Особенности мембранного пищеварения у рыб различных таксономических и экологических групп

Коростелев, Сергей Георгиевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Особенности мембранного пищеварения у рыб различных таксономических и экологических групп
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Особенности мембранного пищеварения у рыб различных таксономических и экологических групп"

на правах рукописи

КОРОСТЕЛЁВ СЕРГЕЙ ГЕОРГИЕВИЧ

ОСОБЕННОСТИ МЕМБРАННОГО ПИЩЕВАРЕНИЯ У РЫБ РАЗЛИЧНЫХ ТАКСОНОМИЧЕСКИХ И ЭКОЛОГИЧЕСКИХ

ГРУПП

Специальность: 03.00.13. - физиология АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Астрахань - 2006

Работа выполнена в Камчатском научно-исследовательском институте рыбного хозяйства и океанографии (КамчатНИРО)

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

доктор биологических наук

доктор биологических наук, профессор

А.Н. Невалённый

Ю.В. Алтуфьев А.С. Васильев А.Ф. Сокольский

Ведущая организация:

Камчатский государственный технический университет

часов на

Защита диссертации состоится 10 февраля 2006 г. в заседании регионального диссертационного совета ДМ 212.009.01. при Астраханском государственном университете, по адресу: 414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке АГУ по адресу: 414056, г. Астрахань, ул. Татищева, 20а.

Автореферат разослан

» января 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Ю.В. Нестеров

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Полученная в течение второй половины XX века информация значительно изменила многие наиболее фундаментальные представления о работе пищеварительной системы. Традиционные взгляды на механизм ассимиляции пищевых веществ гетеротрофными организмами основывались на общепринятом представлении о существовании двух типов пищеварения - внеклеточного и внутриклеточного. Однако в конце 50-х годов было обнаружено (Уголев, 1960-а; б), что помимо упомянутых выше классических типов пищеварения существует третий фундаментальный тип - мембранное пищеварение, которое осуществляется при контакте пищевых субстратов с ферментами,, локализованными на внешней поверхности структур кишечных" клеток. В этот же период описаны наиболее существенные особенности мембранного пищеварения. Обнаружение последнего позволило приблизиться к пониманию ряда важных закономерностей работы пищеварительного аппарата всех биотрофов.

Вместе с тем известно, что ртбы - это наиболее многочисленная группа позвоночных животных, насчитывающая более 20 тыс. видов с огромным разнообразием пищевых особенностей. В результате проведенных к настоящему времени исследований охарактеризованы закономерности полостного, мембранного и внутриклеточного гидролиза пищи и транспорта нутриентов в кишечнике рыб, достигнуты значительные успехи в изучении процессов индуцированного аутолиза и участия ферментов микрофлоры в реализации пищеварительной функции (Кузьмина, Цветкова, 2001; Кузьмина, Скворцова, 2001,2002,2003; Неваленный и др., 2003; Извекова, Лаптева, 2004 и мн. др.).

В конце XX века появились представления о том, что биосферу можно рассматривать, как трофосферу, где пищевые сети образуют замкнутую систему, функции обратной связи в которой играют ферменты, осуществляющие гидролитическое расщепление биополимеров (Уголев, 1985, 1990). Известно, что важнейшим биотическим фактором для гетеротрофных организмов является обеспеченность необходимой пищей, а наиболее важными абиотическими, особенно для холоднокровных гидробионтов — температура и для гидробионтов - концентрация водородных ионов в воде.

сведений о температурных адаптациях мембранных ферментов с учетом роли различных компонентов фермент-мембранных комплексов энтероцитов. Имеющиеся данные не позволяют сделать вывод о том, как влияют важнейшие абиотические факторы среды обитания на процессы пищеварения у рыб в течение жизненного цикла.

Несмотря на то, что регуляторные свойства ферментов, обеспечивающих процессы мембранного пищеварения у рыб, были установлены достаточно давно (Гредин, 1977; Кузьмина 1987), механизмы взаимодействия пищевых веществ в процессе гидролиза остаются до конца не выясненными (Неваленный и др., 2003). Сведения, полученные при исследовании этих вопросов, необходимы для -решения не только ряда теоретических и прикладных проблем питания и пищеварения рыб, но также и для понимания процессов, происходящих в водных экосистемах. . __

Цель и задачи исследований. Основная цель работы заключалась в изучении особенностей усвоения пищи у рыб различных таксономических и экологических групп. Центральное внимание было уделено влиянию температуры и концентрации ионов водорода на процессы мембранного пищеварения и процессам взаимодействия пищевых веществ в кишечнике рыб.

В связи с этим, были поставлены следующие задачи:

Исследовать видовые температурные адаптации пищеварительных ферментов рыб, стоящих на разных ступенях эволюционной лестницы.

Выявить индивидуальные температурные адаптации на примере мембранносвязанной мальтазы карпа.

Оценить влияние температуры среды содержания и функционального состояния карпов на структурные характеристики их кишечников.

Сравнить физико-химические свойства мембранной, детергентной и протеазной форм кишечной мальтазы различных карповых рыб.

Проанализировать влияние концентрации водородных ионов в воде на активность гидролитических ферментов рыб в условиях in vivo и in vitro.

Изучить влияние состава потребляемой пищи на активность пищеварительпых ферментов и установить эффекты взаимодействия пищевых веществ в процессе гидролиза у рыб различных таксономических групп.

проходных экологических групп. При этом показано, что свойства пищеварительных ферментов у исследованных групп видов рыб свидетельствуют об их значительной адаптированности к условиям функционирования, что обеспечивает оптимальное осуществление пищеварительной функции в естественных условиях.

Впервые при акклимации рыб к разным температурам проведено одновременное исследование как весовых и линейных характеристик кишечника, так и активности, и свойств ферментов клеток слизистой оболочки кишечника карпов. Установлено, что изменение температуры акклимации в диапазоне 8-28°С не вызывает адаптивных сдвигов в уровне активности и свойствах ферментов, осуществляющих мембранный гидролиз углеводов в кишечнике. Высказана гипотеза, что гомеостаз мембранного пищеварения при изменении температуры акклимации поддерживается не за счет регуляции .активности и свойств кишечных ферментов, а за счет изменения" массы слизистой оболочки кишечника. При понижении температуры она увеличивается, а при повышении - уменьшается. По-видимому, этот механизм особенно важен для сезонных адаптаций пищеварительной системы рыб.

Впервые на основе исследования физико-химических свойств мембраной, детергентной и протеазной форм кишечной мальтазы карповых рыб установлены видовые различия фермент-мембранного комплекса, а также внутривидовые особенности у карпов украинской и ропшинской породных групп, которые исчезают при разрушении комплекса фермент-мембрана. Выявленные различия свидетельствуют о фенотипических температурных адаптациях ферментных систем кишечника рыб, которые осуществляются за счет изменения микросреды - свойств клеточной мембраны и гидрофобного домена, но не затрагивают структуру белковой глобулы фермента. Кроме того, показано, что амфипатические ферменты холоднокровных животных менее прочно связаны с мембранами несущих их клеток, по сравнению с ферментами теплокровных.

В экспериментах по влиянию различных концентраций водородных ионов в среде содержания карпов на активность мембранных ферментов показан Э-образный характер зависимости активности карбогидраз при увеличении концентрации водородных ионов в воде с минимумом при рН 5-6 и максимумом при рН 4. В результате сопоставления рН-функций, полученных для пищеварительных ферментов лососевых рыб, обитающих в водоемах Камчатки, отмечена более широкая зона оптимальных значений рН, по сравнению с пресноводными костистыми рыбами умеренных широт.

При исследовании ферментативно активных препаратов слизистой кишечника осетровых, лососевых, карповых и камбаловых видов рыб выявлены процессы

взаимодействия субстратов ферментативных реакций в условиях in vitro для всех исследованных групп пищевых веществ. Установлено, что во всех случаях трисубстратных взаимодействий при исследовании слизистой кишечника рыб, стоящих на разных ступенях эволюционной лестницы, обитающих как в пресной, так и в морской среде, а также у проходных видов рыб обнаружен только активирующий эффект.

В целом, анализ собственных и литературных данных" позволил сделать заключение о том, что у рыб, стоящих на различных ступенях эволюционной лестницы, но близких по характеру питания, наблюдается сходное соотношение состава и_активности мембранных гидролаз, а у рыб таксономически близких, различающихся по экологии, напротив, отмечаются значительные различия.

Результаты диссертации имеют и практический интерес. Установленные в работе_ закономерности позволяют рекомендовать при разработке кормов для выращиваемых видов рыб очень точную сбалансированность по содержанию основных групп пищевых веществ, характерному для пищи вида в естественных условиях, чтобы обеспечить максимальную эффективность гидролитического процесса. Полученные данные необходимо учитывать прй~ исследованиях болезней рыб и нарушений пищеварения, как в естественных условиях, так и в аквакультуре.

Установленные факты могут быть использованы для оптимизации условий выращивания рыб и при проведении селекционной работы. В частности, данные по влиянию температуры и реакции среды на активность пищеварительных ферментов необходимо использовать для расчета норм кормления выращиваемых рыб в зависимости от температуры и рН воды или для искусственного поддержания этих факторов на оптимальном уровне. При селекции рыб и выборе объектов выращивания для различных климатических зон рыбоводства необходимо учитывать выявленные в диссертации температурные адаптации ферментов мембранного пищеварения.

Результаты работы могут бьггь включены в курсы лекций при подготовке специалистов: ихтиологов, гидробиологов и экологов. Некоторые данные уже включены в лекции по экологии и трофологии, читаемых для студентов в ряде университетов.

1990), Всесоюзной конференции «Оценка состояния, охрана и рациональное использование биологических ресурсов водных экосистем в условиях антропогенного воздействия» (Ростов-на-Дону, 1990), 15-ой Всесоюзной конференции «Физиология пищеварения и всасывания» (Краснодар, 1990), 4-ой Всесоюзной конференции по рыбохозяйственному использованию теплых вод (Курчатов, 1990), заседании методсовета «Корма, кормление и кормопроизводство для рыб» НЦ «Аквакультура» НПО по рыбоводству (Рыбное, 1991), Международной конференции «Каспий - настоящее и будущее» (Астрахань, 1995), 1-ом Конгрессе ихтиологов России (Астрахань, 1997), 3 International symposium on sturgeon— (Piacenza, 1997), Международной конференции «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов (Петрозаводск, 2004).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 45 работ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 276 страницах машинописного текста, иллюстрирована 63 рисунками, содержит 11 таблиц, состоит из введения, 5 глав, общего заключения, выводов и указателя цитируемой литературы, который включает 425 работ, в том числе 292 отечественных и 133 иностранных авторов.

_ МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В качестве объектов исследований для выявления особенностей мембранного пищеварения у рыб были выбраны представители таксономических групп, стоящих на разных ступенях эволюционной лестницы, обитающие в разных экологических условиях (осетровые — Acipenseridae, лососевые — Salmonidae, карповые - Cyprinidae и камбаловые -Pleuronectidaé). Всего исследовано 904 экз. рыб, выполнено 426 опытов и 41298 биохимических определений.

Для изучения активности и свойств ферментов, обеспечивающих мембранное пищеварение, использовали гомогенаты слизистой оболочки кишечника. Солюбилизированные ферменты получали по следующей схеме. После размораживания слизистой оболочки ее гомогенизировали в охлажденном растворе Рингера в соотношении 1:9 и центрифугировали в течение 20 мин при 3000 g (при этом основная ферментативная активность наблюдалась в надосадочной жидкости). Детергентную и протеазную формы мальтазы получали как супернатант после обработки надосадочной жидкости при температуре 25°С в течение 20 мин неполярным детергентом тритоном-Х-100 (1 мл на 100 мл препарата) или трипсином (1 мг на 1 мл препарата) при температуре 37°С в течение 30 мин и последующего ультрацентрифугирования при 100000 g в течение 30 мин. Мембранная

форма мальтазы находилась в осадке после ультрацентрифугирования препарата без предварительной обработки солюбилизирующими агентами.

Исследование влияния температуры инкубации на скорость ферментативных реакций проводили в диапазоне температур 0-75°С в течение коротких интервалов времени (5-10 мин) в специальном политермостате (Варламов и др., 1971).

Активность мальтазы определяли при помощи глюкозооксидазного метода (Dahlqvist, 1964), сахаразную и суммарную карбогидразную активность - методом Нельсона в модификации A.M. Уголева и Н.Н_Иезуитовой (1969), активность а-амилазы - по убыли крахмала модифицированным методом Смита и Роя~ (Уголев, 1969), суммарную протеиназную (рН 7.4) - модифицированным методом Лоури (Алейникова, Рубцова, 1988), активность щелочной фосфатазы с использованием 0,6 мМ рдствора п-нитрофенилфосфата Na в качестве субстрата.

Для исследования полисубстратных эффектов сопоставляли скорость гидролиза гомогенатами слизистой оболочки кишечника рыб 1% раствора растворимого крахмала, 2% раствора мальтозы, 1% раствора казеина и 0,6 мМ раствора n-нитрофенилфосфата Na по отдельности и в присутствии одного или двух веществ являющихся субстратом при определении уровня активности комплекса карбогидраз, мальтазы, суммарной протеиназы и щелочной фосфатазы. Гомогенаты слизистой оболочки кишечника приготавливали по отдельности. Модификаторы добавляли непосредственно к субстрату перед инкубацией его с ферментативно активным препаратом.

Активность фермента выражали в мг или мкмоль продуктов гидролиза, образующихся за 1 мин инкубации в расчете на 1 г влажного веса слизистой кишечника (мг или мкмоль х г"1 х мин"1).

Энергию активации рассчитывали по формуле (1):

Е,„ = R х Т2 х Т, х (Lg V2 - Lg V,) / (Т2 - Т,), (1)

где R — универсальная газовая постоянная, Тг и Ti - величина обратная абсолютной температуре (К"' х Ю3) инкубации, a Vi и Vi — скорости ферментативной реакции при разных температурах.

Морфометрические измерения проводили по стандартным методикам, принятым в ихтиологии (Правдин, 1966). Полученные результаты обрабатывали методами вариационной статистики (Закс, 1976; Лакин, 1990). Достоверность различий определяли с помощью критериев Стьюдента и Манна-Уитни.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Видовые температурные адаптации пищеварительных ферментов рыб

Температурная зависимость физиологических функций организма пойкилотермных животных является одним из наиболее твердо установленных фактов в современной биологии. Считается, что компенсация негативного влияния изменений температуры на скорость ферментативных процессов у пойкилотермных— животных осуществляется, преимущественно, на клеточном и молекулярном уровне посредством изменения концентрации ферментов и за счет изменения их свойств (Хочачка, Сомеро, 1988). Температурная., адаптация позволяет поддерживать относительную независимость физиологических процессов, в том числе пищеварительных, в~1оне температур, характерных для среды обитания различных видов пойкилотермных животных.

Достаточно подробно исследованы температурные адаптации мембранносвязанных пищеварительных ферментов холоднокровных животных, по сравнению с таковыми теплокровных (Егорова и др., 1974; Asgearsson et al., 1995). При этом показано, что температурные оптимумы одноименных ферментов у них.могут различаться на десятки градусов. Более того, подобные результаты получены и при изучении гидролаз рыб, обитающих в среде с разной температурой (Уголев и др., 1976, 1981; Gelman et al., 1989). Убедительно продемонстрировано, что свойства одноименных ферментов коррелируют с экологическими особенностями исследованных пресноводных костистых рыб (Уголев, Кузьмина, 1993; Пономарев, 1995,1997; Коростелев, Неваленный, 2005).

Интересно отметить, что у судака, леща и белого толстолобика летом наблюдается увеличение термостабильности щелочной фосфатазы, з также увеличивается fc-акт (Гельман, Нехамкин, 1979; Gelman et al., 1984; 1992). При исследовании кишечной сахаразы ряда видов рыб, обитающих в условиях Севера (бассейн р. Печора), в ряде случаев выявлены адаптивные перестройки свойств фермента, обеспечивающих температурную компенсацию заключительных этапов гидролиза полисахаридов (Пономарев, 1992а, 1997).

Характеристики пищеварительных ферментов, осуществляющих начальные и заключительные этапы гидролиза углеводов, у лососевых видов рыб, обитающих в водах Камчатского полуострова, ранее не изучались. В связи с этим, объектами исследований являлись наиболее массовые виды рода тихоокеанских лососей - горбуша (Oncorhynchus gorbuscha), кета (О. ке!а) и нерка (О. nerka), дикая жилая форма радужной форели (Salmo gairdneri) или микижа и проходная форма гольца (Salvelinus alpinus).

Данные по влиянию температуры инкубации на активность а-амилазы слизистой кишечника у тихоокеанских лососей представлены на рис. 1. Температурный оптимум а-амилазы для всех трех видов тихоокеанских лососей соответствует 30°С. Можно видеть, что в зоне постмаксимальных температур формы температурных зависимостей практически совпадают. Необходимо также отметить, что в зоне физиологических температур инкубации (0-10°С) относительная актавность а-амилазы кишечника нерки несколько выше, чем у горбуши и кеты (рис. 1Б), Также обращает на себя внимание наиболее узкая зона

оптимальных значений температуры д ля фермента кишечника кеты. --

А — Б

Рис. 1. Зависимость активности а-амилазы кишечника тихоокеанских лососей от температуры инкубации. По горизонтали - температура (°С); по вертикали - (А) - активность фермента (мг х гх мин"'), (Б) - в % от максимальной активности, принятой за 100.

Величина температурного оптимума а-амилазы кишечника гольца и микижи на 5 и 10°С соответственно выше, чем у исследованных видов тихоокеанских лососей и составляет 35 и 40°С (рис. 2). Как видно на рис. 2Б, форма температурной зависимости а-амилазы кишечника обоих видов рыб очень близка, и только в зоне физиологических температур относительная активность фермента у гольца несколько выше, чем у микижи. Результаты, представленные на рис. 3, свидетельствуют также о некоторых различиях в температурных характеристиках мальтазы кишечника исследованных видов тихоокеанских лососей. Как

видно из рисунка, температурный оптимум фермента кишечника нерки и горбуши одинаков и соответствует 50°С, а у кеты на 15°С ниже. Наиболее широкая зона оптимальных значений наблюдается для мальтазы кишечника кеты, а наиболее узкая - нерки (рис. ЗБ). Важно отметить, что в зоне физиологических температур относительная активность фермента кишечника нерки ниже, чем у кеты и горбуши.

А _ Б

--«---голец —■—микижа

Рис. 2. Зависимость активности а-амилазы кишечника гольца и микижи от температуры инкубации. По оси абсцисс - температура (°С); по оси ординат - (А) - активность фермента (мг х г х мин "'), (Б) - относительная активность в % от максимальной активности, принятой за 100.

Величина температурного оптимума мальтазы кишечника гольца соответствует 40°С, а у микижи на 10°С выше (рис. 4). Как видно на рис. 4Б форма температурной зависимости мальтазы кишечника обоих видов рыб очень близка, однако в зоне температур, лежащих ниже температурного оптимума, относительная активность фермента у гольца несколько выше, чем у микижи, поэтому в отношении карбогидраз, функционирующих в кишечнике гольца, можно сделать вывод об их адаптированности к функционированию в условиях низких температур. При анализе температурных функций а-амилазы и мальтазы лососевых рыб можно видеть, что наиболее близки они среди исследованных видов тихоокеанских лососей, а среди них у нерки и горбуши.

А Б

—нерка —■—горбуша —*—кета

Рис. 3. Зависимость активности мальтазы кишечника тихоокеанских лососей от температуры инкубации. По оси абсцисс - температура (°С); по оси ординат - (А) - активность фермента (мкмоль х г х мин "'), (Б) - относительная активность в % от максимальной активности, принятой за 100. ......

А Б.

--■•--■голец ■—и—микижа

Рис. 4. Зависимость активности мальтазы кишечника гольца и микижи от температуры инкубации. По оси абсцисс - температура (°С); по оси ординат - (А) - активность фермента (мкмоль х г х мин "'), (Б) - относительная активность в % от максимальной активности, принятой за 100.

Полученные данные подтверждают предположение, высказанное В.В. Егоровой с соавторами (1974) о том, что в процессе эволюции могут отбираться в качестве полезного признака соответствия между температурными условиями среды обитания видов и наиболее эффективной конформацией фермента.

Расчет значений Еакт для а-амилазы слизистой кишечника исследованных видов лососевых рыб представлен в табл. 1. Можно видеть, что только для фермента кишечника кеты эта величина постоянна во всем исследованном диапазоне температур инкубационной —ереды и составляет 6,7 кдж/моль. Значения Еакт процесса гидролиза крахмала препаратами слизистой кишечника нерки и горбуши для диапазона температур 0-10°С составили 8,3 и 14,8, а при температурах_от 10 до 30°С - 1,1 и 2,8 кдж/моль, соответственно. Следовательно, на графике Аррениуса имеется излом при температуре выше 10°С, а эффективность фермента у этих видов в зоне температур от 10 до 30°С, выше в 7 и 5 раз, соответственно.

Таблица 1

Значения энергии активации (дж/моль) а-амилазы кишечника лососевых рыб при физиологических температурах инкубации

Вид Диапазон температур инкубации, °С

0-10 10-20 . 20-30

Нерка 8275 1095

Кета 6713

Горбуша 14812 2796

Голец 2332 4193

• Микижа 5166 7937 4235

Для а-амилазы кишечника гольца и микижи, напротив, наблюдается скачкообразное увеличение величины Еакт при температуре выше 10°С. При этом для фермента гольца Е^ увеличивается почти в два раза для диапазона температур от 10 до 30°С, а для фермента микижи увеличение этого показателя в 1,5 раза наблюдается только для температур от 10 до 20°С.

Рассчитанные ЗНЗЧСНИЯ С/акт процесса гидролиза мальтозы препаратами слизистой кишечника исследованных видов лососевых рыб представлены в табл. 2. Только для фермента кишечника нерки и гольца эта величина постоянна во всем исследованном диапазоне температур инкубационной среды и составляет 4,8 и 2,6 кдж/моль, соответственно. Для мальтазы из кишечника микижи и кеты на графике Аррениуса

наблюдается излом при температуре 10 и 20°С, соответственно, а эффективность фермента в зоне физиологических температур почти в три раза выше. Для фермента кишечника горбуши также наблюдается скачкообразное уменьшение величины Еакт, но при температуре от 10 до 20°С.

Данные, касающиеся Еакт карбогидраз кишечника исследованных видов лососевых, свидетельствуют о зависимости этого показателя от типа питания рыб и диапазона температур активного откорма. Так, в диапазоне температур 0-10°С минимальные значения Е«кт а-амилазы_наблюдаются у гольца, мальтазы - у микижи, являющихся хищниками-факультативными бентофагами, которые не прекращают интенсивно питаться при низких температурах воды. Исследование ферментов кишечника тихоокеанских лососей показало, что при температурах ниже 10°С, при которых они питаются слабо, Еа1СТ карбогидраз либо увеличивается-либо не изменяется, по сравнению с диапазоном температур (10-20°С) наиболее активного питания. . .

Таблица 2

Значения энергии активации (дж/моль) мальтазы кишечника лососевых рыб в диапазоне

физиологических температур инкубации

- Вид Диапазон температур инкубации, °С

0-10 10-20 20-30

Нерка 4846

Кета 1736 3941

Горбуша 3540 1205 3120

Голец 2573

Микижа 1599 4435

Таким образом, при исследовании активности и температурных характеристик а-амилазы и мальтазы из кишечника нерки, кеты, горбуши, микижи и гольца, обитающих в водах Камчатского полуострова, показано, что в кишечнике всех исследованных лососевых видов рыб присутствуют карбогидразы, осуществляющие как начальные, так и заключительные этапы гидролиза углеводов пищи. При анализе температурных характеристик карбогидраз отмечено, что наиболее близки они среди исследованных видов тихоокеанских лососей. Свойства ферментов кабогидразной цепи в большинстве случаев коррелируют с такими экологическими условиями жизнедеятельности разных видов лососевых рыб, как характер питания и температура среды обитания.

Близкие результаты получены и при исследовании камбаловых рыб, обитающих в дальневосточных морях. Так, рассчитанные значения Еакт процесса гидролиза мальтозы препаратами слизистой кишечника звездчатой камбалы для диапазона температур 0-20°С составили 0,91-0,92 кдж/моль, а при температурах от 20 до 40°С — 2,35-2,36 кдж/моль. Следовательно, на графике Аррениуса имеется излом при температуре 20°С, а эффективность фермента в зоне физиологических температур почти в два раза выше. Для мальтазы кишечника белокорого палтуса также наблюдается скачкообразное увеличение величины Еакт, но при температуре 10°С.—

Расчет значений Еакт для а-амилазы слизистой кишечника обоих исследованных видов камбаловых рыб показал, что эта величина постоянна во всем исследованном диапазоне температур инкубационной среды и составляет 2,16 и 1,7 кдж/моль для фермента звездчатой камбалы и белокорого палтуса соответственно.

Графики Аррениуса для щелочной фосфатазы и суммарной протеиназы кишечника обоих видов камбаловых рыб имеют излом при 10°С. При этом Наст в диапазоне физиологических для этих видов рыб температур 0-10°С в среднем в два раза ниже, чем при более высоких температурах. Так, в диапазоне температур 0-10°С Еакт для щелочной фосфатазы звездчатой камбалы и белокорого палтуса составляет 7,77 и 13,26, а для температур 10-20°С - 14,77 и 22,15 кдж/моль, соответственно. Аналогичная закономерность характерна и для Eon- процесса гидролиза казеина препаратами слизистой кишечника этих видов рыб (при температурах 0-10°С этот показатель соответствует 6,4 и 7,32, а при 10-20°С —15,69 и 12,92 кдж/моль, для звездчатой камбалы и белокорого палтуса, соответственно).

Важно отметить более низкие значения Еакт Для мальтазы, щелочной фосфатазы и суммарных протеиназ в зоне низких температур, характерных для среды обитания исследованных камбаловых видов рыб. Это свидетельствует о большей эффективности гидролиза в их кишечниках при низких температурах, что также указывает на адаптацию мембранносвязанных пищеварительных ферментов. Близкие результаты были получены и при исследованиях кишечных ферментов карповых и осетровых видов рыб, обитающих в разных температурных условиях.

Таким образом, выявлено сходство ферментных систем, обеспечивающих процессы мембранного пищеварения у рыб разных таксономических групп, обитающих в холодных водах и у видов, обитающих в южных водоемах. При этом температурные характеристики пищеварительных ферментов у исследованных видов рыб свидетельствуют об их значительной адаптированное™ к условиям функционирования, что обеспечивает оптимальное осуществление пищеварительной функции в естественных условиях.

Индивидуальные температурные адаптации кишечной мальтазы карпов

Индивидуальные адаптации пищеварительных ферментов у рыб одного вида к изменению температуры среды обитания в настоящее время недостаточно изучены. Поэтому в специальном цикле экспериментов исследовали мальтазу кишечника карпов при изменении температуры акклимации. Карпов в течение двух недель выдерживали в аквариумах при температуре воды 18°С (контроль). Затем их делили на три группы: первую содержали при температуре 18°С, вторую - при пониженных до 8 (голодные) и 12°С (сытые), третью - при 28°С. В_начале эксперимента и через каждые 7 дней отбирали препараты^ слизистой кишечника.

Результаты, полученные для фермента из разных отделов кишечника, и для голодающих и для питающихся рыб, акклимированных к повышенным и пониженным температурам в течение и 7 и 14 суток оказались сходными. Характер влияния температуры инкубации на активность мальтазы оказался одинаков для всех групп рыб (рис. 5). Сравнение таких температурных характеристик кишечной мальтазы карпов, содержавшихся при разных температурах, как температурный оптимум, относительная активность при низких и высоких температурах инкубации, термостабильность, энергия активации, не позволило выявить адаптивных изменений свойств фермента при изменении температуры акклимации*рыб. Так, температурный оптимум гидролиза мальтозы препаратами слизистой кишечника всех групп рыб соответствует 70°С. Относительная активность мальтазы при 0°С составляет 3-5%, при 75°С - 74-78% от максимальной активности, различия для всех исследованных групп рыб отсутствуют. Расчет значений Еаст гидролиза мальтозы препаратами слизистой кишечника карпов также не позволил выявить зависимости этого показателя от величины температуры среды содержания рыб. Емп- постоянна во всем исследованном диапазоне температур инкубационной среды и составляет для фермента рыб, экспонированных при температуре 18°С 9,1 кдж/моль, а при температурах 12 и 28°С - 8,7 и 9,0 кдж/моль, соответственно.

Известно, что характер питания и факторы среды оказывают существенное влияние на строение и функционирование пищеварительной системы рыб. В частности, для молоди карпа, выращиваемой в прудах, полученные данные свидетельствуют, что морфологические И функциональные показатели пищеварительной системы подвержены сезонным изменениям и зависят от интенсивности питания рыб (Соболев, 1991). Большинство авторов полагает, что среди причин, вызывающих эти изменения, главной является температура.

А Б

Рис. 5. Влияние температуры инкубации на активность мальтазы слизистой кишечника карпов, акклимированных в течение 14 суток при разных температурах среды:* 1 - 18°С (контроль), 2 - 12°С, 3 - 28°С. По ос«-абсцисс - температура инкубации (°С), по оси ординат — скорость реакции, слева в мкмоль*г"'*мин"', справа в % от максимальной, принятой за 100.

В связи с этим, нами исследованы весовые и линейные характеристики кишечника карпов, аюслимированных к разным температурам. Установлено, что при повышении температуры от 18 до 28°С, относительная масса кишечника рыб уменьшается в 1.6 раза (р<0.01), в то время как при понижении от 18 до 12°С значение этого показателя, напротив, увеличивается в 1.2 раза (р<0.05). Изменения массы кишечника карпов при выдерживании в течение двух недель в среде с повышенными и пониженными температурами связаны, в основном, с изменениями массы слизистой оболочки. Действительно, эта величина выше у карпов, акклимированных к 12°С, чем к 28°С, в 2.6 раза (р<0.01), в то время как масса мышечной оболочки выше только в 1.3 раза (р<0.05). Необходимо также отметить, что относительная длина кишечника рыб, акклимированных к разным температурам, статистически не различается.

При исследовании влияния температуры на морфологические характеристики кишечника голодающих в течение двух недель карпов, установлена сходная закономерность. Однако необходимо отметить, что масса слизистой оболочки кишечника голодавших рыб,

акклимированных к 12 и 28°С, по сравнению с питавшимися, различается менее значительно - лишь в 1.9 раза (р<0.05). Кроме того, при понижении температуры акклимации от 12 до 8°С, этот показатель статистически не изменяется.

Следовательно, температура среды оказывает значительное влияние на весовые характеристики кишечника карпов и практически не влияет на линейные. При понижении температуры акклимации в диапазоне 28-12°С^ когда карп способен активно потреблять пищу независимо от его функционального состояния увеличивается масса кишечника. Увеличение массы кишезвика вызывается увеличением, как массы слизистой, так и массы мышечной оболочек. Однако масса слизистой оболочки кишечника увеличивается в большей степени.

Гипертрофия органов пищеварительной системы при адаптации к холоду отмечена ранее рядом исследователей. В частности, продемонстрировано (Lee, Cossins, 1988), что у карпов, акклимированных к 10°С, объем слизистой кишечника и его диаметр больше, а складки выше и шире, чем у акклимированных к 30°С. При этом установлено, что количество выростов стенки кишечника одинаково у обеих групп рыб. Сопоставление этих данных с результатами, полученными нами, позволяет заключить, что при понижении температуры увеличивается количество энтероцитов в слизистой оболочке кишечника рыб.

Таким образом, в зоне физиологических для карпа температур наблюдается относительная независимость гидролитических процессов на уровне мембранного пищеварения от влияний температуры среды обитания. Действительно, если при понижении температуры среды активность ферментов на единицу массы слизистой снижается, а при повышении — возрастает (имеется в виду реальная активность ферментов, т.е. определенная при температуре инкубации равной темпераггуре среды содержания рыб), тогда как масса последней, напротив, увеличивается при понижении температуры и уменьшается при повышении, то достигается гомеостатирующий эффект. По-видимому, в процессе эволюции подобный механизм оказался наиболее целесообразным и закрепился генетически (о чем свидетельствуют сходные результаты, полученные при разном функциональном состоянии организма), поскольку он не сопровождается сложными процессами, связанными с адаптивным синтезом молекул пищеварительных ферментов с новыми свойствами при многократных изменениях температуры среды обитания рыб.

Возможно, процесс усвоения пищи у рыб при понижении температуры воды лимитируется не на уровне мембранного гидролиза и всасывания, а на стадиях расщепления биополимеров, связанных с полостными ферментами.

Температурные характеристики трех форм кишечной мальтазы карповых рыб

Как было продемонстрировано в предыдущих экспериментах, исследование температурных характеристик мальтазы карпов, экспонированных при различных температурах, не позволяет выявить адаптивных изменений свойств фермента к изменению температуры окружающей среды при различных функциональных состояниях организма. Однако, как мы отметили выше, в целом ряде случаев наблюдаются адаптивные приспособления свойств ферментов для видов "рыб, обитающих в среде с различными температурами, при этом наблюдаемые свойства ферментов коррелируют с экологическими особенностями исследованных рыб. Мы также отмечали, что исследовались виды рыб, значительно различающиеся температурными условиями среды обитания. — *

Большая часть работ, касающихся температурных адаптации, выполнена с использованием в качестве ферментативно-активного препарата гомогенатов тканей и органов. Вместе с тем в настоящее время показано, что большинство собственно кишечных ферментов, в том числе мапьтаза, обладают амфипатической структурой и состоят из гидрофильной и гидрофобной частей (Semenza, 1981,1986; Kenny, Maroux, 1982).

Ферменты с амфипатической структурой -молекулы могут быть изолированы из мембраны с помощью неполярных детергентов (например, тритона-Х-100) с образованием детергентной формы (Д-формы) фермента. Протеолитическое расщепление связи между гидрофильной и гидрофобной частями молекулы приводит к образованию протеазной формы (П-формы), лишенной гидрофобного домена.

В связи с этим, используя современные возможности, была получена кишечная мальтаза в мембранносвязанной форме (М-форма), Д- и П-формах от различных карповых рыб, что позволило разделить эффекты мембранных компонентов и встроенного в них ферментативно-активного белка, а также роль гидрофобного участка молекулы в температурных адаптациях пищеварительных ферментов.

Было проведено два цикла экспериментов. В первом, для сравнительного изучения были выбраны украинская и ропшинская породы карпа, выращенные, соответственно, в южных (Астраханская обл.) и северных (Ленинградская обл.) прудовых хозяйствах; во втором - украинская порода карпа и белый толстолобик, выращенные в одинаковых температурных условиях (пруды Астраханской обл.), но различающиеся теплолюбивостью в естественных условиях.

Результаты, полученные при исследовании различных форм кишечной мальтазы украинской и ропшинской пород карпа, представлены в табл. 3. Можно видеть, что

температурный оптимум и Еакт различаются для мембранносвязанной мальтазы кишечника исследованных пород карпа. Значение температурного оптимума М-формы фермента обоих пород карпа на 5°С превышает эту величину для Д-формы.

Таблица 3

Температурные характеристики различных препаратов мальтазы украинской (У) и

ропшинской (Р) породы карпов

Обработ- Фракция По- % Концен- Температурный Еает,

ка рода фракции трация оптимум, кдж/моль

препара- __ белка, °С

тов мг/мл

Без обработки раствор Р 71±5 58±10 70 9Д±0,8

У 58±3 90±22 65 10,0±0,8

осадок М-форма Р 29±5 38±3 75 7,1 ±0,7 •

У 40±3 40±4 70 9,2±0,6

Трито-ном-Х-100 раствор Д-форма Р 78±3 103±16 70 9,6±1,1

У 80±6 127±10 65 8,6±0,2

Трипсином раствор П-фордо Р 74±5 86±9 -65 8,7±1,0

У 67±4 97±9 65 9,8±0,1

Важно отметить, что мембранная форма кишечной мальтазы ропшинской породы карпа, по сравнению с украинской, характеризуется меньшими значениями Еют. Различия в величинах температурного оптимума и Еа1СГ наблюдаются для М- и Д-форм мальтазы кишечника исследованных пород карпа, но отсутствуют для П-формы, лишенной гидрофобного участка.

Результаты, полученные при исследовании различных форм мальтазы кишечника карпа и белого толстолобика, представлены в табл. 4. Как видно из таблицы, температурный оптимум М-формы фермента у карпа выше, чем у белого толстолобика, тогда как для Д- и П-форм мальтазы различия в значениях этого показателя недостоверны (значение критерия Манна-Уитни - 12). Расчет значений Еаи- показывает, что эта величина для всех трех форм мальтазы карпа выше, чем для соответствующих форм фермента белого толстолобика. При этом максимальные различия наблюдаются для Еакт М-формы мальтазы, а минимальные — для П-формы.

При ультрацентрифугировании основная активность мембранносвязанных ферментов млекопитающих находится в осадке (Уголев, 1985). Так, для мальтазы кишки крыс более

80% ферментативной активности наблюдается в осадке. Активность же мембранной формы мальтазы карпа и белого толстолобика в наших экспериментах составляла от 21 до 42% от всего количества фермента в препарате. По-видимому, кишечная мальтаза карповых рыб легче солюбилизируется, или доля мембранной формы фермента меньше, чем у млекопитающих. У речных раков активность мальтазы и ряда других пищеварительных ферментов также выше в супернатанте (ццтозольная фракция), чем в осадке (Никитина, Тимофеева, 1995, 1997). Можно заключить, что ферменты теплокровных животных имеют не только более жесткую структуру (Александров, 1975, 1985), но и, в случае мембранных— ферментов, более прочно связаны с мембранами несущих их клеток, по сравнению с ферментами холоднокровных.

______Таблица 4

Температур ныехарактеристики различных препаратов мальтазы карпа (К) и белого

толстолобика (Т)

Обработ- Фракция Вид % Концен- Температурный Еакт,

ка рыб фракции трация оптимум, кдж/моль

препара- белка, °С

тов .... мг/мл

Без обработки раствор К 79±3 103±11 64,0 6,5±0Д

Т 58±3 106+12 62,2 6,5±0,8

осадок М-форма К 21±3 49±7 65,4 7,1 ±0,9

Т 42±3 •55±7 62,5 5,5±0,5

Трито-ном-Х-100 раствор Д-форма К 88±2 170±24 63,8 8,4±0,8

т 87±3 164+14 62,1 6,9±0,5

Трипсином раствор П-форма к 73+3 156±9 62,5 8,1±0,5

т 62±3 148±4 61,7 7,8±0,6

Другой аспект температурных адаптаций мембранных белков относится к влиянию состава липидного матрикса мембран на свойства ферментов. Многими исследователями было отмечено различие свойств фермент-мембранных комплексов и ферментов, в том числе и гидролитических, отделенных от мембраны (обзоры: Хочачка, Сомеро, 1988; Уголев, Кузьмина, 1993). В наших экспериментах только для мембранной формы мальтазы наблюдались меньшие значения Еакт у ропшинской породы карпов, по сравнению с украинской, что может свидетельствовать о большей эффективности гидролиза мальтозы у

карпов, выращенных в Ленинградской области и приспособленных к пониженным температурам среды обитания.

Таким образом, по мере деградации фермент-мембранных комплексов относительная активность кишечной мальтазы исследованных пород и видов карповых рыб становится близкой. Достоверные различия в величине температурного оптимума, наблюдавшиеся для М-формы фермента, уменьшаются для Д-формы и отсутствуют для П-формы. Это, по-видимому, свидетельствует о важной роли не только мембраны, но и гидрофобного домена в обеспечении адаптации молекулы фермента к температуре.

Влияние концентрации водородных ионов на активность пищеварительных ферментов

Хорошо известно, что каждый фермент характеризуется более или менее узкой областью концентрации водородных ионов, при которой он обладает наибольшей активностью. Поэтому на уровень активности ферментов рыб, наряду с температурой среды обитания, большое влияние оказывает и концентрация ионов водорода в воде — важнейший показатель физико-химических свойств воды. Пищеварительный тракт рыб в естественных условиях находится в прямом контакте с внешней средой, а его содержимое может рассматриваться как часть окружающей среды (Кузьмина, Неваленный, 1983). Следовательно, рН окружающей среды может непосредственно влиять на концентрацию водородных ионов в желудочно-кишечном тракте и, соответственно, на активность ферментов, осуществляющих мембранное пищеварение. Согласно современным представлениям, основной физиологический эффект низких значений рН воды состоит во влиянии на фермент через изменение конформации активного центра и ионизации субстрата.

Большинство работ, посвященных исследованиям влияния концентрации водородных ионов на пищеварительные ферменты рыб, выполнены в условиях in vitro (Уголев, Кузьмина, 1993), когда уровень ферментативной активности при уменьшении рН снижается в результате денатурирующего воздействия кислоты на молекулы гидролаз. Работ же касающихся исследований влияния рН на пищеварительные процессы в условиях in vivo, когда, как указывают В.В. Кузьмина с соавторами (1998), помимо попадания закисленной воды в пищеварительный тракт может наблюдаться каскад реакций организма (кислотно-щелочной дисбаланс—»закисление крови—»нарушение дыхания различных тканей—»снижение интенсивности синтеза ферментов—»подавление начальных этапов ассимиляции пищи), в литературе крайне мало.

В данной части работы представлены результаты исследования влияния разных концентраций водородных ионов как в условиях in vivo, так и в условиях in vitro на уровень активности пищеварительных ферментов рыб.

Известно, что уровень активности карбогидраз в кишечнике окуня из ацидных озер в 1,5-2,0 раза, а протеиназ - в 2-9 раз ниже, чем у рыб из нейтрального озера (Кузьмина и др., 1998). Окунь имеет желудок, в котором поддерживается кислая реакция, а так как пища в кишечник поступает из желудка, он может служить своеобразным буфером. В связи с этим, однозначно определить непосредственно или опосредованно влияет увеличение концентрации водородных ионов в среде обитания на пищеварительные ферменты, не представляется возможным. Поэтому для исследования влияния изменения рН среды содержания рыб на уровень активности карбогидраз кишечника в качестве объекта был. выбран безжелудочный вид рыб - карп.

Исследования выполнены в аквариальных условиях на сеголетках карпов. Рыбы размещались в аквариумах, в которых в течение 5 ч поддерживалась рН, равная 3, 4, 5, 6 и 7. При рН=3 рыбы через 1 ч погибали. Необходимую концентрацию водородных ионов в аквариумах поддерживали добавлением концентрированной серной кислоты.

Как видно на рисунке б, влияние повышения концентрации водородных ионов на а-амилазную, сахаразную, мальтазную и суммарную карбогидразную активность имеет сходный характер с некоторыми вариациями в минимальных и минимальных значениях. Для всех исследованных карбогидраз кишечника карпов наблюдается S-образный характер зависимости активности при увеличении концентрации водородных ионов в воде с минимумом при рН 5-6 и максимумом при рН 4. По-видимому, в наших экспериментах отражено классическое развитие стресс-реакции по Селье (1960, 1972) на увеличение концентрации водородных ионов в среде содержания карпов.

Для каждого фермента имеется оптимальное значение рН, при котором скорость реакции максимальна, при отклонении в любую сторону от этого значения скорость реакции снижается. Оптимумы рН определены для разных пищеварительных ферментов у многих видов пресноводных и морских рыб (обзор: Уголев, Кузьмина, 1993). Однако данных касающихся гидролаз дальневосточных лососей в литературе практически отсутствуют. В связи с этим, исследовали влияние концентрации водородных ионов на активность а-амилазы, мальтазы, щелочной фосфатазы и суммарной протеиназы кишечника нерки, горбуши, кеты, микижи и гольца. Для достижения условий, максимально приближенных к естественным, субстрат и ферментативно-активный препарат готовили на растворе Рингера для холоднокровных животных.

300

250

£ 200

Ъ.

150

к 100

РН

200

I 150 г

1 100 50 0

3 4 5 6 7 РН

2,5

2,0

| 1.5 "2

| 1,0 ж

0,5 0,0

3 4 5 6 7 РН

16,0 14,0 12,0 10,0 8,0 6,0 4,0 2,0 0,0

РН

Рис. 6. Влияние концентрации водородных ионов в воде на уровень активности суммарных карбогидраз (А), а-амилазы (Б), сахаразы (В) и мальтазы (Г) кишечника карпов.

£к

В большинстве случаев у исследованных нами лососевых видов рыб снижение значений рН в инкубационной среде как до 5,0, так и повышение до 10,0 вызывало снижение относительной активности мальтазы на 10-30% от максимума (рис. 7, 8). Литературные данные демонстрируют снижение относительной активности мальтазы при рН 5,0 на 40-60% у пресноводных видов рыб умеренных широт (Кузьмина, Невапенный, 1983). Обнаруженная широкая зона оптимальных значений рН для кишечной мальтазы у всех исследованных лососевых рыб, смещена в сторону щелочных значений рН.

г з

I 2,5

| г

I 1.5-

д-

—1 • — 2

10 11 12

РН

Рис. 7. Влияние разных концентраций рН на уровень активности мальтазы кишечника нерки -1, горбуши - 2.

Похожие результаты получены и при исследовании уровня активности а-амилазы слизистой оболочки кишечника у большинства исследованных лососевых рыб, у которых максимальная гидролитическая активность а-амилазы обнаруживается при рН 8,0-9,0. Сопоставляя полученные результаты с литературными данными, можно отметить, что у пресноводных костистых видов рыб, исследованных ранее, рН — оптимум а-амилазы находится в диапазоне значений рН от 6,5 до 7,5 (Уголев, Кузьмина, 1993).

Снижение рН инкубационной среды до 5,0 вызывает снижение относительной активности а-амилазы до 40-80% от максимума, в то время как у разных видов пресноводных костистых рыб, исследованных ранее, при данных значениях рН относительная активность фермента снижается гораздо значительнее - до 15-40% от

максимальной величины (Кузьмина, Неваленный, 1983; Уголев, Кузьмина, 1993). Те же различия прослеживаются и при увеличении рН среды до 10, когда у исследованных нами лососевых рыб относительная активность фермента сохраняется в пределах 50-90% от оптимальной, а у представителей бассейна р. Волга — только 40-80% от максимального значения (Уголев, Кузьмина, 1993). Для щелочной фосфатазы в большинстве случаев установлены сходные результаты. _1.

■— 1

> — 2

10 11 12

РН

Рис. 8. Влияние разных концентраций рН на уровень активности мальтазы кишечника кеты -1, гольца-2.

Исследование влияния разных концентраций водородных ионов на уровень активности суммарной протеиназы слизистой оболочки кишечника ряда видов рыб Волжского региона показал, что оптимум рН для данной группы ферментов варьирует от 7,5 до 10,0 (Ка1ас, 1978; Хаблюк, Проскуряков, 1983). В наших исследованиях было показано, что максимальная активность суммарной протеиназы кишечника большинства тихоокеанских лососей обнаружена при рН 11,0.

Таким образом, оптимальные значения реакции среды (рН) для гидролаз кишечника лососевых рыб (горбуша, кета, нерка, голец, микижа), наблюдаются при рН 8,0 (щелочная фосфатаза, а-амилаза, мальтаза) и рН 11,0 (суммарная протеиназа), при этом наблюдается

более широкая зона оптимальных значений рН, по сравнению с пресноводными костистыми рыбами умеренных широт.

Влияние состава потребляемой пищи на эффективность пищеварительных процессов

_Проблема адаптации пищеварительной системы животных к составу пищи имеет более чем вековую историю. Еще на рубеже 19-20 "веков классическими работами И.П. Павлова (1951) была показана непосредственная зависимость между составом пищи и уровнем секреции панкреатических ферментов. —

Возможность перестройки ферментного спектра в ответ на изменение состава пищи рыб долгое время дискуссировалась (обзор: Barrington, 1957). Однако, в настоящее рремя эта возможность подвержена в ряде работ для основных экологических групп рыб, стоящих на разных ступенях эволюционной лестницы. Более того, дифференциация спектра ферментов у рыб, потребляющих разные виды пищи, наблюдается уже в раннем посэмбриогенезе. Эта особенность продемонстрирована, в частности, для лососевых (Пономаре!^ 1995) и растительноядных карповых рыб (Неваленный и др., 1988, 1989; Волкова, Зайцев, 1997,1999, 2001; Абдурахманов и др., 2003).

При этом в ответ на изменение композиции пищи приспособление в одних случаях достигается за счет репрессии, в других - индукции синтеза различных ферментов (Уголев, 1978; Груздков и др., 1986). Кроме того, продемонстрировано, что активность одних гидролаз изменяется быстрее, других - медленнее, а для третьих отличается стабильностью (Уголев, 1972). Таким образом, исследование одного фермента, как правило, не дает решения вопроса об адаптированности или неадаптированности системы, в связи с этим необходимо характеризовать ферментный спектр как можно более широко.

Интерес к данной проблеме обусловлен тем, что сведения о характере адаптированности пищеварительной системы к кормам различной рецептуры, возможно, позволят контролировать эффективность их применения при индустриальном выращивании рыб. Кроме того, исследование данного вопроса позволит приблизиться к пониманию особенностей протекания пищеварительного процесса в естественных условиях.

Ферменты, осуществляющие гидролиз углеводов в кишечнике лососевых видов рыб, изучены наиболее полно на примере радужной форели (Kitamicado, Tachino, 1960; Nagayma, Saito, 1968; Plantikow, 1985; Василевский, Самойлова, 1987; Hidalgo at el., 1999). При этом большинство работ касается характеристик а-амилазы. Сравнительные исследования показали, что активность этого фермента у хищной форели ниже, чем у всеядных видов рыб,

но при поедании корма, богатого крахмалом, в содержимом кишечника она повышается в 15 раз (Spannhof, Plantikow, 1983). Исследование а-амилазы кишечника у арктического гольца продемонстрировало очень низкую активность фермента - в 400 раз ниже, чем у карпа (Reimer, 1986).

При исследовании уровня активности карбогидраз у разных видов пресноводных костистых рыб показана зависимость между активностью ферментов и принадлежностью рыб к той или иной экологической группе. Так, активность карбогидраз возрастает в ряду (типичные хищники) — (хищники-факультативные-бентофаги и планктофаги) — (типичные бентофаги и планктофаги). При этом наиболее значительные различия выявлены для а-амилазы. Величины максимальной активности фермента (у карпа) превышают минимальные (у щуки) в 70-400 раз. Диапазон изменчивости уровня активности мальтазы много ниже - в 4 раза (карась - щука) (Уголев, Кузьмина, 1993).

.....Уровень активности а-амилазы кишечника у исследованных лососевых видов рыб

также несколько различается (табл. 5). Так, максимальная ферментативная активность, отмеченная у микижи, превышает минимальную (у кеты и гольца) более чем в два раза. Среди тихоокеанских лососей активность кишечной а-амилазы максимальна у нерки, статистически недостоверно меньше у горбуши л достоверно минимальна (р<0.05), по сравнению с ними, у кеты. ___

Таблица 5

Уровень активности карбогидраз кишечника лососевых рыб при температуре 10°С

Фермент Вид лососевых рыб

горбуша кета нерка микижа голец

а-амилаза, мг х гх мин 6,85±0,58 (п=10) 4,84±0,73 (п=11) 7,57±0,50 (п=9) 10,03±0,12 (п=10) 4,62±0,36 (п=Ю)

мальтаза, мкмоль х гх мин 1,80±0,05 (п=10) 1,21 ±0,04 (п=11) 1,69±0,04 (п=9) 1,58±0,01 (п=10) 2,36±0,09 (п=10)

Как видно из таблицы 5, уровень активности кишечной мальтазы достоверно (р<0.05) ниже у кеты, по сравнению со всеми исследованными видами, а у гольца максимален и почти в два раза выше. При этом для тихоокеанских лососей наблюдается закономерность, отмеченная и при исследовании а-амилазы - более высокий уровень активности кишечной мальтазы характерен для горбуши и нерки, по сравнению с этим показателем для кеты (р<0.05). Необходимо также отметить, что для карбогидраз кишечника гольца и микижи

наблюдается противоположная зависимость - максимальному уровню активности одного фермента соответствуют минимальные значения для другого.

Известно, что исследованные нами виды тихоокеанских лососей являются планктофагами-факультативными хищниками. Так, основной пищей кеты в период летнего откорма в прибрежных водах восточного побережья Камчатки являются крылоногие моллюски, эвфаузииды и молодь рыб; горбуши - рыбы, эвфаузииды и пшерииды; нерки -эвфаузииды, гипсрииды и калянусы. При этом наиболее сходна пища горбуши и нерки (индекс пищевого сходства до 78%), что обусловлено равным потреблением эвфаузиид и гипериид (Андриевская, 1958, 1966). Аналогичные результаты были продемонстрированы и при исследовании питания тихоокеанских лососей в море в последние годы. Так, В.В. Максименковым с соавторами (2002) также было показано, что максимальное пищевое сходство наблюдается у горбуши и нерки. Данное обстоятельство хорошо объясняет отсутствие различий уровня активности исследованных карбогидраз в кишечнике этих видов тихоокеанских лососей.

В питании кеты обычно основное"значение имеют молодь рыб, крылоногие моллюски и кишечнополостные, которые практически не встречаются в пище нерки и горбуши (Максименков и др., 2002). Поскольку углеводов в пище кеты значительно меньше, чем в пище двух других видов, это и объясняет минимальный уровень активности как мальтазы, так и а-амилазы в её кишечнике среди исследованных видов тихоокеанских лососей. Действительно, известно, что амилолитическая активность пищеварительного тракта у различных видов рыб уменьшается по мере увеличения белковых и уменьшения углеводных компонентов в характерной для вида пище (Уголев, Кузьмина, 1993). Более того, имеются многочисленные сведения и об адаптации рыб на уровне активности пищеварительных ферментов к диете (Кузьмина, 1981; Зайцев и др., 1990; Неваленный и др., 1997; Абдурахманов и др., 2003).

Жилую форму микижи (Кохменко, 1972а; Савваитова и др., 1973) и проходного гольца в речной период жизни (Кохменко, 19726; Тиллер, Введенская, 1988) характеризуют как хищников-факультативных бентофагов. Также известно, что основу питания гольца в период морского нагула составляют пшерииды и рыба (Grainger, 1953; Андриевская, 1957). Выше отмечено, что уровень активности а-амилазы в кишечнике микижи максимален. Данный факт, на первый взгляд, противоречит хорошо известным из литературы сведениям о низкой активности этого фермента у хищных рыб (Пономарев, 1992; Уголев, Кузьмина, 1993). Однако необходимо отметить, что среди исследованных нами видов лососевых рыб только микижа в период сбора материала активно питалась. Кета, горбуша, нерка и голец

экзогенно не питались, так как находились на стадии нерестовой миграции. Возможно, в период нагула активность а-амилазы в кишечнике у этих видов возрастает в результате секреции поджелудочной железы и может быть даже выше, чем у микижи. Так, при сравнении суточной динамики суммарной карбогидразной активности в слизистой кишечника у голодавших и питавшихся карпов продемонстрировано, что у рыб, получавших корм, ферментативная активность р два раза выше в любое время суток (Неваленный и др., 1991).

По-видимому, этим же можно объяснить повышенную активность мальтазы из кишечника гольца. Общеизвестно^ _*jto у тихоокеанских лососей в период нерестовой миграции происходит угасание пищеварительной функции и после нереста происходит гибель, в то время как голец после нереста начинает активно питаться (Тиллер, Введенская, 1988) и у него восстанавливается нормальное пищеварение. Повышенная активность кишечной мальтазы у этого вида'в период эндогенного питания может свидетельствовать о продолжении синтеза этого фермента и его накоплении в энтероцитах.

В целом можно заключить, что для рыб различных таксономических групп спектр пищеварительных ферментов кишечника и уровень их активности определяется характером потребляемой пищи в естественных условиях. ____

В реально протекающем гидролитическом процессе одновременно перевариваются белки, жиры и углеводы, которые определенным образом влияют друг на друга, что было достаточно подробно исследовано на высших позвоночных животных (обзоры: Уголев, 1972; Кушак, 1983). Установлены эффекты взаимодействия на уровне субстратов мембранного пищеварения, кроме того, продемонстрирована возможность взаимодействия молекул интактных биополимеров. Например, некоторые белки тормозят расщепление жиров (Kronal et al., 1968), но стимулируют переваривание лактозы (Блюгер и др., 1978), которая, в свою очередь, уменьшает усвоение белка и жира (Leichter, Tolensky, 1975). Имеются отдельные сведения и о взаимодействии пищевых веществ в процессе гидролиза в кишечнике рыб (Хаблкж и др., 1985; Hofer, Sturmbauer, 1985; Кузьмина, 1987; Gasser, Kirshner, 1987; Уголев, Кузьмина, 1993; Неваленный, 1996; Бедняков, 2004).

При исследовании полисубстратного пищеварения, как правило, пользуются простейшей моделью одновременного переваривания двух различных пищевых веществ. Для того чтобы усложнить модель, нами были проанализированы не только бисубстратные, но и трисубстратные взаимодействия. Исследованы осетровые, лососевые, карповые и камбаловые виды рыб. Полученные результаты оказались очень близки, поэтому приводим данные касающиеся наиболее подробно изученного семейства — лососевых.

Данные, касающиеся активности щелочной фосфатазы, полученные при инкубации ферментативно-активных препаратов слизистой оболочки кишечника исследованных лососевых рыб в моно- (контроль), ди- и трисубстратной среде, представлены на рисунке 9. Как видно из рисунка, практически у всех видов в присутствии казеина происходит повышение уровня активности щелочной фосфатазы, по сравнению с контролем (на 80% - у нерки, на 73% - у горбуши, на 36% - у кеты и на 9% - у гольца). Исключением является микижа, у которой отмечен обратный эффект - снижение уровня активности фермента на

10%. __

__ При добавлении мальтозы происходит снижение уровня активности энзима у нерки, горбуши и кеты, в то время как у микижи и гольца отмечен противоположный процесс. _ Совместное присутствие этих биополимеров приводит к возрастанию активности щелочной фосфатазы слизистой кишечника всех исследуемых видов лососевых рыб.

Следует отметить, что наибольшее увеличение ферментативной активности в трисубстратной среде по сравнению с дисубстратной, когда отмечалось действие мальтозы, зафиксировано у горбуши, у которой произошел рост активности фермента на 89%, тогда как у нерки уровень активности увеличился на 80%, у кеты - на 38%, у микижи - на 19%, а минимальное увеличение отмечено у гольца-на 16%.

В присутствии казеина максимальный рост активности фермента вновь зарегистрирован у горбуши (на 71% от уровня активности щелочной фосфатазы при совместном действии биополимеров), а минимальный - у кеты (на 30%); у остальных видов наблюдалось следующее изменение в уровне активности фермента: у нерки произошло повышение ферментативной активности на 46%, у гольца - на 39%, а у микижи - на 33%. При сравнении изменения уровня активности щелочной фосфатазы слизистой оболочки кишечника у лососевых рыб в средах, где казеин и мальтоза действуют раздельно, отмечено, что у нерки, горбуши и кеты произошло снижение уровня активности фермента при действии мальтозы на 34%, 18% и 8% соответственно, в то время как у гольца и микижи отмечен рост активности щелочной фосфатазы на 23% и 14%, соответственно.

Данные, полученные при исследовании суммарной протеиназы представителей лососевых видов рыб, показаны на рисунке 10. Можно отметить, что у кеты и гольца происходит заметное снижение скорости ферментативного расщепления белка при добавлении мальтозы, по сравнению с контрольным значением, в то время как у нерки оно весьма незначительно, а у горбуши не наблюдается. У микижи кеты и гольца отмечен рост активности этой группы ферментов в присутствии n-нитрофенилфосфата Na, тогда как у остальных видов происходит снижение уровня активности суммарных протеиназ. В

трисубстратной среде, как и при исследовании щелочной фосфатазы, наблюдается значительное повышение уровня активности суммарной протеиназы у всех исследованных лососевых видов рыб.

3,5 -3 -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 -0

□ - Контроль

Ш-1

Ш-2

1-3

Рис. 9. Уровень активности щелочной фосфатазы слизистой кишечника (слева направо) нерки, горбуши, кеты, микижи и гольца. (По горизонтали: К — контроль, 1 — п-нитрофенилфосфат Ыа+казеин 1%, 2 - п-нитрофенилфосфат Ка+мальтоза 2%, 3 - п-нитрофенилфосфат Ка+казеин 1%+мальтоза 2%. По вертикали: скорость реакции (мкмоль/мин*г).

Кроме того, отмечены следующие различия в изменении уровня активности суммарной протеиназы. Максимальное увеличение скорости гидролиза казеина, по сравнению с действием мальтозы в отдельности и при совместном влиянии мальтозы и п-нитрофенилфосфата Ыа, зафиксировано у микижи, у которой произошел рост ферментативной активности на 107%, у кеты отмечен несколько сниженный уровень активности суммарной протеиназы - на 61%, у нерки - на 48%, горбуши - на 36%, а у гольца наблюдается самое низкое значение -19%.

Отмечены следующие изменения в уровне активности исследуемой группы ферментов при сопоставлении действия трисубстратной среды и п-нитрофенилфосфата Иа в отдельности: у нерки скорость гидролиза казеина при совместном действии мальтозы и п-

нитрофенилфосфата Иа на 51% выше, чем при действии п-нитрофенилфосфата N8 отдельно, у микижи - на 58%, у горбуши - на 46%, у гольца - на 42%, у кеты — на 31%. Продемонстрировано, что у нерки, горбуши и гольца происходит снижение уровня активности суммарной протеиназы в присутствии п-нитрофенилфосфата N8, по сравнению с действием мальтозы на 3%, 10% и 23%, соответственно. Однако у кеты и микижи отмечен противоположный эффекту наблюдается рост активности ферментов на 3% и 49%, соответственно.

□-Контроль Ш-1 ЕЭ-2 Ш-З

Рис. 10. Уровень активности суммарной протеиназы слизистой кишечника (слева направо) нерки, горбуши, кеты, микижи и гольца. По горизонтали: К - контроль, 1 - казеин 1% + мальтоза 2%, 2 - казеин 1%+п-нитрофенилфосфат Ыа, 3 - казеин 1%+п-нитрофенилфосфат Ка+мальтоза 2%. По вертикали: скорость реакции (мкмоль/мин*г).

Результаты влияния различных пищевых веществ на уровень активности мальтазы показаны на рисунке 11. Можно видеть, что у всех видов произошел рост уровня активности мальтазы при добавлении казеина относительно контроля. Так, у нерки уровень ферментативной активности мальтазы увеличился на 8%, у горбуши - на 10%, у кеты и микижи на — 15%, у гольца — на 24%. п-Нитрофенилфосфат Иа вызвал обратное воздействие

на уровень активности мальтазы практически у всех видов, за исключением микижи, у которой произошло увеличение ферментативной активности на 4%. Так, наблюдается снижение активности этого фермента у нерки на 14%, у горбуши - на 20%, у кеты - на 21% и у гольца - на 33%.

4,5-, 4

3,5 -3 -2,5 2 -1,5 -1 -0,5 -0

О- Контроль

11-1

Ш-2

1-3

Рис. 11. Уровень активности мальтазы слизистой кишечника (слева направо) нерки, горбуши, кеты, микижи и гольца. По горизонтали: К - контроль, 1 - мальтоза 2%+казеин 1%, 2 -мальтоза 2%+п-нитрофенилфосфат N8, 3 — мальтоза 2%+казеин 1%+п-нитрофенилфосфат Иа. По вертикали: скорость реакции (мкмоль/мин*г).

При совокупном действии биополимеров уровень ферментативной активности мальтазы повышается, но очень незначительно, по сравнению с уровнем активности в данной среде щелочной фосфатазы и суммарной протеиназы. Особенно невелико ее изменение в трисубстратной среде относительно дисубстратной, куда был добавлен казеин: у нерки и микижи уровень активности фермента повысился на 6%, а у горбуши, гольца и кеты - лишь на 2%. Практически у всех видов заметное повышение скорости гидролиза мальтозы

можно отметить при совместном действии двух субстратов, по сравнению с отдельным присутствием в среде п-нитрофенилфосфата Иа, которая у нерки увеличилась на 20%, у кеты - на 23%, у горбуши - на 32%, у гольца — на 35% и лишь у микижи эта величина увеличилась незначительно - на 2%.

При раздельном действии казеина и п-нитрофенилфосфата N3 отмечены следующие изменения ферментативной активности. У нерки, горбуши, гольца и кеты наблюдается снижение активности мальтазы в присутствии второго субстрата относительно первого на 14%, 20%, 33% и 21%, соответственно, а у микижи, напротив, отмечается повышение активности фермента в среде, где присутствует п-нитрофенилфосфат Иа, в отличие от отдельного воздействия казеина, — на 4%.

Сопоставление влияния модификаторов различной^ природы на одноименные ферменты у рыб разных видов позволило выявить неоднозначность их эффектов. Так, при исследовании активности щелочной фосфатазы сибирского, осетра наблюдается тенденция к снижению уровня активности фермента в присутствии казеина, в то время как у нерки, горбуши, кеты и гольца происходит увеличение ферментативной активности, а у микижи результаты идентичны результатам, продемонстрированным для сибирского осетра.

Приведенные выше данные свидетельствуют, что во всех случаях при исследовании карбогидраз, протеаз и щелочной фосфатазы слизистой оболочки кишечника рыб в присутствии трех субстратов происходит активирующий эффект. В то же время одно и то же вещество может служить активатором для одного ферментативного процесса и ингибитором для другого (например, уровень активности щелочной фосфатазы в присутствии казеина у нерки заметно увеличивается, а у микижи - снижается).

Важно отметить, что в наших экспериментах во всех случаях трисубстратных взаимодействий при исследовании слизистой кишечника рыб, стоящих на разных ступенях эволюционной лестницы, обитающих как в пресной, так и в морской среде, а также у проходных видов рыб обнаружен только активирующий эффект. Необходимо еще раз подчеркнуть, что нами исследовались как общая протеазная и карбогидразная активности слизистой кишечника рыб, так и отдельные мембранные ферменты мальтаза и щелочная фосфатаза.

Таким образом, состав потребляемой пищи непосредственным образом влияет на эффективность мембранного пищеварения в кишечнике рыб разных таксономических и экологических групп посредством либо индукции, либо редукции синтеза соответствующих ферментов, в зависимости от композиции диеты, а также за счет модификаторного эффекта компонентов пищевой смеси на уже имеющийся в кишечнике пул гидролаз.

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные результаты свидетельствуют о том, что индивидуальные температурные адаптации для мембранносвязанных пищеварительных ферментов у карпа отсутствуют. При этом не вызывают сомнения результаты многочисленных исследований (Егорова и др., 1974; Гельман, 1976; Кузьмина, 1985; Уголев и др., 1990; Кузьмина и др., 1999;), а также полученные нами данные о том, что ферментативно-активные белки рыб, различающихся температурными условиями существования, обладают значительной адаптированностью к условиям жизнедеятельности. Следовательно, имеют!место существенные различия в стратегии температурных адаптаций гидролитических систем в процессе эволюции и в течение индивидуальной жизни особи. В первом случае, адаптация к температурным условиям среды обитания "достигается за счет изменения свойств и количества макромолекул, функционирующих в энтероцитах, во втором - за счет варьирования численности популяции кишечных клеток на фоне неизменных характеристик фермент-мембранных комплексов.

Следует отметить, что весьма значительные различия температурных характеристик кишечной мальтазы карповых. рыб, которые наблюдались в наших экспериментах для комплекса фермент-мембрана, резко уменьшаются или исчезают при попытках охарактеризовать свойства фермента, отделенного от мембраны в детергентной форме, а также в протеазной, т.е. лишенной гидрофобного участка. Это позволяет сделать чрезвычайно важный вывод о том, что физиологические особенности скорее обусловлены пространственными и временными сочетаниями имеющихся функциональных белков, а не образованием новых молекулярных структур. Возможно, при естественном отборе сохраняются оригинальные сочетания стандартных функциональных блоков, а не образуются новые. Полученные данные являются чрезвычайно убедительным примером, подтверждающим развивавшуюся в последние годы жизни акад. A.M. Уголевым (1979,1982, 1983, 1985, 1987, 1990) концепцию о блоковом строении самых различных биологических структур и функций, предполагающей, что естественный отбор приводит к появлению новых сочетаний стандартных функциональных блоков, а не к образованию новых молекулярных структур.

Переваривание пищи является типичным ферментативным процессом. В связи с этим, данные об изменении хода гидролиза при одновременном присутствии в инкубационной среде нескольких субстратов, по сути дела, характеризуют изменение активности кишечных ферментов или их регуляцию под влиянием модификаторов. Следовательно, взаимодействие

пищевых веществ в процессе мембранного пищеварения является регуляцией на уровне активности пищеварительных ферментов и может быть описано с помощью существующих в пастоящее время теорий. Показано, что регуляция ферментативной активности осуществляется на двух уровнях. Первый, применительно к собственнокишечным ферментам, связан с процессом синтеза ферментативного белка и транслокацией его в мембрану энтероцита; регуляция второго типа происходит на основе уже существующих молекул белка и сопряжена с изменением их структуры (обзоры: Хочачка, Сомеро, 1977, 1988; Кушак, 1983; Адаптационнно-компенсаторные процессы . \ 1991 и др.). Естественно, что в процессе полисубстратного пищеварения регуляция активности пищеварительных процессов не связана с синтезом белка, на который необходимо определенное время (минуты, часы), а осуществляется практически мгновенно, иногда в доли секунды, за счет, изменения активности ферментов в результате их связывания с тормозящими или стимулирующими модификаторами.

Таким образом, установленные нами у рыб процессы ди- и трисубстратных взаимодействий "имеют важное значение для понимания механизма реализации пищеварительной функции у рыб. Они обеспечивают тесное сопряжение работы различных ферментативных цепей в кишечнике рыб, чем достигается определенный автоматизм в работе пищеварительной системы и настройка ее на соответствующий вид пищи. Следовательно, путем регуляции на уровне активности пищеварительных ферментов осуществляется определенная последовательность в обработке пищи и, по-видимому, интеграция пищеварительных и транспортных процессов.

ВЫВОДЫ

1. Исследованы ферментные системы, обеспечивающие процессы мембранного пищеварения у рыб, обитающих в холодных водах и у видов, обитающих в южных водоемах. Показано, что температурные характеристики (относительная активность при низких и высоких температурах инкубации, энергия активации) пищеварительных ферментов у исследованных групп видов рыб свидетельствуют об их значительной адаптированное™ к условиям функционирования, что обеспечивает оптимальное осуществление пищеварительной функции в естественных условиях.

2. Изменение температуры акклимации не вызывает адаптивных изменений уровня актавноста мембранных гидролаз, что подтверждается отсутствием, в большинстве случаев, статистически значимых различий в активности при стандартной температуре (25°С)

мембранносвязанных ферментов у карпов, содержавшихся при 18°С, а затем акклимировашгых в течение одной-двух недель при температурах 8; 12; 28°С. Содержание карпов при различных температурах не приводит к изменению исследованных свойств (температурный оптимум, относительная активность при низких и высоких температурах инкубации, энергия активации) мембранносвязанной мальтазы кишечника рыб.

3. Температура среды содержания оказывает значительное влияние, на морфологические характеристики кишечника карпов. При акклимации рыб к пониженной температуре относительная масса кишечника увеличиваетсяг-что связано с гипертрофией слизистой оболочки. Так, относительная масса слизистой оболочки кишечника у~.рыб, акклимированных в течение двух недель к температуре среды 12°С, для питавшихся карпов в 2,6 раза, а для голодавших в 1,9 раза выше, чем у рыб, акклимированных к температуре 28?С. При изменении температуры среды содержания рыб относительная масса мышечной оболочки изменяется незначительно.

4. Сравнение морфологических и функциональных характеристик кишечника карпа, акклимированного к различным температурам, позволяет заключить, что гомеостаз мембранного пищеварения при изменении температуры воды обеспечивается, в частности, за счет регуляции массы слизистой оболочки кишечника рыб, тогда как активность и свойства кишечных ферментов не изменяются. По-видимому, этот механизм особенно важен для сезонных адаптаций пищеварительной системы рыб.

5. Сопоставление значений температурных оптимумов и энергии активации мембранносвязанной мальтазы кишечника карповых рыб позволило выявить видовые (карп, белый толстолобик) и внутривидовые (украинскач и ропшинская породы карпа) различия в свойствах фермент-мембранного комплекса, направленность которых свидетельствует о наличии температурных адаптаций на уровне ферментов мембранного пищеварения. Установлено, что при разрушении фермент-мембранного комплекса детергентами и протеазами видовые и внутривидовые различия в свойствах мальтазы исследованных карповых рыб исчезают. Поскольку температурные адаптации мембранносвязанных ферментов кишечника карповых рыб осуществляется не путем образования молекул фермента с модифицированными свойствами, а на уровне комплекса фермент-мембрана -они являются фенотипическими.

имеют не только более жесткую структуру, но и, в случае мембранных ферментов, более прочно связаны с мембранами несущих их клеток, по сравнению с ферментами холоднокровных.

7. Адаптация пищеварительной функции кишечника рыб к температуре среды достигается путем взаимодействия молекул ферментов и компонентов мембраны энтероцитов, а также за счет изменения массы слизистой оболочки кишечника на фоне неизменных характеристик фермент-мембранных комплексов. Полученные данные являются чрезвычайно убедительным примером, подтверждающим концепцию о блоковом строении самых различных биологических структур и функций, предполагающей, что естественный отбор приводит к появлению новых сочетаний стандартных функциональных блоков, а не к образованию новых молекулярных структур. __

8. В экспериментах по влиянию различных концентраций водородных ионов в среде содержания карпов на активность карбогидраз. кишечника показано, что наблюдается S-образный характер зависимости активности а-амилазы, мальтазы, сахаразы и суммарных карбогидраз при увеличении концентрации водородных ионов в воде с минимумом при рН 5-6 и максимумом при рН 4.

Оптимальные значения реакции среды для гидролаз кишечника лососевых рыб (горбуша, кета, нерка, голец, микижа), наблюдаются при рН 8,0 (щелочная фосфатаза, а-амилаза, мальтаза) и рН 11,0 (суммарная протеиназа). Сопоставление рН-функций, полученных для пищеварительных ферментов лососевых рыб, обитающих в водоемах Камчатки, позволяет отметить широкую зону оптимальных значений рН, по сравнению с пресноводными костистыми рыбами умеренных широт.

9. У рыб, стоящих на разных ступенях эволюционной лестницы, но близких по характеру питания, наблюдается сходное соотношение состава и активности мембранных гидролаз, а у рыб таксономически близких, различающихся по экологии, напротив, отмечаются значительные различия.

10. При исследовании ферментативно активных препаратов слизистой кишечника осетровых, лососевых, карповых и камбаловых выявлены процессы взаимодействия субстратов ферментативных реакций в условиях in vitro для всех исследованных групп пищевых веществ. Во всех случаях трисубстратных взаимодействий при исследовании слизистой кишечника рыб, стоящих на разных ступенях эволюционной лестницы, обитающих как в пресной, так и в морской среде, а также у проходных видов рыб обнаружен только активирующий эффект.

Список основных работ опубликованных по теме диссертации

1. Неваленный, А. Н. Влияние концентрации водородных ионов в воде на активность некоторых карбогидраз кишечника карпа [Текст] / А. Н. Неваленный, С. Г. Коростелев, М.И. Карпгок И 1-ая Всес. конф. по рыбохоз. токсикол.: тез. докл. Ч. 2. - Рига, 19S9. - С. S1-52.

2. Коростелев, С. Г. Температурная адаптация некоторых кишечных карбогидраз у рыб [Текст] / С. Г. Коростелев // Механизмы регуляции физиологических функций: тез. докл. -Ленинград, 1988. - С_53. —

3. Сухова, З.А. Характеристика активности некоторых пищеварительных ферментов у молоди ленского осетра, выращиваемой на различных рационах [Текст] / З.А. Сухова, А.Н. Неваленный, A.A. Попова, С.Г. Коростелев, И.Б.Жарков // 7-ая Всес. конф. /Экологическая физиология и биохимия рыб: тез. докл. Т.2. - Ярославль, 1989. - С. 165.

4. Коростелев, С.Г. Исследование кишечной мальтазы карпа при разных температурах акклимации [Текст] / С.Г. Коростелев, В.В. Егорова // 7-ая Всес. конф. / Экологическая физиология и биохимия рыб: тез. докл. Т.1. - Ярославль, 1989. - С. 215-216.

5. Неваленный, А.Н. Действие различных рационов пищи на активность некоторых ферментов у молоди ленского осетра [Текст] / А.Н. Неваленный, С.Г. Коростелев, З.А. Сухова // Всес. науч. конф. / Оценка состояния, охрана и рациональное использование биологических ресурсов водных экосистем в условиях антропогенного воздействия: тез. докл. - Ростов-на-Дону, 1990. - С. 112-114.

6. Зайцев, В.Ф. Влияние комбикормов на активность карбогидраз кишечника карпа [Текст] / В.Ф. Зайцев, А.Н. Неваленный, С.Г. Коростелев, С.Н. Егоров // Водные биоресурсы и экология гидробионтов: сб. науч. тр. / Всесоюзн. науч. иссл. ин-т прудового рыбного хоз-ва. Вып. 59. - Москва, 1990.-С. И7-И8.-Библиогр.: с. 118.

7. Коростелев, С.Г. О температурных адаптациях кишечной мальтазы карповых рыб [Текст] / С.Г. Коростелев, В.В. Егорова, А.М. Уголев // Ж. эволюц. биохимии и физиол. - 1990. - Т. 26. - № 6. - С. 842-843. - Библиогр.: с. 843. - ISSN 0044-4529.

8. Коростелев, С.Г. Температурные адаптации некоторых ферментов кишечных микроворсинок карповых рыб [Текст] / С.Г. Коростелев, В.В. Егорова // XV Всес. конф. / Физиология пищеварения и всасывания: тез. докл. - Краснодар, 1990. - С. 136.

9. Коростелев, С.Г. Температурные зависимости и энергия активации мальтазы слизистой кишечника карпа, экспонированного при различных температурах среды [Текст] / С.Г. Коростелев П Краткие р-ты научной деятельности ин-та за 1989-1990 гг. / Астраханский техн. ин-т рыбной пром. и хоз-ва, Астрахань. - Москва, 1990. - С. 84-85.

10. Неваленный, А.Н. Влияние температуры на пищеварителыю-транспортную функцию кишечника рыб [Текст] / А.Н. Неваленный, С.Г. Коростелев, В.Ф. Зайцев // IV Всес. совещ. по рыбохозяйственному использованию теплых вод, Курчатов. - Москва, 1990. - С. 155-156.

11. Неваленный, А.Н. Динамика уровня активности карбогидраз в кишечнике белого толстолобика при изменении температуры [Текст] / А.Н. Неваленный, В.Ф. Зайцев, С.Г. Коростелев // Вопросы экологии гидробионтов: сб. науч. тр. / Всесоюзн. науч. иссл. ин-т прудового рыбного хоз-ва. Вып. 64. - Москва, 1991. - С. 69-70. - Библиогр.: с. 70.

12. Nevalyonny, A.N. Effect of water pH different valves on_activity of some digestive enzymes in carp (Cyprinus Carpió L.) [Text] / A.N. Nevalyonny, V.F. Zaitsev, S.N. Yegorov, S.G.-Korostelyov // Acta Ichthyologica et piscatoria. - 1991. - Vol. 21. - f. 1. - Szczecin. P. 59-63.

13. Коростелев, С.Г. Температурные адаптации кишечной мальтазы ропшинской и украинской пород карпа [Текст] / С.Г. Коростелев // VIII Науч. конф. по экол. физиол. и биохимии рыб: тез. докл. Т. 1. - Петрозаводск, 1992. - С. 162-163.

14. Коростелев, С.Г. Влияние температуры на весовые и линейные характеристики кишечника карпа [Текст] / С.Г. Коростелев, А.Н. Неваленный, В.Ф. Зайцев, С.Н. Егоров II Водные биоресурсы, воспроизводство и экология гидробионтов: сб. науч. тр. / Всесоюзн. науч. иссл. ин-т прудового рыбного хоз-ва. Вып. 66. - Москва, 1992. - С. 18-20. - Библиогр.: с. 20. —

15. Неваленный, А.Н. Активность некоторых пищеварительных ферментов рыб ильменя Горчичный [Текст] / А.Н. Неваленный, С.Г. Коростелев, С.Н. Егоров // Вестник Астраханского техн. ин-та рыбной пром. и хоз-ва: сб. науч. тр. Т. 1. - Москва, 1993. - С. 9193. - Библиогр.: с. 92-93. - ISBN 85382-114-8.

16. Неваленный, А.Н. Исследование температурных характеристик кишечной а-амилазы иссык-кульского чебачка [Текст] / А.Н. Неваленный, С.Г. Коростелев, С.Н. Егоров // Вестник Астраханского госуд. техн. ун-та: сб. науч. тр. Т. 2. - Москва, 1994. - С. 58-59. - Библиогр.: с. 59.-ISBN 85382-114-8.

17. Егорова, В.И. Активность гидролаз в кишечнике белуги в зависимости от типа использованного корма [Текст] / В.И. Егорова, С.Г. Коростелев, JI.B. Витвицкая // Межд. конф. / Каспий - настоящее и будущее: тез. докл. - Астрахань, 1995. - С. 174-175.

18. Неваленный, А.Н. Взаимодействия пищевых веществ в процессе пищеварения у рыб на примере карпа Cyprinus carpió [Текст] / А.Н. Неваленный, С.Н. Егоров, С.Г. Коростелев // Ж. эволюц. биохимии и физиол. - 1996. - Т. 32. - №2. - С. 156-159. - Библиогр.: с. 159. - ISSN 0044-4529.

19. Неваленный, А.Н. Нутритивные адаптации процесса пищеварения у осетровых рыб [Текст] / А.Н. Неваленный, С.Г. Коростелев, JI.B. Витвицкая, В.И. Егорова // Докл. акад. наук. - 1997. - Т. 352. - № 6. - С. 837-839. - Библиогр.: с. 159. - ISSN 0869-5652.

20. Неваленный, А.Н. Исследование адаптации пищеварительной функции у рыб [Текст] / А.Н. Неваленный, С.Н. Егоров, С.Г. Коростелев // Первый конгресс ихтиологов России, Астрахань: тез. докл. - Москва, 1997. - С. 334-335. ISBN 5-85382-172-5. —.

21. Nevalyonny, A.N. Acipenser baeri (Brand) polysubstract digestion in vivo and in vitro [Text] / A.N. Nevalyonny, S.G. Korostelyov // Booklet of abstracts: 3 International symposium on sturgeon. -Piacenza, Italy,1997.-S. 266-267. "__

22. Неваленный, A.H. Влияние температуры акклимации на температурныехарактеристики мальтазы слизистой кишечника карповых рыб [Текст] / А.Н. Неваленный, С.Гт Коростелев // Вестник Астраханского госуд. техн. ун-та: сб. науч. тр. / Экология. - Астрахань, 1994. - С. 92^-95. - Библиогр.: с. 95. - ISBN 85382-114-8.

23. Nevalyonny, A.N. In vivo and in vitro polysubstrate digestion in Acipenser baeri (Brandt) [Text] / A.N. Nevalyonny, S.G, Korostelyov // Journal of Applied Ichthyology Blackvell Wissensclañs. - Verlag, Berlin, 1999. - Vol. 15. - № 4-5. - P. 338-339.

24. Неваленный, A.H. Влияние модификаторов на процесс мембранного пищеварения у сибирского осетра Acipenser baeri [Текст] / А.Н. Неваленный, С.Г. Коростелев^//Ж. эволюц. биохимии и физиол. - 2002. - Т. 3 8. - №2. - С. 185-187. - Библиогр. : с. 187. - ISSN 0044-4529.

25. Абдурахманов, Г.М. Особенности мембранного пищеварения карповых видов рыб [Текст] / Г.М. Абдурахманов, И.В. Волкова, С.Н. Егоров, В.И. Егорова, В.Ф, Зайцев, С.Г. Коростелев ; отв. ред. Г.М. Абдурахманов. - М. : Наука, 2003. - 301 с. : ил. ; 10 см. -Библиогр.: с. 272-299. - 500 экз. - ISBN 5-94587-035-8.

26. Коростелев, С.Г. Характеристика пищеварительных ферментов кишечника у некоторых камбаловых видов рыб, обитающих в дальневосточных морях [Текст] / С.Г. Коростелев, А.Н. Неваленный, O.E. Левченко // Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов: мат. межд. конф. - Петрозаводск, 2004. - С. 70-71. - ISBN 5-9274-0145-7.

27. Левченко, O.E. Влияние концентрации водородных ионов на активность некоторых пищеварительных ферментов лососевых видов рыб Oncorynchus gorbuscha и Salvelinus malma [Текст] / O.E. Левченко, А.Н. Неваленный, С.Г. Коростелев // Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов: мат. межд. конф. - Петрозаводск, 2004. - С. 81. -ISBN 5-9274-0145-7.

28. Levchenko, O.E. Activity Level and Temperature Correlations between Intestine a-Amilase and Maltase of Mass Species of Pacific Salmon, Reproducing in the Rivers of Eastern Kamchatka

[TextI / A.N. Nevalennyy, O H. t.evclienko, S G. Korostelcv II Salmon and Marine l-cusvslcms in Ihc Bering Sea and Adjacent Waters / NI'AI'C International Workshop "ÜASIS-2001' I'rugram abstracts. - Sapporo, I loUaido, Japan - 200J. - l>. 60. - ISSN 1029-5917

29 Левченко, O.K. Влияние модификаторов на процесс мембранного пищеварения на примере рыб семейства лососевые (Satmonidae) [Текст] / О Н Левченко, А.II HeBa.ieinii.iii, С.Г. Успехи совр ^^гвозиания, 2004. - №12. - С. Н9. - ISSN 1681-7494.

30 Левченк-о7~О.Е. Влияние температуры инкубации на уровень акшвности некоторых пищеварительных ферментов лососевых видов рыб [Текст] / O.E. Левченко, All. Невалгнный, С.Г. Коростелев // Естественные науки: жури, фунда.ч. и прикладных исследований, Астрахань: сб. науч. тр. - Астрахань, 2004. - №3 (9) - С 8-12. - Библногр.: с. 12

\/5\. Коростелев, С.Г. Влияние температуры на пищеварителыю-транспортную функцию кишечника карповых рыб [Текст] / С.Г. Коростелев, А.II. Неваленный // Вопр. ихтиологии, 2005. - Т. 45. - № 2. - С. 225-235. - Библиогр.: с. 234-235 - ISSN 0042-8752. yj 32. Коростелев, С.Г. Уровень активности и температурные зависимости а-амилазы и мальтазы кишечника рыб семейства лососевых (Satmonidae), воспроизводящихся в реках Камчатки [Текст] / С Г. Коростелев, АН. Неваленный, O.E. Левченко // Изв. ТИНГО, 2005. -Т. 140 -С. 228-239. -Библиогр.: с. 238-239. -ISSN 1606-9913.

33. Коростелев, С.Г. Характеристика пищеварительных ферментов кишечника белокорого палтуса Hippogtossus stenolepis Schmidt. 1904 н звездчатой камбалы Platichthys siellatus

\f (Pallas. ¡788) [Текст] / С.Г. Коростелев, A.II. Неваленный, O.E. Левченко // Биология моря, 2005. -Т.^^ГйЗ. -С. 221-22<?^^^1лиогр.: с. 224. - ISSN 0134-3475.

34. Коростелев, С.Г. Температурные адаптации кншечной мальтазы у карповых рыб [Текст] / С.Г. Коростелев // Популяционная биология, генетика и систематика гидробионтов: сб. научн. тр. ; под. ред. HB. Варнавской. - Петропавловск-Камчатский. 2005. - С. 350-361. - Библиогр.: с. 360-361. ISBN 5-902210-17-8.

^J 35. Левченко, O.E. Влияние температуры инкубации на уровень активности пищеварительных ферментов кеты (Oncorhynchus keta) [Текст] / O.E. Левченко, A.II. Неваленный, С.Г. Коростелев // Вестник Российского университета дружбы народов: Научный журнал. Сери» экология и безопастность жизнедеятельности, 2005. - №2(12) - С. 89-92. -Библиогр.: с. 92

Коростелёв Сергей Георгиевич

Особенности мембранного пищеварения у рыб различных таксономических и эв(>гических гру^Р

Автореферат

Подписано в печать 16 декабря 2005 г. Объем 22 стр. А5

Заказ от 26 декабря 2005 г. Тираж ] )0.

Издательство КамчатНИРО,

683602, Петропавловск-Камчатский, ул. Набережная, 18

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Коростелев, Сергей Георгиевич

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.И

1.1. Современные концепции пищеварения.

1.1.1. Полостное (внеклеточное или дистантное пищеварение).

1.1.2. Внутриклеточное пищеварение.

1.1.3. Мембранное пищеварение.

1.1.4. Аутолитическое пищеварение.

1.1.5. Симбионтное пищеварение.

1.1.6. Транспорт нутриентов.

1.2. Структурно-функциональная характеристика пищеварительной системы рыб.

1.2.1. Морфологические особенности пищеварительного тракта рыб.

1.2.2. Структуры слизистой поверхности кишечника рыб.

1.2.3. Пищеварительные процессы.

1.2.4. Влияние характера питания на активность пищеварительных ферментов у рыб.

1.3. Адаптация пищеварительной системы рыб к температуре среды обитания.

1.3.1. Видовые адаптации.

1.3.2. Индивидуальные адаптации.

1.4. Взаимодействие пищевых веществ в процессе пищеварения.

1.5. Эффективность функционирования транспортных систем кишечника у рыб.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объекты исследований.

2.2. Техника приготовления ферментативно-активных препаратов, условия проведения опытов.

2.3. Методы определения активности ферментов слизистой кишечника

2.3.1. Определение активности мальтазы.

2.3.2. Определение сахаразной и суммарной карбогидразной активности.

2.3.3. Определение активности а-амилазы.

2.3.4. Определение суммарной протеиназной (рН 7,4) активности.

2.3.5. Определение активности щелочной фосфатазы.

2.3.6. Исследование полисубстратных эффектов.

2.4. Расчет температурных характеристик ферментативных реакций.

ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ НА МОРФО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ КИШЕЧНИКА РЫБ РАЗЛИЧНЫХ ТАКСОНОМИЧЕСКИХ ГРУПП.

3.1. Видовые температурные адаптации пищеварительных ферментов рыб.

3.1.1. Осетровые.

3.1.2. Лососевые.

3.1.3. Камбаловые.

3.2. Индивидуальные температурные адаптации кишечной мальтазы карпа.

3.2.1. Уровень активности мальтазы кишечника при изменении температуры среды содержания карпа.

3.2.2. Температурные характеристики мальтазы различных отделов кишечника голодающих карпов при изменении температуры среды содержания.

3.2.3. Температурные характеристики мальтазы кишечника питающихся карпов при изменении температуры среды содержания.

3.3. Влияние температуры среды содержания и функционального состояния карпов на структурные характеристики их кишечников.

3.4. Физико-химические свойства мембранной, детергентной и протеазной форм кишечной мальтазы различных карповых рыб.

3.4.1. Температурные характеристики различных форм мальтазы кишечника украинской и ропшинской пород карпа.

3.4.2. Температурные характеристики различных форм мальтазы кишечника карпа и белого толстолобика.

ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ВОДОРОДНЫХ ИОНОВ В ВОДЕ НА АКТИВНОСТЬ ПИЩЕВАРИТЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ У РЫБ.

4.1. Влияние изменения рН среды содержания карпов на уровень активности карбогидраз кишечника.

4.2. рН-функции пищеварительных ферментов слизистой оболочки кишечника лососевых видов рыб.

ГЛАВА 5. ВЛИЯНИЕ ИЗМЕНЕНИЯ СОСТАВА ПОТРЕБЛЯЕМОЙ ПИЩИ НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПИЩЕВАРИТЕЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ.

5.1. Взаимодействия пищевых веществ в условиях in vivo.

5.2. Взаимодействия пищевых веществ в условиях in vitro.

5.2.1. Осетровые.

5.2.2. Лососевые.

5.2.3. Карповые.

5.2.4. Камбаловые.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности мембранного пищеварения у рыб различных таксономических и экологических групп"

Актуальность проблемы. Полученная в течение второй половины XX века информация значительно изменила многие наиболее фундаментальные представления о работе пищеварительной системы. Традиционные взгляды на механизм ассимиляции пищевых веществ гетеротрофными организмами основывались на общепринятом представлении о существовании двух типов пищеварения - внеклеточного и внутриклеточного (обзоры: Павлов, 1987; Лондон, 1916; Бабкин, 1927; Коштоянц, 1950 и мн. др.). Однако в конце 50-х годов было обнаружено (Уголев, 1960 а, б), что помимо упомянутых выше классических типов пищеварения существует третий фундаментальный тип -мембранное пищеварение, которое осуществляется при контакте пищевых субстратов с ферментами, локализованными на внешней поверхности структур кишечных клеток. В этот же период описаны наиболее существенные особенности мембранного пищеварения. Обнаружение последнего позволило приблизиться к пониманию ряда важных закономерностей работы пищеварительного аппарата млекопитающих, а затем и всех биотрофов.

Вместе с тем известно, что рыбы - это наиболее многочисленная группа позвоночных животных, насчитывающая более 20 тыс. видов с огромным разнообразием пищевых особенностей. В результате проведенных к настоящему времени исследований охарактеризованы закономерности полостного, мембранного и внутриклеточного гидролиза пищи и транспорта нутриентов в кишечнике рыб, достигнуты значительные успехи в изучении процессов индуцированного аутолиза и участия ферментов микрофлоры в реализации пищеварительной функции (Кузьмина, Цветкова, 2001; Кузьмина, Скворцова, 2001, 2002,2003; Неваленный и др., 2003; Извекова, Лаптева, 2004 и мн. др.).

В конце XX века появились представления о том, что биосферу можно рассматривать, как трофосферу, где пищевые сети образуют замкнутую систему, функции обратной связи в которой играют ферменты, осуществляющие гидролитическое расщепление биополимеров (Уголев, 1985, 1990). Известно, что важнейшим биотическим фактором для гетеротрофных организмов является обеспеченность необходимой пищей, а наиболее важными абиотическими, особенно для холоднокровных гидробионтов - температура и для гидробионтов - концентрация водородных ионов в воде.

В связи с этим, особый интерес представляет исследование влияния экологических факторов на пищеварительную функцию кишечника рыб и выявление механизмов взаимодействия нутриентов в естественных условиях пищеварительного процесса. Следует отметить, что до последнего времени влияние температуры акклимации и реакции среды (рН) на активность энтеральных ферментов рыб практически не изучено, крайне мало сведений о температурных адаптациях мембранных ферментов с учетом роли различных компонентов фермент-мембранных комплексов энтероцитов. Имеющиеся данные не позволяют сделать вывод о том, как влияют важнейшие абиотические факторы среды обитания на процессы пищеварения у рыб в течение жизненного цикла.

Несмотря на то, что регуляторные свойства ферментов, обеспечивающих процессы мембранного пищеварения у рыб, были установлены достаточно давно (Гредин, 1977; Кузьмина 1987), механизмы взаимодействия пищевых веществ в процессе гидролиза остаются до конца не выясненными (Неваленный и др., 2003). Сведения, полученные при исследовании этих вопросов, необходимы для решения не только ряда теоретических и прикладных проблем питания и пищеварения рыб, но также и для понимания процессов, происходящих в водных экосистемах.

В связи с этим, были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать видовые температурные адаптации пищеварительных ферментов рыб, стоящих на разных ступенях эволюционной лестницы.

2. Выявить индивидуальные температурные адаптации на примере мембранносвязанной мальтазы карпа.

3. Оценить влияние температуры среды содержания и функционального состояния карпов на структурные характеристики их кишечников.

4. Сравнить физико-химические свойства мембранной, детергентной и протеазной форм кишечной мальтазы различных карповых рыб.

5. Проанализировать влияние концентрации водородных ионов в воде на активность гидролитических ферментов рыб в условиях in vivo и in vitro.

6. Изучить влияние состава потребляемой пищи на активность пищеварительных ферментов и установить эффекты взаимодействия пищевых веществ в процессе гидролиза у рыб различных таксономических групп.

Научная новизна и практическая значимость работы. Выявлены особенности ферментных систем, обеспечивающих процессы мембранного пищеварения у рыб разных таксономических групп (осетровые, лососевые, карповые, камбаловые), обитающих в холодных водах и у видов из южных водоемов, а также у пресноводных, морских и проходных экологических групп. При этом показано, что свойства пищеварительных ферментов у исследованных групп видов рыб свидетельствуют об их значительной адаптированности к условиям функционирования, что обеспечивает оптимальное осуществление пищеварительной функции в естественных условиях.

Впервые при акклимации рыб к разным температурам проведено одновременное исследование как весовых и линейных характеристик кишечника, так и активности, и свойств ферментов клеток слизистой оболочки кишечника карпов. Установлено, что изменение температуры акклимации в диапазоне 8-28°С не вызывает адаптивных сдвигов в уровне активности и свойствах ферментов, осуществляющих мембранный гидролиз углеводов в кишечнике. Высказана гипотеза, что гомеостаз мембранного пищеварения при изменении температуры акклимации поддерживается не за счет регуляции активности и свойств кишечных ферментов, а за счет изменения массы слизистой оболочки кишечника. При понижении температуры она увеличивается, а при повышении - уменьшается. По-видимому, этот механизм особенно важен для сезонных адаптаций пищеварительной системы рыб.

В экспериментах по влиянию различных концентраций водородных ионов в среде содержания карпов на активность мембранных ферментов показан S-образный характер зависимости активности карбогидраз при увеличении концентрации водородных ионов в воде с минимумом при рН 5-6 и максимумом при рН 4. В результате сопоставления рН-функций, полученных для пищеварительных ферментов лососевых рыб, обитающих в водоемах Камчатки, отмечена более широкая зона оптимальных значений рН, по сравнению с пресноводными костистыми рыбами умеренных широт.

При исследовании ферментативно активных препаратов слизистой кишечника осетровых, лососевых, карповых и камбаловых видов рыб выявлены процессы взаимодействия субстратов ферментативных реакций в условиях in vitro для всех исследованных групп пищевых веществ. Установлено, что во всех случаях трисубстратных взаимодействий при исследовании слизистой кишечника рыб, стоящих на разных ступенях эволюционной лестницы, обитающих как в пресной, так и в морской среде, а также у проходных видов рыб обнаружен только активирующий эффект.

В целом, анализ собственных и литературных данных позволил сделать заключение о том, что у рыб, стоящих на различных ступенях эволюционной лестницы, но близких по характеру питания, наблюдается сходное соотношение состава и активности мембранных гидролаз, а у рыб таксономически близких, различающихся по экологии, напротив, отмечаются значительные различия.

Результаты диссертации имеют и практический интерес. Установленные в работе закономерности позволяют рекомендовать при разработке кормов для выращиваемых видов рыб очень точную сбалансированность по содержанию основных групп пищевых веществ, характерному для пищи вида в естественных условиях, чтобы обеспечить максимальную эффективность гидролитического процесса. Полученные данные необходимо учитывать при исследованиях болезней рыб и нарушений пищеварения, как в естественных условиях, так и в аквакультуре.

Результаты работы могут быть включены в курсы лекций при подготовке специалистов: ихтиологов, гидробиологов и экологов. Некоторые данные уже включены в лекции по экологии и трофологии, читаемых для студентов в ряде университетов.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и представлялись на Всесоюзной конференции «Механизмы регуляции физиологических функций» (Ленинград, 1988), 4-ой Всесоюзной конференции по раннему онтогенезу (Москва, 1988), 1-ой Всесоюзной конференции по рыбохозяйственной токсикологии (Рига, 1989), 7-ой и 8-ой Всесоюзных конференциях по экологической физиологии и биохимии рыб (Ярославль, 1989; Петрозаводск, 1992), 4-ом Всесоюзном симпозиуме «Мембрана щеточной каймы» (Рига, 1990), Всесоюзной конференции «Оценка состояния, охрана и рациональное использование биологических ресурсов водных экосистем в условиях антропогенного воздействия» (Ростов-на-Дону, 1990), 15-ой Всесоюзной конференции «Физиология пищеварения и всасывания» (Краснодар, 1990), 4-ой Всесоюзной конференции по рыбохозяйственному использованию теплых вод (Курчатов, 1990), заседании метод совета «Корма, кормление и кормопроизводство для рыб» НЦ «Аквакультура» НПО по рыбоводству (Рыбное, 1991), Международной конференции «Каспий -настоящее и будущее» (Астрахань, 1995), 1-ом Конгрессе ихтиологов России (Астрахань, 1997), 3 International symposium on sturgeon (Piacenza, 1997), Международной конференции «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов (Петрозаводск, 2004).

Я выражаю свою сердечную благодарность своему Учителю академику АН СССР Александру Михайловичу Уголеву, доктору биологических наук Егоровой Вере Васильевне, доктору биологических наук, профессору Неваленному Александру Николаевичу за консультации, постоянное внимание и помощь при выполнении работы.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Коростелев, Сергей Георгиевич

выводы

1. Исследованы ферментные системы, обеспечивающие процессы мембранного пищеварения у рыб, обитающих в холодных водах и у видов, обитающих в южных водоемах. Показано, что температурные характеристики (относительная активность при низких и высоких температурах инкубации, энергия активации) пищеварительных ферментов у исследованных групп видов рыб свидетельствуют об их значительной адаптированности к условиям функционирования, что обеспечивает оптимальное осуществление пищеварительной функции в естественных условиях.

2. Изменение температуры акклимации не вызывает адаптивных изменений уровня активности мембранных гидролаз, что подтверждается отсутствием, в большинстве случаев, статистически значимых различий в активности при стандартной температуре (25°С) мембранносвязанных ферментов у карпов, содержавшихся при 18°С, а затем акклимированных в течение одной-двух недель при температурах 8; 12; 28°С. Содержание карпов при различных температурах не приводит к изменению исследованных свойств (температурный оптимум, относительная активность при низких и высоких температурах инкубации, энергия активации) мембранносвязанной мальтазы кишечника рыб.

3. Температура среды содержания оказывает значительное влияние на морфологические характеристики кишечника карпов. При акклимации рыб к пониженной температуре относительная масса кишечника увеличивается, что связано с гипертрофией слизистой оболочки. Так, относительная масса слизистой оболочки кишечника у рыб, акклимированных в течение двух недель к температуре среды 12°С, для питавшихся карпов в 2,6 раза, а для голодавших в 1,9 раза выше, чем у рыб, акклимированных к температуре 28°С. При изменении температуры среды содержания рыб относительная масса мышечной оболочки изменяется незначительно.

5. Сопоставление значений температурных оптимумов и энергии активации мембранносвязанной мальтазы кишечника карповых рыб позволило выявить видовые (карп, белый толстолобик) и внутривидовые (украинская и ропшинская породы карпа) различия в свойствах фермент-мембранного комплекса, направленность которых свидетельствует о наличии температурных адаптаций на уровне ферментов мембранного пищеварения. Установлено, что при разрушении фермент-мембранного комплекса детергентами и протеазами видовые и внутривидовые различия в свойствах мальтазы исследованных карповых рыб исчезают. Поскольку температурные адаптации мембранносвязанных ферментов кишечника карповых рыб осуществляется не путем образования молекул фермента с модифицированными свойствами, а на уровне комплекса фермент-мембрана - они являются фенотипическими.

6. Показано, что кишечная мальтаза карповых рыб легче солюбилизируется, чем у млекопитающих. Так, при ультрацентрифугировании активность мембранной формы (осадок) мальтазы карпа и белого толстолобика составляет от 21 до 42% от всего количества фермента в препарате, а у крыс -80%. Следовательно, ферменты теплокровных животных имеют не только более жесткую структуру, но и, в случае мембранных ферментов, более прочно связаны с мембранами несущих их клеток, по сравнению с ферментами холоднокровных.

8. В экспериментах по влиянию различных концентраций водородных ионов в среде содержания карпов на активность карбогидраз кишечника показано, что наблюдается S-образный характер зависимости активности а-амилазы, мальтазы, сахаразы и суммарных карбогидраз при увеличении концентрации водородных ионов в воде с минимумом при рН 5-6 и максимумом при рН 4. Оптимальные значения реакции среды для гидролаз кишечника лососевых рыб (горбуша, кета, нерка, голец, микижа), наблюдаются при рН 8,0 (щелочная фосфатаза, а-амилаза, мальтаза) и рН 11,0 (суммарная протеиназа). Сопоставление рН-функций, полученных для пищеварительных ферментов лососевых рыб, обитающих в водоемах Камчатки, позволяет отметить широкую зону оптимальных значений рН, по сравнению с пресноводными костистыми рыбами умеренных широт.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Современный этап исследования процесса усвоения пищи характеризуется значительными успехами, которые связаны с открытием A.M. Уголевым в конце 50-х (Уголев, 1960а, б) механизма мембранного пищеварения, который обеспечивает расщепление около 80-90% химических связей молекул биополимеров. Этот фундаментальный механизм обнаружен у животных различных таксономических групп (обзоры: Уголев, 19726, 1985; Кушак, 1983; Мембранный гидролиз и транспорт ., 1986; Груздков и др., 1991), в том числе и у рыб (Берман, Салиенице, 1966; Пегель, Антипин, 1971, 1972; Кузьмина, 1978, 1986а, Уголев, Кузьмина, 1993; Абдурахманов и др., 2003). Тем не менее, особенности мембранного пищеварения у рыб исследованы недостаточно. Об этом свидетельствуют многие сообщения последних лет (Неваленный, 1996; Кузьмина, Голованова, 1998; Туктаров, 2002; Неваленный и др., 2003; Бедняков, 2004; Коростелев, Неваленный, 2005).

Понимание механизмов эволюционных и адаптивных перестроек пищеварительной системы рыб возможно лишь при тщательном изучении влияния на функционирование этой системы как биотических, так и абиотических факторов среды. Одним из важнейших факторов среды, который непосредственно влияет на скорость биохимических реакций, является температура. Считается, что компенсация негативного влияния изменений температуры на скорость ферментативных процессов у пойкилотермных животных осуществляется, преимущественно, на клеточном и молекулярном уровне посредством изменения концентрации ферментов и за счет изменения их свойств (обзоры: Хочачка, Сомеро, 1977, 1988). Температурная адаптация позволяет поддерживать относительную независимость физиологических процессов, в том числе пищеварительных, в зоне температур, характерных для среды обитания различных видов животных.

Необходимо обратить внимание также на то, что адаптации биологических систем к условиям функционирования следует рассматривать как результат взаимодействия двух основных ее форм: генетической или видовой, отражающей приспособительное развитие вида, и фенотипической или индивидуальной, отражающей приспособление отдельных представителей вида к конкретным условиям среды обитания. Кроме того, известно, что существенные адаптивные сдвиги в сложных системах могут достигаться за счет незначительных изменений в каждом отдельном компоненте, входящим в их состав.

В настоящее время достаточно подробно исследованы температурные адаптации мембранносвязанных пищеварительных ферментов холоднокровных животных, по сравнению с таковыми теплокровных (Егорова и др., 1974; Аз£еагз80п е1 а1., 1995). При этом показано, что температурные оптимумы одноименных ферментов у них могут различаться на десятки градусов. Более того, подобные результаты получены и при изучении гидролаз рыб, обитающих в среде с различными температурами (Уголев и др., 1976, 1981; Ое1шап е1 а1., 1989). Убедительно продемонстрировано, что свойства одноименных ферментов коррелируют с экологическими особенностями исследованных рыб (Ое1шап е1 а1., 1992; Уголев, Кузьмина, 1993; Пономарев, 1995, 1997).

Так, значительные различия были обнаружены при исследовании щелочной фосфатазы кишечника рыб, обитающих в разных климатических зонах Атлантического океана. Например, температурный оптимум щелочной фосфатазы соответствует 50-60°С для тропических видов рыб (скумбрии, ставриды, сардинеллы), тогда как для фермента глубоководной акулы, обитающей при 4-5°С, лишь 30°С (Уголев и др., 1976; Ое1шап е1 а1., 1989). Подробные результаты были получены и при исследовании щелочной фосфатазы кишечника рыб умеренных широт (Уголев и др., 1981). В частности, показано, что температурный оптимум фермента крысы соответствует 50°С, судака - 45°С, леща и форели - 40°С. Различия наблюдаются и в зоне постмаксимальных температур. Относительная активность щелочной фосфатазы у представителей южного понто-каспийского фаунистического комплекса - леща и судака при значениях температурного оптимума фермента крысы составляет 88 и 92%, соответственно, от максимальной активности, а у холодолюбивой форели - лишь 67%. Важно отметить, что у судака, леща и белого толстолобика летом наблюдается увеличение термостабильности щелочной фосфатазы, а также увеличивается Еа1ГГ (Гельман, Нехамкин, 1979; Ое1шап е1 а1., 1984; 1992). При исследовании кишечной сахаразы ряда видов рыб, обитающих в условиях Севера (бассейн р. Печора), в ряде случаев выявлены адаптивные перестройки свойств фермента, обеспечивающих температурную компенсацию заключительных этапов гидролиза полисахаридов (Пономарев, 1992а, 1997).

Близкие закономерности обнаружены при исследовании рыб, обитающих в средней полосе и различающихся по типу питания (Кузьмина, Морозова, 1977). Так, у типичных хищников (налима, щуки, судака), способных питаться при температуре близкой к 0°С, значения температурных коэффициентов для а-амилазы в зоне физиологических температур ниже (1,1-1,6), чем у бенто- и планктофагов (леща, плотвы, синца, карпа и карася), начинающих питаться при температуре 7-8°С (температурные коэффициенты колеблются у них от 1,4 до 3,0). При этом у первых при температуре 0°С активность фермента составляет 35-70%, у вторых - лишь 10-20% от максимальной активности, принятой за 100. Однако, у хищных и мирных рыб, обитающих в бассейне северной р. Печора, подобных различий в температурных характеристиках а-амилазы не выявлено, что объясняется значительной эврифагией рыб в северных водоемах (Пономарев, 19926). Интересно также отметить, что низкая температура вызывает снижение активности карбогидраз в большей степени у «мирных», чем у хищных рыб (Голованова, 1997). Известно, что теплолюбивые рыбы, независимо от характера питания, в условиях оптимальных температур обладают большей способностью усваивать углеводы пищи и трансформировать их в жиры, чем холодолюбивые, как хищники, так и мирные, которые нуждаются в большем содержании жиров в пище с целью сохранения белка для роста (Остроумова, 1988).

Нами при исследовании влияния температуры инкубации на уровень активности ферментов слизистой оболочки кишечника рыб, различных экологических и таксономических групп (осетровые, лососевые, карповые, камбаловые) также показано, что основные температурные характеристики (температурный оптимум, относительная активность ферментов при низких и высоких температурах инкубации, энергия активации) различаются в зависимости от экологических особенностей этих видов рыб.

Однако, различия в величине температурного оптимума одноименных ферментов гомойо- и пойкилотермных животных, а также и среди последних наблюдаются далеко не всегда. Так, температурный оптимум кишечной мальтазы и у кур, и у крыс, и у большинства видов рыб соответствует 60°С (Щербаков, 1969а,б; Егорова и др., 1974, 1982; Кузьмина, 1985; Неваленный, Коростелев, 1998; Абдурахманов и др., 2003). Очень близки температурные характеристики общей амилолитической активности (преимущественно активность мальтазы) у разных видов рыб, обитающих в условиях Севера, которые не имеют сезонных различий (Пономарев, 1991). При исследовании температурных зависимостей кишечных протеиназ у некоторых видов пресноводных костистых рыб, относящихся по типу питания к разным экологическим группам, показан довольно близкий характер ^-функций, практически не зависящий от типа субстрата. В то время как для желудочных протеиназ хищных видов рыб обнаружена исключительно высокая относительная активность по гемоглобину (преимущественно активность пепсина) в зоне низких температур, что свидетельствует об адаптации ферментов, обеспечивающих начальные этапы протеолиза у хищников, к низким температурам функционирования (Кузьмина, 19906). В связи с перечисленными выше фактами, сделан вывод (Уголев, Кузьмина, 1993; Кузьмина и др., 1999) о том, что пищеварительные ферменты, реализующие начальные этапы гидролиза углеводов и белков у хищных рыб, более адаптированы к низким температурам, чем у «мирных» рыб, а гидролазы, осуществляющие промежуточные и заключительные этапы гидролиза этих нутриентов у тех и других, к низким температурам мало адаптированы.

В некоторых работах показано, что величина температурного оптимума ферментов может отражать условия существования вида в далеком прошлом. В частности, у пресноводного налима, обитающего в средних широтах, но имеющего арктическое происхождение, температурный оптимум мальтазы соответствует 50°С, а у остальных рыб этой зоны - 60°С (Кузьмина, 1985; Кузьмина, Неваленный, 1986). У угольной сабли, обитающей при температуре 4-5°С, но формировавшейся в условиях тропиков, температурный оптимум щелочной фосфатазы составляет 60°С, как и у других тропических видов рыб (Уголев и др., 1976; Ое1шап Qt а1., 1989).

Эти факты, а также то, что оптимум ферментативной активности, как правило, находится при значениях температур, не совместимых с жизнью, позволяют согласиться с мнением В.А. Александрова (1975, 1985), что собственно термостабильность белков, по-видимому, не является полезным признаком при естественном отборе. Вероятно, непосредственное адаптивное значение имеет термостабильность на организменном и клеточном уровнях, которая, не вполне понятным образом, связана с термостабильностью молекул различных типов (Ушаков, 1974,1990).

В связи с этим, для понимания температурных адаптаций пищеварительных ферментов следует особое внимание обратить на область физиологических температур. Поэтому в последние годы внимание исследователей привлекли показатели, позволяющие оценить адаптивные перестройки ферментов в зоне физиологических температур. Так, определение кажущейся энергии активации (Еакт) щелочной фосфатазы кишки крыс и миног показало, что у первых эта величина в зоне низких температур (0-30°С) - 5,2 и 13,8 кдж/моль соответственно. У вторых величина ЕаКт в диапазоне температур от 0 до 40°С постоянна и составляет 9,3 кдж/моль (Егорова и др., 1974). Таким образом, в области физиологических для данного организма температур эффектность действия кишечной щелочной фофатазы является наибольшей.

Излом на графике Аррениуса объясняется тем, что фермент крыс существует в двух формах, характеризующихся различной конформацией и различной энергией активации (Егорова и др., 1974; Уголев и др., 1983). Данные, показывающие, что и у рыб в зоне физиологических температур эффективность ряда ферментов выше, приводятся в ряде работ. В частности, Еа|ГГ щелочной фосфатазы кишечника угольной сабли в диапазоне температур 0-10°С составляет 6,3 кдж/моль, а в диапазоне 10-50°С - 12,9 кдж/моль (Уголев и др., 1976). Напротив, продемонстрировано, что у субтропических рыб - трех видов тиляпий ТИар1а ятотя, Т. ИШ, Т. Шойса и бурого групера Ертерке1№ guaza Еакт щелочной фосфатазы в зоне низких температур выше, чем в зоне высоких температур, лежащих выше точки перегиба на графике Аррениуса (Ое1тап е1 а1., 1992).

При исследовании мальтазы у пресноводных рыб (Кузьмина, 1985; Кузьмина, Неваленный, 1986) продемонстрировано, что для фермента бентофагов, начинающих питаться при температуре, близкой к 10°С, величина Еакт во всем исследованном диапазоне температур постоянна, и колеблется у рыб разных видов от 3,1 до 4,0 кдж/моль. У хищников, способных питаться при температурах около 0°С, отмечен излом на графике Аррениуса. В зоне низких температур величина Еа|ГГ в 2 раза ниже, чем в зоне высоких температур. Изучение амилазы у тех же видов рыб показало, что величина Еа|ГГ для фермента хищников в 2-3 раза ниже, чем у бенто- и планктофагов (Кузьмина, 1985; Кузьмина, Неваленный, 1986).

Для протеолитических ферментов кишечника рыб, обитающих в условиях Севера (бассейн р. Печора) также обнаружены скачкообразные изменения кажущейся Еа|ГГ, свидетельствующие о повышении эффективности ферментативного процесса в диапазоне физиологических для данного времени года температур (Пономарев, 1995, 1997). При этом, изломы на графике Аррениуса, соответствующие конформационному переходу от одной формы молекулы к другой, выявлены у разных по типу питания видов рыб, а не только хищных, как в средней полосе (Кузьмина, 1986).

С использованием современных возможностей для трипсина антарктической рыбы (синей нототении) и стальноголового лосося (обитающего в умеренных широтах) было показано, что аминокислотный состав обоих белков одинаков, но пептидные карты отличаются (Genicot et al., 1988). Кроме того, эти исследователи обнаружили, что трипсин нототении в диапазоне температур инкубации 5-35°С обладает большим числом оборотов, а, следовательно, и большей физиологической эффективностью, последняя увеличивается и за счет более низкой свободной энергии активации трипсина нототении, по сравнению с ферментом лосося и свиньи. Большая каталитическая способность при низких температурах продемонстрирована и для трипсина гренландской трески (Simpson, Hoard, 1984) и лобана (Guizani et al., 1991), по сравнению с ферментом крупного рогатого скота. При сравнении кинетических свойств бычьего химотрипсина и химотрипсина, выделенного у катрана (Ramakrisha et al., 1987) отмечено, что молекулярная активность фермента катрана в 2-3 раза выше.

Причины различий температурных характеристик и эффективности функционирования ферментов у гомойо- и пойкилотермных животных не вполне ясны. Предполагалось, что ферменты теплокровных животных имеют более жесткую структуру, чем одноименные ферменты холоднокровных (Александров, 1975, 1985; Хочачко, Сомеро, 1977, 1988 и др.).

Действительно, в настоящее время установлено, что важнейшим фактором адаптации, дающим рыбам возможность жить в условиях низких температур, являются аминокислотные замены в белках, которые позволяют сохранить внутримолекулярную подвижность ферментов и, соответственно, их каталитическую эффективность. Обычно в результате мутаций пролин, обеспечивающий жесткость полипептидной цепи, заменяется на более гибкий аланин (Озернюк, 2002; Ozernyuk, 2005). Эти результаты подтверждают предположение (Егорова и др., 1974) о том, что в процессе эволюции могут отбираться в качестве полезного признака соответствия между температурными условиями среды и наиболее эффективной конформацией фермента.

Ввиду того, что свойства ферментов, действующих в растворе, всецело определяются структурой белковых глобул, а связанных с мембраной зависят от структуры фосфолипидного бислоя мембраны, приспособление к температуре, по-видимому, достигается не вполне идентично для полостных ферментов и ферментов, связанных с микроворсинками энтероцитов (Егорова и др., 1974; Уголев и др., 1983; Уголев, Кузьмина, 1993). Ряд работ, проведенных на мембранных ферментах, подтвердили это предположение. Так, при исследовании ферментов, осуществляющих мембранное пищеварение у крыс и некоторых видов морских и пресноводных рыб, было установлено, что экстракция липидов при помощи ацетона приводит к изменению температурных характеристик ферментов (Егорова и др., 1974; Уголев и др., 1981; Кузьмина, 1985). Для кишечной сахаразы пресноводных рыб установлено даже смещение температурного оптимума в сторону низких температур на 10°С. Температура, при которой происходит скачкообразное уменьшение Еакт, для щелочной фосфатазы кишки крыс связанной с мембраной происходит при температуре около 30°С, а после экстракции липидов и солюбилизации -примерно при 40°С (Егорова и др., 1974). У пойкилотермных животных также обнаружены изменения Еакт в результате делипидизации мембран. Так, для холодолюбивого налима величина Еакт щелочной фосфатазы увеличивается в зоне низких температур почти в два раза (с 6,5 до 12,5 кдж/моль) (Кузьмина, 1984,1985,1986а; Кузьмина, Неваленный, 1986).

Приведенные результаты свидетельствуют о значительном влиянии фосфолипидного матрикса мембраны на температурные характеристики связанных с ней ферментов. При этом влияние мембраны, по всей вероятности, обусловлены жирнокислотным составом липидов, играющих важную роль в поддержании жидкокристаллического состояния мембран (Brasitus et al., 1979; Brasitus, Schachter, 1980; Vodtke, 1981a,б; Kpenc, 1981; Brasitus, 1983; Bell et al., 1986; Смирнов, Богдан, 2004). В результате адаптации рыб к холоду, увеличивается количество ненасыщенных жирных кислот в слизистой кишечника рыб (Кузьмина и др., 1982; Roche, Peres, 1984; Кузьмина, 1985;

Cowey, 1988; Crockett, Hazel, 1995), что позволяет мембранам и связанным с ними ферментам эффективно функционировать при низких температурах среды, поскольку известно как важно взаимодействие липидного матрикса мембран и ферментативных белков в реализации свойств последних (Brasitus et al, 1979; Costanzo et al, 1983; Brasitus, 1983; Bell et al, 1986; Рабинович, Рипатти, 2004).

Солюбилизация ферментов также приводит к изменению их температурных характеристик. В частности, наблюдаются различия величины Еакт для мембранносвязанной, детергентной и протеазной форм щелочной фосфатазы у млекопитающих и рыб (Уголев и др., 1981). Более того, показано, что характеристики детергентной и протеазной форм у-амилазы, сахаразы и щелочной фосфатазы кишечника леща отличаются от характеристик мембранно-связанной формы и являются температурно-зависимыми (Кузьмина, 1985). Это может свидетельствовать о важной роли в температурных адаптациях мембранных ферментов не только фосфолипидного матрикса мембраны и свойств самой белковой глобулы молекулы, но также и ее гидрофобной части.

Можно заключить, что видовые температурные адаптации пищеварительных ферментов рыб различных таксономических и экологических групп достигаются сходным образом за счет аминокислотных замен в белках, которые позволяют сохранить внутримолекулярную подвижность ферментов и, соответственно, их каталитическую эффективность при низких температурах. Для мембранносвязанных пищеварительных ферментов рыб при адаптации к холоду важное значение имеет увеличение количества ненасыщенных жирных кислот в мембранах энтероцитов, что позволяет связанными с ними ферментам сохранять подвижность и эффективно функционировать при низких температурах среды. В случае трансмембранных гидролаз важную роль в температурных адаптациях может играть гидрофобная часть молекулы фермента.

Анализ литературы, посвященной влиянию температуры среды содержания рыб на активность пищеварительных ферментов, свидетельствует о некоторой противоречивости результатов, поученных различными авторами. В частности, одни исследователи отмечали, что при воздействии повышенной температуры возрастает амилолитическая активность в кишечнике карпов (Кузьмина, Поддубная, 1986; Василевский, Самойлова, 1987), другие, наоборот, наблюдали значительное снижение активности этого фермента у карпов (Ро1асоуа е1 а1., 1988). В наших исследованиях также наблюдались достоверные различия уровня активности мальтазы в различных отделах кишечника карпа, акклимированного к высоким и низким температурам. Эти различия наблюдались в одни сроки эксперимента и отсутствовали в другие, были характерны для одних и отсутствовали в других отделах кишечника. В связи с этим, можно сделать вывод, что сама температура среды содержания рыб не оказывает влияния на уровень активности кишечной мальтазы. По-видимому, наблюдаемые различия связаны со стресс-реакцией (Селье 1960, 1972) на изменение температуры, а не влиянием температуры среды содержания рыб на ферментативную активность.

При исследовании акклимации пойкилотермных животных к различным температурам среды особый интерес представляют механизмы компенсации влияния температуры на скорость ферментативных реакций. Изучение уровней активности фермента, как правило, не позволяет определить изменяется ли количество функционирующих молекул, или изменяются их свойства. Адаптивные изменения свойств фермента можно обнаружить также в изменении температурных оптимумов, теплоустойчивости, активности в области низких температур, Еает и т.д. В связи с этим, нами были исследованы некоторые температурные характеристики мальтазы кишки карпа, акклимированного к различным температурам среды. При этом было продемонстрировано, что зависимость скорости реакции от температуры инкубации для мальтазы различных отделов кишки карпов, выдержанных в течение и 7, и 14 суток при различных температурах, имеет сходных характер.

Изменения Еакт процесса при изменении температуры содержания рыб мы также не обнаружили. Эти факты могут свидетельствовать о том, что какие-либо изменения свойств мальтазы кишки карпа при изменении температуры среды обитания отсутствуют.

Этот вывод кажется достаточно убедительным, так как подобные результаты были получены нами в экспериментах и на голодающих, и на питающихся карпах. По-видимому, адаптации к температуре среды пищеварительной функции у рыб осуществляются на более высоком системном уровне, чем на молекулярном. Известно, что в соответствии с системно-функциональным подходом, впервые разработанным П.К. Анохиным (1975, 1977), адаптация определяется как реакция биологической системы на изменение условий среды существования, выражающаяся в том, что система реагируя на изменение факторов среды, перестраивает, изменяет свои структурные связи для сохранения функций, обеспечивающих ее существование как целого в изменяющейся среде (обзор: Воложин, Субботин, 1987). По отношению к пищеварительной системе механизм адаптации может включать морфо-физиологические реакции на уровне молекул, клеток, органа. В наших исследованиях мы не обнаружили адаптации пищеварительной системы к температуре среды на молекулярном уровне, однако это не означает, что адаптивные реакции отсутствуют при рассмотрении пищеварительной системы как органа в целом.

Высказанное предположение подтвердилось при определении такой морфологической характеристики пищеварительной системы, как масса слизистой поверхности кишечника карпов, содержавшихся при различных температурах. Оказалось, что при понижении температуры среды она увеличивается, а при повышении - уменьшается. Необходимо отметить, что данная закономерность была выражена как для голодных, так и для питающихся рыб. Гипертрофия некоторых органов при адаптации к холоду отмечалась и ранее рядом исследователей. В частности, С.Е. Китчин и Д. Моррис (Kitchin, Morris, 1971) обратили внимание на увеличение объема слизистой кишечника рыб, адаптированных к холоду. В работе Д.А. Ли и А.Р. Коссинса (Lee, Cossins, 1988) продемонстрировано, что у карпов, акклимированных к холоду, объем слизистой кишечника и его диаметр больше, а складки выше и шире, чем у акклимированных к теплу. При этом количество складок одинаково у обеих групп рыб. Сходные данные получены и при исследовании морфологии кишечника леща (Голованова, 1996). Можно предположить, что при изменении температуры среды изменяется количество энтероцитов в слизистой поверхности кишечника, в то время как качественных и количественных изменений связанных с ними ферментов не наблюдается.

Таким образом, в зоне физиологических температур для карповых рыб наблюдается относительная независимость гидролитических процессов на уровне мембранного пищеварения от влияний температуры среды обитания. Действительно, если при понижении температуры среды активность ферментов на единицу массы слизистой снижается, а при повышении - возрастает (имеется в виду реальная активность ферментов, т.е. определенная при температуре инкубации, равной температуре среды содержания рыб), тогда как масса последней, напротив, увеличивается при понижении температуры и уменьшается при увеличении, то достигается гомеостатирующий эффект. Возможно, в процессе эволюции подобный механизм оказался наиболее целесообразным и закрепился генетически (о чем свидетельствуют сходные результаты, полученные при разном функциональном состоянии организма), поскольку он не сопровождается сложными процессами, связанными с адаптивным синтезом молекул пищеварительных ферментов с новыми свойствами при многократных изменениях температуры среды обитания рыб.

При исследовании транспортных процессов у леща было установлено достоверное повышение аккумуляции глюкозы и продуктов гидролиза крахмала, сахарозы и мальтозы в кишечнике при понижении температуры акклимации (Неваленный, 1987; 1996). Аналогичные результаты, как было указано выше, были получены рядом авторов при исследовании влияния температуры акклимации на интенсивность всасывания в кишечнике рыб некоторых аминокислот (Kitchin, Morris, 1971; Smith, 1983). Кроме того, А.Н. Неваленным (1987) было установлено, что в зимний период аккумуляция углеводов кишечными препаратами леща выше, чем в другие сезоны года.

Механизм усиления всасывания углеводов в кишечнике карповых видов рыб при воздействии низких температур не вполне ясен. Однако, увеличение массы слизистой кишечника, которое мы наблюдали при понижении температуры содержания карпа, позволяет достаточно убедительно объяснить этот феномен. Действительно, если скорость транспортных процессов выражена на единицу массы отрезка кишки, то при увеличении массы слизистой поверхности и неизменной массе мышечной оболочки (в случае понижения температуры среды), уровень аккумуляции глюкозы будет возрастать. Как известно, интенсивность аккумуляции продуктов гидролиза в кишечнике рыб зависит от эффективности функционирования транспортных систем энтероцитов. Следовательно, при выражении интенсивности транспорта на единицу массы слизистой оболочки, а не на массу отрезка кишечника рыб, акклимированных к различным температурам, эта величина будет постоянной.

Одновременно Неваленным А.Н. (1987; 1996) показано, что аккумуляция глюкозы, а также продуктов гидролиза поли- и дисахаридов в кишечнике леща при изменении температуры инкубации меняется незначительно (коэффициент Qio процесса близок 1). Следовательно, можно предположить, что, по крайней мере у карповых рыб, процессы пищеварения при изменении температуры среды обитания лимитируются не на заключительных этапах гидролиза и начальных этапах всасывания, а на стадиях расщепления биополимеров, связанных с полостными ферментами.

Результаты нашей работы свидетельствуют о том, что индивидуальные температурные адаптации для мембранносвязанных пищеварительных ферментов у карпа отсутствуют. При этом не вызывают сомнения результаты многочисленных исследований (Егорова и др., 1974; Кузьмина, 1985; Уголев и др., 1990; Кузьмина и др., 1999; Пономарев, 1997 и др.), а также полученные нами данные о том, что ферментативно-активные белки рыб, различающихся температурными условиями существования, обладают значительной адаптированностью к условиям жизнедеятельности. Следовательно, имеют место существенные различия в стратегии температурных адаптаций гидролитических систем в процессе эволюции и в течение индивидуальной жизни особи. В первом случае, адаптация к температурным условиям среды обитания достигается за счет изменения свойств и количества макромолекул, функционирующих в энтероцитах, во втором за счет варьирования численности популяции кишечных клеток на фоне неизменных характеристик фермент-мембранных комплексов.

В связи с этим, следующий этап этой работы был посвящен анализу адаптивных изменений кишечных ферментов при выращивании карповых рыб в среде с различными температурами. В качестве объекта исследовании вновь была выбрана мальтаза, как так для этого мембранного фермента показано, что он обладает амфипатической структурой и состоит из гидрофильной и гидрофобной частей (обзоры: Kenny, Maroux, 1982; Semenza, 1986). Ферменты с амфипатической структурой молекулы могут быть изолированы из мембраны с помощью неполярных детергентов (например, тритона-Х-100) и обозначаются как детергентная форма фермента. Протеолитическое расщепление связей между гидрофильной и гидрофобной частями молекулы приводит к образованию протеазной формы, лишенной гидрофобного домена. Поэтому, используя современные возможности, мы получили фермент в мембранносвязанной, детергентной и протеазной формах от некоторых карповых рыб, что позволило разделить эффекты мембранных компонентов и встроенного в них ферментативно-активного белка, а также роль гидрофобного участка в температурных адаптациях мембранных гидролаз.

Если исходный ферментативно-активный препарат без обработки детергентами или протеазами подвергнуть скоростному центрифугированию, то активность мембранносвязанного фермента определяется в осадке. Например, активность фракции мембранной формы мальтазы карпа и белого толстолобика составляет от 21 до 42% от всего количества фермента в препарате. В то же время, для мальтазы кишки крыс обнаружено более 80% ферментативной активности в осадке. Активность же мембранной формы мальтазы карпа и белого толстолобика в наших экспериментах составляла от 21 до 42% от всего количества фермента в препарате. По-видимому, кишечная мальтаза карповых рыб легче солюбилизируется, или доля мембранной формы фермента меньше, чем у млекопитающих. У речных раков активность мальтазы и ряда других пищеварительных ферментов также выше в супернатанте (цитозольная фракция), чем в осадке (Никитина, Тимофеева, 1995, 1997). Можно предположить, что ферменты теплокровных животных имеют не только более жесткую структуру (Александров, 1975, 1985), но и, в случае мембранных ферментов, более прочно связаны с мембранами несущих их клеток, по сравнению с ферментами холоднокровных. Возможно, это и объясняет значительное различие некоторых свойств фермент-мембранных комплексов пойкилотермных и гомойотермных организмов.

Как было указано выше, важный аспект температурных адаптаций мембранных белков относится к влиянию состава липидного матрикса мембран на свойства ферментов. Многими исследователями было отмечено различие некоторых свойств фермент-мембранных комплексов и ферментов, отделенных от мембраны, в том числе и гидролитических (обзоры: Уголев и др., 1981; Хочачка, Сомеро, 1988).

Результаты, полученные нами, также показали, что для мембранной формы кишечной мальтазы ропшинской породы карпа, по сравнению с украинской, наблюдались меньшие значения Еакт, свидетельствующие о большей эффективности гидролиза мальтозы у карпов, выращенных в Ленинградской области, что, по-видимому, можно охарактеризовать как адаптацию к пониженным температурам среды обитания. Кроме того, только для мембранной формы фермента в зоне физиологических для карпа температур (0-30°С), относительная активность мальтазы кишечника выращенных в Ленинградской области рыб, была несколько выше, чем у выращенных в Астраханской области. Значение температурного оптимума мембранной мальтазы кишечника украинской породы карпа оказалось ниже, чем этот показатель для фермента ропшинской породы, что еще раз подтверждает вывод В.Я. Александрова (1975) о том, что собственно термостабильность белков не является полезным признаком при естественно отборе.

По мере деградации ферментмембранных комплексов относительная активность кишечной мальтазы двух пород карпа становится близкой друг к другу. Различия в величине температурного оптимума наблюдается для детергентной (состоящей из гидрофильной белковой глобулы и гидрофобного домена) формы, но отсутствуют для протеазной (лишенной гидрофобного участка) формы. Это может свидетельствовать о важной роли гидрофобного домена в обеспечении свойств каталитически активного гидрофильного участка молекулы фермента в связи с температурными адаптациями.

Так, в последнее время (Хюттер и др., 1982, 1986; Егорова, 1990) показано, что гидрофобный домен участвует в поддержании оптимальной конформации фермента и стабилизации его структуры. Следовательно, мембрана оказывает значительное влияние на температурные характеристики мальтазы, включенной в ее состав, а гидрофобный домен, в свою очередь на свойства белковой, преимущественно каталитической части, что обеспечивает своеобразие свойств фермент-мембранного комплекса в целом.

В следующем цикле экспериментов мы исследовали различные формы кишечной мальтазы двух видов карповых рыб (карпа и белого толстолобика), выращенных при одинаковых температурах, но различающихся характером питания. Обнаружилось, что температурный оптимум мембранной формы кишечной мальтазы карпа выше, чем - белого толстолобика, тогда как для детергентной и протеазной форм фермента различия в значениях этого показателя недостоверны. Различия в Еакт процесса также обнаружены только для мембранной формы фермента, а для протеазной они минимальны. Важно отметить, более низкие значения Еакт мембранносвязанной мальтазы кишечника фитофага белого толстолобика, по сравнению со значениями Еает этой формы фермента кишечника всеядного карпа. Это может свидетельствовать о большей эффективности гидролиза углеводов в кишечнике белого толстолобика, чем в кишечнике карпа, при одинаковых температурах среды, что также указывает на адаптацию мембранносвязанного фермента кишечника белого толстолобика к условиям функционирования.

Таким образом, при исследовании индивидуальных температурных адаптаций в пределах одной породы карпа (украинской породы, подвергшейся длительной селекции - хотя и не линии, но генетически чистой группы) адаптивных приспособлений кишечной мальтазы не было обнаружено. Первоначальное предположение о том, что меняются свойства фермента при изменении температуры среды содержания, а не только их количество, не подтвердилось. Гомеостастатирующий эффект осуществляется на более высоком системном уровне - за счет регуляции массы слизистой оболочки кишечника; при понижении температуры среды, активность кишечных ферментов падает, но масса последней увеличивается, и в результате этого происходит поддержание пищеварительного процесса на относительно постоянном уровне. Эти данные являются чрезвычайно убедительным примером температурных адаптаций путем увеличения или уменьшения числа уже имеющихся неизменных функциональных блоков.

Следует также отметить, что весьма значительные различия температурных характеристик кишечной мальтазы карповых рыб, которые наблюдались в наших экспериментах для комплекса фермент-мембрана, резко уменьшаются или исчезают при попытках охарактеризовать свойства фермента, отделенного от мембраны в детергенной форме, а также в протеазной, т.е. лишенной гидрофобного участка. Это позволяет сделать чрезвычайно важный вывод о том, что физиологические особенности скорее обусловлены пространственными и временными сочетаниями имеющихся функциональных белков, а не образованием новых молекулярных структур. Возможно, при естественном отборе отбираются новые сочетания стандартных функциональных блоков, а не образуются новые. Полученные данные являются чрезвычайно убедительным примером, подтверждающим развивавшуюся в последние годы жизни акад. A.M. Уголевым (1979, 1982, 1983, 1985, 1987, 1990) концепцию о блоковом строении самых различных биологических структур и функций, предполагающей, что естественный отбор приводит к появлению новых сочетаний стандартных функциональных блоков, а не к образованию новых молекулярных структур.

Особый интерес представляет способность пищеварительной системы рыб к адаптации в условиях резкого изменения температуры среды обитания. Нами было продемонстрировано, что быстрое понижение температуры среды содержания карпов (в течение 1 часа) от 18 до 8°С приводит первоначально к возрастанию активности кишечной мальтазы в 1.5 раза, а затем к резкому, приблизительно трехкратному ее падению и повышению до первоначального уровня через 24 часа после изменения температуры и стабилизации на пониженном в 1,5 раза уровне через 40 часов.

Наблюдаемое резкое усиление и последующее падение ферментативной активности слизистой кишечника в течение первых 24 часов после понижения температуры среды содержания рыб может быть вызвано как стресс-реакцией (Селье 1960, 1972) на резкое изменение температуры среды содержания, так и суточной ритмикой изменения активности пищеварительных ферментов, установленной в ряде исследований (Неваленный и др., 1991, 1992; Неваленный, Егоров, 1995). Полученные результаты согласуются с представлением о том, что адаптивный процесс является сложной, существенно меняющейся во времени реакцией (Уголев и др., 1983), а перестройки гидролитических систем происходят в течение коротких интервалов времени.

В естественных условиях на процессы усвоения пищи среди абиотических факторов среды, наряду с температурой среды обитания, большое влияние оказывает и концентрация ионов водорода в воде (Немова и др., 1998). Можно отметить, что у ранее исследованных рыб Волжского бассейна оптимумы рН кишечной мальтазы сдвинуты вправо и отмечаются при рН 7,0-8,0 (Кузьмина, Неваленный, 1983). В большинстве случаев у исследованных нами лососевых видов рыб снижение значений рН в инкубационной среде как до 5,0, так и повышение до 10,0 вызывало снижение относительной активности мальтазы на 10-30% от максимума. Литературные данные показывают снижение относительной активности мальтазы при рН 5,0 на 40-60% у других видов рыб (Кузьмина, Неваленный, 1983). Обнаруженная широкая зона оптимальных значений рН для кишечной мальтазы у всех исследованных лососеобразных рыб смещена в сторону щелочных значений рН.

Похожие результаты получены и при исследовании уровня активности а-амилазы слизистой оболочки кишечника у большинства исследованных лососевых рыб, у которых максимальная гидролитическая активность а-амилазы обнаруживается при рН 8,0-9,0. Сопоставляя полученные результаты с литературными данными, можно отметить, что у пресноводных костистых видов рыб, исследованных ранее, рН - оптимум а-амилазы находится в диапазоне значений рН от 6,5 до 7,5 (Уголев, Кузьмина, 1993).

Снижение рН инкубационной среды до 5,0 вызывает снижение относительной активности а-амилазы до 40-80% от максимума, в то время как у различных видов рыб, исследованных ранее, при данных значениях рН относительная активность фермента снижается гораздо значительнее - до 1540% от максимальной величины (Кузьмина, Неваленный, 1983; Уголев, Кузьмина, 1993). Те же различия прослеживаются и при увеличении рН среды до 10,0, когда у исследованных нами лососеобразных рыб относительная активность фермента сохраняется в пределах 50-90% от оптимальной, а у представителей Волжского бассейна - только 40-80% от максимального значения (Уголев, Кузьмина, 1993). Для щелочной фосфатазы в большинстве случаев установлены сходные результаты.

Исследование влияния различных концентраций водородных ионов на уровень активности суммарной протеиназы слизистой оболочки кишечника различных видов рыб Волжского региона показал, что оптимум рН данной группы ферментов варьирует от 7,5 до 10,0 (Ка1ас, 1978; Хаблюк, Проскуряков, 1983). В наших исследованиях было показано, что максимальная активность суммарной протеиназы кишечника большинства тихоокеанских лососей обнаружена при рН 11,0.

Таким образом, сопоставление данных, полученных для пищеварительных ферментов лососевых рыб, обитающих в водоемах Камчатки, позволяет отметить широкую зону оптимальных значений рН, по сравнению с пресноводными костистыми рыбами умеренных широт. Сохранение высокой относительной активности всех исследованных пищеварительных ферментов слизистой оболочки кишечника лососевых рыб при смещении рН как в кислую, так и щелочную сторону свидетельствует о высокой устойчивости белковой глобулы фермента к различным концентрациям ионов водорода.

При исследовании особенностей пищеварения у окуня, обитающего в кислых и нейтральных озерах, показано (Кузьмина и др., 1998), что уровень активности карбогидраз в кишечнике окуня из ацидных озер в 1,5-2,0 раза, а протеиназ - в 2-9 раз ниже, чем у рыб из нейтрального озера. Это может свидетельствовать как о более низкой активности протеиназ, связанной с меньшей концентрацией белка в пище рыб-бентофагов из кислых озер, так и о том, что система протеиназ в условиях закисления водоемов угнетается в большей степени, чем система карбогидраз.

В наших экспериментах по влиянию различных концентраций водородных ионов в среде содержания карпов на активность карбогидраз кишечника показано, что наблюдается Б-образный характер зависимости активности а-амилазы, мальтазы, сахаразы и суммарных карбогидраз при увеличении концентрации водородных ионов в воде с минимумом при рН 5-6 и максимумом при рН 4. По-видимому, результаты исследования В.В. Кузьминой с соавторами (1998) отражают различия в спектрах питания окуня из озер с различными рН концентрацией, а не влиянием высокой концентрации водородных ионов. В наших же экспериментах отражено классическое развитие стресс-реакции по Селье (1960, 1972) на увеличение водородных ионов в среде содержания карпов.

Одной из наиболее важных биологических закономерностей функционирования пищеварительной системы является ее тонкая приспособляемость к качеству пищи, обнаруженная еще на рубеже 19-20 веков в классических работах И.П. Павлова (1951). В последующих исследованиях данная закономерность получила дальнейшее подтверждение (Бабкин, 1927; Corring, 1980; Уголев и др., 1986; Solomon, 1987; Уголев, 1961, 1972а, 1978, 1990; Груздков и др., 1991; и др.).

Необходимо отметить, что сущность пищевого или субстратного регулирования состоит в специфическом изменении структурных и функциональных характеристик кишечника, в том числе, ферментативной активности, в ответ на изменение состава пищи. При этом адаптивное изменение пищеварительной функции кишечника осуществляется как за счет регулирования численности энтероцитов, так и путем изменения их свойств (Уголев, 1972а, 1978, 1991; Груздков и др., 1991).

В настоящее время не вызывает сомнения тот факт, что структура и функционирование пищеварительной системы позвоночных животных адаптированы к характеру потребляемой пищи. Доказано существование адаптаций на уровне пищеварительных ферментов к характеру питания и у рыб (Пегель, 1950; Nagayama, Saito, 1968; Пегель и др., 1971; Кузьмина, 1981, 1985; Уголев, Кузьмина, 1993 и др.). Подводя итог исследования нутритивных адаптаций ферментов, осуществляющих мембранное пищеварение у рыб, В.В.Кузьмина (1978, 1981, 1985) отметила, что максимальные значения активности а-амилазы наблюдаются у типичных бенто- и планктофагов, несколько меньшие - у хищников факультативных бенто- и планктофагов, минимальные - у типичных хищников, и уровень энтеральных гидролаз (у-амилазы, мальтазы, инвертазы) также имеет подобное распределение. В то же время по уровню активности пептидаз рыб можно расположить по убывающей в ряд: хищники - "мирные" рыбы. Таким образом, у хищных рыб выше активность протеаз, у "мирных" - карбогидраз.

Вопрос о возможности адаптаций пищеварительной системы рыб к изменению состава пищи длительное время дискутировался (обзор: Уголев, Кузьмина, 1993). Так, Е. Баррингтон (Вагпг^оп, 1957) признавая существование определенной связи между ферментативным спектром и обычной диетой у рыб разных видов, отрицал возможность выраженной адаптированности ферментативного спектра в ответ на изменение диеты. Однако при исследовании некоторых видов рыб сделано предположение о существовании достаточно тонких приспособлений к изменению композиции диеты на уровне пищеварительной системы (Трофимова и др., 1975; Щербина и др., 1976; Щербина, 1980; Зайцев и др., 1990а,б, 1994; Неваленный и др., 1988, 1989, 1990а,б,в; Егоров, 1995; Егорова и др., 1995; Зайцев, Неваленный, 1995; Абдурахманов и др., 2003). Противоречивость литературных данных, по-видимому, в значительной степени обусловлена тем, что при характеристике пищевых адаптаций ферментных цепей у рыб их реакции рассматривались, как правило, изолировано и не учитывали функциональной взаимосвязи процессов гидролиза белковых и углеводных компонентов пищи.

Продемонстрировано, что в случае выращивания в течение трех недель молоди сибирского осетра на преимущественно белковой пище, характерной для данного вида, не требуется значительного напряжения протеазной гидролитической цепи - уровень активности нейтральных протеаз в кишечнике рыб практически не изменяется (Неваленный и др., 1997). Увеличение углеводной составляющей корма приводит к появлению напряжения, выраженного в трехкратном увеличении общей протеолитической активности кишечника сибирского осетра. Соответственно, углеводная гидролитическая цепь при преимущественно белковой диете также характеризовалась определенным напряжением, выраженным в увеличении уровня активности карбогидраз кишечника сибирского осетра в 1.5 раза на 14 сутки выращивания по сравнению с диетами, содержащими 25-35% углеводов, что может свидетельствовать о своеобразной компенсаторной реакции на отсутствие соответствующего субстрата в пище рыб. Обращает на себя внимание тот факт, что увеличение активности ферментов карбогидразной цепи в кишечнике сибирского осетра на 14 сутки выращивания на преимущественно белковой диете нивелируется к окончанию выращивания, в то время как напряжение протеазной гидролитической цепи сохраняется в течение всего периода использования диеты с пониженным содержанием белка. Эти результаты свидетельствуют о том, что перестройки ферментных систем кишечника рыб в ответ на изменение композиции диеты происходят достаточно медленно - в течение одной недели, а возникающие напряжения ферментативных цепей при отсутствии соответствующего компонента в корме субстратноспецифичны и могут иметь обратимый характер.

Анализ результатов, полученных при исследовании влияния изменения композиции диеты на активность карбогидразной и протеазной ферментативных цепей в кишечнике рыб, свидетельствует о том, что на изменения состава диеты наиболее чутко реагирует цепь гидролиза тех компонентов, которые находятся в дефиците. Так, недостаток углеводной составляющей в корме приводит к значительному изменению уровня активности ферментов карбогидразного пула, тогда как уменьшение количества белка и, соответственно, увеличение углеводной составляющей приводит к значительному изменению активности протеолитических ферментов. При этом характер изменения уровня активности непосредственным образом зависит от доминирующего компонента характерной для вида диеты.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что основные ферментные системы (протеазные и карбогидразные), обеспечивающие пищеварительную функцию, достаточно тонко адаптированы к составу потребляемой пищи. Изменение в пище доли характерного для данного вида компонента сопровождается относительной стабильностью активности соответствующей группы пищеварительных ферментов и варьированием уровня активности не специфичной для данного субстрата группы ферментов.

Анализ адаптаций ферментных систем, особенно цепи протеаз, у рыб на организменном уровне недостаточен и должен учитывать наличие собственных ферментных систем жертвы, которые также могут участвовать в реализации пищеварительной функции (1апсаг1к, 1964; Кузьмина, Перевозчикова, 1989; Угол ев, Кузьмина, 1993; Кузьмина, Голованова, 2001; Кузьмина, Цветкова, 2001; Кузьмина, 1990, 1993, 2001, 2004). Исследование активности нейтральных протеаз, функционирующих в кишечнике молоди белуги (Неваленный и др., 1997), демонстрирует, что скорость гидролиза белковых компонентов пищи при использовании рыбного фарша более чем в два раза ниже, по сравнению со значением этого показателя в кишечнике рыб, получавших живые корма. Полученные данные, возможно, объяснить только результатом увеличения протеолитической активности кишечника молоди белуги за счет собственных протеолитических ферментных систем зоопланктона.

Таким образом, в ферментных системах, реализующих пищеварение у рыб, происходят достаточно четко выраженные сдвиги в зависимости от композиции диеты. Полученные результаты, безусловно, имеют определенный практический интерес. Выявленные особенности перестроек гидролитических систем при выращивании молоди рыб на диетах с различным содержанием основных групп пищевых веществ позволяют подойти к решению проблемы создания наиболее физиологичных стартовых кормов, используя такой биохимический тест, как уровень активности пищеварительных ферментов.

В реально протекающем гидролитическом процессе одновременно перевариваются белки, жиры и углеводы, поэтому естественно возникает вопрос: каким образом влияют эти вещества друг на друга в процессе пищеварения? В настоящее время на высших позвоночных животных достаточно подробно исследованы эффекты взаимодействия на уровне субстратов мембранного пищеварения (обзоры: Уголев, 1972а; Кушак, 1983 и др.), имеются также многочисленные сведения и о взаимодействии пищевых веществ в процессе гидролиза в кишечнике рыб (Кузьмина, 1987; Уголев, Кузьмина, 1993; Неваленный и др., 1997, 2003; Бедняков, 2004). Однако при исследовании полисубстратного пищеварения, как правило, пользуются простейшей моделью одновременного взаимодействия двух различных веществ. Для усложнения модели, нами были исследованы не только бисубстратные, но и трисубстратные взаимодействия веществ, являющихся субстратами при оценке активности основных ферментативных цепей слизистой кишечника рыб.

Сопоставление интенсивности гидролиза гомогенатами слизистой кишечника осетровых, лососевых, карповых и камбаловых нутриентов по отдельности и в присутствии одного или двух веществ позволило выявить эффекты взаимодействия субстратов ферментативных реакций. При этом важно отметить, что при исследовании бисубстратного взаимодействия одно и то же вещество может служить одновременно активатором для одного ферментативного процесса и ингибитором для другого. Однако крайне интересен тот факт, что эффекты трисубстратного пищеварения не являются суммой бисубстратных эффектов, более того, они могут иметь противоположную направленность.

Важно подчеркнуть, что в экспериментах во всех случаях трисубстратных взаимодействий при исследовании основных ферментативных цепей слизистой кишечника всех видов рыб, стоящих на различных ступенях эволюционной лестницы, обнаружен только активирующий эффект. При этом исследовалась общая протеазная и карбогидразная активности слизистой кишечника карпа и сибирского осетра, а не отдельные ферменты протеазной и карбогидразной цепи. В связи с этим, полученные данные можно с большой долей вероятности экстраполировать на процессы пищеварения, осуществляемые в кишечнике рыб в реальных условиях.

Еще И.П. Павлов (1951) высказал предположение о возможности взаимных влияний, возникающих при переваривании различных пищевых веществ. Однако в дальнейшем это предположение не проверялось до открытия в конце 50-х годов механизма мембранного пищеварения (Уголев, 1961, 1972а). При исследовании высших позвоночных животных было установлено существование сложной системы взаимодействия пищевых веществ в процессе мембранного гидролиза. В частности, показано, что если в пищеварительный канал одновременно поступают жиры, белки и углеводы, сначала перевариваются жиры, затем углеводы и, наконец, белки. При моносубстратных процессах с наибольшей скоростью перевариваются белки, а наиболее медленно - жиры. Кроме того, в присутствии жиров имеет место смещение зоны гидролиза белков в дистальном направлении кишечника (Уголев, 1972а; и£о1еу е1 а1., 1975).

Известно, что переваривание пищи является типичным ферментативным процессом. В связи с этим, данные об изменении хода гидролиза при одновременном присутствии в инкубационной среде нескольких субстратов, по сути дела, характеризуют изменение активности кишечных ферментов, или их регуляцию, под влиянием модификаторов. Следовательно, взаимодействие пищевых веществ в процессе мембранного пищеварения является регуляцией на уровне активности пищеварительных ферментов и может быть описано с помощью существующих в настоящее время теорий. Показано, что регуляция ферментативной активности осуществляется на двух уровнях. Первый, применительно к собственнокишечным ферментам, связан с процессом синтеза ферментативного белка и транслокацией его в мембрану энтероцита; регуляция второго типа происходит на основе уже существующих молекул белка и сопряжена с изменением их структуры (обзоры: Хочачка, Сомеро, 1977, 1988; Кушак, 1983; Груздков и др., 1991 и др.). Естественно, что в процессе полисубстратного пищеварения регуляция активности пищеварительных процессов не связана с синтезом белка, на который необходимо определенное время (минуты, часы), а осуществляется практически мгновенно, иногда в доли секунды, за счет изменения активности ферментов в результате их связывания с тормозящими или стимулирующими модификаторами.

Таким образом, установленные у рыб процессы ди- и трисубстратных взаимодействий имеют чрезвычайное значение для понимания механизма реализации пищеварительной функции у рыб. Они обеспечивают тесное сопряжение работы различных ферментативных цепей в кишечнике рыб, чем достигается определенный автоматизм в работе пищеварительной системы и настройка ее на соответствующий вид пищи. Следовательно, путем регуляции на уровне активности пищеварительных ферментов осуществляется определенная последовательность в обработке пищи и, по-видимому, интеграция пищеварительных и транспортных процессов.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Коростелев, Сергей Георгиевич, Петропавловск-Камчатский

1. Абдурахманов Г.М., Волкова И.В., Егоров С.Н., Егорова В.И., Зайцев В.Ф., Коростелев С.Г. Особенности мембранного пищеварения карповых видов рыб. М.: Наука, 2003. 301 с.

2. Адунц Г.Т., Саркисян JT.B. Влияние некоторых факторов на ферментативную активность севанской храмули // Биол. журн. Армении, 1966. Т. 19, №10. С. 37-41.

3. Алейникова Т.Л., Рубцова Г.В. Биохимия. Руководство к практическим занятиям по биологической химии. М.: Высшая школа. 1988. 239 с.

4. Александров В.Я. Клетки, макромолекулы и температура. Л.: Наука, 1975.329 с.

5. Александров В.Я. Реактивность клеток и белки. Л.: Наука, 1985. 320 с.

6. Аминева В.А., Яржомбек A.A. Физиология рыб. М.: Легкая и пищевая промышленность, 1984. 200 с.

7. Ананичев A.B. Пищеварительные ферменты рыб и сезонная изменчивость их активности // Биохимия, 1959. Т. 24, № 6. С. 1033 1040.

8. Андриевская Л.Д. Летние миграции тихоокеанских лососей и их питание в морской период жизни // Изв. ТИНРО. 1957. - Т. 44. - С. 75-96.

9. Андриевская Л.Д. Питание тихоокеанских лососей в северо-западной части Тихого океана // Материалы по биологии морского периода жизни дальневосточных лососей. М.: ВНИРО, 1958. С. 64 75.

10. Андриевская Л.Д. Пищевые взаимоотношения тихоокеанских лососей в море // Вопр. ихтиол. 1966. Т. 6, № 1. С. 84 90.

11. Анохин П.К. Очерки по физиологии функциональных систем. М.: Медицина, 1975. 448 с.

12. Анохин П.К. Теория функциональной системы и ее место в построении теоретической биологии // Эволюция темпов индивидуального развития. М.: 1977. С. 9-18.

13. Бабкин Б.П. Внешняя секреция пищеварительных желез. М.- Л.: Госиздат, 1927. 550 с.

14. Бедняков Д.А. Модификационное регулирование уровня активности некоторых пищеварительных ферментов у рыб. Автореф. дис. . канд. биол. наук. Астрахань, 2004. 24 с.

15. Берман Ш.А., Салиенице И.К. Пристеночное пищеварение у рыб // Вопр. ихтиол. 1966. Т. 6, № 4. С. 720 724.

16. Блюгер А.Ф., Новицкий И.Н., Кушак А.Г. Исследование процессов полисубстратного пищеварения в кишечнике // Теоретические и прикладные аспекты мембранного пищеварения. Тез. докл. 2-го Всес. симпозиума. Рига, Зинатне. 1978. С. 17-19.

17. Валенкович Л.Н., Морозов К.А., Уголев A.M. Взаимоотношение полостного и мембранного пищеварения при старении // Физиология человека. 1978. Т. 4, №1. С. 77-85.

18. Вальдман А.Р. Питание и микрофлора // Химические и физиологические проблемы создания и использования синтетической пищи. Рига: Зинатне, 1972. С. 60-89.

19. Василевский B.C. О секреции пищеварительных ферментов с желчью рыб при температурной акклимации // 8 Науч. конф. по экол. физиол. и биохимии рыб. Тез. докл. Петрозаводск, 1992. С. 52 53.

20. Василевский B.C., Василевская Г.И. Ферментативная активность кишечника мальков белого амура (Ctenopharyngodon idella Val., Cyprinidae) // Гидробиол. журн. 1993. Т. 29, № 3. С. 76 87.

21. Василевский B.C., Самойлова Т.Д. а-Амилазная активность органов карпа и форели при холодовых акклимациях // Экология. 1987. № 3. С. 40 46.

22. Васильева Н.Е., Коровина В.М. Сравнительно-гистологическое исследование средней кишки некоторых лососевых // Вопр. ихтиологии, 1969. Т. 9, №1. С. 191-196.

23. Варламов В.Ф., Груздков A.A., Егорова В.В. Политермостат // Физиол. журн. СССР. 1971. Т. 57. С. 1556 1558.

24. Веригина И. А. Эколого-морфологические особенности пищеварительного тракта некоторых карпообразных рыб // Зоология (итиология). Изд-во Москва, 1968. С. 79 -109.

25. Веригина И.А., Жолдасова И.М. Эколого-морфологические особенности пищеварительной системы костистых рыб. Ташкент: «Фан», УзССР. 1982. 154 с.

26. Волкова И.В. Активность некоторых пищеварительных ферментов у разновозрастных групп растительноядных рыб // Вестн. АГТУ. Рыбное хозяйство. Астрахань, 1997. С. 20 26.

27. Волкова И.В., Зайцев В.Ф. Процессы мембранного пищеварения у производителей растительноядных рыб // 41-я Науч.-техн. конф. проф.-преп. состава АГТУ. Астрахань, 1997. С. 42.

28. Волкова И.В., Зайцев В.Ф. Активность некоторых пищеварительных ферментов у разновозрастных групп растительноядных рыб // Ресурсосберегающие технологии в аквакультуре. 2-й Межд. симп. Краснодар, 1999. С. 188.

29. Волкова И.В., Зайцев В.Ф. Гидролиз углеводных и белковых компонентов пищи растительноядных рыб // Наука производству, 2001. № 6. С. 23-24.

30. Воложин А.И., Субботин Ю.К. Адаптация и компенсация -универсальный биологический механизм приспособления. М.: Медицина, 1987. 176 с.

31. Воля Г.С. Некоторые данные о пищеварительных ферментах черноморских рыб и микромодификации определения пепсина, амилазы и липазы // Физиология морских животных. М.: 1966. С. 137- 145.

32. Высоцкая Р.У. Лизосомальные ферменты у рыб и влияние на них природных, антропогенных и патогенных факторов: Автореф. дис. д-ра биол. наук. Петрозаводск, 1999.42 с.

33. Гальперин Ю.М., Лазарев П.И. Пищеварение и гомеостаз. М., 1986. 280 с.

34. Гельман А.Г. Некоторые данные по температурным и кинетическим характеристикам щелочной фосфатазы рыб тропической и бореальной областей // Пути повышения продуктивности животных и растений. Рига, 1975а.

35. Гельман А.Г. Влияние среды обитания на температурные характеристики щелочной фосфатазы рыб // 2 Всес. конф. мол. уч. по вопр. сравнительной морфологии и экологии животных. Тез. докл. М.: Наука, 19756. С. 60-61.

36. Гельман А.Г. Сравнительные данные по температурным характеристикам щелочной фосфатазы сардинеллы и ставриды центральной части восточной Атлантики // Совершенствование технологии рыбных продуктов. Тр. АтлантНИРО. 1976а. Вып. 59. С. 27 36

37. Гельман А.Г. Сравнительная оценка изменения активности щелочной фосфатазы у ставриды и сардинеллы // Тр. АтлантНИРО. 19766. Вып. 59. С. 36 -42.

38. Гельман А.Г., Нахамкин Б.Л. Сезонная изменчивость активности и температурных характеристик щелочной фосфатазы судака и леща Куршского залива//Тр. АтлантНИРО, 1976. Вып. 64. С. 31-35.

39. Гельман А.Г., Нехамкин Б.Л., Шендерюк В.И. Исследование некоторых свойств глицил-Ь-лейцинпептидазы рыб // Тр. АтлантНИРО. 1976. Вып. 64. С. 26-30.

40. Голованова И.Л. Анализ moho-, би- и полифакторного воздействия температуры, pH и кадмия на пищеварительные карбогидразы рыб // Биология внутр. вод. 1997. № 2. С. 58 64.

41. Голованова И.Л. Влияние различных факторов на устойчивость пищеварительных карбогидраз рыб к действию кадмия // Биология внутр. вод. 2004. №2. С. 76-83.

42. Голованова И.Л. Особенности морфологии различных отделов кишечника леща и карпа // Биол. внутр. вод: Инф. бюл. / РАН, 1996. № 99. С. 39-45.

43. Голованова И.Л., Кузьмина В.В. Транспорт нутриентов в кишечнике рыб // Биол. внутр. вод. 1998. № 2. С. 62 72.

44. Голованова И.Л., Кузьмина В.В, Голованов В.К. Воздействие высоких температур на пищеварительные гидролазы серебряного карася Carassius auratus II Журн. вопр. ихтиол. 2002. Т. 42, № 1. С. 121 128.

45. Груздков A.A. Гусев В.М, Егорова В.В, Иезуитова H.H., Никитина A.A., Тимофеева Н.М, Токгаев Н.Т, Уголев A.M. Адаптационно-компенсаторные процессы: На примере мембранного гидролиза и транспорта. Л.: Наука, 1991. 288 с.

46. Диксон М, Уэбб Э. Ферменты / Пер. с англ. М.: Мир, 1982. Т. 1. 392 с.

47. Егоров С.Н, Егорова В.И. Исследование влияния некоторых факторов среды на эффективность мембранного пищеварения у карпа Cyprinus carpió (L.)

48. Ресурсосберегающие технологии в аквакультуре. Мат. докл. 2-го Межд. симпоз. Краснодар, 1999. С. 192.

49. Егорова В.В. Молекулярная физиология мембранного пищеварения и его регуляция: Автореф. дис. д-ра биол. наук. J1. 1990.

50. Егорова В.В., Гозите И.К., Колтушкина Г.Г., Уголев A.M. Сравнительная характеристика некоторых ферментов щеточной каймы, выделенных из состава мембран с помощью детергентов и протеаз // Докл. АН СССР. 1977. Т. 233. С. 487-490.

51. Егорова В.В., Никитина A.A., Хюттер Г.Ю. Сравнительная характеристика d- и р-форм некоторых собственно кишечных гидролаз у различных животных // Мембранный гидролиз и транспорт: Новые данные и гипотезы. Л.: Наука, 1986. С. 85 98.

52. Егорова В.И., Зайцев В.Ф., Егоров С.Н. Влияние состава корма на общую амилолитическую активность слизистой оболочки кишечника карпа // 1 Конгр. ихтиологов России. Тез. докл. Астрахань, 1997. С. 329.

53. Елецкий Ю., Цибулевский А.Ю. Ультраструктурные и молекулярные основы транспорта веществ через щеточную кайму энтероцита тонкой кищки // Успехи совр. биологии, 1979. Т. 87. С. 304 320.

54. Жадька Е.А., Арбузова JI.JL, Серков В.М. Гистоморфология внутренних органов костистых рыб: пищеварительная, дыхательная, репродуктивные системы. Владивосток: Изд-во Дальрыбвтуза, 1988. 86 с.

55. Жакоб Ф., Моно Ж. Биохимические и генетические механизмы регуляции в бактериальной клетке // Молекулярная биология: Проблемы и перспективы. М.: Мир. 1964. С. 14-39.

56. Зайцев В.Ф., Неваленный А.Н., Коростелев С.Г., Егоров С.Н. Влияние комбикормов на активность карбогидраз кишечника карпа // В сб. науч. тр. ВНИИПРХ. Водные биоресурсы и экология гидробионтов. Вып. 59. Москва, 1990. С. 117-118.

57. Закс JI. Статистическое оценивание: Пер. с нем. М.: Статистика, 1976.588 с.

58. Извекова Г.И., Лаптева H.A. Микрофлора, ассоциированная с пищеварительно-транспортными поверхностями рыб и паразитирующих в них цестод // Экология, 2004. №4. С. 205-209.

59. Ильина И.Д., Турецкий В.И. Развитие пищеварительной функции у рыб //Вопр. ихтиол., 1987. Т. 27, №5. С. 835 843.

60. Исаева Н.М., Козиненко И.И. Иммуномоделирующее действие бактерий (их продуктов) на рыб // Вопр. ихтиол. 1999. Т. 39, № 4. С. 527 534.

61. Кандюк Р.П. Терморезистентность пищеварительных ферментов некоторых рыб северо-западной части Черного моря // Физиологические основы экологии животных: Тез. докл. науч. совещ. Севастополь, 1965. С. 46.

62. Кандюк Р.П. Сравнительная оценка активности и термостабильности пищеварительных ферментов некоторых планктоноядных и бентосоядных рыб северо-западной части Черного моря // Тез. докл. Всес. совещ. по экол. физиол. рыб. М.: 1966а. С. 66-67.

63. Кандюк Р.П. О щелочной фосфатазе и энтерокиназе пищеварительного канала некоторых рыб северо-западной части Черного моря // Гидробиол. журн., 19666. Т. 2, № 5. С. 81 84.

64. Кандюк Р.П. Сравнительная оценка активности и термостабильности пищеварительных ферментов некоторых рыб северо-западной части Черного моря // Обмен веществ и биохимия рыб. М.: 1967а. С. 209 214.

65. Кандюк Р.П. Сравнительная оценка активности и термостабильности пищеварительных ферментов некоторых рыб северо-западной части Черного моря // Биохимия морских организмов. Киев, 19676. С. 122 133.

66. Кириленко Н.С., Доценко Н.В. Особенности пищеварения канального сома при выращивании на теплых водах // 8 Науч. конф. по экол. физиол. и биохимии рыб: Тез. докл. Петрозаводск, 1992. С. 141 142.

67. Комиссарчик Я.Ю., Уголев A.M. Ультраструктура и возможное функциональное значение гликокаликса микроворсинок кишечных клеток // Докл. АН СССР. Т. 184, №3. С. 731-733.

68. Коржуев П.А. Влияние высокой температуры на трипсин теплокровных и холодокровных животных // Физиол. журн. СССР. 1936. Т. 21. Вып. 3. С. 433 -437.

69. Коровина В.М., Васильева Н.Е. Сравнительное гистохимическое исследование средней кишки некоторых лососевых (Salmonidae) II Вопр. ихтиологии, 1971. Т. 11, №3. С. 502-508.

70. Коростелев С.Г. Температурная адаптация некоторых кишечных карбогидраз у рыб // Механизмы регуляции физиологических функций. Тез. докл. Ленинград, 1988. С. 53.

71. Коростелев С.Г. Температурные адаптации кишечной мальтазы ропшинской и украинской пород карпа // Тез. докл. VIII Науч. конф. по экол. физиол. и биохимии рыб. Т. 1. Петрозаводск, 1992. С. 162 163,

72. Коростелев С.Г., Егорова В.В. Исследование кишечной мальтазы карпа при различных температурах акклиматизации // В кн. Экол. Физиология и биохимия рыб. Тез. докл. 7 Всес. конф. Т. 1. Ярославль, 1989, С. 215 216.

73. Коростелев С.Г., Егорова В.В. Температурные адаптации некоторых ферментов кишечных микроворсинок карповых рыб // В сб. Физиология пищеварения и всасывания. Тез. докл. XV Всес. конф. Краснодар, 1990. С. 136.

74. Коростелев С.Г., Егорова В.В., Уголев A.M. О температурных адаптациях кишечной мальтазы карповых рыб // Журн. Эвол. Биох. и физиол., 1990. Т. 26, №6. С. 93 -94.

75. Коростелев С.Г., Неваленный А.Н. Влияние температуры на пищеварительно-транспортную функцию кишечника карповых рыб // Вопр. ихтиологии, 2005. Т. 45, №2. С. 225-235.

76. Кохменко Л.В. Питание микижи Salmo mykiss Walb. в некоторых водоемах Камчатки // Вопр. ихтиол. 1972а. Т. 12, № 2. С. 319 328.

77. Кохменко Л.В. Изменения размеров пищевых компонентов в зависимости от размера гольца Salvelinus alpinus (L.) II Изв. ТИНРО. 19726. Т. 82. С. 191 -197.

78. Коштоянц Х.С. Основы сравнительной физиологии. М.-Л.: Изд. АН СССР, 1950. Т. 1.524 с.

79. Коштоянц Х.С., Коржуев П.А. Материалы к сравнительной физиологии пищеварительных ферментов. I. Трипсин холоднокровных и теплокровных животных, температурный оптимум и теплоустойчивость их // Зоол. журн. 1934. Т. 13. Вып. 1.С. 71 -82.

80. Краюхин Б.В. Физиология пищеварения пресноводных костистых рыб. М.: Изд. АН СССР, 1963. 140 с.

81. Крепе Е.М. Липиды клеточных мембран. Эволюция липидов мозга, адаптационная функция липидов. Л.: Наука, 1981. 339 с.

82. Кузьмина В.В. Мембранное пищеварение у круглоротых и рыб // Вопр. ихтиологии, 1978. Т. 18, №14. С. 684 696.

83. Кузьмина В.В. Сезонные и возрастные изменения активности а-амилазы у лъщь Abramis brama (L.) И Вопр. ихтиол. 1980. Т. 20, № 1. С. 128 133.

84. Кузьмина В.В. Нутритивные адаптации ферментов, осуществляющих мембранное пищеварение у пресноводных костистых рыб // Журн. общ. биол. 1981. Т. 42, №2. С. 258-265.

85. Кузьмина В.В. Температурные адаптации ферментов, осуществляющих мембранное пищеварение у пресноводных костистых рыб // Ж. Общ. биол., 1985. Т. 46, №6. С. 824-837.

86. Кузьмина В.В. Общие закономерности мембранного пищеварения у рыб и его адаптивные перестройки: Автореф. дис. д-ра биол. наук. Л.: 1986а. 39 с.

87. Кузьмина В.В. Основные закономерности мембранного пищеварения у рыб // Мембранное пищеварение и всасывание. Тез. докл. III Всес. симп. Рига: Зинатне, 19866. С. 69-71.

88. Кузьмина В.В. Регуляторные свойства ферментов, обеспечивающих процессы мембранного пищеварения у рыб // Журн. общей биологии, 1987. Т. 48, №6. С. 828-838.

89. Кузьмина В.В. Синэкологические аспекты мембранного пищеварения у рыб // Мембрана щеточной каймы. Ферментативные и транспортные процессы в мембране щеточной каймы энтероцитов / Тез. докл. IV Всес. симп. Рига, 1990а. С. 69-70.

90. Кузьмина В.В. Биоценотические аспекты физиологии питания гидробионтов//Экология, 19906. №5. С. 52-58.

91. Кузьмина B.B. Характеристика ферментов, осуществляющих мембранное пищеварение у пластиножаберных рыб // Журн. эволюц. экологии и биохим., 1990в. Т. 26, №2. С. 161-166.

92. Кузьмина В.В. Особенности эволюции пищеварительно-транспортных функций у рыб // Журн. эволюц. физиол. и биохим. 1991. Т. 27, № 2.

93. Кузьмина В.В. Активность пищеварительных ферментов слизистой кишечника у различающихся по экологии костистых рыб Черного моря // Вопр. ихтиологии, 1992. Т. 32, № 2. С. 141 148.

94. Кузьмина В.В. Роль индуцированного аутолиза в процессе пищеварения у рыб // Физиол. журн. 1993. Т. 79, № 6. С. 102 108.

95. Кузьмина В.В. Особенности пищеварения у рыб (биоценотические аспекты) // Физиол. журн. 1996. Т. 82, № 3. С. 95 102.

96. Кузьмина В.В. Вклад индуцированного аутолиза в процессы пищеварения вторичных консументов (на примере гидробиотов) // Докл. РАН. 2000. Т. 373, № 1.С. 132-134.

97. Кузьмина В.В. Физиологические адаптации (на примере процесса экзотрофии у рыб) // Ж. эволюц. Биохимии и физиол. 2001. Т. 37, №3. С. 215224.

98. Кузьмина В.В. Физиология питания рыб. Новые факты и гипотезы // Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов / Матер. Межд. Конф. Петрозаводск, 2004. С. 74.

99. Кузьмина В.В., Голованова И.Л. Влияние pH на активность карбогидраз слизистой кишечника рыб // Вопр. ихтиол. 1980. Т. 20, № 3. С. 566 571.

100. Кузьмина В.В., Голованова И.Л. Влияние антропогенных факторов на активность пищеварительных ферментов рыб // Биол. внутр. вод, 1998. №3. С. 71-76.

101. Кузьмина В.В., Голованова И.Л. Вклад карбогидраз объектов питания в процессы пищеварения хищных рыб // Журн. вопр. ихтиологии. 2001. Т. 41, № 5. С. 691-698.

102. Кузьмина В.В., Кузьмина Е.Г. Характеристика некоторых ферментов пищеварительного тракта стерляди Acipenser ruthenus II Вопр. ихтиологии, 1991. Т. 31, №2. С. 306-313.

103. Кузьмина В.В., Морозова E.H. Влияние температуры на активность а -амилазы у пресноводных костистых рыб // Вопр. ихтиологии, 1977. Т. 17, № 5. С. 922 929.

104. Кузьмина В.В., Неваленный А.Н. Влияние концентрации водородных ионов на активность карбогидраз пищеварительного тракта рыб // Вопр. ихтиологии, 1983. Т. 23, № 3. С. 481 -490.

105. Кузьмина В.В., Неваленный А.Н. Температурные адаптации // Физиология адаптационных процессов. Руководство по физиологии. М.: Наука, 1986. С. 394-403.

106. Кузьмина В.В., Перевозчикова О.Б. Роль экзоферментов в процессах пищеварения рыб //Биол. внутр. вод. Информ. бюлл. 1989. № 80. С. 60-63.

107. Кузьмина В.В., Поддубная Е.А. Уровень активности пищеварительных ферментов карпа при акклимации рыб к высоким температурам // Биол. внутр. вод, 1986. №71. Р. 35-38.

108. Кузьмина В.В., Скворцова Е.Г. Активность протеолитических ферментов потенциальных объектов питания хищных рыб. Влияние природных и антропогенных факторов // Вопр. ихтиологии, 2001. Т. 41, №2. С. 239-248.

109. Кузьмина В.В., Скворцова Е.Г. Активность протеиназ энтеральной микробиоты рыб: ревизия методических подходов // Журн. биол. внутренних вод, 2002. №3. С. 76-83.

110. Кузьмина В.В., Скворцова Е.Г. Вклад протеолитических ферментов объектов питания в процессы пищеварения хищных рыб // Вопр. ихтиологии, 2003. Т. 43, №2. С. 209-214.

111. Кузьмина В.В., Таликина М.Г. Влияние экстремальных воздействий в период раннего индивидуального развития на пищеварительные гидролазы сеголеток плотвы Rutilus rutilus II Вопр. ихтиол. 1998. Т. 38, № 4. С. 524 529.

112. Кузьмина В.В., Цветкова В.А. Индуцированный аутолиз: роль в процессах пищеварения рыб // Журн. биол. внутренних вод, 2001. №3. С. 3-10.

113. Кузьмина В.В., Голованова И.Л., Комов В.Т. Особенности процессов пищеварения у окуня Perca fluviatilis из «кислых» озер Дарвиновского заповедника (Вологодская область) // Вопр. ихтиол. 1998. Т. 38, № 3. С. 365 -370.

114. Кузьмина В.В., Голованова И.Л. Механизмы температурных адаптаций пищеварительной системы гидробионтов // Физиол. механ. природ, адапт. Тез. докл. 3-го Всерос. междунар. симп. Иваново, 1999. С. 93 94.

115. Кузьмина В.В., Помазанская Л.Ф., Забелинский С.А., Пустовой В.К. Жирнокислотный состав липидов слизистой кишечника пресноводных костистых рыб // Журнал эвол. биохимии и физиол. 1982. Т. 18, № 6. С. 538 -563.

116. Кузьмина В.В., Скворцова Е.Г., Первушина К.А. Активность протеаз энтеральной микробиоты рыб: влияние температуры и pH // Журн. биол. внутр. вод. 2002. № 4. С. 69 74.

117. Куперман Б.И., Кузьмина В.В. Ультраструктура кишечного эпителия щуки Exos luclus L. II Вопр. ихтиологии, 1984. Т. 24. Вып. 3. С. 431 437.

118. Куперман Б.И., Кузьмина В.В. Структурная и функциональная топография кишечника рыб разных экологических групп // Экологическая физиология и биохимия рыб. Вильнюс, 1985. С. 489 490.

119. Куперман Б.И., Веригина И.А., Кузьмина В.В. Ультраструктура кишечного эпителия налима Lota lota (L.) (Gadidae) II Вопр. ихтиологии, 1985. Т. 25, №2. С. 275-282.

120. Кушак Р.И. Пищеварительно-транспортная система энтероцитов. Рига: Зинанте, 1983. 304 с.

121. Лакин Г.В. Биометрия: Учебное пособие для биологических специальностей вузов. 4-ое изд. перераб. и допол. М.: Высш. шк., 1990. 352 с.

122. Лизосомы. Методы исследования / Под. ред. Дж. Дингла. М.: Мир, 1980.342 с.

123. Лондон Е.С. Физиология и патология пищеварения. СПб.: Прогресс, 1916. 168 с.

124. Лукьяненко В.И. Экологические аспекты ихтиотоксикологии. М.: Агропромиздат, 1987. 240 с.

125. Мальдов Д.Г. Характеристика индукции ферментов пищеварительного тракта осетровых // 1 Конгр. ихтиологов России. Тез. докл. Астрахань, 1997. С. 229-230.

126. Мальдов Д.Г., Голованова Т.С., Ермолов Г.Н., Никоноров С.И. Соотношение активности липазы и общей эстеразы в пищеварительном тракте осетровых //1 Конгр. ихтиологов России. Тез. докл. Астрахань, 1997. С. 230.

127. Мальдов Д.Г., Савушкина С.И. Влияние кормов на активность протеаз и амилаз пищеварительного тракта сибирского осетра // 1 Конгр. ихтиологов России. Тез. докл. Астрахань, 1997. С. 332.

128. Мембранный гидролиз и транспорт: Новые данные и гипотезы / Под. ред. А.М.Уголева. Л.: Наука, 1986. 240 с.

129. Мечников И.И. (1880) О внутриклеточном пищеварении у кишечнополостных // Акад. собр. соч. М.: Изд-во мед. лит., 1954. Т.5. С. 9-10.

130. Михайлова M.B. Гистохимические исследования пищеварительной системы ранней молоди белорыбицы в зависимости от рационов питания и температуры выращивания // Каспийский Плавучий Ун-т. 2000. № 1. С. 141 -142.

131. Неваленный А.Н. Влияние температуры на эффективность функционирования транспортных систем кишечника рыб: Автореф. дис. канд. биол. наук. М., 1987. 19 с.

132. Неваленный А.Н. Функциональная организация и адаптивная регуляция процессов пищеварения у рыб в различных экологических условиях: Автореф. дис.докт. биол. наук. М., 1996. 35 с.

133. Неваленный А.Н., Егоров С.Н. Суточная динамика суммарной карбогидразной активности кишечника карпа Cyprinus carpió, выращиваемого в прудовых условиях // Вопр. ихтиологии, 1995. Т. 35, № 4. С. 549 552.

134. Неваленный А.Н., Коростелев С.Г. Влияние температуры акклимации на температурные характеристики мальтазы слизистой кишечника карповых рыб // Вестник АГТУ. Сб. научных трудов. Экология, Астрахань: изд-во АГТУ, 1998. С. 92 -95.

135. Неваленный А.Н., Коростелев С.Г. Влияние модификаторов на процесс мембранного пищеварения у сибирского осетра Acipenser baeri // Ж. эволюц. биох. и физиол., 2002. Т. 38, № 2. С. 185 187.

136. Неваленный А.Н., Туктаров A.B. Исследование процессов аккумуляции углеводов и аминокислот в кишечнике осетровых рыб // Межд. конф. Осетровые на рубеже 21 века. Тез. докл. Астрахань, 2000. С. 178 179.

137. Неваленный А.Н., Егоров С.Н., Зайцев В.Ф., Егорова В.И. Суточная динамика активности кишечных карбогидраз белого амура // 8 Научн. конф. по экол. физиол. и биохимии рыб: Тез. докл. Т. 2. Петрозаводск, 1992. С. 19 -20.

138. Неваленный А.Н., Егоров С.Н., Коростелев С.Г. Исследование адаптации пищеварительной функции у рыб // 1 Конгр. ихтиологов России, Астрахань, 1997а. Тез. докл. С. 334-335.

139. Неваленный А.Н., Егоров С.Н., Коростелев С.Г., Зайцев В.Ф. Суточная динамика активности некоторых кишечных ферментов карпа // Комбикорма и обмен веществ у рыб. Сб. научн. трудов КТИРПХ. Калининград, 1991. С. 53 -60.

140. Неваленный А.Н., Коростелев С.Г., Витвицкая Л.В., Егорова В.И. Нутритивные адаптации процесса пищеварения у осетровых рыб // ДАН, 1997в. Т. 352, №6. С. 837-839.

141. Неваленный А.Н.,Коростелев С.Г., Егоров С.Н. Активность некоторых пищеварительных ферментов рыб ильменя Горчичный // Вестн. Астрыбвтуза. Астрахань, 1993. № 1. С. 91 93.

142. Неваленный А.Н.,Коростелев С.Г., Егоров С.Н. Взаимодействия пищевых веществ в процессе пищеварения у рыб на примере карпа СурпшдБ сагрю // Ж. эволюц. биохимии и физиол., 1996. Т. 32, № 2. С. 156 159.

143. Неваленный А.Н., Коростелев С.Г., Пак У.Е. Активность а-амилазы у личинок белого и пестрого толстолобиков при выращивании на различных кормах // IV Всес. конф. по раннему онтогенезу рыб. Тез. докл. Т. 2. Москва, 1988. С. 25 -27.

144. Неваленный А.Н., Туктаров A.B., Бедняков Д.А. Интенсивность всасывания углеводов и аминокислот в кишечнике белуги и бестера // Вестн. Астрахан. гос. техн. ун-та. Рыбное хозяйство. 2000. С. 116-119.

145. Неваленный А.Н., Туктаров A.B., Бедняков Д.А. Функциональная организация и адаптивная регуляция процессов пищеварения у рыб // Астрахань, ФГОУ ВПО «Астр. гос. техн. ун-т». 2003. 152 с.

146. Неваленный и др.) A.N. Nevalyonny, V.F. Zaitsev, S.N. Yegorov, S.G. Korostelyov. Effect of water PH different valves on activity of some digestive enzymes in carp (Cyprinus Carpió L.) II Acta Ichthyologica et piscatoria, 1991. Vol. 21, f. l.P. 59-63.

147. Немова H.H., Высоцкая Р.У. Биохимическая индикация состояния рыб. М.: Наука, 2004.215 с.

148. Никитина A.A., Тимофеева Н.М. Пищеварительные гидролазы гепатопанкреаса речного рака Astacus astacus II Журн. Эволюц. Биохимии и физиологии. 1995. Т. 31, № 5,6. С. 538 544.

149. Никитина A.A., Тимофеева Н.М. Температурные адаптации мальтазы и щелочной фосфатазы гепатопанкреаса речного рака Astacus astacus II Журн. эволюц. биохимии и физиологии. 1997. Т. 33, № 6. С. 585 591.

150. Номенклатура ферментов / Под. ред. А.Е. Браунштейна. М.: Изд. ВИНИТИ, 1979.316 с.

151. Озернюк Н.Д. Температурные адаптации у рыб: феноменология и механизмы // Современные проблемы физиологии и экологии морскихживотных (рыбы, птицы, млекопитающие). Тез. докл. междунарю семинара. Ростов-на-Дону, 2002. С. 126- 128.

152. Остроумова И.Н. Особенности роста, физиологии и пищевых потребностей карпа при разных температурах // Сб. науч. тр. Гос. НИИ оз. и реч. рыб. х-ва, 1986. № 246. С. 5 -16.

153. Остроумова И.Н. Особенности пищевых потребностей у рыб с различной температурой обитания и пути повышения эффективности их кормления // Сб. науч. тр. Гос. НИИ оз. и реч. рыб. х-ва НПО по пром. и тепловод. рыбвод, 1988. №275. С. 5 -25,158.

154. Павлов И.П. (1897) Лекции о работе главных пищеварительных желез // Полн. собр. соч. М. -Л.: Изд. АН СССР, 1951. Т. 2, кн. 2. 522 с.

155. Пегель В.А. Физиология пищеварения рыб. Томск: Изд. Томского университета, 1950. 199 с.

156. Пегель В.А., Антипин A.C. Влияние температуры, сезона и питания на амилолитическую активность кишечника пресноводных рыб // Морфо-физиологические и биохимические механизмы адаптации животных к факторам среды. Краснодар, 1972. С. 208.

157. Пегель В.А., Антипин A.C. Влияние некоторых эндогенных и экзогенных факторов на амилолитическую активность пристеночного и полостного пищеварения рыб // Экологическая физиология рыб. М.: Наука, 1973. С. 171 -173.

158. Пегель В.А., Реморов В.А., Антипин A.C., Новак В.А. Исследование пристеночного и полостного пищеварения в кишечнике разных видов пресноводных рыб // Научн. докл. высш. школы. Биологические науки. 1971. № 10. С. 30-33.

159. Пономарев В.И. Температурная зависимость гидролиза белков и углеводов в пищеварительном тракте у молоди семги р. Щугор // Физиол. мор. животных: Тез. докл. Всес. конф., Мурманск, 1989. С. 50.

160. Пономарев В.И. Влияние температуры на общую амилолитическую активность слизистой кишечника у некоторых видов рыб бассейна р. Печора // Вопр. ихтиол. 1991. Т. 31, № 2. С. 292 299.

161. Пономарев В.И. Влияние температуры и особенностей питания на характеристики а-амилазы рыб Севера // Экология, 1992. № 5. С. 50 55.

162. Пономарев В.И. Межсезонные изменения уровня активности пищеварительных ферментов у рыб северных широт // Вопр. ихтиологии, 1993а. Т. 33, №3. С. 401 -406.

163. Пономарев В.И. Соотношение активности гидролаз, обеспечивающих процессы полостного и мембранного пищеварения у рыб северных широт // Вопр. ихтиологии, 19936. Т. 33, № 5. С. 728 731.

164. Пономарев В.И. Влияние характера питания на активность пищеварительных гидролаз у рыб бассейна р. Печоры // Экология, 1994. № 5 -6. С. 88-90.

165. Пономарев В.И. Динамика активности пищеварительных ферментов в онтогенезе у хариуса и молоди семги // Онтогенез. 1995. Т. 26, № 5. С. 376 -383.

166. Пономарев В.И. Адаптация пищеварительной системы рыб к условиям севера//1 Конгр. ихтиологов России. Тез. докл. Астрахань, 1997. С. 234.

167. Правдин И.Ф. Руководство по изучению рыб (преимущественно пресноводных). 4-ое изд. перераб. и доп. М.: Пищевая промышленность, 1966. 376 с.

168. Проссер Л., Браун Ф. Сравнительная физиология животных: Пер. с англ. М.: Мир, 1967. 766 с.

169. Пучков Н.В. Физиология рыб. М.: Пищепромиздат, 1954. 339 с.

170. Пятницкий Н.П. Об изменчивости пепсина // Сб. докл. XI Всес. съезда физиол., биохим., фармокол. Тбилиси, 1937. С. 499 500.

171. Рабинович А.Л., Рипатти П.О. Свойства ненасыщенных жирнокислотных цепей природных липидов (компьютерное моделирование) // Современныепроблемы физиологии и биохимии водных оргаизмов. Матер, междунар. конф. Петрозаводск, 2004. С. 114-115.

172. Решетников Ю.С., Котляр А.Н., Расе Т.С., Шатуновский М.И. Пятиязычный словарь названий животных. Рыбы. Латинский-русский-английский-неме^кий-французский. М.: Рус. яз., 1989. 734 с.

173. Реснянский В.В. Циркадианная ритмика активности пищеварительных ферментов у молоди белорыбицы при прудовом выращивании // Каспийский Плавучий Ун-т. 2000. № 1. С. 150- 151.

174. Савваитова К.А., Максимов В.А., Мина М.В., Новиков Г.Г., Кохменко Л.В., Мацук В.Е. Камчатские благородные лососи (систематика, экология, перспективы использования как объекта форелеводства и акклиматизации). Воронеж: Изд-во ВГУ, 1973. 120 с.

175. Свирский A.M., Извеков Е.И. Основные принципы и механизмы температурной адаптации рыб // Физиологические механизмы природных адаптаций. Тез. докл. 3-го Всерос. междунар. симп. Иваново, 1999. С. 133 134.

176. Селье Г. Очерки об адаптационном синдроме. М.: Медгиз. 1960. 254 с.

177. Селье Г. На уровне целого организма. М.: Наука. 1972. 122 с.

178. Словарь физиологических терминов / Ред. акад. О.П. Газенко. М.: Наука, 1987.448 с.

179. Соболев Л.Б. Морфофункциональная характеристика пищеварительной системы молоди карпа, выращиваемоц в прудах: Автореф. дисс. . канд. биол. наук, 1991.24 с.

180. Сорвачев К.Ф. Основы биохимии питания рыб. М.: Легкая и пищевая промышленность, 1982. 247 с.

181. Смирнов К.В., Уголев A.M. Космическая гастроэнтерология: Трофологические очерки. М.: Наука, 1981. 278 с.

182. Смирнов Л.П., Богдан В.В. К вопросу о температурной преадаптации жирнокислотных составов липидов у эктотермных животных // Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов. Матер, междунар. конф. Петрозаводск, 2004. С. 129 130.

183. Строганов Н.С. Экологическая физиология рыб. М.: Изд. МГУ, 1962.348 с.

184. Строганов Н.С., Бузинова Н.С. Активность ферментов пищеварительного тракта белого амура. Сообщение 1. Амилаза и липаза // Вестник МГУ им. М.В. Ломоносова. Сер. Биология. М.: Изд-во МГУ, 1969. № 3. С. 2 5.

185. Суворова Е.Г., Трещук Л.И. Морфология и гистохимия желудочно-кишечного тракта белого байкальского хариуса Thymllus arcticus baicalensis Dyb. II Вопр. ихтиологии, 1973. Т. 13. №3 (80). С. 523 534.

186. Тиллер И.В., Введенская Т.Л. Питание проходной формы и молоди гольца Salvelinus alpinus sensu lato в реке Хайлюля (Камчатка) // Вопр. ихтиол. 1988. Т. 28, № 1.С. 103 109.

187. Тимейко В.Н. Активность кишечной аланинаминопептидазы у личинок ладожской палии Salvelinus lepechini, акклимированных в процессе эмбрионального развития к различным температурам // Вопр. ихтиологии, 2001. Т. 41, №2. С. 253-260.

188. Тимофеева Н.М., Иезуитова H.H., Черняховская М.Ю., Де Лей П., Уголев A.M. Взаимодействие трибутирина, дипептидаз и сахарозы при их гидролизе слизистой тонкой кишки // Докл. АН СССР. 1967. Т. 176. С. 1451 1454.

189. Токранов A.M., Максименков В.В. Особенности питания звездчатой камбалы Platichthys stellatus в эстуарии р. Большая (Западная Камчатка) // Вопр. ихтиол. 1993. Т. 33, № 4. С. 561 565.

190. Трофимова J1.H., Щербина Т.В., Щербина М.А. Активность пищеварительных ферментов карпа при различном уровне белка в рационах и ее изменение при смене рационов // Тр. ВНИИПРХ. М. 1975. Т. 24. С. 62 70.

191. Туктаров A.B. Влияние ионов металлов на пищеварительно-транспортную функцию кишечника осетровых рыб: автореф. дис.канд. биол. наук. Астрахань, 2002. 21 с.

192. Уголев A.M. О существовании пристеночного (контактного) пищеварения // Бюлл. экспер. биол. и мед., 1960а. Т.49, №1. С.12-17.

193. Уголев A.M. Некоторые общие закономерности полостного и пристеночного пищеварения // Тр. науч. конф. по пробл. физиол. и патол. пищеварения, поев, памяти акад. K.M. Быкова. Иваново, 19606. С. 829-834.

194. Уголев A.M. Пищеварение и его приспособительная эволюция. М.: Высшая школа, 1961. 306 с.

195. Уголев A.M. Пристеночное (контактное) пищеварение. M.-JL: Изд. АН СССР, 1963. 107 с.

196. Уголев A.M. Взаимоотношение пищеварительных и всасывательных процессов в кишечной клетке // Физиология и патология всасывания в желудочно-кишечном тракте. Материалы симпоз. Одесса, 1964. С. 7-20.

197. Уголев A.M. Эволюционные аспекты пристеночного пищеварения // Четвертое научн. совещ. по эволюцион. физиолог., поев, памяти акад. JI.A. Орбели. Л.: 1965а. С. 260 261.

198. Уголев A.M.) Ugolev A.M. Membrane (contact) digestion // Physiol. Rev. 1965b. V. 45, №3. P. 555-595.

199. Уголев A.M. Физиология и патология пристеночного (контактного) пищеварения. Л.: Наука, 1967. 230 с.

200. Уголев A.M. Определение амилолитической активности // Исследование пищеварительного аппарата у человека (обзор современных методов). Л.: Наука, 1969. С. 187 192.

201. Уголев A.M. Организация и регуляция процессов мембранного пищеварения и транспорта // Физиол. журн. СССР. 1970. Т.56. С.651-662.

202. Уголев A.M. Мембранное пищеварение. Полисубстратные процессы, организация и регуляция. JI.: Наука, 1972а. 358 с.

203. Уголев A.M. Мембранное пищеварение и процессы усвоения пищи в мире животных // Журн. эволюционной биохим. и физиологии, 19726. Т. 8, №3. С. 269 278.

204. Уголев A.M.) Ugolev A.M. Membrane (contact) digestion // Intestinal absorption / Ed. by D.H. Smyth. London, New-York: Plenum Press. 1974. P. 285362. (Biomembranes, Vol. 4A).

205. Уголев A.M. Структурная и функциональная интеграция процессов мембранного гидролиза и транспорта (гипотеза «пермеома») // Физиол. журнал СССР. 1977. Т.63. С.181-190.

206. Уголев A.M. Энтериновая (кишечная гормональная) система. Л.: Наука, 1978.314 с.

207. Уголев A.M. Эволюция пищеварения и некоторые принципы эволюции функций // Журн. эволюц. биохим. физиол., 1979. Т. 15. С. 239 248.

208. Уголев A.M. Трофология новая междисциплинарная наука // Вестник АН СССР. 1980. № 1.С. 50-61.

209. Уголев A.M. Гипотеза о возможности -эволюции и специализации функций на основе рекомбинации и транспозиции элементарных функциональных блоков //Журн. эволюц. биохим. физиол., 1982. Т. 18. С.11 -26.

210. Уголев A.M. Функциональная эволюция и гипотеза функциональных блоков // Журн. эволюц. биохим. физиол., 1983. Т. 19. С. 390 399.

211. Уголев A.M. Эволюция пищеварения и принципы эволюции функций: элементы современного функционализма. Л.: Наука, 1985. 544 с.

212. Уголев A.M. Естественные технологии биологических систем. JI.: Наука, 1987.317 с.

213. Уголев A.M. Трофология и система наук о биосфере // Научное и социальное значение деятельности В.И. Вернадского. Д., 1989. С. 54-73.

214. Уголев A.M. Концепция универсальных функциональных блоков и дальнейшее развитие учений о биосфере, экосистемах и биологических адаптациях // Журн. эвол. физиол. и биохим., 1990. Т. 26, № 4. С. 441 454.

215. Уголев A.M., Иезуитова Н.Н. Определение активности инвертазы и других дисахаридаз // Исследование пищеварительного аппарата у человека (обзор современных методов). Л.: Наука, 1969. С. 192 196.

216. Уголев A.M., Иезуитова Н.Н.) Ugolev A.M., Iezuitova N.N. Membrane digestion and modern concept of food assimilation // World Rav. Nutr. Diet. 1982. Vol. 40. P. 113-187.

217. Уголев A.M., Кузьмина B.B. Пищеварительные процессы и адаптации у рыб. СПб: Гидрометеоиздат, 1993. 238 с.

218. Уголев A.M., Смирнова Л.Ф. Пищеварительно-транспортный конвейер // Физиология всасывания / Под ред. A.M. Уголева. Л.: Наука, 1977. С. 489-523.

219. Уголев A.M., Цветкова В.А. Индуцированный аутолиз как важный механизм начальных стадий пищеварения в естественных условиях // Физиол. журн. СССР, 1984. Т.70. С. 1542-1550.

220. Уголев A.M., Смирнова Л.Ф., Тимофеева Н.М. Спонтанная солюбилизация дипептидаз с поверхности интактной кишечной слизистой // Докл. АН СССР, 1975. Т. 221. С. 984-986.

221. Уголев A.M., Гельман А.Г., Гредин В.Г. Некоторые характеристики ферментов, осуществляющих мембранное пищеварение у рыб // Экологическая физиология рыб: Тез. докл. Киев: Наукова думка, 1976. Т. 2. С. 78.

222. Уголев A.M., Митюшова H.M., Егорова B.B. Регуляторные свойства пищеварительных ферментов и биология многосубстратных пищеварительных процессов // Журнал эволюц. биохим. физиолог. 19776. Т. 13. С. 589-599.

223. Уголев A.M., Иезуитова H.H., Цветкова В.А. Эволюционная физиология пищеварения // Руководство по физиологии. Эволюционная физиология / Под ред. Е.М. Крепса. Л.: Наука, 1983. С. 301-370.

224. Уголев A.M., Груздков A.A., Иезуитова H.H., Митюшова Н.М., Тимофеева В.А., Цветкова В.А. Ферментные адаптации как интегративныесистемные реакции // Мембранный гидролиз и транспорт. Новые данные и гипотезы. Л.: Наука, 1986а. С. 64-72.

225. Уголев A.M., Тимофеева Н.М., Груздков A.A. Адаптация пищеварительной системы // Физиология адаптационных процессов. М.: Наука, 19866. С. 371-481.

226. Ушаков В.Б. Естественный отбор, температура среды и теплоустойчивость клеток животных // Журн. эволюц. биохим. и физиол., 1974. Т. 10. С. 3-6.

227. Ушаков В.Б. Физиологический анализ изменений приспособленности особей в онтогенезе и селективного преимущества гетерозигот // Журн. общ. биологии, 1984. Т. 45, № 5. С. 602 614.

228. Фандж Р., Гроув Д. Пищеварение // Биоэнергетика и рост рыб. М.: Легкая и пищевая промышленность, 1983. С. 112 202.

229. Халилов Ф.К. Материалы по морфологии и гистологии пищеварительной системы костистых рыб. Алма-Ата: Мектеп, 1969. 131 с.

230. Хаблюк В.В., Проскуряков М.Т. Состав панкреатических протеиназ карпа и особенности их физико-химических свойств, связанные с отсутствием желудка // Прикладная биохим. и микробиол. 1983. Т. 19, № 3. С. 403 407.

231. Хочачка П. Сомеро Д. Стратегия биохимической адаптации: Пер. с англ. М.: Мир, 1977.360 с.

232. Хочачка П. Сомеро Д. Биохимическая адаптация: Пер. с англ. М.: Мир, 1988. 568 с.

233. Чукаловская Р.Н. Гистология рыб. Л.: Изд. Ленингр. ветеринарн. ин-та, 1971. 175 с.

234. Щербаков Г.Г. Сравнительно-физиологические исследования пристеночного (мембранного) пищеварения у кур, рыб и млекопитающих: Автор, дис. канд. биол. наук. Л, 1969а. 21 с.

235. Щербаков Г.Г. Некоторые кинетические характеристики пептидазы и мальтазы у птиц и рыб // Сб. работ Ленинградского ветерин. ин-та, 19696. Вып. 30. С. 29-31.

236. Шпарковский И.А. Физиология пищеварения рыб: Двигательная функция. Л.: Наука, 1986. 176 с.

237. Щербина М.А. Переваримость и эффективность использования питательных веществ искуственных кормов прудовыми рыбами. М.: Легкая и пищевая промышленность, 1973. 132 с.

238. Щербина М.А, Рекубратский Н. В, Киселев А.Ю. Методические указания по оценке эффективности применения комбикормов в прудовых хозяйствах на основе определения суточных рационов рыб // М.: ВНИИ прудового рыб. х-ва, 1987. 40 с.

239. Щербина М.А, Трофимова Л.Н, Казлаускене О.П. Активность протеаз и интенсивность резорбции протеина при введении в рацион карпа различных количеств жира// Вопр. ихтиол, 1976. Т. 16, № 4. С. 698 702.

240. Щербина М.А, Щербина Т.В, Казлаускене О.П. Активность амилазы и интенсивность резорбции углеводов при введении в рацион карпа различных количеств жира // Вопр. ихтиол, 1977. Т. 17, № 3. С. 366 369.

241. Щербина М.А., Эрман Е.З. Изменение концентрации водородных ионов в содержимом кишечника карпов в процессе продвижения кормов по пищеварительному тракту // Сб. научн. тр. ВНИИ прудового рыб. х-ва, 1971. Вып. 18. С. 263 -266.

242. Щербина Т.В. Влияние качественного состава пищи на активность амилолитических ферментов у карпа: Автореф. дис. канд. биол. наук. Д., 1978. 25 с.

243. Щербина Т.В. О температурном оптимуме активности кишечной амилазы карпа // Сб. научн. тр. ВНИИ прудового рыб. х-ва, 1984(1985). Вып. 42. С. 103 106.

244. Хаблюк В.В., Проскуряков М.Т. Состав панкреатических протеиназ карпа и особенности их физико-химических свойств, связанные с отсутствием желудка // Методы интенсиф. пруд, рыбов.: Тез. докл. Всес. конф. мол. уч. Москва, 1984. С. 80-81.

245. Хюттер Г.Ю., Егорова В.В., Никитина A.A. Физиология гидрофобного домена. // Физиологический журнал СССР. 1986. Т. 61, № 4. С. 425-430.

246. Элер A.A. Некоторые данные о влиянии введенного инсулина на у-амилазную, мальтазную и глицил-Ь-лейциндипептидазную активность в пищеварительном тракте карпа // Механизмы регуляции функций организма при экстремальных воздействиях. Томск, 1981. С. 56 58.

247. Элер A.A., Пегель В.А. Некоторые данные о влиянии инсулина на активность собственно кишечных ферментов рыб // Тез. докл. IV Всесоюзн. конф. по эколог, физиол. и биохим. рыб. Астрахань, 1979. Т. 2. С. 39.

248. Al-Hussaini А.Н. On the functional morphology of the alimentary tract of some fish in relation to differences in their feeding habits: anatoma and histology // Quatr. 3. Microscop. Sei., 1949, Vol. 90, part 2. P. 102 139.

249. Alliot E., Febre A., Metailler R. Les proteases digestives chez un teleosteen carnivore Dicentrus labraxll Ann. biol. anim. biochim. biophys., 1974. Vol. 14. P. 23 -35.

250. Alpers D.H. Digestion and Absorption of Carbohydrates and Proteins // Physiology of the Castrointestinal Tract / Second Edition, ed. L.R. Johnson. New York: Raven Press. 1987. Ch. 53. P. 1469-1487.

251. Alpers D.H. Protein synthesis in intestinal mucosa: the effect of route of administration of precursors amino acids // J. Clin. Invest. 1972. vol. 51. P. 167-173.

252. Alpers D.H. Protein turnover in intestinal mucosal villus and crypt brush border membranes // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1977. vol. 75. P. 130-135.

253. Alpers D.H. Digestion and absorption of carbohydrates and proteins // Physiology of the gastrointestinal tract / Ed. L.R. Jonson. New York: Raven Press, 1987. Vol. 2. P. 1469-1487.

254. Alpers D.H., Goodwin C. Effect of size and anatomic location on the degradation rate of intestinal brush border proteins // Gastroenterology. 1971. vol. 60. P. 760 (Abstr.).

255. Anisul I. Crossocheilus latius latius. Morpho-histology of the alimentary canal of Crossocheilus latius latius //Bangladesh J. Zool., 1987. Vol. 15, № 1. C. 31 35.

256. Arrelano J., Dinis M.T., Sarasquete C. Histomorphological and histochemical characteristics of the intestine of the Senegal sole Solea senegalensis II Eur. J. Histochem, 1999. Vol. 43, № 2. P. 121 133.

257. Arrhenius S. Über die Reaktionsgeschwindigkeit bei der Inversion Rohrzucker durch Säuren // Z. Physic. Chem. 1889. Vol. 4. P. 226 238.

258. Artenie V., Misaila E.R., Human A., Misaila C. The activity of some enzymes of the digestive tube of the rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) foddered with diet supplemented with carotenes // Pesce, 2000. Vol. 17, № 2. P. 29 31.

259. Asgearsson В., Hartemink R., Chlebowski J.F. Alkaline phosphatase from Atlantic cod (Gadus morhua). Kinetic and structural properties which indicate adaptation to low temperatures // Compar. Biochem. and Physiol. 1995. Vol. 110B, №2. P. 315-329.

260. Ash R. Hydrolytic capacity of the trout (Salmo gairdneri) intestinal mucosa with respect to three specific dipeptides //Сотр. Biochem. Physiol. 1980. Vol. 65. P. 173-176.

261. Ash R., McLean E. Intact protein absorption in teleosts: comparative considerations // Arch. Int. Physiol, et Biochim., 1989. Vol. 97, № 5. C. 4.

262. Bakke-McKellep A.M., Nordrum S., Krogdahl A., Buddington R.K. Absorption of glucose, amino acids and dipeptides by the intestines of Atlantic salmon (Salmo salar L.) 11 Fish Physiol, and Biochem., 2000. Vol. 22, № 1. P. 33 -44.

263. Barnard E.) Барнард E. Пищеварение: Пер. с англ. // Сравнительная физиология животных / Под ред. JI. Проссера. М.: Мир, 1977. Т.1. С. 286-296.

264. Barrington E.J.W. The alimentary canal and digestion // Physiology of Fishes. № 4. Acad.Press., 1957. Vol. 1. P. 109-161.

265. Barrington E.J.W. Digestive enzymes // Adv. Сотр. Biochem. Physiol. 1962. Vol.1. P. 1-65.

266. Bell M.V., Henderson R.J., Sargent J.R. The role of polyunsaturated Fatty acids in fish // Сотр. Biochem. Physiol. Vol. 83B, № 4. 1986. P. 711 719.

267. Bergot P. Demonstration pur le rounge de ruthenium d'invasinations profondes de la membrane plasmique applicale des enterocytes dans l'intestin posterieur ches la bruite arcenciel // Ann. Biol. Anim. Biochim. Biophys., 1976. Vol. 16, №1. P. 37-42.

268. Bergot P., Flechon J. Forme et voie d'absorption intestionale des acides gras a'chaine longue ches la truite arcen-cicl (Salmo gairdneri Rich.). I. Lipides en particules // Ann. Biol. Anim. Biochim. Biophys., 1970. Vol 10, № 3. P. 459 472.

269. Birktoft J.J., Blow D.M., Henderson R., Steitz T.A. Chymotrypsin structure // Phil. Trans. Roy. Soc. London, 1970. Vol. 257B. P. 67 76.

270. Boge G., Rigal A., Perez G. Rates of in vivo intestinal absorption of glycylglycine by rainbow trout (Salmo gairdneri Rich.) II Comp. Biochem. Physiol. 1981. Vol. 69. P. 455-459.

271. Bozic F., Srebocan E., Kozaric Z. Starvation-induced pathobiology in the gut of carp {Cyprinus carpio L.) И Berlin, und munch, tierarztl. Wochenschr., 2001. Vol. 114, №3-4. P. 134-138.

272. Brasitus T.A., Schachter D. Membrane lipids can modulate quanylate cyclase activity of rat intestinal microvillus membranes // Biochim. Biophys. Acta. 1980. № 1. Vol. 63B. P. 152- 156.

273. Brasitus T.A. Protein lipid interactions and lipid dynamics in rat enterocyte plasma membranes // Intestinal Transport Ed. by Gilles-Baillien N.R.C. Berlin-Heidelberg-New York-Tokyo. 1983. P. 183 - 197.

274. Brasitus T.A., Schachter D., Mamoneas T.G. Functional interactions of lipids and proteins in rat intestional microvillus membranes // Biochemistry. 1979. Vol. 18, № 19. P. 4136-4144.

275. Brunner J., Hauser H., Braun H., Wilson K.J., Wacker H., O'Neil В., Semensa G. The mode of association of the enzyme complex sucrase-lsomaltase with the intestinal brush border membrane // J. Biol. Chem. 1979. Vol. 254. P. 1821-1828.

276. Buddenbrock W. Vergleichende Physiologie Wasserhaushalt und Mineralhaushalt der Tiere. Basel, Stuttgart, 1956. Bd.3. 677 p.

277. Buddington R.K., Hilton J.W. Intestinal adaptations of rainbow trout to changes in dietary carbohydrate // Amer. J. Physiol., 1987. Vol. 253, № 4, Pt.l. P. G489 G496.

278. Buddington R.K., Diamond J.M. Pyloric caeca of fish: a "new " absorptive organ // Amer. J. Physiol., 1987. Vol. 252, №1. P. 665 676.

279. Buddington R.K., McKellep A.M.B., Krogdahl A. The intestines of carnivorous fish: Structure, functions and adaptive response // 7th Int. Symp. Fish Physiol. Oslo, 1996. P. 40.

280. Bretscher A., Weber K. Localization of actin and microfilament-associated proteins in the microvilli and terminal web of the intestinal brush border by immunofluorescence microscopy//J. Cell Biol., 1978. vol. 79. P. 839-845.

281. Cahu C.L., Zambonino I.J.L., Corraze G., Coves D. Dietary lipid level affects fatty acid composition and hydrolase activities of intestinal brush border membrane in seabass // Fish Physiol, and Biochem., 2000. Vol. 23, № 2. P. 165 172.

282. Chen P., Wang Z., Zheng S. Influence of salinity on digestiv enzyme activities of the young fish Pagrosomus major II Xiamen daxue xuebao. Ziran kexue ban = J. Xiamen Univ. Natur. Sci., 1998. Vol. 37, № 5. P. 754 756.

283. Chiu Y.N., Benitez L.V. Studies on the carbohydrases in digestive tract of milkfish Chanos chanos II Mar. Biol., 1981. Vol. 61, № 2-3. P. 247 254.

284. Cogoli A., Eberle A., Sigrist H., Joss C., Robinson E., Mosimann H., Semenza G. Subunits of the small-intestinal sucrase-isomaltase complex and separation of its enzymatically active isomaltase moiety // Eroup. J. Biochem. 1973. V. 33. P. 40-48.

285. Cogoli A., Mosimann H., Vock C., Balthazar A.K., Semenza G. A simplified procedure for the isolation of the sucrase-isomaltase complex from rabbit intestine. Its aminoacid and sugar composition // Eruop. J. Biochem. 1972. V. 30. P. 7-14.

286. Colbeau A., Maroux S. Integration of alkaline phosphatase in the intestinal brush border membrane // Biochim. Biophys. Acta. 1978. V. 511. P. 39-51.

287. Cordier D., Maurice A., Chanel J. Influence de la temperature sur l'absorption intestinale des oses chez la Tanche {Tinea vulgaris) // C.r.Soc. biol., 1954, Vol.48, № 15, P. 1417-1418.

288. Corraze G., Larroquet L., Medale F. Alimentation et depots lipidiques chez la truite arc-en-ciel, effect de la temperature d'elevage // Prod. anim. / INRA. 1999. Vol. 12, №4. P. 249-256.

289. Corring T. The adaptation of digestive enzymes to the diet: its physiological significance//Mol. Physiol. 1983. Vol. 20B. P. 1217- 1235.

290. Courdrier E., Reggio H., Louvard D. Immunolocalization of the 110.000 molecular weight cytoskeletal protein of intestinal microvilli // J. Molec. Biol., 1981. vol. 152. P. 49-66.

291. Costanzo G., Duportail G., Florentz A.,Leray C. The brush border membrane of trout intestine: influence of its lipid composition on ion permeability, enzyme activity and membrane fluidity // Mol. Physiol. 1983. Vol. 4. № 5-6. P. 279 290.

292. Cowey C.B. The nutrition of fish: the developing scene // Nutr. Res. Rev. 1988. Vol. 1. Cambridg etc., 1988. P. 255 280.

293. Crozier W. On the critical thermal increment for the locomotion of a diplopod //Journ. Gen. Physiol. 1924. Vol. 7. P. 123 137.

294. Dahlqvist A. Method for assay of intestinal disaccharidases // Analyt. Biochem. 1964. Vol. 7. P. 18-25.

295. De Duve C. Tissue fractionation. Past and present // J. Cell. Biol. 1977. V. 50. P. 200-550.

296. Desnuelle P. Intestinal and renal aminopeptidases: a model of a transmembrane protein // Europ. J. Biochem. 1979. V. 101. P. 1-11.

297. Eggermont E. The biochemical defects in sucrose intolerance and in glucose-galactose malabsorption. These (Louvain), 1968. 71 p.

298. El-Sayed A.-F.M., Nmartinez I., Moyano F.J. Assessment of the effect of plant inhibitors on digestive proteases of nile tilapia using in vitro assays // Aquacult. Int. 2000. Vol. 8, №5. P. 403-415.

299. Escoubet P., Boge G., Rigal A. Comparaison de l'absorption intestinale de glycocolle et du glucose chez la truite {Salmo gairdneri R.) a différentes temperatures // Ann. Inst. M. Pacha. 1973. № 6. P. 37 44.

300. Fagbenro O., Adedire C.O., Aiyegbeni M.L. Food compositin and digestive enzymes in the gut of the African electric catfish, Malapterurus electricus (Gmelin 1789) (Malapteruridae) //Trop. Zool., 2001. Vol. 14, № 1. С. 1 6.

301. Ferguson A. Immunology / Ed. by Duthie H.L., Wormsley K.G. Scientific basis of gastroenterology. Edinburgh ate.: Livingstone, 1979. P. 49-70.

302. Finean J.B., Coleman R., Mitchell R.H.) Финеан Дж., Колмэн P., Мичелл P. Мембраны и их функции в клетке. М.: Мир, 1977. 199 с.

303. Flanagan P.R., Forstner G.G. Enzyme activity in partly dissociated fragments of rat intestinal maltase /glycoamylase // Biochem. J. 1978. V. 177. P. 487 -492.

304. Gargiulo A.M., Ceccarelli P., Dall'Aglio C., Pedini V. Histology and ultrastructure of the gut of the tilapia (Tilapia spp.), a hybrid teleost // Anat. Histol. Embriol., 1998. Vol. 25, № 2. P. 89 94.

305. Gautier G.F., Landis S.C. The relationship of ultrastructural and cychemical features to absorptive activity in the goldfish intestine // Anat. Rec., 1972. Vol. 172, № 4. P. 675 702.

306. Gelman A., Mokady S., Cogan U. The effect of seasonal changes on the activity of intestinal alkaline phosphatase of pike perch, Lucioperka lucioperka and bream Abramis brama II J. Fish. Biol. 1984. Vol. 25.

307. Gelman A., Mokady S., Cogan U. The thermal properties of intestinal alkaline phosphatase of three kinds of deep-water fish // Comp. Biochem. Physiol. 1989. Vol. 94B, № 1.

308. Gelman A., Cogan U., Mokady S. The thermal properties of fish enzymes as a possible indicator of the temperature adaptation potential of the fish // Comp. Biochem. Physiol. 1992. Vol. 101B, № 1-2. P. 205 208.

309. Genicot S., Feller G., Garday Ch. Trypsin from antarctic fish (Paranotothenia magellanica Forster) as compared with trout (Salmo gairdneri) trypsin // Comp. Biochem. and Physiol. 1988. Vol. B.90, № 3. P. 601 609.

310. Goldberg D.M., Campbell R., Roy A.D. Binding of trypsin and chymotrypsin by human intestinal mucosa// Biochim. Biophys. Acta. 1968. V. 167. P. 613-615.

311. Goldberg D.M., Campbell R., Roy A.D. The interaction of trypsin and chymotrypsin with intestinal cells in man and several animal species // Comp. Biochem. Physiol. 1971. V. 38. P. 697-706.

312. Goolish E.M., Adelman I.R. Effects of ration size and temperature on the growth juvenile common carp (Cyprinus carpio L.) II Aquaculture. 1984. Vol. 36, № 1-2. P. 27-35.

313. Grainger E.H. On the age, growth, migration, reproductive potential and feeding habits of the arctic char (Salvelinus alpinus) of Frobisher Bay, Baffin Island // J. Fish. Res. Board Canada. 1953. Vol. 10, № 6. P. 326 370.

314. Gram L. The microflora of raibow trout intestine: a comparison of traditional and molecular indentification // Aquaculture. 2000. Vol. 182. P. 1-15.

315. Gray G.M. Carbohydrate absorption and malabsorption // Physiology of gastrointestinal tract / Ed. by Johnson L.R. New York : Raven Press. 1981. V. 2. P. 1063-1072.

316. Guizani N., Rolle R.S., Marshall M.R., Wei C.I. Isolation, purification and characterization of a trypsin from the pyloric caeca of mullet (Mugil cephalus) II Compar. Biochem. and Physiol. 1991. Vol. 98, № 4. P. 517 521.

317. Hajjou M., Le G.Y. Purification and characterization of an aminopeptidase from tuna (Thynnus albaceres) pyloric caeca // Biochim. Biophys. Acta. Protein Struct, and Mol. Enzymol. 1994,1204, № 1. C. 1 13.

318. Herrera L., Iordana R. The effect of temperature and absence sodiuv on the oxygen uptake, water and d-galactose transfer dy the intestinal sacs of fish Gobius paganellus L. II Rev. esp. fisiol. 1973. Vol. 29, № 1. P. 83 88.

319. Hidalgo M.C., Urea E., Sanz A. Comparative study of digestive enzymes in fish with different nutritional habits. Proteolytic and amylase activities // Aquaculture, 1999. Vol. 170, № 3-4. P. 267-283.

320. Hirji K.N., Courtney W.A.M. Luicine aminopeptidase activity in the digestive tract of perch, Perca fluviatilis L. // J. Fish Biol. 1982. Vol. 21, № 6.

321. Holdsworth C.D., Sladen G.E. Absorption from stomach and small intestine / Ed. by Outhie H.L., Wormsley K.G. Scientific basis of gastroenterology. Edinburgh; London; N.-Y.: Churchill Livingstone, 1979. P. 338-397.

322. Horn M.H. Microbial activity in the digestive tracts of marine herbivorous Fishes: A perspective based on latitude and temperature // 8th Bien. Conf. Ecol. and Evolut. Ethol. fishes: Abstr. Univ. New Hampshire. Durham, 1992.

323. Hussain M.M., Tranum-Jensen J., Noren 0., Sjöström H., Cristiansen K. Reconstitution of purified amphiphilic pig intestinal microvillus aminopeptidase. Mode of membrane insertion and morphology // Biochem. J. 1981. V. 199. P. 179186.

324. Huang Feng, Yan Ansheng, Mu Song, Wang Xiaodong. The proteases and amylases Hypophthalmichthys molitrix and Aristichthys nobilis // J. Fish. Sei. China, 1999. Vol. 6, №2. P. 14-17.

325. James W.P.T., Alpers D.H., Gerber I.E., Isselbacher K.J. The turnover of disaccharidasses and brush border proteins in rat intestine // Biochim. biophys.acta. 1971. vol. 230. P. 194-203.

326. Jancarik A. Die Verdaunung der Hauptbähzstoffe beim Karpfen // Z. Fischerei., 1964. № 8-10. P. 601 684.

327. Jenniaux C. Chitine et chitinolyse. Paris: Masson, 1963. 181 p. Jansson B.O., Olsson P. The cytology of the caecal epithelial cells of Perca // Acta zool. Stockholm, 1960. Vol. 41, № 3. P. 267 276.

328. Jennings J.B. Feeding, digestion and assimilation in animals. 2nd ed. London; Basingstoke: Macmillan Press, 1972. 244 p.

329. Kalac I. Studies on herring (Clupea harengus L.) and capelin (Mallotus villosus L.). Pyloric caeca proteases: partial purification, separation and identification of proteases // Biologia, 1978. Vol. 33, № 6. P. 412 -419.

330. Kapoor B.G., Smith H., Verighina I.A. The alementary canal and digestion in teleosts//Adv. marine biol., 1975. V. 13. P. 109-239.

331. Kaufman M.A., Korsmo H.A., Olsen W.A. Circadian rhythm of intestinal sucrase activity in rats. Mechanism of enzyme change // J. Clin. Invest. 1980. vol. 65. P. 1174-1181.

332. Kawai S., Ikeda S. Studies on digestive enzymes of fishes in digestive organs of several fishes//Bull. Jap. Soc. Sci. Fish., 1971. Vol. 37. P. 333 337.

333. Kelly J.J., Alpers D.H. Properties of human intestinal glucoamylase // Biochim. biophys. acta. 1973. V. 315. P. 113-122.

334. Kenny A.J., Maroux S. Topology of microvillar membrane hydrolases of kidney and intestine //Physiol. Rev. 1982. V. 62. P. 91-128.

335. Kenny A.J., Macnair R.D.C., Booth A.G. The topology of kidney microvillar enzymes // Biochem. Soc. Transaction. 1978. V. 6. P .825-829.

336. Kim Y.S. Intestinal mucosal hydrolysis of proteins and peptides // Peptide transport and hydrolysis / Ed. by Elliott K., O'Connor M. Ciba Found. Symp. 50. Amsterdam; Oxford; New-York: ASP. 1977. P. 151-171.

337. Kitamikado M., Tachino Sh. Studies on the digestive enzymes of rainbow trout. I. Carbohydrases //Bull. Japan. Soc. sci. fish. 1960. Vol. 26, № 7. P. 679 684.

338. Kitchin S.E., Morris D. The effect of acclimation temperature on amino acid transport in the gold fish intestine // Comp. Biochem. Physiol. 1971. Vol. 40A. № 2. P. 431 -443.

339. Krementz A.B., Chapman G.B. Ultrastructure of the posterior half of the intestine of the catfish Ictalurus punctatus 11 J. Morphol., 1975. Vol. 145, № 4. P. 441 -182.

340. Krogdahl A., Lea T.B., Olli J.J. Soybean proteinase inhibitors affect intestinal trypsin activities and amino acid digestibilities in rainbow trout (Oncorhynchys mykiss) II Comp. Biochem. And Physiol. 1994. Vol. 107A, № 1. P. 215 219.

341. Malik N., Butterworth P.J. Catalytic and ligand-binding properties of rat intestinal alkaline phosphatase // Arch. Biochem. Biophys. 1977. V.179. P. 113-130.

342. Maroux S., Louvard D. On the hydrophobic part of aminopeptidases and maltase which bind the enzyme to the intestinal brush-border membrane // Biochim. biophys. acta. 1976. V. 419. P. 189-195.

343. Maroux S., Louvard D., Baratti J. The aminopeptidase from hog intestinal brush border//Biochim. biophys. acta. 1973. V. 321. P. 282-295.

344. Maroux S., Louvard D., Semeriva M., Desnuelle P. Hydrolases bound to the intestinal brush border: an example of transmembrane proteins // Annu. Biol. anim. Bioch. 1979. V. 19. P. 787-790.

345. McLean E., Ash R. Intact protein (antigen) absorption in fishes: mechanism and physiological significance // J. Fish Biol., 1987. Vol. 31. Suppl. A. P. 219 223.

346. McLean E., Ash R. (Carassius auratus). Uptake of horseradisch peroxidase in intact form from the gut of the goldfish (Carassius auratus) II Arch. Int. Physiol, et Biochim., 1989. Vol. 97, № 5. P. 34.

347. McLeese J.M., Stevens E.D. The effect of acclimation temperature, assay temperature and ration on the specific activity of trypsin and chymotrypsin from rainbow trout (Salmo gairdnery) II Comp. Biochem. Physiol. 1982. Vol. 73B. P. 631 -634.

348. McLeese J.M., Stevens E.D. Trypsin from two strains of rainbow trout, Salmo gairdneri, is influenced differently by assay and acclimation temperature // Can. J. Fish, and Aquat. Sci. 1986. Vol. 43, № 8. P. 1664 1667.

349. Moerland I. Cellulase activity in natural and temperature acclimated population of Fundulus heteroclitus II Mar. Ecol. Progr. Ser., 1985. № 3. P. 305 -308.

350. Mengoli A. Anatomia e fisiologia dell'apparato digerente nei pesci // Pesce, 1999. Vol. 16, №6. P. 70-85.

351. Merret T.G., Bar-Eli E., Van Vunakis H. Pepsinogens A, C and D from the smooth dogfish//Biochemistry, 1969. Vol. 8,№3.P. 142-151.

352. Mooseker M.S., Tilney L.G. Organization of an actin filament-membran complex. Filament polarity and membrane attachment in the microvilli of intestinal epithelial cells // J. Cell Biol., 1975/ vol. 67. P. 725-743.

353. Musacchia X.J., Neff S.S., Westhoff D.D. Active transport of D-glucose by intestinal segments, in vitro, oilctalurus nebulosus II Biol. Bull., 1964, Vol. 126 P. 291 -301.

354. Nagase G. Contribution to the physiology of digestion in Tilapia mossambica Petors: Digestive enzymes and the offects of diets on their activity // Z. Vergl. Physiol., 1964. Vol. 49.

355. Nagayama F., Saito Y. Distribution of a-amylase, a- and P-glucosidase, and galactosidase in fish // Bull. Japan. Soc. sci. fish. 1968. Vol. 34, № 10. P. 944 949.

356. Natarajan M., Ross B., Ross L.G. Susceptibility of carp and tilapia a-amylase to purified wheat amylase inhibitor // Aquaculture. 1992. Vol. 102, № 3. P. 265 -274.

357. Nishi Y., Takesue Y. Electron microscope studies on Triton-solubilized sucrase from rabbit small intectine // J. Ultrastruct. Rev. 1978a. V. 62. P. 1-12.

358. Nishi Y., Takesue Y. Localization of intestinal sucrase-isomaltase complex on the microvillous membrane by electron microscopy using nonlabelled antibodies // J. Cell. Biol. 1978b. V. 79. P. 516-525.

359. Noaillac-Depeyre J., Gas N. Fat absorption by the enterocytes of the Cyprinus carpio L. II Cell Tissue Res., 1974. Vol.155. P. 353 365.

360. Noaillac-Depeyre L., Gas N. Electron microscopic study on gut epithelium of the teuch (Tinnca tinea L.) with respect to its absorptive function // Tissue Cell., 1976. Vol. 8. P. 511 -530.

361. Noren O., Sjostrom H. The insertion of pig microvillus aminopeptidase intoIthe membrane as probed by J iodonaphthyl-azide // Europ. J. Biochem. 1980. V. 104. P. 25-31.

362. Noren O., Sjostrom H., Danielsen E.M., Cowell G.M., Skorbjerg H. The enzymes of the enterocyte plasma membrane / Ed. by Pesnuelle. Molecular and cellular basis of digestion. Amsterdam etc. Elsevier, 1986a. P. 335 365.

363. Noren O., Sjostrom H., Cowell G.M., Tranum-Jensen J., Hansen O., Welinder K.G. Pig intestinal microvillar maltase-glucamylase // J. Biol. Chem. 1986b. Vol. 261, №26. P. 12306- 12309.

364. Odense P.H., Bishop C.M. The ultrastructure of the epithelial border of the ileum, pyloryc caeca and rectum of cod Gadus morhua II J. Fish Res. Board Can., 1966. Vol. 23, №12. P. 1841 1843.

365. Ojeda F.P., Caceres C.W. Digestive mechanisms in Aplodactylus punctatus (Valenciennes)'. A temperate marine herbivorous fish // Mar. Ecol. Progr. Ser., 1995. Vol. 118, № 1-3. P. 37-42.

366. Ooshiro Z.Studies on proteinase in the pyloric caeca of fishes. II: Some properties of proteinases purified from the pyloric caeca of mackerel // Nippon Suisan Gakkaishi, 1971. Vol. 37. P. 41 47.

367. Otake T., Hirokawa J., Fujimoto H., Imaizumi K. Fine structure and function of the gut epithelium of pike ell larvae // J. Fish Biol., 1995. Vol. 47, № 1. P. 126 -142.

368. Owen T.G., Wiggs A.J. Thermal compensation in the stomach of the brook trout (Salvelinus fontinalis Mitchill) II Comp. Biochem. Physiol. 40B. P. 465 473.

369. Ozernyuk N.D. Mechanisms of thermal adaptation in poikilothermal aquatic animals // Aquatic Ecology at the Dawn of XXI Centure. Book of abstracts. St.Petersburg, 2005. P. 69.

370. Palackova J., Jirasek J., Svobodova I. Aktivita travicich enzymu kapriho pludku (Cyprinus carpio) pri ruzne teplote vody // Zivoc. vyroba. 1988. Vol. 33, № 10. P. 889- 895.

371. Pavios M., Anders F., Sorunn S., Olav V. Colonization of the gut in first feeding turbot by bacterial strains added to the water of bioencapsulated in rotifers // Aquaculture, 2000. Vol. 8, №5. P. 367-380.

372. Pattus F., Verger R., Desnuelle P. Comparative study of the interaction of the trypsin and detergent form of the intestinal aminopeptidase with liposomes // Biochem. biophys. Res. Commun. 1976. V. 69. P. 718-723.

373. Peptide transport and hydrolysis / Ed. by K. Elliott, O'Connor M. Ciba Found Symp. 50 Oxford etc.: ASP, 1977. 385 p.

374. Plantikow A., Plantikow H. Alanine alaninaminopeptidase (AAP) activity in the mitgut of rainbow trout (Salmo gairdneri R.): the influence of feed quantity, temperature and osmolaryty // Aquaculture, 1985. Vol. 48. P. 261 276.

375. Plantikow H. Der Einflub der Ernährung auf die Temperatur und Salinitätsadaptation der amylase im Mitteldarm der Regenbogenforelle {Salmo gairdneri Richardson) // Zool. Jahrb. Abt. allg. Zool. und Physiol. Tiere. 1985. Vol. 89, № 4. P. 417-426.

376. Polgar L., Halaz P. Current problems in mechanistic studies of serine and cysteine proteinases // Biochem. J., 1983. Vol. 207. P. 1 10.

377. Prahl J.W., Neurath H.Pancreatic enzymes of the spiny pacific goldfish. I: Cationic chymotrypsinogen and chymotrypsin // Biochemistry, 1966a. Vol. 5 P. 128 -135.

378. Prahl J.W., Neurath H.Pancreatic enzymes of the spiny pacific goldfish. II: Procarboxypeptidases В and carboxypeptidase В // Biochemistry, 1966b. Vol. 5 P. 136- 142.

379. Prosser L., Brown F.A.) Проссер JI., Браун Ф. Сравнительная физиология животных. М.: Мир, 1967.766 с.

380. Qian Y. X. Starvation-inuced proteas activity in the digestive tract of Lateolabraxjaponicus II Shuichan kexue = Fish. Sei., 2002. Vol. 21, № 3. C. 6 7.

381. Qian G. The influence activity digestive enzymes in the gut Chinese perch Siniperca chuatsi II Zhejiang nongye daxue xuebao = J. Zhejiang Agr. Univ., 1998. Vol. 24, №2. C. 207-210.

382. Ramakrishna M., Hulfin H.O., Racicot W.F. Some kinetic properties of dogfish chymotrypsin//Comp. Biochem. and Physiol. 1987. B87, № 1. P. 25 30.

383. Reichenbach-Klinke H.H. Grundlagen der Verdaung bei Fischen // Munch. Beitr. Abwasser Fisch. Flussbiol., 1972. Bd 23.

384. Reimer G. The relationship between the digestive enzymes in arctic char, Salvelinus alpinus (Salmonidae, Osteichthyes) and its ability to survive in extreme environments // Hydrobiologia, 1986. Vol. 133, № 1. P. 65 72.

385. Ribeiro L., Sarasquete C., Dinis M.T. Histological and histochemical development of the digestive system of Solea senegalensis Каир 1858 larvae // Aquaculture, 1999a. Vol. 171, № 3-4. P. 293 308.

386. Ribeiro L., Zambonino-Infante J.L., Cahu C., Dinis M.T. Development of digestive enzymes in larvae of Solea senegalensis Каир 1858II Aquaculture, 1999b. Vol. 179, № 1-4. P. 465-473.

387. Sastry K.V. Amino tripeptidase activity in three fishes // Proc. Int. Acad. Sci. 1972, № 76B. P. 251 -257.

388. Sastry K.V. Peptidase activity in a few teleost fishes // Zool. Beitr. Berlin, 1977. №23(1). P. 29-33.

389. Schmidt-Nielsen К.) Шмидт-Ниельсен К. Физиология животных. Приспособление и среда. М.: Мир, 1982. Т. 2. 384 с.

390. Semenza G. The mode of anchoring of sucrase-isomaltase to the small intestinal brush border membrane and its biosynthetic implications // Ed. by Rapoport S. Proc. 12th FEBS Meet. Oxford: Pergamon Press. 1979. V. 53. P. 21-28.

391. Semenza G. A model of anchoring of sucrase-isomaltase to the small intestinal brush border membrane and its biosynthetic implication // Mechanisms of saccharide polymerization and depolymerization. New York : Acad. Press. 1980. P. 135-144.

392. Semenza G. Intestinal oligo- and disaccharidases // Carbohydrate metabolism and its disorders / Ed. by Randle J. P., Steiner D.F., Whelan W.J. London: Acad. Press. 1981. V. 3. P. 425-479.

393. Semenza G. Anchoring and biosynthesis of stalked brush border membrane proteins: glycosidases and peptidases // Annu. Rev. Cell Biol. 1986. V. 2. P. 255 -313.

394. Semenza G, Brunner J, Wacker H. Biosynthesis and assembly of the largest and major intrinsic polypeptide of the small intestinal brush borders // Brush border membranes. CIBA Found. Symp. 95 / London : Pitman. 1983. P. 92-112.

395. Shen W, Shou J., Jin Y, Zhu Y, Qian W. Development of the digestive enzymes Carassius auratus gibelio II Shanghai shuichan daxue xuebao = J. Shanghai Fish. Univ., 2002. Vol. 11, № 3. P. 193 198.

396. Simada H. On the digestive ferments of Theragra chalcogramma (Pallac) II Bull. Sap. Soc. Sci. Fish, 1935. Vol. 4, № 1. P. 117 129.

397. Simpson B.K, Hoard H.F. Purification and characterisation of trypsin from the Greanland cod (Gadus ogac). 1. Kinetic and thermodynamic characteristics // Can. J. Biochem. Cell Biol. 1984. Vol. 62. P. 894 900.

398. Sire M,, Dorin D, Vernier J.M. Intestinal absorption of macromolecular proteins in rainbow trout // Aquaculture, 1992. Vol. 100, № 1-3. P. 234 235.

399. Smith L. S.) Смит JT.С. Введение в физиологию рыб. М.: Агропромиздат, 1986. 166 с.

400. Smith M.W. Methionine transfer across goldfish intestine acclimatized to different temperatures // Experientia, 1967. Vol. 23, № 7. P. 548 549.

401. Smith M.W. Selective regulation of amino acid transport by the intestine of goldfish (Carassius auratus L.) II Сотр. Biochem. Physiol, 1970. Vol. 35. P. 387 -401.

402. Smith M.W. Membrane transport in fish intestine // Сотр. Biochem. Physiol, 1983. Vol. 75A, № 3.

403. Smith R.L. Intestinal amino-acid transport in the marine teleost, Haemulon plumieri И Сотр. Biochem. Physiol. 1969. Vol. 30, № 6. P. 1115 -1123.

404. Shotton D.M. Pancreatic elastase // Methods Enzymol, 1970. Vol. 19. P. 113

405. Solomon N.E. Control of exocrine pancreatic secretion // Physiology of the gastrointestinal tract / Ed. L.R. Johnson. New York. Raven Press. 1987. Vol. 2. P. 1173-1207.

406. Spallanzani L. Experiences sur la digestion de l'home et de différentes especes d'animaux. Geneve, 1783.76 p.

407. Spanggaard В., Huber I., Nielsen J. et al. The micro flora of rainbow trout intestine. A comparison of traditional and molecular identification // Aquaculture, 2000. Vol. 182, №1. P. 1-15.

408. Spannhof L., Plantikow H. Studies on carbohydrate digestion in rainbow trout //Aguaculture. 1983. Vol. 30, №1-4. P. 95 108.

409. Squires E.J., Haard N.F., Feltham A.W. Gastric proteases of the grunland cod Gadus ogac. II: Structural properties // Canad. J. Biocem. a. cell. Biol., 1986. Vol. 64, №3.

410. Stanier R. Y., Adelberg E.A., Ingraham J.L.) Стейниер P., Эдельберг Э., Ингрэм Дж. Мир микробов. M.: Мир, 1979. Т. 3. 486 с.

411. Takeuchi Y., Nishi Y. Toporgaphical studies on intestinal microvillous leucine beta-naphthyl-amydase on the outer membrane // J. Membrane Biol. 1978. V. 39. P. 285-296.

412. Tengjaroenkul В., Smith B.J., Caceci T., Smith S.A. Distribution of intestinal enzyme activities along the intestinal tract of cultured Nile tilapia Oreochromis niloticus L. H Aquaculture, 2000. Vol. 182, № 3-4. P. 317-327.

413. Teskeredzic Z., Teskeredzic E., McLean E., Ash R. Intact protein absorption by the fish gut. 2. Application potential and limitations // Ribarstvo, 1998. Vol. 56, № 3. P. 91-100.

414. Torrissen K.R., Lied E., Espe M. Differences in digestion and absorption of dietary protein in Atlantic salmon (Salmon salar) with genetically different trypsin isozymes // J. Fish. Biol., 1994. Vol. 45, № 6. P. 1087- 1104.

415. Trier J.S. Structure of the mucosa of the small intestine as it relates to intestinal function // Federation Proc. 1967. V. 26, №5. p. 1391-1404.

416. Trier J.S. Morphology of the epithelium of the small intestine / Handbook of physiology. Sec. 6. Alimentary canal. Vol. 3. Intestinal absorption. Washington, 1968. P. 1125-1175.

417. Ushiyama H., Fugimori T., Schibata T., Yoshimura K. Studies on carbohydrates in the pyloric caeca of the salmon, Oncorchynchus keta // Bull. Fac. Fish. Hoccaido Univ., 1965. Vol. 16, № 3. P. 183 188.

418. Villanueva J., Vanacore R., Goicoechea O., Amthauer R. Intestinal alkaline phosphatase of the fish Cyprinus carpio: Regional distribution and membrane association // J. Exp. Zool., 1997. Vol. 279, № 4. P. 347 355.

419. Watson H.C., Shotton D.M., Cox J.M., Muirhead H. Elastase structure // Nature, 1970. Vol. 225. P. 806-811.

420. Woodley J.F., Kenny A.J. The presence of pancreatic proteases in particulate preparations of rat intenstinal mucosa // Biochem. J. V. 115. P. 181-205.

421. Ye J., Lu Т., Tian L., Sun D. Влияние pH и температуры на активность пищеварительных ферментов в желудке гибрида Huso huso «ВЕНЕРА» х «МАРС» // Zhongguo shuichan kexue = J. Fish Sci. China, 2003. Vol. 10, № 1. P. 79 -81. Кит.; рез. англ.

422. Yoshinaka R., Sato M., Ikeda S. Participation of colagenase in the digestion of collagen by rainbow trout // Bull. Jap. Soc. Sci. Fish., 1978. Vol. 44, № 6. P. 342 -354.

423. Zendzian E., Barnard E.A. Distribution of pancreatic ribonuclease, chymotrypsin, and trypsin in vertebrates// Arch. Biochem. Biophys., 1987. Vol. 122. P. 342 349.

424. Zhou J., Chen Y., Huang Q., Sun Y. Influence of several factors on digestiv enzyme activities of the fish // Beihua daxue xuebao. Ziran kehue ban = J. Beihua Univ. Natur. Sci., 2001. Vol. 2, № 1. P. 70-83.

Информация о работе

Коростелев, Сергей Георгиевич
доктора биологических наук
Петропавловск-Камчатский, 2005
ВАК 03.00.13

Диссертация

Особенности мембранного пищеварения у рыб различных таксономических и экологических групп - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы