Бесплатный автореферат и диссертация по географии на тему

Исследование влияния некоторых природных и антропогенных факторов на эффективность мембранного пищеварения карпа

ВАК РФ 11.00.11, Охрана окружающей среды и рациональное использование природных ресурсов

Автореферат диссертации по теме "Исследование влияния некоторых природных и антропогенных факторов на эффективность мембранного пищеварения карпа"

АСТРАХАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

' Рыбохозяйственный факультет

О -

* На правах рукописи

ЕГОРОВ СЕРГЕЙ НИКОЛАЕВИЧ

УДК 597: 591.132.05

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ НЕКОТОРЫХ ПРИРОДНЫХ И АНТРОПОГЕННЫХ ФАКТОРОВ НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ МЕМБРАННОГО ПИЩЕВАРЕНИЯ КАРПА

Специальность: 11.00.11 - охрана окружающей среды и рациональное использование природных ресурсов

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

АСТРАХАНЬ - 1995

Работа выполнена на кафедре "Ихтиологии и гидробиологии" Астраханского государственного технического университета, г. Астрахань.

Научные руководители:

доктор сельскохозяйственных наук, профессор В.Ф. Зайцев кандидат биологических наук, АЛ. Неваленный Официальные оппоненты: доктор биологических наук Ю.С. Чуйков доктор биологических наук Ю.Г. Юровицкий

Ведущее учреждение - Московский государственный институт пищсбои промышленности

Защита диссертации состоится 1995 г. в

часов на заседании диссертационного совета ^^ > О .0 к

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Астраханского государственного технического университета

Автореферат разослан _1995 г.

Ученый секретарь ^

диссертационного совета У

кандидат биологических начк Лук/" Мелякина Э.М.

-3-ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В настоящее время проблемы охран окружающей среды и поддержания экологического равновесия приобрели особу| актуальность. Это связано с возрастанием антропогенного воздействия н природные экосистемы. В частности, усиление пресса факторов, обусловленны хозяйственной деятельностью человека, на различные естественные водоем! привело к значительному сокращению рыбных запасов. В связи с этим пере, рыбным хозяйством стоит задача создания благоприятных условий дл воспроизводства и увеличения выпуска рыбной продукции за сче совершенствования существующих индустриальных методов. Выделяют дв; основных направления исследований: первое - оптимизация условий выращива ния, второе - оптимизация процессов, связанных с кормлением. При это», следует отметить, что оба направления используют такую важную особен носи живых организмов, как способность адаптироваться к постоянно изменяющим« факторам среды обитания.

Ритмическая организация функций организма в естественных экосистема> подвержена влиянию факторов среды и носит адаптивный характер, не связанный со значительными перестройками того или иного процесса или с нарушением пространственно-временной структуры биоритмов организма. Иная картина наблюдается в искусственных экосистемах, когда антропогенное воздействие заложено в основу самой системы и определяет ее существование, что приводит к существенным сдвигам относительно хронобиологической нормы. Деятельность организма в таком режиме связана с крайним напряжением механизмов реализации функций его систем, что, безусловно, сказывается на их эффективности {Надежность и гомеостаз биологических систем, 1987).

В настоящее время особое внимание многих исследователей направлено на выявление механизмов биохимической адаптации к экологическим факторам организма в целом и влияния этих факторов на реализацию функций отдельных систем. Как известно, факторы окружающей среды, изменяясь во времени, непосредственно или опосредовано воздействуют на организм в течение всей жизни, накладывая заметный отпечаток на интенсивность метаболических процессов. Особенно отчетливо подобного рода перестройки прослеживаются у гидро-бионтов, в частности у рыб. что связано с более тесной зависимостью холоднокровных животных от факторов среды обитания как в естественных, так и в искусственно создаваемых условиях (обзоры: Пегель, 1950; Строганов, 1962; Щербина, Казлаускене, 1971; Киселев, 1985; Остроумова, 1986, 1988 и др.).

Наиболее удобной и сравнительно доступной моделью для решения фундаментальных проблем биологии, в том числе проблемы адаптации, является пищеварительная система. Это связано с тем, что кишечник является центральным органом, который реализует не только процессы ферментативного гидролиза пина но и регулирование, а также поддержание гомеостаза внутренней сре^ы организма благодаря мощным кишечной гормональной и транспортной системам (Груздков и др., 1986; Кузьмина, 1985а; Уголев, 1978, 1985; Уголев и дэ„ 1986.1989).

Открытие A.M. Уголевым в конце 50-х годов механизма мембранного пищеварения существенным образом расширило представление о механизме гидролиза пищи. Этзт фундаментальный механизм обнаружен у животных различных таксономических групп (обзоры: Уголев, 1972, 1985; Кушак, 1983 и мн. др.), в том числе и у рыб (Кузьмина, 1978, 1986; обзор: Ильина, Турецкий, 1987). Продемонстрировано, что структурные и ферментативные основы этого процесса у рыб, з целом, незначительно отличаются от таковых у млекопитающих (обзоры: Уголев. 1972; Кузьмина 1986). Однако следует отметить, что влияние факторов среды и закономерности адаптивных процессов мембранного пищеварения у рыб исследованы недостаточно, касаются, как правило, только одного конкретного звена процесса усвоения пищи, в связи с чем полученные данные носят фрагментарный характер. Работ, посвященных исследованию циркадианной ритмики активности ферментов, как адаптационного процесса, практически не проводилось.

Цель работы. Диссертационная работа посвящена изучению адапта-ционно-ритмичеогай организации функций организма в экосистемах с антропогенной нагрузкой на примере мембранного пищеварения карпа Cyprinus carpio (L).

В процессе работы предстояло решить следующие задачи:

1. Изучить динамику суточной активности пищеварительных ферментов на примере гидролитической системы карпа.

2. Исследсзать характер изменений суточной активности кишечных ферментов карпа в условиях различных антропогенных нагрузок.

3. Охарактеризовать влияние некоторых абиотических факторов среды на циркадианную ритмику активности ферментов кишечника карпа.

4. Изучить на аквариапьной модели особенности циркадианной ритмики пищеварительных ферментов карпа.

5. Исследсзать коррелятивные связи параметров, характеризующих питание и пищевареиле карпа, в условиях искусственно созданных экосистем.

Научная новизна. Впервые в искусственных экосистемах проведено комплексное исследование циркадианной ритмики активности пищеварительных

ферментов кишечника карпа, осуществляющих расщепление углеводной и белковой составляющих корма, и параметров, характеризующих питание. Установлено наличие суточной ритмики как при потреблении, так и при гидролизе компонентов пищи. Выявлено наличие бигеминуса во временной организации процессов гидролиза, проявляющегося в виде двух максимумов и двух минимумов з динамике активности пищеварительных ферментов кишечника карпа в течение суток. Отмечены особенности влияния субстратной нагрузки и факторов среды на циркади-анную ритмику активности кишечных ферментов карпа. Базируясь на результатах исследования модели, разработанной на основе данных аквариальных экспериментов, высказана гипотеза о независимости ритмической организации пищеварительной функции у рыб от режима кормления и наличия корма, способствующая решению вопросов рационального использования природных ресурсов. Полученные данные позволяют более глубоко проникнуть в сущность закономерностей потребления и гидролитического расщепления компонентов пищи. Кроме того, развивая хронобислогические аспекты онтогенеза рыб, они иллюстрируют возможность прогнозирования биоритмического статуса организма на разных этапах онтогенеза, подчеркивая этим необходимость разностороннего исследования временной организации живых систем.

Практическая и методическая значимость работы. Результаты работы представляют значительный практический интерес. В частности, установлено, что являясь процессом самостоятельным, циркадианный ритм изменения активности ферментов может выступать в роли фактора, определяющего режим кормления рыбы при использовании индустриальных технологий рыборазведения. Кроме того, одновременное наблюдение за параметрами, характеризующими процессы потребления и утилизации компонентов пищи карпом в процессе выращивания позволяет оперативно вносить коррективы в нормирование кормления, ставя его в соответствие с потребностями рыбы в данный момент.

Особое внимание следует обратить на методический аспект, выявленный в процессе работы, суть которого заключается в необходимости приурочивания отбора материалов к определенному времени суток, что крайне важно для последующего адекватного сопоставления данных. Полученные результаты свидетельствуют о возможности проведения исследований циркадианной ритмики течения физиолого-биохимичесхих процессов в неравноотстоящих точках наблюдений.

Материалы диссертационной работы включены в курс лекций по экологии и охране природы, читаемых в Астраханском государственном техническом университете.

Апробация работы- Материалы работы докладывались на 4 Всесоюзном симпозиуме "Мембрана 1_еточной <айыы" (Рига, 1990), Международной конференции молодых ученых = Щецингхой сельскохозяйственной академии (Szcecin, 1991), на VIII научной кснферени>и по экологической физиологии и биохимии рыб (Петрозаводск, 1992) на науч-о-методических конференциях профессорско-преподавательского состава АГТУ .Астрахань, 1993,1994, 1995).

Публикации. По теме диссеггации опубликовано 6 печатных работ.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литерггуры, ермалов и методов исследования, 4 глав с описанием результатов гэбствен-ых исследований и их обсуждением, заключения, выводов и приложения Диссертация изложена на 198 страницах машинописного текста, из которых 18 страниц занимают рисунки, 29 страниц список литературы, вклю-ающий :аботы 186 отечественных и 71 иностранного авторов, а также 22 страницы - при'ожения.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена з период 1990-1994 годах в прудовых и аквариальных условиях на базе МП "Волжгслй экспериментальный завод" и кафедре "Ихтиологии и гидробиологии" Астраханского государственного технического университета. В качестве объекта исследования использовали 3672 сеголетка карпа (Cyprinus carpió L.).

В качестве эксяер*менталь-ых использовали пруды площадью 0,5 га, как со стабильными, так и ¡-естабшъны/ии гидрохимическими и гидрологическими показателями. Карпа вьсащивап» по традиционной технологии при плотности посадки 60 тыс. штук/га слримене-ием комбикорма ВБС-РЖ-81 (Гамыгин, 1989). Кормление осуществляли с лодки 'дорожкой* начиная с 26.06 (9,6-3% от массы рыбы, в зависимости зт периода кормления), до этого момента рыба использовала естественною кормогую базу прудов.

Отловы в прудах производил* волокушей шесть раз в сутки с интервалом в четыре часа, начиная с 3.00, в соответствии с рекомендациями М.А.Щербины (Щербина и др., 1987).

При исследовании сезонно? и суточной динамик активности ферментов было проведено четыре сарии отливов, охватывающих весь сезон выращивания (23.06-25.06,15.07-17.07. :5.08-07.Г8, 26.08-28.08). В качестве результата использовали осредненные дан-ые трех -ооведенных подряд суточных отловов (24.06, 16.07, 06.08, 27.08)(Хроно:иотх>гия л хрономедицина. Руководство, 1989).

При исследовании тараметгов, характеризующих питание, было проведено восемь серий отловсв (24.06. Э5.07. 16.07, 30.07, 06.08.16.08, 27.08, 06.09).

Определение суточных рационов основывалось на количественном учете содержимого пищеварительного тракта у рыб через равные периоды наблюдений в течение суток, времени продвижения пищи по кишечнику и степени ее переваривания. (Щербина и др., 1987).

Пробы, после проведения морфоыетрического анализа (Правдин, 1973), упаковывали, этикетировали и в термосах с сухим льдом (-71 °С) доставляли в лабораторию, где подвергали дальнейшему исследованию.

При проведении экспериментов в аквариапьных условиях карпа выдерживали без кормления в течение одной недели. Затем рыб разделили на две группы и поместили в рецикулируемые аквариумы (Яржомбек, 1980) объемом 500 литров. Опытная группа два раза в сутки получала комбикорм (Щербина и др., 1983), контрольная группа содержалась без кормления. Длительность эксперимента составила четыре недели. По окончанию эксперимента проводили морфометрический анализ, а также исследовали суммарную карбогидразную активность и активность нейтральной протеазы.

Для определения активности пищеварительных ферментов кишечник рыб промывали 20 мл охлажденной до 3-4°С дистиллированной воды. Затем его очищали от жира, измеряли и взвешивали. Все операции с кишечником проводили на предварительно сильно охлажденном стекле. С кишечника снимали слизистую оболочку и определяли ее навеску. Гомогенизацию слизистой оболочки производили на гомогенизаторе с тефлоновым поршнем в дистиллированной воде в соотношении 1:9. Таким образом получали исходный раствор, который затем разводили дистиллятом таким образом, чтобы далее определять экстинкцию в линейной зоне.

Суммарную карбогидразную активность определяли методом Нельсона в модификации А.М Уголева и Н.Н.Иезуитовой (1969). Активность нейтральной протеазы определяли модифицированным методом Лоури (Алейникова, Рубцова, 1988).

Полученные результаты подвергали статистическому анализу (Бейли, 1962; Егоров, Егорова, 1995; Катинас, 1982; Лакин, 1980), с использованием интегрированного пакета статистической обработки информации "STATGRAPHICS" (Statistical graphics system by STSC INC. and Statistical graphics Corp., 1993).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Сезонные изменения активности пищеварительных ферментов карпа в прудах с различным гидрохимическим режимом

Преимущество проведения экспериментов в прудовых условиях состоит в том, что, контролируя характеристики среды обитания, возможно проследить.

каким образом на рыбу окэзызгет воздействие весь комплекс реальных абиотических факторов, который невозможно воспроизвести в аквариальных условиях. Именно эти факторы, п: утверждению ряда авторов, в значительной степени способны злиять на г^лролитинеские процессы, протекающие в кишечнике (Кузьмина. Неаапеянык 1986; Нгвапенный, Егоров, 1995; Neva!yonny е1 а!., 1991 и др.). Кроме того, инте-смфикаиионные мероприятия, проводимые в прудах в течение сезона вырануеания рьбы безусловно накладывают определенный отпечаток на реализацию пищеварительной функции.

В серии прудовых экспериме-~оз нами была предпринята попытка исследования характера изменения уровне суммарной кароогидразной активности и активности нейтральной протеазы у кэспа в течение сезона выращивания.

Проведение эксперимента пгсобного рода позволяло осветить два аспекта; во-первых, оценить степень шжния антропогенной нагрузки, выраженной во введении в рацион выращиваемэ* рыбы искусственного корма, а также в проведении мелиоративных работ * удобрении прудов, на процессы гидролиза пищевых компонентов; во-вторых, зпределить характер влияния абиотических факторов среды на процессы геищезг рения.

В качестве экспериментальных были выбраны два пруда. Пруд N1 полностью отвечал требованиям, предъявляемым к выростным прудам, пруд N2, напротив, отличался значительными колебанием значений гидрохимических и гидрологических показателей в течение сезона выращивания (Табл. 1).

Таблица 1

Показатели некоторые абиотических факторов среды в эксперименте /

Показатели Номгр Даты отловов рыб

пру^а

24.06И 6.07 06.08 27.08

ГС 1 29.1 { 25.6 23.4 22.7

2 29.1 (24.9 24.5 22.1

Кислород, 1 5.9 | 5.6 5.9 ( 4 6 6.3

ыг/л 2 2.1 5.9

рН 1 7| 7.4 7\ 7 72. 7.3

2 6 3. 7.3

Глубина,м 1 1.5 > 1.5 1.5 1.5

2 1.51 1 0.7 1.4

Зарастземость, 1 - г 10 10 15

% от площади 2 15 90 15

На рис. 1А представлены лннные, характеризующие динамику уровня суммарной карбогидразной а>ггивч:сти в сгизистой кишечника карпа в течение сезона выращизания.

Экспериментально установлено, что до начала кормления комбикормом (24.06) значение активности комплекса карбогидраз составило 27.25+1.10 мкМоль/(г*мин). В июле (16.07) у рыб в пруду N1 уровень активности фермента снизился до 11.06+1.13 мкМоль/(г*мин). Суммарная карбогидразная активность в начале августа (06.08) возросла до 23.46+0.94 мкМоль/(г*мин), конец августа (27.08) характеризовался дальнейшим ростом активности фермента (34.23+1.73 мкМоль/(г*мин)).

В пруду N2 в июле (16.07) суммарная карбогидразная активность слизистой кишечника карпа находилась на уровне 7.13+0.76 мкМоль/(г*мин). Активность исследуемого фермента в августе (06.08) составила 19.50+0.93 мкМоль/(г*мин). Активность комплекса карбогидраз в конце эксперимента (27.08) достоверно ниже (16.77+1.29 мкМоль/(г*мин)).

нопротеазной (Б) активностей в слизистой кишечника карпа на протяжении сезона выращивания (М+т): а - пруд N1,6- пруд N2.

Обозначения:

по горизонтали - дата отлова рыб,

по вертикали - активность фермента, мкМоль/(г*мин).

Сопоставляя данные, касающиеся сезонной динамики суммарной карбогид-разной активности у карпа в двух прудах, можно отметить сходную тенденцию в изменении ее значений, наблюдаемую в июле и начале августа. Однако в конце периода наблюдений в пруду N1 наблюдается увеличение активности фермента, тогда как в пруду N2 идентифицировано ее падение. В то же время обращает на себя внимание тот факт, что величина значений суммарной карбогидразной активности у рыб в пруду N2 в период кормления искусственными кормами

достоверно ниже, нежели в пруду N1 (р<0.05). По нашему мнению, это связанс со значительной нестабильностью показателей, характеризующих пруд N2 (гидрохимия, гидрология, зарастаемость и т.д.), которая и вызвала снижение уровня активности ферментов, а также задержку в росте (средняя масса рыбы е 6.7 раза ниже, чем в пруду N1). Последнее обстоятельство обусловило неполное использование комбикорма карпом (в частности, его потребление снизилось) что четко отразилось на активности комплекса карбогидраз в последнем отлове.

На рис. 1Б представлены результаты, полученные при исследована динамики активности нейтральной протеазы, функционирующей на гл и кокал иксе кишечника карпа, в течение сезона выращивания.

До начала кормления комбикормом 24.06 активность фермента составляла 3.42+0.33 мкМоль/(г*мин). В июле (16.07) у рыб в пруду N1 не было выявлено достоверных изменений в уровне активности фермента (4.04+0.42 мкМоль/(г*мин)). Начало августа (06.08) в этом пруду характеризовалось ростом активности нейтральной протеазы слизистой кишечника карпа (7.60+0.3Е мкМоль/(г*мин)). Активность фермента в последнем отлове (27.08) несколько снизилась (6.62+0.32 мкМоль/(г*мин)).

Анализ изменения активности нейтральной протеазы в кишечнике карпа из пруда N2 показал, что характер динамики этого показателя аналогичен таковому, описанному для пруда N1. Исключение составляет второй отлов (16.07), где наблюдалось снижение активности фермента до 1.93+0.15 мкМоль/(г*мин). В августе (06.08) скорость гидролиза составила 5.62+0.29 мкМоль/(г*мин). В конце эксперимента наблюдалось падение уровня активности фермента до 3.23+0.2С мкМоль/(г*мин). Следует подчеркнуть, что, как и в случае суммарной карбогид-разной активности, активность нейтральной протеазы у карпа из пруда N2 достоверно ниже (р<0.05), чем у рыб из пруда N1.

Проведенный корреляционный анализ показал наличие значительной положительной связи между суммарной карбогидразной активностью и активностью нейтральной протеазы на всем протяжении сезона выращивания (г>0.5 при р<0.05). Этот факт свидетельствует о том, что уровень активности нейтральной протеазы и комплекса карбогидраз взаимообусловлены.

Анализируя полученные данные, следует подчеркнуть, что перестройки активности исследованных ферментов на протяжении сезона выращивания е значительной мере обусловлены изменением характера потребляемой пищи. Введение в рацион карпа комбикорма сопровождается периодом привыкания, выраженном в некотором (более четко обозначенном для карбогидраз) снижении уровня активности ферментов. В тоже время, результаты экспериментоЕ свидетельствуют о большей вариабельности суммарной карбогидразной

активности, чем протеазной (размах варьирования 28 и 5.4 единиц активности для комплекса карбогидраз и нейтральной протеазы соответственно).

Необходимо подчеркнуть, что, несмотря на различие абиотических факторов в двух искусственных экосистемах, характер динамики уровня активности исследованных ферментов в них в течение сезона выращивания сходен. Активность ферментов и значения показателей факторов среды в этот период не коррелированы. Возможно, адаптация активности ферментов к колебаниям значений абиотических факторов среды осуществляется за более короткие промежутки времени, чем сезон зыращивания.

Циркадианная активность пищеварительных ферментов у карпа выращиваемого в прудовых условиях Традиционная технология выращивания карпа в прудах подразумевает использование комбикормов, которые выступают в роли субстратной нагрузки на гидролитическую систему организма рыбы. Следует, однако, отметить, что эта нагрузка не является постоянной и связана с нормами и режимом кормления.

Данные, полученные в результате описанных выше экспериментов, свидетельствуют о том, что характер динамики суточной активности комплекса кишечных карбогидраз и нейтральной протеазы у карпа в проведенных отловах различен.

9 13 17 21 1

Рис. 2. Суточная динамика уровня суммарной карбогидразной активности в слизистой кишечника карла (А - 24.06, Б-16.07). Обозначения:

по горизонтали - время суток, ч,

по вертикали - активность фермента, мкМоль/(г*мин).

На рис. 2А отражено изменение суммарной карбогидразной активности в <ишечнике карпа в течение суток до начала кормления комбикормом (24.06). <ак видно из рисунка, максимум активности приходился на 17.00. В остальное =ремя суток активность комплекса карбогидраз была в среднем в 1.2 рзза ниже.

После начала кормления рыбы в прудах комбикормом (16.07) выявлен несколько иной характер суточных изменений активности комплекса карбогидраз. В -астности, как показано на рис.2Б, отмечалось падение уровня ферментативной эстивности до минимума в период с 9.00 до 17.00. Далее наблюдался рост г/ммарной активности карбогидраз, которая в 1.00 достигала уровня, идентифицированного в 9.00.

На рис. ЗА представлены данные, характеризующие динамику изменения »ровня суммарной карбогидразной активности у рыб в начале августа (06.08). 3 отличие от предыдущего отлова, минимальная ферментативная активность установлена в 9.00. Далее на протяжении 12 часов наблюдалось узеличение скорости гидролиза углеводных компонентов пищи в слизистой кишечника карпа. Этрезок времени с 21.00 до 1.00 характеризовался падением уровня ферментативной активности в 1.4 раза. К 5.00 активность комплекса карбогидраз ~пи кокал икса карпа вновь возрастала.

32

23т

14

50-

9 13 17 21 1

40:

а-

13 17 21 1

Рис. 3. Суточная динамика уровня суммарной карбогидразной ективности в слизистой кишечника карпа (А - 06.08, Б-27.08). Обозначения, как на рис. 2.

На рис. ЗБ отражены изменения уровня активности комплекса карбогидраз, -аблюдавшиеся в конце эксперимента (27.08) в слизистой кишечника карпа. Минимум ферментативной активности приходился на 17.00. В течение

следующих четырех часов суммарная карбогидразная актизность возросла в 1.6 раза, в то время как с 21.00 до 1.00 наблюдалось- падение активности фермента.

Рассматривая изменения динамики суммарной карбогидразной активности в течение суток в четырех проведенных отловах, можно предположить, что именно включение комбикорма в рацион выращиваемых рыб приводит к существенному изменению процессов реализации пищеварительной функции. Зная состав суточного рациона по естественной пище и комбикорму легко убедиться в истинности этого предположения. Так, к моменту осуществления первого отлова (24.06), суточный рацион карпа состоял целиком из естественной пищи, з которой преобладали представители ветвистоусых и веслоногих ракообразных. У рыб второго отлова (16.07) суточный рацион по комбикорму значительно превосходит таковой по естественной пище (в 1.5 раза), кроме того часть естественной пищи составляет детрит. В третьем отлове (06.03) численное значение суточного рациона карпа по комбикорму в 2-4 раза превышает значение суточного рациона по естественной пище, большая часть которой состоит из детрита. Аналогичное соотношение суточных рационов отмечалось и в последнем отлове (27.08).

Таким образом, необходимо некоторое время для реализации перестройки пищеварительной функции, в течение которого осуществляется переход на новый рацион. Возможно, именно этим объясняется более низкий уровень суммарной карбогидразной активности во втором отлове по сравнению с двумя другими.

ч-"

9 13 17 2! I

1-

13

21 1

Рис. 4. Суточная динамика уровня активности нейтральной протеазы в слизистой кишечника карпа (А - 24.06, Б-16.07). Обозначения, как на рис. 2.

На рис.4А показано вменение динамики нейтрапьнопротеазной активности з кишечнике карпа в теченлэ суток до начала кормления рыбы в прудах (24.06). Максимум активности нейтральной протеазы приходился на утренние часы (5.00 и Э.00). К 13.00 уровень ферментативной активности несколько снизился, а затем к 21 часу скорость гидролиза вноеь возросла. В час ночи отмечена тенденция к снижению уровня исследуемого фермента.

На рис. 4Б отражены результаты, полученные после начала кормления <зрпа комбикормом (16.С7]. Как видно из рисунка, максимальное значение активности нейтральной сротеазы, функционирующей в слизистой кишечника <зрла, отмечалось в 9.03, далее на протяжении восьми часов наблюдалось падение активности нейтральной протеазы до минимума в 17.00.

На рис. 5А приведены данные, касающиеся динамики суточной активности нейтральной протеазы у третьего отлова (06.08), которая характеризовалась наличием двух минимумов зафиксирозанных в 9.00 и в 21.00.

Рис. 5Б отражает результаты, полученные в конце эксперимента (27.08). Различия значений скорости гидролиза белковых компонентов корма в 9.00 и 13.00 носили недостоверный характер. В период с 13.00 до 17.00 наблюдалось снижение активности нейтральной протеазы кишечника карпа. Далее на протяжении дзенадцати часов следовал рост ферментативной' активности, которая достигала максимума к 5.00.

1"\

9 13 17 а 1

6: "

9 13 17 21 1

Рис. 5. Суточная динамика уровня активности нейтральной протеазы в слизистой кишечника карта (А - 06.08, Б-27.08). Обозначения, как кз рис. 2.

При сравнении динамит суммарной карбогидразной и нейтрапьнопротеазной активности в первом отлове обращает на себя внимание факт наличия

значительной обратной связи между исследуемыми ферментами (г = -0.5 при р<0.05). В последующих отловах характер связи коренным образом изменился. В июле и августе связь между активностями ферментов характеризовалась как значительная положительная (г > 0.6 при р<0.05).

Для выявления возможных тенденций в динамике активности исследуемых ферментов нами была осуществлена процедура полиномиального сглаживания (Егоров, Егорова, 1995).

Данные, полученные при анализе открытых сплайнов, описывающие цирка-дианные ритмы суммарной карбогидразной и нейтральной протеазной активностей, позволяют констатировать тот факт, что ферментативные перестройки гидролитической системы способны осуществляться достаточно быстро - менее чем за 4 часа (Рис. 6А).

Таким образом, опираясь на результаты статистического анализа можно говорить об адаптации кишечных ферментов к времени суток как о достаточно мобильном средстве в поддержании гомеостаза организма в целом.

Рис. 6. Открытый (А) и закрытый (Б) сплайны течения процесса гидролитического расщепления углеводных компонентов корма в течение суток в кишечнике сеголеток карпа (06.08).

Обозначения, как на рис. 2.

Используемая методика проведения исследований ритмики течения физиологических процессов позволяет рассматривать изучаемое явление как замкнутый циклический процесс, реализация которого остается условно постоянной на протяжении нескольких циклов. Биоритмы с такими характеристиками обычно считают стационарными и описывают как квазипериодические. Это обсто-

ятельство дает возможность рассматривать динамику суточной активности исследуемых ферментов в точках отловов как систему замкнутых сплайнов. Представление результатов экспериментов в подобной форме позволило выявить тенденции во временной организации суточной ритмики активности комплекса карбогидраз и нейтральной протеазы, функционирующих в кишечной слизистой карпа. В частности, в первом отлове сдвиг фаз процессов изменения уровня активности исследуемых ферментов относительно друг друга составил практически 180°, что говорит о наличии инверсии ритма. В последующих отловах как для суммарной карбогидразной, так и для нейтральной протеазной активностей, выявлена тенденция к образованию в течение суток двух положительных и двух отрицательных экстремумов (Рис. 6Б). Следует подчеркнуть, что несмотря на некоторое различие абиотических факторов, она сохранялась во всех экспериментальных прудах, изменяя только характер выраженности.

Зависимость циркадианной активности пищеварительных ферментов карпа от наличия корма

Помимо экспериментов, проведенных в прудовых условиях, был осуществлен ряд аквариальных опытов. Подобного рода методический подход позволил достичь нескольких целей: во-первых, появилась возможность для создания строго контролируемых условий среды; во-вторых, перестала существовать проблема регулирования плотности посадки; в-третьих, упростилась процедура кормления; в-четвертых, удалось избавиться от многочисленных "второстепенных" факторов среды.

Особо следует подчеркнуть, что постановка эксперимента в аквариальных условиях позволила определить, является ли наличие циркадианного ритма активности исследуемых ферментов самостоятельным процессом, либо он обусловлен влиянием ф&кторов среды.

Исследование модели, описывающей циркадианные ритмы процессов гидролитического расщепления углеводных и белковых компонентов пищи, построенной по результатам аквариальных опытов позволило более детально представить характер ферментативных перестроек гидролитической системы. Основываясь на полученных данных, можно с большой уверенностью говорить о наличии адаптации кишечных ферментов к времени суток вне зависимости от наличия пищи. Иными словами, суточная ритмика активности ферментов существует как самостоятельный процесс на течение которого могут накладывать отпечаток воздействия тех или иных факторов среды (биотического или абиотического характера). При этом, степень выраженности влияния фактора, по

нашему мнению, определяется характером его воздействия (непосредственно или опосредовано), а также наличием других факторов. Так, при отсутствии субстратной нагрузки взаимообусловленность ферментативных активностей исследуемых ферментов проявляется крайне слабо.

Сопоставляя замкнутые сплайны, рассчитанные для суммарной карбо-гидразной и нейтральной протеазной активностей в опытной группе, следует подчеркнуть, что они имеют по две пары экстремумов и довольно точно совпадают по фазам. Этот факт говорит в пользу идентичной временной организации двух квазипериодических процессов, имеющих одинаковый период

замыкания цикла. Кроме того, необходимо отметить, что характер кривых,

/

описывающих изменение во времени активности нейтральной протеазы з опыте и контроле сходен. Вероятно, это свидетельствует о малой подверженности фермента, осуществляющего заключительные стадии гидролиза белкозых компонентов пищи, влиянию субстратной нагрузки в отличие от комплекса карбогидраз.

Следует особо обратить внимание на несколько моментов, которые представляются весьма важными в методическом отношении. Выявленные на сплайнах сдвиги кривой течения исследуемых процессов относительно точек наблюдения свидетельствуют о возможности проведения исследований циркадианной ритмики течения физиолого-биохимических процессов через неравные интервалы времени. Кроме того, для последующего адекватного сопоставления полученных данных необходимо приурочивать отбор материалов для подобных исследований к определенному времени суток.

Исследование корреляционных связей параметров, характеризующих питание и пищеварение карпа Результаты наших экспериментов позволяют считать наиболее мощным среди биотических факторов наличие корма, выступающего в роли субстратной нагрузки на пищеварительную систему. В тоже время работами ряда авторов доказывается существование корреляции между интенсивностью питания и активностью пищеварительных ферментов рыб (Ананичев, 1959; Кузьмина, 1978; Кузьмина, 1980; Пегель, 1950; Пегель, Антипин, 1973 и мн. др.). В связи с этим, нами была предпринята попытка исследования в течение сезона выращивания' динамики некоторых параметров, характеризующих питание карпа в искусственных экосистемах.

С целью выявления зависимости между показателями, характеризующими питание и уровнем активности комплекса карбогидраз и нейтральной протеазы в период кормления карпа искусственным кормом в прудах нами был проведен корреляционный анализ, результаты которого приведены в Таблице 2.

Анализируя полученные данные следует отметить несколько важных аспектов. По нашему мнению, снижение значений коэффициента корреляции между интенсивностью потребления лищи (Ип) и суммарной карбогидразной активностью в период наблюдений представляется вполне закономерным явлением, связанным с тем, что с возрастом отношение сухой химус : масса рыбы (собственно Ил) значительно изменяется, что приводит, естественно, к некоторому ослаблению силы связи между исследуемыми признаками. Значения коэффициента корреляции между долей комбикорма в хииусе и активностью комплекса карбогидраз кишечной слизистой карпа, свидетельствующие о сильной (близкой к функциональной) связи, дают право на утверждение о том, что уровень активности конкретного фермента зависит от «зличества субстрата, который он гидролизует. Интересен и тот факт, что связь между интенсивностью потребления корма и суммарной карботидразнсй активностью имела обратный характер. Это является свидетельством того, что чем больше комбикорма потребляется карпом, тем в меньшей степени его компоненты подвергаются гидролизу и последующей утилизации, и наоборот. Этот момент носит ярко выраженный прикладной характер, делая акцент на такой важной проблеме как нормирование кормления при использовании индустриального способа получения товарной рыбной продукции.

Таблица 2

Коэффициенты корреляции суточной активности ферментов и показателей, характеризующих питание карпа (индекса потребления и долей комбикорма) в течение сезона выращивания, г

Активность ферментов Индекс потребления Доля комбикорма

Даты отловов рыбы 16.07 06.08 27.08 Даты отпозов рыбы 16.07 06.08 27.08

Комплекс карбогидраз -0.8 р<0.05 -0.5 р<0.05 -0.3 р<0.05 -0.9 р<0-05 -0.9 р<0.05 -0.9 р<0.05

Нейтральная протеаза -0.5 р>0.05 0.3 р>0.05 -0.7 р>0.05 -0.9 р<0.05 -0.03 р<0.05 -0.1 р<0.05

Низкие показатели вероятности (р>0.05) при расчзтах коэффициента корреляции между индексом потребления и активностью нейтральной протеазы у карпа свидетельствуют о том, что полученные высокие значения г, по всей видимости, носят случайный характер и не могут характеризовать взаимообусловленность исследуемых признаков. Несколько иначе представляется связь между долей комбикорма и активностью нейтральной протеазы. С началом кормления карпа комбикормом (период привыкания) наблюдалось довольно сильное сопряжение исследуемых признаков. Однако, в последующих

отловах связь между ними практически отсутствсзала. Это свидетельствует о том. что уровень активности нейтральной лротеазы не обусго=лизается характером питания. Вероятнее всего, как отмечалось нами г^-ее, на нейтральнопротеазную активность гликокаликсз кишечника сеголеток карпа существенное влияние оказывает комплекс абиотических фактороз сселы.

Полученные данные позволяют сделать утверждение о том, -тс высокие значения коэффициента корреляции не являются свидетельством того, что характер интенсивности потребления корма в течение суток и доля -ссмбикорма в нем определяют характер суточной динамики активности уссгедуемых ферментов у сеголеток карпа. Из этого следует, что являясь гооцессом самостоятельным, суточная динамика активности ферментов может гь^ступать в роли фактора, определяющего режим кормления рыбы з прудах.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные нами результаты подтвержда-зт данные о том, --.то адаптационный процесс есть процесс ритмический, обусловленный ¡омллексным влиянием на живую систему нескольких многократно действующих с различными интервалами и неодинаковой силой факторов. Это вызывает необходимость перестройки процессов реализации всех жизненно важных функций, направленных на адаптацию организма к окружающей среде и сохранение гомеостаза (Губин, Герловин, 1980; Степанова, 1586; Физиология адаптационных процессов, 1986). Наши исследования позволили не только идентиоицирозать наличие четкой ритмической организации процессов гидролиза компонентов пищи у карпа в течение суток, но и выявить некоторые особенности взаимодействия пищеварительной функции как с биотическими, тг< и с абиотическими факторами среды.

Результаты модельных экспериментов поззоляют утверждать, что адаптация кишечных ферментов к времени суток не зависит от наличия и мощности антропогенной нагрузки {наличия пищи или режима кормления). Иггыми словами, суточная ритмика активности ферментов кишечника рыб существует как самостоятельный процесс, на течение которого мог/т накладывать отпечаток воздействия тех или иных факторов среды. Этот факт представляется очень важным, так как свидетельствует о том, что простракггвенно-временная организация гидролитической системы рыб, в частности гарпа, укладывается з рамки общепризнанной теории, согласно которой циркглианные ритмы эндогенны, они поддаются захватыванию колебаниями различных параметров среды и реакция циркадианной системы на внешние воздействия составляет существенную часть ее механизма (РйепйпдЬ, 1976).

Как известно, согласованное осуществление различных биоритмов в организме необходимо для оптимальной реализации его функций, совокупность которых создает единую стройную систему (Комаров, 1983; Уголев, 1972, 1985, 1987). В связи с этим в последние годы интенсивно развиваются концепции как пространственной, так и временной организации биологических систем. Обладая специфическими чертами, они, тем не менее, должны быть связаны между собой, что дает возможность представлять их как единое целое. Таким образом, понятие о пространственно-временной организации живых систем вносит определенную упорядоченность в совокупность и взаимоотношения их биоритмов. Методика проведения исследований реализации квазипериодических процессов в наших исследованиях дала возможность рассматривать динамику суточной активности комплекса карбогидраз и нейтральной протеазы в виде системы замкнутых сплайнов (цикл замыкания 24 часа). Представление результатов экспериментов в подобной форме позволило выявить тенденции во временной организации суточной ритмики активности исследуемых ферментов, функционирующих в кишечной слизистой карпа. В частности, до начала кормления была идентифицирована инверсия ритма течения гидролитических процессов, связанных с расщеплением белковых и углеводных составляющих пищи, тогда как после начала кормления рыбы в прудах как для суммарной карбогидразной, так и для нейтральной протеазной активностей, выявлена тенденция к образованию в течение суток двух положительных и двух отрицательных экстремумов. Подобная двувершинная форма кривой, так называемый бигеминус, описан Цайглером с соавторами (2е1д!ег е1 а!.. 1971) у типично дневных видов животных при потреблении пищи, однако следует отметить, что не всегда эти пики явно привязаны к моментам наибольшей доступности корма.

Принято считать, что любые внешние по отношению к организму ритмические факторы являются синхронизирующими затягивающими агентами ритмики отдельных осцилляторов, из которых в роли основного выступает ритм чередования света и темноты (РМепйпдЬ, 1976 и др.). Данные, полученные в результате проведенных нами экспериментов, дают основание полагать, что на характер реализации гидролитической функции кишечника карпа накладывают отпечаток как абиотические, так и биотические факторы, однако, как и следовало предполагать, не все они в равной мере способны воздействовать на циркади-знную ритмику мембранного пищеварения карпа. Как показал корреляционный знализ, на протяжении суток протеазная активность более чувствительна к ■вменению абиотических факторов среды, таких как температура (г=-0.9 при э<0.05) и кислородный режим (г=-0.6 при р<0.05), тогда как суммарная

карбогидразная активность в большей меое определяется состазои рациона (р=0.9 при р<0.05). Интересен тот факт, что ответом со стороны лищезарительной системы карла на ухудшение гидрохимических показателей является мобилизация гидролитической функция. направленная на активизацию ферментативного расщепления белковой компоненты корма.

Совпадение по фазам кривых суточнсй динамим суммарной кзрбогидраз-ной и нейтральной протеазной актизнсстей у питающейся группы рыб и различия этих показателей у голодающих карпов eu-Э раз убедительно подтверждает тезис о том, что при отсутствии субстэатной нагрузки взаимообусловленность ферментативных активностей на гликокаликсе кишечника карпа проявляется крайне слабо.

Анализ данных, приводимых различными авто:зми, о взаимосвязи активности пищеварительных ферментов с изменяющимися условиями среды позволяет условно выделить два уровня в адаптации пищеварительных функций. *

Первый уровень адаптации пищеварительной функции отражает реакцию организма в конкретных экологических условиях (Кириленко, Трудоза, 1585, 1987; Мустаев, Коваленко, 1986; Трудова, 1985) и является зесьма мобильным средством поддержания гомеостаза организма. Второй выработался как приспособление организма к сезонным изменениям абиотических условий, связанных с проявлением цирканнуального ритма. (Ананичеэ, 1959; Кузьмина, 1988; Плотников, Проскуряков, 1985; Строганов, Бузинова, 1970; Чепик, 1964; Chopra et al., 1989). Эти два иерархических уровня временной организации процессов адаптации гидролиза пищевых компонентов прослеживаются одновременно и обеспечивают четкую координацию функций организма в естественных условиях среды обитания (Шатуновский, 1987). Кроме того, как показали результаты наших исследований, перестройки циркадианной активности кишечных ферментов, в особенности протеолитических, в ответ на изменение показателей абиотических факторов среды способны осуществляться всего за несколько часов. Эти данные позволяют утверждать, что изменение уровня активности ферментов в течение суток необходимо относить именно к разряду так называемых "быстрых" адаптаций. Наблюдаемые изменения наиболее отчетливы при переходе от состояния относительного покоя к пищевой активности, что сопровождается позышением процессов синтеза и транслокации мембранных ферментов, особенно при белковой диете. Такая перестройка, вероятно, имеет большое функциональное значение, увеличивая ферментативные и транспортные активности энтероцитов (Кушак, 1983).

Иерархия циркадианной системы имеет ряд вахных особенностей. Например, она позволяет объяснить переходный процесс при сдвиге фазы, ха-

рактерный для всех изученных многоклеточных циркадианных систем. Сдвиг фазы всей системы происходит постепенно, на протяжении нескольких циклов, в то время как колебатель перестраивается практически мгновенно. Медленная перестройка системы отражает постепенное возвращение подневольных осцилляторов в исходное устойчивое состояние с прежней фазой относительно сдвинутого периода колебателя. Приспособление пищеварительной системы обеспечивает эффективность и экономичность функционирования. Стимул, возникающий при изменении композиции диеты, к примеру, вызывает кратковременный ответ со стороны пищеварительной системы и должен быть повторен при неоднократном приеме специализированной диеты для стабилизации нового уровня соответствующей ферментативной активности. Как правило, не происходит мгновенной реакции на введение субстрата (Кушак, 1983; Мембранный гидролиз и транспорт, 1986). В наших экспериментах для адаптации гидролитической функции карпа к качественно новому рациону потребовалось 4 недели. Таким образом, сопоставляя полученные нами результаты и данные, приводимые в литературе, можно предположить, что изменения уровня ферментативной активности кишечника у сеголеток карпа на протяжении сезона выращивания в прудовых условиях относятся к так называемым "медленным адаптациям".

Таким образом, отдельный биоритм надо рассматривать как элемент временной организации, которая образуется совокупностью всех ее ритмических процессов, взаимодействующих и согласованных во времени между собой и с изменяющимися условиями среды и формирует хронобиологическую норму организма (Романов, 1985).

ВЫВОДЫ

1. Гидрохимический режим водоема существенно влияет на активность пищеварительных ферментов карпа: обмеление одного из прудов, сопровождавшееся уплотнением посадки сеголетков, 90% зарастаемостъю, падением содержания кислорода и рН воды, вызвало достоверное снижение активности как нейтральной протеазы, так и комплекса карбогидраз слизистой кишечника, особенно выраженное в конце сезона выращивания.

2. Среднесуточная суммарная карбогидразная активность и активность нейтральной протеазы слизистой кишечника карпа претерпевает изменения в течение сезона выращивания в прудах: активность комплекса карбогидраз резко падает в середине июля, вскоре после начала кормления искусственным кормом, затем вновь возрастает до конца августа; активность нейтральной протеазы достигает максимума в начале августа.

- 233. Циркадианная ритмика активности пищеварительных ферментов карпа претерпевает изменения в течение сезона выращивания. Характер этих изменений определяется, с одной стороны, текущим гидрохимическим режимом в пруду, а с другой стороны, зависит от продолжительности искусственного кормления и степени потребления комбикорма рыбами.

4. До начала искусственного кормления максимум суммарной карбогидразной активности отмечен в 17 часов, нейтральной протеазы - в 5 и 9 часов. Вскор>е после начала использования комбикорма максимум активности обоих ферментов сдвигается на 9 часов.

5. Длительное использование комбикорма (1.5-2 месяца) приводит к существенным изменениям циркадианной ритмики активности пищеварительных ферментов, имеющим неодинаковый характер в прудах с различными экологическими условиями, что свидетельствует об экологической неадекватности антропогенного вмешательства в режим и характер питания карпа, наблюдающегося в естественных условиях.

6. В аквариальных экспериментах с контролируемым гидрохимическим режимом показана зависимость как величины, так и циркадианной ритмики активности комплекса карбогидраз слизистой кишечника карпа от наличия субстрата - богатого углеводами комбикорма. Активность нейтральной протеазы у голодающих и питающихся комбикормом рыб резко различалась по величине, но имела сходную циркадианную ритмику.

7. Корреляционный анализ показал, что отсутствие субстратной нагрузки ведет к ослаблению функциональной связи между активностью комплекса карбогидраз и нейтральной протеазой слизистой кишечника карпа, и, напротив, наличие корма приводит к возрастанию тесноты связи. В период питания карпа естественной пищей рост суммарной карбогидразной активности в течение суток сопровождается падением протеазной активности, снижение суммарной карбогидразной активности сопровождается возрастанием протеазной активности, что свидетельствует об инверсии ритма процессов гидролитического расщепления углеводной и белковой составляющей корма. При переходе на рацион с комбикормом тенденции изменения сходны для обоих исследованных ферментов - установлено наличие бигеминуса активности комплекса карбогидраз и нейтральной протеазы на слизистой кишечника сеголеток карпа в течение суток.

8. Характер суточной динамики активности ферментов может выступать в роли фактора, определяющего режим кормления рыбы при использовании индустриальных технологий рыборазведения. Одновременное наблюдение за параметрами, характеризующими процессы потребления и утилизации

компонентов пищи в процессе выращивания позволит также оперативно вносить коррективы в нормирование кормления, ставя его в соответствие с потребностями рыбы на данный момент.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Неваленный А.Н., Коростелев С.Г., Егоров С.Н. Суточная динамика уровня активности некоторых карбогидраз кишечника карпа // Мембрана щеточной каймы: Тез. докл. IV Всес. симпозиума. -Рига, 1990. -С. 92-93.

2. Зайцев В.Ф., Неваленный А.Н., Коростелев С.Г., Егоров С.Н. Влияние комбикормов на активность карбогидраз кишечника карпа // Сб. науч. тр. ВНИИПРХ "Водные биоресурсы и экология гидробионтов". -1990. -Вып. 59. -С. 117-118.

3. Неваленный А.Н., Егоров С.Н., Коростелев С.Г., Зайцев В.Ф. Суточная динамика активности некоторых кишечных ферментов карпа // Комбикорма и обмен веществ у рыб. Сб. научн. тр. КТИРПХ. -Калининград. -1991. -С. 53-60.

4. Неваленный А.Н., Егоров С.Н., Зайцев В.Ф., Егорова В.И. Суточная ди-

С- е ,, 4,,,,

намика активно^!»! кишечных кариогцдраз иелого амура п V ш науч. конф. по экол. физиол. и биохимии рыб: Тез. докл. -Петрозаводск, 1992. -Т. 2. -С. 19-20.

5. Неваленный А.Н., Егоров С.Н. Суточная динамика суммарной карбогид-разной активности кишечника карпа, выращиваемого в прудовых условиях // Вопросы ихтиологии. 1995.-Т. 35, N4. -С. 549-552.

6. Егоров С.Н., Егорова В.И. Использование процедуры статистического сглаживания при моделировании пространственно-временной организации функций живых систем II Новые информационные технологи в региональной инфраструктуре : Тез. Второй Международной научно-технической конференции. Астрахань, 18-23 сентября 1995г.-Астрахань, 1995.-С. 50-51.

АГТУ. Заказ К 735. Тира* 100 экз. 22.11.95