Структурно-функциональное состояние иммуноцитов при их взаимодействии с гуморальными факторами иммунной системы в условиях УФ-облучения

Двурекова, Евгения Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурно-функциональное состояние иммуноцитов при их взаимодействии с гуморальными факторами иммунной системы в условиях УФ-облучения
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональное состояние иммуноцитов при их взаимодействии с гуморальными факторами иммунной системы в условиях УФ-облучения"

На правах рукописи

Двурекова Евгения Александровна

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ИММУНОЦИТОВ ПРИ ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ с ГУМОРАЛЬНЫМИ ФАКТОРАМИ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ В УСЛОВИЯХ УФ-ОБЛ УЧЕНИЯ

Специальность 03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Воронеж - 2005

Работа выполнена в Воронежском государственном университете

Научный руководитель:

доктор биологических наук, заслуженный деятель науки РФ, профессор Артюхов Валерий Григорьевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Попова Татьяна Николаевна

кандидат биологических наук Дмитриев Евгений Владиславович

Ведущая организация:

Воронежская государственная медицинская академия

Защита состоится 28 февраля 2005 г. в 1500 часов на заседании диссертационного совета Д 212.038.03 при Воронежском государственном университете по адресу: 394006, г. Воронеж, Университетская пл., 1, конференцзал.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Воронежского государственного университета.

Автореферат разослан января 2005 года.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Грабович М.Ю.

4S30Ï

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Функционирование иммунной системы контролируется сложной сетью взаимосвязанных информационных сигналов, опосредуемых факторами неспецифического гуморального звена иммунитета. Их продукция и направленное действие на конкретные клетки-мишени определяются сложными молекулярно-клеточными механизмами. Примеров^ тому моясет служить система комплемента, играющая важную роль в нормальной и патологической физиологии человека. Белки комплемента обеспечивают опсонизацию и лизис чужеродных * клеток, участвуя таким образом в формировании иммунного ответа. Связывание активных субфрагментов комплемента со специфическими клеточными рецепторами приводит к локальной модуляции физиологических процессов, координации функциональной активности и кооперации иммуноцитов, что направлено на под-1 держание местного гомеостаза. В то же время, клеточные рецепторы комплемента, например CR 1-рецептор, являются естественными регуляторами активности самого комплемента.

Помимо системы комплемента в процессах иммунорегуляции задействованы и другие факторы гуморального звена иммунитета, в частности, цитокины, обеспечивающие согласованное функционирование различных типов иммуноком-петентных клеток в процессе индукции развития иммунных реакций. Цитокины секретируются многими клетками и представляют собой единую систему регуляции иммунных процессов, процессов воспаления, а также роста, дифференцировки и функциональной активности клеток различной тканевой принадлежности.

Большинство цитокинов обладает плейотропным действием, сопровождающимся модуляцией различных функций, что позволяет рассматривать их как общую систему гомеостатической регуляции клеточной функции, часть сложнейшей цепи взаимосвязанных сигналов, обеспечивающих слаженную работу различных систем в живом организме. Наряду с выполнением специфических функций внутри иммунной системы цитокины формируют сеть коммуникационных сигналов и осуществляют межсистемные связи (A.A. Михайлова, 1992; В Л. Кулинский, Л.С. Колесниченко, 1997). Такой многофакторный контроль функций иммунной системы организма, осуществляемый цитокинами, необходим для повышения надежности и обеспечения вариабельности реакций организма в зависимости от характера агента, вызывающего эти реакции.

В современной медицине для лечения ряда заболеваний используются ре-комбинантные цитокины, в частности фактор некроза опухоли а (Т.Н. Дранник и др., 1994; А.Е. ChernofF et al., 1995; A.A. Останин и др., 1996; ЕА. Варюшина и др., 1998). Его

мощное биологическое влияние на иммуногенез, воспалительные процессы и опухолевые клетки позволяет считать фактор некроза опухоли (ФНОа) многообещающим средством иммунотерапии онкологических, воспалительных, инфекционных и аутоиммунных заболеваний, а также при иммунодефицитах, трансплантации органов и тканей (В.П. Шичкин, 1998).

Несмотря на широкие перспективы использования ФНО в клинике, необходимо решить ряд проблем, связанных с подбором терапевтических концентраций, трудностью прогнозирования и контроля реакции организма на цитокиновую терапию.

Нарушения продукции цитокинов продуцирующими клетками, а также процессов взаимодействия гуморальных факторов со специфическими рецепторами

РОС. НШИСЗДЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА

амСрк

иммуноцитов могут лежать в основе формирования патологии на молекулярно-клеточном уровне. В связи с этим изучение межклеточных и клеточно-гуморальных взаимодействий, опосредуемых различными эффекторными молекулами, может внести существенный вклад в понимание патогенеза и привести к поиску новых способов регуляции и повышения эффективности функционирования отдельных звеньев иммунной системы.

Одним из возможных регуляторов процессов взаимодействия между клеточными и гуморальными факторами иммунитета является УФ-свет. Радом авторов показано, что клеточные и гуморальные компоненты крови, подвергнутые УФ-облучению в физиологических дозах, могут оказывать регулирующее действие на иммунную систему организма в целом. Известно, что УФ-свет индуцирует быстрые структурно-функциональные изменения поверхностных структур имму-нокомпетентных клеток (К.А. Самойлова и др., 1987, 1990, 1991; Е.В. Волгарева и др., 1990; К.А. Samoilova et al., 1996; K.D. Obolenskaya et al., 1998), белков системы комплемента (В.Г. Артюхов и др., 1990, 1993; В.В. Гусинская и др., 1994, 1995а, 1995б), уровня цитокинов (Е.Б. Жибурт и др., 1995; D. Kulms et al., 2001).

Несмотря на большое количество экспериментальных данных, молекулярные механизмы регуляторного действия УФ-света на клеточные и гуморальные компоненты иммунной системы раскрыты недостаточно. Практически не учитывается роль конформационных изменений макромолекул в определении степени фотомодификации сывороточных факторов, в частности отдельных белков системы комплемента. Кроме того, в литературе практически отсутствуют работы, посвященные анализу взаимосвязи структурно-функциональных фотомодификаций иммунокомпетентных клеток крови с процессами их взаимодействия с различными факторами гуморального иммунитета, такими как белки системы комплемента и цитокины. Знания об общих закономерностях и механизмах действия УФ-излучения на клеточные и гуморальные звенья иммунной системы позволят разработать научно-обоснованный теоретический фундамент практического использования УФ-света в медицине.

Представляется интересным также изучение возможности регулирования иммунологических процессов сочетанным действием на компоненты иммунной системы естественных модуляторов физической и химической природы (к примеру, УФ-света и фактора некроза опухоли). В частности, используя различные концентрации ФНОа, являющегося медиатором острой фазы воспаления, можно решить ряд проблем, связанных с повышением эффективности применения метода АУФОК при лечении воспалительных процессов различной степени тяжести.

Изучение механизмов, лежащих в основе регуляторного действия УФ-света и ФНОа на иммунокомпетентные клетки, позволит выявить причины возникновения патогенеза и возможность их применения с целью иммунокоррекции и иммунотерапии.

Цель и задачи диссертационной работы. Целью настоящей работы явилось изучение регуляторного действия УФ-света на структурно-функциональное состояние иммуноцитов (лимфоцитов, макрофагов, нейтрофилов) при их взаимодействии с гуморальными факторами иммунной системы.

В связи с этим перед нами стояли следующие задачи:

1. Изучить влияние УФ-света (240-390 нм, 75,5-2265 Дж/м2) на процесс взаимодействия мембран иммуноцитов (лимфоцитов, макрофагов, нейтрофилов) с С4 фактором системы комплемента;

2. Исследовать структурно-функциональные фотомодификации С4 компонента комплемента;

3. Изучить ФНО-продуцирующую способность Т-лимфоцитов и цитотскси-ческую активность макрофагов в условиях УФ-облучения;

4. Оценить вклад процессов пероксидного фотоокисления липидов в изме-• неняе супероксидцисмутазной и пероксидазной активности фотомодифицирован-

ных лимфоцитов;

5. Выявить влияние сочетанного действия УФ-света и фактора некроза опухоли а на функциональную активность макрофагов.

1 Научная новизна. Работа является комплексным исследованием, посвящен-

ным изучению регуляторного действия УФ-света на функциональную активность иммуноцитов по отношению к С4 фактору системы комплемента и ФНОа.

Впервые изучено влияние УФ-света на взаимодействие мембран иммуноцитов (лимфоцитов, макрофагов, нейтрофилов) с С4 фактором системы комплемента и выявлены основные закономерности, обусловливающие данный процесс. Показано, что структурно-функциональные фотомодификации мембран иммуноцитов обусловлены «кэппинг»-эффектом рецепторов с лигандированным С4 фактором комплемента. Разработана схема УФ-индуцированных структурно-функциональных изменений С4 компонента комплемента.

Выявлено иммунокоррегирующие действие УФ-света на уровень продукции фактора некроза опухоли а Т-лимфоцитами, конечный эффект которого определяется исходной концентрацией цитокина и дозой УФ-света. Обнаружена взаимосвязь ФНО-продуцирующей способности лимфоцитов и цитотоксической активности макрофагов с уровнем генерации активных форм кислорода. Исследовано влияние процессов пероксидного фотоокисления липидов на уровень каталитической активности связанной с мембранами лимфоцитов пероксидазы.

Установлено, что УФ-свет и фактор некроза опухоли а оказывают регуля-торное действие на фагоцитарную активность макрофагов. Обсуждается вклад различных процессов (пероксидного фотоокисления липидов, активности НАДФН-оксидазы и супероксиддисмутазы, состояния CR1 клеточного рецептора) в изменение функционального потенциала фото- и ФНО-модифицированных макрофагов.

Практическая значимость. Научные положения диссертационной работы расширяют и углубляют современные представления о молекулярно-клеточном механизме регуляторного действия УФ-света на отдельные звенья иммунной системы.

Фотоиндуцироваяные изменения структурно-функциональных свойств мембран иммуноцитов и отдельных компонентов комплемента необходимо учитывать при обсуждении вопросов, касающихся выяснения механизмов действия УФ-света на молекулярно-клеточном уровне. Полученные экспериментальные данные позволяют выявить общие закономерности регуляторного действия УФ-света на процесс взаимодействия мембран иммуноцитов (лимфоцитов, макрофагов, нейтрофилов) с С4 фактором комплемента.

Эксперименты с использованием фактора некроза опухоли а позволяют разработать новые подходы к иммунокоррекдии патологических состояний организма при проведении фармакотерапии и определить возможность применения метода АУФОК на различных стадиях воспалительного процесса с целью повышения эффективности его использования.

Предложенная схема регуляторного действия УФ-света и ФНОа на функциональные свойства макрофагов может быть полезна для понимания молекулярных механизмов иммунокоррегирующего действия метода АУФОК.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Всероссийском симпозиуме «Клеточная биология на пороге XXI века» (СПб., 2000); IV Съезде по проблемам радиационной биологии (Москва, 2001); Ш Съезде фотобиологов России (Воронеж, 2001); ХУНТ съезде физиологического общества им. И. П. Павлова (Казань, 2001); УТИ международной конференции по химии и физико-химии олигомеров «0лигомеры-2002» (Черноголовка, 2002); IV международной конференции «Циклы природы и общества» (Ставрополь, 2002); УП Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2003); Ш и IV международном симпозиуме «Механизмы действия сверхмалых доз» (Москва, 2002; СПб., 2003); Научной сессии сотрудников Воронежского госуниверситета (Воронеж, 2002; 2003,2004).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи и 8 тезисов, в том числе 3 Статьи в реферируемых изданиях.

На зяпрцту выносятся следующие положения:

1. УФ-свет (240-390 нм) в дозах 75,5-2265 Дж/м2 индуцирует снижение ан-тителосвязывающей способности С4 компонента комплемента в системе из взаимодействующих иммуноциггов и белков системы комплемента, обусловленное как структурно-функциональными фотомодификациями клеточных мембран, так и процессами, протекающими в сыворотке крови.

2. УФ-индуцированные структурные модификации белка С4 связаны с процессом разворачивания белковой молекулы, сопровождающимся увеличением числа ароматических аминокислот и ионогенных групп на поверхности белковой молекулы.

3. УФ-излучение в дозах 75,5-2265 Дж/м2 оказывает коррегирующее действие на ФНО-продуцирующую способность Т-лимфоцитов, эффект которого в значительной степени определяется исходной концентрацией цитокина, уровнем генерации активных форм кислорода и дозой УФ-света.

4. Интенсификация процессов пероксидного окисления липидов на мембранах фотомодифицированных лимфоцитов способствует повышению их суперок-сиддисмутазной и пероксидазной активности, а также снижению каталитической активности связанной с клетками экзогенной пероксидазы.

5. УФ-излучение в дозах 75,5-2265 Дж/м вызывает разнонаправленные эффекты в отношении цитотоксической и фагоцитарной активности макрофагов. Со-четанное действие УФ-света и фактора некроза опухоли а оказывает модулирующий эффект на функциональное состояние макрофагов.

6. Схема возможных регуляторных процессов, протекающих при сочетан-ном действии УФ-света и фактора некроза опухоли а на функциональную активность макрофагов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа включает 208 страниц машинописного текста, 24 таблицы, 42 рисунка. Состоит из «Введения», семи глав, «Заключения», «Выводов» и «Приложения». Список литературы содержит 287 работ, из них 139 отечественных и 148 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА 1. Клетки иммунной системы, их роль в регуляции иммунологических реакций

В главе приведены современные сведения о морфологических и функциональных особенностях иммуноцитов (лимфоцитов, нейтрофилов, макрофагов), структуре и биологической роли ряда рецепторов (рецепторы к факторам комплемента, цитокинам, Fc-рецепторы). Дана характеристика ФНОа, рассмотрены механизмы его действия на различные клепай и участие в регуляции физиологических процессов в организме. Проведен анализ литературных данных об УФ-индуцированных изменениях структурного и функционального состояния иммуноцитов.

ГЛАВА 2. Система комплемента: особенности строения, функционирования и регуляции активности С4 компонента

В главе представлен обзор основных работ, посвященных системе комплемента, анализу строения и функциям С4 компонента, механизмам его активации, регуляции, биологическому и клиническому значению.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ГЛАВА 3. Объекты и методы исследования

Объектами исследования явились иммуноциты крови человека (лимфоциты, нейтрофилы), перитонеальные макрофаги мыши, а также С4 белок системы комплемента. Выделение лимфоцитов из периферической крови осуществляли путем центрифугирования на градиенте плотности фиколл-урографина (1,077 г/мл) по методу A Boyum; нейтрофилы выделяли на двойном градиенте плотности фиколл-урографина (1,077 и 1,119 г/мл). Разделение суспензии лимфоцитов на Т-клетки проводили на колонках с синтетической ватой по методу P. Terasaki (Ю.М. Зарецкая, 1983). Макрофаги выделяли из перитонеальной жидкости мышей-самцов линии SHK, В качестве источника С4 белка системы комплемента выступала сыворотка крови человека или мыши.

УФ-облучение образцов проводили в стеклянной термостатируемой (20 °С) кювете при постоянном перемешивании с помощью ртутно-кварцевой лампы ДРТ-400 через светофильтр УФС-1 с полосой пропускания в области 240-390 им. Интенсивность излучения - 151 Дж/м2. Дозы облучения лимфоцитов, нейтрофилов, сыворотки крови человека и буферных растворов белка С4 (10"6 моль/л) составили 75,5; 755 и 2265 Дж/м2, макрофагов и мышиной сыворотки - 75,5; 453 и 755 Дж/м2.

Изучение сорбционных свойств мембран иммуноцитов проводили на примере связывания антител к С4 компоненту комплемента, используя твердофазный неконкурентный иммуноферментный анализ (ИФА) и метод прямой иммунофлуо-ресценции. Функциональную активность С4 исследовали методом гемолитического титрования (Л.В. Козлов и др., 1982).

Регистрацию ИК-спектров белка С4 осуществляли на спектрофотометре 5РЕСОЫЗ М-80 в диапазоне 1800-800 см-1. Образцы готовили методом прессования таблеток с избытком КВг. Электронные спектры поглощения С4 снимали на спектрофотометре СФ-46 в диапазоне длин волн 240-300 нм.

Элекрофоретические характеристики С4 исследовали методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле (Г. Маурер, 1971). В эксперименте использовали ТРИС-глициновую буферную систему (рН 8,3); 5,5 %-ный концентрирующий и 7 %-ный разделяющий гели.

Кислотно-основное титрование буферных растворов белка С4 (10"6 моль/л) осуществляли капельным методом с помощью рН-метра У628. В качестве титрующих жидкостей использовали 0,01 н растворы НС1 и КОН.

Концентрацию ФНОа в лизатах Т-лимфоцитов определяли с помощью ИФА-тест-системы на основе антител к ФНОа (производство ООО «Протеиновый контур», СПб.).

Об уровне процессов пероксидного фотоокисления липидов на клеточных мембранах судили по концентрации ТБК-активных продуктов (Ю.А. Владимиров, А.Н. Арчаков, 1972), а также по интенсивности спонтанной хемшпоминесценции (ХЛ) иммуноцитов в присутствии люминола (Ю.А. Владимиров, А .Я. Потапенко, 1989). Измерение ХЛ проводили на биохемилюминометре БХЛ-06 М.

Определение ферментативной активности свободной и связанной с лимфоцитами пероксидазы проводили с помощью твердофазного ИФА, а также спек-трофотометрически по реакции окисления о-фенилендиамина (ОРВ) в присутствии пероксида водорода (А.М. Егоров и др., 1991). Величину оптической плотности продукта реакции измеряли при 1=492 нм на вертикальном фотометре АИФР-01 «Униплан».

СОД-активность иммуноцитов исследовали по изменению интенсивности фотоиндуцированной, опосредованной супероксидными анион-радикалами ХЛ при окислении люминола (Л.Т. Рязанцева и др., 2001).

Цитотоксическую активность макрофагов определяли по отношению к опухолевым клеткам-мишеням линии Ь-929.

Жизнеспособность макрофагов определяли по стандартной методике с использованием красителя трипанового голубого (Д. Клаус, 1990). Фагоцитарную активность макрофагов изучали с помощью люминолзависимой ХЛ, используя в качестве стимулятора фагоцитоза латекс (ЮЛ Владимиров, А .Я. Потапенко,1989).

Статистическую обработку результатов экспериментов проводили с помощью пакета статистических программ «Бш^арЬкв». Достоверность отличий контрольных и экспериментальных результатов оценивали при помощи ^-критерия Стьюдента.

ГЛАВА 4. Влияние УФ-света на процесс взаимодействия С4 фактора системы комплемента с мембранами иммуноцитов

Для исследования механизмов действия УФ-света на процесс взаимодействия С4 фактора системы комплемента с мембранами иммуноцитов (лимфоцитов, макрофагов, нейтрофилов) была разработана следующая схема ИФА-тестов на основе оценки антителосвязывающей способности сывороточного и мембраносвя-занного белка С4:

1+АЧС4>Р11

1+С+А^С4)-РЬ

1+С+А1(С4)-РЬ

(1+С)*+А1(С4)-РЬ

1*+ОА1(С4)-РЬ 1+С+А«С4)-РЬ

С*+А1(С4)-РЬ

1+С*+А1(С4)-РЬ

где жирный шрифт - контрольная система, нормальный шрифт - опытная система; I - иммуяоциты (лимфоциты -макрофаги - М: нейтрофилы -С - сыворотка крови (источник С4);

Аг(С4)-РЬ - конъюгат пероксидазы хрена с антителами к С4 компоненту комплемента; * - УФ-облученный компонент ИФА-системы

Полученные данные (рис. 1) свидетельствуют о том, что после УФО в дозах 75,5; 755 и 2265 Дж/м2 лимфоцитов (2105 клеток/мл) и сыворотки (титр 1:16) (см. схему (1)) регистрировалось падение оптической плотности детектируемого продукта реакции (окисленной формы ОРЦ) по отношению к необлученной системе. Аналогичными ответными реакциями характеризовались и системы (М+С)*+А1 (С4)-РЬ и (№С)*-А1 (С4)-РЬ, где УФ-облученные макрофаги (2105 клеток/мл) и нейтрофилы (10" клеток/мл) взаимодействовали с фотомодифицированной сывороткой. Наблюдаемые эффекты уменьш ения антителосвязывающей способности С4 в указанных ИФА-системах могут быть следствием снижения количества С4 компонента в УФ-облученной сыворотке и на мембранах УФ-облученных имму-ноцитов или в одном из этих компонентов. В связи с этим были проведены эксперименты по изучению фотомодификаций мембран иммуноцитов (см. схему (2)) и сывороточного С4 (см. схему (4)).

Рис 1 УФ-индуцированные изменения антителосвязывающей способности сывороточного и мембраносвязанного С4

■ система (Ь+С)*+А^С4>РЬ; | | - система Ь*+С+А1(С4)-РЬ, Щ - система Ь+С*+А1(С4)-РЬ

Здесь и на рис. 2. 4 <1 ср - средняя разность между значениями ИФА-сигна-ла опытных и контрольных образцов

75,5

2265 Дж/м

УФО (75,5—2265 Дж/м2) лимфоцитов индуцирует возрастание П492 в системе Ь*+А1(С4)-Р11 (рис. 2), обусловленное увеличением числа сорбированных на их мембранах антител к С4 компоненту. УФО макрофагов (75,5 и 453 Дж/м2) и ней-трофюгов (75,5-^2265 Дж/м2) приводит к аналогичным ответным реакциям. При УФ-облучении макрофагов в дозе 755 Дж/м2 достоверного изменения оптической плотности не регистрировалось. Наблюдаемые изменения связаны, по всей видимости, со структурными фотомодификациями клеточных мембран.

ср. 0,15 0,10 0,05 0

* Г*1 Т Г*!

Рис. 2. УФ-индуцированные изменения антителосвязывающей способности мембраносвязанного С4 в системе Ь*+А1(С4>РЬ

75,5 755 2265 Дж/м2

С помощью иммунофлуоресцентного анализа показано, что структурные фотомодификации иммуноцитов проявляются в виде «кэппинг»-эффекта, причем с ростом дозы УФО наблюдается увеличение общего числа кэппирующих клеток. Преобладающим типом распределения флуоресцирующих комплексов на поверхности лимфоцитов при действии УФ-света в дозах 75,5 и 755 Дж/м2 является «кэп '/*» (табл. 1). При УФО макрофагов в дозах 75,5 и 453 Дж/м2 преобладающим типом распределения флуоресцирующих комплексов является «кэп 'Л», при максимальной (755 Дж/м2) - амебовидный.

Таблица 1

Количество (%) »кэппирующих» лимфоцитов в условиях УФ-облучения

Доза УФО, Дж/м2 Типы распределения флуоресцирующих комплексов

« некэшшрующие» клетки «кэхширующие» клетки

краевой «кэп Уз» «кэп У*» | амебовидный

0 99% 1 %

75,5 72% 18% 10% -

755 53% 14% 26% 7%

2265 22% 16% 38% 24%

Иммобилизация нативной сыворотки на мембраны УФ-облученных в дозе 75,5 Дж/м2 лимфоцитов не приводит к изменению Т)^. При увеличении дозы

УФО до 755 и 2265 Дж/м2 наблюдалось последовательное снижение ИФА-сигнала в системе L*+C+At(C4)-Ph (см. схему (3), рис. 1). Таким образом, добавление к фотомодифицированным лимфоцитам нативной сыворотки, содержащей С4 компонент комплемента, ведет к «снятию» «кэппинг»-эффекга на поверхности лим-фоцитарных мембран. Ответные реакции на действие УФ-света в системах M*+C+At(C4)-Ph й N*+C+At(C4)-Ph имеют обратную направленность, то есть, УФ-облученные мембраны фагоцитов способны сорбировать на своей поверхности некоторое количество С4 из нативной сыворотки.

С помощью гемолитического титрования и ИФА выявлено, что УФ-свет в дозах 75,5 и 755 Дж/м2 приводит к фотоактивации С4, сопровождающейся его расщеплением на активные по отношению к комплементарному каскаду субфрагменты -С4а и С4Ь, о чем свидетельствует увеличение гемолитической активности С4 (рис. 3) и уменьшение D492 в системе C*+At(C4)-Ph (рис. 4) вследствие образования низкоаффинных к С4-антителам субфрашентов. УФО в максимальной дозе (2265 Дж/м2) индуцировало снижение ИФА-сигнала в системе C*+At(C4)-Ph и гемолитической активности белка С4, что, по всей видимости, связано или с расщеплением С4 сывороточными ингибиторами до неактивных С4с и C4d-субфрагментов, или же с деструктивными изменениями самой молекулы С4.

ГА 6

2 -

75,5

755

2265

Дж/м

ср.

-0,05 -0.10 -0,15

75,5

755

2265

Дж/м

Рис 3 Изменение функциональной Рис. 4. УФ-индуцированные изменения

активности белка С4 после УФ-облучения антитело связывающей способности С4 ГА - гемолитическая активность, усл. ед сыворотки крови в системе

С*+А1(С4)-РЬ

Аналогичными ответными реакциями на действие УФ-света характеризуются системы 1Х:*+Аг(С4)-Р1г (см схему (5), рис. 1), М+С*+А1(С4)-РЬ и К+С*+А^С4)-РЬ. Таким образом, в основе фотомодификаций вышеуказанных систем лежат сходные механизмы, касающиеся самого фактора С4 и процессов его расщепления: при малых доза* УФО на субфрагменты С4а и С4Ь с последующим

взаимодействием С4Ь-субфрагмента с поверхностью лимфоцитов, а при больших дозах (2265 Дж/м2) с фотоактивацией сывороточных ингибиторов.

Следовательно, эффект усиливающегося с ростом дозы УФ-света снижения антителосвязывающей способности С4 в системе из взаимодействующих УФ-облученных компонентов - мембран лимфоцитов и белков системы комплемента (см. схему (1), рис. 1) - является суммарным и определяется структурно-функциональными фотомодификациями как клеточных мембран, так и процессами, протекающими в сыворотке крови, при преобладающем вкладе последних.

ГЛАВА 5. Анализ УФ-ицдуцированных структурных модификаций С4 белка системы комплемента

С целью проведения анализа структурных модификаций белка С4 были зарегистрированы его дифференциальные ИК-спектры (1800-800 см -1).

Нативная молекула С4 характеризовалась преобладанием неупорядоченной структуры (53±5 %) над а- и Р-структурами (27±5 % и 20±5 % соответственно). Достоверных изменений в соотношении типов П структуры белка С4 после его УФ-облучения не выявлено.

УФ-свет в диапазоне доз 75,5-2265 Дж/м2 индуцирует увеличение оптической плотности буферных растворов белка С4 в области максимума (278 нм), что свидетельствуют о его структурных фотомодификациях, по-видимому, связанных с разворачиванием белковой глобулы и возрастанием на ее поверхности ранее скрытых (нетестируемых) в нативном белке хромофоров УФ-света.

С помощью электрофореза в ПААГ выделена одна фракция нативного белка С4 шириной 4,0 ± 0,2 мм. При УФО в диапазоне доз 75,5-2265 Дж/м2 буферных растворов белка количество и ширина белковых фракций, а также значение свето-поглощения полосы оставалось постоянным. УФ-свет в дозах 755 и 2265 Дж/м 2 приводит к увеличению электрофоретической подвижности белка С4, что, по всей видимости, обусловлено изменением зарядового состояния молекулы С4 вследствие разворачивания белковой молекулы и изменения соотношения положительно и отрицательно заряженных ионогенных групп на ее поверхности (табл. 2).

Таблица 2

Электрофоретические характеристики нативного и фотомодифицированного

белка С4

Доза УФО, Дж/м'1 Ширина фракции белка, мм Электрофоретическая подвижность

0 4,0±0,2 0,64±0,02

75,5 4,3±0,5 0,68±0.03

755 4,4±0,3 0,70±0,02*

2265 4,6±0,5 0,76±0,04*

Примечание: здесь и в табл. 3 и 4 * - достоверное отличие от контроля (р<0,05)

УФ-облучение белка С4 в диапазоне доз 75,5—2265 Дж/м2 приводит к повышению его кислотной буферной емкости на 10,75; 19,35 и 30,1 % соответственно, что обусловлено увеличением на поверхности белковой молекулы остатков аспа-рагиновой и глутаминовой аминокислот, и к уменьшению на 8,4 % основной буферной емкости при дозе УФО 755 Дж/м2 (рис. 5).

хЮ"4

Рис 5. Изменение кислотной и основной буферной емкости растворов белка С4 после УФ-облучения

| | - кислотная буферная емкость,

- основная буферная емкость;

Здесь и на рис 9 * - достоверное отличие от контроля

2265 Дж/м

На основании полученных данных по ЮС- и УФ-спектрофотометрии, электрофореза в ПААГ, кислотно-основного и гемолитического титрования предложена схема возможных структурных фотомодификаций белка С4 (рис. 6).

ГЛАВА 6. Влияние УФ-света иа некоторые функциональные свойства лимфоцитов крови человека

Нами проведено исследование влияния УФ-света (75,5+2265 Дж/м2) на ФНО-продуцирующую способность Т-лимфоцитов крови человека. По исходной концентрации ФНОа в лизатах нативных Т-лимфоцитов, исходному значению максимальной интенсивности спонтанной ХЛ (1пих) лимфоцитов и направленности ответных реакций на действие УФО нами были выделены три группы доноров.

Выявлено, что УФ-свет (75,5+2265 Дж/м2) индуцирует повышение исходно низкой и средней и подавление исходно высокой ФНО-продуцирующей способности Т-лимфоцитов (рис. 7). УФО лимфоцитов в вышеуказанных дозах приводит к повышению интенсивности их ХЛ у всех групп доноров (рис. 8), что является следствием интенсификации процессов ПФОЛ. Обнаружена корреляционная зависимость (г ср = -0,844) между уровнем АФК и концентрацией ФНОа у доноров с исходно высокой цитокина. Таким образом, повышение концентрации ФНО у доноров с исходно низким и средним значением таковой определяется в первую очередь увеличением синтезирующей способности лимфоцитов; роль АФК в данном процессе, по всей видимости, незначительна. Подавление высокой ФНО-продуцирующей способности Т-лимфоцитов под действием УФ-света преимущественно обусловлено увеличением уровня АФК.

Исходное структурное состояние молекулы С4 Иу

поглощение энергии УФ-света преимущественно остатками ароматических аминокислот и -в-Б- связями цистина

структурные изменения, не затрагивающие соотношение типов П структуры

изменение числа ионогенных групп, а также ароматических аминокислот на поверхности белковой молекулы

75,5 Дж/м2

755 Дж/м2

2265 Дж/м2

увеличение числа ароматических аминокислот » на 4,3 %, кислых ионогенных групп * на 10,75 %, основных ионогенных групп, тирозина и гистидина » на 3,7%

увеличение числа ароматических аминокислот » на 10 %, кислых ионогенных групп ® на 19,35 %, уменьшение основных ионогенных групп, тирозина и гистидина ж на 8,4 %

повышение функциональной активности белка С4, обусловленное его расщеплением на активные по отношению к комплементарному каскаду С4Ь-субфрагменты

^ на 0,6 ед. ГА фотоактивация С4

на 1,5 ед. ГА

фотоактивация С4

увеличение числа ароматических аминокислот »

на 20,4 %, кислых ионогенных групп » на 30,1 %, основных ионогенных групп, тирозина и гистидина « на 2,8%

снижение функциональной активности С4, обусловленное деструктивными фотомодификациями белковой молекулы ^ на 1,0 ед. ГА

фотоинактивация С4

Рис. 6. Схема структурно-функциональных фотомодификаций белка С4

ГА - гемолитическая активность

С помощью теста на определение ТБК-активных продуктов (ТБК-АП) показано, что УФ-облучение в интервале доз 75,5-:-2265 Дж/м2 лимфоцитов генерирует протекание в них в течение трех часов пострадиационного периода темпового окисления липидов. При этом максимальное накопление ТБК-АП регистрируется в первый час после воздействия УФ-света в дозах 755 и 2265 Дж/м2.

С целью выяснения роли ферментативных антиоксидантов в процессах фотомодификации иммуноцитов нами проведены эксперименты по изучению перок-сидазной и супероксиддисмутазной активности лимфоцитов.

С помощью ИФА и спектрофотометрического метода выявлено, что УФ-облучение лимфоцитов в дозах 75,5 и 2265 Дж/м2 приводит к повышению их пе-роксидазной активности, что является, по всей видимости, следствием интенсификации процессов ПФОЛ. Показана способность нативных и фотомодифицирова-ных лимфоцитов сорбировать на своей поверхности экзогенную перокеидазу. При

этом регистрируется снижение каталитической активности иммобилизованного-фермента на 20,3-29,2 % (табл. 3).

Таблица 3

Активность (%) ассоциированной с лимфоцитами пероксидазы

Доза, Дж/м2 Метод ИФА Спектрофотометрический метод

свободная пероксидаза ассоциированная пероксидаза свободная пероксидаза ассоциированная пероксидаза

0 не определяется 100±5,3 (контроль) 100±2,2 (контроль) 75,4±2,5*

75,5 и 71,1±б,0* 75,6±ЗД*

755 4« 72,8±9,4* 79,7±2,7*

2265 _ Ч _ 63,8±8,3*

Показано, что УФО лимфоцитов в дозах 755 и 2265 Дж/м2 индуцирует повышение их СОД-активности на 59,5 и 98,5 % соответственно.

[ФИО], пкг/мл

400 _

1шах,мВ

300

200 _

100 _

75,5 755

2265 , 2 Дж/м

75,5 755 2265

Дж/м

Рис 7 Концентрация ФНО в дизатах Рис 8 Хемилюминесценгные свойства нативных и фотомодифицированных нативных и фотомодифицированных Т-лимфоцитов лимфоцитов

Здесь и на рис. 8

-1 группа доноров; 1_I - II группа доноров,

- III группа доноров

ГЛАВА 7. Исследование сочетанного действия УФ-света и фактора некроза опухоли а на функциональную активность макрофагов

В ходе работы было исследовано влияние УФ-излучения на цитотоксиче-скую активность (по отношению к опухолевым клеткам линии Ь-929) макрофагов. УФ-свет в дозах 75,5 и 453 Дж/м2 оказывает активирующее действие на цитоток-сичность макрофагов и на их способность лизировать опухолевые клетки. Дальнейшее увеличение дозы УФО (755 Дж/м2) индуцировало снижение регистрируемого параметра фагоцитов до нативного уровня.

Выявлено, что УФ-свет (75,5-5-755 Дж/м2) приводит к последовательному увеличению уровня спонтанной ХЛ макрофагов, связанному, по всей видимости, с повышением концентрации АФК вследствие интенсификации процессов ПФОЛ на мембранах фотомодифицированных клеток. ФНОа (40-1000 пкг/мл) не оказывает влияния на генерацию АФК и интенсивность процессов ПФОЛ на мембранах на-тивных и фотомодифицированных макрофагов, нестимулированных к фагоцитозу.

Показано, что УФ-свет в дозах 453 и 755 Дж/м , ФНОа б высоких концентрациях (500 и 1000 пкг/мл), а также его сочетанное действие с УФО (75,5-^-755 Дж/м2) вызывают снижение количества жизнеспособных макрофагов, по всей видимости, за счет дестабилизации мембранных структур УФ- и цитокинмодифиии-ро ванных клеток.

При стимуляции макрофагов латексом выявлено, что ФНОа в диапазоне концентраций 40-1000 пкг/мл выступает в качестве регулятора их фагоцитарной активности. Максимальный эффект активации макрофагов наблюдается при 40 пкг/мл и с увеличением концентрации ФНОа (до 200 и 500 пкг/мл) становится менее выраженным. Цитокин в концентрации 1000 пкг/мл приводит к резкому снижению функциональной активности макрофагов (рис. 9).

УФ-свет в дозах 75,5 и 453 Дж/м2 индуцирует повышение функционального потенциала макрофагов, обусловленное преимущественно активацией НАДФН-оксидазного комплекса (Г.И. Клебанов и др., 2001). Максимальная доза УФ-света (755 Дж/м2) приводит к замедлению процесса фагоцитоза.

Сочетанное действие УФ-света и ФНОа также носит разнонаправленный характер, зависит от дозы УФО и в большей степени от концентрации цитокина. УФ-свет (75,5 и 755 Дж/м2) и ФНОа в концентрации 40 пкг/мл оказывают стимулирующее действие на функциональный потенциал макрофагов. Повышение концентрации цитокина до 200 и 500 пкг/мл индуцирует снижение фагоцитарной активности фотомодифицированных макрофагов (рис. 10). Максимальный эффект снижения функциональной активности макрофагов наиболее выражен при совместном действии УФ-света в диапазоне доз 75,5-755 Дж/м2 и цитокина в концентрации 1000 пкг/мл.

ФНОа в концентрациях 40 и 200 пкг/мл приводит к повышению антитело-связывающей способности С4 на поверхности нативных макрофагов вследствие увеличения его аффинности (И.А. Щепеткин и др., 1994). Аналогичный эффект наблюдается при действии УФ-света в малых дозах (75,5 и 453 Дж/м2).

При сочетанием действии ФНОа (40-500 пкг/мл) усиливает фотоактивацию С4 на поверхности макрофагов. ФНОа в высокой концентрации (1000 пкг/мл) и УФ-свет снижают антителосвязывающую способность С4.

I, мВ

1шах, мВ

Рис 9 Влияние ФНО на хемилюми-несцентный ответ макрофагов

1 - ХЛ ответ немодифииированных клеток;

2 - ФНО в концентрации 40 пкг/мл,

3 - 200 пкг/мл,

4 - 500 пкг/мл,

5 - 1000 пкг/мл

Рис 10. Изменение стимулированной ХЛ макрофагов, модифицированных ФНО в концентрациях 40 и 200 пкг/мл

ДНИ - в отсутствие ФНО; | | - ФНО в концентрации 40 пкг/мл; ^^Н - 200 пкг/мл

Показано, что УФО в дозах 75,5; 453 и 755 Дж/м приводило к повышению СОД-активности макрофагов (табл. $).

Цитокин в концентрациях 40 и 200 пкг/мл индуцировал повышение СОД-активности макрофагов, обусловленное, по всей видимости, усилением генерации и накоплением АФК вследствие увеличения их фагоцитарной активности (табл. Ц.

Таблица Ъ/

Влияние сочетанного действия УФ-света и ФНОа на СОД-активность

Концентрация цитокина, пкг/мл Доза УФО, Дж/м2

0 75,5 453 755

- 65,4 ± 4,6 73,2 ± 1,2* 73,9 ±2,1* 75,5 ± 2,2*

40 74,5 ± 1,8** 79,4 ± 1,9 75,6 ±4,4 77,7 ± 4,0

200 72,6 ± 2,5** 75,7 ± 3,2* 77,7 ±2,4* 77,3 ± 2,8*

500 67,5 ± 1,4 74,5 ± 2,4* 76,4 ± 2,3* 77,4 ±2,8*

1000 67,9 ± 1,6 75,5 ±2,1* 76,9 ± 3,5* 78,3 ±3,2*

Примечание. * - ^гличие по сравнению с контролем (необлученной системой) достоверно; ** - отличпе от контроля (немодифицированной системы) достоверно, р<0,05

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С помощью методов иммуноферментного анализа, иммунофлуоресценции, УФ- и ИК-спектрофотометрии, кислотно-основного и гемолитического титрования, электрофореза в полиакриламидном геле, люмияолзависимой хемилюминес-ценции, определения ТБК-акгивных продуктов, цитотоксической активности и жизнеспособности макрофагов и определения каталитической активности ферментов антиоксидантной системы (свободной и ассоциированной пероксидазы, супер-оксиддисмутазы) изучено действие УФ-света (240-390 нм, 75,5-^2265 Дж/м2) на структурно-функциональное состояние иммуноцитов при их взаимодействии с гуморальными факторами иммунной системы.

Для исследования механизмов действия УФ-излучения на структурно-функциональное состояние мембран иммуноцитов (лимфоцитов, макрофагов, ней-трофилов) и С4 компонента комплемента, функционирующих отдельно и в комплексе друг с другом, была разработана схема ИФА-тестов на основе оценки анти-телосвязывающей способности сывороточного и мембраносвязанного белка С4.

Показано, что эффеет усиливающегося с ростом дозы УФ-света снижения антителосвязывающей способности С4 в системе из взаимодействующих УФ-облученных компонентов (мембран иммуноцитов и белков системы комплемента) является суммарным и определяется структурно-функциональными фотомодификациями как клеточных мембран, так и процессами, протекающими в сыворотке крови, при преобладающем вкладе последних.

Установлено, что структурно-функциональные фотомодификации мембран иммуноцитов проявляются в виде «кэппииг»-эффекта с образованием рецептор-ных кластеров с лигандированным С4 фактором комплемента. Преобладание распределения флуоресцирующих комплексов ьа УФ-облученных лимфоцитах (755 и 2265 Дж/м2) и макрофагах (453 Дж/м2) по «кэп Vi и '/«»-типу приводит к повышению антителосвязывающей способности лигандированного С4, и, как следствие, к возрастанию адгезивных свойств иммуноцитов. При УФО макрофагов в дозе 755 Дж/м2 наблюдается увеличение процента клеток с амебовидным «кэпом», сопровождающимся, по всей видимости, шеддингом рецепторов с лигандированным С4 и снижением антителосвязывающей способности мембраносвязанного С4. Таким образом, изменение числа и локализации рецепторов с лигандированным С4 компонентом комплемента лежит в основе механизма регуляции рецепторных, адгезивных, сорбционных и т. д. свойств иммуноцитов.

Функциональную активность фотомодифицированного С4 фактора системы комплемента исследовали с помощью метода гемолитического тигрования и ИФА. Выявленный эффект активации белка С4 УФ-светом в дозах 75,5 и 755 Дж/м2 можно объяснить облегчением процесса расщепления его молекул на функционально активные С4а и С4Ь-субфрагменты. Показано, что образующийся в результате фотоакгивации С4Ъ участвует в формировании кластеров на поверхности клеточных мембран иммуноцитов, экранирующих мембраносвязанный С4. Связывание С4Ь субфрагмента с клеточными мембранами может активировать специфические реакции иммуноцитов, например, фагоцитарную активность макрофагов и нейтрофилов, активацию В-лимфоцитов. Максимальная доза УФО (2265 Дж/м2) приводит, по всей видимости, к активации сывороточных ингибиторов, расщепляющих С4 на неактивные для комплементарного каскада субфрагменты. Таким

образом, путем изменения доз УФ-облучения компонентов крови можно регулировать процессы взаимодействия мембран иммуноцитов с отдельными факторами системы сывороточного комплемента.

Методами УФ- и ИК-спектрофотометрии, кислотно-основного титрования, а также электрофореза в полиакриламидном геле выявлены УФ-индуцированные структурные модификации белка С4 системы комплемента. Установлено, что УФ-свет в дозах 75,5 и 755 Дж/м2 вызывает разворачивание белковой глобулы С4, не затрагивающее соотношение типов П структуры, но сопровождающееся экспонированием новых остатков ароматических аминокислот (тирозина, триптофана, фе-нилаланина) и ионогенных групп (глутаминовой и аспарагиновой аминокислот, лизина, цистеина) на ее поверхности. УФО в максимальной дозе (2265 Дж/м2) индуцирует значительное увеличение числа функциональных групп на поверхности белковой молекулы, что свидетельствует о значительных конформационных перестройках, проявляющихся в разворачивании и разрыхлении молекулы С4.

Выявлено коррегирующее действие УФ-излучения по отношению к ФНО-продуцируюшей способности Т-лимфоцитов, конечный эффект которого определяется в першую очередь исходной концентрацией цитокина, уровнем генерации АФК в клетках и дозой УФ-света. Показано, что повышение исходно низкой ФНО-продуцирующей способности Т-лимфоцитов в условиях УФО в незначительной степени зависит от концентрации АФК и обусловлено, по всей видимости, интенсификацией синтеза цитокина. Подавление исходно высокой ФНО-продуцирующей способности Т-лимфоцитов под действием УФ-света определяется в основном увеличением уровня АФК.

С помощью метода определения ТБК-активных продуктов, спектрофото-метрического метода и ИФА исследовано влияние процессов ПФОЛ на функциональное состояние ферментных систем лимфоцитов. Показано, что с ростом дозы УФ-облучения имеет место интенсификация процессов пероксидного фотоокисления липидов на мембранах лимфоцитов, сопровождающаяся увеличением их су-пероксиддисмутазной и пероксидазной активности, а также способности сорбировать экзогенную пероксидазу. Ассоциация пероксидазы с нативными и УФ-облученными лимфоцитами приводит к падению ее каталитической активности. Выявленный нами эффект фотоактивации СОД- и пероксидазной активности лимфоцитов может свидетельствовать о высоком функциональном резерве ферментов антиоксидантной системы и явиться причиной относительной стабильности мембран лимфоцитов при действии УФ-света в высоких дозах (2265 Дж/м2).

Установлено, что УФ-свет (75,5—755 Дж/м2) индуцирует увеличение уровня АФК, а, следовательно, и интенсификацию процессов ПФОЛ на поверхности макрофагов. Повышение уровня АФК при УФ-облучении фагоцитов в дозах 75,5 и 453 Дж/м2 индуцирует увеличение их цитотоксической активности, обусловленной в основном продукцией ими ФНОа, по отношению к опухолевым клеткам линии Ь-929. Еще большее повышение уровня АФК при дозе УФО 755 Дж/м2 приводит к снижению цитотоксической активности макрофагов.

Выявлено, что УФ-свет (453 и 755 Дж/м2) и ФНОа (500 и 1000 пкг/мл) снижают жизнеспособность макрофагов вследствие фотохимической модификации (деструкции) внешних примембранных слоев клеток, что сопровождается увеличением проницаемости мембран для красителя трипанового голубого. Сочетанное действие УФО (75,5-755 Дж/м2) и ФНОа в концентрации 1000 пкг/мл усиливает

процесс деструкции мембран фагоцитов. УФ-свет и ФНОа в меньших дозах и концентрациях не оказывают влияния на жизнеспособность макрофагов.

С помощью методов люминолзависимой XJI, ИФА и определения ферментативной активности СОД изучено влияние сочетанного действия УФ-света (75,5+755 Дж/м2) и ФНОа (40 - 1000 пкг/мл) на фагоцитарную активность перито-неальных макрофагов. Выявлен вклад процессов ПФОЛ, активности ферментативных систем (НАДФН-оксидазы и СОД) и функционального состояния CR1-рецепторов с лигандированным С4 в изменение функциональной активности фото-и ФНО-модифицированных макрофагов. <

УФО макрофагов в дозах 75,5 и 453 Дж/м2 индуцирует повышение их фагоцитарной активности, которая определяется, по крайней мере, двумя основными механизмами: активацией НАДФН-оксидазного комплекса вследствие прямого и/или опосредованного продуктами ПФОЛ действия УФ-света и «кэппинг»- ' эффектом CR1-рецепторов с лигандированным С4 компонентом комплемента. Все это реализуется в более мощном ответе макрофагов на стимуляцию, в увеличении продукции ими АФК (в первую очередь О г), сопровождающимся повышением СОД-активности иммуноцитов. Увеличение дозы УФО (755 Дж/м2) приводит к снижению фагоцитарной активности макрофагов, по всей видимости, вследствие фотоинактивации НАДФН-оксидазы или шеддинга (десорбции) рецепторов с лигандированным С4 и приводит к подавлению иммунного ответа в целом.

ФНОа в диапазоне концентраций 40-1000 пкг/мл выступает в качестве регулятора фагоцитарной активности макрофагов, причем изменение функциональных свойств фагоцитов под действием ФНОа является разнонаправленным и зависит от концентрации цитокина.

ФНОа в концентрациях 40 и 200 пкг/мл индуцирует увеличение функциональной активности фагоцитов, обусловленное активацией НАДФН-оксидазы (по Са2+-независимому механизму) и повышением аффинности рецепторов CR1 с мембраносвязанным С4 компонентом комплемента. Наблюдаемое увеличение СОД-активности в данном случае является следствием прайминга цитокинмоди-фицированных макрофагов, вносит незначительный вклад в активацию процесса фагоцитоза и направлено на регуляцию содержания в клетке токсичных для нее АФК. ФНО в концентрации 1000 пкг/мл приводит к снижению фагоцитарной активности макрофагов, по всей видимости, за счет инактивации НАДФН-оксидазы вследствие цитотоксического действия цитокина на мембранные структуры мода- * фицированных клеток.

Показано, что УФ-свет (75,5+755 Дж/м2) и ФНОа в концентрации 40 пкг/мл оказывают стимулирующее действие на функциональный потенциал макрофагов, что может быть опосредовано как увеличением активности НАДФН-оксидазы, так и повышением аффинности рецепторов CR1 с лигандированным С4 на мембранах УФ-облученных клеток.

С повышением концентрации цитокина до 200, 500 и 1000 пкг/мл наблюдается подавление фагоцитарной активности УФ-облученных клеток, обусловленное уменьшением активности НАДФН-оксидазного комплекса, а для максимальной концентрации ФНОа и аффинности CR1-рецепторов с лигандированным С4 компонентом комплемента.

Выявлено, что взаимодействие ФНОа (40-1000 пкг/мл) с УФ-модифицированными (75,5+755 Дж/м2) макрофагами (не стимулированными к фа-

гоцитозу) не вызывает изменения уровня их спонтанной хемилюминесценции, а, следовательно, и интенсивности процессов ПФОЛ. Данный цитокин выступает в роли регулятора выработки АФК только в случае активации фагоцитоза латексом.

Показано, что ФНОа не оказывает влияния и на СОД-активность фотомоди-фицированых макрофагов. Изменение функционального потенциала стимулированных фагоцитов при сочетанном действии УФ-света и ФНОа в большинстве случаев регулируется несколькими механизмами, действующими, по всей видимости, одновременно и включающими в себя изменение активности НАДФН-оксидазы и аффинности CR1-рецепторов с лигандированным С4 на поверхности макрофагов.

Активация функционального потенциала макрофагов при действии УФ-света в дозах 75,5 и 453 Дж/м2, ФНОа в концентрациях 40 и 200 пкг/мл, также при совместном действии УФО и ФНОа (40 пкг/мл) сопровождается увеличением уровня генерации АФК НАДФН-оксидазой, цитокинов (в частности, ФНОа) и повышением адгезивных свойств фагоцитов вследствие структурно-функциональных модификаций их мембран. Образующиеся в результате активации АФК и цитокины могут опосредовать протекание иммунных реакций, оказывать цитотоксическое действие на опухолевые клетки, участвовать в регуляции пролиферации лимфоидных клеток, индуцируя повышение уровня неспецифического иммунитета, противоопухолевой и противовирусной резистентности организма.

На основании собственных экспериментальных и литературных данных предложена схема возможного регуляторного действия УФ-света и ФНОа на функциональные свойства макрофагов (рис. 11).

ВЫВОДЫ

1. При взаимодействии иммуноцитов (лимфоцитов, макрофагов, нейтрофи-лов) и белков системы комплемента под действием УФ-света (240-390 нм) в диапазоне доз 75,5-2265 Дж/м2 происходит снижение антителосвязывающей способности белка С4, обусловленное как структурно-функциональными фотомодификациями клеточных мембран, так и процессами, протекающими в сыворотке крови, при преобладающем вкладе последних.

2. Структурно-функциональные УФ-модификации мембран иммуноцитов проявляются в виде «кэппинг»-эффекта с образованием рецепторных кластеров с лигандированным С4. Преобладание «кэпов» по типу «кэп *Л» и «кэп "4» приводит к повышению, а амебовидных «кэпов» - к снижению антителосвязывающей способности лигандированного на поверхности фотомодифицированных иммуноцитов С4 компонента комплемента.

3. УФ-облучение сыворотки крови (доноров или мыши) приводит к усиливающемуся с ростом дозы снижению антителосвязывающей способности сывороточного С4, что связано, по всей видимости, е процессами его расщепления на субфрагменты: активные по отношению к комплементарному каскаду С4а и С4Ь (при УФО в дозах 75,5-755 Дж/м2) и на неактивные С4с и C4d (2265 Дж/м2).

4. Экспонирование на поверхность макромолекул УФ-облученного в дозах 75,5-2265 Дж/м2 белка С4 новых хромофоров УФ-света и ионогенных групп является результатом разворачивания белковой глобулы, не затрагивающего соотношения типов ее П структуры.

УФ-свет (240 - 390 им), 75,5 и 453 Дж/м2

Изменение адгезивных свойств фагоцитов

Стимуляция или подавление иммунного ответа

Рис. 11. Схема возможного регуляторного действия УФ-света и ФНО на функциональные свойства макрофагов

5. УФ-свет (75,5-2265 Дж/м2) оказывает коррегирующее действие на ФНО-продуцирующую способность Т-лимфоцитов, конечный эффект которого определяется исходной концентрацией цитокина, уровнем генерации АФК в клетках и дозой УФО.

6. Усиливающиеся с ростом дозы УФ-облучения (75,5+2265 Дж/м2) и времени последействия (до трех часов) процессы пероксидного фотоокисления липидов, протекающие на фотомодифицированных лимфоцитах, индуцируют повышение

их СОД- и пероксидазиой активности, а также способности сорбировать экзогенную пероксидазу.

7. Иммобилизация пероксидазы с нативными и фотомодифицированными лимфоцитами приводит к снижению ее каталитической активности.

8. УФ-свет в дозах 75,5 и 453 Дж/м2 индуцирует увеличение цитотоксиче-ской активности макрофагов по отношению к опухолевым клеткам линии L-929, обусловленное повышением ФНО-продуцирующей способности фагоцитов и генерацией активных форм кислорода в клетке. Значительное накопление активных форм кислорода при действии УФО в дозе 755 Дж/м2 оказывает ингибирующее действие на цитотоксическую активность макрофагов.

9. Повышение фагоцитарной активности макрофагов при их УФ-облучении в дозах 75,5 и 453 Дж/м2 обусловлено интенсификацией процессов ПФОЛ, активацией НАДФН-оксидазы, цитозольной СОД и «кэппинг»-эффектом CR1-рецепторов с лигандированным С4 компонентом комплемента. Максимальная доза УФО (755 Дж/м2) приводит к снижению интенсивности фагоцитоза вследствие фотоинактивации НАДФН-оксидазы и шеддинга CR1-рецепторов.

10. ФНОа в диапазоне концентраций 40-1000 пкг/мл оказывает разнонаправленное действие по отношению к функциональной активности макрофагов, зависящее от концентрации цитокина: малые концентрации ФНОа оказывают активирующее действие, а высокие — инактивирующее.

11. УФ-свет (75,5+755 Дж/м2) и ФНОа (40-1000 пкг/мл) при сочетанном действии выступают в роли иммуномодуляторов фагоцитарной активности стимулированных макрофагов, вызывая изменения активности НАДФН-оксидазы и структурно-функционального состояния CR1-рецепторов с лигандированным С4. Максимальная стимуляция процесса фагоцитоза достигается при действии УФ-света в дозе 75,5 Дж/м2 и ФНОа в концентрации 40 пкг/мл.

12. При взаимодействии ФНОа (40-1000 пкг/мл) с фотомодифицированными, не стимулированными к фагоцитозу, макрофагами не наблюдается изменения уровня их спонтанной хемилюминесценции. Данный цитокин выступает в роли регулятора выработки активных форм кислорода только в случае активации фагоцитоза латексом.

13. Общими закономерностями действия УФ-света на иммуноциты являются: изменение их цитокинпродуцирующей способности, формирование «кэпов» с лигандированным С4 на клеточной поверхности, интенсификация процессов ПФОЛ, изменение активности НАДФН-оксидазы и увеличение активности ферментов антиоксидантной системы (пероксидазы, СОД), которые проявляются в изменении функциональных свойств иммуноцитов и отражаются на процессах клеточно-гуморальных и межклеточных взаимодействий в цепи иммунологических реакций.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Арпохов В.Г. Влияние УФ-света на взаимодействие С4 компонента комплемента с лимфоцитарными мембранами / В.Г. Артюхов, В.В. Гусинская, Е.А. Рамиль-цева // Цитология. - 2001. - Т. 43, №4. - С. 316-317.

2. Изменения структурно-функциональных свойств иммуноцитов крови человека, индуцированные УФ-светом и лазерным излучением / В.Г. Артюхов, В.В. Гусинская, OJB. Башарина, Л.Т. Рязанцева, Е.А. Рамильцева // Материалы XVIII съезда

200Ь-4

физиологического общества им. И.П. Павлова: тез. докл. - Казань. 25-Ж сентября 2001.-С. 303.

3. Анализ структурно-функциональных УФ-модификаций сывороточного и связанного с эритроцитарными мембранами С4 компонента комплемента / В.Г. Ар-тюхов, В.В. Гусинская, Е.А. Рамильцева и др. // IV Съезд по радиационным исследованиям: тез. докл. - Москва, 20-24 ноября 2001. - С.800.

4. УФ-индуцированные структурно-функциональные модификации белка С4 / В.Г. Артюхов, В.В. Гусинская, М.П. Рубцов, Е.А. Рамильцева и др. // Ш съезд фотобиологов России: тез. докл. - Воронеж, 28 июня-4 июля 2001. - С. 11-12.

5. Регуляция УФ-светом процесса взаимодействия С4 фактора системы комплемента с лимфоцитарными мембранами / В.Г. Артюхов, В.В. Гусинская, Е.А. Рамильцева и др. // Вестник ВГУ, Серия Химия, Биология. - 2001. - №2. - С. 78-83.

6. Структурно-функциональные фотомодификации СЗ и С4 белков системы комплемента, функционирующих отдельно и в комплексе с мембранами нейтрофилов / ВТ. Артюхов, В.В. Гусинская, Е.А. Рамильцева и др. // VIII международная конференция по химии и физико-химии олигомеров «0лигомеры-2002»: тез. докл. -Черноголовка, 9-14 сентября 2002. - С. 318.

7. Влияние ультрафиолетового излучения на некоторые показатели антиоксидант-ной системы крови / В.Г. Артюхов, О.В. Башарина, В.В. Гусинская, Е.А. Рамильцева и др. // Циклы природы и общества. Материалы IV международной конференции. - Ч. 4. - Ставрополь, октябрь 2002. - С. 23-28.

8. Артюхов В.Г. Влияние УФ-излучения на уровень активных форм кислорода и супероксиддисмутазную активность лимфоцитов крови человека / В.Г. Артюхов, В.В. Гусинская, Е.А. Рамильцева // Ш международный симпозиум «Механизмы действия сверхмалых доз»: тез. докл. - Москва, 3-6 декабря 2002. - С. 164.

9. Двурекова Е.А. Уровень продукции фактора некроза опухоли Т-лимфоцитами в условиях ультрафиолетового облучения / Е.А. Двурекова // 7-ая Путинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века»: тез. докл. - Пу-щино, 14-18 апреля 2003. - С. 59.

10. Двурекова Е.А. Влияние фактора некроза опухоли на функциональную активность фотомодифицированных макрофагов / Е.А. Двурекова, В.Г. Артюхов, В.В. Гусинская // Ш международный конгресс «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине»: тез. докл. - Т. 1. - СПб, 1-4 июля 2003. — С. 59-60.

11. Двурекова Е.А. Влияние ультрафиолетового облучения на функциональную активность макрофагов / Е.А. Двурекова, ВТ. Артюхов, В.В. Гусинская // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. - Вып. 5. — Воронеж, 2003-С. 37-41.

12. Артюхов В.Г. Влияние пероксидного фотоокисления липидов на активность связанной с лимфоцитами пероксидазы / В.Г. Артюхов, В.В. Гусинская, Е.А. Рамильцева // Украинский биохимический журнал. - 2003. - Т. 75, № 6. - С. 69-74.

Заказ № 13 от^У 200¿"г Тираж МО экз Лаборатория оперативной полиграфии ВГУ

21 \!Л? Г93

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Двурекова, Евгения Александровна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 1. Клетки иммунной системы, их роль в регуляции иммунологических реакций.

1.1. Функциональные особенности клеток иммунной системы.

1.2. Основные рецепторы на поверхности иммуноцитов.

1.3. Общая характеристика цитокинов. Роль фактора некроза опухоли в иммунологических реакциях.

1.4. УФ-индуцированные изменения структурного и функционального состояния иммуноцитов.

ГЛАВА 2. Система комплемента: особенности строения, функционирования и регуляции активности С4 компонента.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.,.

ГЛАВА 3. Объекты и методы исследования.

3.1 .Объекты исследования.

3.2. Методы исследования.

3.2.1. Выделение лимфоцитов из крови человека.

3.2.2. Получение Т-лимфоцитов.

3.2.3. Выделение макрофагов из перитонеальной жидкости мыши.

3.2.4. Получение супернатанта иммуноцитов.

3.2.5. Выделение нейтрофилов из крови человека.

3.2.6. Получение сыворотки крови.

3.2.7. УФ-облучение исследуемых образцов.

3.2.8. Инкубация макрофагов с фактором некроза опухоли а.

3.2.9. Метод иммуноферментного анализа для изучения процессов взаимодействия С4 фактора комплемента с мембранами иммуноцитов.

3.2.10. Метод иммунофлуоресценции для изучения структурных

Т* свойств мембран иммуноцитов.

3.2.11. Определение функциональной активности С4 фактора системы комплемента методом гемолитического титрования.

3.2.12. Регистрация и анализ ИК-спектров белка С4.

3.2.13. Регистрация электронных спектров поглощения белка С4.

3.2.14. Проведение диск-электрофореза в полиакриламидном геле белка С4.

3.2.15. Измерение буферной емкости и снятие кривых титрования белка С4.

3.2.16. Получение лимфоцитарных и макрофагальных лизатов для определения концентрации фактора некроза опухоли а и цитоток-сической активности макрофагов.

3.2.17. Метод иммуноферментного анализа для определения концентрации ФНОа в лизатах Т-лимфоцитов.

3.2.18. Измерение интенсивности люминолзависимой хемшпоминес-ценции иммуноцигов.

3.2.19. Метод определения ТБК-активных продуктов в суспензии лимфоцитов.

3.2.20. Определение пероксидазной активности лимфоцитов.

3.2.21. Определение супероксиддисмутазной активности лимфоцитов методом люминолзависимой хемилюминесценции.

3.2.22. Определение цитотоксической активности макрофагов.

3.2.23. Определение жизнеспособности макрофагов с помощью трипа-нового голубого.

3.2.24. Статистическая обработка результатов экспериментов.

ГЛАВА 4. Влияние УФ-света на процесс взаимодействия С4 фактора системы комплемента с мембранами иммуноцитов.

4.1. Взаимодействие С4 фактора системы комплемента с мембранами лимфоцитов и макрофагов в условиях УФО.

4.1.1. Влияние УФ-света на функциональное состояние мембраносвя-занного С4.

4.1.2. Влияние УФ-света на структурное состояние CR1-рецепторов с лигандированным С4 на поверхности лимфоцитов и $ макрофагов.

4.1.3. Взаимодействие фотомодифицированных иммуноцигов с сывороточным С4.

4.1.4. Влияние УФ-света на гемолитическую активность белка С4.

4.1.5. Влияние УФ-света на структурно-функциональное состояние сывороточного С4.

4.2. Взаимодействие С4 компонента комплемента с мембранами нейтрофилов крови человека в условиях УФО.

4.3. Определение роли фотомодификаций белка С4 и мембран имму-ноцитов в изменение антителосвязывающей способности изучаемых систем.

ГЛАВА 5. Анализ УФ-индуцированных структурных модификаций

С4 белка системы комплемента.

5.1. Влияние УФ-света на РЖ-спектральные характеристики С4 белка системы комплемента.

5.2. Электронные спектры поглощения УФ-облученных растворов С4.

5.3. Электрофоретические характеристики фотомодифицированного белка С4.

5.4. Влияние УФ-света на буферную емкость растворов белка С4.

ГЛАВА 6. Влияние УФ-света на некоторые функциональные свойства лимфоцитов крови человека.

6.1. Уровень продукции фактора некроза опухоли а Т-лимфоцитами в условиях УФ-облучения.

6.2. Изучение процессов ПФОЛ, протекающих на мембранах лимфоцитов.

6.2.1. Влияние УФ-света на хемилюминесцентные свойства лимфоцитов.

6.2.2. Дозовая зависимость накопления ТБК-активных продуктов в суспензии лимфоцитов в условиях УФ-облучения.

6.3. Влияние УФ-света на ферментанивную активность лимфоцитов.

6.3.1. Влияние УФ-света на пероксидазную активность лимфоцитов.

6.3.2. Влияние УФ-света на супероксидцисмутазную активность лимфоцитов.

ГЛАВА 7. Исследование сочетанного действия УФ-света и фактора некроза опухоли а на функциональную активность макрофагов.

7.1. Изменение цитотоксической активности макрофагов в условиях УФ-облучения.

7.2. Исследование сочетанного действия УФ-света и ФНОа на уровень спонтанной хемилюминесценции макрофагов.

7.3. Исследование уровня жизнеспособности УФ- и цитокинмоди-фицированных макрофагов с помощью красителя трипанового голубого.

7.4. Влияние сочетанного действия УФ-света и ФНОа на фагоцитарную активность макрофагов.

7.5. Влияние сочетанного действия УФ-света и фактора некроза опухоли на состояние CR1-рецепторов с лигандированным С4 на поверхности макрофагов.

7.6. Изучение сочетанного действия УФ-света и ФНОа на супероксид-дисмутазную активность макрофагов.

7.7. О процессах, ответственных за изменение функциональной активности фото- и цитокинмодифицированных макрофагов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-функциональное состояние иммуноцитов при их взаимодействии с гуморальными факторами иммунной системы в условиях УФ-облучения"

Актуальность проблемы. Функционирование иммунной системы контролируется сложной сетью взаимосвязанных информационных сигналов, опосредуемых факторами неспецифического гуморального звена иммунитета. Их продукция и направленное действие на конкретные клетки-мишени определяются сложными молекулярно-клеточными механизмами. Примером тому может служить система комплемента, играющая важную роль в нормальной и патологической физиологии человека. Белки комплемента обеспечивают опсонизацию и лизис чужеродных клеток, участвуя таким образом в формировании иммунного ответа. Связывание активных субфрагментов комплемента со специфическими клеточными рецепторами приводит к локальной модуляции физиологических процессов, координации функциональной активности и кооперации иммуноцитов, что направлено на поддержание местного гомеостаза. В то же время, клеточные рецепторы комплемента, например CR1-рецептор, являются естественными регуляторами активности самого комплемента.

Помимо системы комплемента в процессах иммунорегуляции задействованы и другие факторы гуморального звена иммунитета, в частности, цитокины, обеспечивающие согласованное функционирование различных типов иммунокомпетентных клеток в процессе индукции развития иммунных реакций. Цитокины секретируются многими клетками и представляют собой единую систему регуляции иммунных процессов, процессов воспаления, а также роста, дифференцировки и функциональной активности клеток различной тканевой принадлежности.

Большинство цитокинов обладает плейотропным действием, сопровождающимся модуляцией различных функций, что позволяет рассматривать их как общую систему гомеостатической регуляции клеточной функции, часть сложнейшей цепи взаимосвязанных сигналов, обеспечивающих слаженную работу различных систем в живом организме. Наряду с выполнением специфических функций внутри иммунной системы цитокины формируют сеть коммуникационных сигналов и осуществляют межсистемные связи [67, 88]. Такой многофакторный контроль функций иммунной системы организма, осуществляемый цитокинами, необходим для повышения надежности и обеспечения вариабельности реакций организма в зависимости от характера агента, вызывающего эти реакции.

В современной медицине для лечения ряда заболеваний используются рекомбинантные цитокины, в частности фактор некроза опухоли а [35, 41, 42, 140]. Его мощное биологическое влияние на иммуногенез, воспалительные процессы и опухолевые клетки позволяет считать фактор некроза опухоли (ФНОа) многообещающим средством иммунотерапии онкологических, воспалительных, инфекционных и аутоиммунных заболеваний, а также при иммунодефицитах, трансплантации органов и тканей [134].

Нарушения продукции цитокинов продуцирующими клетками, а также процессов взаимодействия гуморальных факторов со специфическими рецепторами иммуноцитов могут лежать в основе формирования патологии на молекулярно-клеточном уровне. В связи с этим изучение межклеточных и клеточно-гуморальных взаимодействии, опосредуемых различными эффек-торными молекулами, может внести существенный вклад в понимание патогенеза и привести к поиску новых способов регуляции и повышения эффективности функционирования отдельных звеньев иммунной системы.

Одним из возможных регуляторов процессов взаимодействия между клеточными и гуморальными факторами иммунитета является УФ-свет. Рядом авторов показано, что клеточные и гуморальные компоненты крови, подвергнутые УФ-облучению в физиологических дозах, могут оказывать регулирующее действие на иммунную систему организма в целом. Известно, что УФ-свет индуцирует быстрые структурно-функциональные изменения поверхностных структур иммунокомпетентных клеток [21, 23, 43, 113, 247, 264], белков системы комплемента [2,3,30-32}, уровня цитокинов [121,229].

Цель и задачи диссертационной работы. Целью настоящей работы явилось изучение регуляторного действия УФ-света на структурно-функциональное состояние иммуноцитов (лимфоцитов, макрофагов, нейтро-филов) при их взаимодействии с гуморальными факторами иммунной системы. i

В связи с этим перед нами стояли следующие задачи: 1. Изучить влияние УФ-света (240-390 нм, 75,5-2265 Дк/м2) на процесс взаимодействия мембран иммуноцитов (лимфоцитов, макрофагов, нейтрофи-лов) с С4 фактором системы комплемента;

2. Исследовать структурно-функциональные фотомодификации С4 компонента комплемента;

3. Изучить ФНО-продуцирующую способность Т-лимфоцитов и цито-токсическую активность макрофагов в условиях УФ-облучения;

4. Оценить вклад процессов пероксидного фотоокисления липидов в изменение супероксиддисмутазной и пероксидазной активности фотомоди-фицированных лимфоцитов;

Научная новизна. Работа является комплексным исследованием, посвященным изучению регуляторного действия УФ-света на функциональную активность иммуноцитов по отношению к С4 фактору системы комплемента и ФНОа.

Впервые изучено влияние УФ-света на взаимодействие мембран иммуноцитов (лимфоцитов, макрофагов, нейтрофилов) с С4 фактором системы комплемента и выявлены основные закономерности, обусловливающие данный процесс. Показано, что структурно-функциональные фотомодификации мембран иммуноцитов обусловлены «кэппинг»-эффектом рецепторов с ли-гандированным С4 фактором комплемента. Разработана схема УФ-индуцированных структурно-функциональных изменений С4 компонента комплемента.

Выявлено иммунокоррегирующие действие УФ-света на уровень продукции фактора некроза опухоли а Т-лимфоцитами, конечный эффект которого определяется исходной концентрацией цитокина и дозой УФ-света. Обнаружена взаимосвязь ФНО-продуцирующей способности лимфоцитов и ци-тотоксической активности макрофагов с уровнем генерации активных форм кислорода. Исследовано влияние процессов пероксидного фотоокисления липидов на уровень каталитической активности связанной с мембранами лимфоцитов пероксидазы.

Установлено, что УФ-свет и фактор некроза опухоли а оказывают ре-гуляторное действие на фагоцитарную активность макрофагов. Обсуждается вклад различных процессов (пероксидного фотоокисления липидов, активности НАДФН-оксидазы и супероксиддисмутазы, состояния CR1 клеточного рецептора) в изменение функционального потенциала фото- и ФНО модифицированных макрофагов.

Фотоиндудированные изменения структурно-функциональных свойств мембран иммуноцитов и отдельных компонентов комплемента необходимо учитывать при обсуждении вопросов, касающихся выяснения механизмов действия УФ-света на молекулярно-клеточном уровне. Полученные экспериментальные данные позволяют выявить общие закономерности регуляторного действия УФ-света на процесс взаимодействия мембран иммуноцитов (лимфоцитов, макрофагов, нейтрофилов) с С4 фактором комплемента.

Эксперименты с использованием фактора некроза опухоли а позволяют разработать новые подходы к иммунокоррекции патологических состояний организма при проведении фармакотерапии и определить возможность применения метода АУФОК на различных стадиях воспалительного процесса с целью повышения эффективности его использования.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Всероссийском симпозиуме «Клеточная биология на пороге XXI века» (СПб., 2000); IV Съезде по проблемам радиационной биологии (Москва, 2001); Ш Съезде фотобиологов России (Воронеж, 2001); XVIII съезде физиологического общества им. И. П. Павлова (Казань, 2001); УШ международной конференции по химии и физико-химии олигомеров «Оли-гомеры-2002» (Черноголовка, 2002); IV международной конференции «Циклы природы и общества» (Ставрополь, 2002); VII Пущинской школеконференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2003); Ш и IV международном симпозиуме «Механизмы действия сверхмалых доз» (Москва, 2002; СПб., 2003);. Научной сессии сотрудников Воронежского госуниверситета (Воронеж, 2002,2003,2004).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи и 8 тезисов, в том числе 3 статьи в реферируемых изданиях.

На защиту выносятся следующие положения:

1. УФ-свет (240-390 нм) в дозах 75,5-^2265 Дж/м2 индуцирует снижение антителосвязывающей способности С4 компонента комплемента в системе из взаимодействующих иммуноцитов и белков системы комплемента, обусловленное как структурно-функциональными фотомодификациями клеточных мембран, так и процессами, протекающими в сыворотке крови.

3. УФ-излучение в дозах 75,5-^2265 Дж/м оказывает коррелирующее действие на ФНО-продуцирующую способность Т-лимфоцитов, эффект которого в значительной степени определяется исходной концентрацией цито-кина, уровнем генерации активных форм кислорода и дозой УФ-света.

4. Интенсификация процессов пероксидного окисления лнпидов на мембранах фотомодифицированных лимфоцитов способствует повышению их супероксиддисмутазной и пероксидазной активности, а также снижению каталитической активности связанной с клетками экзогенной пероксидазы.

5. УФ-излучение в дозах 75,5-^2265 Дж/м вызывает разнонаправленные эффекты в отношении цитотоксической и фагоцитарной активности макрофагов. Сочетанное действие Уфтсвега и фактора некроза опухоли а оказывает модулирующий эффект на функциональное состояние макрофагов.

6. Схема возможных регуляторных процессов, протекающих при сочетанием действии УФ-света и фактора некроза опухоли а на функциональную активность макрофагов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа включает 208 страниц машинописного текста, 24 таблицы, 42 рисунка. Состоит из введения, семи глав, заключения, выводов и приложения. Список литературы содержит 287 работ, из них 139 отечественных и 148 зарубежных.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Двурекова, Евгения Александровна

выводы

1. При взаимодействии иммуноцитов (лимфоцитов, макрофагов, нейтрофилов) и белков системы комплемента под действием УФ-света (240-390 р*\ нм) в диапазоне доз 75,5-2265 Дж/м происходит снижение антителосвязывающей способности белка С4, обусловленное как структурно-функциональными фотомодификациями клеточных мембран, так и процессами, протекающими в сыворотке крови, при преобладающем вкладе последних.

2. Структурно-функциональные УФ-модификации мембран иммуноцитов проявляются в виде «кэппинг»-эффекта с образованием рецепторных кластеров с лигандированным С4. Преобладание «кэпов» по типу «кэп Уг» и «кэп 1Л» приводит к повышению, а амебовидных «кэпов» - к снижению антителосвязывающей способности лигандированного на поверхности фотомодифицированных иммуноцитов С4 компонента системы комплемента.

3. УФ-облучение сыворотки крови (доноров или мыши) приводит к усиливающемуся с ростом дозы снижению антителосвязывающей способности сывороточного С4, что связано, по всей вероятности, с процессами его расщепления на субфрагменты: активные по отношению к комплементарному каскаду С4а и С4Ь (при УФО в дозах 75,5-755 Дж/м2) и на неактивные С4с и C4d (2265 Дж/м2).

5. УФ-свет (75,5—2265 Дж/м ) оказывает коррегирующее действие на ФНО-продуцирующую способность Т-лимфоцитов, конечный эффект которого определяется исходной концентрацией цитокина, уровнем генерации АФК в клетках и дозой УФО.

6. Усиливающиеся с ростом дозы УФ-облучения (75,5*2265 Дж/м2) и времени последействия (до трех часов) процессы пероксидного фотоокисления липидов, протекающие на фотомодифицированных лимфоцитах, индуцируют повышение их СОД- и пероксидазной активности, а также способности сорбировать экзогенную пероксидазу.

7. Иммобилизация пероксидазы с нативными и фотомодифицирован-ными лимфоцитами приводит к снижению ее каталитической активности. А

8. УФ-свет в дозах 75,5 и 453 Дж/м индуцирует увеличение цитоток-сической активности макрофагов по отношению к опухолевым клеткам линии L-929, обусловленное повышением ФНО-продуцирующей способности фагоцитов и генерацией активных форм кислорода в клетке. Значительное Л накопление активных форм кислорода при действии УФО в дозе 755 Дж/м оказывает ингибирующее действие на цитотоксическую активность макрофагов.

9. Повышение фагоцитарной активности макрофагов при их УФл облучении в дозах 75,5 и 453 Дж/м обусловлено интенсификацией процессов ПФОЛ, активацией НАДФН-оксидазы, цитозольной СОД и «кэппинг»-эффектом CR1-рецепторов с лигандированным С4 компонентом комплемента. Максимальная доза УФО (755 Дж/м2) приводит к снижению интенсивности фагоцитоза вследствие фотоинактивации НАДФН-оксидазы и шеддинга CR1-рецепторов с мембран макрофагов.

И. УФ-свет (75,5-755 Дж/м2) и ФНОа (40-1000 пкг/мл) при сочетанном действии выступают в роли иммуномодуляторов фагоцитарной активности стимулированных макрофагов, вызывая изменения активности НАДФН-оксидазы и структурно-функционального состояния CR1-рецепторов с лигандированным С4. Максимальная стимуляция процесса фагоцитоза достигается при действии УФ-света в дозе 75,5 Дж/м2 и ФНОа в концентрации 40 пкг/мл.

12. При взаимодействии ФНОа (40-1000 пкг/мл) с фотомодифициро-ванными, не стимулированными к фагоцитозу, макрофагами не наблюдается изменения уровня их спонтанной хемилюминесценции. Данный цитокин выступает в роли регулятора выработки активных форм кислорода только в случае активации фагоцитоза латексом.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С помощью методов иммуноферментного анализа, иммунофлуоресценции, УФ- и ИК-спектрофотометрии, кислотно-основного и гемолитического титрования, электрофореза в поли акрил амидном геле, люминолзависимой хемилюминесценции, определения ТБК-активных продуктов, цито-токсической активности и жизнеспособности макрофагов и определения каталитической активности ферментов антиоксидантной системы (свободной и ассоциированной пероксидазы, супероксиддисмутазы) изучено действие УФ-света (240-390 нм, 75,5-2265 Дж/м2) на структурно-функциональное состояние иммуноцитов при их взаимодействии с гуморальными факторами иммунной системы.

Для исследования механизмов действия УФ-излучения на структурно-функциональное состояние мембран иммуноцитов (лимфоцитов, макрофагов, нейтрофилов) и С4 компонента комплемента, функционирующих отдельно и в комплексе друг с другом, была разработана схема ИФА-тестов на основе оценки антителосвязывающей способности сывороточного и мембраносвя-занного белка С4.

Показано, что эффект усиливающегося с ростом дозы УФ-света снижения антителосвязывающей способности С4 в системе из взаимодействующих УФ-облученных компонентов (мембран иммуноцитов и белков системы комплемента) является суммарным и определяется структурно-функциональными фотомодификациями как клеточных мембран, так и процессами, протекающими в сыворотке крови, при преобладающем вкладе последних.

Установлено, что структурно-функциональные фотомодификации мембран иммуноцитов проявляются в виде «кэппинг»-эффекта с образованием рецепторных кластеров с лигандированным С4 фактором комплемента. Преобладание распределения флуоресцирующих комплексов на УФ-облученных лимфоцитах (755 и 2265 Дж/м2) и макрофагах (453 Дж/м2) по «кэп Уг и %»-тпу приводит к повышению антителосвязывающей способности лигандированного С4, и, как следствие, к возрастанию адгезивных свойств иммуноцитов. При УФО макрофагов в дозе 755 Дж/м2 наблюдается увеличение процента клеток с амебовидным «кэпом», сопровождающимся, по всей видимости, шеддингом рецепторов с лигандированным С4 и снижением антителосвязывающей способности мембраносвязанного С4. Таким образом, изменение числа и локализации рецепторов с лигандированным С4 компонентом комплемента лежит в основе механизма регуляции рецептор-ных, адгезивных, сорбционных и т. д. свойств иммуноцитов.

Функциональную активность фотомодифицированного С4 фактора системы комплемента исследовали с помощью метода гемолитического титрования и ИФА. Выявленный эффект активации белка С4 УФ-светом в дозах 75,5 и 755 Дж/м2 можно объяснить облегчением процесса расщепления его молекул на функционально активные С4а и С4Ь-субфрагменты. Показано, что образующийся в результате фотоактивации С4Ь участвует в формировании кластеров на поверхности клеточных мембран иммуноцитов, экранирующих мембраносвязанный С4. Связывание С4Ь субфрагмента с клеточными мембранами может активировать специфические реакции иммуноцитов, например, фагоцитарную активность макрофагов и нейтрофилов, активацию В-лимфоцитов. Максимальная доза УФО (2265 Дж/м ) приводит, по всей видимости, к активации сывороточных ингибиторов, расщепляющих С4 на неактивные для комплементарного каскада субфрагменты. Таким образом, путем изменения доз УФ-облучения компонентов крови можно регулировать процессы взаимодействия мембран иммуноцитов с отдельными факторами системы сывороточного комплемента.

Установлено, что УФ-свет в дозах 75,5 и 755 Дж/м вызывает разворачивание белковой глобулы С4, не затрагивающее соотношение типов П структуры, но сопровождающееся экспонированием новых остатков ароматических аминокислот (тирозина, триптофана, фенилаланина) и ионогенных групп (глутами-новой и аспарагиновой аминокислот, лизина, цистеина) на ее поверхности. УФО в максимальной дозе (2265 Дж/м ) индуцирует значительное увеличение числа функциональных групп на поверхности белковой молекулы, что свидетельствует о значительных конформационных перестройках, проявляющихся в разворачивании и разрыхлении молекулы С4.

Выявлено коррегирующее действие УФ-излучения по отношению к ФНО-продуцирующей способности Т-лимфоцитов, конечный эффект которого определяется в первую очередь исходной концентрацией цитокина, уровнем генерации АФК в клетках и дозой УФ-света. Показано, что повышение исходно низкой ФНО-продуцирующей способности Т-лимфоцитов в условиях УФО в незначительной степени зависит от концентрации АФК и обусловлено, по всей видимости, интенсификацией синтеза цитокина. Подавление исходно высокой ФНО-продуцирующей способности Т-лимфоцитов под действием УФ-света определяется в основном увеличением уровня АФК.

С помощью метода определения ТБК-активных продуктов, спектрофо-тометрического метода и ИФА исследовано влияние процессов ПФОЛ на функциональное состояние ферментных систем лимфоцитов. Показано, что с ростом дозы УФ-облучения имеет место интенсификация процессов перок-сидного фотоокисления липидов на мембранах лимфоцитов, сопровождающаяся увеличением их супероксиддисмутазной и пероксидазной активности, а также способности сорбировать экзогенную пероксидазу. Ассоциация пе-роксидазы с нативными и УФ-облученными лимфоцитами приводит к падению ее каталитической активности. Выявленный нами эффект фотоактивации СОД- и пероксидазной активности лимфоцитов может свидетельствовать о высоком функциональном резерве ферментов антиоксидантной системы и явиться причиной относительной стабильности мембран лимфоцитов при действии УФ-света в высоких дозах (2265 Дж/м ). у

Установлено, что УФ-свет

75,5*755 Дж/м ) индуцирует увеличение уровня АФК, а, следовательно, и интенсификацию процессов ПФОЛ на поверхности макрофагов. Повышение уровня АФК при УФ-облучении фагоцитов в дозах 75,5 и 453 Дж/м индуцирует увеличение их цитотоксической активности, обусловленной в основном продукцией ими ФНОа, по отношению к опухолевым клеткам линии L-929. Еще большее повышение уровня АФК при дозе УФО 755 Дж/м2 приводит к снижению цитотоксической активности макрофагов.

С помощью методов люминолзависимой XJI, ИФА и определения ферментативной активности СОД изучено влияние сочетанного действия УФ/у света (75,5-755 Дж/м ) и ФНОа (40 - 1000 пкг/мл) на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов. Выявлен вклад процессов ПФОЛ, активности ферментативных систем (НАДФН-оксидазы и СОД) и функционального состояния CR1-рецепторов с лигандированным С4 в изменение функциональной активности фото- и ФНО-модифицированных макрофагов. л

УФО макрофагов в дозах 75,5 и 453 Дж/м индуцирует повышение их фагоцитарной активности, которая определяется, по крайней мере, двумя основными механизмами: активацией НАДФН-оксидазного комплекса вследствие прямого и/или опосредованного продуктами ПФОЛ действия УФ-света и «кэппинг»-эффектом CR1 -рецепторов с лигандированным С4 компонентом комплемента. Все это реализуется в более мощном ответе макрофагов на стимуляцию, в увеличении продукции ими АФК (в первую очередь О 2 )> с0~ провождающимся повышением СОД-активности иммуноцитов. Увеличение дозы УФО (755 Дж/м2) приводит к снижению фагоцитарной активности макрофагов, по всей видимости, вследствие фотоинактивации НАДФН-оксидазы или шеддинга (десорбции) рецепторов с лигандированным С4 и приводит к подавлению иммунного ответа в целом.

ФНОа в концентрациях 40 и 200 пкг/мл индуцирует увеличение функциональной активности фагоцитов, обусловленное активацией НАДФН

Л | оксид азы (по Са -независимому механизму) и повышением аффинности рецепторов CR1 с мембраносвязанным С4 компонентом комплемента. Наблюдаемое увеличение СОД-активности в данном случае является следствием прайминга цитокинмодифицированных макрофагов, вносит незначительный вклад в активацию процесса фагоцитоза и направлено на регуляцию содержания в клетке токсичных для нее АФК. ФНО в концентрации 1000 пкг/мл приводит к снижению фагоцитарной активности макрофагов, по всей видимости, за счет инактивации НАДФН-оксидазы вследствие цитотоксического действия цитокина на мембранные структуры модифицированных клеток.

Показано, что УФ-свет (75,5-755 Дж/м2) и ФНОа в концентрации 40 пкг/мл оказывают стимулирующее действие на функциональный потенциал макрофагов, что может быть опосредовано как увеличением активности НАДФН-оксидазы, так и повышением аффинности рецепторов CR1 с лигандированным С4 на мембранах УФ-облученных клеток.

Выявлено, что взаимодействие ФНОа (40 - 1000 пкг/мл) с УФ-модифицированными (75,5-755 Дж/м2) макрофагами (не стимулированными к фагоцитозу) не вызывает изменения уровня их спонтанной хемилюминесценции, а, следовательно, и интенсивности процессов ПФОЛ. Данный цито-кин выступает в роли регулятора выработки АФК только в случае активации фагоцитоза латексом.

Показано, что ФНОа не оказывает влияния и на СОД-активность фото-модифицированых макрофагов. Изменение функционального потенциала стимулированных фагоцитов при сочетанном действии УФ-света и ФНОа в большинстве случаев регулируется несколькими механизмами, действующими, по всей видимости, одновременно и включающими в себя изменение активности НАДФН-оксидазы и аффинности CR1-рецепторов с лигандированным С4 на поверхности макрофагов.

Рис. 42. Схема возможного регуляторного действия УФ-света и ФНО на функциональные свойства макрофагов

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Двурекова, Евгения Александровна, Воронеж

1. Аналитические методы белковой химии / Под ред. П. Александера, P.M. Блока. М. : Издательство иностранной литературы, 1963. - С. 334-431.

2. Арпохов В.Г. Роль фотомодификации некоторых компонентов крови в изменении функциональной активности системы комплемента сыворотки доноров / В.Г. Арпохов, В.В. Гусинская, Г.И. Зарубаева // Иммунология. 1990. - № 6. - С. 9-12.

3. Арпохов В.Г. О соотношении вкладов прямого и косвенного действия УФ-радиации в изменение функциональных свойств системы комплемента / В.Г. Арпохов, В.В. Гусинская, М.В. Белич И Радио/ биология. 1993. - Т. 33, вып. 3. - С. 453-458.-У

4. Арпохов В.Г. Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами / В.Г. Арпохов, М.А. Наквасина. Воронеж : Изд-во Воронеж, ун-та, 2000.296 с.

5. Бакуев М.М. Особенности секреции миелопероксидазы и хемилюми-несцентного ответа нейтрофилов человека при контакте со стимуляторами различной природы / М.М. Бакуев, М.З. Саидов, А.А. Бутаков // Иммунология. 1991. - № 1. - С. 15-17.

6. Брондз Б.Д. Т-лимфоциты и их рецепторы в иммунологическом рас-позновании / Б.Д. Брондз. М.: Наука, 1987. - 470 с.

7. Бурлакова Е.Б. Роль токоферолов в пероксидном окислении липидов биомембран / Е.Б. Бурлакова, С.А. Краснаков, Н.Г. Храпова // Биологические мембраны. 1998. - Т. 15, № 2. - С. 137-167.

8. Вальтер Т. Фагоцитарная активность гранулоцитов после УФ-облучения / Т. Вальтер, М. Риттер, В. Гаст // Биофизика. 1989.1. Т. 34, №6.-С. 1001-1003.

9. Василенко А.М. Цитокины в сочетанной регуляции боли и иммунитета / A.M. Василенко, Л.А. Захарова // Успехи современной биологии. 2000. - Т. 120, № 2. - С. 174-189.

10. Васильева Г.И. Кооперативное взаимодействие моно- и полинуклеар-ных фагоцитов, опосредованное моно- и нейтрофилокинами / Г.И. Васильева, И.А. Иванова, С.Ю. Тюкавкина // Иммунология. 2000. -№5.-С. 11-17.

11. Васильева Г.И. Цитокины общая система гомеостатической регуляции клеточных функций I Г.И. Васильева, И.А. Иванова, С.Ю. Тюкавкина // Цитология. - 2001. - Т. 43, № 12. - С. 1101-1112.

12. Взаимоотношение иммунитета и аллергии / А.М. Земсков и др. // Успехи современной биологии. 2000. - Т. 120, № 1. - С. 12-22.

13. Владимиров Ю.А. Фотобиология и спектральные методы исследования. Практикум по общей биофизике : в 8 выпусках. / Ю.А. Владимиров, Ф.Ф. Литвин. М.: Высшая школа, 1964. - Вып. 8.-210 с.

14. Владимиров Ю.А. Перекисное окисление липидов в биомембранах / Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков. М.: Наука, 1972. - 252 с.

15. Владимиров Ю.А. Физико-химические основы фотобиологических процессов / Ю.А. Владимиров, А.Я. Потапенко. М : Высшая школа, 1989, -199 с.

16. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в первичных биологических процессах / Ю.А. Владимиров Н Биологические мембраны. 1998. -Т. 15,№5.-С. 517-529.

17. Владимиров Ю.А. Биохемилюминесценция / Ю.А. Владимиров. М.: Наука, 2000. - С. 294-302.

18. Влияние УФ-облучения в терапевтических дозах на экспрессию некоторых маркеров поверхности лимфоцитов крови доноров / К.А. Самойлова и др. // Тезисы Ш Всесоюзного съезда гематологов и трансфузиологов. Москва, 1991. - Т. 2. - С. 416-417.

19. Влияние эндогенных фотосенсибилизаторов на лазер-индуцированный прайминг лейкоцитов крови / Г.И. Клебанов и др. // Биологические мембраны. 1998. - Т. 15, № 3. - С. 273-285.

20. Волгарева Е.В. Влияние УФ-облучения и УФ-облученной аутологич-ной крови на функциональное состояние лимфоцитов периферической крови человека / Е.В. Волгарева, А.П. Волгарев, К.А. Самойлова // Цитология. 1990. - Т. 32, № 12. - С. 1217-1224.

21. Волькенпггейн М.В. Биофизика / М.В. Волькенштейн. М. : Наука, 1988.-262 с.

22. Галактионов В.Г. Иммунология / В.Г. Галактионов. М. : Изд-во Моск. ун-та, 1998. - 260 с.

23. Ганелина И.Е. Механизмы влияния облученной ультрафиолетовыми лучами крови на организм человека и животных / И.Е. Ганелина, К.А. Самойлова. JI.: Наука, 1986. - 264 с.

24. Герасимов И.Г. Функциональная неравнозначность нейтрофилов крови человека: генерация активных форм кислорода / И.Г. Герасимов, Д.Ю. Игнатов // Цитология. 2001. - Т. 43, № 5. - С. 432-434.

25. Гуляева Н.В. Механизм функционирования супероксиддисмутазы: многоцентровая модель / Н.В. Гуляева, А.Б. Обидин, Б.С. Маринов // Изв. АН СССР. Сер. биол. наук. -1989 № 6 - С. 890-898.

26. Гусинская В.В. Структурно-функциональное состояние отдельных факторов системы комплемента УФ-облученной сыворотки крови человека / В.В. Гусинская, С.А. Воробьева // Успехи физиологических наук. 1994. - Т. 25, №1.-С. 117-118.

27. Гусинская В.В. Анализ УФ-индуцированных структурно-функциональных изменений белков системы комплемента и эритро-цитарных мембран : дисс. . канд. биол. наук / В.В. Гусинская. Воронеж, 1995. -173 с.

28. Действие УФ-излучения на поверхность лимфоидных клеток / В.А. Крыленков и др. // ДАН СССР. 1983. - №1. - С. 219-223.

29. Дмитриев Е.В. Модуляция структурно-функциональных изменений мембран Т- и В-лимфоцитов крови человека некоторыми химическими и физическими агентами : дисс. . канд. биол. наук/ Е.В. Дмитриев. Воронеж, 2003 - 161 с.

30. Дранник Г.Н. Иммунотропные препараты / Г.Н. Дранник, Ю.А. Гри-невич, Г.М. Дизик. Киев : Здоровя. - 1994. - 142 с.

31. Дубинина Е.Е. Некоторые особенности функционирования ферментов антиоксидантной защиты плазмы крови человека / Е.Е. Дубинина // Биохимия. 1993. - Т. 58, № 2. - С. 268-273.

32. Дубинина Е.Е. Роль активных форм кислорода в качестве сигнальных молекул в метаболизме тканей при состоянии окислительного стресса / Е.Е. Дубинина П Вопросы медицинской химии. 2001. - Т. 47, № 6. -С. 561-581.

33. Зарецкая Ю.М. Клиническая иммуногенетика / Ю.М. Зарецкая. М. : Медицина, 1983. - 208 с.

34. Зенков Н.К. Активированные кислородные метаболиты в биологических системах / Н.К. Зенков, Е.Б. Меньшикова И Успехи современной биологии. -1993. Т. 113, № 3. - С. 286-296.

35. Зубова С.Г. Роль молекул адгезии в процессе распознавания чужеродных и трансформированных клеток макрофагами млекопитающих / С.Г. Зубова, В.Б. Окулов // Успехи современной биологии. 2001. -Т. 121,№1.-С. 59-66.

36. Изучение влияния местного применения препарата рекомбинирован-ного интерлейкина 10 на продукцию цитокинов и на функции лейкоцитов в очаге воспаления / Е.А. Варюшина и др. // Иммунология. -1998,-№6.-С. 37.

37. Изменение иммунологических показателей у онкологических больных при проведении адаптивной иммунотерапии / А.А. Останин и др. // Иммунология. 1996. - № 1. - С. 29-32.

38. Изменение поверхности активации циркулирующих лейкоцитов при аутотрансфузии УФ-облученной крови // К.А. Самойлова и др. // Вестник хирургии. 1990. - Т. 144, № 6. - С. 99-105.

39. Изменения экспрессии мембранных маркеров и количества мононук-леаров крови человека после ее облучения in vivo и in vitro видимым и инфракрасным светом в терапевтических дозах / Н.А. Жеваго и др. // Цитология. 2003. - Т. 45, № 2. - С. 179-194.

40. Изотипирование компонента С4 комплемента человека с использованием различий в функциональной активности изотипов С4А и С4В / JI.B. Козлов и др. // Биоорганическая химия. 2000. - Т. 26, № 7. -С. 539-547.

41. Иммуногенетика человека. Основные принципы и клиническое значение : в 2-х т. / Под ред. С. Литвина. М.: Мир, 1994. - Т. 2. - 368 с.

42. Иммунологические методы / Под ред. Г. Фримеля. М. : Медицина. -1987.-412 с.

43. Иммунология : в 3-х т. / Под ред. У. Пола. М. : Мир, 1989. - Т. 3. -340 с.

44. Ингибирование комплементзависимого гемолиза липосомами, содержащими церебразидсульфат / А.П. Каплун и др. // Биохимия. 2000. - Т. 26, № 1. - С. 68-77.

45. Ингибирование связывания и активации первого компонента комплемента человека. Действие синтетических пептидов, фрагментов иммуноглобулинов и некоторых белков / JT.B. Козлов и др. // Биохимия. 1986. - Т. 51, № 5. - С. 707-718.

46. Интерлейкинзависимые иммунодефицита человека / О.В. Петров и др. // Иммунология. 1987. - № 4. - С. 20-24.

47. Искусных А.Ю. Исследование механизмов окислительно-восстановительного гомеостаза на примере системы «активированные нейтрофилы-пероксидное окисление липидов-антиоксиданты» : дисс. . канд. биол. наук / А.Ю. Искусных. Воронеж, 2004. - 158 с.

48. Карандашов В.И. Ультрафиолетовое облучение крови / В.И. Каран-дашов, Е.В. Петухов. М.: Медицина, 1997. - 224 с.

49. Карандашов В.И. Фототерапия, руководство для врачей / В.И. Карандашов, Е.В. Петухов, B.C. Зродников. М. : Медицина, 2001. - 392 с.

50. Кетлинский С.А. Эндогенные иммуномодуляторы / С.А. Кетлинский,

51. А.С. Симбирцев, А.А. Воровьев. Спб.: Гиппократ, 1992. - 255 с.

52. Кетлинский С.А Цитокины мононуклеарных фагоцитов в регуляции воспаления и иммунитета / С.А. Кетлинский, Н.М. Калинина // Иммунология. 1995. - № 3. - С. 30-44.

53. Клебанов Г.И. Клеточные механизмы прайминга и активации фагоцитов / Г.И. Клебанов, Ю.А. Владимиров // Успехи современной биологии. 1999. - Т. 119, № 5. - С. 462-475.

54. Клебанов Г.И. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на ^ пероксидацию мембранных липидов и концентрацию ионов кальция вцитозоле фагоцитов / Г.И. Клебанов, Т.В. Чичук, Ю.А. Владимиров // Биологические мембраны. 2001. - Т. 18, № 1. - С. 42-50.

55. Козлов JI.B. Модифицированные методы определения функциональной активности факторов комплемента С2, СЗ, С4, С5 / JI.B. Козлов, Ю.И. Крылова, В.П. Чих // Биоорганическая химия. 1982. - Т. 8, №5.-С. 652-659.

56. Козлов JI.B. Новый низкомолекулярный белковый эффектор комплемента из яда среднеазиатской кобры Naja naja oxiana / JI.B. Козлов, Л.С. Соляков, А.А. Зинченко // Биоорганическая химия. 1984. - Т. 10, №3.-С. 323-332.

57. Козлов Л.В. Особенности функционирования протеиназ комплемента / Л.В. Козлов // Биоорганическая химия. -1994. № 3. - С. 229-240.

58. Козлов Л.В. Ингибирование образования С5-конвертазы комплемента / Л.В. Козлов, Т.В. Лебедева // Биоорганическая химия. 1998. - № 5. -С. 350-355.

59. Круглякова К.Е. Общие представления о механизме действия антиок-сидантов / К.Е. Круглякова, Л.Н. Шишкина // Исследование синтетических и природных антиоксидантов in vitro и in vivo: сб. науч. ст. -М., 1992.-С. 5-8.

60. Кубанова АЛ. Уровень сывороточного фактора некроза опухоли при различных дерматозах / А.А. Кубанова, Л.И. Маркушева, Е.Е. Фомина // Иммунология. 1998. - № 2. - С. 47-49.

61. Кулаков В.В. Влияние некоторых цитокинов на цитостатическую и цитотоксическую функции нейтрофилов крови человека / В.В. Кулаков, А.Г. Коробко, Б.В. Пинегин // Иммунология. 1997. - № 3.1. С. 48-50.

62. Кулинский В.И. Актуальные и дискуссионные аспекты гормонологии // В.И. Кулинский, Л.С. Колесниченко // Биохимия. -1997. Т. 62, №10.-С. 1369-1372.

63. Кулинский В.И. Активные формы кислорода и оксидативная модификация макромолекул: польза, вред и защита / В.И. Кулинский // Соросовский образовательный журнал. -1999. № 1. - С. 2-7.

64. Кульберг А .Я. Молекулярная иммунология // А.Я. Кульберг. М. : Высшая школа, 1985. - 287 с.

65. Курганов Б.И. Физико-химические механизмы регуляции активности ферментов // Б.И. Курганов. М.: Наука, 1992. - 59 с.

66. Кэбот Е. Экспериментальная иммунохимия / Е. Кэбот, М. Мейер. -М.: Медицина, 1968. С. 140-240.

67. Лакин Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. М.: Высшая школа, 1990. -351 с.

68. Лимфоциты: Методы / Под ред. Дж. Клауса. М.: Мир, 1990. - 395 с.

69. Ложкина А.Н. Участие системы комплемента в регуляции гомеостаза / А.Н. Ложкина // Успехи современной биологии. 1987. - Т. 1, № 4. -С. 36-54.

70. Локшина Л.А. Протеиназы плазматической мембраны лимфоидных клеток и их биологическая функция / Л.А. Локшина II Биоорганическая химия. 1998. -№ 5. - С. 323-331.

71. Лю В.И. Кислородно-перекисная концепция апоптоза и возможные варианты его механизма / В.И. Лю // Успехи современной биологии. -2001.-Т. 121,№5.-С. 488-501.

72. Ляшенко А А. К вопросу о систематизации цитокинов / А. А. Ляшен-ко, В.Ю. Уваров // Успехи современной биологии. 2001. - Т. 121, №6. -С. 589-603.

73. Маринов Б.С. Изменение активности супероксиддисмутазы под действием доноров и акцепторов электронов / Б.С. Маринов, А.Б. Оби-дин, Н.В. Гуляева // Биохимия. 1987. - Т. 52, № 6. - С. 846-849.

74. Мартынова Е.А. Влияние сфинголипидов на активацию Т-лимфоцитов / Е.А. Мартынова // Биохимия. 1998. - Т. 63, № 1.1. С. 122-132.

75. Маурер Г. Диск-электрофорез / Г. Маурер. М.: Мир, 1971. - 247 с.

76. Маянский А.Н. Механизмы рекогнисцировочных реакций нейтрофи-ла / А.Н. Маянский // Успехи современной биологии. 1986. - Т. 102, вып. 3(6). - С. 360-376.

77. Маянский А.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге / А.Н. Маянский, Д.Н. Маянский. Новосибирск : Наука, 1989. - 340 с.

78. Маянский А.Н. Активация макрофагов / А.Н. Маянский, Д.Д. Цырен-доржиев // Успехи современной биологии. 1990. - Т. 109, № 3.1. С. 352-365.

79. Маянский Д.Н. Проблемы хронического воспаления в современной патофизиологии / Д.Н. Маянский // Патологическая физиология. -1994.-№2.-С. 51-55.

80. Маянский А.Н. Проблемы управления фагоцитарными механизмами иммунитета / А.Н. Маянский, A.JI. Невмятуллин, Н.А. Маянский // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1995. -№3.-С. 21-26.

81. Медуницин Н.В. Цитокины и аллергия, опосредованная IgE / Н.В. Медуницин // Иммунология. 1993. - № 5. - С. 11-12.

82. Меныцикова Е.Б. Антиоксиданты и ингибиторы радикальных окислительных процессов / Е.Б. Меньшикова, Н.К. Зенков // Успехи современной биологии. 1993. - Т. 113, № 4. - С. 442-455.

83. Михайлова А.А. Участие медиаторов иммунитета в нейроиммунном воздействии // А.А. Михайлова // Иммунология. 1992. - № 4.1. С. 4-8.

84. Михайлов И.Ф. Флуоресцирующие антитела и методы их применения / И.Ф. Михайлов. -М.: Медицина, 1968. 188 с.

85. Модуляция апоптоза нейтрофилов периферической крови человека УФ-излучением диапазона С и у-излучением / М.Г. Винокуров и др. // Биофизика. 1999. - Т. 44, № 5. - С. 929-930.

86. Молекулярно-клеточные механизмы действия низкоинтенсивного лазерного излучения У Ю.А. Владимиров и др. П Биофизика. 2004. -Т. 49, вып. 2. - С. 339-350.

87. Несмеянов В.А. Рецепторы цитокинов: функциональная асимметрия субъединиц в рецепторном комплексе / В.А. Несмеянов // Биоорганическая химия. 1997. - Т. 23, № 1. - С. 78-80.

88. Олигомерные белки: модуляция УФ-чувствительности и закономерности фотохимических превращений / В.Г. Артюхов и др. // Радиационная биология. Радиоэкология. 2001. - Т. 41, № 1. - С. 78-103.

89. Особенности синтеза фактора некроза опухоли в условиях гиперли-пидемии / Р.П. Огурцов и др. И Иммунология. 1998. - № 6. - С. 20.

90. Пальцев М.А. Межклеточные взаимодействия / М.А. Пальцев, А.А. Иванов. М.: Медицина, 1995. - 224 с.

91. Панков Ю.А. О фундаментальной эндокринологии / Ю.А. Панков // Биохимия. 1997. - Т. 62, № 10. - С. 1373-1375.

92. Патология: Руководство / Под ред. М.А. Пальцева, B.C. Паукова, Э.Г. Улумбекова. М.: ГЭОТАР-МДД, 2002. - 960 с.

93. Поберезкина Н.В. О биологической роли супероксиддисмутазы / Н.В. Поберезкина // Украинский биохимический журнал. 1989. - Т. 61, №2.-С. 57-61.

94. Потапнев М.П. В-лимфоциты. Цитокинобразующая функция / М.П. Потапнев // Иммунология. 1994. - № 4. - С. 4-8.

95. Потапнев М.П. Цитокиновая сеть нейтрофилов при воспалении / М.П. Потапнев // Иммунология. 1995. - № 4. - С. 34-40.

96. Потапнев М.П. Апоптоз клеток иммунной системы и его регуляция цитокинами / М.П. Потапнев // Иммунология. 2002. - № 4. - С. 237243.

97. Практикум по биофизике / В.Г. Арпохов и др.. Воронеж : Изд-во Воронеж, ун-та 2001. - 224 с.

98. Практикум по иммунологии: Учебное пособие / Под ред. И.А. Кондратьевой, В.Д. Самуилова. М.: Изд-во МГУ, 2001. - 224 с.

99. Ройт А. Иммунология / А. Ройт, Д. Бростофф, Д. Мейл. М. : Мир, 2000.-581 с.

100. Роль интерлейкина-1 и его сигнальной трансдукции в иммунокомпе-тентных и нервных клетках в развитии стрессорной реакции / Е.Г. Рыбакина и др. // Иммунология. 1998. - № 6. - С. 23.

101. Роль тимуса в регуляции синтеза цитокинов клетками костного мозга при стрессе / И.В. Богдашин и др. // Иммунология. 1991. - № 5. -С. 30-32.

102. Роль цитокинов в регуляции взаимодействия между Т-хелперами 1 и 2 на клональном уровне / Т.В. Калиниченко и др. // Иммунология. -1996.-№3.-С. 25-29.

103. Рощупкин Д.И. Молекулярные механизмы фотоповреждений биологических мембран / Д.И. Рощупкин // Фотобиология животной клетки. Л., 1979. - С. 5-16.

104. Рощупкин Д.И. Фотобиологические процессы в биомембранах при действии ультрафиолетового излучения на клетки, ткани и органыживотных / Д.И. Рощупкин, М.А. Мурина // Биофизика. 1993. - № 6. -С. 1053-1068.

105. Рощупкин Д.И. Свободнорадикальное и циклооксигеназное окисление липидов в мембранах клеток крови при УФ-облучении / Д.И. Рощупкин, М.А. Мурина // Биологические мембраны. 1998. - Т. 15, №2.-С. 221-226.

106. Ш.Рязанцева Л.Т. Исследование влияния лазерного облучения крови на супероксиддисмутазную активность плазмы методом хемилюминесценции / Л.Т. Рязанцева, О.В. Башарина, В.Г. Артюхов // Материалы Ш съезда фотобиологов России. Воронеж, 2001. - С. 183-184.

107. Самойлова К.А. Выход веществ из лимфоцитов периферической крови человека, облученных коротковолновыми УФ-лучами / К.А. Самойлова, А.П. Миронова, Р.А. Арцишевская // Цитология. 1984.1. Т. 26, № 1. С. 102-108.

108. Симбирцев А.С. Интерлейкин-2 и рецепторный комплекс интерлей-кина-2 в регуляции иммунитета / А.С. Симбирцев // Иммунология. -1998.-№6.-С. 3-8.

109. Славянский А.А. Цитоплазматическая зернистость нейтрофильных лейкоцитов / А.А. Славянский П Клиническая лабораторная диагностика. 2002. - № 3. - С. 39-43.

110. Суслов А.П. Макрофаги и противоопухолевый иммунитет / А.П. Суслов // Итоги науки и техники. Сер. «Онкология». М. : ВИНИТИ, 1990. - Т. 19. - С. 56-60.

111. Таран Г.Н. Система комплемента / Г.Н. Таран // Биохимия. 1993. -Т. 58,№5.-С. 420-428.

112. Теория и практика иммуноферментного анализа / Под ред. А.М. Егорова. М.: Высшая школа, 1991. - 288 с.

113. Тотолян А.А. Клетки иммунной системы (1-П) / А.А. Тотолян, И.С. Фрейндлин. СПб.: Наука, 2000. - 231 с.

114. Турпаев К.Т. Активные формы кислорода и регуляция экспрессии генов / К.Т. Турпаев // Биохимия. 2002. - Т. 67, вып. 3. - С. 339-352.

115. Ультрафиолетовая фотомодификация функционального состояния лейкоцитов / Е.Б. Жибурт и др. // Эфферентная терапия. 1995.1. Т. 1, № 3. С. 56-58.

116. Ушлакова В.Н. Анализ свободных радикалов липидов крови спек-трофотометрическим, флюорометрическим и кинетическим методами / В.Н. Ушлакова // Лабораторное дело. 1987. - Т. 6. - С. 446-450.

117. Фрейндлин И.С. Система мононуклеарных фагоцитов / И.С. Фрейндлин. М.: Наука, 1984. - 272 с.

118. Фрейндлин И.С. Ключевая позиция макрофагов в цитокиновой регу-ляторной сети / И.С. Фрейндлин // Иммунология. 1995. - № 3.1. С. 44-48.

119. Фрейндлин И.С. Дефекты цитокиновой сети и принципы их коррекции / И.С. Фрейндлин, Н.К. Артеменко, Г.С. Фрейндлин // Иммунология. 1998. - № 6. - С. 23-25.

120. Фрейндлин И.С. Клетки иммунной системы (Ш-IV) / И.С. Фрейндлин, А.А. Тотолян. СПб.: Наука, 2001. - 390 с.

121. Фридович И. Радикалы кислорода, пероксид водорода и токсичность кислорода. Свободные радикалы в биологии// И. Фридович. М. : Мир, 1979. - Т. 1. - С. 272-308.

122. Фридрих П. Ферменты: четвертичная структура и надмолекулярные комплексы // П. Фридрих. М.: Мир, 1986 - 374 с.

123. Хаитов Р. М. Иммуногенетика и иммунология: резистентность к инфекциям / Р. М. Хаитов, В. М. Манько, Л. П. Алексеев. Ташкент, 1991.-С. 75-186.

124. Хаитов Р.М. Некоторые избранные проблемы функциональной активности макрофагов / Р.М. Хаитов, В.М. Земсков // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. -1995. № 3.1. С. 27-32.

125. Хаитов P.M. Вторичные иммунодефицита: клиника, диагностика, лечение / Р.М. Хаитов, Б.В. Пинегин // Иммунология. 1999. - № 1. -С. 14-17.

126. Хаитов P.M. Современные представления о защите организма от инфекции / P.M. Хаитов, Б.В. Пинегин // Иммунология. 2000. - № 1. -С. 61-64.

127. Химическая энциклопедия : в 5-ти т. / Под ред. И. JI. Кнунянц. М.: Советская энциклопедия, 1988. - Т. 1. - С. 339.

128. Шичкин В.П. Патогенетическое значение цитокинов и перспективы цитокиновой/антицитокиновой терапии / В.П. Шичкин // Иммунология. 1998. -№ 2. - С. 9-13.

129. Щепеткин И.А. Регуляция функциональной активности нейтрофилов цитокинами / И.А. Щепеткин, Н.В. Чердынцева, Н.В. Васильев // Иммунология. 1994. - № 1. - С. 4-6.

130. Юинг Г. Инструментальные методы химического анализа / Г. Юинг. -М.: Мир, 1989. 608 с.

131. Ярилин А.А. Система цитокинов и принципы ее функционирования в норме и при патологии / А.А. Ярилин // Иммунология. 1997. - № 5. -С. 7-14.

132. Ярилин А.А Основы иммунологии / А. А. Ярилин. М. : Медицина, 1999.-607 с.

133. Яровая Г.А. Система комплемента / Г.А. Яровая, Ю.Е. Ершикова. -М. ЦОЛИУВ, 1990. 58 с.

134. A random, controlled trial of IL-10 in human } A.E. ChernofF et a.] // J. Immunol. 1995. - Vol. 156. - P. 5492-5499.

135. Abbas A. Functional diversity of helper T lymphocytes / A. Abbas, K. Murphy, A. Sher И Nature. 1996. - V. 383. - P. 787-793.

136. Actin and tubulin co-cap with surface immunoglobulins in mouse В lymphocytes / G. Gabbiani et al. // Nature. 1977. - Vol. 269 - P. 697-698.

137. Activation of human polymorphonuclear neutrophils by tumor necrosis factor-alpha / M.R. Shalaby {et al. // J. Leukocyte Biol. 1989. - Vol. 41. -P. 196-204.

138. Aderka D. Stabilization of the bioactivity of tumor necrosis factor by its soluble receptors / D. Aderka, H. Engelman, Y. Maor // J. Exp. Med. -1992.-V. 175.-P. 323-331.

139. Adherence of neutrophils induces release of soluble tumor necrosis factor receptor forms / M. Lantz et al. // J. Immunol. 1994. - V. 152.1. P. 1362-1369.

140. Aggarwal B. Cytokines: from clone to clinic / B. Aggarwal, E. Pocsik // Arch. Biochem. Biophys. 1992. - Vol. 292. - P. 335-345.

141. Alterations in СЗ, C4, factor B, and related metabolites in septic shock / R. Lin et al. // Clin. Immunol, and Immunopathol. 1993. - Vol. 69, № 2. -P. 136-142.

142. Babior B.M. NADPH-oxidase: an update / B.M. Babior // Blood. 1999. -Vol. 93, № 5. - P. 1464-1476.

143. Bakhid M. Potential role of autoantibodies in the regulation of cytokine responses during bacterial infections / M. Bakhid, A. Diab, G. Monamustafa // Infect. Immunol. 1997. - V. 65. - 3300-3303.

144. Baner I. Regulation of interleukin 6 receptor expression in human monocytes and monocyte derived macrophages. Comparison with the expression in human hepatocytes / I. Baner, T.M. Baner, T. Kalb // J. Exp. Med. -1989.-V. 170.-P. 1537-1550.

145. Basu-Modak S. Singlet oxygen: a primary effector in the ultraviolet A/near-visible light induction of the human heme oxygenase gene // S. Basu-Modak, R.M. Tyrrell // Cancer Res. 1993. - V 53. - P. 4510-4550.

146. Bell S. A selective defect in IgM antigen receptor synthesis and transport causes loss of cell surface IgM expression on tolerant В lymphocytes / S. Bell, C. Goodnow // The EMBO Journal. 1994. - Vol.13. - P. 816-826.

147. Bentley G.A. The structure of the T ceU antigen receptor / G.A. Bentley, R.A. Mariuzza // Ann. Rev. Immunol. 1996. - Vol. 15. - P. 563-590.

148. Beta-actinin is equivalent to CapZ protein. / K. Maruyama et al. // Biol. Chem. 1990. - V. 265. - P. 8712-8715.

149. Beutler B. TNF, apoptosis and autoimmunity: A common thread? / B. Beutler, F. Bazzoni // Blood Cells, Molecules, and Diseases. -1998.1. V. 24, №2.-P. 216-230.

150. Biron С. Effects of IL-12 on immune responses to microbial infections: a key mediator in regulating disease outcome / C. Biron, R. Gazzinelly // Curr. Opin. Immunol. 1995. - Vol. 7. - P. 485-496.

151. Borsos T. Immune hemolysis and the functional properties of the second and fourth components / T. Borsos, H. J. Rapp, H.R. Colten H J. Immunol. 1970. -V. 105. - P. 1439-1446.

152. Boym A. Separation of blood leukocytes, granulocytes and lymphocytes / A. Boym // Tissue antigens. 1974. - № 4. - P. 269-274.

153. Bradley J. Processed MHC class I alloantigen as the stimulus for CD4+ T-cell depend antibody-mediated graft rejection /J. Bradley, A. Mowat, E. Bolton // Immunol. Today. 1992. - Vol.13. - P. 3434-438.

154. Breedveld F. New tumor necrosis factor-alpha therapies for rheumatoid arthritis / F. Breedveld // Eur. Cytokine Netw. 1998. - Vol. 9.1. P. 233-238.

155. Campbell К. В lymphocyte antigen receptors (mlg) are non-covalently associated with a disulfide linked, inducibly phosphorylated glycoprotein complex / K. Campbell, J. Cambier // The EMBO Journal. 1990.1. Vol. 9.-P. 441-448.

156. Campbell R.D. Amino acid sequence the thiol and reactive acyl groups of human complement / R.D. Campbell, J. Gagnon, R.R. Porter // Biochem. J. -1981. V. 199. - P. 359-370.

157. Carswell E.A. An endotoxin-induced serum factor that causes necrosis of tumots / E.A. Carswell, L.J. Old, R.L. Kassel // Proc. Acad. Sci. USA. -1975. Vol. 72. - P. 3666-3670.

158. Cassatella M.A. The production of cytokines by polymorphonuclear neutrophils / M.A. Cassarella / Immunol. Today. 1995. - Vol. 16.1. P. 21-26.

159. Changes in cytokine levels during reactivation of Toxplasma gondii infection in lungs / G. Fittce let al. // Infect. Immunol. 1999. - V. 67.1. P. 2082-2089.

160. Clydesdale G. Ultraviolet light induced injury immunological and inflammatory effects / G. Clydesdale, G.W. Dandie, H.K. Muller // Immunol. Cell. Biol. 2001. - V. 79. - P. 547-568.

161. Collagen-induced arthritis in TNF receptor-1-deficient mice: TNF recep-tor-2 can modulate arthritis in the absence of TNF receptor-1 / Y. Tada et al.J // Clin. Immunol. 2001. - V. 99, № 3. - P. 325-333.

162. Colten H.K. Complement deficiencies / H.K. Colten, F.S. Rosen // Ann. Rev. Immunol. 1992. - Vol. 10. -P. 809-834.

163. Condeelis J. Isolation of concanavalin A caps during various stages of formation and their association with actin and myosin / J. Condeelis // J. Cell Biology. 1979. - Vol. 80. - P. 751-758.

164. Cooper N.R. Complement viruses and virus-infected cells / N. R. Cooper, G.R. Nemerov // Springer Seminars Immunopathol. 1983. - V. 6, № 4. -P. 327-347.

165. Copeland K.T. T helper cell activation and human retroviral pathogenesis / K.T. Copeland, J.L. Heeney // Microbiol. Rev. 1996. - V. 60.1. P. 724-742.

166. Cosman D. The hematopoietin receptor superfamily / D. Cosman // Cytokine. 1993. -V. 6. - P. 95-106.

167. Coyne K.E. Mapping of epitopes, glycosylation sites, and complement regulatory domains in human decay accelerating factor / K.E. Coyne, S.E. Hall, E.S. Thompson // J. Immunol. 1992. - Vol. 149. - P. 2906-2913.

168. Crystal structure of extracellular human BAFF, a TNF family member that stimulates В lymphocytes / M. Karpusas et al. // J. Molecular Biology. -2002. V.315,№ 5. -P. 1145-1154.

169. Danpure H.J. Oxygen-dependence of near UV (365 nm) lethality and the interaction of near UV and X-rays in two mammalian cell lines / H. J. Dan-pure, R.M. Тупей 11 Photochem. Photobiol. -1976. V. 23. - P. 171-177.

170. Davies K.A. Complement deficiency and immune complex disease / K.A. Davies, J.A. Schifferli, MJ. Walport // Springer Semin. Immunopathol. -1994.-Vol. 15.-P. 397-416.

171. Differential effects between maiymastat, a TNF-converting enzyme inhibitor, and anti-TNF-antibody on murine models for sepsis and arthritis / F. Tsuji et al.J //Cytokine. 2002. V. 17, № 6. - P. 294-300.

172. Dinarello C.A. Inflammatory cytokines: interleukin 1 and tumor necrosis factor as effector molecules in autoimmune diseases / C.A. Dinarello // Curr. Opin. Immunol. 1991. - V. 3. - P. 941-948.

173. Discrete generation of superoxide and hydrogen peroxide by T-cell receptor stimulation: selective regulation of mitogen-activated protein kinase activation and fas ligand expression / S. Devadas et al. // J. Exp. Med. -2002.-Vol. 195.-P. 59-70.

174. Disulfiram inhibits TNF-induced cell death / A. Zhao et al. // Cytokine. -2000. V. 12, № 9. - 1356-1367.

175. Dodds A.W. The reaction mechanism of the internal thioester in the human complement component C4 / A.W. Dobbs, X.D. Ren, A. C. Willis // Nature. 1996. - Vol. 379. - P. 177-179.

176. Durum S.K. Proinflammatory cytokines and immunity / S.K. Durum, J.J. Oppenheim // Fundamental Immunology. New York, 1993.1. P. 801-835.

177. Effect of T-cells on the complement production by monocytes / H. Tsuka-moto et al. // Cellular Immunology. 1993. - Vol. 146, № 2.1. P. 382-390.

178. Endogenous IFN-a J3 suppresses colony-stimulating factor (CSF)-l stimulated macrophages DNA synthesis and mediates inhibitory effects of lipopolysaccharide and TNF-a / J.A. Hamilton et al. // J. Immunol. -1996. V. 156. - P. 2553-2557.

179. Endogenous oxygen radicals modulate protein tyrosine phosphorylation and JNK-1 activation in lectin-stimulated thymocytes / G. Pani et al. // Biochem. J. 2000. - V. 347. - P. 173-181.

180. Evidence that singlet oxygen-induced human T-helper cell apoptosis is the basic mechanism of ultraviolet-A radiation phototherapy / A. Morita et al. // J. Exp. Med. 1997. - V. 186. - P. 1763-1768.

181. Evolutionary conserved rigid module-domain interactions can be detected at the sequence leVel: the examples of complement and blood coagulation proteases / G. Gaboriaud et al. // J. Molec. Biology. 1998. - Vol. 282, №2.-P. 459-470.

182. Fantone J.C. Role of oxygen-derived free radicals and metabolites in leukocyte-dependent inflammatory reactions /J.C. Fantone, P.A. Ward // Am. J. Phatol. -1982. Vol. 107. - P. 397-418.

183. Fearon D.T. Identification of the membrane glycoprotein that the C3b receptor of the human erythrocyte, polymorphonuclear leukocyte, В lymphocyte and monocyte / D.T. Fearon // J. Exp. Med. 1980. - Vol. 152. -P. 20-30.

184. Fedczyna Т.О. Expression of TNF by muscle fibers in biopsies from children with untreated juvenile dermatomyositis: association with the TNF-308A allele / Т.О. Fedczyna, J. Lutz, M. Pachmanl // Clinical Immunology. 2001. - V. 100, № 2. - P. 236-239.

185. Fernandez-Botran R. Soluble cytokine receptors: their role in immunoregu-lation / R. Femandez-Botran // FASEB J. 1991. - V. 5. - P. 2567-2574.

186. Ferrari R. The role of TNF in cardiovascular disease / R. Ferrari // Pharmacological Research. 1999. - V. 40, № 2. - P. 97-105.

187. Finkel T. Oxygen radicals and signaling / T. Finkel I I Curr. Opin. Cell Biol. -1998. -Xo 10. P. 248-253.

188. Fischer E. Characterization on the human glomerula C3 receptor as the C3b/C4b complement type one (CR1) receptor / E. Fischer, M.D. Appay, J. Cook //J. Immunol. 1986. - Vol. 136, № 4. - P. 1373-1377.

189. Flanagan J. Cross-linked surface Ig attaches to actin / J. Flanagan, G.L. Koch // Nature. -1978. Vol. 273. - P. 278-281.

190. Frank M. The role of complement in inflammation and phagocytosis / M. Frank, L. Fries // Immunol. Today. 1991. - V. 12. - P. 322-328.

191. Frick G. Fibel der Ultraviolettbestrahlung des Blutes / G. Frick. -Munchen: Hans Muller Verlag, 1993. S. 89.

192. Fridman W. Fc receptors and immunoglobulin binding factors / W. Frid-man // FASEB J. 1991. - Vol. 5. - P. 2684-2689.

193. Fujita T. Human C4 binding protein. П. Role in proteolysis of C4b by C3b inactivator / T. Fujita, I. Gigli, V. Nussenzweig // J. Exp. Med. 1978. -Vol. 148.-P. 1044-1051.

194. Furth R. van. Production and migration of monocytes and kinetics of macrophages. Mononuclear Phagocytes / R. van Furth. Leiden, 1992. -P. 3-12.

195. Gallard R. The cytokine. Facts book / R. Gallard, A. Gearing. London, 1994.-265 p.

196. Gamaley I. A. Roles of reactive oxygen species: signaling and regulation of cellular function / I.A. Gamaley, I.V. Klyubin // Int. Review. Cytol. -1999.-№188.-P. 203-255.

197. Gleichmann E. T-lymphocyte subpopulation in immunotoxicology / E. Gleichmann // Immunol. Today. 1998. - V. 19. - P. 586.

198. Godar D. Special dependence of UV-induced immediate and delayed apoptosis: the role of membrane and DNA damage / D. Godar, A.D. Lucas //Photochem. Photobiol. 1995. - V. 62. - P. 108-113.

199. Godar D. UVA1 radiation triggers two different final apoptosis pathway / D. Godar // J. Invest. Dermatol. 1999. - V. 122, № 1. - P. 3-12.

200. Goeddell D.V. Signal transduction by TNF receptors / D.V. Goeddell // Tolerance and autoimmunity. Keystone, 1997. - P. 7.

201. Hall R.E. Cell-free synthesis of the fourth component of guinea pig complement (C4): Identification of a precursor of serum (pro-C4) / R.E. Hall, M.R. Colten // Proc. Natl. Acad. USA. 1977. - V. 74. - P. 1707-1710.

202. Henderson В. Therapeutic modulation of cytokines / B. Henderson // Ann. Rheum. Dis. -1995. V. 54. - P. 519-523.

203. Holers V.M. The evolution of mouse and human complement C3-binding proteins: divergence of form but conservation of function / V.M. Holers, T. Kinoshita, H. Molina // Immunol. Today. 1992. - Vol. 13.1. P. 231-236.

204. Hoover R.L. Inhibition of cap formation on lymphocytes by free fatty acids is not mediated by a depletion of ATP / R.L. Hoover, R. Klausner, M. Karnovsky 11 J. Biol. Chem. 1982. - Vol. 257. - P. 2151-2154.

205. Human C4 binding protein. I. Isolation and characteristics / J. Scharfstein et al.J //J. Exp. Med. 1978. - Vol. 148. - P. 207-221.

206. Identification of IL-1 receptors of human monocytes / F. Uhl et al. // J. Immunol.-1989.-Vol. 142.-P. 1576-1581.

207. Identification of superoxide generating NADPH oxidase system in human fibroblasts / B. Meier et al. // Biochem. J. 1991. - № 275.1. P. 241- 245.

208. Induction of neutrophil respiratoiy burst by tumor necrosis factor-alpha; priming effect of solid-phase fibronectin and intervention of CD lib-CD 18 integrins / P. Dapino et al. // Clin. Exp. Immunol. -1993. V. 94.1. P. 533-538.

209. Inhibition of macrophage inflammatoiy protein 1 a expression by EL-10. Differential sensitivities in human blood monocytes and alveolar macrophages / N. Berkman et al. // J. Immunol. 1995. - V. 155.1. P. 4412-4418.

210. Interferon-induced biosynthesis of complement components C2, C4 and factor H by human proximal tubular epithelial cells / J. Gerritsma et al. // Cytokine. -1997. Vol. 9, № 4. - P. 276-283.

211. Jaattela M. Biologic activities and mechanisms of action of tumor necrosis factor a/ cachectin / M. Jaattela // Laboratory Investigation. 1991.1. Vol. 64, №6.-P. 724-741.

212. Jinguan T. Regulation of human T lymphocytes chemotaxis in vitro by T cell-derived cytokines IL-2, IL-10 and IL-13 / T. Jinguan, B. Delenran, B. Gesser // J. Immunol. -1995. V. 154. - P. 3742-3752.

213. Johansson A. Chemokines and chemokine receptors / A. Johansson, A.

214. Hansson, S. Holmdahi. Keystone, 1999. - P. 41.

215. Kim H.A. TNF-mediated apoptosis in chondrocytes sensitized by MG132 or actinomycin / H.A. Kim, Y.W. Song // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2002. - V. 295, № 4. - P. 934-944.

216. Kronke M. Tumor necrosis factor signal transduction / M. Kronke, S. Schutze, P. Scheurich // Cell. Signalling. 1990. - V. 2. - P. 1-8.

217. Kiych M. A secreted small form of human complement C3b/C4b receptor / (CR1), that binds to C4b but not C3b / M. Krych, M.W. Nickells, J.P. Atkins // FASEB Joum. -1989. Vol 3, № 3. - P. 368.

218. Kulms D. Ultraviolet radiation-indused IL-6 release in HeLa cells is mediated via membrane events in a DNA damage independent way / D. Kulms, B. Poppelman, T. Schwarz // J. Biol. Chem. - 2000. - Vol. 275. -P. 15060-15066.

219. Kulms D. Ultraviolet radiation inhibits IL-2-induced tyrocine phosphorylation and the activation of STAT5 in T lymphocytes / D. Kulms, T. Schwarz // J. Biol. Chem. 2001. - Vol. 276. - P. 12849-12855.

220. Lambris J.D. Isolation of lymphocyte complement receptor type two (C'3dг ^receptor) and preparation of receptor specific antibody / J.D. Lambris, N. Dobson, G. Ross // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. - Vol. 78. -P. 1828-1832.

221. Lambris J.D. Characterization of the lymphocyte membrane receptor for Factor H (plH globulin) with an antibody to factor H idiotype / J.D. Lambris, G. Ross // J. Exp. Med. -1982. Vol. 155. - P. 1400-1440.

222. Liszewski M.K. Control of the complement system / M.K. Liszewski, T.C. Fairies, D.M. Lublin//Adv. Immunol. -1996. Vol. 61. - P. 201-283.

223. Loor F. Plasma membrane and cell cortex interactions in lymphocyte functions / F. Loor // Adv. Immunol. -1980. Vol. 30. - P. 1-120.

224. Matsushima К. Review article: interleukin 8 and MCAF: novel inflammatory cytokines inducible by IL-1 and TNF / K. Matsushima, J. J. Oppen-heim // Cytokine. 1989. - V. 1. - P. 2-6.

225. McCall T. Synthesis of nitric oxide from L-arginine by neutrophils. Release and interaction with superoxide anion / T. McCall, N.K. Broughton-Smith, R. Palmer // Biochem. J. 1989. - Vol. 261. - P. 293-296.

226. Miley G.P. Ultraviolet blood irradiation. A history and guide to clinical application (1933-1997) / G.P. Miley, R.C. Olney, H.T. Lewis // The Foundation for blood irradiation Inc. Silver Spring, 1997. - 253 p.

227. Miller M.D. Biology and biochemistry of the chemokines: a family of chemotactic and inflammatory cytokines / M.D. Miller, M.S. Krangel // Crit. Rev. Immunol. 1992. - V. 12. - P. 17-46.

228. Modulation of T-helper cell responses: in vitro competition between Thl and ТЪ2 clones / T. Orris et al. // Lymphocyte activation. Keystone Symp., 1996.-P. 145.

229. Moon К E. Complement primary structure of human C4a anaphylatoxin / K.E. Moon, J.P. Gorski, Т.Е. Hugh // J. Biol. Chem. 1981. - V. 256.1. P. 8685-8692.

230. Morgan B.P. Complement regulatory molecules: application to therapy and transplantation / B.P. Morgan // Immunol. Today. 1995. - Vol. 16.1. P. 257-259.

231. Nagasawa S. Cleavage of C4b by C3b inactivator: production of a nicked form of C4, C3b, as an intermediate cleavage product of C4b by C3b inactivator / S. Nagasawa, C. Ichihara, R.M. Stroud П J. Immunol. 1980. -Vol. 125.-P. 578-582.

232. Nakajama R. Association between virulence of Yersinia pestis and suppression of gamma interferon and tumor necrosis factor alpha / R. Naka-jama, R.R. Brubaker 11 Infect. Immunol. -1993. V. 61. - P. 23-31.

233. Niedel J. Receptor-mediated uptake and degradation of 1251 chemotactic peptide by human neutrophils / J. Niedel, S. Wilkinson, P. Cuatrecasas // J. Biol. Chem. 1979. - Vol. 254. - P. 10700-10706.

234. NMR studies of a viral protein that mimics the regulators of complement activation / A. Wiles et al. // J. Molec. Biology. 1997. - Vol. 272, № 2. -P. 253-265.

235. Non-enzymatic triggering of the ceramide signaling cascade by UVA radiation / S. Grether-Beck et al. // EMBO J. 2000. - V. 19.1. P. 5793-5800.

236. Padovan E. Modulation of cytokines in human Th clones by antigenic and non-antigenic penicillins / E. Padovan, H.U. Weltzien // Tolerance and autoimmunity. Keystone Symp., 1997. - P. 47.

237. Panzer S. Interaction of IL-бр, IL-6 and tumor necrosis factor-alpha (TNFa) in human T cells activated by murine antigens / S. Panzer, M. Madden, K. Matsuki // Clin. Exp. Immunol. 1993. - V. 93. - P. 471-478.

238. Parriilo J.E. Phatogenetic mechanisms of septic shock / J.E. Parrillo // N. Engl. J. Med. 1993. - V. 328, № 19. - P. 1471-1477.

239. Pierce J.H. Salicylates inhibit 1кВ-а phosphorilation, endothelial-leukocyte adhesion molecule expression, and neutrophil transmigration / J.H. Pierce, M. Read, H. Ding // J. Immunol. -1996. Vol. 156.1. P. 3961-3969.

240. Polymorphisms at position-308 in the promoter region of the TNF and in the first intron of the TNF-genes and spontaneous and lipopolysaccharide induced TNF-release in sarcoidosis / A. Somosk et al. // Cytokine. -1999. V. 11, № 11. - P. 882-887.

241. Prognostic values of tumor necrosis factor/cachectin, interleukin 1, interferon a and interferon у in the serum of patients with septic shock / T. Ca-landra et al. // J. Infect. Dis. -1990. V. 161. -P. 982-987.

242. Rapid local expression of interleukin-12, tumor necrosis factor alpha, and gamma interferon alter cutaneous Francisella tularensis infection in Tula-remia-immune mice / S. Stenmark et al. // Infect. Immun. 1999.1. Vol. 67. -P. 1789-1797.

243. Recombinant tumor necrosis factor: its effect and synergism with interferon on variety of normal and transformed human cell lines / L. Fransen et al. // Europ. J. Cancer. Clin. Oncol. 1986. - Vol. 22.№ 4.1. P. 419-426.

244. Reid K.B. Complement system proteins which interact with C3b or C4b: a superfamily of structurally related proteins / K.B. Reid, D. R. Bentley, D.R. Campbell // Immunol. Today. 1986. - Vol. 7. - P, 230-234.

245. Ress R.C. Cytokines: their role in regulation immunity and the response to infection / R.C. Ress // Rev. Med. Microbiol. 1992. - V. 3. - P. 9-14.

246. Robbins R. Inducible nitric oxid synthase is increased in murine lung epithelial cells by cytokine stimulation / R. Robbins, D. Springall, J. Warren II Biochem. Biophys. Res. Comm. -1994. Vol. 198. - P. 835-843.

247. Role of cholesterol in the capping of surface immunoglobulin receptors on murine lymphocytes / R.L. Hoover et al. // J. Cell Biology. 1983. -Vol. 97.-P. 73-80.

248. Rothbard J. Interaction between immunogenic peptides and MHC proteins / J. Rothbard, M. Gefter // Annu. Rev. Immunol. 1991. - Vol. 9.1. P. 527-535.

249. Rubin B.J. Nonhematopoietic cells selected for resistance to tumor necrosis factor produce tumor necrosis factor / B.J Rubin , S.L Anderson , S.A. Sullivan//J. Exp. Med.-1986.-Vol. 164, N94. -P. 1350-1355.

250. Ryter S.W. Singlet molecular oxygen (^Oi): a possible effector of eukari-otic gene expression / S.W. Ryter, R.M. Tyrrell // Free Radic. Biol. Med. -1998. № 24. - P. 1520-1534.

251. Sam H. Deficiency in tumor necrosis factor alpha activity does not impair early protective Thl responses against blood-stage malaria / H. Sam, Z. Su, M. Stevenson // Infect. Immunol. -1999. V. 67. - P. 2660-2664.

252. Samoilova K.A. Ultraviolet irradiation of blood: mechanisms of wide therapeutic effect / K.A. Samoilova, S.A. Snopov, K.D. Obolenskaya //

253. Biological effects of light. Berlin, New York : Walter de Gruyter, 1996. -P. 199-203.

254. Sauer H. Reactive oxygen species as intracellular messenger during cell growth and differentiation / H. Sauer, M. Wartenberg, J. Hescheler // Cell. Physiol. Biochem. 2001. - V. 11, № 4. - P. 173-186.

255. Schreier G.F. Membrane and cytoplasmic changes in В lymphocytes induced by ligand surface Ig interaction / G.F. Schreier, E.R. Unanue // Adv. Immunol. 1976. - Vol. 24. - P. 37-165.

256. Selective cytokine production by epithelian cells following exposure to Escherichia coli / W. Agace et al. // Infect. Immun. 1993. - V. 61.1. P. 602-609.

257. Stingl G. Dendritic cells: a major story unfolds / G. Stingl, P. Bergstresser // Immunol. Today. -1995. Vol. 16. - P. 330-333.

258. Structural basis of the polymorphism of human complement components Ota and C4b: gene size, reactivity and antigenicity / C. Y. Yu et al. // The EMBO Journal. 1986. - V. 5. - P. 2873-2881.

259. Sutton H.S. Peroxidase and catalase / H.S. Sutton, N.H. Becker // New

260. York. Acad. Scien. 1969. - V. 159. - P. 497-502.»

261. The intracellular oxidation of 2, 7 -dichlorofluorescin in murin T lymphocytes / D.M. Van Reyk et al. // Free Radic. Biol. Med. 2001. - № 30. -P. 82-88.

262. TNF induces and insulin inhibits caspase 3-dependent adipocyte apoptosis / H. Qian et al. // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2001. - V.284, № 5. - p. 1176-1183.

263. Transforming growth factor-02 regulates C3 secretion in monocytes through a protein kinase C-dependent pathway / S. Drouin et al. // Molec. Immunol. -1998. Vol. 35. - P. 1-12.

264. Turner J.R. Purification and characterization of the membrane protein (gp 45-70) that is a cofactor for cleavage of C3b and C4b / J.R. Turner, J.P. Atcinson // J. Exp. Med. 1986. - Vol. 163, № 4. - P. 837-855.

265. Ultraviolet iiTadiation accelerates apoptosis in human polymorphonuclear leukocyte: protection by LPS and GM-CSF / J. F. Sweeney et al. // J. Leukocyte Biol. 1997. - Vol. 62. - P. 517-523.

266. Unkless J.C. Function and heterogeneity of human Fc receptors for immunoglobulin G / J.C. Unkless // J. Clin. Invest. 1989. - Vol. 83.1. P. 355-361.

267. Van der Winkel J. Biology of human immunoglobulin G Fc receptors / J. Van der Winkel, C.L. Anderson // J. Leukoc. Biol. 1991. - Vol. 49.1. P. 511-524.

268. Van der Winkel J. Human IgG Fc receptor geterogeneity: molecular aspects and clinical implications / J. Van der Winkel, P. Capel // Immunol. Today. 1993. - Vol. 14. - P. 215-220.

269. Vassali P. The pathogphysiology of tumor necrosis factor / P. Vassali // Annu. Rev. Immunol. 1991. - V. 10. - P. 411-452.

270. Vignais P.V. The superoxide generating NADPH-oxidase: structural aspects and activation mechanism / P.V. Vignais // Cell Mol. Life Sci. -2002. Vol. 59, № 9. - P. 1428-1459.

271. Wasylyk C. The immunoglobulin heavy-chain B-lymphocyte enhancer efficiently stimulates transcription in non-lymphoid cells / C. Wasylyk, B. Wasylyk // The EMBO Journal. 1986. - Vol. 5. - P. 553-560.

272. Weber K. The reliability of molecular weight determinations by dodecyl sulfate polyacrilamide gel electrophoresis / K. Weber, M. Osborn // J. Biol. Chem. - 1969. - V. 244, № 16. - P. 4406-4412.

273. Weiss S. Handbook of Inflammation / S. Weiss. Amsterdam-New York-Oxford, 1983.-P. 37-87.

274. Whaley K. Molecular aspect of complement activation / K. Whaley, A. Ferguson // Molec. Asp. Med. 1981. - Vol. 4, № 3-4. - P. 209-273.

275. Winter M. Preclinical safety assessment of the recombinant TNF receptor-immunoglobulin Fusion Protein / M. Winter // Clinical Immunology and Immunopathology. 1997. - V. 83, № 1. - P. 21-24.

276. X-ray crystal structure of the Old fragment of human complement component C4 / J. Van den Elsen et al. // J. Molec. Biology. 2002. - Vol. 322, № 3. - P. 414-428.

Информация о работе

Двурекова, Евгения Александровна
кандидата биологических наук
Воронеж, 2005
ВАК 03.00.02

Диссертация

Структурно-функциональное состояние иммуноцитов при их взаимодействии с гуморальными факторами иммунной системы в условиях УФ-облучения - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы