Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Синтез и экспрессия искусственного гена гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Синтез и экспрессия искусственного гена гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека"

и? з''

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХММШ КМ. М.М. ШИШКИНА

на правах рукописи

КАЖЬЯП Судхир Кумар

СИНТЕЗ И ЭКСПРЕССИЯ КСКУССТБШЗГОГО ГЕНА ГРЛНУЛСЩЯАРНОГО К0£01£ЕСТ!"Г/Л5РУП!ЕГО ФАКТОРА ЧЕЛОВЕКА

03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1992

Разота выполнзна в Институте Сиоорганичзской зимни кк. Н.М. Еаьжна РАК

Научный руководитель: кандидат химически наук В.Г.КороОко

Официальные сппонэкти: доктор химических наук В. А. Ефимов

доктор биологических наук П.М.Чумаков

Ведущая организация: Институт биологии гена РАН

Защита состоится 5 февраля 1992 г. в Ю00 час. на заседании Спецгализированкого совета Д 002.35.01 в Институте биоорганЕческой земли им. М. Н. Шемякина РАН по адресу : 117871, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

С дассергшэй можно ознакомиться в библкотзкв Института

биооргеничзской им. М.М. Шемякина РАК

Автореферат разослан -г--

Учэккй скгре-тарь Специадиз-чрозанного совета ИБХ АК СССР

кандидат химичэскгз: наук В. А. Несмеянов

i СБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

ссертаци'1 ¡

Актуальность проблемы

Гранулошг колошгзстимулирукщий фэктор человека (hG-CSF) - гликопротеин с молекулярной массой около 1Э кД, продуцируемый в незначительных количествах при соответствующей стимуляции макрофагами, фиСрсбластам и клетками эндотелия, является вашим фактором кроветворения. G-CS? человека характеризуется шроким спектром биологической активности, включая быстрое увеличение числа циркулирующих нейтробнльшх гранулоцитов in vivo и индукцию преимущественного образования колоний нейтро-филов. hG-CSF такз-:э окззивает влияние на активность зрэлых шйтрофгиов, переключая эти клетки ла продукцию аниона супор-оксидз в ответ на бактериальную кнфехцив и усиливая антитело-ззвисЕмуэ клеточную цитстоксичность а фагоцитоз. Кроме того, iiG-csp стимулирует тергсшальные стадии дай^зрапцкровкн, по крайней море, некоторых культивируемых клеточных лилий человека. Сгшсапнко свойства hG-сзр открывают пфакиз перспективы для его терапевтического прк.иЕенкя пр:т некоторых видах рака с долыз преодоления нейтроленни после трансплантации костного козга и интенсивной зсжпотерашп, а тгкг.э поваюнля устойчивости к бактериальным ;г пнруснгм шфэкштл, включая СГЩ.

По крайней мэре, в одной ши клеток кэрцкнош обкэругэ-но каличио двух ферм зрелого hG-cSF, вгслзочаташс 177 (hG-csPa) и 174 (hG-CSPb) ашЕскиелотвнх остатка. Более длинная форма характеризуется наличием трех дополнительных остатков после положения 35, начиная о ií-кснца. Образование двух форм молекулы hG-CSP происходит при трансляции дзух различных мРЖ, явля-нцихся продуктами альтернативного сплайсинга первичного тракс-1фхшта.

В настоящее время проводится ряд исследований с цель» детального изучения биологической активности hG-cs?, механизма рзгулягяи экспрессам его гена, квдухциа пролиферации л диФФэ-рекцировки хлеток-ггосдпествэнников, путей пэродачи сигнала после связпванг.я молекул hG-csF клетсчякш рецепторами и т.п. О"другой, стороны,'в ходе клинических испытаний изучаются терэ-nsr.TIi'30CJG:9 ВОЗМОЖНОСТИ ilG-CSP (отдельно и в комбинации с другим! цкгоккяаш и хташгерзеевтитееккки агентами) при лечении о'гктсриелыиа и зтруешк гагфгкцкй, а таккэ некоторых мзлзгке-зируших опухолей.

Вместе с тем оставтся нерешенными вопросы функционального соотношения и значения двух форы белка, тканевой специфичности их продукции и распределения в тканях организма.

Указанные сх5стоятельства делают желательным получение двух форы hG-CSF в значительных количествах. Известно, что этот белок синтезируется различными тканями организма, однако в крайне низкой концентрации даже при максимальном уровне стимуляции, что сильна усложняет процесс его выделения и очистки. Лучшим источником получения природного hG-csp ' являются клеточные линии карциномы, для которых характерен конститутивный синтез белка. Однако использование методов генной инженерии позволяет достичь его суперпродукщш в бактериальных или эука-огических клетках, причем показано, что рекомбинаятный негли-коБИЛярованньй белек полностью сохраняет свою биологическую активность.

Цель работы

Целью работы являлся химико-ферментативный синтез двух форм искусственного гена, кодирующего два варианта гранулоцит халотэсттутрущего фактора человека, и исследование их экспрессии в клетках Escherichia coll.

Научная новизна и практическая ценность работы

Настоящая работа является частью комплексных исследований по клонированию я экспрессии генов ростовых факторов и лго<фо-кинов, проводимых в Институте Сиоорганической химии ИМ.М.М.Шемякина АН СССР. Ргбота проводилась в период с 1988 по 1991 гг в группе химии генов.

В результата проделанной работы с использованием химико-ферментативного штода получены две формы гена, кодирующего человеческий G-os?, и изучена их экспрессия в бактериальных клетках. Сконструирована серия плазмидных Еекторов для экспрессии подученных генов, которые могут быть использованы для получения штаммов-продуцентов рекомбинангного hG-CSP.

Доступность двух форт белкового продукта гена hG-csp открывает возможкзеть для получения антител и их использования в различных иммунологических исследованиях.

В настоящее время реномбинантный hG-csp успешно проходит широкие клинические испытания, которые свидетельствуют о чрезвычайной перспективности его использования при трансплантации костного мозга,а гак© в терапии различных видов злокачествен-

шк опухолей, лейкемии, СПИДа, а также бактериальных и вирус-1ШХ ИНфеКЩШХ.

Объем работа

Диссертационная работа изломана на 103 стр машинописного текста к состоит из введения, обзора литературы, обсукдешш результатов, экспериментально,! части, выводов и списка цитируемой литературы, ссстсяг.его из 143 ссылок.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Хпм~жо-фзру,ентатившй синтез генов, кодкруших две гЬзрг.ы hc-cs?.

Срлтез двух вгрквтачзй гзна гракулоции-арного колонкесткм?-JEipi"crj;nro фактора человека бил зашшкровея на основе ксвсст-%2Х структур зреднх .».»FKK, иодучавдихся в результате альтернативного еллейеднга. ■ Стратег-ям получения двух гэеоз ззялоталссь г, тем, что сначала проводили синтез г£шэ-"пр8ДЕ9с,Хйенника"1 кодгфукцзго деля цкм.тай варл ® do же hG-CS? (Ркс.1), у которого удалзко 9 с^шсхгслотлго: остатков (с 34-го по 45-?:). При атом з точке делоцки ген-"предлзственнт-л-:" содерп:т участок уз-рзстпсцнотсюй мздокуклеезя HînSIlX, что позволяет восстановить любую форму гена, h.G-CL?ïa или hG-CSPb, при клонировании ПО нону ОДЕОГО КЗ двух СИП'е-ТИЧЭСЮТ ДНК-душгексоз, ? или С-, соответственно.

Для ферментативного синтеза искусственных генов ho-csr б1?ла использована стратегия последовательного клонирования составлявших их фрагментов. 3 сеязя с этим для удобства синтеза ir клонирования гена-предшественника он бал разбит на 5 сегментов А, В, О, В к 2 длиной 25, 82, 163, 111 и 133 пар нук-леоткдов соответственно, вкступэгацие концы которих били запланированы с учетом вырондэшости генетического кода совместимыми с концами, образующимися при расщеплении ДНК эндонуклэазами рестрикции: сегмента А - с ресгрянтазами Clal и XhoX, сегмента В - Xhol и H in diu, сегмента С - Eindlil и BarcHl, сегмента D -ВашН1* и Pstl, сегмента В - ïstl и SalGl. Благодаря наличию таких концов все указанные сегмента, за исключением сегмента D, могли быть независимо клонированы в плазмядном векторе, описанном далее, в полилинкера которого содержались участки

MetThr?roLeuGlyJroA.laSeraer-LeaProCln3erPheI,euXeubysC7Sleu-cgatatgactccactgggtcctgccîcgagtotgccccagagcracctgctgaagtgctïa-tatactgaggtgacccaggàcggagctcagacggggtctcgaaggacgagtîcacgaar-CïaJ XKoI

I- A -î- В —

GlnGluVQlArgLy-sIleG2nGl7AspGlyAlaAlsXeuGlnGlulysI.euCyEHisPi-o-

gagcaagtgaggaagaíccagggcgatggcgcagcgctccaggagaagctttgccacccc-

ctcgttcactccttctaggtgccggtaccgcg5ggcgaggtggtcttcgaaacggtgggg-

HindlII

-1-

GluGluleuValLaiabeuGlyHisSerI.auGlyIleProTz-pAlaPx-oXeuSez-Sei-Cys-

gaggagctggtgctgctcggacactc1cigggcatcccctggggtcccctgagtagctgc-c'tcctcgaccacgacgagcctgtcagagacccgtaggggacccgaggggactgaicgacg-

ProSarGlnilaLeuGlnleullaGlyCy-sbeuSerGlnXeuHisSerGXyieuPhebeu-CCMGCCAGGCCCTCCAGCÏGGCAGGGTGCTTGAGCCAACTCCATAGCGGCCTTTTCCTC-GGTTCGGTCCGGGAGGTCGACCGTCCGACGAACrCGGTTGAGGTAICGCCGGAAAAGGAG-- С -----:-:-

TyrGlnGlyLe-aJjeuGlr^leLLeuGlvGlylleSerPrcGluleuGlyPr-oThr-LeuAsp-

TACCAGGGOTCCTAGAGGCCCTGGAAGGGAÏCTCÏCCAGAGTÏGGGÏCCCACCTÎGGAC-ATGGTCCCCGAGGATGTCCGGGACCraCGCTAGAGAIGTCTCAACCCAGGGTGGAACGTG-

BOJHHÎ*

-ь—---

Thr*LeuGI^iLev\¿.spVe.XAXaJlEpPh.eAlaTlrirThjrXleTrpGl^Gltiiía tGXuGluIJeu—

ACAC!Î^CAGCÎCGACGTCGCCGACЯ^2GCCACCAGCATCTGGGAGCAGAÎГGGAÂGAACîG— TGTGAAGTCGAGCîGCAGCGGCïGAAACGG'fGGTCGÏAGAGCGTCGTCTACCTÎC'ITGAC-—:-!— б -

GXyMetAXaPr^Aliibet^Xiû'iTDThxGXnGXyAlaHetProAleîlîoAXeSsri.XaPlie-

ggaatgggacctgcactgcaccccacccagggtgccatgccggccttcgccï'otgctttc-cctîaccgtggacgtgacgrcgggrgggrcccacggracggccggaagcggacacgaaag-

Pstl,

и1пАгеАгеА1аС1у01уУа11<еи7'а1А1аЗвг-Н1зЪвиа1п5егРЬв1,еиС1иУа13вг-

САССОССССССАССАССЛ^ТТСТАсЬсССТСССАТОТаСАСАССТТССТССАССТСТСС-СТССССССССОТССТССАСААСАТСААСаСАССС'ХАСАССТСТССААССАСгаССАСАСС-

- Е -----

Тух-Аг8'7йХХеиА1-еН1зЬеиА1а01пРгоТег-

ТАСССССТТСТАСаССАССТТССССАССССТСАО АТСССССААОАТССССгССААССССГССССАСТСАССТ

Рлс.1. Куклеотадная последовательность гепг,-"предшественника" С—С5? к кодируемая ею последовательность аминокислот. Указаны сайты узнавания рэстрнктаз. Подчеркнуты инициирующий и терминирующий кодсны. Выделены 5'-концевые звенья синтетических олигонуклеотидов. Границы сегментов А-Б обозначены по верхней, кодирующей цепи

узнавания соответствующих рестриктаз. Из-за того, что сегмент и обладает вшгёп-совдасткмым сайтом, который не восстанавливается в результате клонирования этого сегмента по отдельности, сн долкен был Сыть клонирован в плазмидном векторе только поело клонирования в нем предкествуюцего сегмента С.

Положение участка узнавания рэстрмктазы 2го'Х в 5'-концевой части гена было спланировано тагам образом, ' чтобы обеспечить возможность для изменения последовательности, кодируетей п-кокцевув часть гена ьс-сэр и предшествующей ей последовательности участка инициации трансляции.

ЗаЛ С1

Ьу5ЬеиУа13о1-а1-аСузА1г).Т)ггТуг1уз

АСС'?ССГСАСТиАСТСГаССАССТАСА

ССАСТСАСТСАСАСССИСАТСТТСОА !- ? -1 '

Х^--гХеа7а1А1 аХЬлгТзтЬуг

АССТетСТСССАССТАСА

САСАСОСТССАТСИТСаА

- б -

Конструирование плазшды для клонирования синтетически! сегментов

Для клонирования указанных сегментов гена и их окончательной сборки использовалась плазмида рСЕМ4Ы, полученная на основе плазмида рСМ4, полилинкер которой был модифицирован для расположения участков узнавания всех рестриктаз в необходимом порядке. Эта модификация была осуществлена путем клонирования синтетического дуплекса ДНК по участкам расщепления рестриктазачи ЕооЕ1 и Н1пй111. Синтетический дуплекс получили в результате одной лигазной реакции с участием четырех химически синтезированных олигонуклеотидов,. образующих две комплементарные цепи необходимой последовательности с концами,

1

ААПСАТССАТСТСОАбААО

5ТА&СТА6А6СТСТТ ССААСС Ш

II

сттсАтссассАетотозАС тасюсашсасаосгстсс^ и

Ро1угис!еоИе кгсьеШ Ш

ТА

ЕсоИ

НШ Ш*

N

ЕсоИ ■СЫ

Л7|01

Кп4 Ш ВастШ РгЛ Зз/О!

Рис.2. Схема конструирования векторной плазмида раЕ№'

совместимыми с участками расщепления рестрикгазами EcoRI и Hindlll. 5'- концы олигонуклеотидов, образующее эти сайта, не подвергались фосфорилированию. Расположение участков расщепления рестриктаз в плазмвдэ рсимы представлено на рис.2.

Сборка синтетических сегментов

Сборка пяти дзухцепочэчных сегментов ДЯК осуществлялась путем объединения при помощи ДНК-лигазы полученных химическим синтезом и фосфорилнрованных по 5' -концу олигонуклеотидов (рис.3). Планировалось получение сегментов А, В, С, D и Е в результате отзига и лигирования 2, 5, 15, 8 и 8 олигонуклеотидов соответственно, имеющих длину от IS до 39 звеньев. Нуклеоткд-ные последовательности их бкли нодоОрани таким образом, чтобы обеспечить наличие одноцепочечного участка длиной 4-9 нуклэо-тидов на 5'- или 3'-конца для дальнейшего лигирования или встраивания в векторную плазмнду pGEM4M и понизить вероятность образования внугрицэпочачной вторичной структуры ДНК. Все оли-гонуклеотиды, составляющие искусственный ген G-csi1 были синтезированы в Учебно-Научном центре ИБХ им.Ы.М.Шэмякинэ.

Сегмент А был получен в результате отетга двух олигонуклеотидов после тепловой денатурации (рис. За). Сборка сегмента В производилась в одной лигазной реакции с участием вести олигонуклеотидов после нагревания и огкига (рис.36). Получение сегмента С проводили в три стадии. На первом этапе были синтезированы 4 двухцепочечшх блона CI, CXI, СГО и СIV в результате лигазной реакции с использованием 4 олигонуклеотидных компонентов для каждого блока. Затем блоки были соединены в две стадии лигазной реакцией как показано на рис.Зз. Аналогичным образом сегменты D и К были получат литерованием соответ-ствувднх олигонуклеотидов в две стадии (Рис.4). На первой из них конструировались блоки DI к DII, EI и EII путем дотирования олигонуклеотидов з четырэхкомпонентной системе, после чего они объединялись в сегменты.

Перед лигазной реакцией 5' -концы всех олигонуклеотидов фэсфорялировали с помощью Т4 полкнуклеотидкшазы, за исключением участвующих в образованзп: участков расцепления рестрикта-зами, чтобы избегать образования мульттшернкх форм сегментов.

Xíio5

341 Cí

2Í_ 335 ■ 3i6 337 _____ __

cu

344 345 Polyrrjcleotide (except 333,

T4 0NA c]]1 ligase

346 347 kinose 348)

339 340

"змГ

С IV

HíndUI

325

327 328

IMyrudeoticte kinnse

(except 323,328) T4 DW ligóse

Mhdin Bo/nHIv ■ «índlJl\,

eomHl\ TA 0NA 1;9°se

CI и Т4 ONA ligase СШ ЗУ

С Т4 DNA ligase

SainHI

НШШ

Ват HI

СО I

Гис.З. Схема лигазных сшивок н клонирования сегментов А, В и С

353 О!

35* 355 Ро1упис1есШе Ипюе

(ехсер13£5,356) ТД ОНА Пдоге

352 ~35б

РИ

О (ТА СШИдоге

«мН

■ еонш

Р$П

358

359

360

362 363 Ро!>пис1м1с!г к'тоге

1ехсср1 357.364! Т4 от Пдозе

Л/И.

Рис.4. Схема лнгаэных сшивок и клонирования сегментов О и Е

Рис.5. Схема получения плэзмнк pGCSFa и pGCSFb

Для осуществления контроля за прохождением лигазной реакции в реакции фосфорялирования использовали [?32Р]гАТР низкой удельной активностью, что позволяло визуализировать продукты сшивки путем авторадиографии после электрофореза ли-газных продуктов в полиакриламидном геле и проводить их выделение и очистку. Ввделекие продуктов лигазной реакции, сегментов и составляющих их блоков проводили путем элюции из поли-акриламидяого геля. Для клонирования сегментов в плазмидаом векторе ДНК вектора и сегмента лигировались в молярном соотношении 1:10. После трансформации полученными продукта?® клеток E.coli НВЮ1 скрининг рекомбинантных клонов проводили гибридизацией колоний с использованием одного из 5'- Р-меченых оли-гонуклеотидов, входящих в состав клонируемого сегмента. В результате получили рекомбинантше плазмиды pG4MA, pG4K3, pG4MC, PG4MCD и pG4ME, в которых наличие сегментов А, В, С, CD и Е, соответственно, установили рестриктным анализом с помощью эндонуклеаз рестрикции Мвр1 или ВврЕС. Нуклеотидную последовательность всех сегментов подтверждали методом твердофазной химической модификации и/или ферментативным методом с использованием дидезокитердинаторов. На заключительной стадии сборки гена- "предшественника" все составляющие его сегменты были последовательно переклонированы в плазмиду роиш.

Для получения двух форм зрелого гена дзухцепоче'оше блоки 7 и G были клонированы в плазмиду pGCSPA по уникальному для гена-"предаестввш2ка" сайту Hindin. Рекомбинантныэ клоны екринировали гибридизацией с 32Р-меченыыи клонируемыми олиго-нуклеотидами. В результате получили плазмиды pGSCPa и pGCSPb, содержащие оба варианта синтетического гена (рис.5). Структуру полученных таким образом рекомбинантных плазмид подтверждали определением часта их нуклеотидной последовательности мевду сайтами Clal И SalGI.

Конструирование плазмид для экспрессии генов,

кодирующих hG-CSF В Escherichia ooli.

Несмотря на большое количество литературных данных по экспрессии генов в клетках бактерий, весьма затруднительно предсказать, какой из факторов может иметь решающее значение для

эффективного биосинтеза рэхомбинантного белка. Поэтому сначала мы предприняли попытку прямой экспрессии синтетических генов.

В качестве вектора была выбрана плазмида рСРС2, содержащая необходимые для экспрессии генов регуляторныэ элэментн (тандем сильных промоторов А2 и АЗ ранней области бактериофага Т7 и синтетический участок инициации трансляции) и удобные для клонирования сайга рестриктаз. Клонирование в плазмиде рСРС2 проводили по сайгам расщепления рестриктаз С1а1 и за1И, причем больший фрагмент векторной плазмида .цитировали с меньшими

ЛЬо!

ТЗаХ

Л/со1 ЛЬо! 1и СИАйдске 1агдег ¡гадтег^

и№77гРгоЦеи вуРгоАЬ

соатат ае£лссдттАезтат (XI

ТАТАСТОТоегААТСсАОВАССААса с/01_______ХК>1'

Рис.6. Схема конструирования рекомбинантных шгазмид для прямой экслресии генов ис-сбр

фрагментами, подученными при расщеплении теми ке рестриктазами плазмид pGCSFa и pGCSPb (рис.6). В полученных плазмидах pPSKa и pPSKb последовательность Шайна-Далгарно расположена на расстоянии 10 нукпеотидов от ивициирувдего кодона ASG генов hG-CSP, что может быть неоптимальным. Поэтому с целью изменения структуры участка инициации трансляции обе формы гена были переклонированы из плазмид pPSKa и pPSXb в плазмиду ргНР31д., которая ранее успешно была использована для экспрессии гена фактора некроза опухолей человека. Для этого векторную ДНК, полученную гидролизом плазмиды рТКР31д рестриктазами Clal и líool и выделения большего из образовавшихся фрагментов, дотировали с (фрагментами плазмид pPSKa и pPSKb, .образовавшимися при расщеплении этими же рестркктазаш и содержащими гены hG-CSFa и hG-csîb. Полученные в результате этого зонирования плазмида pPSSKa и pPSSKb содержали данные гены под контролем промоторов А2 и A3 фага Т7 и новый участок инициации трансляции. Сравнение структуры участков инициации трансляции в двух группах полученных плазмид показывает (pic .7), что они различаются величиной спейсера между последовательностью Шайна-Далгарно и юшицшруквдш кодоном (10 и 8 нуклеотидов, соответственно), а также его нуклэотидным составом.

pPSKa, pPSKb: iMTAAGGATATCATCGATATGAGT

pPSSK, pPSSKb: Al'TOAAGGATOAO'OGilAfGAO

Рис.7. Структура участков инициации трансляции в плазмидах pSK И pSSK

Для оценки уровня экспрессии двух фэрм гена полученными плазгдздами трансформировали клетки H.ooli SG2OO50 (1оп~) и клеточные лизаты ночной культуры анализировали электрофорезом в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Однако обнаружилось, что в данной системе продукция белков hG-csPa и iiG-csPb не достигает уровня, позволяющего идентифицировать их на фоне остальных клеточных белков.

Известно, что на экспрессию гетерологичшх генов в E.coli оказывает влияние ряд фактороз, включая тип промотора, эффективность участка связывания рибосом, а также последователь-

ность самого кодирующего района. В частности, невысокий уровень экспрессии может определяться формированием вторичной структуры мРНК в районе участка связывания риоосом и ишвдпгрукщего кодона, препятствующей эффективной трансляции. Возможность образования такой структуры нельзя исключить в случае синтетических генов hG-csF, 5'-концевая часть которых содержит большое количество qc пар (12 из 18 ближайших к инициирующему кодону). В связи с этим представлялось целесообразным уменьшить содержание остатков G и С в м-концевой части мРНК путем замены первых 5 кодонов синтетического гена. С этой цельо с помощь» кассетного мутагенеза была осуществлена замена участка мекду сайтами расщепления рэстриктаз cial и Xhoi синтетическим дуплексом (рис.в). В результате получили плазмиды pPS96a и ppsgßb содержащие гены iiG-cs? с измененной последовательность® If-концевой части, экспрессия которых находится под контролем тех ?.е регуляторных элементов, что и в плазмидах серии pSSK. Анализ экспрессии модифицированных генов методом электрофореза лизатов ночной культуры E.coli, трансформированной плазмидаш pPS96a и ppsg6b, не еыявил существенного увеличения экспрессии бежа. По всей видимости, сделанные нами изменения в N-концэвой. части мРНК являются недостаточными для зф{ективной инициации трансляции.

Одним из подходов, успешно применяющихся для оптимиззщга экспрессии гетерологичных генов в E.ooli, является использование полиишстронной системы экспрессии. Эта система предполагает размещение целевого гена с собственным участком инициации в качестве дистального цистрона на поляцистронной матрице после эффективно транслирукцейся последовательности. Ш предпринял;!! попытку сконструировать такую двухдастроннуи систему для экспрессии синтетических генов hG-csF. При этом в качестве первого цистрона использовали фрагмент эффективно экспрессирувдегося гена фактора некроза опухолей со своими регуляторными элементами, причем были запланированы два варианта сопряжения цист-ронов. В одаом варианте два тавдешшх терминирующих кодона TGATCA первого цистрона, состоящего из 8 кодонов, образовывали инициирутощий кодон второго цистрона, кодирующего hG-csP. Во Етором случае инициирующий кодон дистального цистрона перекрывался с терминирующим кодоном короткого проксимального, образуя последовательность ÄTGA (рис.8). Следует отметить, что в

обеих конструкциях второму дастрону прошествовала последовательность Шайн-Далгарно, являндаяся частью первого цистрона.

ТШС^тТССАГШАССТССАСССТАКА^МСГСШАСАССТтеАСС (1)

эш эк ■

ТТАА^ТТАТСаАТШАССГССАСССТАССАаАТАТагаЩАСАССтАСд (2)

ЗВ1 БЕЗ

Рис.8. Структурная организация цистронов в пдазмидах рРБЭВОа (}) И рР393ТЬ (2)

/ Т ч

ТССЖССТАЕСАЕАТАТСТСМ- СЛСДСПТПАСОТССТбСТ

сосетсстстАТАСАСмстоте еаАагаюуссААКТ

ш а

1Ыугис1ео1йЗе (опоэе

(ехсерГ /./V) Т4 ОМА Ида£<?

//101"

Рис.Э. Схема конструирования рзксмбннантнкх хмазмид рРБ98 с бицистрояной системой экспрессии генов ЬО-сбр

Конструирование рекомбинантных плазмид, содеркащих бицис-трокшо структуры проводили как представлено на рис.9. Сначала в четкрехкомпонентной лигазной реакции сшивали четыре синтетических олигонуклеотида (i-lv), два из которых были предсталены вариантными формами с а; ш Q в олигонуклеотиде 1 и А или с в комплементарном олигонуклеотиде 111 для отбора путем скрининга при клонировании обоих видов бицисгронов. Полученный вырожденный ДНК-дуплекс затем лигировали с большим Nool/Xhol-фрагментом плазмиды рЗ?игз1А, содержащим регуляторную область и начало гена фактора некроза опухолей (ГОТ), и меньшим NcoI/XhoI-фраг-ментом плазмид pPSSXa и pPSSJCb, содержащим синтетический ген M-CSP. В результате скрининга удалось идентифицировать пла-змиду pPS98Ga, содержащую бицистрон 1 типа и "длинный" вариант гена iiG-CSFa, а тага© ллазмиду pFS9STbc бицистроном 2 типа и "коротким" вариантом гена hG-CSPb. Строение рекомбинантных плазмид подтверждали рестриктным анализом и определением нук-леотидной последовательности района сочленения цистронов. Анализ уровня экспрессии гена hG-csp в полученных двухцистронных системах электрофорезом суммарного клеточного белка не обнаружил существенного повышения уровня синтеза рекомбиналтного белка. \

Полученные неудачные результаты в попытках достичь существенного уровня биосинтеза рекомбинантных белков в системах прямой экспрессии с использованием выаеогшсанных конструкций, по всей видимости, могут объясняться образованием вторичной структуры МРНК с участием последовательности Шайна-Далгарко и кодирующего участка, которая препятствует эффективной инициации трансляции. Поэтому на следующем этапе работа мы предприняли попытку создания такой системы, в которой гены синтезированные наш hG-csp находились бы в составе гибридов с короткой

1

MetSerSerSerAspAspAspAspbysThrProLeu— TTTAAGGAraATCGATATGAGGTCGAGCGATGACGATGATAAGACACCTCTG...

SD |—hG-CSF...

Рис.10. Структура начала гибридного гена и кодируемая ей аминокислотная последовательность. Стрелкой показано место расщепления гибридного белка энтеропептидазой

эффективно зкспрэссирущзйся кодирующей последовательностью, продукт которой затем мог Сыть удален путем химического или ферментативного гидролиза. В качестве такой лидеркой последовательности т выбрали начало гена фактора некроза опухолей человека, кодирующее его первые четыре ачикокслога, который соединили с началом гена hG-CSF через последовательность, кодирующую сайт расщепления белков энтеропетвдазой тонкого кишечника (рис.10). Наличие уникальных сайтов рестрикционной эн-донуклеазы Xhoi в начале генов к ho-csp значительно упрос-

0 ь

tcga&cgatoacgatgataa оасассгтотссткт

CGCTACTGCTACrAT TCTGTG GAAVCCAGGACGAAGCT

с ■ a

Potinucfeoiiti& kiitose

(except a,dl TiDNAligas?

XhoS

Hco I

Рис.11. Схема конструирования плазмед pPS94, гибридные гены M-csP

содержаадх

тило конструирование гибридного гена (рис.11). С этой целью сначала из синтетических олигонунлеотидов с помощью ДНК лигазы получили короткий ДНК-дуплекс, кодирующий энтеропептидазный линкер и имеющий Xhol-выступакхщв концы. Затем гидролизом ДНК плазмида ргая?31А рестрактвзами Mool и Xhol получили векторный фрагмент. Аналогичным образом из плазмад pPSSKa и pPSSKb выделили Hcol/Xhoi-фрагменты, содержащие синтетические гены. Полученные таким сбразом фрагменты соединяли с вектором и синтетическим ДНК-дуплексом и лкгазной смесью трансформировали компэ-тентныв клетки E.ooli. Скрининг рекомбинантных клонов проводили гибридизацией с одним из 3 Р-мзченных олигонуклеотвдов, входящих в состав ДНК-дуллеска. В результата получили плазмиды pPS94a и pPS94b, нодирувдие гибридные белки. Следует отметить, что в этих плазмидах гибридному гену предшествует оптимальный участок инициация трансляции (последовательность Шайн-Далгарно и начало гибридного гена), значительно обогащенный остатками А и г (рис.10), что, в свои очередь, может препятствовать образованию ингибирузсщих вторичных структур мРНК.

Для проверки уровня экспрессии гибридных генов плазмидны-ми ДНК pPS94a и pPS94b трансформировали- клетки е. coli втамма SG20050 и анализировали ллзаты полученной ночной культуры электрофорезом суммарного клеточного белка в денатурирующем лоля-экриламидном геле. При этом в лизатах клеток, содержащих плазмиды pPS94a и pPS94b обнаруживаются дополнительные полосы, соответствующие по подвижности белку с молекулярной массой около '19 кД, что свидетельствует об эффективном биосинтезе гибридных белков, которые в дальнейшем могут быть использовыны для получения зрелых форм рекомбляантного балка hG-csp.

Несмотря на то, что по-прежнему не удается выделить все факторы, определяющие уровень биосинтеза гетерологичных белков в бактериальной системе, мокно с уверенностью утверждать наличие существенного влияния на нее вторичной структуры мРНК в районе последовательности Иайна-Далгарно и инициирующего кодона. Кроме того, в последнее время появились данные о важной роли в процессе инициации белкового синтеза последовательностей, расположенных перед участком связывания рибосом. Показано, в частности, что мРНК гена 10 бактериофага Т7 содержит перед последовательностью SD участок, который в значительной

степени способен повышать эффективность трансляции ■ эукариоти-ческих генов в е.coli (энхансер трансляции, гкш). В связи с этим на заключительном этапе работы мы решили проверить- влияете трансляционного энхансзра на экспрессию синтетических генов hG-csp. В качестве источника этого регу.чяторного элемента использовали плазмиду pTREK5 (любезно предоставлена А.И.Гуре-вичем), содержащую синтетический энхансер трансляция. Последовательность ии; была получена нэки при помоци цепкой полмаэ-разной реакции с использованием - термофильной ДНК полимеразк из ü.aquatious. При этом последовательность синтететических. олк-гонуклеотидных праймеров была выбрана таким срабзом, чтобы ввести в структуру усилителя трансляции точечные мутации с целью образования участков расщепления рестриктазами Clal и Kpnl для последнего клонирования этой последовательности перед генами hG-CSF (рис.12).

Kpnl

CCÄGCffG2ACCG СЛРС СТ'Г CGAAA2ТА ... CCAGCGGA2GOGCAICCITCGAMTl,AA'IACGACa;QACTA2AGGGAüACOACAi1CC-a--... OGa'CGCCTAGGCGTACCAAGOmAAiü'ATOCTGAC'iGAa'A'r'CCC'rraGGTGtSGCC-

TTTCCCT0TAG.UA.lSAAi!iai'XGTa'TAA.OT!rfPAAGMGC^CA5AT0Al1AA!rG... AAAGGGAGAirCM-miriAАААОАААМОААА^ТСТТССГОгАГАСТАМЛС. . -

¿AggGAAAglCSIOOgt'a.'gAGCyPAÜACT Clal

Рис.12. Последовательность trki в плазмздз pTR2N5 и структура прайыеров для амплификации

Для клонирования последовательности ттзш перед генами h.G-CSP амплифаццровашшй (фрагмент подвергали расщеплениа рестриктазами Clal и КрпХ и легировали с фрагментами плазмвд рРЗЭба и pPS96b, полученными в результате гидролиза рестрикта-заш Kpnl, Nool и Clal как показано на рис.12. В ■ результате получили ракомбанантные плазмида рТЕЭба и рГЕ9бъ, содержащие последовательность энхансзра трансляции перед генами hG-CSFa и hG-cspb, соответственно. Строение полученных плазмид подтверждали рестриктным анализом, а также определением нуклзотидной

Kpnl

polymerase chairreodion

Kpnl CI o3

fcoRI

Era R1 nri->\Kpnl ^aSSxaal

At о I

Рис.13. Схема конструирования плазмид енхансар трансляции

рГЕ9б, содержащих

последовательности TREU я прилегающих областей твердофазным химическим методом. Для анализа уровня экспрессии синтетических генов с плазмид рТЕ9ба и рТЕЭбЬ тотальные лизаты клеток E.coli mTaMMaSG20050, трансформированных соответствующими плазмидами, анализировали электрофорезом в денатурирующем голиакридамвдном геле (рис.14). Хорошо' видно, что клетки E.coll, содержащие плазмида pTI96a и рТЕ96Ъ, синтезируют по сравнению с басплазмвдными клетками дополнительно белок,

ЬБ^г

25, 6

16,9

«го

о,

Рис.14. Разделение в БЮ-шлиакриламидном геле суммарных клеточных балков Е.ооХ! итамма эсгоо^о без плазкидн (1, б) и с плавмидами р!Е9ба (3), рТЕЭбъ (4), рйЕРЗЧА и рР394а. Стрелками показано положение маркеров молекулярной массы

соотвэстзукшэй по подвижности бэлну с молекулярной массой около 13 кДа. Полученный результат свидетельствует о ток, что клетки Е.ооП, содержащие плазшдк рТЕ96а и рГЕ9£Ь, способны~к конститутивному биосинтезу рекомбинантных белков в количествах, которые делают целесообразным разработку штода для препаративного выделения этих белков и последующего изучения их биологической активности.

ВЫВОДЫ

1. Осуществлен ферментативный синтез и зслскировигло з й.соИ дтзух вариантов искусственного гена гранулошгггрногс колоннестимулирующего фзктора человека (bG-CSP).

2. Сконструирована серия рзкомбинаятвнх плазмид для прямой экспрессии обеих форм гена hGCS?, а такяе для экспрзс-спл в составе гибридных бзлкоз.

3. Исслздозанз зкспрэссия ксскусотвекзшл генов в клетках 2.coli. Полученные результаты позволяют сделать предположение о взлегой роли эффективной инициации трансляции в экспрессии стгнтетлчоского гена hG-CSF.

4. Создан бактериальный зтгад - продуцент гибридного белка, в котором короткая лидерный пептид соединен через линкер, содержащий сайт расцепления знгеропептидазой тонкого ютечнкхз, с аминокислотной последовательностью зрелого грану лоцит арного колошхеегтулирухщэго фактора.

5. С использованием "усилителя" трансляции гена 10 бактериофага Т7 сконструирован штамм S.coli - продуцент зрелого белка iic—csy.

Оспоенъ'з результата дассертшки кзлоеоея в сладукглп: печатных работах:

1. Казьяп С.К., Быстров Н.О., ЕсяповД.С., Коробко В.Г. С:п:тоз л клонирование гене трапулецнт хаддаявеегкмудирукфгз Фактора челог-зкг// Тезисы докладов 2-го Всесоюзного епкпокп-уш "Тоореттчексио и пргпслэднне аспекты молекулярной около • пи" 19Э1. Самарканд. С. ВЗ.

2. Кзньял С.К., Болдырева Е.Ф., Коробко В.Г., Быстров п.С;., Полякова H.A., Севзрцова И.В. Хгашсо-ферментативный синтез

и клонирование искусственного гена гранулоцит колоннестимулирующего фзктора человека // Бяоорганическая химия. 1992. Т.18. Is 1. С.71 -77.