Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Каталитическая субъединица энтеропептидазы человека: получение, характеризация ферментативных свойств и моделирование мутаций, облегчающих ренатурацию и повышающих специфичность фермента

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Каталитическая субъединица энтеропептидазы человека: получение, характеризация ферментативных свойств и моделирование мутаций, облегчающих ренатурацию и повышающих специфичность фермента"

на правах рукописи

УДК 577.322.4

Остапченко Валерий Геннадиевич

КАТАЛИТИЧЕСКАЯ СУБЪЕДИНИЦА ЭНТЕРОПЕПТИДАЗЫ ЧЕЛОВЕКА: ПОЛУЧЕНИЕ, ХАРАКТЕРИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ СВОЙСТВ И МОДЕЛИРОВАНИЕ МУТАЦИЙ, ОБЛЕГЧАЮЩИХ РЕНАТУРАЦИЮ И ПОВЫШАЮЩИХ СПЕЦИФИЧНОСТЬ ФЕРМЕНТА

03.00.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва-2006

Диссертация выполнена в Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН и на кафедре физико-химической биологии и биотехнологии МФТИ (ГУ)

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор

кандидат биологических наук

Долгих Дмитрий Александрович Гаспарян Марине Эдуардовна

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, доцент

доктор физико-математических наук

Ефремов Роман Гербертович

Бычкова Валентина Егоровна

Ведущая организация:

НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ

Защита состоится 20 декабря 2006 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета К 212.156.03 при Московском физико-техническом институте (государственном университете) по адресу: 141700, Московская обл., г. Долгопрудный, Институтский пер., 9, тел.: (495) 408-57-00,408-56-27.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского физико-технического института (государственного университета).

Автореферат разослан «/(У> ноября 2006 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета К 212.156.03 к.ф.-м.н., доцент

Брагин В.Е.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Энтеропептидаза - ключевой фермент пищеварения млекопитающих. Она управляет каскадом пищеварительных ферментов, превращая трипсиноген в трипсин, который, в свою очередь, активирует другие зимогены, а также сам активно участвует непосредственно в протеолизе белковой пищи. Благодаря крайне редко встречающейся в других белках последовательности сайта узнавания (-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-) энтеропептидаза является широко используемым в биотехнологии инструментом для получения рекомбинантных гибридных белков, которые она расщепляет в этом сайте. Тем не менее, нередко наблюдаются случаи сниженной ферментативной активности энтеропептидазы по отношению к определенным гибридным белкам, а также потеря целевого продукта в результате неспецифического гидролиза.

В связи с этим важно оценить в полной мере специфичность энтеропептидазы и выявить факторы, влияющие на нее. В последние годы подобная работа проделана в отношении десятков ферментов. Для многих из них определена специфичность по отношению не только к остатку, идущему непосредственно перед разрезаемой связью (Pi), но и к более удаленным остаткам, как с N-конца сайта узнавания (Рг-Рп), так и с С-конца (Pi'-Pn'). Для подобного исследования необходим многосторонний подход к изучению специфичности фермента, включая использование широких наборов или библиотек пептидных субстратов, а также исследование неспецифического гидролиза различных белков.

Не менее важной проблемой является понимание роли дистальных по отношению к разрезаемой связи аминокислотных остатков в ферментативном катализе. Считается, что их связывание с субстратом может понижать барьер реакции ферментативного расщепления путем передачи энергии по сети водородных связей. Кроме того, предполагается, что взаимодействия дистальных остатков с сайтами связывания протеиназы может влиять на внутренние движения фермента и субстрата, необходимые для осуществления некоторых этапов протеолитической реакции. Для проверки этого предположения необходимо накопление большого объема данных по подобным взаимодействиям, включая каталитические константы, энергетику процесса и молекулярную динамику взаимодействия фермент-субстрат.

Для полноценного исследования рекомбинантных белков очень важно наличие эффективных систем экспрессии, позволяющих нарабатывать белки в значительных количествах. В случае энтеропептидазы потребности современной науки весьма широки: помимо интереса ее изучения как важного элемента физиологии человека, энтеропептидаза стала важным инструментом биотехнологии, где используется для расщепления рекомбинантных гибридных белков. В связи со значительной трудностью получения в Е. coli правильно сложенного белка с несколькими дисульфидными связями в цитоплазме, периплазме или секретированного в культуральную среду, часто используют такие условия экспрессии, при которых происходит агрегация белка и образование телец включения. В этом случае для получения правильно сложенного белка производят его ренатурацию из телец включения. Разработка и оптимизация процедуры ренатурации важна не только для получения конкретного белка, но и для выявления элементов структуры, важных для фолдинга родственных белков.

Цели исследования.

Целью данной диссертационной работы является получение рекомбинантной каталитической субъединицы энтеропептидазы человека, исследование ее ферментативных и физико-химических свойств, моделирование структурных изменений,

облегчающих ее ренатурацию, и исследование структурных элементов, ответственных за специфичность фермента при расщеплении пептидных субстратов.

Задачи исследования.

1) Получить эффективную экспрессионную конструкцию для продукции рекомбинантной легкой цепи энтеропептидазы человека (L-HEP) в виде гибридного белка с тиоредоксином в Е. coli и оптимизировать процедуру экспрессии.

2) Разработать и оптимизировать методики очистки и ренатурации гибридного белка тиоредоксин/L-HEP и очистки целевого белка L-HEP.

3) Охарактеризовать ферментативные свойства полученного препарата энтеропептидазы по гидролизу специфических и неспецифических пептидных субстратов, а также гибридных белков, содержащих сайт узнавания энтеропептидазы. Исследовать устойчивость препарата к денатурирующим агентам (детергенты, высокие концентрации солей, повышенная температура, кислые и щелочные рН и пр.).

4) С помощью методов молекулярного моделирования исследовать структуру L-НЕР на возможность введения мутаций для улучшения выхода ренатурации и повышения специфичности фермента.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Все результаты, представленные в диссертационной работе, получены впервые, что следует из сравнения с отечественными и зарубежными публикациями.

1. Впервые осуществлена экспрессия каталитической субъединицы энтеропептидазы человека (L-HEP) в Escherichia coli в составе гибридного белка с тиоредоксином в качестве белка-носителя.

2. Разработана процедура ренатурации гибридного белка тиоредоксин/L-HEP, позволяющая получать до 10 мг активного фермента с литра культуры Е. coli.

3. Впервые охарактеризована ферментативная активность каталитической субъединицы энтеропептидазы человека. Показано преимущество фермента человека по сравнению с ферментом быка при гидролизе рекомбинантных гибридных белков.

4. Показана высокая устойчивость ферментативной активности L-HEP к действию денатурирующих агентов, таких как детергенты, повышенная температура, отличная от физиологической кислотность буфера и восстанавливающие агенты. Показано, что взаимодействие L-HEP с ингибиторами проходит по типу трипсин-подобных сериновых протеиназ.

5. Показано, что высокие концентрации NaCl и СаСЬ ингибируют расщепление специфических субстратов L-HEP, при этом слабо влияя на скорость гидролиза неспецифических субстратов.

6. Построена пространственная модель L-HEP. Проведено молекулярное моделирование замещения цистеинов в положениях 122, 136 и 201 с целью получения фермента с более высоким выходом ренатурации. Получен мутантный вариант L-HEP/C122S, выход ренатурации которого в 4 раза выше, чем у дикого типа. Показано, что ферментативные свойства L-HEP и L-HEP/C122S практически не отличаются.

7. Показана вторичная специфичность L-HEP к хромогенным субстратам и белкам с ароматическими и большими гидрофобными остатками в положении Рг-

8. Впервые выявлены различия ферментативных свойств каталитических субъединиц энтеропептидаз человека и быка.

9. С помощью методов молекулярного моделирования определено, что аминокислотные остатки в положениях 96 и 219 ответственны за различие ферментативных свойств легких цепей энтеропептидаз быка и человека. Получены мутантные варианты Ь-НЕР с заменой остатков в этих позициях на соответствующие остатки каталитической субъединицы энтеропептидазы быка (Ь-ВЕР). Показано, что остатки 96 и 219 влияют на константы связывания различных субстратов и частично определяют специфичность энтеропептидазы.

Разработанная методика получения рекомбинантной каталитической субъединицы энтеропептидазы человека позволяет не только облегчить дальнейшие исследования этого белка, но и более широко использовать технологию получения рекомбинантных белков в составе гибридов с белком-носителем.

Апробация результатов работы.

Основные материалы, изложенные в диссертации, докладывались и обсуждались на семинарах Лаборатории инженерии белка (ИБХ РАН), были представлены на международных конференциях, таких как Международный конгресс «Пиридоксальфосфат-зависимые ферменты: структура, молекулярная патология и медицина» (Москва, 2002), 15-ая зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2003), РЕВ5 Форум для молодых ученых при 29-м конгрессе БЕВЗ (Варшава, 2004), 30-й Конгресс РЕВБ «Мир белка» (Будапешт, 2005), 18-ая зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 2), материалов и методов (глава 3), результатов и обсуждения (глава 4), выводов и списка литературы. Работы изложена на страницах машинописного текста, содержит рисунков, 12 таблиц. Список литературы включает "/¿^источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Синтез гена L-HEP. его клонирование в плазмидные векторы и подбор экспрессионной системы.

Для получения последовательности ДНК, кодирующей легкую цепь энтеропептидазы человека (L-HEP), аминокислотные остатки 801-1035 (16-243 в нумерации химотрипсина), были синтезированы из 26 перекрывающихся на концах олигонуклеотидов. Для улучшения экспрессии в гене были заменены плохоэкспрессируемые в Е. coli кодоны (согласно таблице встречаемости кодонов в геноме Е. coli). Все олигонуклеотиды имели по 12-14 перекрывающихся нуклеотидов на

«Да

1 2 3 4 5 6 7

21

31

45

97 66

14

k-L-HEP

Рисунок 1. Экспрессия и очистка L-HEP. Гибридный белок Trx/L-HEP экспрессировали в штамме Escherichia coli BL21(DE3), содержащем плазмиду pET-32a/L-HEP, и анализировали с помощью 12%-ного трис-трицинового ДСН-электрофореза в ПААГ. Дорожка 1, маркер молекулярного веса; дорожка 2, клеточный лизат до индукции. Дорожки 3-5 представляют постиндукционные фракции белков; дорожка 3, клеточный лизат и дорожки 4-5, растворимая и нерастворимая фракции, соответственно. Дорожка 6, результат автокаталитического расщепления Trx/L-HEP после ренатурации нерастворимой фракции. Дорожка 7, L-HEP, очищенная на СИТ-агарозе.

обоих концах. Первый олигонуклеотид дополнительно кодировал сайт узнавания энтеропептидазы и сайт рестрикции Bgl II на 5'-конце. К последнему олигонуклеотиду добавили сайт рестрикции Hind III на 5'-конце. Собранный с помощью полимеразной цепной реакции ген был клонирован в вектор рЕТ-32а по рестрикционным сайтам Bgl II и Hind III. Данный вектор предназначен для продукции в Е. coli гибридных белков с тиоредоксином на N-конце, целевым белком на С-конце и соединяющим их линкером, содержащим сайт узнавания энтеропептидазы (непосредственно перед целевым белком), а также два сайта для аффинной очистки: полигистидиновый и S-tag.

Полученной плазмидной ДНК pET-32/L-HEP трансформировали компетентные клетки Е. coli XL-1 Blue для секвенирования последовательности и наработки плазмидной ДНК для дальнейшей экспрессии. Подбор штамма для экспрессии гибридного белка показал, что наилучшим образом для этой цели подходит штамм Е. coli BL21 (DE3), в котором экспрессия протекает под контролем Т7/1ас-оперона. После проведения оптимизации условий экспрессии (подбор кулыуральной среды, температуры роста, концентрации индуктора IPTG) был достигнут очень высокий уровень экспрессии: более 100 мг гибридного белка Trx/L-HEP со 100 мл культуры Е. coli (рис.1, дорожка 3).

Ренатурация гибридного белка Trx/L-HEP и очистка активного фермента L-HEP.

Наработанный бактериями гибридный белок Trx/L-HEP на 80% находился в составе телец включения (рисунок 1, дорожка 5). Тельца включения после процедуры отмывки содержали до 95% целевого белка. Очищенный из растворимой фракции гибридный белок Trx/L-HEP не расщеплялся автокаталитически и не проявлял активности даже после расщепления экзогенной энтеропептидазой (для чего использовали препарат

каталитической субъединицы энтеропептидазы быка производства фирмы New England Biolabs). Активный фермент был получен с помощью ренатурации гибридного белка Trx/L-HEP из телец включения, после их солюбилизации в 6 М гуанидин-гидрохлориде. Для образования правильных дисульфидных связей была применена система буферов, содержащих пару окисленный/восстановленный глутатион. Процедура ренатурации состояла из нескольких этапов. Сначала белок для полного восстановления цистеинов переводили в буфер с низким pH и пониженной концентрацией гуанидина (3 М). Затем в раствор добавляли окисленный глутатион для дисульфидного обмена с восстановленными SH-группами белка. На следующем этапе с помощью диализа избавлялись от избытка окисленного глутатиона и одновременно делали pH близким к физиологическому. Окончательный фолдинг белка проходил в буфере на основе аргинина, который параллельно ингибировал появляющуюся ферментативную активность. Кроме того, в буфере содержался восстановленный глутатион, способствующий дисульфидному обмену между полуцистин-глутатионами и образованию нативных дисульфидных связей.

После ренатурации гибридного белка от него автокаталитически отщеплялась L-НЕР — в процессе диализа белка против буфера, содержащего 50 мМ трис-гидрохлорид, pH 8.0, и 1 мМ СаСЬ, в течение 3 ч. Активный фермент был очищен с помощью аффинной хроматографии на агарозе, конъюгированной с соевым ингибитором трипсина (СИТ) (рис.1, дорожка 7). Количество белка было определено по поглощению на длине волны 280 нм. Выход продукта (отношение количества чистого активного белка к количеству гибридного белка, взятому для ренатурации) до оптимизации ренатурации составил 1%. Оптимизация проводилась по нескольким направлениям: изменение состава буферов для ренатурации и их pH, изменение температуры и длительности различных этапов диализа и инкубации, а также изменение концентрации ренатурируемого белка на разных стадиях ренатурации. В результате выход был увеличен до 2%, и удалось получить до 10 мг активного фермента с высокой степенью чистоты с 1 л культуры клеток (таблица 4).

Исследование ферментативных свойств L-HEP.

Для характеризации каталитических свойств L-HEP был проведен традиционный для исследования трипсин-подобных сериновых протеиназ набор тестов по расщеплению субстратов и ингибированию каталитической активности. В качестве субстратов были использованы синтетические субстраты Z-Lys-SBzl (субстрат трипсина) и GD4K-na (специфический субстрат энтеропептидазы - аналог активационного пептида трипсиногена), а также гибридный белок Trx/hEGF (содержащий тиоредоксин в качестве белка-носителя и эпидермальный фактор роста человека в качестве целевого белка). Гидролиз тиоэфира Z-Lys-SBzl, пептидного флуоресцентного субстрата GD4K-na проводили согласно ранее описанным методикам. При гидролизе белкового субстрата его концентрация во всех случаях была в пределах 0.5-1 мг/мл, что соответствовало 15-50 мкМ. При измерении кинетических параметров ферментативная реакция гидролиза считалась соответствующей кинетике Михаэлиса-Ментен. Для расчета параметров брали по две точки с концентрациями субстрата меньше и больше константы Михаэлиса. График зависимости скорости гидролиза от концентрации субстрата строился в двойных обратных координатах (1/V, 1/S) Лайна-Уивер-Берка (уравнение 1). Линейное приближение этой зависимости считали с помощью программного пакета Origin 7.0 (Microcal, США).

1/V = 1/Vmax + Km/Vm ax • 1/S [Уравнение 1],

где V - скорость гидролиза, Vmax = hat • E, E - концентрация фермента в реакционной смеси, S - начальная концентрация субстрата в реакционной смеси.

Таблица 1. Сравнение кинетических параметров расщепления и

Сй4К-па с помощью ЫНЕР и [.-ВЕР. Величины Кт и к^ выражены как среднее ± квадратичная ошибка результатов трех независимых измерений.

Z-Lys-SBzl GD4K-na

¿etc"') Кт (мм) км/Кт (мм-'-с1) Ас-(с1) АГга (мм) kcJKm (мм-' с1)

L-HEP 133 ±3 140 ±7 950 ±50 115 ± 5 0.16 ±0.01 719 ±40

L-BEP 129 ±4 120 ±10 1075 ±70 42.7 ±4.0 0.61 ± 0.09 70 ±10

ч-Тгх

-«-hEGF

L-HEP

Рисунок 2. Сравнение расщепления гибридного белка Trx/hEGF с помощью L-HEP и рекомбинантной легкой цепи энтеропептидазы быка (L-BEP, New England Biolabs).

А - Отдельные пробы, содержащие 15 мкг Trx/hEGF инкубировались при 20 ОС в течение 20 часов в 0.1 М трис-гидрохлориде, рН 8.0, 1 мМ CaCI2 и 0,1% Tween с различными количествами относительных единиц активности (определяемых как изменение поглощения при 412 нм при расщеплении Z-Lys-SBzl) L-HEP и L-BEP. Дорожка 1. проба без фермента; дорожки 2-4 и 5-7 соответствуют 0.0003, 0.0009 и 0.0045 относительным единицам активности бычьей и человеческой энтеропептидаз, соответственно.

Б - пробы, содержащие 15 мкг Trx/hEGF, инкубировали при 25 °С с одинаковыми относительными единицами активности L-HEP и L-BEP (по расщеплению Z-Lys-SBzl) в буфере, содержащем 0.1 М Tris-HCI (рН 8.0) и 0.02 мМ CaCI2, различные интервалы времени. Пробы

анализировали с помощью 12%-ного трис-трицинового ДСН-электрофореза в ПААГ, и окрашивали Кумасси бриллиантовым синим.

Оценку скорости расщепления гибридных белков с сайтом узнавания энтеропептидазы проводили с помощью сканирования электрофорезных гелей на денситометре ImageMaster VDS («Amersham Pharmacia Biotech», США).

Результаты показали (таблица 1, рисунок 2), что при расщеплении тиоэфира Z-Lys-SBzl константа специфичности k^tIKm L-HEP совпадает с k^JKm рекомбинантной легкой цепи энтеропептидазы быка (L-BEP), а при расщеплении субстратов по специфическому сайту превышает ее на порядок. Эти результаты, с одной стороны, предполагают сходство ферментов в субстрат-связывающем центре Si и сходство конформации остатков, непосредственно участвующих в гидролизе субстрата, с другой -их отличие в субстрат-связывающих центрах S2-S„.

Повышение содержания в реакционном буфере ионов Са2+ (>0.1 мМ) ингибировало расщепление субстратов со специфическим сайтом, однако совершенно не влияло на расщепление Z-Lys-SBzl (рисунок 3). Эффект ингибирования, скорее всего, связан с координированием и ионным взаимодействием ионов кальция с тетрааспартатом субстрата, не дающих последнему связываться со вторичным субстрат-связывающим центром фермента. Хотя изучение первичной последовательности L-HEP не обнаружило в ней специализированных кальций-связывающих центров (в некоторых протеиназах семейства химотрипсина Са2+-связывающий регуляторный сайт образуют отрицательно заряженные остатки в положениях 70 и 80 полипептидной цепи), наблюдалась небольшая стимуляция активности микромолярными концентрациями ионов кальция (рисунок За). Это может быть обусловлено незначительной стабилизацией структуры L-HEP при связывании ионов кальция кислыми остатками на поверхности молекулы.

Повышенные концентрации солей щелочных металлов (в частности, NaCl) ингибировали гидролиз специфических субстратов. Это, видимо, обусловлено экранированием заряженных остатков в окрестности активного центра и ослаблением электростатических взаимодействий пептида DDDDK с S2-S5 остатками фермента (в частности, с петлей 96-99).

а

IL-HEP J L-BEP

0.01 0.02 0.1 0.2 1 2.5 CaClj. (мМ]

CaCI2

Тгх hEGF

Рисунок 3. Влияние ионов Са2* на скорость гидролиза С04К-па и гибридного белка Тгх/ИЕСР с помощью 1.-НЕР:

а - гидролиз С04К-па в присутствии различных концентраций СаС12 или 1 мМ ЭДТА (точка 0 на абсциссе диаграммы);

б - пробы, содержащие 15 мкг Тгх/ЬЕСР, инкубировали при 25 °С с 0.001 ед. акт. Ь-НЕР (по расщеплению г-Ьуз-БВг!) в буфере, содержащем 0.1 М Тиб-НС! (рН 8.0), в течение 8 ч.

Было исследовано влияние различных ингибиторов на каталитическую активность L-HEP (таблица 2). Наибольшее влияние на фермент оказали конкурентные ингибиторы трипсин-подобных сериновых протеиназ (СИТ, бычий панкреатический ингибитор трипсина (апротинин), бензамидин) ингибитор химотрипсина леупептин и ингибитор цистеиновых протеиназ Е-64. На активность практически не влияли многие ингибиторы химотрипсина и мателлопротеиназ. В связи с высокой гомологией СИТ и природных ингибиторов трипсинов млекопитающих, было подробно изучено ингибирование гидролиза Z-Lys-SBzl L-HEP при связывании СИТ. Кинетические данные аппроксимировали методом нелинейной регрессии с помощью программы Origin 7.0 (Microcal, США) к уравнению 2,

[Р] = Vot + (V0- Vs)(1 - exp(-kobat))/kobs [Уравнение 2],

где [Р] - концентрация З-карбокси-4-нитрофеноксида во время t, Vs - скорость реакции в стационарном состоянии, Vo - начальная скорость реакции и Aobs - константа видимой скорости перехода от Vo к Vs. Линейная зависимость tabs от концентрации СИТ (рисунок 4) показывает, что медленное ингибирование L-HEP соответствует следующему механизму связывания СИТ:

медленно кх

Е + I <=> EI

кг

Ингибирование по этому механизму не включает в себя медленную изомеризацию фермента либо комплекса фермент-ингибитор. Кинетические параметры ингибирования: ki = 0.033 нМ"1 мин'1, кг = 0.076 мин"1 и К-* = кг/к\ = 2.3 нМ были определены из графика зависимости ¿obs от концентрации СИТ [I] (уравнение 3):

/fobs = к2 + /п[1]/(1 + [S ]/Кт)

[Уравнение 3],

где [Б] - это концентрация субстрата г-Ьуэ-ЗВ/!, для которого Кт — константа Михаэлиса. Такой же механизм ингибирования с помощью СИТ с К¡* = 1.6 нМ наблюдался для Ь-ВЕР.

10 15 20 25

Время (мин)

[СИТ] (нМ)

Рисунок 4. Ингибирование ШЕР СИТ. А - Реакцию гидролиза 2-1_уз-5Вг1 в присутствии 0, 1.5, 3, 6, 10, 20, 33, 50 нМ СИТ (сверху вниз) начинали добавлением 0.34 нМ ШЕР, и кривые непрерывно регистрировались в течение 30 мин. В каждом случае (за исключением концентрации 1.5 нМ) расход субстрата не превышал 10%. Б - График зависимости /«а» от концентрации СИТ.

Таблица 2. Влияние ингибиторов протеиназ на гидролитическую активность 1.-НЕР. Значения активностей представлены как средние ± среднеквадратичное отклонение, исходя из трех независимых измерений.

Ингибитор Концентрация Активность, %

СИТ ЗнМ 46.1 ± 1.1

33 нМ 6.0 ± 0.2

Апротинин 250 нМ 36.0 ± 1.0

2 мкМ 8.8 ± 0.3

Леупептин 10 мкМ 6.3 ± 0.3

Антипаин 10 мкМ 15.7 ± 1.0

100 мкМ 4.5 ± 0.2

Е-64 10 мкМ 52.4 ± 1.4

100 мкМ 16.3 ±0.8

Бензамидин 100 мкМ 35.6 ± 0.9

1 мМ 8.2 ± 0.5

Химостатин 100 мкМ 81.1 ±2.0

Пепстатин А 100 мкМ 95.0 ± 1.5

Бестатин 100 мкМ 93.0 ± 1.8

ФМСФ 1 мМ 45.9 ±1.1

TJIXK 1 мМ 87.0 ±1.5

ЭДТА 10 мМ 100.0 ±3.3

Таблица 3. Влияние различных денатурирующих агентов на скорость расщепления г^уэ-ЭВг! с помощью ЫНЕР. В графе «Активность» представлено отношение скорости гидролиза в присутствии денатуранта к скорости в начальной реакции как среднее ± среднеквадратичное отклонение, исходя из трех независимых измерений.

Денатурирую -щий агент Концентрация Активность, %

Triton Х-100 0.1% 70 ±3

1.0% 18 ± 1

Tween 20 0.1% 80 ±4

1.0% 25 ± 1

ДСН 0.1% 60 ±3

1.0% 28 ± 1

Этанол 1.0% 90 ±4

10.0% 70 ±3

Имидазол 50 мМ 97 ± 3

250 мМ 68 ±2

дтт 5.0 мМ 100 ±3

20.0 мМ 91 ±3

NaCl 0.1 М 150 ±7

1.0 М 225 ± 10

KCl 0.1 М 120 ±6

1.0 М 100 ±5

Мочевина 1.0 М 50 ±3

6.0 М 10± 1

При расщеплении Z-Lys-SBzl L-HEP показала высокую толерантность по отношению к присутствию в реакционном буфере различных детергентов, солей и других реагентов (таблица 3). Влияние рН реакционного буфера на гидролиз малых субстратов было различным: в случае Z-Lys-SBzl наблюдалась колоколообразная кривая зависимости скорости гидролиза от рН с максимумом при рН 7.54. Гидролиз GD4K-na ускорялся при изменении рН от 6 до 9. Подобная картина наблюдалась при гидролизе пептидов другими сериновыми протеиназами, в частности наттокиназой, и может быть объяснена использованием ферментом гидроксил-иона вместо воды в ферментативной реакции.

Построение пространственной модели L-HEP.

Пространственная модель каталитической субъединицы энтеропептидазы человека была построена (рисунок 5) на основе кристаллической структуры каталитической субъединицы энтеропептидазы быка в комплексе с ингибитором У1>4К-хлорметаном (1ЕКВ в базе данных белковых структур PDB). Аминокислотные последовательности этих двух белков идентичны для 83% и гомологичны для 93% остатков. Для построения пространственной модели использовали программный пакет Insight II (Accelrys, США). Из структуры была удалена молекула ингибитора и пептид, соответствующий части тяжелой цепи энтеропептидазы, связанный с легкой цепью дисульфидной связью. Выравнивание

Рисунок 5. Пространственная модель L-HEP. 3-мерная структура легкой цепи энтеропептидазы человека была построена по гомологии ферментов человека и быка, на основе кристаллической структуры 1ЕКВ с помощью программного пакета INSIGHT II. Синим цветом обозначены Р1-Р4 остатки субстрата. Отображены боковые цепи остатков каталитической триады и цистеинов L-HEP. Номерами аминокислотной последовательности (по химотрипсиновой нумерации) обозначены цистеины, для которых было проведено моделирование замещений другими остатками.

аминокислотных последовательностей легких цепей энтеропептидаз человека и быка и последующее построение пространственной модели L-HEP проводили с помощью модуля Homology. Минимизацию конформационной энергии полученной модели белка проводили в модуле Discover методом сопряженных градиентов.

Моделирование и получение мутантных вариантов L-HEP с увеличенным выходом ренатураиии.

В связи с тем, что выход ренатурации L-HEP был очень низким (2%), был произведен поиск структурных изменений, приводящих к увеличению выхода ренатурации без потери высокой активности фермента. Одной из главных проблем ренатурации многих белков является образование правильных дисульфидных связей. Большое количество остатков цистеина в L-HEP (9, из которых 8 образуют 4 дисульфида и один остается неспаренным) значительно затрудняет ее ренатурацию из-за высокой вероятности образования неправильных дисульфидных связей. На основе сравнения аминокислотных последовательностей энтеропептидазы и родственных ей сериновых протеиназ было предположено, что цистеины 122 (неспаренный), 136 и 201 (образующие дисульфидную связь) не обязательны для поддержания каталитической активности

фермента. Было проведено выравнивание полученной модели с кристаллической структурой матриптазы (1ЕАХ) — наиболее близкого к энтеропептидазе фермента с отсутствующей дисульфидной связью Cysl36-Cys201, - с помощью которого был выбран определенный набор вариантов замен цистеинов 122, 136 и 201, а также близлежащих остатков (с целью стабилизировать этот участок молекулы в отсутствие дисульфидной связи Cysl36-Cys201). Анализ показал, что структурно близкие L-HEP сериновые протеиназы (матриптаза, тканевый активатор плазминогена (tPA)) в положении 137 содержат остаток с крупной боковой цепью (Тгр в случае матриптазы и Arg в случае tPA), который, вероятно, стабилизирует эту область фермента в отсутствие дисульфидной связи Cysl36-Cys201.

Для полученного набора аминокислотных замен были построены модели соответствующих мутантных вариантов L-HEP тем же способом, что и модель L-HEP. Полученные 3-мерные модели мутантных вариантов L-HEP оценивали по методу Айзенберга, в котором анализируется соответствие типов аминокислотных остатков их положению в структуре белка по полярности окружения и предпочтению ими определенного типа вторичной структуры (3D-1 D-функция). Кроме того, оценивалась энергия взаимодействия замененного аминокислотного остатка с окружением и заполненность внутреннего пространства молекулы белка.

Варианты L-HEP с заменами C122S, C136V/S137R/C201D (VRD), C136V/S137R/C201M (VRM), C136A/S137R/C201D (ARD), C136V/C201D (VD) (с наиболее оптимальными по критерию Айзенберга заменами остатков) были подвергнуты дальнейшему тестированию с помощью молекулярной динамики (МД). Для расчетов МД белков использовался программный пакет GROMACS (версия 3.2). В частности, использовали силовое поле GROMOS87, оптимальное для расчетов МД белков в окружении явно заданных молекул воды (молекулярная модель воды SPC). Для моделей L-HEP и ее мутантных вариантов были рассчитаны траектории МД длительностью 15 не. Для всех траекторий были рассчитаны среднеквадратичное отклонение по позициям атомов белка относительно стартовой структуры (СКО) и их среднеквадратичные флуктуации относительно усредненной в МД структуры (СКФ). Анализ вторичной структуры белков в МД проводился с помощью программы DSSP. МД показала одинаковую стабильность как отдельных участков, так и целых молекул L-HEP/C122S и L-HEP, в случае же остальных мутантных вариантов наблюдались большие, чем у L-HEP, отклонения от исходной структуры. В целом все мутантные варианты были достаточно стабильны (СКО<0.2 нм для атомов основной цепи), а их вторичная структура не претерпевала заметных изменений. Варианты с заменами C122S, VRD, и ARD были взяты для экспериментальной проверки.

Мутации в гене L-HEP были проведены с помощью процедуры точечного мутагенеза. Экспрессия мутантных вариантов и их ренатурация проводилась по методикам для L-HEP. Ренатурация L-HEP/C122S дала значительно повышенный по

Таблица 4. Ренатурация Тгх/1_-НЕР и Тгх/С122в и очистка активного фермента. Приведены усредненные данные пяти независимых экспериментов.

Гибридный белок Тельца включения со 100 мл Ренатурированный н очищенный на СИТ-агарозе Выход ренатурации, %

культуры, м г фермент, мг

Trx/L-HEP 100 (58.6 мг L-HEP) 1.1 ±0.2 2.0% .

Trx/C122S 100 мг (58.6 mtC122S) 4.6 ± 0.3 7.8 %

сравнению с L-HEP (до 8%) выход активного фермента (таблица 4). Как и в случае L-HEP было проведено тестирование ферментативных свойств и стабильности L-HEP/C122S. В случае гидролиза Z-Lys-SBzl, GD4K-na и гибридных белков наблюдалась одинаковая с L-НЕР активность мутанта. Кроме того, стабильность мутантного белка по отношению к денатурирующим агентам (детергенты, соли, pH, температура и др.) осталась на том же высоком уровне.

Для остальных мутантных вариантов (с заменами VRD и ARD) используемая процедура ренатурации дала количество активного фермента достаточное лишь для автокаталитического расщепления за время, в 10-20 раз превышающее аналогичное в случае L-HEP. Этот факт не позволил получить необходимые для анализа количества активных мутантных вариантов L-HEP/VRD и L-HEP/ARD.

Можно предположить несколько причин, по которым при использованной методике ренатурации не было получено достаточные количества активных ферментов L-HEP/VRD и L-HEP/ARD. Основная - это то, что удаляемая дисульфидная связь может быть критически важна при фолдинге белка in vitro. Возможно, дисульфидная связь 136201 поддерживает необходимую для высокой активности напряженную внутреннюю структуру белка. Поэтому стабилизация с помощью невалентных взаимодействий может не уравновешивать дестабилизацию, обусловленную разрывом ковалентной связи. Другая предполагаемая причина - это образование растворимого белка в неактивной конформации. Ее анализ в таком случае затруднен сложностью ее очистки, так как она не связывается с СИТ-агарозой. Кроме того, судя по тому, что основная масса белка после диализа из ренатурационного буфера выпадает в осадок, выход ренатурации, очевидно, не растет, а падает.

Исследование специфичности L-HEP.

Специфичность является важнейшей характеристикой ферментов. Ранее считалось, что энтеропептидаза расщепляет пептид исключительно на С-конце последовательности DDDDK. В последнее время были зафиксированы факты гидролиза белков энтеропептидазой и в других сайтах. Предполагая существование вторичной специфичности энтеропептидазы (соответствующей другому физиологическому субстрату), а также учитывая важность высокой специфичности при расщеплении гибридных белков, было проведено подробное изучение гидролиза различных субстратов, не содержащих последовательность DDDDK, с помощью L-HEP. Для определения предпочтительных для легкой цепи энтеропептидазы человека сайтов расщепления отличных от такового в трипсиногене был проведено расщепление ряда хромогенных пептидных субстратов с остатком лизина или аргинина в положении Р| и варьирующимися остатками в положениях Р2-Р4. Гидролиз и хромогенных трипептидов XY(R/K)-pNA и тетрапептидов XYZ(R/K)-pNA проводили по ранее описанным методикам. Было показано, что L-HEP предпочитает аргинин лизину в положении Pi, а субстраты с ароматическими или большими гидрофобными остатками в положении Рг расщепляются всего лишь в несколько раз медленнее, чем Z-Lys-SBzl (таблица 5). Было проведено сравнение специфичности легких цепей энтеропептидаз человека и быка. В качестве последней был взят препарат американской фирмы New England Biolabs, представляющий собой легкую цепь энтеропептидазы быка, экспрессированную в бактериях. Оказалось, что подобные субстраты расщепляются бычьим ферментом от 2 (в случае Z-AFR-pNA) до 5 и более раз медленнее. Как и в случае расщепления специфического субстрата GD4K-na разница обуславливается различием как в Кт, так и

kcat.

Таблица 5. Гидролиз неспецифических субстратов с помощью 1.-НЕР. Значения констант представлены как средние ± среднеквадратичное отклонение, исходя из трех независимых измерений.

Субстрат L-HEP L-BEP

*«» c"1 Km, MKM kat/Km, MlVT1 • с"' Act, с ' Km, mkM kcJKm, мМ 1 • c1

Z-Lys-SBzl 133 ±4 140 ±7 950 ±30 129 ±4 120 ±6 969 ± 30

For-Ala-Phe-Arg-pNA 23.5 ± 0.9 76 ±4 309± 11 26.3 ±1.0 192 ± 10 137 ± 6

2-Ala-Phe-Arg-pNA 17.5 ±0.7 67 ±4 261 ± 10 19.1 ±0.9 155 ±8 123 ±6

Z-Ala-Ala-Phe-Arg-pNA 28.9 ± 2.0 110 ±5.5 255 ±15 28.5 ± 2.3 461 ±20 61 ±5

Z-Gly-Pro-Arg-pNA 14.4 ±0.6 91 ±5 158 ± 7 12.5 ±0.5 305 ± 15 41 ±2

For-Ala-Phe-Lys-pNA 18.2 ±0.8 167 ±8 109 ±5 15.4 ±0.5 280 ± 15 55 ±3

Z-Ala-Tyr-Arg-pNA 10.0 ±0.4 109 ±5 92 ±5 9.3 ± 0.7 360 ± 18 28.4 ± 1.5

Z-Ala-Leu-Arg-pNA 15.2 ±0.7 234 ± 11 65 ±3 7.2 ± 0.7 640 ± 25 11.3 ± 1.7

Z-Ala-Trp-Arg-pNA 11.5 ±0.5 240 ± 12 48 ±3 9.5 ± 0.5 515 ± 20 18.5 ±2.0

Z-Ala-Ala-Leu-Arg-pNA 11.6 ± 1.0 268 ± 15 42.9 ± 2.5 7.1 ± 1.0 930 ±50 7.6 ± 1.5

Z-Ala-Ala-Arg-pNA 9.5 ± 0.7 356 ± 16 26.7 ± 1.6 3.3 ± 0.4 680 ±30 4.8 ±1.1

Z-Pro-Phe-Arg-pNA 6.2 ± 0.3 265 ± 13 23.4 ± 1.3 4.4 ± 0.2 720 ± 30 6.1 ±0.3

Z-Ala-Met-Arg-pNA 7.6 ± 0.3 420 ± 20 18.2 ± 1.0 4.0 ± 0.2 2100 ±90 1.9 ±0.1

Неспецифический гидролиз проявлялся и при обработке энтеропептидазой гибридных белков. В частности, при расщеплении гибридного белка Trx/TRAIL наблюдалось появление посторонних продуктов расщепления. Было исследовано расщепление белков TRAIL и BSA, у которых отсутствуют специфический сайт, но есть много сайтов трипсинолиза, в том числе и с одним-двумя отрицательно заряженными остатками в позициях Р2-Р5. Результаты инкубации этих белков с L-HEP анализировали с помощью электрофореза и масс-спектрального анализа. TRAIL расщеплялся преимущественно по сайту QEEIK4EN, содержащему большую гидрофобную цепь в положении Рг и отрицательно заряженные остатки в положении Рз и Р4 (рисунок 9А, дорожка 3). Расщепление BSA происходило преимущественно по сайту DEHVKlLV, также содержащему отрицательно заряженные остатки, в этом случае в позициях Р4 и Р5 (рисунок 9Б, дорожка 3). Сравнение гидролиза этих белков под действием L-HEP и L-BEP (дорожки 2 и 3, соответственно, на рисунке 9) показало, что L-BEP практически не расщепляет пептиды в указанных сайтах.

Для выяснения причин, обуславливающих такое различие, было проведено моделирование взаимодействия каталитических субъединиц энтеропептидаз человека и быка с различными субстратами.

Моделирование взаимодействия активного центра энтеропептидазы с пептидными субстратами.

За основу модели комплекса фермента с субстратом был выбран комплекс легкой цепи энтеропептидазы быка с ковалентно связанным ингибитором У04К-хлорметаном

(1ЕКВ в базе данных PDB). Первоначально в качестве субстрата было решено взять наиболее часто используемый при оценке специфической ферментативной активности энтеропептидазы пептид глицил-тетрааспартил-лизил-/?-нафтиламид (GD4K-na). Однако, пробные запуски МД этих комплексов показали быстрое нарушение каталитически активной конфигурации активного центра энтеропептидазы, которая не восстанавливалась в течение разумного для МД эксперимента (5-15 не) времени. Поэтому для работы был взят субстрат, содержащий, кроме остатков GD4K, изолейцин в Pi'-положении (как в трипсиногене). Для построения комплекса L-HEP с субстратом GD4KI было проведено выравнивание пространственных структур L-BEP и L-HEP. При этом молекулу ингибитора копировалась в структуру L-HEP и, с помощью модуля Builder, проводилась модификация несовпадающих фрагментов молекулы субстрата. Затем проводилась минимизация конформационной энергии комплекса с помощью процедуры, использованной при построении модели L-HEP. Аналогичным образом были получены модели комплексов L-BEP и L-HEP с пептидами AAFR, AALR и EEIK.

Анализ ближайшего окружения субстрата (10 À) позволил выделить несколько структурных различий ферментов человека и быка, способных повлиять на связывание субстрата. С помощью программы Insight II было проведено сравнение взаимодействия субстрата с остатками, находящимися в этих положениях в L-HEP и L-BEP (рисунок 6). Анализ электростатических взаимодействий и водородных связей между ферментом и субстратом при сравнении комплексов L-HEP и L-BEP со специфическим субстратом, указывает, что остатки 96 и 219 отвечают за различие каталитических констант у ферментов быка и человека.

Стабильность полученных комплексов фермент-субстрат исследовалась с помощью метода МД. Был проведен сравнительный анализ взаимодействий L-BEP, L-HEP и ее мутантных вариантов с субстратами по структурам, извлеченным из траекторий МД. Полученные МД траектории были проанализированы, с целью установить интервалы с относительно стабильным взаиморасположением фермента и субстрата. Оценивались расстояния между заряженными частями следующих пар остатков: Lys-Pj - Asp 187, Asp-Рг - Lys(Arg)96, Asp-P2 - Lys99, Asp-P3 - Lys99/219, Asp-P4 - Lys(Arg)96/99/219, Asp-Ps - Lys219. Кроме того, в качестве параметра, характеризующего близость взаиморасположения фермент-субстрат к реакционно-способному, оценивались расстояния между Oe (Asp 102) & N51 (His57), Ne2(His57) & Oy(Serl95). Анализ случайно выбранных структур из МД траекторий показал, что в случае L-HEP и ее мутантного варианта L-HEP/R96K (имеющих в своем составе лизин-219) субстрат стремится усилить электростатические и водородные связи с ферментом, максимально приближаясь к боковой цепи лизина-219 (правда, преимущественно за счет взаимодействия не с Рз, что предполагалось из анализа комплексов до МД, а с Р4 и Р5). При отсутствии положительного заряда в данной позиции полипептидной цепи фермента (L-BEP и мутантные варианты L-HEP/K219Q и L-HEP/R96K/K219Q) отрицательно заряженные остатки Р2-Р5 ориентируются либо вдоль петли 216-220, либо возле петли 96-99, либо отклоняются в сторону петли 172-175, что стабилизируется электростатическим взаимодействием с Arg224.

Усредненные в МД энергии электростатических и Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий между остатками фермента и субстрата были оценены с помощью модуля g_nbi из пакета GROMACS на непрерывном интервале размером в 1 не. Для этого брались точки с периодичностью 1 пс, в них вычислялась энергия невалентных взаимодействий (включая электростатические и Ван-дер-Ваальсовы взаимодействия), а на заключительном этапе вычислялось среднее арифметическое всех показаний. Подобное измерение производилось для трех независимых МД траекторий для каждой пары фермент/субстрат. По энергии взаимодействия субстрата с мутантными вариантами

Рисунок 6. Сравнение пространственных структур комплексов L-BEP и L-HEP со специфическим субстратом. Модели взаимодействия энтеропептидаз со специфическим субстратом были построены на основе кристаллической структуры комплекса легкой цепи энтеропептидазы с ингибитором VD4K-cm (1ЕКВ). При сравнении картин взаимодействий L-BEP (А) и L-HEP (Б) с остатками субстрата Р1-Р5 хорошо видны отличия, обусловленные присутствием в случае L-HEP положительно заряженного остатка лизина в положении 219 и заменой в положении 96 остатка лизина на более объемный остаток аргинина.

Рисунок 7. Комплексы энтеропептидаза/субстрат, полученные в ходе молекулярной динамики. Структуры комплексов представляют конечные точки траекторий МД. Для сравнения комплексов было произведено их выравнивание по атомам основной цепи с помощью программы INSIGHT II. Субстрат (выделен синим цветом) в случае L-HEP и L-HEP/R96K (А) ориентировался вдоль петли 216-220 (центральная нижняя часть рисунка). В случае же L-BEP, L-HEP/K219Q и L-HEP/R96K/K219Q (Б) субстрат мог занять как положение вдоль петли 216-220, так и отклоняться в сторону петель 96-99 (правый верхний угол) или 172-175 (левый верхний угол).

Ь-НЕР/Я96К и Ь-НЕР/К219С> занимали промежуточное положение по отношению к Ь-НЕР и Ь-ВЕР, что говорит о влиянии остатков 96 и 219 на связывание субстратов энтеропептидазой, и предполагает, что они играют большую роль в различии констант связывания субстрата Х-Б^-У энтеропептидазами человека и быка. Изменения в энергии взаимодействия с субстратом, вызванные введением в Ь-НЕР мутаций Я96К, К219<3 и 1196К/К219<3 (с заменами остатков Ь-НЕР на соответствующие им остатки Ь-ВЕР), обосновывают разницу в константах Михаэлиса Ь-НЕР и Ь-ВЕР по отношению к специфическим субстратам, однако ничего не говорят о наблюдаемом различии каталитических констант Ь-НЕР и Ь-ВЕР.

В МД экспериментах с субстратом выяснилось, что хотя структура гидрофобного ядра каталитического домена энтеропептидазы остаётся во время динамики практически неизменной, некоторые экспонированные на поверхность петлевые участки очень подвижны. В частности, это касается субстрат-связывающих регионов 96-99,216-220. Это в определенной мере объясняет способность энтеропептидазы гидролизовать неспецифические субстраты, хотя и с меньшим сродством.

Как и в комплексах некоторых других химотрипсин-подобных сериновых протеиназ с субстратами/ингибиторами, в кристаллическом комплексе каталитической субъединицы энтеропептидазы быка с аналогом активационного пептида трипсиногена У04К-хлорметаном наблюдается образование антипараллельной р-структуры между Р1-Р5 остатками субстрата и 214-216 остатками фермента. При этом образование водородных связей между субстратом и ферментом не только улучшает связывание субстрата, но и в значительной мере определяет положение субстрата в активном центре. С помощью МД экспериментов было обнаружено, что большее число водородных связей между основными цепями Ь-НЕР и в04К1 образуется в случае присутствия положительно заряженного остатка в позиции 219 фермента, взаимодействие с которым аспартатов субстрата способствует выстраиванию последнего вдоль петли 216-220 фермента и образованию между ними Р-структуры (рисунок 7, А). Такая картина наблюдалась во всех траекториях с участием Ь-НЕР и Ь-НЕР/Я96К. В случае Ь-ВЕР, а также Ь-НЕР/К2190 и Ь-НЕР/Я96К/К219() (рисунок 7, Б) наблюдалась другая картина: И-концевая часть

субстрата практически в каждой траектории располагалась по-разному по отношению к субстрат-связывающим центрам фермента. Это объясняется отсутствием преобладающего центра связывания для отрицательно заряженных остатков АБр-Р4 и Азр-Р^, каковым в Ь-НЕР является Ьув219.

Было проведено исследование взаимодействия Ь-НЕР и Ь-ВЕР с другими пептидами, в частности, АЛИ?, и ААЫ1. Наблюдалась незначительная разница в энергии нековалентных взаимодействий пептидов с ферментами, которая, тем не менее, не объясняет полностью различие в скоростях гидролиза этих субстратов с помощью Ь-НЕР и Ь-ВЕР. Длинные гидрофобные боковые цепи фенилаланина и лейцина примерно одинаково располагаются по отношению к субстрат-связывающим центрам ферментов человека и быка: вблизи гидрофобной части боковой цепи Ьуз99. Наиболее вероятная причина наблюдаемой разницы в константах специфичности Ь-НЕР и Ь-ВЕР по отношению к этим субстратам - это большая приспособленность Ь-НЕР к гидролизу амидной связи вне зависимости от Рг-Рп остатков субстрата.

Получение и исследование каталитических свойств мутантных вариантов Ь-НЕР с заменами Я96К. К21Ю и К96К/К2190.

Мутации в ген Ь-НЕР были введены с помощью сайт-направленного мутагенеза. Экспрессию гибридных белков, ренатурацию и очистку мутантных вариантов фермента проводили с помощью процедур, используемых для Ь-НЕР. Тиоэфир г-Ьуз-БВг!, как и ожидалось, гидролизовался всеми тремя мутантами с теми же кинетическими параметрами, что и в случае Ь-НЕР. При расщеплении специфического пептидного субстрата С04К-па наблюдалась другая картина (таблица 6). Мутации К219<3 и 1196К/К.219<3 приводили к понижению по сравнению с Ь-НЕР констант специфичности в 1.76 и 2.4 раза, соответственно, сохраняя, тем не менее, преимущество над Ь-ВЕР (5- и 4-кратное, соответственно). Ухудшение происходило преимущественно за счет уменьшения константы Михаэлиса, отвечающей за связывание субстрата. Это соответствует результатам моделирования, предполагающим, что при вхождении молекулы С04К-па в щель активного центра Ь-НЕР устанавливается электростатическое взаимодействие между положительно заряженной боковой цепью Ьуэ219 и отрицательно заряженными Р3-Р5, отсутствующее в случае Ь-ВЕР.

Таблица 6. Сравнение кинетических параметров Ь-НЕР, Ь-ВЕР и Ь-НЕРЛ196К, Ь-НЕР/К219<2 и Ь-НЕР/К96К/К219С). Значения констант представлены как средние ± среднеквадратичное отклонение, исходя из трех независимых измерений.

Фермент г-Ьув-ЗВг!, в 0.1 М Тт-На, рН 8.0 СБ4К-па, в 25 шМ Тпз-НО, 0.1 мМ СаС12, рН 8.4

Аса., С-' Кт, МКМ Аса,, с"1 Кт, мкМ

Ь-НЕР 133 ±3 140 ±7 950 ±50 117 ±8 42 ±3 2790 ±250

Ь-НЕР/И96К 121 ± 3 115 ± 5 1050 ± 50 115 ±5 40 ±3 2875 ±250

Ь-НЕР/К219<2 131 ±4 121 ±8 1080 ±70 145 ± 10 92 ±8 1580 ±150

Ь-НЕР/К96К/К219<2 140 ±5 135 ±8 1040 ±60 102 ±7 88 ±8 1160 ±130

Ь-ВЕР 129 ±4 120 ± 10 1075 ±70 47 ±4 160 ± 10 295 ±30

K219Q

кДа

45 31

L-HEP

R96K/K219Q

Рисунок 8. Расщепление гибридного белка Trx/hEGF под действием L-BEP, L-HEP и ее мутантных вариантов.

А. Титрование расщепления Trx/hEGF. В реакционную смесь, содержащую 15 мкг гибридного белка, добавляли различные количества L-BEP, L-HEP, L-HEP/R96K и L-HEP/K219Q (0.0003, 0.001 и 0.003 ед.ак. по Z-Lys-SBzl) и инкубировали в течение 16 ч при комнатной температуре. Б. Кинетика расщепления гибридного белка Trx/hEGF с помощью L-HEP и L-HEP/R96K/K219Q. Для электрофореза отбирались пробы инкубации 15 мкг гибридного белка с 0.001 ед. акт. в течение 30 мин, 1, 2, 4, 8 и 16 ч.

Остатки Asp-Рг и Asp-Pi также могли бы усиливать связывание субстрата с ферментом за счет более сильной связи с Arg96, чем с Lys96. Однако, судя по сохранению мутантным вариантом R96K полной активности L-HEP по расщеплению GD4K-na, эта разница не сказывается ни на Кт, ни на kcat. Этот результат можно объяснить тем, что Lys219 предположительно связывает не взаимодействующие с другими остатками фермента Asp-Рз и Asp-Ps, в то время как Arg96 взаимодействует с уже связанными с Lys99 Asp-Рг и Asp-P4. Сохранение у мутантов высокой каталитической константы может быть объяснено отличием L-HEP и L-BEP не в центрах связывания субстрата, а в элементах активных центров, участвующих непосредственно в разрезании пептидной связи (включая остатки каталитической триады и амидные группы, стабилизирующие оксианион субстрата). Это предположение подтверждается тем фактом, что одинаковая гидролитическая активность у ферментов быка и человека наблюдается только при расщеплении тиоэфира Z-Lys-SBzl, тогда как все проверенные субстраты с амидной связью лучше гидролизует фермент человека.

Иная ситуация наблюдается при расщеплении мутантными вариантами L-HEP гибридных белков с сайтами узнавания энтеропептидазы (рисунок 8). L-HEP/R96K, L-HEP/K219Q и L-HEP/R96K/K219Q расщепляли гибридный белок Trx/hEGF приблизительно так же эффективно, как и L-HEP. Предполагается следующая причина нечувствительности гидролиза гибридных белков к мутациям в субстрат-связывающем центре L-HEP. Конформация участка гибридного белка, связывающегося с L-HEP в данном случае такова, что либо взаимодействие субстрата с боковой цепью остатка 219 фермента отсутствует, либо влияет на связывание/расщепление незначительно. Это можно объяснить более жесткой, чем в GD4K-na, структурой пептидной цепи субстрата, ограничивающей возможные конформации сайта DDDDK энергетически выгодными для соседних с ним участков гибридного белка.

Показательный результат влияния исследуемых остатков на ферментативный катализ был получен в опытах неспецифического расщепления белков TRAIL и BSA по сайтам QEEIK^EN и DEHVKlLV, соответственно, где отрицательно заряженные боковые

Рисунок 9. Гидролиз белков TRAIL и BSA под действием L-BEP, L-HEP и ее мутантных вариантов R96K, K219Q и R96K/K219Q.

A. TRAIL: Дорожка 1- контроль, 15 мкг TRAIL без добавления фермента; дорожки 2-6 - результаты инкубирования смеси, содержащей 15 мкг TRAI с 0.1 ед.ак. L-BEP, L-HEP, R96K, K219Q и R96K/K219Q, соответственно, в течение 24 ч при 25° С.

Б. BSA: Дорожка 1 • контроль (20 мкг БСА без фермента); дорожки 2-6 - результаты инкубирования смеси, содержащей 20 мкг БСА с 1 ед.ак. (по Z-Lys-SBzl) L-BEP, L-HEP, R96K, K219Q и R96K/K219Q, соответственно, в течение 24 ч при 25е С.

цепи отсутствуют в Рг и в Р2-Р3 положениях. В обоих случаях мутанты с одиночными заменами и, особенно, с двойной менее активно расщепляли белки по этим сайтам, значительно приблизившись в этом отношении к легкой цепи энтеропептидазы быка (рисунок 9). Результаты моделирования взаимодействия пептида EEIK с L-HEP предполагают, что в случае TRAIL любой из пары Arg96/Lys219 улучшает связывание белкового субстрата с ферментом, поэтому, хотя одиночные замены дают незначительное падение неспецифического гидролиза TRAIL, двойная замена значительно увеличивает специфичность фермента. В случае BSA основное понижение активности происходит при замене Arg96Lys. Видимо, Arg96 «отталкивает» Val-Рг от петли 96-99, способствуя образованию антипараллельной p-структуры между субстратом и петлей 216-220. Также можно предположить, что в случае лизина-96 образуется участок энергетически невыгодного интерфейса между ферментом и субстратом, обусловленный большей концентрацией положительного заряда возле гидрофобной боковой цепи Val-Рг. Сама по себе замена Lys219Gln незначительно уменьшает гидролиз BSA энтеропептидазой, однако при двойной замене наблюдается кооперативный эффект. Можно сделать вывод, что в данном случае Arg96 способствует образованию выгодной для гидролиза конформации субстрата в активном центре энтеропептидазы, a Lys219 лишь закрепляет ее.

Данные результаты, с одной стороны, говорят о важности остатков 96 и 219 для гидролиза пептидных субстратов, а, с другой стороны, обосновывают различие каталитических параметров ферментов быка и человека, главным образом, не отличающимися S2-S5 сайтами связывания, а различиями в самой каталитической машине. Последние могут включать в себя различия в пространственном размещении остатков каталитической триады и ее расположение по отношению к оксианионной дыре и Si сайту. Именно они могут позволить L-HEP с большей (по сравнению с L-BEP) скоростью расщеплять амидные субстраты, которые значительно более требовательны к механике фермента, чем сложные эфиры и тиоэфиры.

Для проверки этого предположения было решено провести сравнение каталитических параметров гидролиза Pi-субстратов, содержащих в месте гидролиза тиоэфирную или амидную связь. В качестве амидного субстрата были протестированы лизин- и аргинин-паранитроанилиды, однако ни один из них не гидролизовался со

скоростью доступной для спектрофотометрической детекции. Этот результат предполагает, что конформация такого субстрата в связанном состоянии не позволяет ферменту провести гидролиз амидной связи. Причиной этого может быть только необходимость существования амидного субстрата в некой напряженной конформации, для которой • необходимо присутствие Рг-Рп остатков. Учитывая тот факт, что энтеропептидаза расщепляет не только специфические субстраты с аспартатами в этих положениях, но и различные другие субстраты (табл. 5), можно сделать вывод, что критическим для создания подобной конформации является установление определенного набора водородных связей между основной цепью субстрата и фермента. Такие водородные связи (подобные наблюдающимся в антипараллельной ß-структуре) показаны как для кристаллической структуры комплекса легкой цепи энтеропептидазы быка с ингибитором-аналогом активационного пептида трипсиногена, так и при моделировании динамики взаимодействия L-BEP, L-HEP и ее мутантных вариантов с пептидными субстратами. В связи с тем, что участок 216-220 более стабилен, чем лабильная петля 96-99, выравнивание субстрата происходит именно по нему, а положительно заряженные остатки, окружающие щель активного центра, в большей степени фильтруют субстраты и стабилизируют необходимую для гидролиза конформацию комплекса фермент/субстрат.

Выводы.

1. Синтезирован ген каталитической субъединицы энтеропептидазы человека (L-НЕР) и осуществлена ее экспрессия в Escherichia coli в составе гибридного белка с тиоредоксином в качестве белка-носителя.

2. Разработана процедура ренатурации гибридного белка тиоредоксин/L-HEP, позволяющая получать до 10 мг активного фермента с литра культуры.

3. Впервые охарактеризованы ферментативные свойства легкой цепи энтеропептидазы человека. Определены кинетические параметры L-HEP по гидролизу пептидных субстратов и гибридных белков, содержащих сайт узнавания энтеропептидазы DDDDK. Обнаружено, что константа специфичности {к^/ЛГт) L-НЕР при гидролизе подобных субстратов на порядок превышает константу специфичности L-BEP.

4. Показано, что взаимодействие L-HEP с ингибиторами проходит по типу трипсин-подобных сериновых протеиназ. Показано, что ионы одно- и двухвалентных металлов (Na+, Са2+) ингибируют гидролиз специфических субстратов. Изучение влияния денатурирующих агентов на L-HEP показало ее высокую стабильность.

5. Построена пространственная модель L-HEP. С помощью молекулярного моделирования найдена мутация C122S, введение которой в L-HEP повышает выход ренатурации в 4 раза. Показана критичность образования дисульфидной связи 136-201 для рефолдинга L-HEP.

6. Обнаружена вторичная специфичность L-HEP по отношению к хромогенным субстратам и белкам, содержащим в положении Рг ароматические и большие гидрофобные боковые цепи. Показано, что L-HEP расщепляет белковые субстраты,

даже если в сайте связывания субстрата в позициях Р2-Р5 содержится менее 4-х остатков с отрицательно заряженными боковыми цепями (Asp/Glu).

7. С помощью методов молекулярного моделирование показано, что аминокислотные остатки в положениях 96 и 219 отвечают за различия каталитических свойств легких цепей энтеропептидаз быка и человека. Показано, что введение в L-HEP мутаций R96K и K219Q улучшает специфичность белка, практически не меняя скорость гидролиза специфических субстратов.

8. Показан кооперативный эффект улучшения специфичности при одновременном введении мутаций R96K и K219Q в L-HEP. Неспецифическое расщепление белков TRAIL и BSA по сайтам QEEIKiEN и DEHVKlLV, соответственно, значительно уменьшается при использовании мутантного варианта L-HEP/R96K/K219Q, по сравнению с диким типом и вариантами с одиночными заменами R96K и K219Q.

Материалы диссертации изложены в следующих работах:

1. Гаспарян М. Э., Остапченко В. Г.. Шульга А. А., Долгих Д. А. Синтез гена и экспрессия в Е. coli каталитической субъединицы энтеропептидазы человека. Международный конгресс «Пиридоксальфосфат-зависимые ферменты: структура, молекулярная патология и медицина», Москва, май 2002, сборник трудов, стр. 58.

2. Остапченко В. Г.. Гаспарян М. Э., Долгих Д. А. Экспрессия рекомбинантной каталитической субъединицы энтеропептидазы человека в Е. coli и характеризация ее ферментативной активности. XV зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 10-14 февраля 2003, сборник тезисов, стр. 7.

3. Marine Е. Gasparian, Valeriv G. Ostapchenko. Alexey A. Schulga, Dmitry A. Dolgikh, and Mikhail P. Kirpichnikov. Expression, purification and characterization of human enteropeptidase catalytic subunit in Escherichia coli. Protein Expression & Purification, 31/1, September 2003, pp. 133-139.

4. V.G. Ostapchenko. M.E. Gasparian, D.A. Dolgikh. Production in E. coli and investigation of recombinant catalytical cubunit of human enteropeptidase. FEBS Forum For Young Scientists, Warsaw, June 24-26 2004, abstract book, p. 27.

5. M. E. Gasparian, V. G. Ostapchenko. D. A. Dolgikh and M. P. Kirpichnikov Kinetic characterization of recombinant human enteropeptidase light chain and its mutant C122S. the FEBS Journal, vol. 272, suppl. 1, July 2005. 30,h FEBS Congress "The Protein World", abstracts, p. 168.

6. Гаспарян M. Э., Остапченко В. Г.. Долгих Д. А., Кирпичников М. П. Биохимическая характеристика рекомбинантной легкой цепи энтеропептидазы человека. Биохимия, 2006, том 71, вып. 2, с. 149-156

7. Остапченко В. Г.. Гаспарян М. Э., Долгих Д. А. Исследование вторичного центра связывания субстратов энтеропептидазы. XVIII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 7-10 февраля 2006, сборник тезисов, стр. 44.

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Остапченко, Валерий Геннадиевич

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1 Энтеропептидаза - ключевой фермент пищеварения.

2.1.1. История открытия и физиологическая роль.

2.1.2. Структура энтеропептидазы.

2.1.3. Экспрессия гена энтеропептидазы.

2.2. Взаимодействия сериновых протеиназ с субстратом при ферментативном катализе.

2.2.1. Специфичность сериновых протеиназ.

2.2.2. Сайты распознавания субстрата.

2.2.3. Распознавание субстратов во время катализа.

A. Критерии специфичности сериновых протеиназ.

Б. Специфичность определяется этапами связывания и ацилирования.

B. Вклад в специфичность ассоциации субстрата.

Г. Следствия, касающиеся специфичности гидролиза сложных эфиров.

2.2.4. Как удаленные взаимодействия влияют на катализ?.

A. Дальние взаимодействия выравнивают субстрат в активном центре.

Б. Удаленные взаимодействия оптимизированы в переходном состоянии.

B. Удаленные взаимодействия индуцируют конформационные изменения, содействующие катализу.

Г. Удаленные взаимодействия экранируют каталитическую триаду от растворителяЗ 1 Д. Удаленные взаимодействия связывают катализ с движением структуры протеиназы.

2.3. Экспрессия рекомбинантных гибридных белков и их ренатурация.

2.3.1. Экспрессия рекомбинантных белков.

2.3.2. Гибридные (слитные) белки.

Проблемы при экспрессии слитных белков.

Расщепление слитных белков.

Слитные белки с тиоредоксином в качестве белка-носителя.

2.3.3. Ренатурация рекомбинантных белков.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Материалы.

3.1.1. Реактивы и ферментные препараты.

3.1.2. Штаммы и плазмидные вектора.

3.1.3. Питательные среды для роста бактерий.

3.1.4. Синтетические олигонуклеотиды.

3.2. Методы.

3.2.1. Трансформация клеток Е. coli плазмидной ДНК.

3.2.2. Выделение плазмидной ДНК.

3.2.3. Электрофоретический анализ ДНК в агарозном геле.

3.2.4. Количественные определения препаратов ДНК и примесей РНК.

3.2.5. Выделение ДНК из агарозного геля.

3.2.6. Определение нуклеотидной последовательности (секвенирование) ДНК.

3.2.7. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pET-32/L-HEP.

3.2.7. Олигонуклеотид-направленный мутагенез.

3.2.8. Экспрессия гена L-HEP и ее мутантных вариантов.

3.2.9. Идентификация белков по N-концевой последовательности.

3.2.10. Ренатурация гибридных белков с тиоредоксином в качестве белка-носителя.

3.2.11. Очистка активной L-HEP и ее мутантных вариантов.

3.2.12. Определение количества белка в растворах и гелях.

3.2.13. Измерение каталитической активности L-HEP и ее мутантных вариантов.

Гидролиз тиоэфира Z-Lys-SBzl.

Гидролиз специфического субстрата GD4K-na.

Гидролиз неспецифических хромогенных пептидных субстратов.

Гидролиз белковых субстратов.

Вычисление кинетических параметров.

3.2.14. Реакции ингибирования каталитической акитвности L-HEP.

3.2.15. Построение пространственных моделей L-HEP и ее мутантных вариантов.

3.2.16. Молекулярная динамика каталитических субъединиц энтеропептидаз.

3.2.17. Оценка мутантных вариантов L-HEP.

3.2.18. Моделирование взаимодействий L-BEP, L-HEP и ее мутантных вариантов с пептидными субстратами.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Синтез гена L-HEP, его клонирование в плазмидные вектора и подбор экспрессионной системы.

4.2. Ренатурация слитного белка Trx/L-HEP и очистка активного фермента L-HEP.

4.3. Исследование ферментативных свойств L-HEP.

4.4. Построение пространственной модели L-HEP.

4.5. Моделирование и получение мутантных вариантов L-HEP с увеличенным выходом ренатурации.

4.6. Исследование специфичности L-HEP.

4.7. Моделирование взаимодействия активного центра энтеропептидазы с пептидными субстратами.

4.8. Получение и исследование каталитических свойств мутантных вариантов L-HEP с заменами R96K, K219Q и R96K/K219Q.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Каталитическая субъединица энтеропептидазы человека: получение, характеризация ферментативных свойств и моделирование мутаций, облегчающих ренатурацию и повышающих специфичность фермента"

Энтеропептидаза - ключевой фермент пищеварения млекопитающих. Она управляет каскадом пищеварительных ферментов, превращая трипсиноген в трипсин, который в свою очередь активирует другие зимогены и, кроме того, активно участвует непосредственно в протеолизе белковой пищи.

Катионный трипсиноген (предшественник трипсина I) не является единственным субстратом энтеропептидазы. Помимо него существуют проферменты анионного трипсина (трипсина II), мезотрипсина и нейронального трипсина, для активации которых также необходима энтеропептидаза. Помимо самого распространенного сайта DDDDK в трипсиногенах встречаются укороченные сайты DK и DDK. Несмотря на то, что экспрессия энтеропептидазы in vivo локализована преимущественно в дуоденальных энтероцитах, при патологиях может наблюдаться побочная экспрессия, например, в раковых клетках. В таком случае можно ожидать существования отличного от трипсиногена субстрата.

В связи с этим важно оценить в полной мере специфичность энтеропептидазы и выявить факторы, влияющие на нее. В последние годы подобная работа проделана в отношении десятков ферментов. Для многих из них определена специфичность по отношению не только к остатку, идущему непосредственно перед разрезаемой связью (Pi), но и к более удаленным остаткам, как с N-конца сайта узнавания (Рг-Рп), так и с С-конца (Pi'-Pn')- Для подобного исследования необходим многосторонний подход к изучению специфичности фермента, включая использование широких наборов или библиотек пептидных субстратов, а также исследование неспецифического гидролиза различных белков.

Не менее важной проблемой является понимание роли дистальных по отношению к разрезаемой связи аминокислотных остатков в ферментативном катализе. Считается, что их 5 связывание с субстратом может понижать барьер реакции ферментативного расщепления путем передачи энергии по сети водородных связей. Кроме того, предполагается, что взаимодействия дистальных остатков с сайтами связывания протеиназы может влиять на внутренние движения фермента и субстрата, необходимые для осуществления некоторых этапов протеолитической реакции. Для проверки этого предположения необходимо накопление большого объема данных по подобным взаимодействиям, включая каталитические константы, энергетику процесса и молекулярную динамику взаимодействия фермент-субстрат.

Для полноценного исследования рекомбинантных белков очень важно наличие эффективных систем экспрессии, позволяющих нарабатывать белки в значительных количествах. В случае энтеропептидазы потребности современной науки весьма широки: помимо интереса ее изучения как важного элемента физиологии человека, энтеропептидаза стала важным инструментом биотехнологии, где используется для расщепления рекомбинантных гибридных белков. В связи со значительной трудностью получения в Escherichia coli правильно сложенного белка с несколькими дисульфидными связями в цитоплазме, периплазме или секретированного в культуральную среду, часто используют такие условия экспрессии, при которых происходит агрегация белка и образование телец включения. В этом случае для получения правильно сложенного белка производят его ренатурацию из телец включения. Разработка и оптимизация процедуры ренатурации важна не только для получения конкретного белка, но и для выявления элементов структуры, важных для фолдинга родственных белков.

В настоящей диссертационной работе разработана процедура получения рекомбинантной каталитической субъединицы энтеропептидазы человека (L-HEP). Для этого создан штамм-продуцент Е. coli, обеспечивающий высокий уровень экспрессии гибридного белка тиоредоксин/L-HEP, и разработана методика ренатурации этого белка из телец включения. Для повышения выхода ренатурации было проведено молекулярное моделирование оптимизированной аминокислотной последовательности энтеропептидазы. Один из предсказанных моделированием мутантных вариантов дал значительно увеличенный выход ренатурации, что позволило получать до 40 мг активного фермента с 1 л бактериальной культуры. Исследования ферментативной кинетики полученного препарата показали его на порядок более высокую, чем у бычьего аналога, активность при гидролизе специфического субстрата, и, кроме того, обнаружили вторичную специфичность к субстратам с гидрофобными остатками в положении Рг. Моделирование комплексов ферментов человека и быка со специфическим субстратом позволило предположить, что различные константы Михаэлиса обосновываются различными аминокислотными остатками в положения 96 и 219 полипептидной цепи ферментов. Введение в названные положения L-HEP соответствующих аминокислотных остатков энтеропептидазы быка подтвердило эту гипотезу и, кроме того, значительно уменьшило гидролиз белковых субстратов по сайтам, отличающимся от специфического отсутствием отрицательно заряженного остатка в положениях V2 и Рз.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Остапченко, Валерий Геннадиевич

выводы

1. Синтезирован ген каталитической субъединицы энтеропептидазы человека (L-HEP) и осуществлена ее экспрессия в Escherichia coli в составе гибридного белка с тиоредоксином в качестве белка-носителя.

2. Разработана процедура ренатурации гибридного белка тиоредоксин/L-HEP, позволяющая получать до 10 мг активного фермента с литра культуры.

3. Впервые охарактеризованы ферментативные свойства легкой цепи энтеропептидазы человека. Определены кинетические параметры L-HEP по гидролизу пептидных субстратов и гибридных белков, содержащих сайт узнавания энтеропептидазы DDDDK. Обнаружено, что константа специфичности (кСй1/Кт) L-HEP при гидролизе подобных субстратов на порядок превышает константу специфичности L-BEP.

4. Показано, что взаимодействие L-HEP с ингибиторами проходит по типу трипсин-подобных сериновых протеиназ. Показано, что ионы одно- и двухвалентных металлов (Na+, Са2+) ингибируют гидролиз специфических субстратов. Изучение влияния денатурирующих агентов на L-HEP показало ее высокую стабильность.

5. Построена пространственная модель L-HEP. С помощью молекулярного моделирования найдена мутация C122S, введение которой в L-HEP повышает выход ренатурации в 4 раза. Показана критичность образования дисульфидной связи 136-201 для рефолдинга L-HEP.

6. Обнаружена вторичная специфичность L-HEP по отношению к хромогенным субстратам и белкам, содержащим в положении Рг ароматические и большие гидрофобные боковые цепи. Показано, что L-HEP расщепляет белковые субстраты, даже если в сайте связывания субстрата в позициях Р2-Р5 содержится менее 4-х остатков с отрицательно заряженными боковыми цепями (Asp/Glu).

7. С помощью методов молекулярного моделирование показано, что аминокислотные остатки в положениях 96 и 219 отвечают за различия каталитических свойств легких цепей энтеропептидаз быка и человека. Показано, что введение в l-hep мутаций r96k и k219q улучшает специфичность белка, практически не меняя скорость гидролиза специфических субстратов.

8. Показан кооперативный эффект улучшения специфичности при одновременном введении мутаций r96k и k219q в l-hep. Неспецифическое расщепление белков trail и bsa по сайтам qeeik-len и dehvkIlv, соответственно, значительно уменьшается при использовании мутантного варианта l-hep/r96k/k219q, по сравнению с диким типом и вариантами с одиночными заменами r96k и k219q.

4.9. Заключение

В настоящей работе был получен активный препарат рекомбинантной легкой цепи энтеропептидазы человека высокой степени чистоты. Исходя из сложности сборки подобной протеиназы при использовании прокариотической системы экспрессии был выбран выриант производства целевого белка в виде единой полипептидной цепи с тиоредоксином в нерастворимом виде для последующей его ренатурации. Использование схемы с дисульфидным обменом цистеинов белка с парой окисленный/восстановленный глутатионы (помогающей сборке белков с дисульфидными связями в эукариотических клетках) позволило получить достаточное для биохимических и физико-химических исследований количество высокоактивного фермента. Однако значительная трудоемкость и существенный расход материалов (реактивов) делают такую ренатурацию малоперспективной процедурой получения рекомбинантных белков. Для облегчения этой задачи была проведена оптимизация, затронувшая как процедуру ренатурации, так и структуру самого ренатурируемого белка. В результате удалось не только достичь почти десятикратного увеличения выхода ренатурации каталитической субъединицы энтеропептидазы, но и получить существенные результаты по влиянию на фолдинг белка некоторых структурных элементов. Эти результаты могут быть использованы при получении и исследованиях других сериновых протеиназ химотрипсинового типа.

Важнейшей характеристикой регуляторных протеиназ, каковой является энтеропептидаза, считается специфичность по отношению к определенным пептидным последовательностям. Физиологическая роль энтеропептидазы с середины прошлого века предполагалась исключительно в активации трипсиногена. Обнаруженная при исследовании L-HEP побочная специфичность позволяет предположить существование иных мишеней у энтеропептидазы человека. Например, может существовать белок-мишень, подобный TRAIL, у которого энтеропептидаза способна расщепить одну из экспонированных на поверхность белка петель, что может привести к блокированию сигнала. Другой результат подобного изменения специфичности - появление нестрогого соблюдения иерархии в каскаде пищеварительных ферментов. Расширение специфичности энтеропептидазы может позволить ей как активацию других зимогенов панкреатического сока, помимо трипсиногена, так и более значительное участие в переваривании белковой составляющей пищи, особенно при денатурации последней. Возможно, такой эволюционный шаг требуется для улучшения пищеварения всеядных млекопитающих (человека, свиньи). Либо, наоборот, травоядность быка потребовала более высокорегулированного каскада пищеварительных протеиназ, опосредованного более высокоспецифичной энтеропептидазой в его корне.

Полученные результаты влияния различных участков субстрат-связывающего центра энтеропептидазы на гидролиз субстратов позволили не только выявить конкретные структурные различия, приводящие к отличиям в специфичности ферментов человека и быка по отношению к различным субстратам, но и сделать вывод об их недостаточности для полного обоснования этой разницы. Так как фермент человека более активно гидролизует все рассмотренные субстраты, вне зависимости от остатков Рг-Рп, логично предположить, что одно из главных различий L-HEP и L-BEP кроется в структуре активного центра. Его устройство чрезвычайно тонко: десятые доли ангстрема в расстояниях между остатками каталитической триады, оксианионной дыры и субстратом играют большую роль; поэтому даже небольшие изменения в укладке ядра молекулы фермента могут привести к серьезному изменению эффективности работы каталитической машины. Подобные перемещения ее элементов особенно должны влиять на расщепление амидной связи, так как для уменьшения ее жесткости при образовании тетраэдрического интермедиата необходимо идеальное взаиморасположение субстрата и всех элементов активного центра. Исследование двух ферментов с практически одинаковыми структурами, но отличающимися параметрами катализа может значительно прояснить сам процесс катализа, который до сих пор не имеет однозначного объяснения. Другая возможная причина обнаруженного различия - это влияние связывания субстрата в отдаленных от расщепляемой связи сайтах на его гидролиз не через простое увеличение сродства, а более сложными путями, каковыми считаются изменения внутреннего движения фермента и реорганизация обширной сети водородных связей, в которую входят и связи, непосредственно влияющие на процесс ферментативного катализа. В частности, преимущество L-HEP может быть связано с большей сопряженностью энергии водородных связей (или опосредуемых этими связями структурных изменений комплекса), образуемых петлей 216-220 и основной цепью субстрата, с каталитическим процессом.

Для подтверждения или опровержения этих гипотез необходимо накопление статистических данных по разным ферментам, включая параметры катализируемых ими реакций, моделирование динамики их взаимодействий с различными субстратами, кристаллографические данные и др. Однако несомненным фактом является то, что получение подобной информации для одного фермента (чему посвящена данная работа) указывает направление исследований и может способствовать изучению других ферментов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Остапченко, Валерий Геннадиевич, Москва

1. Pavlov, I. P.(1902). The Work of the Digestive Glands, Trans, Charles Griffin & Co.1. W.H.Thompson, London.

2. Kunitz M. (1939) Formation of trypsin from crystalline trypsinogen by means ofenterokinase. J Gen Physiol, 22, 429-446.

3. Davie, E.W. & Neurath, H. (1955) Identification of a peptide released during autocatalyticactivation of trypsinogen. J. Biol. Chem. 212, 515-529.

4. Yamashina, I. (1956) The action of enterokinase on trypsinogen, Acta Chem. Scand. 10,739.743.

5. A. Light, H. Janska, Enterokinase (enteropeptidase): comparative aspects, Trends

6. Biochem. Sci. 14(1989) 110-112.

7. Lu,D. & Sadler,J.E. (1998) Enteropeptidase. In Handbook of Proteolytic Enzymes

8. Barrett,A.J., Rawlings,N.D., & Woessner,J.F.J., eds), pp. 50-54. Acadenic Press Ltd, London.

9. Hadorn,B., Tarlow,M.J„ Lloyd,J.K, & Wolff,O.H. (1969) Intestinal enterokinasedeficiency. Lancet, 1, 812-3.

10. Hadorn B, Haworth JC, Gourley B, Prasad A, Troesch V. (1975) Intestinal enterokinasedeficiency. Occurrence in two sibs and age dependency of clinical expression. Arch. Dis. Child. Apr;50(4):277-82.

11. Haworth,J.C., Gourley,В., Hadorn,В., & Sumida,C. (1971) Malabsorption and growthfailure due to intestinal enterokinase deficiency. JPediatr, 78,481-90.

12. Kitamoto,Y., Yuan,X., Wu,Q., McCourt,D.W., & Sadler,J.E. (1994) Enterokinase, the initiator of intestinal digestion, is a mosaic protease composed of a distinctive assortmentof domains. Proc Natl Acad Sci USA, 91, 7588-92.

13. Matsushima,M., Ichinose,M., Yahagi,N., Kakei,N., Tsukada,S., Miki,K., Kurokawa,K., Tashiro,K., Shiokawa,K., Shinomiya,K., & et,a.l. (1994) Structural characterization of porcine enteropeptidase. J Biol Chem, 269, 19976-82.

14. J.D. Hooper, J.A. Clements, J.P. Quigley, T.M. Antalis, Type II transmembrane serine proteases. Insights into an emerging class of cell surface proteolytic enzymes, J. Biol. Chem. 276 (2001) 857-860.

15. Light, A. & Fonseca P. (1984) The preparation and properties of the catalytic subunit of bovine enterokinase. J Biol Chem. 259(21):13195-8.

16. Anna G. Mikhailova, Lev D. Rumsh (1999). Autolysis of bovine enteropeptidase heavy chain: evidence of fragment 118-465 involvement in trypsinogen activation. FEBS Lettrs 442, 226-230.

17. LaVallie,E.R., Rehemtulla,A., Racie,L.A., DiBlasio,E.A., Ferenz,C., Grant,K.L., Light,A., & McCoy,J.M. (1993) Cloning and functional expression of a cDNA encoding the catalytic subunit ofbovine enterokinase. J Biol Chem, 268,23311-7.

18. Lu,D., Yuan,X., Zheng,X., & Sadler,J.E. (1997) Bovine proenteropeptidase is activated by trypsin, and the specificity of enteropeptidase depends on the heavy chain. J Biol Chem, 272,31293-300.

19. Lu,D„ Futterer,K., Korolev,S., Zheng,X., Tan,K., Waksman,G., & Sadler,J.E. (1999) Crystal structure of enteropeptidase light chain complexed with an analog of the trypsinogen activation peptide. JMolBiol, 292,361-73.

20. Kitamoto,Y., Veile,R.A, Donis-Keller,H., & Sadler,J.E. (1995) cDNA sequence andchromosomal localization of human enterokinase, the proteolytic activator of trypsinogen. Biochemistry, 34, 4562-8.

21. Svetina,M., Krasevec,N., Gaberc-Porekar,V., & Komel,R. (2000) Expression of catalytic subunit of bovine enterokinase in the filamentous fungus Aspergillus niger. J Вiotechnol, 76,245-51.

22. Blow, D. M. (1997) The tortuous story of Asp . His . Ser: structural analysis of alpha-chymotrypsin. Trends Biochem. Sci. 22, 405-408.

23. Dodson, G.; Wlodawer, A. (1998) Catalytic triads and their relatives. Trends Biochem. Sci. 23, 347-352.

24. Rawlings, N. D.; Barrett, A. J. (2000) MEROPS: the peptidase database Nucleic Acids Res. 28, 323-325.

25. Neurath, H. (1984) Evolution of proteolytic enzymes. Science 224, 350-357.

26. Johnson, D. E. (2000) Programmed cell death regulation: basic mechanisms and therapeutic opportunities. Leukemia 1695-1703.

27. Joseph, К.; Ghebrehiwet, В.; Kaplan, A. P. (2001) Activation of the kinin-forming cascade on the surface of endothelial cells. Biol. Chem. 382, 71-75.

28. Coughlin, S. R. (2000) Thrombin signalling and protease-activated receptors. Nature 407, 258-264.

29. Barros, C.; Crosby, J. A.; Moreno, R. D. (1996) Early steps of sperm-egg interactions during mammalian fertilization. Cell Biol. Int. 20, 33-39.

30. Davidson, D. J.; Higgins, D. L.; Castellino, F. J. (1990) Plasminogen activator activities of equimolar complexes of streptokinase with variant recombinant plasminogens. Biochemistry 29, 3585-3590.

31. Sim, R. В.; Laich, A. (2000) Serine proteases of the complement system Biochem. Soc. Trans. 28, 545-50.

32. Collen, D.; Lijnen, H. R. (1986) The fibrinolytic system in man. CRC Crit. Rev. Oncol. Hematol. 4, 249-301.

33. LeMosy, E. K.; Hong, С. C.; Hashimoto, C. (1999) Signal transduction by a protease cascade. Trends Cell Biol. 9, 102-107.

34. Van den Steen, P. E.; Opdenakker, G.; Wormald, M. R.; Dwek, R. A.; Rudd, P. M. (2001) Matrix remodelling enzymes, the protease cascade and glycosylation. Biochim. Biophys. Acta 1528, 61-73.

35. Selvarajan, S.; Lund, L. R.; Takeuchi, Т.; Craik, C. S.; Werb, Z. (2001) A plasma kallikrein-dependent plasminogen cascade required for adipocyte differentiation. Nat. Cell Biol. 3, 267-275.

36. Perona, J. J.; Craik, C. S. (1995) Structural basis of substrate specificity in the serine proteases. Protein Sci. 4, 337-360.

37. Perona, J. J.; Hedstrom, L.; Rutter, W. J.; Fletterick, R. J. (1995) Structural origins of substrate discrimination in trypsin and chymotrypsin. Biochemistry 34.

38. Czapinska, H.; Otlewski, J. (1999) Structural and energetic determinants of the SI-sitespecificity in serine proteases. Eur. J. Biochem. 260, 571-595.

39. Blow, D. M. In The Enzymes', 3rd ed.; Boyer, P. D., Ed.; Academic Press: Boca Raton, (1971) Vol. 3.

40. Kraut, J. (1977) Serine proteases: structure and mechanism of catalysis. Annu. Rev. Biochem. 46, 331-358.

41. Patthy, L. (1993) Modular design of proteases of coagulation, fibrinolysis, and complement activation: implications for protein engineering and structure-function studies. Methods Enzymol. 222, 10-21.

42. Schechter, I.; Berger, A. (1967) On the size of the active site in proteases. I. Papain. Biochem. Biophys. Res. Commun. 27, 157-162.

43. Knowles, J. R. (1965) Enzyme specificity: alpha-chymotrypsin. J. Theor. Biol. 9, 213228.

44. Dorovskaya, V. N.; Varfolomeyev, S. D.; Kaznskaya, N. F.; Klyosov, A. A.; Martinek, K. (1972) The influence of the geometric properties of the active centre on the specificity of -chymotrypsin catalysis. FEBSLett. 23, 122.

45. Kreiger, M.; Kay, L. M.; Stroud, R. M. (1974) Structure and specific binding of trypsin: comparison of inhibited derivatives and a model for substrate binding. J. Mol. Biol. 83, 209-230.

46. Shotton, D. M.; Watson, H. C. (1969) Three-dimensional structure of tosyl-elastase. Nature 25, 811-816.

47. Waugh, S. M.; Harris, J. L.; Fletterick, R.; Craik, C. S. (2000) The structure of the pro-apoptotic protease granzyme В reveals the molecular determinants of its specificity. Nat.1. Struct. Biol. 7, 762-765.

48. Huber, H.; Bode, W. (1978) Crystal structure of bovine trypsinogen at 1-8 A resolution. II. Crystallographic refinement, refined crystal structure and comparison with bovine trypsin. Act. Chem. Res. 11, 114-122.

49. Bone, R.; Shenvi, А. В.; Kettner, C. A.; Agard, D. A. (1987) Serine protease mechanism: structure of an inhibitory complex of alpha-lytic protease and a tightly bound peptide boronic acid. Biochemistry 26, 7609-7614.

50. Laskowski, M.; Qasim, M. A. (2000) What can the structures of enzyme-inhibitor complexes tell us about the structures of enzyme substrate complexes? Biochim. Biophys. Acta 1477, 324-337.

51. Bode, W.; Huber, R. (1992) Natural protein proteinase inhibitors and their interaction with proteinases. Eur. J. Biochem. 204, 433-451.

52. Dixon, M. M.; Matthews, B. W. (1989) Is gamma-chymotrypsin a tetrapeptide acyl-enzyme adduct of alpha-chymotrypsin? Biochemistry 28, 7033-7038.

53. Blanchard, H.; James, M. N. (1994) A crystallographic re-investigation into the structure of Streptomyces griseus proteinase A reveals an acyl-enzyme intermediate. J. Mol. Biol. 241,574-587.

54. Read, R. J.; James, M. N. G. Elsevier Science Publishing Co., Inc.: New York, 1986.

55. Bone, R.; Sampson, N. S.; Bartlett, P. A.; Agard, D. A. (1991) Crystal structures of alpha-lytic protease complexes with irreversibly bound phosphonate esters. Biochemistry 30, 2263-2272.

56. Coombs, G. S.; Rao, M. S.; Olson, A. J.; Dawson, P. E.; Madison, E. L. (1999) Revisitingcatalysis by chymotrypsin family serine proteases using peptide substrates and inhibitors with unnatural main chains. J. Biol. Chem. 274, 24074-24079.

57. Thompson, R. C. (1973) Use of peptide aldehydes to generate transition-state analogs of elastase. Biochemistry 12, 47-51.

58. Kettner, C. A.; Bone, R.; Agard, D. A.; Bachovchin, W. W. (1988) Kinetic properties of the binding of alpha-lytic protease to peptide boronic acids. Biochemistry 27, 7682-7688.

59. Brady, K.; Abeles, R. H. (1990) Inhibition of chymotrypsin by peptidyl trifluoromethyl ketones: determinants of slow-binding kinetics. Biochemistry 29, 7608-7617.

60. Schellenberger, V.; Braune, K.; Hofmann, H. J.; Jakubke, H. D. (1991) The specificity of chymotrypsin. A statistical analysis of hydrolysis data. Eur. J. Biochem. 199, 623-636.

61. Stein, R. L.; Strimpler, A. M.; Hori, H.; Powers, J. C. (1987) Catalysis by human leukocyte elastase: mechanistic insights into specificity requirements. Biochemistry, 26, 1301-1305.

62. Bode, W.; Meyer, E., Jr.; Powers, J. C. (1989) Human leukocyte and porcine pancreatic elastase: X-ray crystal structures, mechanism, substrate specificity, and mechanism-based inhibitors. Biochemistry, 28, 1951-1963.

63. Baggio, R.; Shi, Y.-Q.; Wu, Y.-Q.; Abeles, R. H. (1996) Biochemistry, 35, 3351-3353.

64. Hedstrom, L.; Szilagyi, L.; Rutter, W. J. (1992) Converting trypsin to chymotrypsin: the role of surface loops. Science, 255, 1249-1253.

65. Harper, J. W.; Cook, R. R.; Roberts, C. J.; McLaughlin, B. J.; Powers, J. C. (1984) Biochemistry, 23, 2995-3002.

66. Stein, R. L. (1985) Catalysis by human leukocyte elastase: III. Steady-state kinetics for the hydrolysis of p-nitrophenyl esters. Arch. Biochem. Biophys., 236, 677-680.

67. Thompson, R. C.; Blout, E. R. (1970) Evidence for an extended active center in elastase. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 67, 1734-1740.

68. Stein, R. L. (1985)7. Am. Chem. Soc., 107, 5767-5775.

69. Hess, G. P.; McConn, J.; Ku, E.; McConkey, G. (1970) Studies of the activity of chymotrypsin. Philos. Trans. R. Soc. London, В 257, 89-104.

70. Tanizawa, K.; Kanaoka, Y.; Lawson, W. B. (1987) Acc. Chem. Res., 20, 337-343.

71. Liang, Т.; Abeles, R. H. (1987) Complex of alpha-chymotrypsin and N-acetyl-L-leucyl-L-phenylalanyl trifluoromethyl ketone: structural studies with NMR spectroscopy. Biochemistry 26, 7603-7608.

72. Cassidy, C. S.; Lin, J.; Frey, P. A. (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun., 273, 789792.

73. Lin, J.; Cassidy, C. S.; Frey, P. A. (1998) Correlations of the basicity of His 57 with transition state analogue binding, substrate reactivity, and the strength of the low-barrier hydrogen bond in chymotrypsin. Biochemistry 37, 11940-11948.

74. Cassidy, C. S.; Lin, J.; Frey, P. A. (1997) Biochemistry, 36, 4576-4584.

75. Tobin, J. В.; Whitt, S. A.; Cassidy, C. S.; Frey, P. A. (1995) Biochemistry, 34, 6919-24.

76. Inagami, Т.; Murachi, T. (1964) J. Biol Chem., 239, 1395-1401.

77. Ascenzi, P.; Menegatti, E.; Guarneri, M.; Bortolotti, F.; Antonini, E. (1982)

78. Biochemistry, 21, 2483-2490.

79. Robertus, J. D.; Kraut, J.; Alden, R. A.; Birktoft, J. J. (1972) Subtilisin; a stereochemical mechanism involving transition-state stabilization. Biochemistry, 11, 4293-4318.

80. Read, R. J.; Fujinaga, M.; Sielecki, A. R.; James, M. N. G. (1983) Biochemistry, 22, 4420-4433.

81. Katz, B. A.; Finer-Moore, J.; Mortezaei, R.; Rich, D. H.; Stroud, R. M. (1995) Episelection: novel Ki approximately nanomolar inhibitors of serine proteases selected by binding or chemistry on an enzyme surface. Biochemistry, 34, 8264-8280.

82. Corey, D. R.; Craik, C. S. (1992)7. Am. Chem. Soc., 114, 1784-1790.

83. Cannon, W. R.; Benkovic, S. J. (1998) Solvation, reorganization energy, and biological catalysis. J. Biol. Chem., 213, 26257-26260.

84. Jencks, W. P. (1975) Binding energy, specificity, and enzymic catalysis: the circe effect. Adv. Enzymol., 43, 219-410.

85. Gandour, R. D.; Nabulsi, N. A. R.; Fronczek, F. R. (1990) J. Am. Chem. Soc., 112, 78167817.

86. Satterthwait, A. C.; Jencks, W. P. (1974) J. Am. Chem. Soc., 96, 7018-7031.

87. Dufton, M. J. (1990) Could domain movements be involved in the mechanism of trypsin-like serine proteases FEBS Lett., 271, 9-13.

88. Stormo, G.D., Schneider, T.D. and Gold, L. (1982) Characterization of translation initiation sites in E. coli. Nucl. Acids Res. 10:2971-2996.

89. Casadaban MJ, Martinez-Arias A, Shapira SK, Chou J (1983) |3-galactosidase gene fusion for analyzing gene expression in Escherichia coli and yeast. Methods Enzymol 100:293-308,.

90. Smith, D.B. and Johnson, K.S. (1988) Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase. Gene 67:31-40.

91. LaVallie ER, DiBlasio EA, Kovacic S, Grant KL, Schendel PF, McCoy JM. (1993) A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y). 11(2): 187-93.

92. Mitraki, A. and King, J. (1989) Protein folding intermediates and inclusion body formation. Bio/Technology 7: 690-697.

93. Lunn, C.A., Kathju, S., Wallace, B.J., Kushner, S.R. and Pigiet, V. (1984) Amplification and purification of plasmid-encoded thioredoxin from Escherichia coli К12. J. Biol. Chem. 259:10469-10474.

94. Katti, S.K., LeMaster, D.M. and Eklund, H. (1990) Crystal structure of thioredoxin from Escherichia coli at 1.68 angstroms resolution. J. Mol. Biol. 212: 167-184.

95. Stader, J.A. and Silhavy, T.J. (1990) Engineering Escherichia coli to secrete heterologous gene products. Methods inEnzymol. 165: 166-187.

96. S. Ohnishi and K. Takano (2003) Amyloid fibrils from the viewpoint of protein folding. Cell Mol Life Sci, 61 (5), pp.511-524.

97. Grojean H, Fiers W (1982) Preferential codon usage in prokariotic genes: The optimal codon-anticodon interaction energy and the selective codon usage in efficiently expressed genes. Gene 18:199-209.

98. Kalafatis,M. & Mann,K.G. (1993) Role of the membrane in the inactivation of factor Va by activated protein C. J Biol Chem, 268,27246-57.

99. Bradford,М.М. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 72, 248-54.

100. Gill,S.C. & von Hippel,P.H. (1989) Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Anal Biochem, 182, 319-26.

101. Green,G.D. & Shaw,E. (1979) Thiobenzyl benzyloxycarbonyl-L-lysinate, substrate for a sensitive colorimetric assay for trypsin-like enzymes. Anal Biochem, 93, 223-6.

102. Grant, D.A. & Hermon-Taylor,J. (1979) Hydrolysis of artificial substrates by enterokinase and trypsin and the development of a sensitive specific assay for enterokinase in serum. Biochim Biophys Acta, 567, 207-15.

103. Baratti,J., Maroux,S., Louvard,D., & Desnuelle,P. (1973) On porcine enterokinase. Further purification and some molecular properties. Biochim Biophys Acta, 315, 147-61.

104. Anderson,L.E., Walsh,K.A., & Neurath,H. (1977) Bovine enterokinase. Purification, specificity, and some molecular properties. Biochemistry, 16,3354-60.

105. Liepnieks,J.J. & Light,A. (1979) The preparation and properties of bovine enterokinase. J Biol Chem, 254,1677-83.

106. Morrison,J.F. & Walsh,C.T. (1988) The behavior and significance of slow-binding enzyme inhibitors. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol, 61, 201-301.

107. Berendsen, H. J. C,, van der Spoel, D., van Drunen, R. (1995) GROMACS: A message-passing parallel molecular dynamics implementation. Сотр. Phys. Comm. 91:43-56.

108. Lindahl, E., Hess, В., van der Spoel, D. (2001) Gromacs 3.0: A package for molecular simulation and trajectory analysis. J. Mol. Mod. 7:306-317.

109. Berendsen, H. J. C., Postma, J. P. M., DiNola, A., Haak, J. R. (1984) Molecular dynamics with coupling to an external bath. J. Chem. Phys. 81:3684-3690.

110. Darden, Т., York, D., Pedersen, L. (1993) Particle mesh Ewald: An N-log(N) method for Ewald sums in large systems. J. Chem. Phys. 98:10089-10092.

111. Luthy R, Bowie JU, Eisenberg D (1992) Assessment of protein models with three-dimensional profiles, Nature 356 (6364), 83-5.

112. Kabsch, W. & Sander, C. (1983) Dictionary of protein secondary structure: Pattern recognition of hydrogen bonded and geometrical features, Biopolymers, 22, 2577-2637.

113. Hedstrom, L. (2002) Serine protease mechanism and specificity. Chem Rev, 102, 45014523.

114. Stein RL, Strimpler AM, Edwards PD, Lewis JJ, Mauger RC, Schwartz JA, Stein MM, Trainor DA, Wildonger RA, Zottola MA. (1987) Mechanism of slow-binding inhibition of human leukocyte elastase by trifluoromethyl ketones. Biochemistry. 26(10):2682-2689.

115. Case A, Stein RL (2003) Mechanistic origins of the substrate selectivity of serine proteases. Biochemistry 42(11): 3335-48.

116. Thompson RC, Blout ER. (1973) Dependence of the kinetic parameters for elastase-catalyzed amide hydrolysis on the length of peptide substrates. Biochemistry 12(1 ):51-57.1. БЛАГОДАРНОСТИ

117. Выражаю глубокую благодарность своим научным руководителям, д.б.н., профессору Д.А. Долгих и к.б.н. М.Э. Гаспарян, за доброе внимание, поддержку начинаний и своевременную, и потому неоценимую, помощь при выполнении моей диссертационной работы.

118. Я очень признателен моему консультанту по молекулярному моделированию к.ф.-м.н. Ю.А. Косинскому за терпеливое обучение методам и ценные обсуждения результатов.

119. Также не могу не отметить важную роль моей семьи и друзей в стабилизации фона проводимых исследований: благодарю их и надеюсь, что смогу быть полезен в ответ.