Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние температуры на морфо-функциональные характеристики кишечника карповых рыб

ВАК РФ 03.00.10, Ихтиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние температуры на морфо-функциональные характеристики кишечника карповых рыб"

всероссийски^ научно-исследовательскил институт прудового

рыбного хозяйства /вниипрх/

На правах рукописи

КОРОСГЕЛЕВ СЕРГЕЯ ГЕОРГИЕВИЧ

УДК 597:591.132.05

влияние температуры на морфо-функциональные характеристики кишечника карповых рыб

03.00.10 - ихтиология

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1992

Работа выполнена на кафедре ихтиологии и гидробиологии Астраханского технического института рыбной промышленности и хозяйства / АТИРПиХ /

научные руководители: кандидат, биологических наук, доцент

В.Ф.Ьайцев

■ академик АН СССР 1 "А.М.Оголев!

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профес-

■ сор М.А.Щербина

доктор биологических наук, ведущий научным сотрудник Ю.Г.Юровицкий

Ведущее-учреждение: Каспийский научно-исследовательский

институт рыбного 'хозяйства /КаспНИРХ/

Защита состоится » дМ^Х/Щ 1992 г. в час. на

заседании Специализированного совета Д 117.04.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте прудового рыбного хозяйства /ВНИИПРХ/ по адресу: 141821, Московская область, Дмитровский район, п.Рыбное, ВШШРХ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ1РХ

Автореферат разослан 1992'г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

С .Г! Л'рямкина

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Интенсивный путь развития рыбного хозяйства внутренних водоемов возможен лишь при комплексном учете влияния факторов среды начпроцесс воспроизводства численности и биомассы рыб. При этом особое внимание должно уделяться процессу усвоения пищи, так как в настоящее время затраты, связанные с кормлением рыбы в товарном рыбоводстве, составляют не менее 60^ себестоимости производства /Комбикорма для рыб: производство и методы кормления, 1989/.

Современный этап исследования процесса усвоения пищи характеризуется- значительными успехами, которые связаны с открытием А.М.Угйлевым в конце 50-х годов механизма мембранного пищеварения, который обеспечивает расщепление около 80-90'* химических связей молекул биополимеров /Уголсв, 1960а,б/. Этот фундаментальный механизм обнаружен у животных различных таксономических групп, в том числе и у рыб /Берман, 1964, 1972; Пегель, 1973, 1978; Пегель и др., 1971, 1972, 1976; Щербина и др., 1976, 1977; Кузьмина, 1978, 1986а; и др./ Однако, влияние факторов среды на мембранное пищеварение у рыб исследовано недостаточно, о чем свидетельствуют сообщения последних лет /Ильина, Турецкий, 1987, 1988; Пономарев, 1989; Соболев,1991/.

В связи с тем, что мембранное пищеварение представляет собой совокупность процессов, обеспечивающих ферментативное расщепление биополимеров, особый интерес вызывает способность кишечных ферментов к адаптации в условиях многократных суточных и сезонных изменений температуры среды. Тем не менее, до последнего времени влияние температуры акклимации на активность и свойства энтеральных ферментов рыб не исследовано; крайне мало сведений о температурных адаптациях мембранных

ферментов с учетом роли различных компонентов фермент-мембранных комплексов энтсроцитов. Имеющиеол данные не позволяют сделать вывод о механизмах влияния температуры среды обитания на процессы мембранного пищеварения у рыб в течение жизненного цикла. Сведения, полученные np>i исследовании этой проблемы, необходимы для решения ряда теоретических и прикладных проблем питания и пищеварения у рыб. Кроме того, современные технологии рыборазведения позволяют регулировать абиотические факторы среды, поэтому выдвигается новая задача - определение оптимальных значений этих факторов и температуры в первую очередь. .

Цель и задачи исследований.. Целью работы являлось изучение влияния температуры среды обитания на процессы мембранного.пищеварения у рыб,, на .примере карпа Cyprinus- carpió 'L. и белого толстолобика Uypophthalmichtys molitrix (Val.). В связи с этим, были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать-весовые и-линейные характеристики кишечника карпа при изменении температуры среды содержания рыб.

2. Изучить влияние температуры акклимации на активность и свойства кишечных ферментов карпа.

3. Охарактеризовать влияние температуры и голодания на функциональную активность и структуру кишечника карпа.

4. Сравнить физико-химические свойства мембранной, детер-гентной и протеазной форм кишечной мальтазы различных карповых рыб.

Каучная новизна и практическая значимость работы. Впервые при акклимации рыб к различным температурам проведено одновременное исследование как весовых и линейных характеристик кишечника, так и активности, и свойств ферментов клеток слизистой оболочки кишечника карпа. Установлено, что изменение темпера-

туры акклимации в диапазоне 8-28°С не вызывает адаптивных сдвигов в уровне активности- и свойствах сахаразы и мальтазы, осуществляющих мембранный гидролиз углеводов в кишечнике. Высказана гипотеза, что гомеостаз мембранного пищеварения при изменении температуры акклимации поддерживается не за счет регуляции активности и свойств кишечных ферментов, а за счет изменения массы слизистой оболочки кишечника: при понижении температуры она увеличивается, а при повышении - уменьшается.

Ьа основе исследования физико-химических свойств мебран-ной, детергентноп и протеазной форм кишечной мальтазы карповых рыб установлены видовые различия фермент-мембранного комплекса, а также внутривидовые особенности у карпов украинской и ропшинской породных групп, которые исчезают при разрушении комплекса фермент-мембрана. Выявленные различия свидетельствуют о фенотипических температурных адаптациях ферментных систем кишечника рыб.

Полученные данные позволяют более полно охарактеризовать закономерности гидролиза углеводов и приблизиться к пониманию механизмой эволюционных и адаптивных перестроек пищеварительной системы при изменениях температуры -среды обитания рыб. Установленные факты могут быть использованы при проведении селекционной работы и для оптимизации температурных условий выра-цивания карповых рыб.

Апробация работы. Материалы работы докладывались и пред-¡тавлялись на Ленинградской городской конференции молодых уче-)ых и специалистов "Механизмы регуляции физиологических ¿унк-1ий" /Ленинград, /1988/, на ХШП научно-методической конфе->енции профессорско-преподавательского состава АТИРПиХ /1988/, ;а УН Всесоюзной конференции по экологической физиологии и

биохимии рыб /Ярославль, 1939/, на АУ Всесоюзной конференции по физиологии пищеварения и всасывания /Краснодар, 1990/, на 1У Всесоюзном совещании по рыб©хозяйственному использованию теплых вод /Курчатов, 1990/, расширенном заседании лаборатории питания института физиологии им.И,И.Павлова A¡i СССР /июль,1990/ и на расширенном заседании методсовета "Корма,кормление и кормопроизводство для рыб" г!Ц "Аквакультура" лПО по рыбоводству /июнь, 1991/.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Объем диссертации. Дисаертация изложена на 4Sé страницах машинописного текста, иллюстрирована 28 рисунками, содержит 5 таблиц. Список литературы включает работы 130 отечественных и 109 иностранных авторов.

МАТЕРИАЛ И ЫЕГ0ДЦ ИССЛВД0ВА1М

Работа выполнена в течение 1986-1991 г.г. в лабораторных условиях на 655 экз.сеголетков и годовиков карпа, выращенных в прудах Астраханской и Ленинградской обл., а также 78 экз. сеголетков белого толстолобика, выращенных в Астраханской обл. Рыб, отловленных неводом, в течение двух недель выдерживали в аквариумах объемом 200 л с хорошо аэрируемой водой при температуре 18°С. Затем делили на три группы: для первой - температура воды в аквариуме повышалась до 28°С, для второй - понижалась до 8 и 12°С для голодающих и питающихся рыб соответственно, для третьей /контрольной/ - не изменялась.

Исследование влияния температуры акклимации на морфо-фун-кциональные характеристики кишечника карпа проводили через каждые 7 дней от начала эксперимента. Получение различных форм

кишечной мальтазы карпа украинской, ропшинской породных групп и белого толстолобика осуществляли из препаратов слизистой оболочки кишечника рыб, выловленных непосредственно из прудов.

Рыб обездвиживали, проводили морфометрический анализ, извлекали кишечник и промывали его 20 мл охлажденного раствора Рингера для холоднокровных животных /рН - 7.4/. Кишечник измеряли, взвешивали и при помощи специального скребка снимали слизистую оболочку, которую взвешивали и немедленно замораживали в сухом льду при температуре /-71°С/. Исходный фермента-тивно-активнык препарат получали после разморозки слизистой оболочки и гомогенизации её в растворе Рингера в соотношении 1:9. Детергентную и протеазную формы мальтазы получали после обработки гомогенатев слизистой 1^-ным тритоном-Х-100 или трипсином /I мг на мл препарата/ соответственно и последаклцего центрифугирования при 100000ё в течение 30 мин, при этом активность этих форм фермента определяли в сулернатанте. Иод мембранной формой мальтазы подразумевали активность фермента,находящегося в осадке при ультрацентрифугировании, без предварительной обработки солгабилизирующими агентами /Кузьмина и др., 1981/.

Исследование влияния температуры на скорость ферментативных реакций проводили в диапазоне температур 0-75°С в специальном политермостате /Варламов и др., 1971/ в течение коротких интервалов времени /5-10 мин/. Мальтазную активность /Ш 3.2.1.20/определяли при помощи глюкозооксидазного метода /оа^у,^ , 1964/, сахаразнуго /Ш 3.2.1.48/ - методом Нельсона в модификации А.М.Уголева и Н.Н.Иезуитовой /1969/. В качестве субстратов использовали 55 мМ растворы мальтозы и сахарозы, приготовленные на растворе Рингера. Активность фермен-

тов выражали в мкмоль продуктов гидролиза, образовавшихся за I ми» инкубации в расчете на I г влажного веса ткани /мкмоль. мин~Чг~*/\ Энергию активации рассчитывали графическим способом Аррениуса. В целом выполнено 285 опытов и проведено более 6,2 тыс. биохимических анализов. Полученные результаты обрабатывали при помощи методов вариационной статистики /Закс,1976/. Достоверность различий определяли с помощью критериев Стьюден-та и Манна-Уитни.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Влияние температуры среды содержания и функционального состояния карпа на морфологические характеристики его кишечника

Известно, что характер питания и факторы среды оказывают существенное влияние на строение и функционирование пищеварительной системы рыб /обзоры: Краюхин, 1963; Поляков, 1975; Щербина, 1973, 1984; Остроумова, 1983 и др./. В частности, для молоди карпа, выращиваемой в прудах, полученные данные свидетельствуют, что морфологические и функциональные показатели пищеварительной системы подвержены сезонным изменениям и зависят от интенсивности питания рыб /Соболев, 1991/. Большинство авторов полагает, что среди причин, вызывающих эти изменения, главной является температура, однако исследований влияния температуры одновременно и на структуру, и на ферменты слизистой оболочки кишечника рыб, не проводилось.

В связи с этим, нами исследованы весовые и линейные характеристики кишечника карпа, акклимированного к повышенной ■ /28°С/ и пониженной /8 и 12°С/ температуре воды, в качестве контрольной служила температура 18°С.

Результаты, полученные при исследовании влияния темпера-

туры на структуру кишечника питающихся карпов, представлены в табл.№ 1.

■Таблица I

Морфологические показатели кишечника питающихся карпов, содержавшихся в течение 14 дней при различных температурах среды

Показатель _Температура, °С

12 18/контроль/ 28

Масса рыб, г 47,0 + 4,0 53,0 + 2,0 48,0 + 4,0

/п = 8/ /п = 8/ /п = 8/

Относительная масса

кишечника, мг/г 24,9 + 1,3 20,4 + 1,4 13,0 + 0,5

% к контролю 122 100 64

Относительная масса

слизистой оболочки

кишечника, мг/г 15,9 + 1,1 12,4 + 0,7 6,22 + 0,2

% к -контролю 128 100 50

Относительная масса

мышечной оболочки.

кишечника, мг/г 9,2 ± 0,4 8,3 + 0,5 .7,3 + 0,4

'о к контролю НО 100 88

Относительная длина кишечника, % к

длине тела 138,0 +3,4 133,0+4,4 128,0+4,7

Можно видеть, что при повышении температуры от 18 до 28°С,

относительная масса кишечника рыб уменьшается в 1,6 раза /р <0.01/, в то время как при понижении от 18 до 12°С значения этого показателя, напротив, увеличиваются в 1,2 раза / Р <0.05/. Изменения массы кишечника карпа при выдерживании в течение двух недель в среде с повышенными и пониженными температурами связаны, в основном, с изменениями массы слизистой оболочки кишечника рыб. Действительно, эта величина выше у карпов, акклимированных к 12°С, чем к 28°С, в 2,6 раза /Р<0.01/,

в то время как масса мышечной оболочки выше только в 1,3 раза /Р<0.05/. Необходимо также отметить, что относительная длина кишечника рыб, акклимированных к.различным температурам, статистически не различается.

При исследовании влияния температуры на морфологические характеристики кишечника голодающих в течёние двух недель карпов, установлена сходная закономерность /табл.?.1 2/. Однако, необходимо отметить, что масса слизистой оболочки кишечника голодающих рыб, акклимированных к 12 и 28°С, по сравнению с питающимися, различается менее значительно - лишь в 1,9 раза / Р <С 0.05/. Кроме того, при понижении температуры акклимации от 12 до 8°С, этот показатель статистически не изменяется. .

Таблица 2

Морфологические показатели кишечника голодающих карпов, содержащихся в течение 14 дней при различных температурах среды

Показатель _Температура, °С_

8 12 18/контроль/ 28

Масса рыб, г 43,0+2,0 38,0+3,0 42,3+5,5 47,0+6,0

/п=б/ /п»7/ /п =8/ / п =8/

Относительная масса кишечника,

мг/г 17,а+0,6 18,8+1,6 14,6+3,7 11,3+0,8

% к контролю 122 129 100 77

Относительная масса слизистой оболочки кишечника,мг/г 10,8+0,6 11,4+1,1 8,2+1,6 6,1+0,5

1 к контролю 132 139 100 74

Относительная масса мышечной оболочки кишечника,мг/г 7,1+0,3 7,5+0,4 6,6+1,9 5,3+0,3

% к контролю 108 114 100 80

Относительная длина кишечника,"i к

длине тела 141,5+3,3 136,6+10,5 126,0+2,4 122,0+7,8

Важно также подчеркнуть, что у голодающих рыб, по сравнению с питающимися, более выражено снижение массы мышечной оболочки кишечника при повышении температуры среды содержания от 12 до 28°С /в 1,4 раза, р<0.05/, и наблюдается достоверное уменьшение длины кишечника. По-видимому, это вызвано отсутствием функциональной нагрузки на пищеварительную систему и переходом на эндогенное питание.

Таким образом, нами установлено, что температура воды оказывает значительное влияние на весовые характеристики кишечника карпа и практически не влияет на линейные. При понижении . температуры акклимации в диапазоне 28 - 12°С, когда карп способен активно потреблять пищу, независимо от функционального состояния увеличивается масса кишечника рыб. Увеличение массы кишечника вызывается увеличением как массы слизистом, так и массы мышечной оболочек. Однако, масса слизистой оболочки кишечника увеличивается в' большей степени.

Гипертрофия органов пищеварительной системы при адаптации к холода отмечена ранее рядом исследователей. В частности, * С.Китчин и Д.Моррис /Kitohin , Morris , 1971/ обратили внимание на увеличение объема слизистой кишечника карася, адаптированного к холоду. В последнее время продемонстрировано / Ьее, Cossina , 1988/, что у карпов, акклимированных к Ю°С, объем слизистой кишечника и его диаметр больше, а складки выше и шире, чем у акклимированных к 30°С. При этом установлено, что количество выростов стенки кишечника одинаково у обеих групп рыб. Сопоставление этих данных с результатами, полученными нами, позволяет предположить, что при понижении температуры увеличивается количество энтероцитов в слизистой оболочке кишечника рыб.

Влияние температуры акклимации на активность и свойства ферментов кишечника карпа

Известно, что карп относится к о'езжелудочиым рыбам, поэтому гидролиз всьх компонентов.его пищи осуществляется в кишечнике. Более половины питательных веществ, поступающих в пищеварительный тракт карпа, составляют углеводы /Щербина, 1973,1984/. Полисахариды при помощи панкреатической' с^ -амилазы преобразуются в олигосахариды, которые под действием дисахаридаз слизистой оболочки кишечника, таких как сахараза, мальтаза и изомоль-таза, разрушаются до конечных проектов, способных к всасыванию .- моносахаридов.

В литературе имеется ряд указаний на то, что температура акклимации оказывает значительное влияние на уровень активности с< -амилазы в кишечнике карпа /Василевский', Самойлова, 1987; ?&1асс^а ег &1. ,1983/ и, за исключением одной работы /Кузьмина, Подпубная, 1986/,' отсутствуют сведения, касающиеся такого влия-' ния на активность дисахаридаз кишечника рыб. В связи с этим, исследовали влияние изменения температуры акклимации на активность и свойства мальтазы и сахаразы слизистой оболочки кишечника карпа. .

Данные по влиянию температуры инкубации на активность мальтазы и сахаразы кишечника карпа, акклимированного к различным температурам, представлены на рис.1. Как видно на рисунке, уровень активности ферментов с увеличением температуры инкубации увеличивается у рыб, находившихся в течение 14 суток при повышенной до 28°С температуре, от 0,7+0,2 и 0,07+0,03 до 15,9+2,1 и 0,43+0,06, при пониженной до 8°С температуре - от 1,2+0,7 и 0,13+0,05 до 21,6+3,1 и 0,53+0,14; в контроле - от 0,9+0,4 и 0,23+0,06 до 17,8+3,4 и 0,77+0,07 мкмоль.г~^.мин~*,'для мальтазы

' 1.0 ЯП .-о 40 50 Г;0 70 О 1П ?С с-С ¿Р ?Г

Рис.1. Влияние температуры инкубации на активность мальтазы /слева/ и с&харазы /справа/ слизистой кишечника карпа, аккли-мированного в течение 14 суток к различным температурам среды: 1 - 18°С /контроль/, 2 - 8°С, 3 - 28°С. По оси абсцисс - температура инкубации /°С/; по оси ординат - скорость реакции

/мкмоль.г~*.мин"*Л

и сахараэы соответственно. В области низких температур инкубации различия в уровне активности мальтазы для всех групп рыб отсутствуют, тогда как при высоких температурах инкубации большая активность фермента наблюдается у рыб, акклимированных к низкой температуре. Активность кишечной сахаразы рыб, содер-

жавшихся при повышенной и пониженной температурах, несколько ниже, чем у контрольной группы.

Сопоставление полученных данных.позволяет отметить, что уровень активности сахаразы на порядок ниже уровня активности мальтазы. Ввиду низких значений активности сахаразы и значительной вариабельности данных в дальнейших исследованиях мы отказались от определения активности этого фермента.

Поскольку адаптация - это существенно меняющаяся во времени реакция, в следующем цикле экспериментов определяли активность и свойства кишечной мальтазы как через 7, так и через 14 суток после изменения температуры акклимации рыб. В связи с тем, что из литературы известно о функциональной неравноценности отделов кишечника рыб /Щербина, 1973, 1984;. Кузьмина, 19§6а/, исследовали мальтазу проксимального, медиального и дистального участков кишечника карпа. Кроме того, сравнивали активность и свойства фермента кишечника рыб, находившихся при высокой и низкой температурах, а затем реа'кклимированных к контрольной температуре /18°С/ в течение 7 и 14 суток.

Результаты, полученные для фермента различных отделов кишечника карпа, оказались сходными. В частности, через 7 суток после повышения или понижения температуры среды, различия в уровне активности мальтазы медиального отдела кишечника всех групп рыб не установлены. При исследовании мальтазы медиального отдела кишечника карпа, реакклимированного к.контрольной температуре также продемонстрировано отсутствие статистически значимых различий в уровне активности фермента.

Необходимо отметить, что результаты, изложенные выше, были получены нами на голодающих в течение эксперимента карпах. Однако известно, что различия в активности пищеварительных ферментов могут отсутствовать у голодающих рыб, акклимированных к вы-

- Ib -

еокой и низкой температуре, и проявляться у рыб, получающих корм / Plantikov , 1982, 1985/. Поэтому, в следующем цикле экспериментов исследовали мальтазу кишечника активно питающихся карпов при изменении температуры акклимации от 18°С до 28 и 12°С.

Полученные результаты представлены на рис.2. Как видно на рисунке, характер влияния температуры инкубации на активность кишечной мальтазы питающихся карпов, акклимированных в течение и 7, и 14 суток к различным температурам, одинаков для всех групп рыб. Сравнение таких температурных характеристик кишечной мальтазы питающихся карпов, содержавшихся при различных температурах, как температурный оптимум, относительная активность при низких и высоких температурах инкубации, термостабильность, Энергия активации, не позволяет выявить адаптивных изменений свойств фермента при изменении температуры акклимации рыб.

Анализ полученных данных свидетельствует о том, что при исследовании индивидуальных температурных адаптация кишечной мальтазы в пределах одной породы карпа /украинской/ адаптивных изменений активности и. свойств фермента не обнаружено. По-видимому, адаптация пищеварительной функции кишечника карпа к температуре осуществляется на более высоком системном уровне - органном, чем на молекулярном и клеточном. Действительно, если при понижении температуры активность ферментов на единицу массы слизистой оболочки кишечника падает, а при повышении - увеличивается /имеется в.виду реальная активность ферментов, т.е. определенная при температуре инкубации, равной температуре акклимации/, тогда как общая масса слизистой оболочки кишечника, напротив, увеличивается npvi понижении температуры и уменьшается при увеличении, то достигается гомеостатирующий эффект на уровне пищеварительной функции кишечника рыб.

- т;

.-з- *

h

/1 ■

у}'

1-У1/

т.Уг /I'

-i-" ■

í 2 i 3

I

50

100

,v

#

>'C 70

-i

MI3

vi 'Jl

у 1г

/

' г

, -i',

j/г

_1_1_I_1_u

O 10 2"1 30 Ю 50 6~! 70

50

100

/v

//

O 10 20 30 40 50 60 70

Рис.2. Влияние температуры инкубации на активность мальтазы

слизистой кишечника питающихся карпов, выдержанных в течение

7 /А/ и 14 /Б/ суток при различных температурах среды: I - 18°С

/контроль/, 2 - 12°С, 3 - 28°С.

Обозначения: по оси абсцисс - температура /°С/, по оси ор-

I X

динат - скорость реакции, слева в мкмоль.мин" .г" ; справа в %

от максимальной, принятой за 100.

Температурные характеристики различных форм мадьтазы кишечника карповых рыб

Из литературы известно, что в ряде случаев наблюдаются адаптивные приспособления свойств кишечных ферментов рыб, обитающих в среде с различными температурами /Уголев и др.,1976, 1981, 1983; Кузьмина, Леваленный, 1986/. Однако, в этих работах исследовались виды рыб, значительно различающиеся экологическими особенностями и систематическим положением, поэтому, наблюдаемые различия свойств ферментов связывались, в основном, с генетическими различиями. Исследования, посвященные фенотипи-ческим температурным адаптациям мембранносвязанных пищеварительных ферментов рыб, в литературе отсутствуют.

В последнее время в отношении'большинства собственно кишечных ферментов показано, что они обладают амфипатической структурой и состоят из гидрофильной и гидрофобной частей /обзоры: Уголев, Иезуитова, 1982; Kenny , Maroux , 1982/. Это установлено также для ферментов группы мальтаз и ^-амилазы / Semenza, 1981, 1986/. Ферменты с амфипатичеекой структурой молекулы могут быть изолированы из мембраны с помощью неполярных детергентов /например, тритона-Х-100/ и обозначаются как детергентная форма фермента. Протеолитическое расщепление связей между гидрофильной и гидрофобной частями молекулы приводит к образованию протеазной формы, лишенной гидрофобного домена.

В связи с этим, используя современные возможности, нами была получена мальтаза кишечника в мембранносвязанной, детергент-ной и протеазной формах от различных карповых рыб, что позволило разделить эффекты мембрпнных компонентов и встроенного в них ферментативноактивного белка, а также, роль гидрофобного участка в температурных адаптациях пищеварительных ферментов.

Было проведено два цикла экспериментов. В первом, в качестве объектов исследований, для сравнительного изучения были выбраны украинская и ропшинская породы карпа, выращенные соответственно в южных /Астраханская обл./ и северных /Ленинградская обл./ условиях; во втором - кэрп и белым, толстолобик, выращенные в одинаковых температурных условиях /Астраханской обл/, но различающихся теплолюбивостью.

Результаты, полученные при исследовании различных форм кишечной. мальтазы украинской и рогшинской пород карпа, представлены в табл.3.

Таблица 3

Температурные характеристики различных форм кишечной • мальтазы украинской•и ропшинской пород карпа

Порода Форма- фермента Температурный оптимум /°С/ • Энергия активации Дж/моль (Какт)

Украинская Мембранная 75 9.2

Детергентная 70 9.8

Протеазная 65 8.6

Ропшинская Мембранная 70 7.1.

Детергентная 65 ' 9.5

Протеазная 65 8.6

Можно видеть, что температурный оптимум и Еакт различаются

для мембранносвязанной мальтазы кишечника исследованных пород карпа. Значение температурного оптимума мембранной формы фермента обоих пород карпа на 5°С превышает эту величину для детер-гентной формы. Важно отметить, что мембранная форма кишечной мальтазы ропшинской'породы карпа, по сравнению с украинской, характеризуется меньшими значениями Еакт» это свидетельствует об адаптации коплекса фермент-мембрана к пониженной температуре

- ХУ -

функционирования.

Различия в величинах температурного оптимума и Еакт наблюдаются для мембранной и детергентной форм кишечной мальтазы исследованных пород карпа, но отсутствуют для протеазной, лишенной гидрофобного участка. Это может свидетельствовать о важной роли гидрофобного домена в обеспечении свойств каталитически-активного гидрофильного участка молекулы фермента в связи с его температурными адаптациями.

Результаты, полученные при исследовании различных форм кишечной мальтазы карпа и белого толстолобика, представлены в табл.4.

Таблица 4

Температурные характеристики различных фо£>м кишечной мальтазы карла и белого толстолобика

Вид Форма фермента Температурный оптимум /°С/ Энергия активации, Дж/моль Шакт).

Карп Мембранная 65.4 7.1

Детёргентная. 63.8 8.4

Протеазная 62.5 8.1

Белый Мембранная 62.5 5.5

толсто- Детергентная 62.1 6.9

лобик Протеазная 61.7 7.8 *

Установлено, что температурный оптимум мембранной формы кишечной мальтазы-у карпа выше, чем у белого толстолобика, тогда как для детергентной и протеазной форм фермента различия в

значениях этого показателя недостоверны. Различия в про-

ект

цесса также обнаружены только для мембранной формы фермента, а для протеазной они статистически не значимы. Важно отметить более низкие значения мембранносвязанной мальтазы кишечника

белого толстолобика, по сравнению с значениями этого показателя для мембранной формы фермента кишечника карпа. Это свидетельствует о большей эффективности гидролиза углеводов в кишечнике фитофага белого толстолобика, «ку. у всеядного карпа, при одинаковых температурах среды обитания.

Таким образом, мембранносвязанпая мальтаза кишечника карповых рыб характеризуется различными температурными характеристиками у различных пород и видов, но ферментативно-активная белковая глобула фермента■обладает сходными свойствами. »

ЗАКЛЮЧЕНИИ

Проведенные исследования подтверждают данные о том, что у рыб промежуточные и заключительные этапы гидролиза углеводов пищи происходят за счет мембранносвязанных пищеварительных ферментов, которые синтезированы в клетках эпителия кишечника и встроены в мембрану щеточной каймы /обзоры: Уголев, 1972а; Кузьмина, 1978, 1986а; Кушак, 1983 и др./.

Температура среды оказывает значительное влияние на активность пищеварительных ферментов. Как правило, компенсация негативного' влияния изменений температуры среды обитания на скоро- . |

I

сть ферментативных реакций у пойкилотермных животных осущест- 1 вляется на клеточном и молекулярном уровне посредством измене- ^ ния концентрации ферментов и за счет изменения их свойств /обзоры: Хочачка, Семеро,.1977, 1988/. Однако, полученные нами результаты свидетельствуют, что каких-либо адаптивных изменений в активности и в свойствах для кишечных ферментов при акклима-ции рыб к различным температуром, выявить не удается. Гомеоста-тирующий эффект осуществляется на более высоком системном уровне - за счет регуляции массы слизистой оболочки кишечника;

при понижении температуры среды, активность кишечных ферментов падает, но масса последней увеличивается. Эта реакция позволяет поддерживать процесс мембранного пищеварения на относительно постоянном уровне при колебаниях температуры среды. По-видимому, в процессе эволюции подобный механизм индивидуальных температурных адаптация в пищеварительной системе оказался предпочтительнее, поскольку он не сопровождается процессами, связанными с адаптивным синтезом молекул фермента с новыми свойствами при изменениях температуры среды обитания рыб. Эта реакция является убедительным примером адаптации путем увеличения или уменьшения числа неизменных функциональных блоков и подтверждает развиваемую в последние годы теорию о блоковом строении самых различных структур и функций /обзоры: Уголев, 1983, 1985/.

Следует также отметить, что у рогадинской породы карпа мем-бранносвязанная мальтаэа кишечника адаптирована к пониженной температуре функционирования. Этот факт хорошо согласуется с результатами обширной литературы, демонстрирующей множество примеров адаптации белков к температурным условиям среды обитания организмов /обзоры: Александров, 1985; Хочачка, Сомеро, 1988; Ушаков, 1990/. В то время как свойства фермента, отделенного от мембраны как с помощью детергентов, так и с помощью, про-теаз, очень близки у различных карповых рыб. Это свидетельствует о том, что температурные адаптации кишечных карбогидраз осуществляются на уровне фермент-мембранных комплексов энтероцитов и, видимо, не затрагивают структуры молекулы фермента. По-видимому, адаптации сложных ферментных систем к условиям функционирования реализуются за счет рекомбинации стандартных функциональных блоков, а не синтеза новых.

Таким образом, полученные результаты позволяют предполо-

1

кить, что мембранный гидролиз углеводов пищи может происходить

в кишечнике карпа с приблизительно одинаковой эффективностью при различных температурах окружающей среды. Ранее было показано /Неволенный, 1987/, что транспортные процессы также не ли--митируют скорости поступления углеводов во внутреннюю среду организма карповых рыб. Возможно, процесс усвоения пищи при понижении температуры воды лимитируется у карповых рыб не на уровне мембранного гидролиза и всасывания, а на стадиях расщепления биополимеров, связанных с полостными ферментами.

выводи

1. Температура среды содержания оказывает значительное влияние на морфологические характеристики кишечника карпа. При ак- -климации рыб к понижению температуры относительная масса кишечника увеличивается, что связано с гипертрофией -слизистой оболо- ■ чки. Так, -относительная касса слизистой оболочки кишечника у акклимированных в течение двух'недель к-температуре среды 12°С для питавшихся карпов в 2,6 раза, а для голодавших в 1,9 раза выше, чем у рыб, акклимированных к температуре 28°С, в то время как, при изменении температуры среды содержания рыб. относительная масса мышечной оболочки изменяется незначительно.

2. Изменение температуры акклимации не вызывает адаптивных изменений уровня активности мембранных гидролаз, что подтверждается отсутствием, в большинстве случаев, статистически значимых различий в активности при стандартной температуре /25°С/ как кишечной мальтазы, так и кишечной сахаразы у карпов, содержавшихся при 18°С, а затем акклимированных в течение одной-двух недель при температурах 8; 12; 28°С.

3. Содержание карпа при различных температурах не приводит к изменению исследованных свойств /температурный оптимум, отно-

сительная активность при низких и высоких температурах инкубации, термостабильность, энергия активации/ мембранносвязанноп мальтазы кишечника рыб.

4. Сравнение морфологических и функциональных характеристик кишечника карпа, акклимированного к различным температурам, позволяет предположить, что гомеостаз мембранного пищеварения при изменении температуры воды обеспечивается, в частности, за счет регуляции массы слизистой оболочки кишечника рыб, тогда как активность и свойства кишечных ферментов не изменяются. По-видимому, этот механизм особенно важен для сезонных адаптации пищеварительной системы рыб. • • '

5. Сопоставление значений температурных оптимумов и энергии активации мембранносвязаниой мальтазы кишечника карповых рыб позволило выявить видовые /карп, белый толстолобик/ и внутривидовые /украинская и ропшинская породы карпа/ различия в свойствах фермент-мембранного комплекса, направленность которых свидетельствует о наличии температурных адаптации на уровне мембранного пищеварения. ' -

6. Установлено, что. при разрушении фермент-мембранного комплекса детергентами и протеазами видовые и внутривидовые различия в свойствах мальтазы исследованных карповых рыб исчезают. Поскольку, температурные адаптации мембранносвязанных ферментов кишечника карповых рыб осуществляются не путем образования молекул фермента с модифицированными свойствами, а на уровне комплекса фермент-мембрана - они являются фенотипическими.

7. Полученные результаты позволяют заключить, что адаптация пищеварительной функции кишечника карповых рыб к температуре среды достигается путем взаимодействия молекул ферментов и компонентов мембраны энтероцитов, а также за.счет изменения массы слизистой оболочки кишечника на фоне неизменных характерис-

тик фермент-мембранных комплексов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Коростелев С.Г. Температурная адаптация некоторых кишечных карбогидраз у рыб //Механизмы регуляции физиологических функций: Тез.докл.-Ленинграда -1988.-С.53.

2. Коростелев С.Г., Егорова В.В. Исследование кишечной мальтазы карпа при разных температурах акклимации //v 11 Всесоюзная конференция по экологической физиологии и биохимии рыб: Тез. докл. -Ярославль, 1989. -ч. 2. -Сх, 215-216.

3. Коростелев С.Г., Егорова В.В. Температурные адаптации некоторых ферментов кишечных микроворсинок карповых рыб //. ХУ Всесоюзная конференция по физиологии пищеварения и всасывания: Тез докл,-Краснодар,1990.-С.136.

4. Неваленный А.Н., Коростелев С.Г., Зайцев В.Влияние температуры на пищеварительно-транспортную функцию кишечника рыб // 1У Всесоюзное совещание по рыбохозяйственному использованию теплых вод: Тез.докл.-Курчатов,1990.-С.155-156..

5. Коростелев С.Г. Температурные зависимости я энергия активации мальтазы слизистой кишечника карпа, экспонированного при различных температурах среды // Краткие результаты научной деятельности Астраханского технического института рыбной промышленности и хозяйства за 1989-1990 г.г.:Астрахань, 1990.

6. Коростелев С.Г., Егорова В.В., Уголев A.M. О температурных адаптациях кишечной мальтазы карповых рыб // Журн.эвол.биох. и физиол., !? 6, 1990.-С.93-94.

7. Неваленный А.Н..Зайцев В.Ф.,Коростелев С.Г. Динамика уровня активности карбогидраз в кишечнике белого толстолобика при изменении температуры //Сб.научн.тр./Вопросы экологии гидро-бионтов, В:1ИИ11РХ-вып. 64,1991. -С. 69-7.Q.

ATMTliX ЗЛЮЭТ ТИРД20 CQ009Zr,