Модификационное регулирование уровня активности некоторых пищеварительных ферментов у рыб

Бедняков, Дмитрий Андреевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Модификационное регулирование уровня активности некоторых пищеварительных ферментов у рыб
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Модификационное регулирование уровня активности некоторых пищеварительных ферментов у рыб"

направахрукописи

БЕДНЯКОВ ДМИТРИЙ АНДРЕЕВИЧ

МОДИФИКАЦИОННОЕ РЕГУЛИРОВАНИЕ УРОВНЯ АКТИВНОСТИ НЕКОТОРЫХ ПИЩЕВАРИТЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ У РЫБ

Специальность: 03.00.13. - Физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Астрахань - 2004

Работа выполнена на кафедре гидробиологии и общей экологии Астраханского государственного технического университета

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор А.Н. Неваленный Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Воробьев В.И. кандидат биологических наук Гераскин П.П.

Ведущая организация - Азовский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства.

Защита состоится декабря 2004 г. в 12-" часов на заседании регионального диссертационного совета ДМ 212.009.01. при Астраханском государственном университете, по адресу: 414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке АГУ по адресу: 414056, г. Астрахань, ул. Татищева, 20а.

Автореферат разослан ноября 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, доцент Ю.В. Нестеров

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Адаптация пищеварительной системы занимает среди других адаптаций особое место в связи с тем, что между уровнем субстратной нагрузки и функционированием желудочно-кишечного тракта, в том числе и уровнем активности пищеварительных ферментов существует тесная связь (Уголев, 1985; Уголев, Кузьмина, 1993; Неваленный и др., 2003). В связи с этим механизм перестройки структуры и функции в ответ на изменение нагрузки имеет важное значение для функционирования пищеварительной системы и организма рыб в целом (обзоры: Хочачка, Сомеро, 1988; Уголев, Кузьмина, 1993; Неваленный и др., 2003 и мн.др.). Наиболее доступной моделью для решения фундаментальных проблем адаптации является пищеварительная система. Это связано с тем, что «кишечник является центральным органом, который реализует не только основные процессы переваривания и всасывания пищи, но и peгулирова-ние, связывающее собственно желудочно-кишечный тракт с метаболизмом организма благодаря мощной кишечной гормональной (энте-риновой) системе» (цит. по: Адаптационно-компенсаторные процес-

В течении последних лет для рыб описаны все известные типы пищеварения, изучены процессы транспорта нутриентов в кишечнике, индуцированного аутолиза (обзор: Уголев, Кузьмина, 1993; Неваленный, 1996; Pavios et al., 2000; Spanggaard et al., 2000; Кузьмина, Скворцова, 2003; Кузьмина и др., 2003; Извекова, Лаптева, 2004). В результате чего пищеварение у рыб в настоящее время описывается как шестизвенный процесс. Тем не менее, механизмы взаимодействия пищевых веществ (модификационные эффекты) в процессе пищеварения в кишечнике рыб остаются до конца не выясненными (Кузьмина, Голованова, 1998; Туктаров, 2002; Неваленный и др., 2001 в, 2003). В то же время результаты, полученные при разработке данных вопросов, необходимы для решения ряда теоретических и прикладных проблем питания и пищеварения у рыб.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилось изучение in vitro влияния модификаторов различной природы на уровень активности некоторых гидролитических ферментов пищеварительной системы белуги, русского осетра, севрюги, щуки, белого амура, леща, сазана, карася, белого толстолобика, окуня, ерша и бер-ша.

В связи с этим в процессе

сы..., 1991).

щие задачи:

БИБЛИОТЕКА

1.Исследовать влияние ионов шести металлов четвертого периода Периодической системы химических элементов Д. И. Менделеева ^п, Fe (И), Со, №, Си и Zn) в концентрации 10 мг/л на уровень активности суммарной протеиназы, мальтазы и щелочной фосфатазы слизистой оболочки кишечника рыб.

2. Изучить влияние углеводов (глюкозы, фруктозы) и аминокислот (глицина, L-глутамина, L-лейцина и БЬ-в-фенила-а-аланина) на уровень активности мальтазы, щелочной фосфатазы и суммарной протеиназы слизистой оболочки кишечника рыб.

3.Сопоставить интенсивность гидролиза гомогенатами слизистой оболочки кишечника 12 видов рыб, относящихся к различным экологическим и систематическим группам, 2% раствора мальтозы, 1% раствора казеина, 0,6 mМ раствора ^нитрофенилфосфата № по отдельности и в присутствии одного или двух веществ, являющихся субстратами при определении активности мальтазы, суммарной про-теиназы и щелочной фосфатазы соответственно.

4.Выявить видовые различия характера ответной реакции гидролитических систем кишечника рыб на действие исследованных модификаторов.

Научная новизна работы. Впервые получены данные по исследованию влияния модификаторов различной природы на уровень активности комплекса пищеварительных ферментов (суммарной про-теиназы, мальтазы и щелочной фосфатазы) слизистой оболочки кишечника и охарактеризованы процессы полисубстратного пищеварения в кишечнике 12 видов рыб относящихся к различным экологическим и систематическим группам. Произведено сопоставление влияния модификаторов различной природы на уровень активности ферментов в кишечнике осетровых, карповых и окуневых рыб.

Установлено существование регуляторной функции микроэлементов, углеводов, аминокислот, казеина и эфира фосфорной кислоты на уровень активности ферментов в слизистой оболочке кишечника исследованной группы рыб. Продемонстрированы видовые отличия в уровне ответной реакции гидролитических систем, осуществляющих расщепление пищи в кишечнике представителей разных видов, связанные, вероятно, с особенностями систематического положения, биологии и экологии этих рыб.

Установлено, что у рыб, как и у высших позвоночных животных, ферменты, обеспечивающие процессы мембранного пищеварения являются регулируемыми и способны изменять активность под действием веществ Органичесюй и неорганической природы.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты дополняют представления о характере перестроек гидролитических систем при наличии модификаторов различной природы, что свидетельствует о достаточно тонкой адаптации гидролитических систем к составу пищи.

Полученные в работе результаты позволяют сделать вывод о существовании значительного влияния, оказываемого модификаторами органической и неорганической природы, на процесс усвоения пищи, что необходимо использовать при разработке рецептур кормо-смесей для объектов аквакультуры.

Материалы диссертационной работы включены в лекционные курсы по энзимологии в Астраханском государственном техническом университете.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы представлялись на III Всероссийской научной конференции "Эколого-биологические проблемы Волжского региона и Северного Прикаспия" (Астрахань, 2000), Международной научно-практической конференции посвященной 70-летию КГТУ (Калининград, 2000), Международной конференции «Aquaculture Europe» (Тронхейм, Норвегия, 2001), Международной конференции «Aquaculture Europe» (Триест, Италия, 2002), V Всероссийской научной конференции "Эколого-биологические проблемы Волжского региона и Северного Прикаспия" (Астрахань, 2002), XI Международном симпозиуме "Эко-лого-физиологические проблемы адаптации" (Москва, 2003), VI Всероссийской научной конференции "Эколого-биологические проблемы Волжского региона и Северного Прикаспия" (Астрахань, 2003), VII Всероссийской научной конференции "Эколого-биологические проблемы Волжского региона и Северного Прикаспия" (Астрахань, 2004) и научно-методических конференциях профессорско-преподавательского состава АГТУ.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ.

Объем и структура работы. Диссертация представлена на 157 страницах машинописного текста, иллюстрирована 33 рисунками и 3 таблицами. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, глав с изложением собственных результатов исследований, обсуждения результатов, выводов, указателя цитируемой литературы. Список литературы включает 226 источника, в том числе 135 работ отечественных и 91 работ иностранных авторов.

Материал и методы исследования

Работа выполнена в течение 2001-2004 годов в лабораторных условиях. В работе были исследованы половозрелые особи белуги (Huso huso L.), русского осетра (Acipenser gueldenstaedtii Brandt), севрюги (Acipenser stellatus Pallas), щуки (Esox lucius L.), белого амура (Ctenopharyngodon idella Valenciennes), леща (Abramis brama L.), сазана (Cyprinys carpio L.), карася (Carassius carassius L.), белого толстолобика (Hypophthalmichthys molitrix Valenciennes), окуня (Perca fluvi-atillis L.), ерша (Gymnocephalus cernua L.) и берша (Stizostedion vol-gensis Gmelin).

Эксперименты проводились в условиях in vitro. Определение уровня активности мальтазы проводили глюкозооксидазным методом (Балаховский, 1987), уровня активности нейтральной протеиназы — модифицированным методом Лоури (Алейникова, Рубцова. 1988), уровня активности щелочной фосфатазы - по степени гидролиза па-ранитрофенилфосфата Na.

В ходе выполнения работы использовали следующие методические подходы:

1. Действие ионов металлов на уровень активности ферментов. В качестве источников ионов металлов использовали соответствующие сернокислые соли (MnSO4, FeS04, ^SO4, NiSC04, CuSO4, ZnSO4). Растворы этих солей добавлялись в ферментативно активный препарат и субстрат в количестве, необходимом для создания в этих средах концентрации соответствующего иона в 10 мг/л.

2. Действие моносахоридов и аминокислот на уровень активности ферментов. В качестве моносахаридов использовали - 10 mM растворы глюкозы, фруктозы и смесь глюкозы и фруктозы с концентрацией каждого из модификаторов в 5 mM, в качестве аминокислот использовали - 10 mM растворы глицина, L-глутамина, L-лейцина, DL-Р-фенил-а-аланина. Модификаторы добавлялись в ферментативно активный препарат и раствор субстрата непосредственно перед началом инкубации.

3. Действие различных субстратов на уровень активности ферментов. Сопоставляли скорость гидролиза гомогенатами слизистой оболочки кишечника рыб 2% раствора мальтозы, 1% раствора казеина и 0,6 mM раствора n-нитрофенилфосфата Na по отдельности и в присутствии одного или двух веществ являющихся субстратом при определении уровня активности мальтазы, суммарной протеиназы и щелочной фосфатазы. Гомогенаты слизистой оболочки кишечника приготавливали по. отдельности. Модификаторы добавляли непосредст-

венно к субстрату перед инкубацией его с ферментативно активным препаратом.

Результаты обрабатывались методами вариационной статистики (Закс, 1976; Лакин, 1990). Достоверность различий определялась с помощью критериев Стьюдента. Основная часть статистической обработки выполнена с использованием пакета статистической обработки информации STATGRAPHICS.

Результаты исследования и их обсуждение

1. Сопоставление интенсивности гидролиза казеина и мальтозы в слизистой оболочке кишечника рыб, относящихся к различным экологическим и систематическим группам

В ряде работ было ошМечено, что у рыб, относящихся по типу питания к разным экологическим группам, характеристики одноименных ферментов различны (Уголев, Кузьмина, 1993; Неваленный и др., 2003). В наших экспериментах уровень активности суммарной протеиназы был статистически достоверно выше (р<0,001) у хищных рыб по сравнению с мирными (рис. 1), а мальтазы напротив, у мирных был больше, чем у хищных (рис. 2).

Рис. 1. Уровень активности суммарной протеиназы слизистой оболочки кишечника берша (1), ерша (2), щуки (3), окуня (4), белуги (5), русского осетра (6), карпа (7), карася (8), леща (9), севрюги (10), белого толстолобика (11) и белого амура (12).

Так, по убыли уровня активности суммарной протеиназы слизистой оболочки кишечника исследованные виды рыб можно расположить в ряд: берш —► ерш —* щука —*■ окунь —> белуга —* русский осетр —» карп —*■ карась —» лещ —* севрюга —» белый толстолобик белый амур, а по убыли мальтазной активности: карп —* белый амур -+ карась лещ белый толстолобик щука севрюга белуга русский осетр —» окунь —» ерш —* берш. Данные полученные нами продемонстрировали также, что уровень активности одноименных ферментов у различных видов может отличатся на порядок. К примеру, уровень активности суммарной протеиназы слизистой оболочки кишечника берша составил мкмоль/(гхмин), а у белого аму-

ра мкмоль/(гхмин); уровень активности мальтазы у карпа

составляет мкмоль/(гхмин), а у берша

мкмоль/ (гхмин).

Рис. 2. Уровень активности мальтазы слизистой оболочки кишечника карпа (1), белого амура (2), карася (3), леща (4), белого толстолобика (5), щуки (6), севрюги (7), белуги (8), русского осетра (9), окуня (10), ерша (11) и берша (12).

2. Влияние ионов металлов на уровень активности пищеварительных ферментов

Данные, полученные при исследовании влияния ионов металлов в концентрации 10 мг/л на уровень активности щелочной фосфатазы,

мальтазы и суммарной протеиназы слизистой оболочки кишечника рыб представлены в таблице 1.

Установлено, что ионы металлов оказывают разнонаправленное влияние на уровень активности исследованных ферментов слизистой оболочки кишечника рыб. В частности уровень активности ферментов слизистой оболочки кишечника зависит не только от того, какой металл находится в инкубационной среде, но и от систематического положения исследуемых рыб. Так, например, Мп2+ повышает уровень активности щелочной фосфатазы от 80 до 115%, Fe2+ и Со2+ активируют фермент от 25 до 80%, Си и Zn2+ напротив вызывают ингиби-рование уровня активности щелочной фосфатазы слизистой оболочки кишечника рыб от 10 до 60% в зависимости от вида рыбы.

Fe2+ и Со2+ вызывают статистически достоверные изменения в уровне активности суммарной протеиназы карповых видов рыб, в то время как у осетровых (севрюга) данные металлы не взывают статистически значимых изменений в уровне активности суммарной про-теиназы. Это может быть объяснено, скорее всего, существенными различиями в строении полипептидных цепочек ферментов у представителей семейств Acipenseridae и Cyprinidae.

A.M. Уголевым (Уголев и др., 1983) было высказано предположение о существовании не одного, а нескольких регуляторных центров в молекулах пищеварительных ферментов специализированных для различных групп эффекторов. По мнению ряда исследователей (Уголев, Кузьмина, 1993; Кузьмина, 2001 и др.) быстрые конформа-ционные переходы одной формы молекулы фермента в другую, приводящие к изменению уровня их активности, могут происходить в результате действия модификаторов как органической, так и неорганической природы.

Еще один возможный механизм взаимодействия металла с молекулой фермента, вероятно, заключается в связывании иона металла со специальной контактной площадкой (регуляторный или аллосте-рический центр), пространственно отделенной от активного центра (Monod et al., 1963, 1965; Уголев, 1972) с замещением металлокомпо-нента некоторых энзимов (пептидазы, щелочная фосфатаза) на металл, близкий по атомному строению. Так, ионы ряда металлов, например, марганца, кобальта, цинка, способны активно подменять ионы других металлов, в частности магний, в ряде энзиматических систем (Калоус, Павличек, 1985).

Таблица 1

Влияние ионов металлов на уровень активности пищеварительных ферментов слизистой оболочки кишечника рыб

Виды Ферменты Уровень активности ферментов, мкмоль/(г*мин)

Контроль Мпг+ Яс2' Сог+ Ы!2+ Си2+

Севрюга Щелочная фосфатазы 0,28±0,01 0,59±0,02 0,49±0,01 0,40±0,01 0,40±0,01 0,15±0,01 0,25±0,01

Мальтаза 5,00±0,15 б,34±0,28 5,28±0,24 5,6) ±0.40 5,13±0,25 3,79±0,10 3,18±0,05

Суммарная протеиназа 0,26±0,03 0,44±0,05 0,43±0,02 0,34±0.01 0,27±0,04 0,190,01 0,29±0,02

Белый амур Щелочная фосфатазы 0.71 ±0,03 1,29±0,07 0,98±0,06 0,83±0.02 0,75±0,03 0,57*0,02 0,60±0.02

Мальтаза 4,23±0,15 5,48±0,21 4,99±0,18 5,32±0,17 4,37±0,Н 2,49±0,09 3,25±0,11

Суммарная протеиназа 0,63±0,04 0,82±0,06 0,77±0,03 0,74±0,04 0,60±0,02 0,47±0,03 0,55±0,02

Карп Щелочная фосфатазы 0,18±0,01 0,39±0,02 0,33±0,02 0,23±0,01 0,23±0,01 0,10±0,01 0,12±0,01

Мальтаза 4,34±0,13 5,41±0,18 5,07±0,11 4,98±0.17 4,41 ±0,07 3,21±0,15 3,72±0,11

Суммарная протеиназа 0,42±0,03 0,68±0,02 0,54±0,03 0,51±0,02 0,45±0,03 0,32±0,02 0,35±0,03

Карась Щелочная фосфатазы 0,27±0,01 0,48±0,02 0,44±0,02 0,36±0 02 0,30±0,01 0,10±0,01 0,19±0,01

Мапьтаза 3,48±0,21 5,01±0,37 4,91 ±0,25 4,27±0,19 3,71±0,24 2,18±0,11 2,96±0,17

Суммарная протеиназа 0,74±0,05 1,03±0,06 0,97±0,07 0,83±0,04 0,79±0,03 0,59±0,03 0,65±0,02

Белый толстолобик Щелочная фосфатазы 0,61 ±0,02 1,30±0,03 0,75±0,02 0,76*0,03 0,55±0,02 0,47±0,03 0,56±0,01

Мальтаза 6,61±0,14 8,42±0,12 8,49±0,21 7,63±0,07 6,96±0,14 5,91±0,14 6,14±0,14

С>ммарная протеиназа 1,25±0,06 1,37±0,05 132±0,0б 1,33±0,07 1,20±0,05 0,85±0,05 1,01±0,06

Скорее всего, первый способ взаимодействия ионов металлов с ферментом лежит в основе изменения гидролитической активности такой исследуемой группы ферментов, как суммарная протеиназа и мальтаза. А взаимодействия второго типа характерны для щелочной фосфатазы. Однако не исключено, что в ряде случаев мы имеем дело с эффектом положительной кооперативности, оказываемым ионами металлов, когда в результате взаимодействия олигомерной глобулы фермента с ионом металла увеличивается сродство фермента к субстрату. Следствием этого становится возросшая эффективность образования продукта реакции (Диксон, Уэбб, 1982; Плакунов, 2001).

Приведенные выше данные, свидетельствующие о наличии межвидовых отличий в уровне ответной реакции пищеварительных ферментов на присутствие ионов металлов в инкубационной среде у представителей сем. Аареизепёае и Сурптёае, свидетельствуют о том, что в отличие от каталитических центров ферментов, регулятор-ные имеют существенные отличия у осетровых рыб от таковых у карповых рыб. Вероятно, это может быть объяснено предположением В.В. Кузьминой (1997) о том, что в процессе эволюции каталитические центры ферментов изменяются в меньшей степени, чем регуля-торные.

Еще А.В. Войнаром (1960) была отМечена зависимость ответной реакции ферментов на действие ионов металлов в соответствии с их положением в периодической таблице химических элементов Д.И. Менделеева. В наших экспериментах была продемонстрирована зависимость ответной реакции щелочной фосфатазы слизистой оболочки кишечника рыб от положения находящегося в инкубационном растворе металла в таблице химических элементов Д.И. Менделеева. В частности, установлено, что в ряду металлов IV периода вспомогательных групп Мп2+, Ре2+, Со2+, N1 Си2+ и максимальное влияние оказывают металлы, находящиеся в начале и конце ряда. Причем, перечисленные металлы, находящиеся в начале периода оказывают стимулирующее действие на уровень активности щелочной фосфата-зы слизистой оболочки кишечника рыб, а в конце - угнетающее. Данная зависимость для мальтазы и суммарной протеиназы прослеживается в меньшей степени.

Приведенные результаты демонстрируют регуляторную функцию ионов металлов, выступающих в качестве модификаторов ферментов гидролитических систем как осетровых, так и карповых видов рыб. Исходя, из приведенных фактов следует, что, варьируя концентрацию микроэлементов, входящих в составе премиксов в искусст-

венные корма, возможно стимулирование процесса усвоения углеводных или белковых компонентов пищи у выращиваемых видов рыб.

3. Влияние углеводов и аминокислот на уровень активности пищеварительных ферментов рыб

Результаты экспериментов по исследованию влияния углеводов и аминокислот на уровень активности пищеварительных ферментов рыб представлены в таблице 2. Как видно из представленных данных, продукты гидролиза мальтозы существенно подавляют уровень активности мальтазы слизистой оболочки кишечника у всех исследованных видов рыб. При чем, данное подавление было выражено весьма существенно и, в зависимости от вида рыбы, составило от 30 до 80%. Аминокислоты приводили к увеличению скорости гидролиза мальтозы или же не вызывали статистически достоверных изменений в скорости указанного процесса. Так, например, уровень активности мальтазы слизистой оболочки кишечника русского осетра и белого амура составил мкмоль/(гхмин) соответственно,

а в присутствие глюкозы в инкубационной среде уровень активности данного фермента снизился соответственно до 2,03±0,11 и 1,75±0,12 мкмоль/(гхмин). Глицин, L-глугамин, L-лейцин и ОЬ-Р-фенил-а-аланин вызывают активацию уровня активности мальтазы слизистой оболочки берша до 2,63±0,12, 3,22±0,1?, 3,52±0,10 и 3,82±0,09 мкмоль/(гхмин) соответственно против 1,57±0,08 мкмоль/(гхмин) в контроле.

В действии модификаторов углеводной и белковой природы на уровень активности щелочной фосфатазы слизистой оболочки кишечника рыб нам не удалось выявить каких либо видимых закономерностей и здесь, по-видимому, в основе ответной реакции фермента на присутствие модификатора лежат, скорее всего, видовые особенности исследуемых видов рыб. Так, при исследовании взаимодействия модификаторов с ферментами группы суммарной протеиназы установлена зависимость от систематического положения исследуемых видов рыб. В частности, ни один из исследованных модификаторов не вызывал статистически достоверных изменений в уровне активности данного фермента у представителей сем. Аарешепёае. У представителей сем. Сурптёае модификаторы углеводной природы, как правило, приводили к снижению скорости гидролиза казеина в слизистой оболочки кишечника, а аминокислоты не вызывали статистически достоверных изменений в уровне активности суммарной протеиназы.

Таблица 2

Влияние углеводов и аминокислот на уровень активности пищеварительных ферментов слизистой оболочки кишечника рыб

Виды Ферменты Уровень активности ферментов, мкмоль/(г*мин)

Контроль Глкжоз.1 Фруктоза Глюкоза + Фруктоза Глицин Ь-глутамин Ь-лейцин фенил-а-апанин

Русский осетр Щелочная ФосФатазы 1,44±0,01 1,45±0,02 1,43±0,01 1,40*0,03 1,430±,02 1,49±0,02 1,57±0,02 1,54±0,01

Мальтаза 5,36*0,17 2,03±0,01 5,40±0,19 3,24±0,14 5,59=-0,11 5,78±0,23 5,97±0,13 6,23*0,27

Суммарная протеиназа 2,44±0,11 2,43±0,12 2,38±0,09 2,3 7± 0,10 2,48±0,11 2,41 ±0,10 2,51±0,16 2,43±0,10

Белый амур Щелочная (ЬосФатазы 0,600,01 0,62±0.01 0,58±0,01 0,60±0,02 0,60±0,01 0,61 ±0,01 0,60±0,01 0,69±0,04

Мальтаза 4,99±0,29 1,75±0,12 4,86±0,16 1,б5±0,15 4,93±0,11 4,84±0,22 5,44±0,22 4,67±0,39

Суммарная протеиназа 0,б2±0,07 0,61 ±0,07 0,51 ±0,03 0,51±0,02 0,75±0,09 0,52±0,02 0,58±0,03 0,63±0,03

Лещ Щелочная ФоссЬатазы 0,96±0,01 0,85±0,03 0,84±0,01 0,87±0,01 1,15±0,02 0,86±0,01 0,89±0,02 1,06±0,03

Мальтаза 2,55±0,20 0,48±0,10 2,950,20 0,85±0,14 2,56±0,19 2,76±0,16 3,13±0,19 3,27±0,12

Суммарная протеиназа 1,08±0,09 0,84±0,06 0,87±0,06 0,75±0,02 0,85±0,05 1,05±0,02 1,06±0,04 1,05±0,0б

Окунь Щелочная ФосФатазы 1,02±0,01 0,93±0,01 0,90±0,01 0,93±0,01 0,92±0,01 0,90±0,02 0,89±0,02 0,88±0,01

Мальтаза 4,47±0,1б 1,09±0,11 4,88±0,22 2,03±0,19 5,56±0,!2 6,10±0,16 б,76±0,13 7,24±0,15

Суммарная протеиназа 2,10±0,09 1,85±0,10 1,84±0,05 1,99±0,14 2,05±0,06 1,87±0,06 1,83±0,07 1,87±0,06

Берш Щелочная ФосФатазы 1,79±0,04 1,68±0,03 1,70±0,03 1,72±0,04 1,63±0,02 1,70±0,01 1,82±0,03 1,76±0,04

Мальтаза 1,57±0,08 0,53±0,05 1,73±0,09 1,13±0,09 2,63±0.20 3,220,12 3,52±0,10 3,82±0,09

Суммарная протеиназа 2,80±0,07 2,55±0,09 2,6б±0,06 2,43±0,07 2,43±0,11 2,71 ±0,10 2,78±0,12 2,69±0,15

Таким образом, как было уже указано выше, можно предположить, что каталитические центры фермента в процессе эволюции изменяются в меньшей степени, нежели регуляторные.

Ранее было установлено, что конечные продукты гидролиза крахмала способны изменить скорость гидролиза данного биополимера под действием а-амилазы, кроме того продемонстрировано, что модификационный эффект зависит не только от природы вещества модификатора, но и от видовой принадлежности объекта исследования (Неваленный и др., 2003). Подобные результаты были также получены Де Лейем (De Laye, 1966) и Еггермонтом (Eggermont, 1968) на крысах.

Для того, чтобы объяснить полученные нами данные необходимо обратится к основным представлениям теории регуляции ферментативной активности. Так, по современным представлениям, регуляция на уровне ферментативной активности осуществляется с помощью одного из трех механизмов: 1) изостерического; 2) аллостериче-ского 3) гомостерического (Уголев, 1972; Уголев, 1985; Уголев, Кузьмина, 1993; Плакунов, 2001; Неваленный и др., 2003).

В случае с достоверным ингибирующим действием глюкозы на уровень активности мальтазы у всех исследованных нами видов рыб мы, скорее всего, имеем дело с изостерическим эффектом, поскольку продукт реакции является структурным аналогом субстрата, вследствие чего может присоединяться к активному центру фермента и вызывать ингибирование конкурентного типа (Уголев, 1972). Данное явление ретроингибирования впервые было описано Новиком и Сци-лардом (Novic, Szilard, 1954) и Умбаргером (Umbarger, 1956; Умбар-гер, 1954), показавшим, что в цепи ферментативных реакций конечный продукт нередко является ингибитором фермента, катализирующего начальный этап процесса. В результате этого возникает отрицательная обратная связь, поддерживающая постоянство скоростей реакций, которые обеспечиваются данной ферментативной цепью (го-меорезис).

Следует отМетить, что присутствие аминокислот в инкубационной среде в большинстве случаев привело к статистически достоверному (р<0,01) увеличению уровня активности мальтазы слизистой оболочки кишечника рыб, причем L-лейцин и DL-p-фенил-а-аланин активировали уровень активности данного фермента у всех исследованных нами видов рыб. Обращает на себя внимание тот факт, что максимальное положительное действие субстратов-регуляторов (аминокислот) наблюдалось у хищных видов рыб (окунь, берш). Так суб-

страт-регулятор (модификатор) осуществляет изменение ферментативной активности, не являясь субстратом соответствующего фермента и регуляция осуществляется за счет связывания модификатора в пункте пространственно не совпадающем с активным центром (Уголев, 1972, 1985). К примеру уровень активности мальтазы слизистой оболочки кишечника окуня в контроле составил 4,77+0,16 мкмоль/(гхмин), а при действии глицина, L-глутамина, L-лейцина и DL-P-фенил-а-аланина ^увеличился на 17, 28, 41 и 51% соответственно. В то время как у леща глицин и L-глутамин не привели к достоверным изменениям в уровне активности мальтазы, а L-лейцин и DL-Р-фенил-а-аланин активировали уровень активности данного фермента на 22 и 28% соответственно.

Механизм действия исследованных нами модификаторов на уровень активности щелочной фосфатазы и суммарной протеиназы слизистой оболочки кишечника рыб является также аллостерическим. Однако углеводы и аминокислоты могут выступать в роли как активатора, так и неконкурентного ингибитора. Например, глюкоза инги-бирует уровень активности щелочной фосфатазы слизистой оболочки кишечника леща до 0,85+0,03 мкмоль/(гхмин) против мкмоль/(г х мин) в контроле, в то время как глицин, напротив, вызвал активацию данного фермента до 1,15+0,02 мкмоль/(гх мин).

Из полученных нами данных видно, что модификационные взаимодействия могут вызывать существенные изменения в уровне активности ферментов слизистой оболочки кишечника рыб, тем самым осуществлять контроль метаболических процессов, как на уровне клетки, так и целого организма. Причем данная регуляция осуществляется очень быстро и не требует затрат энергии, что чрезвычайно важно для организма.

Кроме того, обращает на себя внимание разный характер влияния модификаторов на уровень активности ферментов у рыб разных видов. Ранее A.M. Уголевым и В.В. Кузьминой (1993) в экспериментах с трибутирином были выявлены различные эффекты модификатора у рыб, относящихся к различным систематическим и экологическим группам. В своей работе авторы не объяснили, чем обусловлены данные различия в ответной реакции ферментов на присутствие модификатора. В наших экспериментах было установлено, что у белого амура глицин вызвал статистически достоверное (р<0,01) увеличение уровня активности суммарной протеиназы, в то время как у леща и карася напротив привел к достоверному (р<0,001) ингибированию уровня активности данного фермента. Все эти три вида относятся к

одному семейству Cyprinidae, а по типу питания белый амур является типичным растительноядным видом, в то время как карась и лещ относятся к группе бентофагов. Таким образом, с большей степенью вероятности можно сделать предположение о том, что ответная реакция фермента на присутствие того или иного субстрат-регулятора обусловлена как особенностями питания исследуемого вида, так и его таксономической принадлежностью.

При этом данные, полученные при исследовании влияния углеводов, аминокислот на уровень активности кишечной щелочной фос-фатазы и суммарной протеиназы демонстрируют идентичную реакцию ферментов на присутствие модификатора у всех исследованных нами представителей семейства Acipenseridae. По всей вероятности, это связано с тем, что пищеварительные ферменты у рыб данного семейства имеют близкую структуру регуляторных центров. Также интересно подчеркнуть, что эти же модификаторы у рыб, относящихся к другим семействам, могут вызвать противоположный эффект. Эти данные дают возможность сделать предположение, что у рыб разных таксономических групп структура регуляторных центров одноименных ферментов различна.

4. Взаимодействие пищевых веществ в процессе пищеварения в слизистой оболочки кишечника рыб

Одной из наиболее важных биологических закономерностей функционирования пищеварительной системы является ее тонкая приспособляемость к качеству пищи, обнаруженная еще на рубеже 19-20 веков в классических работах И.П. Павлова (1951). В последующих исследованиях данная закономерность получила дальнейшее подтверждение (Уголев, 1961, 1972, 1978, 1991; Шлыгин, 1967; Сог-ring, 1980; Уголев и др., 1986; Адаптационно-компенсаторные процессы..., 1991; Уголев, Кузьмина, 1993; Неваленный, 1996; Невален-ный и др., 2003 и др.). Необходимо отМетить, что сущность пищевого или субстратного регулирования состоит в специфическом изменении структурных и функциональных характеристик кишечника, в том числе, ферментативной активности, в ответ на изменение состава пищи. При этом адаптивное изменение пищеварительной функции кишечника осуществляется как за счет регулирования численности эн-тероцитов, так и путем изменения их свойств (Уголев, 1972, 1978, 1991; Johnson, 1987; Уголев, и др., 1991; Неваленный, 1996; Невален-ный и др., 2003).

В реально протекающем гидролитическом процессе одновременно перевариваются белки, жиры и углеводы которые определенным образом влияют друг на друга, что было достаточно подробно исследовано у высших позвоночных животных (Уголев, 1972; Кушак, 1983). Имеются также отдельные сведения и о взаимодействии пищевых веществ в процессе гидролиза в кишечнике рыб (Кузьмина, 1997, Уголев, Кузьмина, 1993; Неваленный и др., 1996; Неваленный, Коро-стелев, 2002; Неваленный и др., 2003). Однако при исследовании полисубстратного пищеварения, как правило, пользуются простейшей моделью одновременного взаимодействия двух различных веществ. Для усложнения модели, нами были исследованы не только бисубст-ратные, но и трисубстратные взаимодействия веществ, являющимися субстратами при оценке основных ферментов слизистой оболочки кишечника рыб. Сопоставление интенсивности гидролиза гомогена-тами слизистой оболочки кишечника рыб, относящихся к различным систематическим и экологическим группам, биополимера (казеина), дисахарида (мальтозы) и эфира фосфорной кислоты (п-нитрофенилфосфата №) по отдельности и в присутствии одного или двух веществ позволило выявить эффекты взаимодействия субстратов ферментативных реакций. При этом важно отМетить, что при исследовании бисубстратного взаимодействия одно и тоже вещество может служить одновременно активатором для одного ферментативного процесса и ингибитором для другого (рис. 3). Однако крайне интересен тот факт, что эффекты трисубстратного пищеварения не являются суммой бисубстратных эффектов, более того они могут иметь противоположную направленность.

Важно подчеркнуть, что в наших экспериментах во всех случаях трисубстратных взаимодействий при исследовании основных ферментов слизистой оболочки кишечника всех исследованных нами видов рыб обнаружен только активирующий эффект. При этом исследовались ферменты как карбогидразного, так и протеиназного цикла в связи с этим, полученные данные можно с большей долей вероятности экстраполировать на процессы пищеварения, осуществляемые в кишечнике рыб в реальных условиях.

Еще И.П. Павлов (1951) высказал предположение о возможности взаимных влияний, возникающих при переваривании различных пищевых веществ, которое подтвердилось только после открытия в 50-х годах 20 века механизма мембранного пищеварения (Уголев, 1961, 1972), так как именно благодаря ему происходит взаимодействие между различными компонентами пищи, а, кроме того, не сущее-

Рис. 3. Уровень активности щелочной фосфатазы (А), мальтазы (Б) и суммарной протеиназы (В) слизистой оболочки кишечника рыб в присутствии различных субстратов.

Обозначения: по вертикали - уровень активности фермента в процентах от контроля принятого за 100%.

твовало сколько-нибудь удовлетворительной теории, объясняющей механизм действия и регуляции ферментативных процессов.

При исследовании высших позвоночных животных было установлено существование сложной системы взаимодействия пищевых веществ в процессе мембранного гидролиза. В частности, показано, что если в пищеварительный канал одновременно поступают жиры, белки и углеводы, сначала перевариваются жиры, затем углеводы и, наконец, белки. При моносубстратных процессах с наибольшей скоростью перевариваются белки, а наиболее медленно - жиры. Кроме того, в присутствии жиров имеет место смещение зоны гидролиза белков в дистальном направлении кишечника (Уголев, 1972; ^о1еу е! а1., 1975).

Известно, что переваривание пищи является типичным ферментативным процессом. В связи с этим, данные об изменении хода гидролиза при одновременном присутствии в инкубационной среде нескольких субстратов, по сути дела, характеризуют изменения активности кишечных ферментов, или их регуляцию, под влиянием модификаторов. Следовательно, взаимодействие пищевых веществ в процессе мембранного пищеварения является регуляцией на уровне активности пищеварительных ферментов и может быть описано с помощью существующих в настоящее время теорий. Показано, что регуляция ферментативной активности осуществляется на двух уровнях. Первый, применительно к собственнокишечным ферментам, связан с процессом синтеза ферментативного белка и транслокацией его в мембрану энтероцита; регуляция второго типа происходит на основе уже существующих молекул белка и сопряжена с изменение их структуры (обзор: Хочачка, Сомеро, 1977, 1988; Кушак, 1983; Адаптационно-компенсаторные процессы..., 1991; Неваленный, 1996; Озернюк, Нечаев, 2002; Неваленный и др., 2003 и др.). Естественно, что в процессе полисубстратного пищеварения регуляция активности пищеварительных процессов не связана с синтезом белка, на который необходимо определенное время, а осуществляется практически мгновенно, иногда в доли секунды, за счет изменения активности ферментов в результате их связывания с тормозящим или стимулирующим субстратом-регулятором (модификатором).

Таким образом, установленные нами у рыб процессы ди- и три-субстратных взаимодействий имеют чрезвычайное значение для понимания механизма реализации пищеварительной функции у рыб. Они обеспечивают тесное сопряжение работы различных ферментативных цепей в кишечнике рыб, чем достигается определенный авто-

матизм в работе пищеварительной системы и настройка ее на соответствующий вид пищи. Следовательно, путем регуляции на уровне активности пищеварительных ферментов осуществляется определенная последовательность в обработке пищи и, по-видимому, интеграция пищеварительных и транспортных процессов.

Необходимо также оmMетить, что при исследовании 12 видов рыб, относящихся к различным таксономическим и экологическим группам, выявлены некоторые закономерности полисубстратных процессов, принципиально близкие описанным ранее для высших позвоночных животных (Уголев, 1972; Уголев и др., 1979; Кушак, 1983 и др.) и рыб (Хюттер и др., 1986; Кузьмина, 1987, 1991; Уголев, Кузьмина, 1993; Неваленный, 1996; Неваленный и др., 2003). Так установлено, что мальтаза, щелочная фосфатаза и ферменты группы суммарной протеиназы обеспечивающие процессы мембранного пищеварения у рыб, являются регулируемыми и способны изменять активность под действием различных компонентов пищевой смеси. Вместе с тем сопоставление в идентичных методических условиях влияния модификаторов различной природы на одноименные ферменты у рыб разных видов позволило выявить неоднозначность их эффектов.

Таким образом, у рыб и, вероятно, других пойкилотермных животных эффект модификаторов может значительно варьировать в силу большей гибкости макромолекул, входящих в состав фермент-мембранных комплексов, по сравнению с гомойтермными животными (Егорова и др., 1974; Александров, 1975; Уголев и др., 1976, 1981; Кузьмина, 1987; Уголев, Кузьмина, 1993; Неваленный, 1996; Нева-ленный и др., 2003).

Полученные данные важны не только для понимания закономерностей мембранного пищеварения у рыб и других животных, но и имеют определенное значение для понимания механизма реализации пищеварительной функции in situ. Использованные в данной работе методические подходы могут оказаться полезными при исследовании темпов биохимической эволюции, причем характеристики регулятор-ных свойств ферментов, по-видимому, могут быть одним из инструментов биохимической систематики. Помимо этого, различие регуля-торных свойств ферментов у рыб разных таксономических групп важно учитывать при составлении рационов искусственно разводимых рыб.

ВЫВОДЫ

1. Продемонстрировано, что ферменты, обеспечивающие про. цессы мембранного пищеварения у рыб различных экологических и систематических групп, являются регулируемыми и способны изменять гидролитическую активность под действием различных веществ органической и неорганической природы.

2. Обнаружены видовые различия в уровне активности одноименных гидролаз в кишечнике исследованных видов рыб. Так показано, что хищные виды рыб имеют более высокий уровень активности ферментов комплекса суммарной протеи-назы, тогда как мирные - мальтазы, что свидетельствует о наличии у рыб видовой адаптации пищеварительной системы к спектру питания.

3. При исследовании в условиях in vitro выявлено влияние ионов металлов (Mn, Fe, Co, Ni, Си и Zn) на уровень активности пищеварительных гидролаз слизистой оболочки кишечника рыб, выражающееся в достоверном (р<0,05) изменении уровня активности ферментов. Так, ответная реакция ферментов слизистой оболочки кишечника рыб под действием ионов металлов зависит от его положения в Периодической таблице химических элементов - максимальное активирующее влияние оказывают металлы, находящиеся в начале периода, а максимальное ингибирующее - в конце.

4. Выявлена идентичная реакция уровня активности пищеварительных ферментов на присутствие в инкубационной среде углеводов и аминокислот у представителей сем. Acipenseridae, свидетельствующая о том, что пищеварительные ферменты рыб данного семейства имеют близкую структуру регулятор-ных центров.

5. В результате исследований закономерностей взаимодействия продуктов гидролитических реакций с пищеварительными ферментами продемонстрировано явление ретроингибирова-ния. Так, уровень активности мальтазы слизистой оболочки кишечника различных видов рыб существенно уменьшается (от 30 до 80% в зависимости от вида рыб) в присутствии продуктов гидролиза мальтозы.

6. Выявлены процессы взаимодействия субстратов ферментативных реакций (мальтозы, казеина и п-нитрофенилфосфата

№) при исследовании ферментативных препаратов слизистой оболочки кишечника рыб. Продемонстрировано, что одно и тоже вещество может служить одновременно активатором для одного ферментативного процесса и ингибитором для другого. Показано, что эффекты трехсубстратного пищеварения у рыб не являются суммой бисубстратных эффектов, при этом во всех случаях трисубстратных взаимодействий обнаружен только активирующий эффект.

7. При исследовании гидролитических процессов в кишечнике 12 видов рыб, относящихся к различным экологическим группам, установлено, что ответная реакция уровня активно_сти пищеварительных ферментов зависит как от природы модификатора, находящегося в инкубационной среде, так и от систематического положения рыб. Это свидетельствует о существовании филогенетических и систематических адаптационных приспособлений пищеварительной системы рыб к условиям среды обитания.

Список публикаций по теме диссертации

1. Функциональная организация и адаптивная регуляция процессов пищеварения у рыб // Моногр. - Астрахань: ФГОУ ВПО «Астрахан. гос. техн. ун-т», 2003. - 152 с. (А.Н. Нева-ленный, А.В. Туктаров)

2. Влияние некоторых металлов на уровень активности щелочной фосфатазы в слизистой кишечника рыб // Эколого-биологические проблемы Волжского региона и Северного прйкаспия: Матер. 3 Всерос. научн. конф. -Астрахань: Изд-во Астраханского гос. пед. ун-та, 2000. -с. 170-171 (А.Н. Нева-ленный, А.В. Туктаров)

3. Воздействие некоторых микроэлементов на уровень активности щелочной фосфатазы и а-амилазы слизистой кишечника тарани // Вопросы рыболовства том 1. № 2-3. 2000, часть II. -с. 67-68 (А.Н. Неваленный)

4. Действие микроэлементов на уровень активности некоторых пищеварительных ферментов карпа // Межд. Научно-техн. конф. посв. 70-летию основания Калининградского гос. техн. ун-та, Часть IV, Калининград. 2000, -с. 298-299 (А.Н. Нева-ленный)

5. Динамика активности пищеварительных гидролаз карпа под действием ряда микроэлементов // Наука производству. №6 (44)/2001, -с. 24-26 (А.Н. Неваленный, А.В. Туктаров)

6. The influence of some metals' ions to alkaline phoshatatoin's active level of white sturgeon's mucus intestines Huso huso L. // Extended abstracts: 4 International symposium on sturgeon. Osh-kosh, Wisconsin, USA. 2001. PP119 (A.N. Nevalennyy, A.V. Tuktarov)

7. Взаимодействие пищевых модификаторов с мембранно-связанными ферментами в кишечнике белуги и белорыбицы // Естественные науки. №5. Астрахань. Изд-во Астраханского гос. пед. ун-та, 2002, - с. 66-69 (А.Н. Неваленный)

8. Влияние модификаторов углеводной природы на процесс мембранного гидролиза у рыб // Эколого-биологические проблемы Волжского региона и Северного прикаспия: Матер. V Всерос. науч. конф. -Астрахань: Изд-во Астраханского гос. пед. ун-та, 2002. -с. 126-128 (А.Н. Неваленный)

9. Iinfluence of some metals on the alkaline phoshatatoin activity of white sturgeon Huso huso L mucus intestine // Technical compendium to the proceeding of the 4th International Symposium on Sturgeon. Oshkosh, Wisconsin, USA, Juli 8-13, 2001. Collection of Extended Abstracrs and Presentation Summaries/ December 2002. P. 046 (A.N. Nevalennyy, A.V. Tuktarov)

10. Влияние аминокислот на мембранный гидролиз углеводов и эфира фосфорной кислоты у рыб // Материалы XI межд. Сим-поз. "Эколого-физиологические проблемы адаптации". М.: Изд-во РУДН, 2003. -с. 56-57

11. The regulations of in the carp's intestines in presence of some microelements // International conference „Aquaculture Europe 2002", Trieste. Italy. October 19-19. - P. 374-376 (A.N. Nevalennyy, A.V. Tuktarov)

12. Digestive enzymes activity level changes of the sturgeon fishes under the influence of microelements // International conference „Aquaculture Europe 2002", Trieste. Italy. October 19-19. - P. 377-378 (A.N. Nevalennyy, A.V. Tukrarov, R.I. Aljanov)

13. The influence of some metals on digestive processes of sturgeons // International conference „Aquaculture Europe 2001" New species. New technologies. - P. 192 (A.N. Nevalennyy, A.V. Tuk-tarov, R.I. Aljanov)

14. Исследование полисубстратного пищеварения у белого толстолобика и белого амура в условиях in vitro // Эколого-биологические проблемы бассейна Каспийского моря: MaTep.VI Межд. научн. конференции: -Астрахань Изд-во Астраханского гос. ун-та, 2003. -с. 110-112 (А.Н. Неваленный)

15. Модификационное регулирование уровня активности мальта-зы у рыб сем. Acipenseride и Cyprinidae // Эколого-биологические проблемы бассейна Каспийского моря: Матер. VII Межд. научн. конф: -Астрахань: Изд-во Астраханского гос. ун-та, 2004. -с. 99-100 (А.Н. Неваленный)

АГТУ Зак. 848 Тир. 100 17.11.04 г.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бедняков, Дмитрий Андреевич

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Современные концепции пищеварения и транспорта пищевых веществ в кишечнике рыб.

1.1.1. Полостное (внеклеточное или дистантное) пищеварение.

1.1.2. Внутриклеточное пищеварение. 1.1.3. Мембранное пищеварение.

J 1.1.4. Краткая характеристика процессов всасывания в кишечнике рыб.

1.2. Влияние модификаторов на процесс пищеварения рыб.

1.2.1. Взаимодействие пищевых веществ в условиях in vitro.

1.2.2. Взаимодействие пищевых веществ в условиях in vivo.

1.3. Действие металлов на биологические системы рыб.

Глава 2. Материал и методы исследования.

2.1. Характеристика исследуемых рыб. s 2.2. Техника приготовления ферментативно активных препаратов и условия проведения экспериментов.

2.3. Определение уровня активности ферментов.

2.3.1. Определение уровня активности суммарной протеиназы.

2.3.2. Определение уровня активности мальтазы.

2.3.3. Определение уровня активности щелочной фосфатазы.

2.4. Статистическая обработка данных.

Глава 3. Влияние ионов металлов на уровень активности пищеварительных гидролаз.

3.1. Влияние ионов металлов на уровень активности щелочной фосфатазы слизистой оболочки кишечника рыб.

3.2. Влияние ионов металлов на уровень активности мальтазы слизистой оболочки кишечника рыб.

3.3. Влияние ионов металлов на уровень активности суммарной протеиназы слизистой оболочки кишечника рыб.

Глава 4. Влияние углеводов и аминокислот на уровень активности пищеварительных ферментов рыб.

4.1. Влияние углеводов и аминокислот на уровень активности щелочной фосфатазы слизистой оболочки кишечника рыб.

4.2. Влияние углеводов и аминокислот на уровень активности мальтазы слизистой оболочки кишечника рыб.

4.3. Влияние углеводов и аминокислот на уровень активности суммарной протеиназы слизистой оболочки кишечника рыб.

Глава 5. Взаимодействие пищевых веществ в процессе пищеварения в слизистой оболочки кишечника рыб.

5.1. Влияние мальтозы и казеина на уровень активности щелочной фосфатазы слизистой оболочки кишечника рыб.

5.2. Влияние п-нитрофенилфосфат № и казеина на уровень активности мальтазы слизистой оболочки кишечника рыб.

5.3. Влияние п-нитрофенилфосфат Ыа и мальтозы на уровень активности суммарной протеиназы слизистой оболочки кишечника

Глава 6. Обсуждение результатов.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Модификационное регулирование уровня активности некоторых пищеварительных ферментов у рыб"

Актуальность проблемы. Адаптация пищеварительной системы занимает среди других адаптаций особое место в связи с тем, что между уровнем субстратной нагрузки и функционированием желудочно-кишечного тракта, в том числе и уровнем активности пищеварительных ферментов существует тесная связь (Уголев, 1985; Уголев, Кузьмина, 1993; Неваленный и др., 2003). В связи с этим механизм перестройки структуры и функции в ответ на изменение нагрузки имеет важное значение для функционирования пищеварительной системы и организма рыб в целом (обзоры: Хочачка, Сомеро, 198; Уголев, Кузьмина, 1993; Неваленный и др., 2003 и мн.др.). Наиболее доступной моделью для решения фундаментальных проблем адаптации является пищеварительная система, это связано с тем, что «кишечник является центральным органом, который реализует не только основные процессы переваривания и всасывания пищи, но и регулирование, связывающее собственно желудочно-кишечный тракт с метаболизмом организма благодаря мощной кишечной гормональной (энтериновой) системе» (цит. по: Адаптационно-компенсаторные процессы., 1991).

В течении последних лет для рыб описаны все известные типы пищеварения, изучены процессы транспорта нутриентов в кишечнике, индуцированного аутолиза (обзор: Уголев, Кузьмина, 1993; Неваленный, 1996; Рауюэ а1., 2000; 8ра^§аагс1 ег а1., 2000; Кузьмина, Скворцова, 2003; Кузьмина и др., 2003; Извекова, Лаптева, 2004). В результате чего пищеварение у рыб в настоящее время описывается как шестизвенный процесс. Тем не менее, механизмы взаимодействия пищевых веществ (модификационные эффекты) в процессе пищеварения в кишечнике рыб остаются до конца не выясненными (Кузьмина, Голованова, 1998; Туктаров, 2002; Неваленный и др., 2001 в, 2003). В то время как результаты, полученные при разработке данных вопросов, необходимы для решения ряда теоретических и прикладных проблем питания и пищеварения у рыб.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилось изучение in vitro влияния модификаторов различной природы на уровень активности некоторых гидролитических ферментов пищеварительной системы белуги, русского осетра, севрюги, щуки, белого амура, леща, сазана, карася белого толстолобика, окуня ерша и берша.

В связи с этим в процессе работы предстояло решить следующие задачи:

1. Исследовать влияние ионов шести »металлов четвертого периода периодической системы химических элементов Д. И. Менделеева (Mn, Fe (II), Со, Ni, Си и Zn) в концентрации 10 мг/л на уровень активности суммарной протеиназы, мальтазы и щелочной фосфатазы слизистой оболочки кишечника рыб различных экологических и систематических групп.

2. Изучить влияние углеводов (глюкозы, фруктозы) и аминокислот (глицина, L-глутамина, L-лейцина и DL-p-фенила-а-аланина) на уровень активности мальтазы, щелочной фосфатазы и суммарной протеиназы слизистой оболочки кишечника рыб.

3. Сопоставить интенсивность гидролиза гомогенатами слизистой оболочки кишечника 12 видов рыб, относящихся к различным экологическим и систематическим группам, 2% раствора мальтозы, 1% раствора казеина, 0,6 шМ раствора n-нитрофенилфосфата Na по отдельности и в присутствии одного или двух веществ, являющихся субстратами при определении активности мальтазы, суммарной протеиназы и щелочной фосфатазы соответственно.

4. Выявить видовые различия характера ответной реакции гидролитических систем кишечника рыб на действие исследованных модификаторов. Научная новизна работы. Впервые получены данные по исследованию влияния модификаторов различной природы на уровень активности комплекса пищеварительных ферментов (суммарной протеиназы, мальтазы и щелочной фосфатазы слизистой оболочки кишечника) и охарактеризованы процессы полисубстратного пищеварения в кишечнике 12 видов рыб относящихся к различным экологическим и систематическим группам. Произведено сопоставление влияния модификаторов различной природы на уровень активности ферментов в кишечнике осетровых, карповых и окуневых рыб.

Установлено, что у рыб, как и у высших позвоночных животных, ферменты, обеспечивающие процессы *мембранного пищеварения являются регулируемыми и способны изменять активность под действием различных компонентов пищевой смеси.

Полученные в работе результаты позволяют сделать вывод о существовании значительного влияния, оказываемого модификаторами органической и неорганической природы, на процесс усвоения пищи, что необходимо использовать при разработке рецептур кормосмесей для объектов аквакультуры.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы представлялись на III Всероссийской научной конференции "Эколого-биологические проблемы Волжского региона и Северного Прикаспия" (Астрахань, 2000), Международной научно-практической конференции посвященной 70-летию КГТУ (Калининград, 2000), Международной конференции «Aquaculture Europe» (Тронхейм, Норвегия, 2001), Международной конференции «Aquaculture Europe» (Триест, Италия, 2002), V Всероссийской научной конференции "Эколого-биологические проблемы Волжского региона и Северного Прикаспия" (Астрахань, 2002), XI Международном симпозиуме "Эколого-физиологические проблемы адаптации" (Москва, 2003), VI Всероссийской научной конференции "Эколого-биологические проблемы Волжского региона и Северного Прикаспия" (Астрахань, 2003), VII Всероссийской научной конференции "Эколого-биологические проблемы Волжского региона и Северного Прикаспия" (Астрахань, 2004) и научно-методических конференциях профессорско-преподавательского состава АГТУ.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ.

Объем и структура работы. Диссертация представлена на 157 страницах машинописного текста, иллюстрирована 33 рисунками и 3 таблицами. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, 3х глав с изложением собственных результатов исследований, обсуждения результатов, выводов, указателя цитируемой литературы. Список литературы включает 226 источника, в том числе 135 работ отечественных и 91 работ иностранных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Бедняков, Дмитрий Андреевич

выводы

1. Продемонстрировано, что ферменты, обеспечивающие процессы мембранного пищеварения у рыб различных экологических и систематических групп, являются регулируемыми и способны изменять гидролитическую активность под действием различных веществ органической и неорганической природы.

2. Обнаружены видовые различия в уровне активности одноименных гидролаз в кишечнике исследованных видов рыб. Так показано, что хищные виды рыб имеют более высокий уровень активности ферментов комплекса суммарной протеиназы, тогда как мирные - мальтазы, что свидетельствует о наличии у рыб видовой адаптации пищеварительной системы к спектру питания.

3. При исследовании в условиях in vitro выявлено влияние ионов металлов (Mn, Fe, Со, Ni, Си и Zn) на уровень активности пищеварительных гидролаз слизистой оболочки кишечника рыб, выражающееся в достоверном (р<0,05) изменении уровня активности ферментов. Так, ответная реакция ферментов слизистой оболочки кишечника рыб под действием ионов металлов зависит от его положения в Периодической таблице химических элементов - максимальное активирующее влияние оказывают металлы, находящиеся в начале периода, а максимальное ингибирующее - в конце.

5. В результате исследований закономерностей взаимодействия продуктов гидролитических реакций с пищеварительными ферментами продемонстрировано явление ретроингибирования. Так, уровень активности мальтазы слизистой оболочки кишечника различных видов рыб существенно уменьшается (от 30 до 80% в зависимости от вида рыб) в присутствии продуктов гидролиза мальтозы.

6. Выявлены процессы взаимодействия субстратов ферментативных реакций (мальтозы, казеина и п-нитрофенилфосфата №) при исследовании ферментативных препаратов слизистой оболочки кишечника рыб. Продемонстрировано, что одно и тоже вещество может служить одновременно активатором для одного ферментативного процесса и ингибитором для другого. Показано, что эффекты трехсубстратного пищеварения у рыб не являются суммой бисубстратных эффектов, при этом во всех случаях трисубстратных взаимодействий обнаружен только активирующий эффект.

7. При исследовании гидролитических процессов в кишечнике 12 видов рыб, относящихся к различным экологическим группам, установлено, что ответная реакция уровня активности пищеварительных ферментов зависит как от природы модификатора, находящегося в инкубационной среде, так и от систематического положения рыб. Это свидетельствует о существовании филогенетических и систематических адаптационных приспособлений пищеварительной системы рыб к условиям среды обитания.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бедняков, Дмитрий Андреевич, Астрахань

1. Адаптационно-компенсаторные процессы: На примере мембранного гидролиза и транспорта / Под ред. A.M. Уголева. -Л.: Наука, -1991, -288с.

2. Алейникова Т.Л., Рубцова Г.В. Биохимия. Руководство к практическим занятиям по биологической химии. -М.: Высшая школа, -1988, -239 с.

3. Александров В.Я. Клетки, макромолекулы и температура. Л.: Наука, 1975. -329 с.

4. Аминева В.А., Яржомбек A.A. Физиология рыб. М.: Легкая и пищевая промышленность, -1984, - 200 с.

5. Балаховский И.С. в кн.: Лабораторные методы исследования в клинике / Под ред. В .В. Меньшикова, М.: Медицина, 1987. С. 230-234.

6. Блюгер А.Ф., Новинцкий И.Н., Кушак А.Г. Исследование процессов полисубстратного пищеварения в кишечнике. // Теоретические и прикладные аспекты мембранного пищеварения. Тез. докл. 2-го Всес. симпозиума-Рига, Зинатне, 1978. С. 17-19.

7. Войнар А.И. Биологическая роль микроэлементов в организме животных и человека.- М.: Высшая школа, I960.- 544 с.

8. Ю.Волкова И.В. Активность пищеварительных ферментов растительноядных рыб на разных этапах онтогенеза // Дис. канд. биол. наук Астрахань,-1999, -324с.

9. П.Воробьев В.И. Биогеохимия и рыбоводство. Саратов, 1993.

10. Гамыгин Е.А. Комбикорма для рыб. -М.: Агропромиздат, -1989, -168 с.

11. З.Голованова И.Л. Интенсивность всасывания различных Сахаров в кишечнике двухлетних карпов // Биология внутренних вод. Информ. бюл. -Л.: Наука, -1985, №67, -с. 50-54.

12. Н.Голованова И.Л. Некоторые характеристики транспорта углеводов в кишечнике рыб-бентофагов на примере леща и карпа // Автореф. канд. дис. -Л.,-1991.-23 с.

13. Голованова И.Л. Анализ влияния ряда антропогенных факторов на пищеварительные карбогидразы пресноводных рыб // Биол. исслед. в Ярослав. гос. ун-те: юбил. сб. тез. конф., Ярославль, 29 нояб., 1996. Ярославль, изд-воЯГУ, 1997.- С. 50-52.

14. Голованова И.Л., Кузьмина В.В. Влияние дихлофоса, нафталина и кадмия на морфофункциональные характеристики кишечника тилипии Oreochromis mossambicus Peters // Биол. внутр. вод. 1998.- №1.- С. 8087.

15. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты: Пер. с англ. М.: Мир, 1982.- Т. 1-3 -1120 с.

16. Егоров С.Н. Исследование влияния некоторых природных и антропогенных факторов на эффективность мембранного пищеварения карпа // Автореф. канд. дис. Астрахань, -1995. -24с.

17. Егорова В.И. Особенности мембранного пищеварения у карповых рыб // Автореф. канд. дис. Астрахань, - 2001, -24с.

18. Жизнь животных. В 7-ми т. / Гл. ред. В.Е. Соколов. Т. 4. Рыбы / Под ред. Т.С. Расса. 2-е изд., перераб. - М.: Просвещение, 1983.- 575 с.

19. Извекова Г.И., Лаптева H.A. Микрофлора, ассоциированная с пищева-рительно-транспортнымм поверхностями рыб и паразитирующих в них цестод. Экология, 2004, №3, с. 205-209.

20. Калоус В., Павличек 3. Биофизическая химия. Пер. с чешек. М.: Мир, 1985.- 446 с.

21. Коновалов Ю.Д. Влияние условий обитания производителей белого толстолоба на свойства белков их яиц // Гидробиол. ж. 1998.- 34, №5.-С. 64-79.

22. Коровина В.М., Воронина Е.П., Неелов A.B. Сравнительная характеристика пищеварительного тракта клокачей рода Dissostichus (Notothenii-dae). Вопросы ихтиологии, 2004, том. 44, №2, с. 218-224.

23. Кошланд Д. Значение гибкости в ферментативной активности. В кн.: Ферменты и синтез биополимеров. М.: Мир, -1967, с. 249-267.

24. Крыжановский С.Р. Эколого-морфологические закономерности развития карповых, вьюновых и сомовых рыб. Труды института Морфологии животных АН СССР. 1949, Вып. 1, с. 5-332.

25. Кузьмина В.В. Мембранное пищеварение у круглоротых и рыб -Вопросы ихтиологии, 1978, т. 18, вып.4(3), -с.684-696.

26. Кузьмина В.В. Нутритивные адаптации ферментов, осуществляющих мембранное пищеварение у пресноводных костистых рыб. // Журн. общ. биол., -1981, т.42, N2, -с.258-265.

27. Кузьмина В.В. Общие закономерности мембранного пищеварения у рыб и его адаптивные перестройки: Автор, дис. д-ра биол. наук. Л., -1986,-39 с.

28. Кузьмина В.В. Биоценотические аспекты физиологии питания рыб // Экология, -1990а, №5.

29. Кузьмина В.В. Активность пищеварительных ферментов слизистой кишечника у различных по экологии костистых рыб Черного моря // Вопросы ихтиологии. 1991. Т.32. №2.

30. Кузьмина В.В. Оценка полифакторных воздействий на активность протеиназ слизистой кишечника рыб // Биол. внутр. вод. 1997а.- №2.-С. 50-57.

31. Кузьмина В.В. Трофическая, защитная и трансформационная функции пищеварительной системы рыб // Первый конгресс ихтиологов России: Тез докл., Астрахань, сентябрь, 1997. М.: изд-во ВНИРО, 19976. - С. 225.

32. Кузьмина В.В. Трофическая, защитная и трансформационная функция пищеварительной системы рыб // Вопр. ихтиол. 1999. - 39, № 1. - С. 6977.

33. Кузьмина В.В. Гормональная регуляция метаболизма и процессов экзо-трофии у рыб. Полифункциональность и полипотентность // Журн. эво-люц. биохим. и физиол. 2000.- 36, №6.- С. 515-525.

34. Кузьмина В.В. Физиологические адаптации (на примере процесса экзо-трофии у рыб) // Журн. эволюц. биохим. и физиол. 2001.- 37, №3.- С. 113-121.

35. Кузьмина В.В., Гельман А.Г. Особенности становления пищеварительной функции рыб // Вопр. ихтиол. 1998.- 38, №7.- С. 113-122.

36. Кузьмина В.В., Голованова И.Л. Влияние антропогенных факторов на активность пищеварительных ферментов рыб. Биология внутренних вод, №3, 1997, с. 72-77.

37. Кузьмина В.В., Голованова И.Л. Влияние антропогенных факторов на активность пищеварительных ферментов рыб // Биол. внутр. вод. — 1998.- №3.- С. 72-77.

38. Кузьмина В.В., Голованова И.Л. Вклад карбогидраз объектов питания в процессы пищеварения хищных рыб // Вопр. ихтиол. 2001.- 41, №5.- С. 691-698.

39. Кузьмина В.В. Гарина Д.В. Влияние глюкозы, инсулина и адреналина на некоторые аспекты пищевого поведения рыб // Журн. эволюц. биохим. и физиол. 2001.-37, №2.- С. 116-120.

40. Кузьмина В.В., Попова Т.А. Активность некоторых гидролаз в кишечнике леща из водохранилищ Волжского каскада // Биол. внутр. вод. 1994. - №96. - С. 59-67.

41. Кузьмина В.В., Таликина М.Г. Влияние экстремальных воздействий в период раннего индивидуального развития на пищеварительные гидролазы сеголеток плотвы Rutilus rutilus // Вопр. ихтиол. — 1998.- 38, №4.- С. 524-529.

42. Кузьмина В.В., Скворцова Е.Г. Активность протеолитических ферментов потенциальных объектов питания хищных рыб. Влияние природных и антропогенных факторов. Вопросы ихтиологии. 2001, том. 41, №2, с. 239-248.

43. Кузьмина В.В., Скворцова Е.Г. Вклад протеолетических ферментов объектов питания в процессы пищеварения хищных рыб. Вопросы ихтиологии. 2003, Том. 43, №2с. 209-214.

44. Кузьмина В.В., Голованова И.Л., Скворцова Е.Г. Вклад ферментов кормовых объектов в процессы пищеварения рыб. Влияние природных и антропогенных факторов // Вопр. ихтиол. 1999а.- 39, №3.- С. 384-393.

45. Кузьмина В.В., Голованова И.Л., Скворцова Е.Г. Вклад ферментов кормовых объектов в процессы пищеварения рыб // 2-й Междунар. симп. «Ресурсосберег. технол. в аквакультуре», Адлер, 4-7 окт., 19996: Матер, докл. Краснодар, изд-во КубГУ, 19996. - С. 203.

46. Кузьмина В.В., Известкова Г.И., Куперман Б.И. Особенности физиологии питания цестод и их хозяев рыб // Успехи современной биологии. - 2000. - 120, №4.- С. 384-394.

47. Кузьмина В.В., Гарина Д.В., Герасимов Ю.В. Роль глюкозы в регуляции пищевого поведения рыб. Вопросы ихтиологии. 2002,Том. 42, №2, с. 253-258.

48. Кузьмина В.В., Голованова И.Л., Скворцова Е.Г. Методические подходы к оценке вклада ферментов объектов питания в процессы пищеварения рыб. Вопросы ихтиологии., 2003, Том. 43, №5, с. 705-710.

49. Куперман Б.И., Кузьмина В.В. Ультраструктура кишечного эпителия щуки Еэох Ьдсшэ Ь. // Вопр. ихт., -1984, т. 24, вып. 3, -с. 431-437.

50. Куперман Б.И., Кузьмина В.В. Структурная и функциональная топор-графия кишечника рыб разных экологиченских групп // Экологическая физиология и биохимия рыб. Вильнюс, -1985, -с.489-490.

51. Кушак Р.И. Пищеварительно-транспортная система энтероцитов. Рига: Зинатне, 1983.-304 с.

52. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1990,- 370 с.

53. Лебедев В.Д., Скаковская В.Д., Совваинов P.A. и др. Рыбы СССР. М.: Мысль, 1969. 447с.

54. Леус Ю.В., Грубинко В.В. Активность антиоксидантной системы карпа при действии ионов тяжелых металлов // Гидробиол. Журнал, — 1998.34, №2.-С. 59-63.

55. Линдберг Г.У. Определитель рыб и характеристика семейств мировой фауны. Л.: Наука, 1971.- 470 с.

56. Мембранный гидролиз и транспорт: Новые данные и гипотезы. Л.: Наука.-1986. -240 с.

57. Неваленный А.Н. Влияние температуры на эффективность функционирования транспортных систем кишечника рыб // Автореф. канд. дис. М., -1987, -24с.

58. Неваленный А.Н. Функциональная организация и адаптивная регуляция процессов пищеварения у рыб в различных экологических условиях // Автореф. докт. дис. М., -1996, -35 с.

59. Неваленный А.Н., Туктаров A.B. Исследование процессов аккумуляции углеводов и аминокислот в кишечнике осетровых рыб. Осетровые нарубеже 21 века. Тез. докл. международной конф. Астрахань, 20006 с. 178-179.

60. Неваленный А.Н., Туктаров A.B. Воздействие микроэлементов на пищеварительную функцию слизистой кишечника некоторых карповых рыб. Матер. Международной конф. посвященной 70-летию АГТУ, Астрахань. 2000в. с. 258-259.

61. Неваленный А.Н., Коростелев С.Г. Влияние модификаторов на процесс мембранного пищеварения у сибирского осетра Acipenser baeri // Журн. эволюц. биохим. и физиол. -2002,- 38, №2.- С. 185-187.

62. Неваленный А.Н., Бедняков Д.А. Токсическое воздействие солей тяжелых металлов на процесс мембранного гидролиза в кишечнике белого амура. Проблемы охраны здоровья и окружающей среды: Сб. науч. трудов. Астрахань, 2001. - 272-275 с.

63. Неваленный А.Н., Бедняков Д.А. Влияние ионов кадмия в среде на уровень активности ферментов, обеспечивающих процессы мембранного пищеварения у карпа. Экология, 2004, 4 №2, с. 152-155.

64. Неваленный А.Н., Коростелев С.Г., Егоров С.Н. Активность некоторых пищеварительных ферментов рыб ильменя Горчичный // Вестник Аст-рыбвтуза, Астрахань., изд-во АТИРПиХ, -1993, N1, -с.91-93.

65. Неваленный А.Н., Коростелев С.Г., Егоров С.Н. Исследование температурных характеристик кишечной а-амилазы иссык-кульского чебачка // Вестник АГТУ, Астрахань, изд-во АГТУ, -1994,- №1, с.58-60.

66. Неваленный А.Н., Коростелев С.Г., Егоров С.Н. Взаимодействия пищевых веществ в процессе пищеварения у рыб на примере карпа // Журн. эволюц. биох. и физиол. 1996.- 32, №2.- С. 156-159.

67. Неваленный А.Н., Коростелев B.C., Витвицкая Л.В., Егорова В.И. Нут-ритивные адаптации процесса пищеварения у осетровых рыб. Докл. РАН, 1997, т.352. №6. С. 837-839.

68. Неваленный А.Н., Туктаров A.B., Горбани Р. Влияние тяжелых металлов на уровень активности кислой протеиназы желудка белуги. Мат. X международного симпозиума "Эколого-физиологические проблемы адаптации" М.: Изд-во РУДН. 20016. с. 375-376.

69. Никольский Г.В. Экология рыб. -М.: Высшая школа, -1974, -336 с.

70. Никольский H.H., Трошин A.C. Транспорт сахоров через клеточные мембранны. JL: Наука, 1973. 222 с.86.0зернюк Н.Д., Нечаев С.К. Анализ механизмов адаптационных процессов. Известия АН. Серия биологическая, 2002, №4. с. 457-462.

71. Орлова Э.А., Попова O.A., Возрастные изменения в питании сома и щуки в авандельте Волги. Вопросы ихтиологии. 1987, том 27, вып.1, с. 140-148.

72. Павлов И.П. (1897). Лекции о работе главных пищеварительных желез // Полн. собр. соч. М.,Л.: Изд-во АН СССР, -1951, т.2, кн.2. -с. 11-215.

73. Перуц М.Ф. Некоторые примеры контроля на молекулярном уровне в биологии. В сб.: Функциональная биохимия клеточных структур. М.: Наука, 1970, с. 207-217.

74. Поляновский O.JI., Заглянский Ю.А., Тумерман Л.А. Молекулярные параметры и структура аспартата-трансаминазы и её субъедениц. Молекулярная биология, т.4, в.З, 1970, с. 458-470.

75. Попова O.A. Роль хищных рыб в экосистемах.// Изменчивость рыб пресноводных экосистем. М.: Наука, 1979а, с. 13-47.

76. Попова O.A. Питание и пищевые взаимоотношения судака, окуня и ерша в водоемах разных широт. // Изменчивость рыб пресноводных экосистем. М.: Наука, 19796, с. 106-160.

77. Промысловые рыбы СССР. М.: Пищпромиздат, 1949, с. 407-409.

78. Рощина Г.М. Особенности всасывания углеводов у некоторых видов костистых рыб // Журн. эволюц. биохим. физиол., 1981, т. 17, -с.93-94.

79. Слоним. А.Д. Экологическая физиология животных. -М.: Высшая школа, 1971.-448 с.

80. Столяр О.Б., Курант В.З., Балабан Р.Б. Влияние ионов меди на тиоловые соединения в печени карпа // Вопр. ихтиол. 1998.- 38, №4,- С. 87-91.

81. Таран Л.Д., Самусь Н.В. Сравнительное исследование структуры активных центров трипсина быка и тихоокеанских лососевых // Укр. биохим. журн. 1994.- 66, №3.- С. 49-54.

82. Тарвид И.Л., Кушак Р.И. Регуляторные свойства кишечных пептидаз и их изменения в онтогенезе. В кн.: Материалы VI конф. Биохимиков Прибалтийских республик, Белоруской ССР и Ленинграда. Ригаб 1981, с. 136-137.

83. Туктаров A.B. Влияние ионов металлов на пищеварительно-транспортную функцию кишечника осетровых рыб // Автореф. канд. дис. Астрахань, - 2002. - 21 с.

84. Туктаров A.B., Бедняков Д.А. Динамика уровня активности кишечной щелочной фосфатазы карпа под действием ионов кадмия. Мат конф. Белки маркеры патологических состояний. Астрахань: АГМА. 2001.-с. 106.

