Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональное исследование химазоподобной протеазы - нового фермента из дуоденума быка

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Соколова, Елена Александровна

ВВЕДЕНИЕ.

I. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДУОДЕНАЗЫ И ХИМАЗ, ФЕРМЕНТОВ, СТРУКТУРНО РОДСТВЕННЫХ ХИМАЗОПОДОБНОЙ ПРОТЕАЗЕ (литературный обзор).

1. Дуоденаза, сериновая протеаза эпителиоцитов бруннеровых желез.

1.1. Локализация и предполагаемая биологическая роль дуоденазы.

1.2. Молекулярные свойства и структура дуоденазы.

1.3. Энзиматические свойства дуоденазы.

2. Химазы тучных клеток.

2.1. Гетерогенность и биологическая значимость тучных клеток.

2.2. Тканевая локализация и молекулярные свойства химаз.

2.3. Структурные особенности химаз.

2.4. Упаковка и хранение химаз в секреторных гранулах.

2.5. Активация предшественников химаз.

2.6. Субстратная специфичность химаз.

2.6.1. Синтетические субстраты.

2.6.2. Полипептидные и белковые субстраты.

2.7. Ингибиторы химаз.

2.7.1. Синтетические ингибиторы.

2.7.2. Природные ингибиторы химаз.

2.8. Физиологическая роль химаз.

II. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Очистка фермента.

2. Критерии чистоты и молекулярные свойства фермента.

3. Стабильность фермента.

4. N-концевая последовательность ChIP.

5. Влияние рН, температуры и ионной силы на активность фермента.

6. Субстратная специфичность ChIP.

6.1. Синтетические субстраты.

6.2. Природные полипептидные субстраты.

7. Ингибиторный анализ.

8. Иммунногистохимическая локализация ChIP.

III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

1. Материалы.

2. Методы.

2.1. Очистка химазоподобной лротеазы.

2.2. Определение белка.

2.3. Определение активности.

2.4. Определение концентрации фермента.

2.5. Определение кинетических параметров гидролиза субстратов.

2.6. Гидролиз белков и пептидов ChIP.

2.7. Масс-спектрометрический анализ.

2.8. Гель-электрофорез.

2.9. Аналитические методы определения ChIP.

2.10. Определение рН-зависимости ChIP.

2.11. Ингибирование ChIP.

2.12. Определение N-концевой последовательности белка.

2.13. Получение антител к ChIP.

2.14. Иммуногистохимический анализ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-функциональное исследование химазоподобной протеазы - нового фермента из дуоденума быка"

Протеолитические ферменты (протеазы), в том числе сериновые протеазы, играют важную роль в регуляции многообразных биологических процессов всех живых организмов, осуществляя модификацию биологически активных белков и пептидов и тем самым определяя начало или прекращение физиологических процессов.

Сериновые протеазы широко распространены в природе и присутствуют как в микроорганизмах, так и в высших растениях и животных, включая человека.

Все сериновые протеазы на основании данных об их пространственном строении разделяют на три семейства: химотрипсина, субтилизина и карбоксипептидазы II. Представители этих семейств берут начало от разных эволюционных предшественников и отличаются друг от друга по первичной структуре и пространственной укладке полипептидных цепей. Однако, все сериновые протеазы разными эволюционными путями пришли к одинаковому каталитическому механизму и содержат в активном центре молекулы каталитически активные остатки His, Ser и Asp в идентичной геометрической ориентации.

Семейство химотрипсина включает большое число протеаз из бактериальных и высших организмов и привлекает большой интерес исследователей. В организме они выполняют как деструктивную, так и регуляторную функции: гидролиз белковых компонентов пищи (ферменты поджелудочной железы трипсин, химотрипсин, эластаза,); посттрансляционный процессинг ферментов, гормонов, цитокинов (энтеропептидаза, калликреин, трипсин, гранзим В); участие в каскадных реакциях активации зимогенов ферментов, контролирующих процесс свертывания крови и фибринолиза (плазмин, тромбин, факторы Va, Vila, Villa, 1Ха,Ха и др.) и системы комплемента (факторы С1г, C1s, I, D). Кроме того, сериновые протеазы этого семейства играют существенную роль в клеточной дифференциации и пролиферации.

Для многих ферментов к настоящему времени хорошо известны энзиматические свойства и выявлены их природные субстраты. Однако, существует ряд сериновых протеаз семейства химотрипсина, изучение которых началось сравнительно недавно. К числу таких ферментов относятся протеазы секреторных гранул гемопоэтических клеток млекопитающих, объединенных в группу так называемых гранзимоподобных протеаз - химазы тучных клеток, катепсин G нейтрофилов, гранзимы цитотоксических Т-лимфоцитов и натуральных киллеров. До сих пор их точная биологическая роль не установлена, но многочисленные данные свидетельствуют о том, что они играют важную роль в иммунном ответе организма, поддержании гомеостаза, развитии ряда патофизиологических процессов. Так, например, для гранзимов А и В из цитотоксических Т-лимфоцитов показано, что они участвуют в запуске апоптических процессов клеток-мишеней, инициируя каскад активации каспаз, важных ферментов апоптоза. Активность катепсина G связана с фагоцитозом - функцией азурофильных гранул, в которых хранится фермент, -. Кроме того, он способен регулировать активную концентрацию цитокинов.

Интерес к изучению гранзимоподобных протеаз клеток гемопоэза не ослабевает, что обуславливается участием ферментов этой группы в жизненно важных процессах организма. Число гранзимоподобных протеаз постоянно пополняется новыми, неизвестными ранее представителями.

Более того, последние данные свидетельствуют о том, что их клеточное происхождение может быть шире и не ограничиваться только клетками иммунной системы, следовательно, расширяется и спектр их действия.

Настоящая работа посвящена исследованию новой сериновой протеазы, структурно близкой гранзимоподобным протеазам (химазоподобной протеазы), обнаруженной в слизистой дуоденума крупного рогатого скота в процессе систематического изучения ферментов тонкого кишечника млекопитающих, проводимого в лаборатории химии протеолитических ферментов ИБХ. Цель настоящего исследования -получение высокоочищенного препарата фермента, изучение его физико-химических и энзиматических свойств, определение клеточной локализации нового фермента.

I. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДУОДЕНАЗЫ И ХИМАЗ,

ФЕРМЕНТОВ, СТРУКТУРНО РОДСТВЕННЫХ ХИМАЗОПОДОБНОЙ ПРОТЕАЗЕ (литературный обзор).

Настоящий литературный обзор посвящен свойствам дуоденазы и химаз - сериновым протеазам, структурно и энзиматически родственным исследуемому нами ферменту химазоподобной протеазе (ChIP). Рассмотрение свойств дуоденазы (первый раздел) представляется интересным в связи с тем, что ChIP и дуоденаза были выделены из одного источника (слизистая дуоденума быка) и обладают близкими молекулярными и некоторыми энзиматическими свойствами. Кроме того, дуоденаза является единственным к настоящему времени охарактеризованным представителем группы гранзимоподобных протеаз крупного рогатого скота, к которой относится исследуемая в данной работе протеаза. Второй раздел литературного обзора посвящен свойствам химаз тучных клеток, аналогом которых является изучаемый нами фермент.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Соколова, Елена Александровна

выводы

1. Из слизистой дуоденума быка с использованием аффинной хроматографии на колонке с иммобилизованным соевым трипсиновым ингибитором выделена новая сериновая протеаза. Полученный препарат фермента является гомогенным по данным N-концевого секвенирования, электрофореза, обращенно-фазовой хроматографии и гель-фильтрации.

2. Методом масс-спектрометрии (MALDI-MS) установлено, что молекулярная масса фермента составляет 24,97 кДа. Фермент является мономером, состоящим из одной полипептидной цепи.

3. Определена N-концевая последовательность фермента (23 аминокислоты); наибольшая степень структурной гомологии обнаруживается с соответствующими участками последовательности химаз тучных клеток.

4. На основании сравнительного анализа данных по гидролизу исследуемой протеазой природных и синтетических субстратов установлено, что специфичность, проявляемая ею (в положениях Р1-РТ), характерна для ряда химаз.

5. Исследовано ингибирующее действие на изучаемую протеазу ряда синтетических и белковых ингибиторов сериновых протеаз. Установлено, что, подобно химазам, фермент наиболее эффективно ингибируется белковыми ингибиторами типа Кунитца и Баумана-Бирк из бобовых, но проявляет устойчивость к действию панкреатического трипсинового ингибитора BPTI.

6. Совокупность полученных в работе данных позволяет предположить, что обнаруженный нами и выделенный в индивидуальном состоянии фермент относится к химазам. Для этого фермента предлагается название бычья химазоподобная протеаза.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Соколова, Елена Александровна, Москва

1. Zamolodchikova, T.S., Vorotyntseva T.I. and Antonov V.K. (1995) Duodenase, a new serine protease of unusual specificity from bovine duodenal mucosa. Purification and properties, Eur. J. Biochem. 227, 866872.

2. Ugolev A.M. and De Laey P. (1973) Membrane digestion. A concept of enzyme hydrolysis on cell membranes, Biochim. Biophys. Acta. v. 300, p. 105-128.

3. Cornaggia M., Riva С., Capella С., Solcia E., Samloff I.M. (1987) Subcellular localization of pepsinogen II in stomach and duodenum by the immunogold technique, Gastroenterology, 92, 585-593.

4. Замолодчикова T.C., Соколова E.A., Александров C.A., Миргородская О.А., Морозов, И.А., Воротынцева Т.И. (1998) Дуоденаза -потенциальный активатор каскада пищеварительных протеиназ, Биоорг. Хим. т. 24, с. 300-305.

5. Zamolodchikova, T.S., Sokolova Е.А., Lu D. and Sadler J.E. (2000) Activation of recombinant proenteroprptidase by duodenase, FEBS Lett., 466, 295-299.10. EMBL №AF198965.

6. Salvesen G., Enghild J.J. (1990) An unusual specificity in the activation of neutrophil serine proteinase zymogens, Biochemistry 29, 5304-5308.

7. Gullberg U., Lindmark A., Nilsson E., Persson A.M., Olsson I. (1994) Processing of human cathepsin G after transfection to the rat basophilic/mast cell tumor line RBL, J. Biol. Chem.;269, 25219-25225.

8. Замолодчикова T.C., Соколова E.A. (2000) Дуоденаза представитель особой группы сериновых протеиназ, Тезисы конференции «Структура и функция протеолитических ферментов», Вопросы мед. химии, т. 64, №5, с. 503.

9. Salvesen G., Farley D., Shurnan J., Przybyla A, Reilly C., Travis J. (1987) Molecular cloning of human cathepsin G: structural similarity to mast cell and cytotoxic T lymphocyte proteinases, Biochemistry 26, 2289-2293.

10. Pemberton A.D., Huntley J.F., Miller H.R. (1997) Sheep mast cell proteinase-1: characterization as a member of a new class of dual-specific ruminant chymases, Biochem. J. 321, 665-670.

11. Polanowska J., Krokoszynska I., Czapinska H., Watorek W., Dadlez M., Otlewski J. (1998) Specificity of human cathepsin G, Biochim. Biophys. Acta 1386, 189-198.

12. Pletnev V.Z., Zamolodchikova T.S., Pangborn W.A., Duax W.L. (2000) Crystal structure of bovine duodenase, a serine protease, with dual trypsin and chymotrypsin-like specificities, Proteins 41, 8-16.

13. Shechter, I.V. and Berger, A.C. (1967) On the size of the active site in proteases. I. Papain, Biochem. Biophys. Res. Commun. 27, 157-162.

14. Соколова E.A., Миргородская О.А., Роепсторф П., Савельева Н.В., Замолодчикова Т.С. (2001) Сравнительное исследование действия дуоденальных протеаз (дуоденаз) на полипептидные субстраты, Биохимия, т. 66, №1, с. 80-86.

15. Гладышева И.П., Замолодчикова Т.С., Соколова Е.А., Ларионова Н.И.1999) Взаимодействие дуоденазы протеиназы двойной специфичности с соевыми ингибиторами типа Баумана-Бирк и Кунитца, Биохимия, т. 64, №11, с. 1473-1479.

16. Гладышева И.П., Ларионова Н.И., Гладышев Д.П., Тихонова Т.В., Казанская Н.Ф. (1994) Классический соевый ингибитор типа Баумана-Бирк эффективный ингибитор а-химотрипсина и катепсина G гранулоцитов человека, Биохимия, т. 59, с. 513-518.

17. Kitamura Y., Matsuda Н., Hatanaka К. (1979) Clonal nature of mast-cell clusters formed in W/Wv mice after bone marrow transplantation, Nature 281, 154-155.

18. Welle M. (1997) Development, significance, and heterogeneity of mast cells with particular regard to the mast cell-specific proteases chymase and tryptase, J. Leukoc. Biol. 61, 233-245.

19. Galli S.J. (1990) New insights into "the riddle of the mast cells": microenvironmental regulation of mast cell development and phenotypic heterogeneity, Lab. Invest. 62, 5-33.

20. Irani A.A., Schechter N.M., Craig S.S., DeBlois G., Schwartz L.B. (1986) Two types of human mast cells that have distinct neutral protease compositions, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 4464-4468.

21. Weidner N., Austen K.F. (1993) Heterogeneity of mast cells at multiple body sites. Fluorescent determination of avidin binding and immunofluorescent determination of chymase, tryptase, and carboxypeptidase content, Pathol. Res. Pract. 189, 156-162.

22. Craig S.S., Schechter N.M., Schwartz L.B. (1988) Ultrastructural analysis of human T and TC mast cells identified by immunoelectron microscopy, Lab. Invest. 58, 682-691.

23. Kube P., Audige L., Kuther K., Welle M. (1998) Distribution, density and heterogeneity of canine mast cells and influence of fixation techniques, Histochem. Cell Biol. 110, 129-135.

24. Kuther K., Audige L., Kube P., Welle M. (1998) Bovine mast cells: distribution, density, heterogeneity, and influence of fixation techniques, Cell Tissue Res. 293, 111-119.

25. Galli S.J. (1993) New concepts about the mast cell, New Engl. J. Med. 328, 257-265.

26. Bienenstock J., Tomioka M., Stead R., Ernst P., Jordana M., Gauldie J., Dolovich J., Denburg J. (1987) Mast cell involvement in various inflammatory processes, Am. Rev. Respir. Dis. 135, 5-8.

27. Rothe M,J., Nowak M., Kerdel F.A. (1990) The mast cell in health and disease, J. Am. Acad. Dermatol. 23, 615-624.

28. Soter N.A., Austen K.F. (1976) The diversity of mast cell-derived mediators: implications for acute, subacute, and chronic cutaneous inflammatory disorders, J. Invest. Dermatol. 67, 313-319.

29. Toyry S., Fraki J., Tammi R. (1988) Mast cell density in psoriatic skin. The effect of PUVA and corticosteroid therapy, Arch. Dermatol. Res. 280, 282285.

30. Craig S.S., DeBlois G., Schwartz L.B. (1986) Mast cells in human keloid, small intestine, and lung by an immunoperoxidase technique using a murine monoclonal antibody against tryptase, Am. J. Pathol. 124, 427-435.

31. Brody I. (1984) Mast cell degranulation in the evolution of acute eruptive guttate psoriasis vulgaris, J. Invest. Dermatol. 82, 460-464.

32. Harvima I.T., Naukkarinen A., Paukkonen K., Harvima R.J., Aalto M.L., Schwartz L.B., Horsmanheimo M. (1993) Mast cell tryptase and chymase in developing and mature psoriatic lesions, Arch. Dermatol. Res. 285, 184192.

33. Stevens R.L., Austen K.F. (1989) Recent advances in the cellular and molecular biology of mast cells, Immunol. Today, 10, 381-386.

34. Gordon J.R., Burd P.R., Galli S.J. (1990) Mast cells as a source of multifunctional cytokines, Immunol. Today, 11, 458-464.

35. Church M.K., el-Lati S., Okayama Y. (1991) Biological properties of human skin mast cells, Clin. Exp. Allergy 21, 1-9.

36. Fritz H., Kruck J., Russe I., Liebich H.G. (1979) Immunofluorescence studies indicate that the basic trypsin-kallikrein-inhibitor of bovine organs (Trasylol) originates from mast cells, Hoppe Seylers Z. Physiol. Chem. 360, 437-444.

37. Westin U., Polling A., Ljungkrantz I., Ohlsson K. (1999) Identification of SLPI (secretory leukocyte protease inhibitor) in human mast cells using immunohistochernistry and in situ hybridization, Biol. Chem. 380, 489-493.

38. Motoi M., Stein H., Lennert K. (1980) Demonstration of lysozyrne, alpha 1-antichymotrypsin, alpha 1-antitrypsin, albumin, and transferrin with the immunoperoxidase method in lymph node cells, Virchows Arch. B. Cell Pathol. Incl. Mol. Pathol. 35, 73-82.

39. Urata H., Kinoshita A., Perez D.M., Misono K.S, Bumpus F.M., Graham R.M., Husain A. (1991) Cloning of the gene and cDNA for human heart chymase, J. Biol. Chem. 266, 17173-17179.

40. Urata H., Boehm K.D., Philip A., Kinoshita A., Gabrovsek J., Bumpus F.M., Husain A. (1993) Cellular localization and regional distribution of an angiotensin ll-forming chymase in the heart, J. Clin. Invest. 91, 1269-1281.

41. Osman I.A., Garrett J.R., Smith R.E. (1989) Enzyme histochemical discrimination between tryptase and chymase in mast cells of human gut, J. Histochem. Cytochem. 37, 415-421.

42. McEuen A.R., Gaca M.D., Buckley M.G., He S., Gore M.G., Walls A.F. (1998) Two distinct forms of human mast cell chymase: differences in affinity for heparin and in distribution in skin, heart, and other tissues, Eur. J. Biochem. 256, 461-470.

43. Caughey G.H., Viro N.F., Lazarus S.C., Nadel J.A. (1988) Purification and characterization of dog mastocytoma chymase: identification of an octapeptide conserved in chymotryptic leukocyte proteinases, Biochim. Biophys. Acta 952, 142-149.

44. Frangogiannis N.G., Burns A.R., Michael L.H., Entman M L. (1999) Histochemical and morphological characteristics of canine cardiac mast cells, Histochem. J. 31, 221-229.59. EMBL № P79204.

45. Kido H., Fukusen N., Katunuma N. (1984) A simple method for purification of chymase from rat tongue and rat peritoneal cells, Anal. Biochem. 137, 449-453.

46. Lagunoff D., Pritzl P. (1976) Characterization of rat mast cell granule proteins, Arch. Biochem. Biophys. 173, 5545-5563.

47. Woodbury R.G., Everitt M.T, Neurath H. (1981) Mast cell proteases, Methods Enzymol. 80, 588-609.

48. Katunuma N., Kominami E., Kobayashi K., Banno Y.r Suzuki K. (1975) Studies on new intracellular proteases in various organs of rat. 1. Purification and comparison of their properties, Eur. J. Biochem. 52, 37-50.

49. Lutzelschwab C., Pejler G., Aveskogh M., Hellman L. (1997) Secretory granule proteases in rat mast cells. Cloning of 10 different serine proteases and a carboxypeptidase A from various rat mast cell populations, J. Exp. Med. 185, 13-29.

50. Le Trong H., Newlands GF, Miller HR, Charbonneau H, Neurath H, Woodbury RG (1989) Amino acid sequence of a mouse mucosal mast cell protease, Biochemistry 28, 391-395.

51. Serafin WE, Reynolds DS, Rogelj S, Lane WS, Conder GA, Johnson SS, Austen KF, Stevens RL (1990) Identification and molecular cloning of a novel mouse mucosal mast cell serine protease, JBC 265, 423-429.

52. Reynolds DS, Stevens RL, Lane WS, Carr MH, Austen KF, Serafin WE (1990) Different mouse mast cell populations express various combinations of at least six distinct mast cell serine proteases, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3230-3234.

53. Coussens LM, Raymond WW, Bergers G, Laig-Webster M, Behrendtsen O, Werb Z, Caughey GH, Hanahan D (1999) Inflammatory mast cells up-regulate angiogenesis during squamous epithelial carcinogenesis, Genes Dev. 13, 1382-1397.

54. Takai S, Shiota N, Yamamoto D, Okunishi H, Miyazaki M. (1996) Purification and characterization of angiotensin ll-generating chymase from hamster cheek pouch, Life Sci.58, 591-597.

55. Nawa Y, Horii Y, Okada M, Arizono N (1994) Histochemical and cytological characterizations of mucosal and connective tissue mast cells of Mongolian gerbils (Meriones unguiculatus), Int. Arch. Allergy Immunol. 104, 249-254.

56. Horii Y, Ishikawa N, Nawa Y. (1992) Heparin-containing mast cells in the jejunal mucosa of normal and parasitized Mongolian gerbils, Meriones unguiculatus, Int. Arch. Allergy Immunol. 98, 415-419.

57. Schechter NM, Fraki JE, Geesin JC, Lazarus GS (1983) Human skin chymotryptic proteinase. Isolation and relation to cathepsin G and rat mast cell proteinase I. JBC 258, 2973-2978.

58. Urata H, Kinoshita A, Misono KS, Bumpus FM, Husain A (1990) Identification of a highly specific chymase as the major angiotensin II-forming enzyme in the human heart, JBC 265, 22348-22357.

59. Sukenaga Y, Kido H, Neki A, Enomoto M, Ishida K, Takagi K, Katunuma N (1993) Purification and molecular cloning of chymase from human tonsils, FEBS Lett. 323, 119-122.

60. Wintroub BU, Kaempfer CE, Schechter NM, Proud D (1986) A human lung mast cell chymotrypsin-like enzyme. Identification and partial characterization, J. Clin. Invest. 77, 196-201.

61. Caughey GH, Zerweck EH, Vanderslice P. (1991) Structure, chromosomal assignment, and deduced amino acid sequence of a human gene for mast cell chymase, JBC 266,12956-12963.

62. Caughey GH, Raymond WW, Vanderslice P (1990) Dog mast cell chymase: molecular cloning and characterization, Biochemistry 29, 5166-5171.

63. Le Trong H, Parmelee DC, Walsh KA, Neurath H, Woodbury RG (1987) Amino acid sequence of rat mast cell protease I (chymase), Biochemistry 26, 6988-6994.

64. Remington SJ, Woodbury RG, Reynolds RA, Matthews BW, Neurath H (1988) The structure of rat mast cell protease II at 1.9-A resolution, Biochemistry 27, 8097-8105.

65. Befus AD, Chin B, Pick J, Evans S, Osborn S, Forstrom J (1995) Proteinases of rat mast cells. Peritoneal but not intestinal mucosal mast cells express mast cell proteinase 5 and carboxypeptidase A, J. Immunol. 155, 4406-4411.

66. Smyth MJ, O'Connor MD, Trapani JA (1996) Granzymes: a variety of serine protease specificities encoded by genetically distinct subfamilies, J. Leukoc. Biol. 60, 555-562.

67. Rao NV, Rao GV, Marshall ВС, Hoidal JR (1996) Biosynthesis and processing of proteinase 3 in U937 cells. Processing pathways are distinct from those of cathepsin G, JBC 271, 2972-2978.

68. Sali A, Matsumoto R, McNeil HP, Karplus M, Stevens RL (1993) Three-dimensional models of four mouse mast cell chymases. Identification of proteoglycan binding regions and protease-specific antigenic epitopes, JBC 268, 9023-9034.

69. Tsukada H, Blow DM (1985) Structure of alpha-chyrnotrypsin refined at 1.68 A resolution, J. Mol. Biol. 184, 703-711.

70. Liao Y, Yi T, Hoit BD, Walsh RA, Karnik SS, Husain A (1997) Selective reporter expression in mast cells using a chymase promoter, JBC 272, 2969-2976.

71. Huang RY, Blom T, Hellman L (1991) Cloning and structural analysis of MMCP-1, MMCP-4 and MMCP-5, three mouse mast cell-specific serine proteases, Eur. J. Immunol. 21, 1611-1621.

72. Gurish MF, Nadeau JH, Johnson KR, McNeil HP, Grattan KM, Austen KF, Stevens RL (1993) A closely linked complex of mouse mast cell-specific chymase genes on chromosome 14, JBC 268, 11372-11379.

73. McNeil HP, Austen KF, Somerville LL, Gurish MF, Stevens RL (1991) Molecular cloning of the mouse mast cell protease-5 gene. A novel secretory granule protease expressed early in the differentiation of serosal mast cells, JBC 266, 20316-20322.

74. Benfey PN, Yin FH, Leder P (1987) Cloning of the mast cell protease, RMCP II. Evidence for cell-specific expression and a multi-gene family, JBC 262, 5377-5384.

75. Hohn PA, Popescu NC, Hanson RD, Salvesen G, Ley TJ (1989) Genomic organization and chromosomal localization of the human cathepsin G gene. JBC 264, 13412-13419.

76. Meier M, Kwong PC, Fregeau CJ, Atkinson EA, Burrington M, Ehrman N, Sorensen O, Lin CC, Wilkins J, Bleackley RC. (1990) Cloning of a gene that encodes a new member of the human cytotoxic cell protease family, Biochemistry 29, 4042-4049.

77. Crosby JL, Bleackley RC, Nadeau JH (1990) A complex of serine protease genes expressed preferentially in cytotoxic T-lyrnphocytes is closely linked to the T-cell receptor alpha- and delta-chain genes on mouse chromosome 14, Genomics 62, 252-259.

78. Chandrasekharan UM, Sanker S, Glynias MJ, Karnik SS, Husain A (1996) Angiotensin ll-forming activity in a reconstructed ancestral chymase, Science 271, 502-505.

79. Caughey GH, Lazarus SC, Viro NF, Gold WM, Nadel JA (1988) Tryptase and chymase: comparison of extraction and release in two dog mastocytoma lines, Immunology 63, 339-344.

80. Sayama S, lozzo RV, Lazarus GS, Schechter NM (1987) Human skin chymotrypsin-like proteinase chymase. Subcellular localization to mast cell granules and interaction with heparin and other glycosaminoglycans, JBC 262, 6808-6815.

81. Schwartz LB, Bradford TR, Irani AM, Deblois G, Craig SS (1987) The major enzymes of human mast cell secretory granules, Am. Rev. Respir. Dis. 135, 1186-1189.

82. Schechter NM, Choi JK, Slavin DA, Deresienski DT, Sayama S, Dong G, Lavker RM, Proud D, Lazarus GS (1986) Identification of a chymotrypsin-like proteinase in human mast cells, J. Immunol! 137, 962-970.

83. De Young MB, Nemeth EF, Scarpa A (1987) Measurement of the internal pH of mast cell granules using microvolumetric fluorescence and isotopic techniques, Arch. Biochem. Biophys. 254, 222-233.

84. McEuen AR, Sharma B, Walls AF (1995) Regulation of the activity of human chymase during storage and release from mast cells: the contributions of inorganic cations, pH, heparin and histamine, Biochim. Biophys. Acta 1267, 115-121.

85. Le Trong H, Neurath H, Woodbury RG (1987) Substrate specificity of the chymotrypsin-like protease in secretory granules isolated from rat mast cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 364-367.

86. Bourdon MA, Oldberg A, Pierschbacher M, Ruoslahti E (1985) Molecular cloning and sequence analysis of a chondroitin sulfate proteoglycan cDNA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 1321-1325.

87. Yurt R.W., Leid R.W., Austen K.F. (1977) Native heparin from rat peritoneal mast cells, J. Biol. Chem., 252, 518-521.

88. Enerback L, Kolset SO, Kusche M, Hjerpe A, Lindahl U (1985) Glycosaminoglycans in rat mucosal mast cells, Biochem. J. 227, 661-668.

89. Stevens RL, Fox CC, Lichtenstein LM, Austen KF (1988) Identification of chondroitin sulfate E proteoglycans and heparin proteoglycans in the secretory granules of human lung mast cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2284-2287.

90. Pejler G, Soderstrom K, Karlstrom A (1994) Inactivation of thrombin by a complex between rat mast-cell protease 1 and heparin proteoglycan, Biochem. J. 299, 507-513.

91. Goldstein SM, Leong J, Schwartz LB, Cooke D (1992) Protease composition of exocytosed human skin mast cell protease-proteoglycan complexes. Tryptase resides in a complex distinct from chymase and carboxypeptidase, J. Immunol. 148, 2475-2482.

92. Patrick MK, Dunn IJ, Buret A, Miller HR, Huntley JF, Gibson S, Gall DG. (1988) Mast cell protease release and mucosal ultrastructure during intestinal anaphylaxis in the rat. Gastroenterology, 94, 1-9.

93. Miller HR, Woodbury RG, Huntley JF, Newlands G (1983) Systemic release of mucosal mast-cell protease in primed rats challenged with Nippostrongylus brasiliensis, Immunology 49, 471-479.

94. Urata H, Karnik SS, Graham RM, Husain A (1993) Dipeptide processing activates recombinant human prochymase, J. Biol. Chem., J. Biol. Chem., 268, 24318-24322.

95. McGuire MJ, Lipsky PE, Thiele DL. (1992) Purification and characterization of dipeptidyl peptidase I from human spleen, Arch. Biochem. Biophys. 295, 280-288.

96. Murakami M, Karnik SS, Husain A. (1995) Human prochymase activation. A novel role for heparin in zymogen processing, J. Biol. Chem., 270, 22182223.

97. Smyth MJ, McGuire MJ, Thia KY (1995) Expression of recombinant human granzyme B. A processing and activation role for dipeptidyl peptidase I, J. Immunol. 154, 6299-6305.

98. Kummer JA, Kamp AM, Citarella F, Horrevoets AJ, Hack CE (1996) Expression of human recombinant granzyme A zymogen and its activation by the cysteine proteinase cathepsin C, JBC 271, 9281-9286.

99. McGuire MJ, Lipsky PE, Thiele DL (1993) Generation of active myeloid and lymphoid granule serine proteases requires processing by the granule thiol protease dipeptidyl peptidase I, J. Biol. Chem., 268, 2458-2467.

100. Dikov MM, Springman EB, Yeola S, Serafin WE (1994) Processing of procarboxypeptidase A and other zymogens in murine mast cells, J. Biol. Chem., 269, 25897-25904.

101. McEuen AR, Ashworth DM, Walls AF (1998) The conversion of recombinant human mast cell prochymase to enzymatically active chymase by dipeptidyl peptidase I is inhibited by heparin and histamine, Eur. J. Biochem. 253, 300308.

102. Yoshida N, Everitt MT, Neurath H, Woodbury RG, Powers JC (1980) Substrate specificity of two chymotrypsin-like proteases from rat mast cells. Studies with peptide 4-nitroanilides and comparison with cathepsin G, Biochemistry 19, 5799-5804.

103. Schechter NM, Jordan LM, James AM, Cooperman BS, Wang ZM, Rubin H. (1993) Reaction of human chymase with reactive site variants of alpha 1-antichymotrypsin. Modulation of inhibitor versus substrate properties, J. Biol. Chem. 268, 23626-23633.

104. Harper JW, Ramirez G, Powers JC. (1981) Reaction of peptide thiobenzyl esters with mammalian chymotrypsinlike enzymes: a sensitive assay method, Anal. Biochem. 118, 382-387.

105. Caughey GH, Leidig F, Viro NF, Nadel JA. (1988) Substance P and vasoactive intestinal peptide degradation by mast cell tryptase and chymase, J. Pharmacol. Exp. Ther. 244, 133-137.

106. Kinoshita A, Urata H, Bumpus FM, Husain A. (1991) Multiple determinants for the high substrate specificity of an angiotensin ll-forming chymase from the human heart, J. Biol. Chem. 266, 19192-19197.

107. Caughey GH, Raymond WW, Wolters PJ. (2000) Angiotensin II generation by mast cell alpha- and beta-chymases, Biochim. Biophys. Acta 1480, :245-257.

108. Shiota N, Fukamizu A, Takai S, Okunishi H, Murakami K, Miyazaki M. (1997) Activation of angiotensin ll-forming chymase in the cardiomyopathic hamster heart, J. Hypertens. 15, 431-440.

109. Woodbury RG, Neurath H (1978) Purification of an atypical mast cell protease and its levels in developing rats, Biochemistry 17, 4298-4304.

110. Bergenfeldt M, Nystrom M, Bohe M, Lindstrom С, Polling A, Ohlsson К (1996) Localization of immunoreactive secretory leukocyte protease inhibitor (SLPI) in intestinal mucosa, J. Gastroenterol. 31, 18-23.

111. Fritz H (1988) Human mucus proteinase inhibitor (human MPI). Human seminal inhibitor I (HUSI-I), antileukoprotease (ALP), secretory leukocyte protease inhibitor (SLPI), Biol. Chem. Hoppe Seyler 369, 79-82.

112. Wiedow 0, Young JA, Davison MD, Christophers E (1993) Antileukoprotease in psoriatic scales, J. Invest. Dermatol. 101, 305-309.

113. Jacoby AS, Melrose J, Robinson BG, Hyland VJ, Ghosh P (1993) Secretory leucocyte proteinase inhibitor is produced by human articular cartilage chondrocytes and intervertebral disc fibrochondrocytes, Eur. J. Biochem. 218, 951-957.

114. Boudier C, Bieth JG. (1992) The proteinase: mucus proteinase inhibitor binding stoichiometry, J. Biol. Chem. 267, 4370-4375.

115. Walter M, Plotnick M, Schechter NM (1996) Inhibition of human mast cell chymase by secretory leukocyte proteinase inhibitor: enhancement of the interaction by heparin, Arch. Biochem. Biophys. 327, 81-88.

116. Pemberton AD, Huntley JF, Miller HR. (1998) Differential inhibition of mast cell chymases by secretory leukocyte protease inhibitor, Biochim. Biophys. Acta. 1379, 29-34.

117. Lawrence DA. (1997) The serpin-proteinase complex revealed, Nat. Struct. Biol. 4, 339-341.

118. Morii M, Travis J. (1983) Amino acid sequence at the reactive site of human alpha 1-antichymotrypsin, J. Biol. Chem. 258, 12749-12752.

119. Carrell RW. (1986) Reactive-centre variants of alpha 1-antitrypsin. A new range of anti-inflammatory agents, Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 4, 291-309.

120. Walter M, Sutton RM, Schechter NM (1999) Highly efficient inhibition of human chymase by alpha(2)-macroglobulin, Arch Biochem Biophys. 368, 276-284.

121. Pirie-Shepherd SR, Miller HR, Ryle A. (1991) Differential inhibition of rat mast cell proteinase I and II by members of the alpha-1 -proteinase inhibitor family of serine proteinase inhibitors, J. Biol. Chem., 266, 17314-17319.

122. Irvine J, Newlands GF, Huntley JF, Miller HR. (1990) Interaction of murine intestinal mast cell proteinase with inhibitors (serpins) in blood; analysis by SDS-PAGE and western blotting, Immunology, 69, 139-144.

123. Ware JH, Wan XS, Rubin H, Schechter NM, Kennedy AR (1997) Soybean Bowman-Birk protease inhibitor is a highly effective inhibitor of human mast cell chymase, Arch. Biochem. Biophys. 344, 133-138.

124. Fukusen N, Kato Y, Kido H, Katunuma N (1987) Kinetic studies on the inhibitions of mast cell chymase by natural serine protease inhibitors: indications for potential biological functions of these inhibitors, Biochem. Med. Metab. Biol. 38, 165-169.

125. Handbook of proteolytic enzymes (1988) Academic press.

126. Schechter NM, Sprows JL, Schoenberger OL, Lazarus GS, Cooperman BS, Rubin H. (1989) Reaction of human skin chymotrypsin-like proteinase chymase with plasma proteinase inhibitors, J. Biol. Chem., 264, 21308

127. Urata Н, Healy В, Stewart RW, Bumpus FM, Husain A. (1990) Angiotensin ll-forming pathways in normal and failing human hearts, Circ Res. 66, 883890.

128. Ihara M, Urata H, Kinoshita A, Suzumiya J, Sasaguri M, Kikuchi M, Ideishi M, Arakawa K. (1999) Increased chymase-dependent angiotensin II formation in human atherosclerotic aorta, Hypertension, 33, 1399-1405.

129. Saarinen J, Kalkkinen N, Welgus HG, Kovanen PT. (1994) Activation of human interstitial procollagenase through direct cleavage of the Leu83-Thr84 bond by mast cell chymase, J. Biol. Chem. 269, 18134-18140.

130. Suzuki K, Lees M, Newlands GF, Nagase H, Woolley DE. (1995) Activation of precursors for matrix metalloproteinases 1 (interstitial collagenase) and 3 (stromelysin) by rat mast-cell proteinases I and II, Biochem. J. 305, 301-306.

131. Fang КС, Raymond WW, Blount JL, Caughey GH. (1997) Dog mast cell alpha-chymase activates progelatinase В by cleaving the Phe88-Gln89 and Phe91-Glu92 bonds of the catalytic domain, J. Biol. Chem. 272, 2562825635.

132. Coussens LM, Raymond WW, Bergers G, Laig-Webster M, Behrendtsen O, Werb Z, Caughey GH, Hanahan D. (1999) Inflammatory mast cells up-regulate angiogenesis during squamous epithelial carcinogenesis, Genes Dev. 13, 1382-1397.

133. Briggaman RA, Schechter NM, Fraki J, Lazarus GS. (1984) Degradation of the epidermal-dermal junction by proteolytic enzymes from human skin and human polymorphonuclear leukocytes, J. Exp. Med. 160, 1027-1042.

134. Vartio T, Seppa H, Vaheri A. (1981) Susceptibility of soluble and matrix fibronectins to degradation by tissue proteinases, mast cell chymase and cathepsin G, J. Biol. Chem. 256, 471-477.

135. Tchougounova E, Forsberg E, Angelborg G, Kjellen L, Pejler G. (2001) Altered processing of fibronectin in mice lacking heparin. A role for heparin-dependent mast cell chymase in fibronectin degradation, J. Biol. Chem. 276, 3772-3777.

136. Sage H, Woodbury RG, Bornstein P. (1979) Structural studies on human type IV collagen, J. Biol. Chem. 254, 9893-9900.

137. He S, Walls AF. (1998) The induction of a prolonged increase in microvascular permeability by human mast cell chymase, Eur. J. Pharmacol. 352, 91-98.

138. Nishikori Y, Kakizoe E, Kobayashi Y, Shimoura K, Okunishi H, Dekio S. (1998) Skin mast cell promotion of matrix remodeling in burn wound healing in mice: relevance of chymase, Arch. Dermatol. Res. 290, 553-560.

139. Pejler G, Karlstrom A. (1993) Thrombin is inactivated by mast cell secretory granule chymase, J. Biol. Chem. 268, 11817-11822.

140. Mizutani H, Schechter N, Lazarus G, Black RA, Kupper TS (1991) Rapid and specific conversion of precursor interleukin 1 beta (IL-1 beta) to an active IL-1 species by human mast cell chymase. J Exp Med 174, 821-825.

141. Longley BJ, Tyrrell L, Ma Y, Williams DA, Halaban R, Langley K, Lu HS, Schechter NM. (1997) Chymase cleavage of stem cell factor yields a bioactive, soluble product, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 9017-9021.

142. Kido H, Nakano A, Okishima N, Wakabayashi H, Kishi F, Nakaya Y, Yoshizumi M, Tamaki T. (1998) Human chymase, an enzyme forming novel bioactive 31-amino acid length endothelins, Biol. Chem. 379, 885-91.

143. Niwa Y, Nagata N, Oka M, Toyoshima T, Akiyoshi H, Wada T, Nakaya Y. (2000) Production of nitric oxide from endothelial cells by 31-amino-acid-length endothelin-1, a novel vasoconstrictive product by human chymase, Life Sci. 67, 1103-1109.

144. Tani K, Ogushi F, Kido H, Kawano T, Kunori Y, Kamimura T, Cui P, Sone S. (2000) Chymase is a potent chemoattractant for human monocytes and neutrophils, J. Leukoc. Biol. 67, 585-589.

145. Takai S, Yuda A, Jin D, Nishimoto M, Sakagichi M, Sasaki S, Miyazaki M. (2000) Inhibition of chymase reduces vascular proliferation in dog grafted veins, FEBS Lett. 467, 141-144.

146. Sommerhoff CP, Caughey GH, Finkbeiner WE, Lazarus SC, Basbaum CB, Nadel JA. (1989) Mast cell chymase. A potent secretagogue for airway gland serous cells., J. Immunol. 142, 2450-2456.

147. Bleackley R.C. (1989) The isolation and characterization of two cytotoxic T-lymphocyte-specific serine protease gens, Current topic in microbiology and immunology, 140, 67-80.

148. Neurath H. (1964) Mechanism of zymogen activation, Feder. Proc. 23, 1-7.

149. Bode W. (1979) Activation, action and inhibition of trypsin-trypsinigen, in The physiological inhibitors of coagulation and fibrinolysis, Elsevier/North-Holland Biomedical Press.

150. Caputo, A., Fahey, D., Lloyd, C., Vozab, R„ McCairns, E. & Rowe, P.B. (1988) Structure and differential mechanisms of regulation of expression of a serine esterase gene in activated human lymphocytes, J. Biol. Chem., 263, 6363-6369.

151. Hartley, B.S. (1964) Amino acid sequence of bovine chymotrypsinogen A, Nature 201, 1284-1287.

152. Schellenberger V., Braune K., Hofmann H.J., Jakubke H.D. (1991) The specificity of chymotrypsin. A statistical analysis of hydrolysis data, Eur. J. Biochem., 199, 623-636.

153. Boudier C., Jung M.L., Stambolieva N., Bieth J.G. (1981 importance of secondary enzyme-substrate interactions in human cathepsin G and chymotrypsin II catalysis, Arch. Biochem. Biophys., 210, 790-793.

154. Bode W., Meyer E., Powers J.C. (1989) Human leukocyte and porcine pancreatic elastase: X-ray crystal structures, mechanism, substrate specificity, and mechanism-based inhibitors, Biochemistry, 28, 1951-1963.

155. Hill R.L. (1965) Hydrolysis of proteins, in Advances in protein chemistry, New York Acad. Press, v. 20, p. 68-74.

156. Knox D.P., Huntley J.F. (1988) Classification of sheep abomasal mucosal mast cell proteinase as a serine endopeptidase (EC 3.4.21), Int. J. Biochem. 20, 193-195.

157. Jenne D.E. and Tchopp J. (1989) Granzymes: a family of serine proteases in granules of cytotoxic T lymphocytes, Current topic in microbiology and immunology, 140, 33-48.

158. Мосолов В.В., Валуева Т.А. (1993) Растительные белковые ингибиторы протеолитических ферментов, Москва, ВИНИТИ.

159. Мосолов В.В., Валуева Т.А., Малова Е.Л., Колосова Г.В., Чебан А.Н. (1982) Строение реактивных центров белка-ингибитора сериновых протеаз из фасоли, Биохимия, т .47, № 4, с.561-568.

160. Мосолов В.В., Колосова Г.В., Валуева Т.А., Дронова Л.А. (1982) Ингибитор трипсина из семян гледичии (gleditsia triacanthos L.), Биохимия, т. 47, № 5, с.797-802.

161. Мосолов В.В. (1973) Протеолитические ферменты, Москва, «Наука».

162. Ванчугова Л.В., Валуева Т.А., Ромашкин В.И., Розенфельд М.А., Валуев Л.И., Мосолов В.В., Плата Н.А. (1988) Взаимодействие овомукоида из белка утиных яиц с сериновыми протеиназами, Биохимия, т. 53, № 9, с. 1455-1461.

163. Jolly S., Detilleux J., Coignoul F., Desmecht D. (2000) Enzyme-histochemical detection of a chymase-like proteinase within bovine mucosal and connective tissue mast cells, J. Сотр. Pathol. 122, 155-162.

164. Bradford, M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal. Biochem. 72, 248-254.

165. Chase, Т. and Shaw, E. (1970) Titration of trypsin, plasmin, and thrombin with p-nitrophenyl p'-guanidinobenzoate HCI, Methods Enzymol. 19, 20-27.

166. Eisenthal, R. and Comish-Bowden, A. (1974) The direct linear plot. A new graphical procedure for estimating enzyme kinetic parameters, Biochem. J. 139, 715-720.

167. Yang, C.Y., Pownall, H.J. and Gotto, A.M. (1985) Identification of peptides containing tryptophan, tyrosine, and phenylalanine using photodiode-array spectrophotometry, Anal, Biochem. 145, 67-72.

168. Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of head of bacteriofage T4, Nature 227,680-685.

169. Zacharius, R.M., Zell, Т.Е., Morrison, J.H. and Woodlock, J.J. (1969), Glycoprotein staining following electrophoresis in acrylamide gels, Anal. Biochem. 30, 148-152.

170. Righetti, P.G. and Drysdale, J.W. (1971) Isoelectric focusing in polyacrylamide gels, Biochym. Biophys. Acta, 236, 17-28.