Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональные изменения гемоглобина и мембран эритроцитов при нарушении кислородного режима

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональные изменения гемоглобина и мембран эритроцитов при нарушении кислородного режима"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ РрСтфвекфЯ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

• ■■ КРАЙНОВА Наталья Николаевна

На правах рукописи

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ГЕМОГЛОБИНА И МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ ПРИ НАРУШЕНИИ КИСЛОРОДНОГО РЕЖИМА

03.00,04—БИОХИМИЯ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ростов-на-Доку 1993

Работа выпо/шша в Ростовокрм .»аучно-мсследовательско-м «статуте акушерства и педиатрии МЗ РФ

Научные руководители:

— доктор (биолопия-еших наук профессор Погорело,ва Т. Н.;

— дснктор медицинских гааук Эстрия В. В.

Официальные оппоненты:

— доктор медицинских -наук профессор Сторожук П. Г.;

— доктор биологических иаук профессор Менджерицмий А. М.

Ведущая организация: Ростовский государственный университет

Защита состоится « » (¿¿и/А J 1993 г.

в-/^ час. та заседании специализированного совета Д.084.53.01 при Ростовском государственном медицинском институте (344700, от. Ростов «а-Дону, пер. Надачевансшй, 29)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ростовского .государственного медицинского института

Автореферат разослан «_»_1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета

доцент //. Я. КОРТ АН О В

Актуальность проблемы: В современной биологии и медицине изучению кислородзависимых патологических состояний и их коррекции отводится ваяное место, т.к. разнообразные вида профессиональной деятельности человека.и лечение.многих, заболзва-.. ниа связаны с экстремальными кислородными режимами. Пшоксия критических состояний в большинстве случаев формируется практически на всех, звеньях жизнедеятельности организма и на всех этапах транспорта кислорода от альвеол до клетки, т.е. представляет собой многообразную патологию то существу всех функций организма.

В свою очередь, гипероксия ведет к появлению кислородной интоксикации, сопровождающаяся многосторонними нарушениями в организме, которые зависят от парциального напряжения кислорода, времени экспозиции и обусловлены токсическим эффектом кислородных радикалов. Дзйствие измененных концентрация кислорода на организм реализуется через цзлш каскад биохимических реакций, включающих мембранодеструктивные процессы и модификацию макромолекул.

В хода биохимической адаптации- к нарушению . кислородного режима важнейшая роль принадлежит гемоглобину (П. Хочачка, №. Сомеро, 1988; Н.Ф. Стародуб, В.И. Назаренко, 1987). В настоящее время имеются сведения о возникающих при нарушениях кислородного режима молвкулярных перестройках гемоглобина, приводящих к изменению гетерогенности и физико-химических свойств (Г.В. Дэрвиз, 1981; В.Й. Коробов, Н.Ф. Стародуб, 1992). Однако, структурно-функциональная модификация гемоглобина при кислородзависимых патологических состояниях практически не изучена.

К числу заболевания, ведущим патогенетическим фактором которьд является гипоксия, относится сепсис новорожденных, занимающий одно из ведущих мест в структуре детской заболеваемости и смертности (Г.В. Яцык с соавт., 1987; Д. Центтерппрем с соавт., 1988). Исследование молекулярных механизмов патогенеза сепсиса у детей лишены системного подаода, который бы позволил провести связь нейду активностью обнаруженных повреждающих факторов и их возможным влиянием на структуру и функции биологических мембран и макромолекул и клиническими проявлениями заболевания.

Факт наличия в группа новорожденных больных сепсисом гипоксии, длительной анемизации, морфологически измененных эритроцитов (В.В. Эстрин, 1990) позволил нам сделать предположение о возможных структурно-функциональных изменениях гемоглобина в этой группа пациентов.

В доступной нам литература отсутствуют данные о динамическом состоянии кислородгранспоргной системы при сепсисе новорожденных, а также при использовании экстракорпоральной мембранной оксигенации в коррекции пшоксических состояний. Наряду с терапевтическими целями, экстрокорпоральная мембранная оксигенация перфузируемоа донорской крови может быть использована в качестве адекватной модели гипероксии. Эти исследования углубляют современные представления о генезе кислородзависимых патологических состояний, а также способствуют решению ряда вопросов, связанных с обоснованием показаний к применению экстракорпоральных методов в клинической практике и выбором режимов и критериев эффективности.

Цель исследования: Целью настоящего исследования явилось выявление общих закономерностей изменения структурно-функциональных свойств гемоглобина и мембран эритроцитов при нарушении кислородного режима в клинике (при сепсисе новорожденных), в эксперименте (мембранная оксингенация перфузируемоа донорской крови) и разработка экспериментально-теоретического обоснования применения методов дезинтоксикационной и оксигено-тарапии гипоксических. состояний.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи.

1. Изучить структуру и функции гемоглобина у новорожденных с различной тяжестью септического процесса;

2. изучить сбалансированность процессов перекисного окисления липидов и состояния антаоксидантной системы защиты в зависимости от тяжести септического процесса;

3. разработать методы экспресс-диагностики тяжести септического процесса;

4. изучить влияние экстракорпоральной мембранной оксигенации на кислородгранспорггные свойства гемоглобина и процэссы перекисного окисления липидов в эксперименте с изолированной донорской кровью;

5. провести сравнительное изучение методов интенсивной терапии сепсиса: метаболической реанимации, гемосорбции.

квантовой гемотерапии в плане их влияния на повреждающие факторы и процессы восстановления структурно-функционального состояния гемоглобина и мембран эритроцитов;

6. разработать показания и критерии зффзктивности проведения гемосорбции.

Положения, выносгашэ на защиту:

1. В условиях гипоксии, в том числе при сепсисе новорожденных, имеют место структурно-функциональные изменения гемоглобина и мембран эритроцитов, коррелирующие со степенью тяжести процесса.

2. Характер функциональных изменения гемоглобина при экспериментальной гипероксии (экстракорпоральной мембранной оксигенации пэрфузируемоа донорской крови) аналогичен таковому в условиях гипоксии.

3. Применение гемосорбции (ГС) и ГС в сочетании с ультрафиолетовым облучэнием (УФО) в терапии кислородзазисимых патологических состояний способствует восстановлению структуры гемоглобина и снижению горекисного окисления липидов в мембранах эритроцитов.

Научная новизна:

1. Впервые получены данные о налитки структурно-функциональных изменений в молекула гемоглобина в условиях гипоксии при сепсисе новорожденных.

2. Установлена однотипность изменения функциональных свойств гемоглобина в условиях гипоксии у новорожденных с сепсисом и при гипэроксии в процессе экстракорпоральной мембранной оксигенации пэрфузируемой донорской крови.

3. Дано теоретическое обоснование применения эфферентных методов лечения сепсиса.

Теоретическая и практическая значимость работы:

Данные о структурно-функциональных изменениях гемоглобина, полученные в ходе настоящего исследования, углубляет современные представления о патогенезе кислородзависимых состояние.

Внедрение в практику здравоохранения тестов прогнозирования септического шока и индивидуальной чувствительности к гемосорбции при лечении сепсиса новоровденных позволит повысить эффективность интенсивной терапии в результате оптимизации использования эфферентных методов детоксикации.

Биохимически обоснованный выбор режимов экстракорпоральной мембранной оксигенации позволит снизить число осложнений и летальность при кислородзависимых патологических состояниях.

Материалы, полученные при выполнении диссертационной работы, используются на семинарах по усовершенствование; врачей реаниматологов и нзонатологоз на базе РНЖАП и медицинского факультета КБГУ.

Апробация работа. Основные положения работы обсувдены на заседаниях Ростовского отдэлзния биохимического общества РАН (1989-1991гг.), на IV Ростовское областной научно-практической конференции "Научные основы охраны здоровья матери и ребенка" (1935), на XI Есзсовзном съезде датских врачей (Москва, 1988), на конференции молода ученых РШИАП (1984-1992).

Публисащ1я материалов исследования :

По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, создано 2 рационализаторских предложения, выполнено 5 изобретений: "Способ определения ккзнеспособности недоношенного новорожденного" а.с.N1537219; "Способ определения индивидуальной чувствительности к гекосорбции при лечении сепсиса у новорожденных" а.с.N1778701; "Способ диагностики'септического шока" патент N1801209; "Способ диагностики родовых внутричерепных кровоизлияний у новорожденных" N5003039, приоритет от 2.08.91; "Способ прогнозирования инфекционных осложнений у новорожденных с острой дыхательной недостаточностью" N5055702, приоритет от 21.СГ7.92.

Структура и ой-ти работы: Диссертация изложена на 162 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, методов исследований, трех глав собственных исследований, заключения, основных выводов и йгЗлиографического списка использованной литературы. Послэдний включает 117 источников на русском языке и 66 на иностранных языках. Диссертация иллюстрирована 18 таблицами и 30 рисунками.

Материалы *д нетода исследования

Под наблюдением состояло 100 детей от 0 до 21 дня жизни, находящихся на лечении в отделении реанимации и интенсивной терапии Ростовского НИИ акушерства и педиатрии.

При поступлении в отделение, а также при динамическом наблюдении всем детям проводилась сщзшса степени тяшети септического процесса по диагностической программе-функции

"Screening" (В.В. Эстрин, 1S81). Клинические группы формировали в зависимости от степени тега ста заболевания к методов лечения. Экспериментальны» исслвдовашп с зкстраксралоральной мембранной сксигенациэг пзрфузируемой донорской крови осуществляли со свежегопаркнизировавной кровью доноров-добровольцев.

Для суждения о степени гипоксии определяли показатели кислотно-щелочного состояния и газового состава капиллярной крови на аппарате ABI-330 фирмы "Radiometer" (Дания).

Ковформационные изменения в молекуле гемоглобина определяли методом спиновых моток (Г.И. Лихтенштейн, 1974). Раствор гемоглобина счищали на сефадексе G-75 (колонка 25 х 5 см, злзо-ция 0,05 М фосфатным буфером рН 7,4 со скоростью 20 мл/час).

Джя установления степени чистоты полученного раствора снимали оптический сдаитр на спектрометра "Specord-40" (Герма- .

ния). В дальнейшем работали с образцами белка, если соблюдалось следующее соотнокение полос: Е 4)5/Е = 3,66 Е Е = 2,35. В качестве спиновой метки использовали N-(1 -оксил-2,2,6,б-тетраметилпиперид-ил) -р-хлормеркуригбонза-шзд фирмы "Reanal" (Венгрия). Парамагнитный спектр снимали на ЭПР-сгоктромэтре "EPR-Varian" (США). Расчитывали соотношение высокополъной, нулевой и низкопольной компонент (h+:hQ:h_) и скорость вращения метки, используя модель анизотропного вращения (А.Н. Кузнецов, 1976).

Для исследования функциональных свойств гемоглобина строили кислородциссоционные кривые (КДК) на приборе Неш-0-Scan (США). Для анализа результатов использовали величину полунасыщения гемоглобина кислородом (Р50) и коэффициент Хилла, который определяли по углу наклона прямой в координатах: lg У/(1-У) - lg р02 (у - процент оксиформы гемоглобина).

Интенсивность процессов шрекисного окисления лшвдов. (ПОЛ) в плазме крови и мембранах эритроцитов определяли по уровни первичных продуктов окисления свободных жирных кислот -диеновых коныогатов (ДК) и конечных продуктов БОЛ - Шиффовых оснований (ШО). Мембраны эритроцитов выделяли по методу Л.И. Колчинской с соавторами (1976). Количественное определение ДК проводили спектрофотометрически (И.Д. Стальная, 1977); ШО -спектрофлуориметрически на флуориметре "ShimacLsu" (Япония).

Общие липиды определяли унифицированным методом с сульфо-ванилиновым реактивом (В.В. Меньшиков, 1987).

Регистрацию параметров перэкисноа хвмилшинэсцзшдаи (ХЛ) осуществляли на хемилюминометре с ФЭУ-127 и ПЭВМ "Электроника БК 0010-01" для цифровой обработки результатов и отображением на мониторе кинетической кривой реакции ("Инжмет", Москва).

Микровязкость мембран эритроцитов определяли по параметрам флуоресценции зонда пирена на спекгрофлуориметрв "Shiraadsu" (Япония) (Ю.А. Владимиров, Г.Е, Добрецов, 1980).

Оксидззную активность цзрулоплазшна (ЦП) в сыворотке крови расчитывали методом Ravin в модификации С.В. Бестужева и В.Г. Колба (В.Г. Колб, B.C. Кзкьишлков, 1982).

Содержание внезригроштарного гемоглобина (ВЭГ) устанавливали по методу A.B. Карзкасева и Е.П. Вкчева (1968).

Полученные рззультаты обработаны методами описательной статистики с использованием критерия Стыадэнта. При проведении статистического анализа применялись корреляционный и регрессионный анализы. Расчеты проведены на ПЭЗМ IBM PS AI с помощью пакета "Microstat".

РЕШБШЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

У всех обследованных нами пациентов, поступивших в отделение реанимации с диагнозом сепсис, были зарегистрированы выраженные нарушения кислотно-щолочного состояния и газового состава крови, свидетельствующие о гипоксии: декомпенсирован-ный сметанный ацидоз pH 7,22±0,03; BE (-8,3)±1,02 ммоль/л; ги-пвркапния рС02 49,3+1,9 мм рт ст; гипоксэмия р02 34,6±3,81 км рт ст.

При анализе хорошо разрешенного тригиэтного ЗПР-спектра спкн-мечвнного гемоглобина новорожденных с сепсисом было обнаружено изменение вязкостных свойств микрорельефа в области ß-93 SH-rpyim. Наибольшее значение времени корреляции вращательной диффузии (tc) , превышающее в 3,5 раза (р<0,001) аналогичный показатель в группе здоровых новорожденных, было зарегистрировано у пациентов с неблагоприятным исходом заболевания. У всэх детей больных сепсисом наблюдалось уменьшение интенсивности высокопольной компоненты по сравнению с нулевой, уширение линии низкопольной компоненты, а у новорожденных с неблагоприятным исходом заболевания - расщепление низкопольной компоненты (рис. 1).

Полученные результаты указывают на наличке у детей с

б

4

4

\г

[Г

РИС. 1

ЭПР-СПЕКТР СПИН-МЕЧЕННОГО ГЕМОГЛОБИНА

А- ЗДОРОВОГО НОВОРОЖДЕННОГО, Б - НОВОРОЖДЕННОГО С СЕПСИСОМ 11-111 СТЕПЕНИ ТЯЖЕСТИ, В - НОВОРОЖДЕННОГО С СЕПСИСОМ 1У СТЕПЕНИ ТЯЖЕСТИ

I I Ч Ж ЭТАПЫ ЗШ1ДШШ РИС. 2

ВРЕМЯ КОРРЕЛЯЦИИ ВРАЩАТЕЛЬНОЙ ДИФФУЗИИ (ЭПР-СПЕКТРОСКОПИЯ) ПРИ ПРИМЕНЕНИИ РАЗЛИЧНЫХ МЕТОДОВ ИНТЕНСИВНОЙ ТЕРАПИИ СЕПСИСА НОВОРОЖДЕННЫХ —— МЕТАБОЛИЧЕСКАЯ РЕАНИМАЦИЯ И ГЕМОСОРБЦИЯ -- — ГЕМОСОРБЦИЯ В СОЧЕТАНИИ С УЛЬТРАФИОЛЕТОВЫМ ОБЛУЧЕНИЕМ

сепсисом информационных изменения в молекуле гемоглобина, ко-релирущих с тяжестью септического процесса. Эти изменения характеризуются ограничением подвижности белковой матрицы, что может быть связано с изн0н9низм вязкостных свойств еа микрорельефа, вследствие увеличения полярности и гидратации, а также с иьмэнениэи свойств сольватной оболочки глобулы (О.В.Бэло-ногор^э с созвт., 1533; Л.11. Кяавяряйнен, 1980).

Особый интерес представляет анализ возможного влияния обнаруженных нами кокфоркацр:-ашньа изменений на функцию гемоглобине. Коззлантво связанные с болковов молекулой нзпеи в большой стегали отраксют внутренние подвижность белковых глобул с частотами 10?- Ю^с-1 и амплитудами, превышающими 0,3-0,5 А, которые гйрвостошннов значение для функциональной ак-

TKXiiocr.i стягов <Г.И. ЛиггевпггеЕН , 1979). Известно, что при-керпс в :/mz зреаэахкг иатервалах происходят кокформационые сдагти в гонт чэЛ!кз при переходе от r-форш к R-форке (А. Aipert Gt :••!., lír,'íJ). Уменьшение локальней подвижности белковой глобулы в гидрофобном кармане может привести, во-юрзых, к доводив скоро ста оксигенации и деоксигензцш гемз, и, во-вторых, к поязлзаию при сепсисе у детей форм гемоглобина с изме-азвнек напряженностью. Такие гемоглобина характеризуется модификацией подаикности субъединиц тетрамера с фиксацией либо в Т-форме, представленной гемоглобинами с высокой напряженность:), обнаруженными при зритроцигозе, либо в R-форш (J.M.Tn'.cc , 1977).

nr<í! изучении функционального состояния гемоглобина нами устаковлано , что у детей I-II степени тяжести сепсиса полу-насыцзниз гемоглобина кислородом соответствовало норке, коэффициент Хилла составил 2,7+0,001 и не отличался от физиологических величин. У детей с тяжелыми формами сопсиса и неблагоприятным исходом заболевания величина P5Q возрастала соответственно, на 20,8% (р<0,001) и 26,0% (р<0,001) относительно нормы, коэффициент Хилла был снижен на 7,0% <р<0,001) и 8,9% (р<0,001) соответственно по сравнению с физиологической величиной.

Таким образом, при тяжелых формах сепсиса у новорожденных наблюдается сдвиг кривой диссоциации гемоглобина вправо и снижение кооперативного эффекта .

Несмотря на то, что вопрос сродства гемоглобина к кисло-

роду изучается более 100 дат, нет однозначного мнения в трактовке экспериментальных и клинических данных. Сдвиг ¡сривои диссоциации гемоглобина вправо , обнаруженный нами у новорожденных с сепсисом, является благоприятным для дыхательной функции и организма в целом лишь до известного момента. острой гипоксии отдача кислорода тканям важнее трудностей оксигенащш. Однако, при снижении pOg до критического уровня, увеличение кислородной экстракции становится недостаточным для удовлетворения тканевых потребностей и тканевое потребление кислорода снижается (Mink R.B., Pollack М.М.,1990).

У детей с тяжелыми формами сепсиса при поступлении в от-» деление отмечалась более высокая интенсивность процессов ПОЛ, имеющая одинаковую направленность как в плазме так и в мембранах эритроцитов. Аналогично содержанию диеновых коньюгатов (ДК) и шффовых оснований (НО), максимальные интенсивность и светосуима перекисноя хемилюминесценции (ХЛ) сыворотки крови зарегистрированы у больных с неблагоприятным исходом заболевания (табл. 1).

Подученный результаты свидетельствуют о том, что интенсивность свободнорадикального окисления липидов коррелирует со степенью тяжести септического процесса у детей. Аналогичные данные при определении уровня малонового даальдегида и пере-кисного гемолиза были получены в исследованиях А.И. Ананенко с соавт. (1978, 1984), I.A. Готуа (1984), A.B. Петренко (1987),

Известно, что при тяжелых формах гнойно-септических заболеваний у детей снижается активность антиоксвдантной системы (В.А. Таболин с соавт., 1983; С.Ю. Русанов с соавт., 1987, 1988). Подгвекдениэм этого служит обнаруженное нами у детей с тяжелым течением сепсиса неуклонное нарастание интенсивности свободнорадикального окисления липидов и, что особенно важно, ХЛ, являющейся интегративным показателем соотношения процессов ПОЛ и антиоксвдантной защиты организма. Увеличение амплитуда перекисной ХЛ и светосуммы, сопровождающее ухудшение клинического состояния больных, свидетельствует о клеточной инактивации (Н.Fischer, Н.Standingen, 1981).

Исследование микровязкости лшщвдого бислоя мембран эритроцитов выявило наиболее низкое соотношение зксимеров и мономеров пирена (0,38+0,02) у детей с неблагоприятным исходом заболевания. Указанная величина у этой категории больных была на

Таблица 1

ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЖИДОВ В ПЛАЗМЕ КРШН И ШШРАНАХ ЭРИТРОЦИТОВ У ДЕТЕЙ С РАЗЛИЧНОЙ ТЯКЕСТЫО СЕПТИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА (№о)

группы

больных

число боль ных

плазма

ДК,

мкмоль/л

Т-1-

ШОДсвече-1 амплитуда ния на 1мг |ХЛ, 10 липидов |квант/с 4п

-1-

109,7+10,5125,78+3,2

светосумма ХЛ, 10£ квант/с 4п

мембраны эритроцитов

ДК,

мкмоль/л

1ЮД свечения на 1 мг липидов

I

30

9,9+1,2

64,99+3,13

13,8+2,3

205,6+15,6

11

20

11,0+1,0

121,7+12,3158,7+2,1 |р <0,001

100,25+3,98 р <0,001

18,1+1,7

315,6+20,3 р <0,001

III

30

13,9+0,9 р <0,02 р1<0,05

16б,4+15,б|93,64+0,31 р <0,001 |р <0,001 р1<0,02 |р1<0,001

102,04+0,19 р <0,001 р!<0,05

19,7+1,1 р <0,05

294,3+18,8 р <0,001

IV

40

34,7+2,1 р <0,001 р1<0,001 р2<0,001

154,8+19,8|203,7+6,5 р <0,01 |р <0,001 |р1<0,001 |р2<0,001

144,48+2,22 р <0,001 р1<0,001 р2<0,001

20,4+1,5 р <0,05

365,9+12,9 р <0,001 р1<0,05 р2<0,01

I_1_

25,5% (р<0,01) и на 22,4% (р<0,001) меньше, чем у детей I и II степени тяжести соответственно, что свидетельствует oö увеличении микровязкости липидноя фазы мембран эритроцитов у этих больных. Микровязкость мембран эритроцитов у инкурабельных детей и больных с III и IV степенью тяжести сепсиса достоверно между собой не отличалась.

Увеличение микровязкости липидного бислоя эритроцитзрной мембраны наряду с нарушением ее функции может способствовать процессам внутрисосудистой коагуляции и микроциркуляторным нарушениям. Эритроцит обладает, по сравнению с другими форменными элементами крови, наибольшей эластичностью, позволяющей ему преодолевать капилляры. Повышение микровязкости мембраны может привести к изменению ее пластичности, проницаемости, электрохимического потенциала и в конечном итоге нарушению процессов газообмена и лизису.

Универсальность гипоксии в генззе подавляющего большинства заболеваний обосновывает необходимость разработки методов и фармакологических средств, направленных на коррекцию гипоксических состояний. Наиболее распространенным способом лечения гипоксии является повышение' парциального давления кислорода в крови, достигаемое путем увеличения процентного содержания (Г102) или давления кислорода во вдыхаемой.смеси. Основанные на этом принципе метода респираторной терапии, включающие искусственную вентиляцию легких <ИВЛ) и гигорбари-ческую оксигенацшо (ГБО) в настоящий момент широко используются в клинической практике, однако терапевтическая эффективность данных методов зависит от степени поражения легких. При тяжелых поражениях легких, когда указаными выше способами не удается ликвидировать гипоксемию, в качестве альтернативного метода применяется экстракорпоральная мембранная оксигенация (ЭКМО).

Необходимо отметить, что при применении ЭКМО парциальное давление кислорода в крови достигает весьма значительных величин, поэтому в условиях уже состоявшегося ишемического повреждения органов и тканей существует реальная опасность возникновения ревэрфузионной альтерации, связанной с процессами ПОЛ (М.В. Биленко, 1989).

Экспериментальная система для ЭКМО тарфузируемой донорской крови представляла собой замкнутую циркулирующую

систему, состоящую из резэрвуера для крови, роликового насоса НП-1110, теплообменника для поддержания постоянной температуры циркулирующей крови, мембранного оксигенатора "МОС1-122 ИЛЕВ". Донорская кровь, стабилизированная гепарином в дозе 5 ЕД/шг, перфузирозалась через мембранный оксигенатор и возвращалась в резервуар. Скорость перфузии составила 100 мл/мин. Газовая смесь подавалась в мембранный оксигенатор через респиратор сг-жестким ступенчатым дозированием кислорода и контролем fiOg. ПерФузировзнную кровь исследовали при следующих ре;шлах fiOg: 0,2; 0,5; 1,0. Режим ГЮ2 1,0 сочетался с ультрафиолетовыми облучением (длина волны 254 нм, мощность 25 ВТ/м2).

Величина рН в ходо эксперимента достоверно не изменялась. Парциальное давление углекислого газа уменьшилось уже при Г102 0,2 в 2,8 (р<0,05) раза. При дальнейшем увеличении процентного содержания кислорода в оксигенаторе пшокапния сохранялась примерно на одном уровне. Лишь при облучении УФ-светом в течение 1 часа при 1Ю2 1,0 давление углекислого газа снизилось в 2,9 раза (р<0,001) по сравненио с исходным фоном. Достоверное увеличение р02 в Я,0 (р<0,001) раза отмечено ун<з при Fi02 0,2. При повышении П02 до 0,5, р02 в перфузируемой крови возросло в 5,8 (р<0,001) раз по сравнению с исходным фоном и в 2,0 (р<0,001) раза по сравнение с оксигенацией при значении Г102 0,2. При дальнеЕсэм увеличении Fi0o мы кэ обнаружили повышения р02. В ходе сочетанного использования ЭКМО и УФО проявился оксипзнирущий эффект квантовой гемотерапии. После 20-ти минутного облучения имелась тенденция к возрастанию р02, а посла облучения в течение часа, этот показатель увеличился в 1,8 (р<0,001) раза по сравнению с оксигенацией с Т102 1,0 без УФО и в 11,2 (р<0,001) раза относительно исходного фона.

Выраженный гемолиз отмечен лишь при режиме Fi02 1,0 с облучением крови УФ светом 1 час. Уровень ВЭГ в этих условиях увеличился в 6,8 (р<0,001) раз, а концентрация ионов в 1,5 (р<0,001) раза по сравнению с исходным фоном.

Концентрация начальных и конечных продуктов ПОЛ, интенсивность и светосунма перепиской ХЛ в сыворотке изолированной донорской крови возрастала на всех этапах оксигенацш (табл. 2).

Обнаруженное нами при проведении ЭКМО увеличение р02 уже при I10z 0,2 до величин соотвествующих максимальной оксигена-

Таблица г

ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ В СЫВОРОТКЕ ИЗОЛИРОВАННОЙ ДОНОРСКОЙ КРОВИ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ РЕЖИМАХ ЭКМО М±т

| Показа! гели

Роками океигенации

"Т"

~Г

ИСХОДНЫЙ

фон

по.

<2 0,2 1 час

И02 0,5 1 час

ПО

■2 1.0 1час

П02 1,0 |Н02 1,0

УФО 20 мин|УФО 1 час -(_-_

22,5±1 ,2

Б 10° квант/ с ГШ!

4-г да,

мкМ/л

ШО, %свэч. на 1 мг липидов

64,3±3,7

10,1 ±0,9

100,7±3,4

25,8±1,3

80,1±4,2 р <0,001

17,1 ¿0,8 р <0,001

114,1 ±5,2

48,3±2,7 р <0,001 р1 <0,001

140,0±5,1 р <0,001 р1 <0,001

28,0±1,1 р <0,001 р,<0,001

148,9±5,9 р <0,001 р, <0,001

50,3±2,9 р <0,001 р, <0,001

124,5±4,7 р <0,001 р1<0,001

20,4±1,0 р <0,001 р2 <0,01

200,0±5,3 р <0,001 р1<0,001 р2<0,001

52,2±2,3 р <0,001 р,<0,001

132,5+5,4 р <0,001 р, <0,001

22,4±1,0 р <0,001 р^О.01 р2<0,01

197,5+6,6 р <0,001 Р1 <0,001 Р2<0,001

|79,3±3,3 |р <0,001 ¡Р1 <0,001 ¡Р2<0,001 ¡Р3<0,001 |р4<0,001 |179,9±7,9 ¡р <0,001 |р1<0,001 |р2<0,001 |р3<0,С.С1 |25,9±0,5 |р <0,001 |р1 <0,001 |р3<0,01 |р4<0,05 |210,4±7,4 |р <0,001 |р1<0,001 |р2<0,001

ции гемоглобина может приводить при длительных сроках экспозиции к тому, что кислородгранспортный белок оказывается "запертым" в оксиформе и выключенным из нормального ритма окси- и дзоксигенации (В.А.Галанок с соавт., 1989). Известно, в частности, что ■ гемоглобин насыщенный кислородом на 50% легко окисляется до метгемоглобина, а полностью дезоксигенированный может выпадать из раствора в осадок (Л.И.Иржак, 1975).

При исследовании прооксидантной активности гемоглобина донорской крови, подвергнутой ЭКМО, мы обнаружили ее возрастание уже при оксигенации с П02 0,2 . Увеличение светосуммы ХЛ на этом этапе в 1,6 (р<0,001) раза по сравнению с исходным значением при неизменной амплитуде вспышки свидетельствует о более активном развитии евободнорадикальных реакций. При оксигенации с Г102 0,5 амплитуда возросла в 1,3 (р<0,01) раза, а светосумма в 2,2 <р<0,001) раза по сравнению с фоном. При ТЮ2 1,0 амплитуда ХЛ возросла в 1,8 (р<0,001) раза по сравнению с фоновым значением и режимом 1102 0,2 и в 1,4 (р<0,001) раза по сравнению с режимом П02 0,5. Светосумма увеличилась относительно исходной в 3,6 (р<0,001) раза, по сравнению с И02 0,2 - в 2,3 (р<0,001) раза, по сравнению с П02 0,5 в 1,7 (р<0,001) раза. Облучение УФ светом не ] лзвало достоверных изменений амплитуда и светосуммы ХЛ.

При исследовании функциональных свойств гемоглобина при ЭКМО перфузируемой донорской крови в условиях экспериментальной ЭКМО нами был обнаружен сдвиг кривой оксигенации вправо. Величина Р50 увеличивалась уже при оксигенации П02 0,2 в 1,3 (р<0,001) раза по сравнению с исходным значением. При дальнейшем повышении процента кислорода в газовой смеси и сочетанном применении УФО достоверных изменений полунасыщэния гемоглобина кислородом не выявлено. Показатель кооперативности имел тенденцию к снижению в ходе оксигенации, однако достоверных отличий не выявлено.

Длительное поддержание гемоглобина в состоянии максимального насыщения приводит к стабилизации его в одном состоянии и выключении из режима окси- и дезоксигенации, что может повлечь за собой изменение его свойств.

Анализ материалов, касающихся изменения структурно-функциональных свойств гемоглобина, интенсивности ПОЛ и связанным с этими процессами повреждением мембранных струк-

тур при нарушении кислородного гомеостаза в клинических условиях и в эксперименте при ЭКМО перфузируемоа донорской крови, позволяет .сделать вывод о стереотипности биохимических процессов, возникающих в биологических системах как при недостатке так и при избытке кислорода.

Очевидно, начиная с определенного момента, важным фактором усиления и углубления патологического процесса, возникающего при гипо- и гигароксии, становится активация свободно-радикальных процессов, интенсификация ПОЛ, а также модификация кислородгранспортного белка - гемоглобина, сопрововдаю-щаяся нарушением его функций.

Полученные в наших исследованиях данные являются важным подтверждением теории реперфузионных повревдений и диктуют необходимость разработки более рациональных и щадящих подходов при лечении гипоксических состояний в клинике и, особенно, в рэаннмацшшной практике. Действительно, лечение гипоксии, возникающей при терминальных состоях, всегда предполагает воздействие гипероксии на ишемизированные органы и ткани. Это положение опй болзо актуально при применении таких агрессивных методов как ИЫ и ЭКМО. При этом, очевидно, что в данном случае именно кровь, клеточные элементы которой одни из первых испытали последствия пшоксического повревдения, подвергается воздействию швышнных концентраций кислорода, и может стать тса биологической средой, которая способствует возникновению и развитию процессов альтерации на уровне всего организма.

Нами было изучено конформационное состояние гемоглобина в группах детей с сепсисом, получавших различное лечение: группа А - дети, которым проводилась "метаболическая реанимация" и энтеросорбция; группа Б - дети, получавшие комплекс "метаболическая реанимация", энтеросорбция и гемосорбция; группа В -дети, - у которых наряду с вышеназванными методами лечения, гемосорбция сочеталась с УФО. Учитывались изменения после сеанса у детеа с различным исходом заболевания. Следует подчеркнуть, что в подавляющем большинстве случаев ГС проводилась детям с 111-1У степенью тяжести сепсиса, так как у детей с 1-11 степенью тяжести благоприятный исход заболевания достигался тра-дицонными методами интенсивной терапии.

Определение ЭПР-спектра спин-мэченого гемоглобина показало, что улучшение клинического состояния пациентов сопрововда-

лось уменьшением вязкости белковой глобулы, однако, темпы изменений зависели от тяжести заболевания и применяемой терапии (рис. 2).

Ранее всего конформационньэ свойства гемоглобина изменялись в эдате В. Уже на 4-5 день обследования, т.е. после первого сеанса ГС с УФО время корреляции вращательной диффуции уменьшилось в 2,2 раза (р<0,001) по сравнению с исходным фоном, в 2,47 раза (р<0,001> по сравнению с группой А и в 2,35 раза (р<0,001) по сравнению с группой Б на этом этапе исследования. Достоверные изменения тс в группах детей, получавших метаболическую реанимацию и ГС, появились лишь к моменту выписки, а на всех других этапах обследования этот показатель был достоверно выше, чем в группа В .

Во всех группах наблюдалось снижение интенсивности ЭПР-сигнала и уменьшение высокополъной компоненты по сравнению с центральной. Указанные изменения зафиксированы в группе В на 10-15 сутки, а в группах А и Б перед выпиской .

Следует подчеркнуть, что уже на 4-5 день обследования время корреляции вращательной диффузии метки у пациентов группы В соответствовало этой величине у здоровых новорожденных. Полученные данные свидетельствуют о рэшающем значении УФО в изменении конформации гемоглобина, заклю* зющемся в увеличении подвижности белковой глобулы.

Исследование кислотно-основного состояния (КОС) капиллярной крови у новорожденных с сепсисом до и после сеанса ГС и ГС в сочетании с УФО показало, что последний метод способствует уменьшению гипоксемии. В обеих группах до сеанса изменения КОС характеризовались наличием декомгонсированного метаболического ацидоза с респираторным алкалозом и гипоксемией. После сеанса ГС достоверных изменений в показателях КОС капиллярной крови обнаружено нэ было. Проведение ГС в сочетании с УФО приводило к нормализации КОС, увеличению р02 на 50,4% (р<0,001) по сравнению с этим показателем до .сеанса ГС с УФО и на 41,8% (р<0,001) - после ГС без УФО.

Таким образом, в физиологических условиях молекулярный аффект УФО, по-видимому, заключается в ускорении внутримолекулярной динамики гемоглобина, облегчении процессов окси- и дэ-оксигенации, увеличении транспорта кислорода в клетку, снижении прооксвдантног активности гемоглобина. В нашем случае,

УФО, вероятно, является единственно возможным лечебным воздействием, способным изменить конформацию гемоглобина, что должно способствовать восстановлению его функциональной активности и уменьшению гипоксии у детей с сепсисом.

Во всех группах обследованных детей было обнаружено снижение активности ПОЛ в плазме и мембранах эритроцитов при улучшении клинического состояния пациентов. Однако, динакшка зависела от методов лечения (табл. 3, 4).

Достоверное снижение содержания в плазме крови начальных продуктов ПОЛ - ДК во всех грушах было обнаружено лишь перед выпиской. В группа А статистически достоверное снижение содер-

шо обнаружено на последнем этапе обследования. У детей, получгвзЕХ ГС ГС в сочетании с У5>0, уже на 4-5 день обследо-Интенсивность и светосумма перекисной хемилюминесденции г г;!уп::з А достоверно изменялась лишь к моменту перевода детой та отделения реанимации. В группе Б снижение амплитуда и све-ч"сс;.'.;«ы ХЛ наблюдалось уже на II этапе обследования. В груше В свечение прогрессивно уменьшалось по мере пребывания ново-розденных в отделении вплоть до выписки.

При исследовании динамики ПОЛ в эритроцитарных мембранах у новорожденных с сепсисом была обнаружена следующая закономерность (табл. 4). Содержание ДК и ШО в группе А достоверно снижалось лишь перед выпиской. В груше Б - на 10-15 день от начала лечения, а в груше В уже на 4-5 день.

Микровязкость мембран эритроцитов нормализовалась в группах А и Б перед выпиской. У детей, получавших ГС в сочетании с УФО уже на 4-5 день.

Полученные нами результаты свидетельствуют о более быстром снижении интенсивности процессов ПОЛ и нормализации вязкостных свойств зритроцитарной мембраны в груше детей получавших ГС к, особенно, ГС с УФО. У детей, получавших ГС с УФО наблюдалось прогрессивное снижение содержания ШО, интенсивности и светосуммы перекисноа ХЛ в процессе лечения, а в группе новорожденных, получавших только ГС перед выпиской икало место повышение указанных параметров. По-видимому, это связано с тем, что в комплексной терапии сепсиса новорожденных кроме элиминации из кровяного русла токсинов и патологически измененных эритроцитов (А.Ф.Комаров, 1990), необходимо добиваться активизации антиоксидантной системы, т.е. ГС должна сочетаться

Таблица з

ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ В ПЛАЗМЕ КРОВИ У НОВОРОЖДЕННЫХ С СЕПСИСОМ ПРИ ПРИМЕНЕНИИ РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ ИНТЕНСИВНОЙ ТЕРАПИИ

М+т

1 |Этапы Ж, мкмоль/л ШО. % свечения на 1 1 мг липидов 1

|обследо

1 1 1 1

|вания А (п=15) |Б (п=17) I 1 В (п=15) 1 ■ А Б 1 В 1

| I 11,0±1,0 I |11,9±0,87 1 |12,8±1 ,43 150,3+15,2 167 ,8±16,4 |166,4±18,3|

1 И 12,3±0,87 112,5±1,3 I 113,4±1,55 I 148,7±13,5 91,2±1 0,2 р <0,001 |97,2±12,4 | I р <0,01 |

1 Ш 10,2±1,35 I |11,3+1,75 I I И0,б±1 ,36 I 110,7±14,7 р3<0,01 57,3±8,7 р <0,001 | р3<0,05 | |71,61+10,2| | р <0,001 |

1 б,6±0,93 I |б,1±5,7 I |5,7±1,01 100,5±9,3 р3<0,01 99,3±8,5 | р3<0,05 | | 75,5±5,1 |

р <0,01 |р <0,001 |р <0,001 р <0,05 р <0,001 | р <0,001 |

| р1 <0,001 <0,001 |р2<0,05 | |р1<0,001 |р2<0,05 | р2<0,01 | р3<0,05 | I Р4<0.05 | | '

Таблица 4

ПЕРЕКИСКОЕ ОНКОШВ® ЖШДСЗ И ШШЮШШОСТЬ ИШВРАИ шттпт У 1Ю80Р0ЗД5ИШХ С СЕПСНООМ

• ПОЛУЧЖИХ РАЗЛИЧНОЕ ЛЕНЕНЖ

М+гя

I-

¡Этапы |обсле-|дования

ДК, мкмолъ/1 № липидов ! Ю, % свечения на 1 мг дипидов

---—[---г—---^

А (п-15) |Б (п-10) |В(п-10)|

Рэ/Рм

~г

А

В

I

II

III

IV

15,7+1,1 14,3+2,3

12,2+1,5

9,5+1,7 р<0,01

15,5+1,5 |19,1+2,3|254,0+16,8|255,0+20,1 12,5+1,7 |16,341.71850,5+21,1 ¡853,5+15,3

I I I

10,1+1,6 113.8И ,41240,9+17,1191,7+17,1 р <0,01 | | | р <0,001 I | I р1 <0,001

I I I рЗ<0,001

11,3+0,98! 8,6+1,3|198,9+12,0|153,2+14,1

р<0.01 1 р<0,001| ! I

р <0,05 р1<0,05 р2<0,05

I р <0,001 | р2<0, 05 ! I

287,8+13,5 174,8+10,6 р <0,01 рЗ<0,01 р4<0,001 164,7+12,3 р <0,001 рЗ<0.01 р4<0,01 165,0+15,2 р <0,001

0,42+0,02 0,41+0,02

0,49+0,01

0,52+0,02 р <0,01 р1<0,01

0,44+0,03 0,49+0,01

0,51+0,01 р <0,01 р1<0,01

0,5210,03 р <0,05

0,45+0,01 0,52+0,02 р <0,01 рЗ<0,01

0,51+0,02 р <0,05

0,62+0,02 р <0,001 р1<0,01 р2<0,01 р3<0,01 р4<0,05

с УФО. Подтверждением этого являются данные экспериментальных и клинических исследований, в которых установлено, что УФО крови в терапевтических дозах не только не стимулирует, но способствует ингибиции процессов ПОЛ, за счет активации ферментов антиоксвдантной защиты: каталазы, глутатионпероксвдазы, судароксадцисмутазы и дерулоплазмина (А.О.Левин с соавт., 1985; В.Г.Аргпохов с соавт., 1992).

ВЫВОДЫ

1. В генезе кислородзависимых патологических состояний, в том числе при сепсисе новорожденных, существенную роль играктг нарушения структуры гемоглобина, выражающиеся в увеличении микровязкости в районе (3-93 БН-группы. Степень повреждения белка соответствует тяжести клинических проявлений патологического процесса.

2. Структурные изменения в молекуле гемоглобина, приводят к нарушению процессов оксигенации. Сродство к кислороду и кооперативный эффект связывания падают, кривая диссоциации кислорода смещается вправо.

3. Кислородная недостаточность у не юровдвнных с сепсисом сопровождается активацией процессов горекисного окисления ли-пидов плазмы и мембран эритроцитов. Динамика показателей пере-кисного окисления липвдов объективно отражает тяжесть течения патологического процесса к может служить прогностическим критерием заболевания.

4.Усиление пероксидации липидов на фоне снижения анти-оксидантной защиты в условиях гипоксии при сепсисе новорожденных приводит к нарушению целостности мембран эритроцитов, изменению жидкокристаллической структуры липидного бислоя, что ■Выявляется в повышении микровязкости и лизисе клеток.

5. Исследования проведенные при гипероксии на экспериментальной модели с ЭКМО жрфузируемой донорской крови позволили установить, что характер именений функциональных свойств гемоглобина и интенсивности процессов перекисного окисления липвдов аналогичен таковому в условиях гипоксии.

6. При использовании экстракорпоральной мембранной оксигенации для коррекции кислородзависимых патологических состояний цэлвсообразным является применение кислородно-воздушной

снеси с Fí02 0,2. Этот ре хин оксиганации позволяет поднять р02 в крови до величины максимального насыщения гемоглобина кислородом, при этом избежать активации перекисного окисления липи-дсв в зритроцитарных мембранах, увеличения прооксидантной активности гемоглобина и лизиса эритроцитов.

7. Применение гемосорбции и, особенно, гемосорбции в сочетании с ультрафиолетовым облучением в комплексной терапии сепсиса новорожденных способствует восстановлению структурно-функциональных свойств гемоглобина и мембран эритроцитов.

ОПИСОК RW4HUX 1РЗГДОЗ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. люкшесцентныя анализ компонентов в системе Н^Ор-лимк-по,:./З.И.1й'дкин, В.В.Внуков/-//Тезисы докл. Всес. коей. "Коли-■чэо :T;3¡a:i'ii люминесцентный анализ многокомпонентных систем био-логичэси; активных веществ". Ташкент, 1982, стр. 51-52

2. Еозможная роль цэрулоплазмкна в адаптации к гипокдш у детей с сепсисом./М.Б.Злочевский, В.В.Зстрин/-//Тезисы докл. Есес. скип. "Стресс, адагггация и функциональные нарушения". "Штиинца", Хшкнев, 1984, стр. 113-113

3. Роль некоторых металлопротеидов в реакции адаптации к гипоксии при сепсисе у детей./-// Сборник научных трудов "Гнойно-септические заболевания новорожденных и детей первого года кизни". Москва, 1985, стр. 91-95

4. Интенсивная терапия новорожденных при инфэкцкон-но-воспалительных заболеваниях./В.В.Эстркн, 0.В.Муравьева/Тезисы докл. XII Есес. съезда детских врачей. Москва, 1988, стр. 284-285

5. Молекулярно-биохимичесюга нарушения в системе зритрона и их коррекция при сопсисэ./В.В.Зстрин, О.В.Муравьев/-//Тезисы докл. VIII съезда детских врачей УССР. Тернополь, 1989, стр. 267-268

6. Этиология, патогенез и интенсивная терапия сепсиса новорожденных. /В. В. Эстрин, О.В.Муравьев, А.А.Синичкин/-// Сборник "Актуальные вопросы заболеваемости новорожденных". Москва, 1990, стр. 110-117

7. Значение мониторинга свободно-радикальных процессов в диагностике и лечении септического шока у новорожденных./В.В.Эстрин, О.В.Муравьев, М.П.Лелик/-//Анест. иреан., 1992, N4. стр. 45-47

8. Структурно-функциональные изменения гемоглобина и возможные пути их коррекции при сепсисе у летев раннего возраста. /-//Тез. докл. I Всероссийского съезда анушеров-гинеко-логов. Челябинск, 1992, стр. 278-279

9. Нарушение равновесия синтетических и катэболических процессов у новорожденных с острой дыхательной недостаточностью и механизмы его восстановления./Н.И.Добренькая/-// Тезисы докл. школы-семинара молодых ученых "Общие вопросы патологии и физиологии". Новосибирск, 1991, стр. 18-19

10.Способ определения тяжести кислородной интоксикации по хемилюминесценции плазмы крови./В.В.Эстрин, В.В.Внуков, С.И.Дудош/-//Рац. предл. N147 РНЖАП от 13.01.84

11.Способ определения индивидуальной чувствительности к токсическому действию ГБО./В.В.Эстрин, В.В.Внуков, С.И.Дуд-кин/-//Рац. предл. N153 РНШАП от 25.04.85

12. Способ определения жизнеспособности недоношенного новорожденного./Т.Н.Погорелова, Н.&.Друккер, А.Ф.Комаров/-//ОБ "Открытия, изобретения",1990, N3, стр.16-16, а.с. N1537219

13. Способ определения индивидуальной чувствительности к гемосорбции при лечении сепсиса у новорожденных./В.В.Эстрин, О.В.Муравьев/-//ОБ"Открытия, изобретен! 1", 1992, N44, стр. 62-62, а.с.N1778701

14.Способ диагностики септического шка./В.В.Эстрин, О.В.Муравьев, М.П.Лелик/-//ОБ "Открытия, изобретения", 1993, N9, стр.253, а.с. N1801209

15.Способ диагностики родовых внутричерепных кровоизлияний у новорожденных./В.В.Эстрин, Е.Я.Каушанская, Т.В.Стеколь-никова/-//заявка N 5003039, приоритетная справка от 2.08.91

16.Способ прогнозирования инфекционных осложнений у новорожденных с острой дыхательной недостаточностью./В.В.Эстрин, Н.И.Добренькая/-//заявка N 5055702, приоритетная справка от 21.07.92