85. Туляганова Е.Х. Материалы по регулированию мембранного пищеварения. Автореф. дис. канд. биол. наук. Д., 1972. 21 с.

86. Турпаева Т.М. К вопросу о приспособлении пищеварительной системы рыб к роду пищи // Бюл. эксперимент. Биологии и медицины. 1941. Т. 12. Вып. 1-2.

87. Тюкавкина H.A., Бауков Ю.И. Биоорганическая химия. М.: Медицина, 1985.-480 с.

88. Уголев A.M. О существовании пристеночного (контактного) пищеварения. //Бюл. экспер. биолог, и мед., -1960. т.49. - №1. -с. 12-17.

89. Уголев A.M. Материалы по пристеночному пищеварению. III. Сопоставление ферментативного гидролиза крахмала в кишке и in vitro. Бюл. Эксперим. Биологии и медицины, 1961, т.52, №8, с. 8-12.

90. Уголев A.M. Пристеночное (контактное) пищеварение. -М.: Изд-во АН СССР,-1963,- 170 с.

91. Уголев A.M. Мембранное пищеварение и процессы усвоения пищи в мире животных. // Журн. эволюц. биохим. и физиол., т.8, N3, -1972, -с. 269-278.

92. Уголев A.M. Трофология новая междисциплинарная наука // Вестник АН СССР. 1980. -№ I. -С.50-61.

93. Уголев A.M. Эволюция пищеварения и принципы эволюции функции: Элементы современного функционализма. Л.: Наука, -1985, -544 с.

94. Уголев A.M. Естественные технологии биологических систем. Л.: Наука, 1987. -317 с.

95. Уголев A.M., Цветкова В.А. Индуцированный аутолиз как важный механизм начальных стадий пищеварения в естественных условиях. // Физиол. журн. СССР, т. 70, -1984, с. 1542-1550.

96. Уголев A.M., Кузьмина В.В. Видовые и индивидуальные адаптации гидролитических функций кишечника рыб. // Совр. пробл. экол. физиол. и биохимии рыб: Матер. 6. Всес. конф., Паланга, сент., -1985, -Вильнюс, Наука, -1988, -с. 222-247.

97. Уголев A.M., Кузьмина В.В. Пищеварительные процессы и адаптации у рыб. Санкт-Петербург, Гидрометиоиздат. 1993. - 239с.

98. Уголев A.M., Груздков A.A., Де Лей П. и др. Некоторые особенности полисубстраных процессов на стадии мембранного пищеварения и их значение в функционировании пищеварительной системы. Физиол. журн. СССР, 1974, т.60, №2, с. 240-249.

99. Уголев A.M.,, Митюшова II,М., Егорова В.В. Регуляторные свойства пищеварительных ферментов и биология многосубстратных пищеварительных процессов // Журнал Эволюц. биохим.физиолог. 1977. -Т.13. -С.589-599.

100. Уголев A.M. и др. Взаимоотношение ферментных функций поджелудочной железы и тонкой кишки при адаптивных процессах // Физиол. Журн. СССР. -1978.-Т. 64.-С. 1217-1228.

101. Уголев A.M., Груздков A.A. Голованова И.Л. и др. Механизмы адаптации ферментов, осуществляющих мембранное пищеварение у рыб. Экологическая физиология и биохимия. Астрахань, 1979, с. 47-48.

102. Уголев A.M., Иезуитова H.H., Цветкова В.А. Эволюционная физиология пищеварения // Руководство по физиологии. Эволюционная физиология / Под ред. Е.М. Крепса. Л.: Наука, 1983. - С. 301-370.

103. Уголев A.M., Кузьмина В.В., Голованова И.Л., Неваленный А.Н. Видовые и индивидуальные адаптации гидролитических и транспортных функций кишечника рыб //Экологическая физиология и биохимия рыб. Вильнюс, -1985, -с.529-530.

104. Уголев A.M., Тимофеева Н.М., Груздков A.A. Адаптация пищеварительной системы //Физиология адаптационных процессов.-М.: Наука, 1986 .- С.371-481.

105. Уголев A.M., Кузьмина В.В., Рощина Г.М. и др. Характеристика мембранного гидролиза и транспорта у рыб. // Изв. АН СССР. Сер. биол., -1989, №3, -с. 341-349.

106. Уголев A.M., Кузьмина В.В., Рощина Г.М., Смирнова Л.Ф., Груздков A.A., Неваленный А.Н. Влияние температуры на мембранный гидролиз и транспорт у рыб // Изв. АН СССР. Сер. биол., -1990, №1, -с.30-39.

107. Уголев A.M. и др. Влияние температуры на мембранный гидролиз и транспорт у рыб // Изв. АН СССР, сер. Биологическая. М., 1991. - №1. - С. 30-39.

108. Умбаргер Г. Подавление активности фермента конечным продуктом (ингибирование конечным продуктом) как механизм обратной связи. В кн.: Регуляторные механизмы клетки. М.: МИР, -1964, с. 390-407.

109. Фанж Р, Гроув Д. Пищеварение // Биоэнергетика и рост рыб. -М.: Легкая и пищевая промышленность, -1983, -с. 112-202.

110. Физиология адаптационных процессов. Руководство по физиологии. М.: Наука, - 1986, 635 с.

111. Филиппович Ю.Б. Основы биохимии. М.: Высшая школа, 1969.576 с.

112. Хаблюк В.В., Проскуряков М.Т. Состав панкреатических протеи-наз карпа и особенности их физико-химических свойств, связанные с отсутствием желудка // Методы интенсиф. пруд, рыбов.: Тез. докл. Всес. конф. мол. ученых. М., 1984. -С. 80-81.

113. Хочачка П., Сомеро Д. Биохимическая адаптация. М.: Мир, 1988. -568с.

114. Хюттер Г.Ю., Егорова В.В., Никитина А.А. Регуляторные свойства некоторых ферментов, осуществляющих мембранное пищеварение в тонкой кишке. В кн.: Мембранный гидролиз и транспорт: Новые данные и гипотезы. JI.: Наука, 1986, с. 98-103.

115. Чеботарева Ю.В., Савоскул С.П., Савваитова К.А. Гермафродитизм у рыб Норило Пясинской водной системы // Вопр. ихтиол. - 1998.38, №4.- С. 564-568.

116. Шлыгин Г.К. Ферменты кишечника в норме и патологии. JI.: Медицина, 1967.-271 с.

117. Щербаков Г.Г. О пептидазной активности содержимого и слизистой тонкой кишки у цыплят // Мат. науч. произв. конф. по болезням с. — х. животных и птиц. Псков, 1968. - С. 373-375.

118. Щербина М.А. Физиологические закономерности пищеварения у рыб в связи с морфологическими особенностями пищеварительного тракта и экологическими условиями (на примере Cyprinus carpio L. и Salmo irideus Gibb.) // Автореф. докт. дис. М.,- 1980. -52с.

119. Abbasi A.R., Shackley S.E., King Р.Е. Effects of copper on the ultrastructure of brain cells of Atlantic herring, Clupea harengus L. // Pakistan J. Zool. 1995.- 27, №3.- P.203-206.

120. AI-Hussaini A.M. On the functional morphology of the alimentary tract of some fish in relation to differences in their feeding habits: anatoma and histology // Quatr. 3. Microscop. Sci. 1949. - V. 90, part 2. - P. 102-139.

121. Alam Mohammed K., Maughan O. Eugene. Acute toxicity of heavy metals to common carp (Cyprinus carpio) // J. Environ. Sci. and Health. A. — 1995.-30, №8.-P. 1807-1816.

122. Alvorado F. Effect of phlotetin and phlotizin on sugar and amino acid transport systems in small intestine. -FEBS Symp., 1970, vol.20, p. 131-139.

123. Artenie V., Misaila H., Human A., Misaila C. The activity of some enzymes of the digestive tu be the rainbow trout (Oncorihynchus mykiss) foddered with diet supdemented with carotenes. Pesca. 2000, -17, №2, p. 2931.

124. Barrengton E.J.W. The alimentary canal and digestion // Physiology of Fishes. №4. - Acad. Press. - 1957. - Vol. 1. - P. 109-161.

125. Barnhoorn I., van Vuren J.H.J., du Preez H.H. Die effek van subletale dosisse mangaan op die getal witbloedseltipes van die bloukurper Oreo-chromis mossambicus // SA Tydskrif Natuurwetenskap Tegnol. 1999.- 18, №1.- P. 5-9. (Africanskyi)

126. Belyaeva E.S., Maldov D.G. Digestive enzyme activities in pad-dlefish juveniles. Int. Symp. On Sturgeons. Sept. 6-11, 1993, MoscowA Abstr. Bull. VNIRO. Moscov. 1993, -p.84.

127. Berge G.B., Bakke-McKellep A.M., Lied E. tn vitro uptake and interaction between arginine and lysine in the intestine of Atlantic salmo (Salmo salar). Aquaculture, 1999, №1-4.-p. 181-193.

128. Bergot P. Demonstration pur le rounge de ruthenium d'invasinations profondes de la membrane plasmique applicale des enterocytes dans l'intestinposterieur chez la truite arc-en ciel //Ann. biol. anim., biochim., biophys., -1976, vol. 16, №1, -p.37-42.

129. Bergot P., Flechon J. Forme et voie d'absorption intestinale des acides gras a' chine longue chez la truite arc-en-ciel (Salmo gairdneri Rich.). 1. Lipides en particules //ann. biol. anim., biochim., biophys., -1970, vol.10, №3, -h.459-472.

130. Bieniarz Krzysztof, Epler Piotr, Sokolowska-Mikolajczyk Miroslawa. Goldfish (Carassius auratus gibelio Bloch) breeding in different concentration of zinc // Pol. arch, hydrobiol. 1996.- 43, №3.- P. 365-371.

131. Bingham J.K., Newey H., Smyth D.H. Specifity of the inhibitory effects of sugar on intestinal amino acid transfer. Biochim. Biophys. Acta, 1966, vol. 120, p. 314-316.

132. Bodansky O. The inhibitory effects of DL-alanine, L-glutamic acid, L-lysine and L-histidine on the activity of intestinal, bone and kidney phosphatases. J. Biol. Chem., 1948, vol. 174, №2, p. 465-476.

133. Boge G., Rigal A., Peres G. The use of intestinal brush border membrane vesicles for comparative studies of glucose and amino isobutyric acid transport by pour species of marine teleost //Comp.Biochem. Physiol., -1982, vol.72a, №1, p.85-89.

134. Boyd C.A.R. Amino acid inhibition of exit of monosaccharide from the intestinal epithelium. J. Physiol., 1977, vol. 271, №2, p. 48-49.

135. Casey M.G., Felber J.P, The effect of galactose on phenylalanine transport and its damage to the mucosal cells of the rat intestine. Gastroenterology, 1967, vol.107, p. 209-215.

136. Cheesman C.J., Smyth D.H. Interaction of amino acid, piptides and peptidases in the small intestine. Proc. Roy. Soc. London, 1957, vol. 190, №1099, p. 149-163.

137. Colbeau A., Maroux S. Integration of alkaline phosphatase in the intestinal brush-border membrane. Biochim. Biophys. Acta, vol. 511, p. 39-51.

138. Cori C.F. The absorption of glycine and d,l-alanine. Proc.Soc. Experimental Biol. Med., 1926, vol.24, №2, p. 125-126.

139. Corring T. The adaptation of digestive enzymes to the diet: its physiological significance// Reprod. Nurt. Develop. -1980. V. B 20. - P. 1217-1235.

140. De Boeck Gudrun, Blust Ronny. Physiological disturbances in the energy metabolism of common carp during sublethal copper exposure // 7-th Int. Symp. Fish Physiol., Oslo, Aug. 3-6, 1996. Oslo, 1996.- P. 9.

141. De Laey P. Absorption of pancreatic enzymes on the intestinal membrane. In: Proteides of the biological fluids / Ed. H. Peters. Amsterdam etc.: Elsevier, 1968, p. 159-165.

142. Dethloff Gail M., Bailey Howard C. Effects of copper on immune system parameters of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) // Environ. Toxicol, and Chem.- 1998.- 17, №19.- P. 1807-1814.

143. Dingfu Chen. Analysis of molecular weight and aminoacidic composition in an alkaline phosphatase at a Silurus meridionalis Chen // J. Sichuan Univ. Natur. Sci. Ed. 1994.- 31, №4, - P. 579-583.

144. Dixon B., Ramirez R. Anaerobic gut flora as a potentisl probiotics. Teut Conf. «Disease of Fish and Shellfish» Dublin 9-11 sept., 2001: Book of Abstracts. Dublin, 2001 p. 98.

145. Eggermont E. The biochemical defects in sucrose intolerance and in glucose-galactose malabsorption. These, 1968.

146. El-Saed A., Nmartiniez I., Moyano F. Assessment of the effect of plant inhibitors on digestive proteases of nile tilapia using in vitro assays. Aquaculture Int. 2000, №5. -p. 403-415.

147. Espe M., Sveier H., Haung E. Nutrient absorption and growth of Atlantic salmon (Salmo salar L) fed fish protein concentrate. Aquaculture. 1999, 174, №1-2, p. 119-137.

148. Fabry P. Feeding pattern and nutritional adaptations. Prague: Academia, 1969. - 175 p.

149. Ferraris R.P., Ahearn G.A. Sugar and amino acid transport in fish intestine //Comp. Biochem. Physiol., -1984, vol.77A, №3, -p.397-413.

150. Fisher R.B., Persons D.S. Galactose absorption from the surviving small intestine of the rat. J. Physiol., 1953, vol. 119. №2/3, p. 255-370.

151. Gauthier G.F., Landis S.C. The relationship of ultrastructural and cy-chemical features to absorbtive activity in the goldfishintestine // Anat. Rec., 1972, - V. 172, - №4, - P. 675 - 702.

152. Gram L. The microflora of rainbow trout intestine: a comparison of traditional and molecular identification // Aquaculture. 2000. V. 182, p. 1-15.

153. Hagihira H., Lin E.C.C., Samiy A.H., Wilson T.H. Active transport of lysine, ornithine, arginine and cystine by the intestine. Biochem. Biophys, Research Communications, 1961, vol. 61, №4, p. 478-481.

154. Hardcastle P.T., Daniels V.G. Interaction between hexoses end amino acid for transport in rat small intestine. Comparative Biochem. Physiol., 1973, vol. A45, №4, p. 995-999.

155. Huang Feng, Yan Ansheng, Mu Song, Wang Xiaodong. The proteases and amylases Hypophthalmichthys molitrix and Aristichthys nobilis // J. Fish. Sci. China. 1999. - 6, №2. - P. 14-17.

156. Ingham L., Arme C. Intestinal absorption of amino acids by rainbow trout, Salmo gairdneri (Richardson) // J. Comp. Physiol., -1977, vol.117, -p.323-334.

157. James R., Sampath K. Sublethal effects of mixtures of copper and ammonia on selected biochemical and physiological parameters in the catfish

158. Heteropneustes fossilis (Bloch) // Bull. Environ. Contam. and Toxicol. -1995.- 55, №2.-P. 187-194.

159. Jansson B.O., Olsson P. The cytology of the caecal epithelial cells of Perca //Acta zool. Stockholm, -1960, vol.41, №3, -p.267-276.

160. Jiayin Dai, Zheng Weiyun, Wang Shuhong. Influence of copper and zinc ions on activity of enzymes in tissues young Pagrosomus major // Chin. J. Environ. Sci. 1998.- 19, №5.- P. 60-62.

161. Jocob F., Monod J. On the regulation of gene activity // Cold Spring Harbor Symp. Quant Biol. Vol.26. Cellular regulatory mechanisms. 1961/ P. 193-211.

162. Jonsson Maria. Mechanism for development of tolerance to heavy metthals in epithelial gill cells of Rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) // 7 Int. Symp. Fish Physiol., Oslo, Aug. 3-6, 1996. Oslo, 1996.- P. 70.

163. Jorgrnsrn C.R. London B.R., Wilson T.H. A common pathway for sugar transport in hamster intrstine. Amer. J. Physiol., 1961, vol.200, №1, p. 111-116.

164. Karan V., Vitorovic S., Tutundzic V., Poleksic V. Functional enzymes activity and gill histology of carp after copper sulfate exposure and recovery // Ecotoxicol. and Environ. Safety. 1998.- 40, №1-2.- P. 49-55.

165. Karasov W., Diamond J. Intestinal glucose transport varies with taxa and diet//Am. Zoologist, -1981, vol.21, -p. 1030.

166. Kimmich G.A. Coupling between Na+ and sugar transport in small intestine. Biochim. Biohys. Acta, 1973, vol.300, p. 32-73.

167. Koshland D.E. Conformation changes at the active site during enzyme action. Feder. Proc., v.23, №3, parts I, 1964, p. 719-726.

168. Krementz A.B., Chapman G.B. Ultrastructure of the posterior half of the intestine of the catfish, Ictalurus punctatus //J. Morphol., -1975, vol.145, N4, -p.441-482.

169. Kronal A., Vaurinrova H., Placer Zd. et al. Influence of proteins on lipid digestion and absorption. In. Congr. Gastroenterol. Intern. VIII Absr. Pr., 1968. 200p.

170. Larsen P.R., Rose J.E., Tapley D.F. Transport of neutral, dibasic and N-methyl-substituted amono acid by rat intestine. Biochim. Biophys. Acta, 1964, vol. 88, №3, p. 570-577.

171. Linschcer W.G., Malagelada J.K., Fishman W.H. Diminished oleic acid absorption in man L-phenylalanine inhibition of an intestinal phosphohy-drolase//Nature New Biol., 1971. Vol.231, №21. P. 116-117.

172. Luisier A.L., Robinson J.W.L. Influence du glucose sur le transport intestinal de la phenylalanine en presence et en absence de dinitrophenol. Ex-perientia, 1972, vol.28, №11, p. 1313-1315.

173. Marr J.C.A., Lipton J., Cacela D., Hansen J.A., Bergman H.L., Meyer J.S., Hogstrand C. Relationship between copper exposure duration, tissue copper concentration, and rainbow trout growth // Aquat. Toxicol. — 1996.36, №1-2.- P. 17-30.

174. McLean B., Ash R. Uptake of horseradisch peroxidase in intact form from the gut of the goldfish (Carassius auratus) //Arch. Int. Physiol, et Bio-chim. -1989, vol.97, №5, -p.34.

175. Mis Jersy, Bieniarz Krzysztof, Epler Piotr, Sokolowska-Mikolajczyk Miroslawa. incubation of fertilized common carp (Cyprinus carpio L.) eggs in different concentrations of zinc // Pol. arch, hydrobiol. 1996,- 43, №1.- P. 79-86.

176. Monod J., Wyman J., Changeux J.P. On the nature of allosteric transition//J. Mol. Biol. 1965. Vol. 12. P. 85-118.

177. Murer H., Sigrist-Nelson K., Hoffer H. On the mechanism of sugar and amino acid interaction in intestinal transport. J. Biol. Dhem., 1975, vol. 250, №18, p. 7392-7396.

178. Murer H., Sigrist-Nelson K., Hopffer H. On the mechanism of sugar and amino acid interaction in intestinal transport. J. Biol. Chem., 1975, vol. 250, N18, p. 7392-7396.

179. Murthy H. Shivanada, Varghese T.S. Dietary requirements of the Indian major carp, Lobeo rohita (Hamilton), for total aromatic amino acid. Israil J. Aguaculture. 1996, - 48, №2, p. 78-83.

180. Natarjan M., Ross B., Ross L.G. Susceptibility of carp and tilapia ami-lase to purified wheat amylase inhibition. Aquaculture . 1992, №3, -p. 265274.

181. Nevalenny A.N., Korostelev S.G. In vivo and in vitro polysybstrate digestion. J. Applied Ichthyology, 1999, vol. 15(4-5). p. 338-339.

182. Nevalenny A.N., Tuktarov A.V., Bednyakov D.A. Research of carbohydrates and amino acid transport in sturgeon's intestines. Extended abstracts: 4 International symposium on sturgeon. Oshkosh, Wisconsin, USA. 2001. GB45.

183. Novick A., Szilard L. Experiments with the chemostat on the rates of amino acid synthesis in bacteria . In.: Dynamics of growth processes. Princeton, 1954, p. 21-32.

184. Odense P.H., Bishop C.M. The ultrastructure of the epithelial border of the ileum, pyloryc caeca and rectum of cod, Gadus morhua //J. Fish Res. Board Can., -1966, vol.23, №12, -p. 1841-1843.

185. Ojeda F. Patricio, Caceres Cristian W. Digestive mechanisms in Aplodactylus punctatus (Valenciennes): A temperate marine herbivorous fish // Mar. Ecol. Progr. Ser. 1995. - 118, №1-3. - P. 37-42.

186. Olsen R., Henderson P., Ringo E. The digestion and selective adsorption of dietary fatty acids in Artie charr, Salvelinus alphinus. Aquaculture Nutr. 1998, 4, №1, p. 13-21.

187. Oluah N.S. Plasma aspartate aminotransferase activity in the catfish Clarias albopunctatus exposed to sublethal zinc and mercury // Bull. Environ. Contam. and Toxicol. 1999.- 63, №3.- P. 343-349.

188. Pavios M., Anders F., Sorunn S., Olav V. Colonization of the gut in first feeding turbot by bacterial strains added to the water of bioencapsulated in rotifers. Aquaculture Int. 2000, -8, №5, p. 367-380.

189. Pirogovsky M.I., Sokolov L.I., Vasilev V.P. Huso huso (Linnaneus, 1758). The Freshwarer Fishes of Europe. Wiebaden: AULA verl., 1989. vol.1. Pt.2. p. 156-200.

190. Popova O.A., Reshetnikov Y.S., Kiyachko V.I. et al. Ruffe from the former USSR: variability within the largest part of its natural range. J. Great Lakes Res. 1998. vol 24, №2. p. 263-284.

191. Roark Shaun, Brown Karen. Effects of metal contamination from mine tailings on allozyme distributions of populations of Great Plains fishes // Environ. Toxicol, and Chem. 1996.- 15, №6.- P. 921-927.

192. Sastry K.V., Garg V.K., Agraval V.P. Effect of inhibitors on Na-dependent D-glucose transport in the small intestine of two teleost fishes // Indian. J. exp. Biol.,-1977, vol.15, №8, -p.661-662.

193. Smith M.W. Membrane transport in fish intestine //Comp. Biochem. Physiol., -1983, vol.75A, №3.

194. Spanggaard B., Huber I., Nielsen J. et al. The micro flora of rainbow trout intestine A comparison of traditional and molecular identification/ Aquaculture. 2000, -182, №1, p. 1-15.

195. Thomas J.E. Organ systems in adaptation. The digestive system // Handbook of physiology. 1964. - Sec. 4, №12. - P. 193-214.

196. Ugolev A.M. et al Substrate interaction on the intestinal mucosa a concept for the regulation of intestinal digestion // Brit. J. Nutr. 1975. Vol.34.

197. Ugolev A.V., De Laye P., Iesuitova N.N. Absorption of enzymes bycell membrane structure (on the example of enterocytes) under normal and

198. Umbarger H.E. Regulation of the biosynthesis of the branchedchain amino acid. In.: Current topics in cellular regulation. V.l. New York London, 1969, p. 57-76.

199. Van Vuren J.H.J., Van der Merwe Marinda, Du Preez H.H. The effect of copper on the blood chemistry of Clarias gariepinus // Ecotoxicol. and Environ. Safety. 1994.- 29, №2.- P. 187-199.

200. Vlasenko F.D., Pavlov A.V., Sokolov L.I., Vasil'ev V.P. Acipenser gueldenstaedti Brandt, 1833. Acipenser persicus Borodin. 1897. The Fresh-warer Fishes of Europe. Wiebaden: AULA verl., 1989. vol.1. Pt.2. p. 249366.

201. Zhao wan-peng, Liu Yong-jiau, Pan Qmy, Lm Ding. Zhenyshan daxue xuebao Ziran kexue ban. Acta sei. nature. Univ. Sutyatseni. Natur Sei. 1999, 38, №4, p. 87-91.

Информация о работе

Бедняков, Дмитрий Андреевич
кандидата биологических наук
Астрахань, 2004
ВАК 03.00.13

Диссертация

Модификационное регулирование уровня активности некоторых пищеварительных ферментов у рыб - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы