтеропептидазы 51 1.2.1. Субстрат Z-Lys-S-Bzl 54 1.2. Модификация трипсина и трипсиногена для обнаружения доменов субстрата, взаимодействующих с SII-центром энтеропептидазы

1.2.2.1. ДФФ-трипсин

1.2.2.2. Ацетилированный трипсиноген

Глава 2. Особенности энтеропептидазного катализа

2.1. Лимитирующая стадия

2.2. Эффект ионов кальция

Глава 3. Пептидные субстраты как модели природных и искусственных белковых субстратов энтеропептидазы.

Кальций-зависимый автолиз энтеропептидазы

3.1. Гидролиз "неспецифических"субстратов энтеропептидазы как модель автолиза

3.2. N-концевые пептиды мутантных катионных трипсиногенов человека K23R и D22G

3.3. "Неспецифический" энтеропептидазный гидролиз белков

3.4. Потенциальные и экспериментально обнаруженные центры автолиза энтеропептидазы

3.5. Физиологическая роль кальций-зависимого автолиза трипсина и тяжелой цепи энтеропептидазы

III. Экспериментальная часть

1. Материалы

2. Методы

2.1. Очистка энтеропептидазы

2.2. Определение белка

2.3. Определение активности энтеропептидазы

2.4. Определение активности трипсина

2.5. Определение кинетических параметров гидролиза синтетических субстратов 10*

2.5.1. Определение кинетических параметров гидролиза Z-Lys-S-Bzl

2.5.2. Определение кинетических параметров гидролиза модельных пептидов

2.6. Изучения влияния ионов кальция на эффективность энтеропептидазного гидролиза

2.7. Определение лимитирующей стадии реакции " гидролиза ряда синтетических субстратов энтеропептидазой

2.8. Получение апо-формы полноразмерной энтеропептидазы и ее укороченной формы

2.9. Получение ДФФ-трипсина

2.10. Получение ацетилированного трипсиногена

2.10.1. Определение влияния ацетилированного трипсиногена на процесс активации трипсиногена энтеропептидазой

2.10.2. Определение влияния ацетилированного трипсиногена на гидролиз GD4K-Nfa энтеропептидазой

2.11. Гель-электрофорез

2.12. Масс-спектрометрический анализ 114 Выводы 115 Список литературы

Список сокращений

BAPNA - а-Л^-бензоил-£>£-аргинин 4-нитроанилид; BPTI - основной панкреатический трипсиновый ингибитор быка; GD4K-Nfa - /?-нафтиламид глицил-тетра-£-аспартил-/,-лизина; Gdn-Bz-OMum - 4'-гуанидинобензоат 4-метилумбеллифериловый эфир; Gdn-Bz-ONp - 4'-гуанидинобензоат 4-нитрофениловый эфир; GPCR - суперсемейство интегральных семидоменных мембранных рецепторов, сопряженных с G-белками;

HEPES - Лг-2-гидрокси-этилпиперазин-Лг-этансульфоновая кислота;

OG - «-октил-/?-£>-глюкопиранозид;

ОМе - метиловый эфир;

PAR - активируемый протеиназой рецептор;

PrA-D4K-P26 - химерный белок, содержащий в качестве носителя модифицированный белок А, а в качестве целевого продукта - рековерин; STI - ингибитор трипсина из бобов сои; TFA - трифторуксусная кислота; TLCK - УУ-тозил-Х-лизин хлорметилкетон; Tris - трис(гидроксиметил)аминометан;

Z-Lys-S-Bzl - тиобензиловый эфир а-//-бензоилоксикарбонил-1-лизина;

ДМСО - диметилсульфоксид;

ДТДП - 4,4'-дитиодипиридин;

ДФФ - диизопропилфторфосфат;

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-функциональные основы уникальной специфичности энтеропептидазы"

Важная роль в организме принадлежит высокоспецифическим протеиназам, которые имеют ограниченное' число физиологических субстратов, гидролизующихся по определенной пептидной связи. Примерами подобных фермент-субстратных пар являются ренин и ангиотензин, химозин и казеин, плазмепсин (аспартатная протеиназа из малярийного плазмодия) и гемоглобин, тромбин и фибриноген, энтеропептидаза и трипсиноген. В связи с развитием методов генной инженерии большое значение приобретает использование высокоспецифических протеиназ в качестве инструмента для точечнои расщепления химерных белков по определенной пептидной последовательности (линкеру), отвечающей специфичности соответствующей протеиназы. Подобные высокоспецифические протеиназы мы назвали "белковыми рестриктазами".

Высокоспецифические протеиназы характеризуются сложной структурной организацией и содержат помимо каталитического и первичного субстрат-связывающего центра, многочисленные домены с определенными функциями". Изучение регуляции активности таких ферментов заключается в понимании сложного механизма, по которому удаленные друг от друга домены согласованно определяют высокую эффективность и селективность катализа.

Энтеропептидаза (энтерокиназа) (КФ 3.4.21.9) была открыта в 1899 году в лаборатории И.П. Павлова, который особо подчеркнул ее значение для организма [1, 2].

Энтеропептидаза - высокоспецифическая протеиназа процессинга -находится в начале каскада реакций активации проферментов пищеварительного тракта. Нарушение нормального течения этого каскада может приводить к преждевременной активации проферментов в поджелудочной железе, что, в свою очередь, приводит к тяжелейшему заболеванию панкреатиту.

В данной работе было проведено исследование особенностей структурном организации энтеропептидазы и ее ферментативных свойств методом субстратного анализа. Проанализированы как независимые свойства доменов, так и условия, при которых проявляется их взаимное влияние.

I. Литературный обзор

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Лихарева, Виктория Владимировна

Выводы.

3. Установлено, что уникальные свойства энтеропептидазы обусловлен^ существованием трех субстрат-связывающих центров. При этом один из вторичных центров (S2) обуславливает специфичность, а другой вторичный центр (SII) -эффективность энтеропептидазного гидролиза. Одной из важных составляющих энтеропептидазного катализа является строгая иерархия субстрат-связывающих центров: взаимодействие обоих вторичных центров с субстратом возможно лишь при одновременном взаимодействии субстрата с первичным центром.

5. Показано, что ионы кальция активируют гидролиз полноразмерной энтеропептидазой субстратов с п = 4, ингибируя, одновременно, гидролиз субстратов с 1 < п < 4, что имеет важное значение для применения энтеропептидазы в процессинге химерных белков.

6. Высказано предположение о возможной физиологической роли кальций-зависимого автолиза энтеропептидазы как составной части общего защитного механизма от преждевременной активации трипсиногена, приводящей к панкреатиту.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Лихарева, Виктория Владимировна, Москва

1. Schepowalnikov, N.P. (1902) Die O.Physiologie des Darmsaftes. Jahresbericht ubcr die Fortschritte der Thierchemie, 29, P. 378-380;

2. Pavlov I.P. (1902) The Work of the Digestive Glands, Charles Griffin, London, 1 st Ed;

3. Maroux, S., Baratti, J., Desnuelle, P. (1971) Purification and specificity of porcine enterokinase. J. Biol. Chem. V. 246, P. 5031-5039;

4. Davie, E.W., Neurath, H. (1955) Identification of a peptide released during autocatalytic activation of trypsinogen. J. Biol. Chem. V. 212, P. 515-529;

5. Yamashina, I. (1956) Acta Chem. Scand. V. 10, P. 739-743;

6. Iladorn, В., Tarlow, M.J., Lloyd, J.K., Wolff, O.H. (1969) Intestinal enterokinase deficiency. Lancet. i,812-813;

7. Haworth, J.C., Gourley, В., Hadorn, В., Sumida, C. (1971) Malabsorption and growth failure due to intestinal enterokinase deficiency. J. Pediator. V. 78, P. 481-490;

8. Hermon-Taylor, J., Perrin, J., Grant, D.A.W., Appleyard, A., Magee, A.I. (1977) Immunofluorescent localization of enterokinase in human small intestine. Gut. V. 18, P. 259-265;

9. Lojda, Z., Gossrau, R. (1983) Ilistochemical demonstration of enteropeptidase activity. New method with a synthetic subsrate and its comparison with the trypsinogen procedure. Histochemistry, V. 78, P. 251-270;

10. Miyoshi, Y., Onishi, Т., Sano, Т., Komi, N. (1990) Monoclonal antibody against human enterokinase and immunohistochemical localization of the enzyme. Gastroenterol. Jpn. V. 25, P. 320-327;

11. Ugolev, A.M., De Laey, P. (1973) Membrane digestion. A concept of enzyme hydrolysis on cell membranes. Biochem. Biophys. Acta, V. 300, P. 105-128;

12. Liepnieks, J.J., Light, A. (1979) The preparation and properties of bovine enterokinase. Biol. Chem. V. 254, P. 1677-1683;

13. Baratti, J., Maroux, S., Louvard, D., Desnuelle, P. (1973) On porcine enterokinase. Further purification and some molecular properties. Biochim. Biophys. Acta. V. 315, P. 147-161;

14. Grant, D.A.W., Hermon-Taylor, J. (1976) The purification of human enterokinase by affinity chromatography and immunoadsorption. Some observations on it<« molecular characteristics and comparisons with the pig enzyme. Biochem. J. V. 155. P. 243-254;

15. Light, A., Fonseca, P. (1984) The preparation and properties of the catalytic subunit of bovine enterokinase. J. Biol. Chem. V. 259, P. 13195-13198;

16. Kitamoto, Y., Yuan, X., Wu, Q., McCourt, D.W., Sadler, J.E. (1994) Enterokinase, the initiator of intestinal digestion, is a mosaic protease composed of a distinctive assortment of domains, Proc. Natl. Acad. Sci. USA V. 91, P. 7588-7592;

17. Hartley, B.S., Kauffman, D.L. (1966) Corrections to the amino acid sequence*of bovine chymotrypsinogen A. Biochem. J. V. 101, P. 229-231;

18. Brown, J.R., Hartley, B.S. (1966) Location of disulphide bridges by diagonal paper electrophoresis. The disulphide bridges of bovine chymotrypsinogen A. Biochem. T. V. 101, P. 214-228;

19. Lu, D., Futterer, K., Korolev, S., Zheng, X., Tan K., Waksman, G., Sadler, J.E. (1999) Crystal structure of enteropeptidase light chain complexed with an analog of the trypsinogen activation peptide. J. Mol. Biol. V. 292, P. 361-373;

20. Yuan, X., Zheng, X.L., Lu, D.S., Rubin, D.C., Pung, C.Y.M., Sadler, J.E. (1998) Structure of murine enterokinase (enteropeptidase) and expression in small intestine during development. Am. J. Physiol. V. 37, G342-G349;

21. Krem, M.M., Di Cera, E. (1998) Conserved water molecules in the specificity pocket of serine proteases and the molecule mechanism of Na+ binding. Proteins: Struct. Funct. Genet. V. 30, P. 34-42;

22. Sudhof, T.C., Goldstein, J.L., Brown, M.S., Russell, D.W. (1985) The LDL receptor gene: a mosaic of exons shared with different proteins. Science, V. 228, P. 815822;

23. Johnson, G.D., Flersh, L.B. (1992) Cloning a rat meprin cDNA reveals the enzyme is a heterodimer. J. Biol. Chem. V. 267, P. 13505-13512;

24. Takagi, S., Ilirata, Т., Agata, K., Mochii, M., Eguchi, G., Fujisawa, H. (1991) The A5 antigen, a candidate for the neuronal recognition molecule, has homologies to complement components and coagulation factors. Neuron. V. 7, P. 295-307;

25. Leytus, S.P., Kurachi, K., Sakariassen, K.S., Davie, E.W. (1986) Nucleotide sequence of the cDNA coding for human complement Clr. Biochemistry, V. 25, P. 48554863;

26. Shimell, M.J., Ferguson, E.L., Childs, S.R., O'Connor, M.B. (1991) The Drosophila dorsal-ventral patterning gene tolloid is related to human bone morphogenetic protein 1. Cell, V. 67, P. 469-481;

27. Mikhailova, A.G., Rumsh, L.D. (1999) Autolysis of bovine enteropeptidase heavy chain: evidence of fragment 118-465 involvement in trypsinogen activation. FEBS Lett. V. 442, P. 226-230;

28. Kitamoto, Y., Veile, R.A., Donis-Keller, II., Sadler, J.E. (1995) cDNA sequence and chromosomal localization of human enterokinase, the proteolytic activator of trypsinogen. Biochemistry, V. 34, P. 4562-4568;

29. Mikhailova, A.G., Rumsh, L.D. (1998) Bioorgan. Khim., V. 24, P. 282-287;

30. Lu, D., Yuan, X., Zheng, X., Sadler, J.E. (1997) Bovine proenteropeptidase is activated by trypsin, and the specificity of enteropeptidase depends on the heavy chain. J. Biol. Chem. V. 272, P. 31293-31300;

31. Zamolodchikova, T.S., Sokolova, E.A., Lu, D., Sadler, J.E. (2000) Activation of recombinant proenteropeptidase by duodenase. FEBS Lett. V. 466, P. 295-299;

32. Лихарева, B.B., Васьковский, Б.В., Шепель, Н.Э., Гаранин, С.К., Михайлова, А.Г., Румш, Л.Д. (2003) Новые субстраты энтеропептидазы. I. Биологически активные гепта-нонапептиды. Биоорган, химия, Т. 29, С. 129-134;

33. Abita, J.P., Delaage, М., Lazdunski, М., Savrda, J. (1969) The mechanism of activation of trypsinogen. The role of the N-terminal aspartyl residues. Eur. J. Biochem. V. 8, P. 314-324;

34. Lee, K.J., Kang, S.G., Kim, I.S. (1998) Streptomyces exfoliates and S. albidoflavus. Pp. 21-22 in Barret, A.J., Rawlings, N.D., Woessner, J.F., eds. Handbook of Proteolytic Enzymes. Academic Press, London;

35. Chen, J.-M., Kukor, Z., Le Marechal, C., Toth, M., Tsakiris, L., Raguenes, O., Ferec, C., Sahin-Toth, M. (2003) Evolution of Trypsinogen Activation Peptides. Mol. Biol. Evol. Epub ahead of print.;

36. Craik, C.S., Largman, C., Fletcher, Т., Roczniak, S., Barr, P.J., Fletterick, P., Rutter, W.J. (1985) Redesigning trypsin: alteration of substrate specificity. Science, V. 228, P. 291-297;

37. Briand, L., Chobert, J.M., Tauzin, J., Declerck, N., Leonil, J., Molle, D., Tran, V., Haertle, T. (1997) Regulation of trypsin activity by Cu2+ chelation of the substrate binding site. Protein Eng. V. 10, P. 551-560;

38. Fehlhammer, II., Bode, W., Huber, R. (1977) Crystal structure of bovine trypsinogen at 1.8 A resolution. Crystallographic refinement, refined crystal structure and comparison with bovine trypsin. J. MoL Biol. V. Ill, P. 415-438;

39. Iledstrom, L., Lin, T.Y., Fast, W. Hydrophobic interactions control zymogen activation in the trypsin family of serine proteases. (1996) Biochemistry, V. 35, P. 451*23;

40. Fonseca, P., Light, A. (1983) The purification and characterization of bovine enterokinase from membrane fragments in the duodenal mucosal fluid. Biol. Chem. V. 258. P. 14516-14520;

41. Light, A., Savithri, U.S., Liepnieks, J.J. (1980) Specificity of bovine enterokinase toward protein substrates. Anal. Biochem. V.106, P. 199-206;

42. Шибанова, Е.Д., Михайлова, А.Г., Александров, С.Л., Румш, Л.Д. (2000) Биоорган, химия Т. 26, С. 522-529;

43. Bricteux-Gregoire, S., Schyns, R., Florkin, M. (1972) Phylogcny of trypsinogen activation peptides. Сотр. Biochem. Physiol. V. 42B, P. 23-39;

44. Light, A., Janska, H. (1989) Enterokinase (enteropeptidase): comparative aspects. Trends Biochem. Sci. V. 14, P. 110-112;

45. Uegaki, K., Nemoto, N., Shimizu, M., Wada, Т., Kyogoku, Y., Kobayashi, Y. (1996) 15N labeling method of peptides using a thioredoxin gene fusion expression system: an application to ACTH-(l-24).' FEBS Lett. V. 379, P. 47-50;

46. Mutt, V., Tatemoto, K., Carlquist, M., Light, A. (1981) Cleavage of eholecystokinin with enterokinase. Bioscience Rep. V. 1, P. 651-659;

47. Safi, W., Maiorano, J.N., Davidson, W.S. (2001) A proteolytic method for distinguishing between lipid-free and lipid-bound apolipoprotein A-I. J. Lipid Res. V. 42, P. 864-872;

48. Agnihotri, R., Crawford, П.С., Наго, II., Matrisian, L.M., Havrda, M.C., Liaw, L. (2001) Osteopontin, a novel substrate for matrix metalloproteinase-3 (stromelysin-1) and matrix metalloproteinase-7 (matrilysin). J. Biol. Chem. V.276. P. 28261-28267;

49. Baratti, J., Maroux, S. (1976) On the catalytic and binding sites of porcine enteropeptidase. Biochim. Biophis. Acta. V. 452, P. 488-496;

50. Emi, M., Nakamura, Y., Ogawa, M., Yamamoto, Т., Nishide, Т., Mori, Т., Matsubara, K. (1986) Cloning, characterization and nucleotide sequences of two cDNAs encoding human pancreatic trypsinogens. Gene, V. 41, P. 305-310;

51. Icho Т., Wickner R.B. (1988) The MAK11 protein is essential for cell growth and replication of M double-stranded RNA and is apparently a membrane-associated protein. J. Biol. Chem. V. 263, P. 1467-1475;

52. Bennett D.E., McCreary C.E., Coleman D.C. (1998) Genetic characterization of a phospholipase С gene from Candida albicans: presence of homologous sequences in Candida species other than Candida albicans. Microbiology, V. 144, P. 55-72;

53. Theologis, A., Ecker, J.R., Palm, C.J., Federspiel, N.A., Kaul, S., White, O.,

54. Bang, D.D., Verhage, R., Goosen, N., Brouwer, J., de Putte, P. (1992) Molecular cloning of RAD 16, a gene involved in differential repair in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. V. 20, P. 3925-3931;

55. Titani, K., Ericsson, L.II., Neurath, II., Walsh, K.A. Amino acid sequence of dogfish trypsin. (1975) Biochemistry, V. 14, P. 1358-1366;

56. Hermodson, M.A., Туе, R.W., Reeck, G.R., Neurath, II., Walsh, K.A. (1971) Comparison of the amino terminal sequences of bovine, dogfish, and Iungfish trypsinogens. FEBS Lett. V. 14, P. 222-224;

57. Lovgren, J., Tians, S., Lundwall, А., Karp, M., Lilja, II. (1999) Production and activation of recombinant hK2 with propeptide mutations resulting in high expression levels. Eur. J. Biochem. V. 266, P. 1050-1055;

58. Franklin, K., Clarke, A.J. (2001) Overexpression and characterization of the chromosomal aminoglycoside 2'-N-acetyltransferase of Providencia stuartii. Antimicrob. Agent Chemother. V. 45, P. 2238-2244;

59. Xiong, A., Singh, V.K., Cabrera, G., Jayaswal, R.K. (2000) Molecular characterization of the ferric-uptake regulator, fur, from Staphylococcus aureus. Microbiology, V. 146, P. 659-668;

60. Einhauer, A., Jungbauer, A. (2001) The FLAG peptide, a versatile fusion tag for the purification of recombinant proteins. J. Biochrm. Biophys. Methods, V. 49, P. 455465;

61. Farrell, P.J., Behie, L.A., Iatrou, K. (2000) Secretion of cytoplasmic and nuclear proteins from animal cells using novel secretion modules. Proteins, V. 41, P. 144153;

62. Matthey, В., Engert, A., Klimka, A., Diehl, V., Barth, S. (1999) A new series of pET-derived vectors for high efficiency expression of Pseudomonas exotoxin-based fusion proteins. Gene, V. 229, P. 145-153;

63. Oh, G.I I., Mahm, M.S., Chung, B.H. (1999) Use of carboxypeptidase V propeptide as a fusion partner for expression of small polypeptides in Escherichia coll. Protein Expr. Purif. V. 17, P. 428-434;

64. Yin, H.S., Shien, J.H., Lee, L.H. (2000) Synthesis in Escherichia coli of avian reovirus core protein varsigmaA and its dsRNA-binding activity. Virology, V. 266, P. 33-41;

65. Takagi, S., Sumi, S., Aoike, M., Sakaguchi, N., Itoh, Y., Jin, D., Matsumura, E., Miyazaki, M. (2000) Characterization of recombinant human chymase expressed in Escherichia coli. Jpn. J. Phzrmzcol. V. 82, P. 144-149;

66. Furumoto, Т., Hata, S., Izui, K. (1999) cDNA cloning and characterization of maize phosphoenolpyruvate carboxykinase, a bundle sheath cell-specific enzyme.Plan* Mol.Biol. V. 41, P. 301-311;

67. Nakashima, A., Mori, K., Nagatsu, Т., Ota, A. (1999) Expression of human tyrosine hydroxylase type I in Escherichia coli as a protease-cleavable fusion protein. Short communication. J. Neural. Transm. V. 106, P. 819-824;

68. Esipov, R.S., Gurevich, A.I., Kaiushin, A.L., Korosteleva, M.D., Miroshnikov, A.I., Shevchenko, L.V., Grishin, E.V. (1997) Bioorg. Khim. V. 23, P. 949952;

69. Kromer, W.J., Carafoli, E„ Bailey, J.E. (1997) Purification of the cardi?c sarcoplasmic reticulum membrane protein phospholamban from recombinant Escherichia coli.Eur. J. Biochem. V. 248, P. 814-849;

70. Nimmesgern, E., Black, J., Futer, O., Fulghum, J.R., Chambers, S.P., Brummel, C.L., Raybuck, S.A., Sintchak, M.D. (1999) Biochemical analysis of the modular enzyme inosine 5'-monophosphate dehydrogenase. Protein Expr. Purif. V 17, P. 282-289;

71. Svetina, M. (2000) Expression of catalytic subunit of bovine enterokinase in the filamentous fungus Aspergillus niger. J. Biotechnol., V. 76, P. 245-251;

72. Choi, S.I. Song, II.W., Moon, J.W., Seong, B.L. (2001) Recombinant enterokinase light chain with affinity tag: expression from Saccharomyces cerevisiae and its utilities in fusion protein technology. Biotechnol. Bioeng., V. 75, P. 718-724;

73. Gasparian, M.E., Ostapchenko, V.G., Schulga, A.A., Dolgikh, D.A., Kirpichnikov, M.P. (2003) Expressipn, purification and characterization of human enteropeptidase catalytic subunit in Escherichia coli. Protein. Expr. Purifi, V. 31, P. 133139;

74. Chubet, R.G., Brizzard, B.L. (1996) Vectors for expression and secretion of FLAG epitope-tagged proteins in mammalian cells. BioTechniques, V. 20, P. 136-141;

75. Fiedler, F. (1987) Effects of secondary interactions on the kinetics of peptide and peptide ester hydrolysis by tissue kallikrein and trypsin. Eur. J. Biochem., V. 163, P. 303-312;

76. Hedstrom, L. (2002) Serine protease mechanism and specificity. Chem. Rev., V. 102, P. 4501-4523;

77. Pozsgay, M., Szabo, G., Bajusz, S., Simonsson., R., Gaspar, R., and Elodi, P. (1981) Investigation of the substrate-binding site of trypsin by the aid of tripeptidyl-p-nitroanilide substrates. Eur. J. Biochem. V. 115, P. 497-502;

78. Kurth, Т., Grahn, S., Thormann, M., Ullman, D., Hofmann, H.-J., Jakubke, H.-D., Hedstrom, L. (1998) Engineering the SI' subsite of trypsin: design of a protease which cleaves between dibasic residues. Biochemistry, V. 37, P. 11434-11440;

79. Kurth, Т., Ullman, D., Jakubke, II.-D., Hedstrom, L. (1997) Converting trypsin to chymotrypsin: structural determinants of SI1 specificity. Biochemistry, P. 10093-' 10104;

80. Grahn, S., Kurth, Т., Ullman, D., Jakubke, H.-D. (1999) S' subsite mapping of serine proteases based on fluorescence resonance energy transfer. Biochim. Biophys. Acta, V. 1431, P. 329-337;

81. Schellenberger, V., Turck, C.W., Hedstrom, L., Rutter, W.J. (1993) Mapping the S' subsites of serine proteases using acyl transfer to mixtures of peptide nucleophiles Biochemistry, V. 32, P. 4349-4353;3

82. Bizzozero, S.A., and Dutler, II. (1987) Comparative specificity of porcine pancreatic kallikrein and bovine pancreatic trypsin. Importance of interactions N-terminal to the scissible bond. Arch. Biochem. Biophys., V. 256, P. 662-676;

83. Reyda, S., Sohn, Ch., Kiebe, G., Rail, K., Ullman, D., Jakubke, II.-D., and Stubbs, M.T. (2003) Reconstructing the binding site of factor Xa in trypsin reveals ligand-induced structural plasticity. J. Mol. Biol. V. 325, P. 963-977;

84. Ilosfield, Т., and Lu, Q. (1999) Influence of the amino acid residue downstream of (Asp)4Lys on enterokinase cleavage of a fusion protein. Anal. Biochem., V. 269, P. 10-16;

85. Dery, O., Corvera, C.U., Steinhoff, M., Bunnett, N.W. (1998) Proteinase-activated receptors: novel mechanisms of signaling by serine proteases. Am. J. Physiol., V. 274, P. 1429-1452;

86. Hollenberg, M.D. (2002) International Union of Pharmacology. XXVIII. Proteinase-activated receptors. Pharmacol. Rev., V.54, P. 203-217;

87. Kawabata, A. (2003) Gastrointestinal functions of proteinase-activated receptors. Life Sci., V. 74, P. 247-254

88. Coughlin, S.R. (2000) Thrombin signalling and protease-activated receptors. Nature, V. 407, P. 258-264;- *

89. Coughlin, S.R. (2002) Protease-activated receptors in the cardiovascular system. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., V. 67, P. 197-208;

90. Лихарева, B.B., Михайлова, А.Г., Румш, Л.Д. (2002) Гидролгз энтеропептидазой неспецифических (модельных) пептидных последовательностей и возможная физиологическая роль этого явления. Вопр. мед. химии, Т. 48, С. 561-569;

91. Likhareva, V.V., Mikhailova, A.G., Vaskovsky, B.V., Garanin, S.K., Rumsh', L.D. (2002) Synthetic model and bioactive peptides as potential substrates for enteropeptidase. Letters in Peptide Science, V. 9, P. 71-76;

92. Михайлова А.Г., Лихарева В.В., Васьковский Б.В., Гаранин С.К., Оноприенко Л.В., Прудченко И.А., Чикин Л.Д., Румш Л.Д. (2004) Исследование вторичной специфичности энтеропептидазы в сравнении с трипсином. Биохимия, Т. 69, С. 118-119;

93. Grant, D.A.W., Hermon-Taylor, J. (1979) Hydrolysis of artificial substrates by enterokinase and trypsin and the development of a sensitive specific assay for enterokinase in serum. Biochim. Biophis. Acta. V. 567, P. 207-215; •„

94. McCutcheon, A.D. (2000) Neurological damage and duodenopancreatic reflux in the pathogenesis of alcoholic pancreatitis. Arch. Surg., V. 135, P. 278-285;

95. Miyata, S. (1999) Expression of trypsin in human cancer cell lines and cancer tissues and its tight binding to soluble form of Alzheimer amyloid precursor protein in culture. J. Biochem., V. 125, P. 1067-1076;

96. Dijkstra, B.W., Drenth, J., Kalk, K.H. (1981) Active site and catalytic mechanism of phospholipase A2. Nature, V. 289, P. 604-606;

97. Pieterson, W.A., Volverk, J.J., De Haas, G.H. (1974) Interaction of phospholipase A2 and its zimogen with divalent metal ions. Biochemistry, V. 13, P. 14391445;

98. Slotboom, A.J., Jansen, E.H.J.M., Vlijm, H., Pattus, F. (1978) Ca2+binding to porcine pancreatic phospholipase A2 and its function in enzyme-lipid interaction. Ibid. V. 17, P. 4593-4600;

99. Matthews, B.W., Weaver, L.I I., Kester, N.R. (1974) The conformation of thermolysin. J. Biol. Chem. V. 249, P. 8030-8044;

100. Fontana, A., Vita, C., Boccu, E., Veronese, F.M. (1977) A fluorimetric study of the role of calcium ions in the stability of thermolysin. Biochem. V. 165, P. 539-545;

101. Bode, W., Schawager, P. (1975) Refined crystal structure of bovine (3-trypsin at 1.8 A resolution. II. Crystallographic refinement, calcium binding site, benzamidinc binding site, and active site at pH 7.0. J. Biol. Chem. V. 98, P. 693-717;

102. Epstein, M., Levitzki, A., Reuben, J. (1974) Binding of lantanides and of divalent metal ions to porcine trypsin. Biochem. V. 13, P. 1777-1782;

103. Cohen, G.II., Silverton, E.W., Davies, D.R. (1981) Refined crystal structure of y-chymotrypsin at 1.9 A resolution: Comparison with other pancreatic serine proteases. J. Biol. Chem. V. 148, P. 449-479;

104. Пермяков E.A., Кальцийсвязывающие белки. M.: Паука, 1993. С. 15-27;

105. Delaage, М., Abita J.P., Lazdunski М. (1986) Physico-chemical properties of bovine chymotrypsinogen B: A comparative study with trypsinogen and chymotrypsinogen A. Europ. J. Biochem. V. 5, P. 285-293;

106. Barns, R.J., Elmslie, R.G. (1974) The active site of porcine enteropeptidase. Selective inactivation of the peptidase activity. Biochim. Biophis. Acta. V. 350, P. 495498;

107. Anderson, L.E., Walsh, K.A., Neurath, H. (1977) Bovine enterokinase. Purification, specificity, and some molecular properties. Biochemistry. V. 16, P. 33543360;

108. Baratti, J., Maroux, S., Louvard, D. (1973) Effect of ionic strength and calcium ions on the activation of trypsinogen by enteroknase. Biochim. Biophis. Acta. \. 321, P. 632638;

109. Magee, A.I., Grant, D.A.W., Hermon-Taylor, J. (1981) Further studies on the subunit structure and oligosaccharide moiety of human enterokinase. Clin. Chim. Acta V. 115, P. 241-254;

110. Mikhailova, A.G., Evtyukova, N.G., Chupova, L.A., Rumsh, L.D. (1998) Vopr. Med. Khim. V. 44, P. 338-346 (in Russia);

111. Mikhailova A.G., Rumsh L.D. (2000) Enteropeptidase: Structure, Function, and Application in Biotechnology, Appl. Biochem. Biotechnol. V. 88, P. 159-174;

112. Barns, R.J., Howe, L.A., Elmslie, R.G. (1973) The effects of Ca2+ on procirs enteropeptidase activity. Biochim Biophys Acta., V. 321, P. 624-631;

113. Rindcrknecht, II., Engeling, E.R., Bunnell, M.J., Geokas, M.C. (1974) A sensitive assay for human enterokinase and some properties of the enzyme. Clin Chim Acta., V. 54, P. 145-160;

114. Delaage, M., Desnuelle, P., Lazdunski, M., Bricas, E., Savrda, J. (1969) On the activation of trypsinogen. A study of peptide models related to the N-terminal sequence of the zymogen. Biocem. Biophys. Res. Commun., V. 29, P. 235-240;

115. Bode, W., Schawager, P. (1975) Refined crystal structure of bovine P-trypsin at 1.8 A resolution. II. Crystallographic refinement, calcium binding site, benzamidine binding site, and active site atpH 7.0. J. Biol. Chem. V. 98, P. 693-717;

116. Cliffe S.G.R., Grant, D.A.W (1981) Calcium-binding constants of trypsin and trypsinogen. Biochem. J., V. 193, P. 655-658; ,

117. Gomez, J.E., Birnbaum, E.R., and Darnall, D. (1974) The metal ion acceleration of the conversion of trypsinogen to trypsin. Lanthanide ions as calcium ion substitutes. Biochemistry, V. 13, P. 3745-3750;

118. Hedstrom, L., Szilagui, L., and Rutter, W. (1992) Converting trypsin to chymotrypsin: the role of surface loops. Science, 255, 1249-1253;

119. Hedstrom, L., Perona, J.J., and Rutter, W. (1994) Converting trypsin to chymotrypsin: residue 172 is a substrate specificity determinant. Biochemistry, 33, 87578763;

120. Perona, J.J., Tsu, Ch.A., Craik, Ch.S., Fletterick, R.J. (1993) Crystal structuresof rat anionic trypsin complexed with the protein inhibitors APPI and BPTI. J. Mol. Biol. 230,919-933;

121. Торчинский Ю.М. Сера в белках. Наука. 1977, стр. 131;

122. Green, G.D., and Shaw, Е. (1979) Thiobenzyl benzyloxycarbonyl-L-Iysinate, substrate for a sensitive colorimetric assay for trypsin-like enzymes. Anal.Biochem., 93, 223-226;

123. Pal, G., Patty, A., Antal, J., Graf, L. (2004) Mutant rat trypsin selectively cleaves tyrosyl peptide bonds. Anal. Biochem., 326, 190-199;

124. Robinson, N.C., Neurath, II., Walsh, K.A. (1973) The relation of the -amino group of trypsin to enzyme function and zymogen activation. Biochemistry, 12, 420-425;

125. Kay, J., Kassel, B. (1971) The autoactivation of trypsinogen. J. Biol. Chem., 246, 6661-6665;

126. Shibanova, E., Alexandrov, S., Miroshnikov, A. (2000) Prot. Pept. Lett., V. 7, P. 43-48;

127. Zerner, В., Bender, M.L. (1964) The kinetic consequences of the acyl-enzyme mechanism for the reactions of specific substrates with chymotrypsin. J. Amer. Chem. Soc., V. 86, P. 3669-3674;

128. Zerner, В., Bond, R.P.M., Bender, M.L. (1964) Kinetic evidence for the formation of acyl-enzyme intermediates in the a-chymotrypsin-catalyzed hydrolysis of specific substrates. J. Amer. Chem. Soc., V. 86, P. 3674-3679;

129. Bender, M.L., Clement, G.E., Gunter, C.R., Kezdy, F.J. (1964) The kinetics of a-chymotrypsin reactions in the presence of added nucleophiles. J. Amer. Chem. Soc., V. 86, P. 3697-3703;

130. Hinberg, I., Laidler, K.J. (1972) The kinetics of reactions catalyzed by alkaline phosphatase: the effects of added nucleophiles. Can. J. Biochem., V. 50, P. 13601368;

131. Savithri, U.S., Light, A. (1980) Retention of enzymatic activity of bovine enterokinase after a limited reduction of disulfide bonds. Biochem Biophys Res Commun , V. 94, P. 360-365;

132. Hofmann, Т., Hodges, R.S. (1982) A new chromophoric substrate for penicillopepsin and other fungal aspartic proteinases. Biochem.J., V. 203, P. 603-610;

133. Mikhailova, A.G., Vorotyntseva, T.I., Bessmertnaya, L.Ya., and Antonov, V.K. (1984) Biochemistry (Moscow), 49, 1483-1487;

134. Teich, N., Ockenga, J., Hoffmeister, A., Manns, M., MUssner, J., Keim, V. Chronic pancreatitis associated with an activation peptide mutation that facilitates trypsin activation. (2000) Gastroenterol., V. 119, P. 461-465;

135. Roach, J.C., Wang, K., Gan, L., Hood, L. (1997) The molecular evolution of the vertebrate trypsinogens. J. Mol. Evol.,45, 640-652;

136. Ferec, C., Raguenes, O., Salomon, R. (1999) Mutation in the cationic trypsinogen gene and evidence for genetic heterogeneity in hereditary pancreatitis. J. Me6 Genet., V. 36, P. 228-232;

137. Sahin-Toth, M., Toth, M.'(2000) Gain-of-function mutations associated with hereditary pancreatitis enhance autoactivation of human cationic trypsinogen. Biochem. Biophys. Res. Commun., V. 278, P. 286-289;

138. Maroux, S., Desnuelle, P. (1969) On some autolyzed derivatives of bovine trypsin. Biochim. Biophys. Acta, V. 181, P. 59-72;

139. Varallyay, E., Pal, G., Patty, A., Szilagyi, L., Graf, L. (1998) Two mutations in rat trypsin confer resistance against autolysis. Biochem. Biophys. Res. Com. V. 243, P. 56-60;

140. Whitcomb, D.C. (1999) The First International Symposium on Hereditary Pancreatitis. Pancreas, V. 18, P. 1-12;

141. Sahin-Toth, M., Graf, L., Toth, M. (1999) Trypsinogen stabilization by mutation Argl 17~>His: a unifying pathomechanism for hereditary pancreatitis? Biochem. Biophys. Res. Commun., V. 264, P. 505-508;

142. March, S.C., Parikh, I., Cuatrecasas, P. (1974) simplified method for cyanogen bromide activation of agarose for affinity chromatography. Anal. Biochem., V. 60, P. 149' 152;

143. Кудрявцева, H.E., Жигис, Л.С., Зубов, В.Г., Вульфсон, A.I I., Мальцев, Л.В., Румш, Л.Д.// Khim. Pharm. Zh. 1995. v. 1, p. 61-63 (in Russian);

144. Bradford, M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem., V. 7, P. 248-254;

145. Eisenthal, R., Cornish-Bowden, A. (1974) The direct linear plot. A new graphical procedure for estimating enzyme kinetic parameters. Biochem. J., V. 139, P. 715720;

146. Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of head of bacteriofage T4, Nature 227, 680-685;

147. Damerval, С. et al. (1987) A simplification of Henkeshoven and Dernick's silver staining of proteins, Electrophoresis 8, 158-159;

Информация о работе

Лихарева, Виктория Владимировна
кандидата химических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.04

Диссертация

Структурно-функциональные основы уникальной специфичности энтеропептидазы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы