Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Инактивация фактора свертывания крови XIIA ингибитором трипсина из кукурузы

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Инактивация фактора свертывания крови XIIA ингибитором трипсина из кукурузы"

На правах рукописи

Корнеева Вера Анатольевна

ИНАКТИВАЦИЯ ФАКТОРА СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ ХНА ИНГИБИТОРОМ ТРИПСИНА ИЗ КУКУРУЗЫ

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 5 АПР 2015

Москва 2015

005567173

005567173

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки «Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии» Российской

академии наук

Научный руководитель: доктор физико-математических наук,

Пантелеев Михаил Александрович

Официальные оппоненты: Косенко Елена Александровна,

доктор биологических наук, ФГБУН

«Институт теоретической и экспериментальной

биофизики» Российской академии наук,

гла&Ный научный сотрудник лаборатории кетаБолическ.010 , моделирования и биоинформатики

Дубилей Светлана Алексеевна, кандидат биологических наук, ФГБУН «Институт биологии гена» Российской академии наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов

Ведущая организация: ФГБНУ« Научно-исследовательский институт

общей патологии и патофизиологии» Российской академии медицинских наук.

Защита диссертации состоится «18» мая 2015 года в 15 часов 30 минут

на заседании Диссертационного совета Д 501.001.71 при Московском

Государственном Университете имени М.В. Ломоносова по адресу:

119991 г. Москва, Ленинские горы, д.1 стр. 12, биологический факультет

Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, аудитория

ББА.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан « у>РПР£лЯ 2015 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

- // /

/,У / ^ //Киселевский Дмитрий Борисович.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Сериновые протеазы широко распространены в природе и составляют около трети всех известных протеолитических ферментов. К ним относят как эндо-, так и экзопептидазы, принадлежащие к различным семействам белков. Эти ферменты участвуют в важнейших процессах - пищеварении, оплодотворении, активации комплемента, апоптозе, иммунном ответе (Tripathi, Sowdhamini 2008).

Свертывание крови - это процесс, обуславливающий остановку кровотечения при повреждении сосудистого русла. В свертывании крови выделяют тромбоцитарное и плазменное звено. Плазменное звено свертывания крови находится под управлением каскада сериновых протеаз, активирующих друг друга за счет протеолитического расщепления и может запускаться двумя способами - по внешнему пути, или пути тканевого фактора, и внутреннему, или контактному. Внешний путь активируется в результате попадания в кровоток в месте повреждения сосуда трансмембранного белка тканевого фактора. Такая активация является физиологической и обеспечивает остановку кровотечения.

Активация плазменного свертывания по контактному пути начинается с автоактивации фактора XII (фХП) при взаимодействии с отрицательно заряженными поверхностями: irt vivo - при контакте с мембраной активированного тромбоцита или бактериальной клетки (Smith et al. 2006; Kannemeier et al. 2007; Renné 2012) и внеклеточными нуклеиновыми кислотами; ex vivo - от контакта со стентами, катетерами и элементами сердечно-легочного шунтирования; in vitro - в результате контакта со стенками пластиковых и стеклянных пробирок при заборе крови (Nossel et al. 1968; Hsu 2001).

Участие фХН в поддержании гемостаза на сегодняшний день не вполне ясно, однако его вклад в патологическое тромбообразование был показан экспериментально на животных моделях FeCb-индуцированного тромбоза (Renne et al. 2005b), коллаген-индуцированной тромбоэмболии легочной артерии и лигирования аорты (Яеппё et al. 2005b; Yau et al. 2014) и острого ишемического инсульта (Leung et al. 2012).

Таким образом, активированный фактор XII (фХПа) представляет собой многообещающую мишень для создания новых антитромботических препаратов, так как подавление работы этого белка не сказывается на поддержании гемостаза, но позволяет предотвратить патологическое тромбообразование при гиперкоагуляционных состояниях. Следовательно, исследование механизмов ингибирования фактора ХПа и особенностей взаимодействия данной протеазы с лучшими из существующих ингибиторов -очевидный и необходимый шаг на пути создания новых антитромботических препаратов.

Ингибитор трипсина из кукурузы (corn trypsin/factor ХПа inhibitor, CHFI) - канонический ингибитор сериновых протеаз, широко применяемый для подавления контактной активации свертывания. В данной работе будет исследована роль протеаза-связывающей петли данного ингибитора в специфическом взаимодействии с активированным фактором свертывания XII.

Целью данной работы было выявление роли протеаза-связывающей петли CHFI и его внепетельных участков во взаимодействии с фХПа. В задачи исследования входило

1. получить рекомбинантный CHFI и серию его укороченных мутантов; разработать протокол экспрессии CHFI и его мутантов в Escherichia coli в растворимой форме для последующей однофазной очистки;

2. измерить константы ингибирования полученных мутантов по отношению к фХПа;

3. построить модельную структуру фХНа на основе гомологии с активатором фактора роста гепатоцитов;

4. на основе известной рентгеновской структуры CHFI построить модельные структуры мутантов CHFI методом молекулярной динамики;

5. провести моделирование взаимодействия CHFI и его мутантов с трипсином, фХНа и фХ1а методом докинга.

Научная новизна. В работе обнаружено, что изолированная протеаза-свя-зывающая петля CHFI (синтетический пептид, С- и N-концы которого соединены дисульфидной связью) не может подавлять активность фактора ХПа, сохраняя при этом способность ингибировать фактор Х1а и трипсин. Таким образом, было показано, что изолированная протеаза-связывающая петля CHFI способна действовать как независимый структурный элемент и подавлять активность некоторых протеаз (фактор Х1а и трипсин). В работе было также показано, что минимальный фрагмент CHFI, сохраняющий ингибирующую активность в отношении фХПа, содержит аминокислотные остатки 12-108 (код 1ВЕА в базе данных PDB). Полученные результаты позволили сделать предположения о механизме ингибирования фактора ХПа CHFI: ингибирование происходит по стандартному механизму (Laskowski, Kato 1980), но с обязательным участием некоторых участков CHFI вне протеаза-связывающей петли.

Научно-практическим значением результатов данной работы является вклад в понимание взаимодействия ингибиторов сериновых протеаз с подавляемыми ферментами и механизма ингибирования фактора ХНа ингибитором трипсина из кукурузы (CHFI) в частности. Разработанный в ходе данной работы протокол получения рекомбинантного CHFI (глобулярный белок массой 14 кДа, содержащий 5 дисульфидных связей) в растворимой форме в культуре Escherichia coli (Е. coli) также имеет научно-практическое

5

значение. Результаты данной работы могут быть использованы для создания новых ингибиторов фХПа и других сериновых протеаз.

Положения, выносимые на защиту:

1. Минимальный фрагмент CHFI, сохраняющий ингибирующую активность в отношении фХПа, содержит аминокислотные остатки 12-108 (1ВЕА, PDB).

2. Протеаза-связывающая петля CHFI принимает участие во взаимодействии с фХПа, но не полностью определяет ингибирующую активность в отношении этого фактора свертывания.

3. Изолированная протеаза-связывающая петля CHFI действует как независимый структурный элемент и ингибирует некоторые сериновые протеазы - трипсин и фХ1а.

4. Разработанный нами протокол экспрессии CHFI и его мутантов в E.coli впервые позволил получать данный рекомбинантный ингибитор в функционально активной форме.

Апробация работы состоялась 26 января 2015 года на заседании заседания кафедры биохимии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Результаты диссертационной работы были представлены на международной конференции «The 60th annual meeting of the International Society on Thrombosis and Haemostasis Scientific and Standardization Committee (ISTH SSC)» (Милуоки, США, 23-26 июня, 2014), 18-ой школе-конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века» (Пущино, Россия, 20-26 апреля, 2014), международной конференции «38th Federation of European Biochemical Societies (FEBS) congress» (Санкт-Петербург, Россия, 6-11 июля, 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ. Статей в рецензируемых журналах - 3; публикаций в трудах конференций и съездов - 3.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 84 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав (главы 1 -обзора литературы, главы 2 - описания материалов и методов, главы 3 -описания экспериментальных результатов, главы 4 - обсуждения результатов), выводов и библиографического указателя, включающего 108 источников. Работа выполнена на базе Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН в лаборатории молекулярных механизмов гемостаза (зав. лабораторией проф., д.ф.-м.н. Пантелеев М.А.).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении описана актуальность исследуемой темы, сформулированы цели и задачи исследования и дана общая характеристика работы.

Глава 1 посвящена обзору литературы. Приведены основные сведения о сериновых протеазах и механизмах их работы. Рассмотрен путь контактной активации свертывания и роль фактора XII в норме и патологии. Описаны ингибиторы контактной активации свертывания: плазменные ингибиторы фХПа и белки неплазменного происхождения, в частности ингибитор трипсина из кукурузы. Описан стандартный механизм ингибирования сериновых протеаз.

В главе 2 описаны материалы и методы, используемые в работе, а также приведены все реактивы, использовавшиеся при проведении экспериментов. Методики, использованные в работе, разделяются на три группы: молекулярно-биологические, биохимические и биоинформатические.

Молекулярно-биологические методы использовались для получения

рекомбинантного СИП и его мутантных форм. Описывается сайт-

7

направленный мутагенез, ПЦР (полимеразная цепная реакция)-сшивка полученных фрагментов и создание экспрессионных конструкций, а также трансформация клеток штамма-продуцента E.coli Rosetta-Gami 2 DE3 плазмидными конструкциями на основе коммерческого вектора рЕТ28а и последующая экспрессия рекомбинантных ингибиторов при температуре 25°С.

Биохимические методы использовались для последующей очистки и проверки активности полученных ингибиторов. Очистку рекомбинантных белков проводили с помощью никель-аффинной хроматографии в неденатурирующих условиях, так как все рекомбинантные белки были клонированы так, что на своем N- и/или С-конце несли гексагистидиновую метку для очистки. Ингибирующую активность полученных рекомбинантных белков оценивали в хромогенных тестах (по расщеплению белком-мишенью своего субстрата), проводимых в соответствии с рекомендациями производителя субстрата с незначительными изменениями. Для проверки ингибирования фХПа использовался хромогенный субстрат S2302, для фХ1а -S2366, а для трипсина - S2765. Расчет констант ингибирования (Ki) проводился по остаточной активности ферментов с помощью преобразованного уравнения Михаэлиса-Ментен.

Биоинформатические методы использовались для подготовки пространственных структур CHFI и его мутантов с помощью молекулярной динамики (МД), построения модельной структуры активированного фактора XII на основе гомологии и проведения докинга рекомбинантных ингибиторов с модельными структурами активированных факторов XII и XI, а также трипсина.

Главы 3 и 4 посвящены описанию экспериментальных результатов и их обсуждению.

Клонирование, экспрессия и очистка рекомбинантного CHFI. Для исследования роли различных участков CHFI, расположенных вне ингибирующей петли, во взаимодействии с фХПа был создан ряд укороченных

мутантов на основе опубликованной пространственной структуры СНР1 (код 1ВЕА в базе данных РОВ): 5 укороченных рекомбинантных вариантов ингибитора (также в работе исследован 1 синтетический пептид), таких что в них отсутствуют Ы- и/или С-концевые участки и некоторые дисульфидные связи (рис.1). Для удобства в названиях рекомбинантных ингибиторов отмечены присутствующие в белке дисульфидные связи (например, в СНР1-234 сохранены вторая, третья и четвертая дисульфидные связи). СНР1-12345 - это полноразмерный рекомбинантный СНР1 без внесения изменений. В мутанте СНР1-2345 отсутствуют 11 Ы-концевых аминокислотных остатков и первая дисульфидная связь, а цистеин 55 заменен на аспарагиновую кислоту (так как неспаренный цистеин мог бы приводить к образованию нежелательных дисульфидных связей между разными пептидами). Мутант СНР1-1234 укорочен на 24 аминокислотных остатка с С-конца, в нем также разрушена пятая дисульфидная связь, а цистеин 57 заменен на аспарагиновую кислоту. СНР1-234 представляет собой комбинацию первых двух вариантов: мутант укорочен на 11 1Ч-концевых и 24 С-концевых аминокислотных остатка, а цистеины 55 и 57 заменены на аспарагиновую кислоту. Для исследования роли участка СНР1 между третьей и четвертой дисульфидной связями, а также для изучения роли четвертой дисульфидной связи, был создан мутант СНР1-123, укороченный с С-конца на 34 аминокислотных остатка. Неспаренные цистеины 45 и 57 в данном мутанте также заменены на аспарагиновую кислоту. Все рекомбинантные белки были клонированы так, что на 1М- и/или С- конце несли гексагистидиновую метку для очистки, а также несколько дополнительных аминокислот.

Чтобы исключить влияние внепетельных участков СНР1 на взаимодействие его протеаза-связывающей петли с фХИа, использовали синтетический циклический 25-аминокислотный пептид СНР1-2, представляющий собой изолированную протеаза-связывающую петлю. Данный пептид содержит аминокислотные остатки СЮТ с 20-ого по 45-ый и замыкается в кольцо дисульфидной связью между цистеинами на его Ы- и С-

концах. Неспаренный цистеин 29, как и в случае с другими мутантами, заменен на аспарагиновую кислоту. Чтобы проверить, не влияет ли замена цистеина 29

CHFM2345

CHFM234

' « Г! Г) » 44«', **•• f, »t4 m ' 4 /'Г'« • t' !Ч

CHFI-2345

CHFI-234

CHFM23

CHFI-1245

CHFI-2 ?

Г. ¡"1 1 •«

Рис.1. CHFI и его мутанты. Приведены схемы вторичной структуры полноразмерного CHFI (CHF1-12345), пяти укороченных мутантов (CHFI-2345, -1234, -234, -123, -1245) и изолированной протеаза-связывающей петли (CHFI-2). Позиции цистеинов подписаны цифрами под каждой схемой.

10

Квадратные скобки обозначают дисульфидные связи, треугольником отмечено положение пептидной связи Р1-Р1'. Замены цистеина на аспарагиновую кислоту показаны крестиком, неспаренный цистеин 86 — овалом.

в изолированной протеаза-связывающей петле (СНП-2) на ее функциональную активность, использовали рекомбинантный мутант СНР1-1245, который представляет собой полноразмерный СНР1 с заменой цистеина 29 на аспарагиновую кислоту.

Рекомбинантные ингибиторы частично экспрессировались в растворимой форме. Благодаря наличию на их 14- и/или С-конце гексагистидиновых меток очищенные препараты белков получали путем одностадийной никель-аффинной хроматографии. Приблизительный выход рекомбинантных ингибиторов варьировал между мутантами от 2,5 до 75 мг очищенного белка на литр бактериальной культуры.

Для исследования ингибирующей активности рекомбинантного СНР1 и его мутантов в отношении фХПа, фХ1а и трипсина, очищенные препараты белков проверяли в хромогенном тесте. Ингибирующую активность оценивали по расщеплению белком-мишенью своего субстрата (табл.1). При ингибировании фХНа отличий между рекомбинантным полноразмерным ингибитором СНР1-12345 и СНР1, выделенным из кукурузных зерен, не было. Этот факт также показывает, что гексагистидиновая метка не влияет на способность ингибитора трипсина из кукурузы ингибировать фХИа.

Табл.1. Константы ингибирования (КО СНИ и его мутантами фактора ХПа и трипсина.

Ингибитор Ю фХНа, нМ Ю трипсин, нМ

СНР1-ЕЯ 1.0 ± 0.1 2.1 ±0.6

СНР1-12345 1.1 ±0.2 1.3 ±0.2

СНР1-2345 1.0 ±0.2 2.9 ±0.5

СНР1-1234 1.0 ±0.3 1.0 ±0.6

СНР1-234 3.2 ±0.4 2.2 ± 1.1

СНР1-1245 50 ±8 250 ± 20

СНР1-123 116 ± 16 н/о**

СНР1-2 н/о* 11700 ±1200

* Не определено: СНИ-2 не ингибировал фХПа в концентрации до 1мМ. ** Не определено: СНР1-123 не ингибировал трипсин в концентрации до 75 мкМ.

Одновременное разрушение четвертой и пятой дисульфидных связей и удаление соответствующих участков белка у мутанта СНР1-123 привело к значительному снижению ингибирующей активности в отношении фХПа (К1 =116 ± 16 нМ) по сравнению с белком дикого типа (Кл = 1.0 ± 0.1 нМ), а также мутантами СНР1-1234, СНР1-2345 и СНР1-234 (табл. 1). Мутант СНР1-1245, представляющий собой полноразмерный СНР1 с разрушенной третьей дисульфид-ной связью, также проявлял сниженную ингибирующую активность в отношении фХПа (Кл = 50 ± 8 нМ). Изолированная протеаза-связывающая петля СЮТ (циклический пептид СНР1-2) не ингибировала фХПа в концентрации до 1мМ. Это неожиданный результат для канонического ингибитора, так как известно, что изолированные протеаза-связывающие петли таких ингибиторов действуют как независимые структурные элементы и обуславливают взаимодействие с ингибируемой протеазой. Например, циклический пептид, представляющий собой изолированную протеаза-связывающую петлю ингибитора из подсолнечника БРТЫ, не только сохраняет ингибирующую активность в отношении трипсина (Кл = 0,5 нМ), но и превосходит по активности полноразмерный ингибитор (Кл = 19 нМ) (МсВпс1е й а1. 2002).

При образовании комплекса СНР1 с фХПа взаимодействия между участками этих белков, не относящимися к протеаза-связывающей петле и каталитическому центру, вероятно, вносят вклад в специфичность и силу связывания. Таким образом, СНР1 является первым каноническим ингибитором, протеаза-связывающей петли которого недостаточно для ингибирования целевой протеазы. Результаты докинга (рис.2) СНР1-2 (изолированной протеаза-связывающей петли СНР1) и фХПа показали, что пептид, вероятно, связывается не с активным сайтом протеазы (рис.2Б). СНР1-2 богат пролином и поэтому обладает жесткой конформацией. Логично было

12

предположить, что изолированная петля, несмотря на наличие пролинов, может оказаться излишне гибкой (лишившись дополнительной стабилизации за счет взаимодействия с остальными частями полноразмерного белка) по сравнению с соответствующим участком полноразмерного ингибитора. Подобная конформационная подвижность могла бы отразиться на взаимодействии с фХПа (более сильном, так как для полноразмерного ингибитора К) = 1,1 ± 0,2 нМ) и, предположительно, должна была бы меньше повлиять на слабое взаимодействие с фХ1а (Кл = 5,4 ± 0,2 мкМ для полноразмерного СНР1).

фХИа

СНР1-2

Рис.2. Комплекс изолированной протеаза-связывающей петли (СНР1-2) с фХПа, полученный методом белок-белкового докинга. Структура ингибитора получена в результате МД-симуляции. Взаимодействующие боковые цепи аминокислотных остатков протеазы (показаны зелеными) и ингибитора (голубые) изображены шариками и палочками.

Поэтому мы проверили ингибирующую активность СНР1-2 в отношении протеаз, которые специфически ингибируются СНР1 (трипсин и фХПа), и фХ1а,

который ингибируется CHFI значительно хуже. Для предсказания характера взаимодействия CHFI-2 с этими протеазами были использованы вычислительные методы — молекулярная динамика и докинг.

Результаты МД-симуляции не подтвердили нашу гипотезу об излишней гибкости изолированной протеаза-связывающей петли. Напротив, по расчетам структура пептида оказалась жесткой и не имеющей серьезных отличий от петли в нативном ингибиторе. Единственным изменением было небольшое изменение угла между альфа-спиралями, фланкирующими петлю, по сравнению с положением соответствующих спиралей в полноразмерном CHFI (рис.3).

Рис.3. Конформация протеаза-связывающей петли CHFI, нативной и мутированной (с заменой цистеина 29 на аспарагиновую кислоту). Угол между альфа-спиралями оказался несколько различным у пептида CHFI-2 (синий) и нативного CHFI-12345 (красный) по результатам МД-симуляции. Визуализация структур выполнена при помощи плагина Bendix для программы VMD.

Результаты измерения ингибирующей активности пептида CHFI-2 согласуются с литературными данными об изолированных протеаза-связывающих петлях канонических ингибиторов (McBride et al. 2002; Brauer et al. 2002). Наши экспериментальные данные позволяют заключить, что изолированная протеаза-связывающая петля CHFI частично сохраняет ингибирующую активность и может действовать как независимый структурный элемент. CHFI-2 сохраняет ингибирующую активность в отношении фХ1а, хотя константа ингибирования (Ki = 94 ± 11 мкМ) и возрастает примерно в 20 раз по сравнению с полноразмер-

14

ным CHFI (Ki = 5,4 ± 0,2 мкМ). CHFI-2 также сохраняет способность ингибиро-вать трипсин, однако различие в константах ингибирования изолированной петли и полноразмерного ингибитора оказывается даже выше, чем в случае с фХ1а (Ki = 12 ± 2 мкМ и Ki = 1,3 ± 0,2 нМ, соответственно). Если проанализировать экспериментальные данные и результаты МД-симуляции в комплексе, можно предположить, что изолированная протеаза-связывающая петля находилась в активной конформации, так как CHFI-2 ингибировал трипсин и фХ1а в хромогенном тесте. Результаты докинга согласуются с экспериментальными данными, поскольку расщепляемая пептидная связь (между аргинином 34 и лейцином 35) находилась в каталитическом сайте при взаимодействии как с трипсином, так и с фХ1а.

Неожиданным результатом явилось то, что CHFI-2 не ингибировал фХПа в хромогенном тесте. Поскольку пептид предположительно находился в активной конформации, отсутствие ингибирования может объясняться некорректным положением расщепляемой пептидной связи протеаза-связывающей петли относительно активного сайта фХПа. Мы предполагаем, что корректное положение протеаза-связывающей петли CHFI в щели активного сайта фХПа обеспечивается взаимодействиями внепетельных участков ингибитора с фХПа за пределами его активного сайта. С данной гипотезой согласуются результаты докинга CHFI-2 и фХПа (рис.2Б). Наиболее энергетически выгодная позиция пептида находилась вне активного сайта модельной структуры фХПа. Однако, с другой стороны, непропорциональная потеря ингибирующей активности изолированной протеаза-связывающей петли в отношении фХПа по сравнению с трипсином и фХ1а может также частично обуславливаться заменой цистеина 29 на аспарагиновую кислоту, а также отсутствием стабилизации, которая обычно осуществляется за счет взаимодействия петли с другими частями ингибитора.

Данные ферментативной кинетики позволяют предположить, что либо участок CHFI между глицином 39 и треонином 108 участвует во взаимодействии с фХПа, либо четвертая дисульфидная связь важна для формирования третичной структуры CHFI. Разрушение первой и пятой дисульфидных связей

(и удаление соответствующих участков белка) не влияет на взаимодействие укороченного ингибитора с фХПа.

Использовав информационный подход к изучению связи между структурой ингибитора и его ингибирующей активностью (Mucsi et al. 2003) и данные о сохранении ингибирующей активности у ранее описанного мутанта CHFI, укороченного на 11 аминокислотных остатков с N-конца (Hazegh-Azam et al. 1998), мы исследовали ингибирующую активность четырех созданных нами укороченных мутантов CHFI в сравнении с ингибитором дикого типа. Укороченные мутанты CHFI-1234 (Ki = 1,0 ± 0,3 нМ в отношении фХПа) и CHFI-2345 (Ki = 1,0 ± 0,2 нМ) сохраняют ингибирующую активность в отношении фХПа на уровне полноразмерного CHFI (Ki = 1,0 ± 0,1 нМ), что согласуется с данными о первом укороченном мутанте CHFI (Hazegh-Azam et al. 1998).

Мутант CHFI-234 объединяет в себе изменения, внесенные в CHFI-1234 и CHFI-2345. Он имеет константу ингибирования в отношении фХПа 3,2 ± 0,4 нМ, что статистически не значимо отличается от соответствующих констант CHFI-1234, CHFI-12345 и CHFI-2345. Сходные результаты были получены для этого мутанта и в хромогенном тесте, где проверялось ингибирование им трипсина (табл.1). Эти данные позволяют заключить, что первые 11 N-конце-вых и последние 24 С-концевых аминокислотных остатка CHFI, а также первая и пятая дисульфидные связи не участвуют во взаимодействии с фХПа и трипсином. Следовательно, CHFI-234 - это минимальный фрагмент CHFI, сохраняющий ингибирующую активность в отношении фХПа, a CHFI-2 может действовать как независимый структурный элемент, способный ингибировать трипсин и фХ1а.

Итак, взаимодействия вне активного сайта фХПа и протеаза-связывающей петли CHFI вносят вклад в силу и специфичность связывания этих белков друг с другом, поскольку изолированная протеаза-связывающая петля не ингибирует фХПа, но сохраняет частичную активность в отношении других протеаз — фХ1а и трипсина. Полученные данные позволяют предположить, что ингибирование фактора Xlla CHFI происходит по стандартному механизму (Laskowski Jr. and

Как) 1980), но с обязательным участием некоторых участков СНР1 вне его про-теаза-связывающей петли. Однако с трипсином и фХ1а СНР1 взаимодействует полностью по стандартному механизму, в котором протеаза-связывающая петля играет ключевую роль.

выводы

1. Разработанный нами протокол экспрессии CHFI и его мутантов в Е. coli штамм Rosetta-gami 2 DE3 при температуре 25 °С позволяет получить данный рекомбинантный ингибитор в частично растворимой, функционально активной форме и выделить после однофазной очистки препараты белков с чистотой выше 99% по электрофорезу в полиакриламидном геле.

2. Изолированная протеаза-связывающая петля CHFI действует как независимый структурный элемент и ингибирует сериновые протеазы трипсин и фХ1а. Минимальный фрагмент CHFI, сохраняющий ингибирующую активность в отношении фХПа, образован аминокислотными остатками 12-108 (1ВЕА, PDB).

3. Протеаза-связывающая петля CHFI принимает участие во взаимодействии с сериновыми протеазами, но не обуславливает ингибирующую активность CHFI в отношении фХПа.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1) Korneeva, V. A., Trubetskov, М. М., Korshunova, А. V, Lushchekina, S. V, Kolyadko, V. N., Sergienko, О. V, Lunin V.G., Panteleev M.A., Ataullakhanov, F. I. (2014). Interactions Outside the Proteinase-Binding Loop Contribute Significantly to the Inhibition of Activated Coagulation Factor XII by its Canonical Inhibitor from Corn. The Journal of Biological Chemistry, 289(20), 14109-14120.

2) Колядко B.H., Корнеева B.A. (2014). Молекулярные механизмы тромбоза. Фундаментальные и прикладные аспекты контактной активации. Биологические Мембраны, 31(4), 1-12.

3) Korneeva VA, Trubetskov MM, Korshunova AV, Lushchekina SV, Kolyadko VN, Sergienko OV, Lunin VG, PanteleevMA and Ataullakhanov FI. Interactions Outside the Proteinase-binding Loop Contribute Significantly to the Inhibition of Activated Coagulation Factor XII by Its Canonical Inhibitor from Corn. The 60th annual meeting of the International Society on Thrombosis and Haemostasis Scientific and Standardization Committee (ISTH SSC), Milwaukee, USA, June 23-26, 2014, Journal of Thrombosis and Haemostasis, 12, 60-61.

4) Корнеева B.A., Трубецков M.M., Пантелеев M.A., Атауллаханов Ф.И. Специфическое взаимодействие ингибитора трипсина из кукурузы с сериновой протеазой FXIIa не определяется его протеиназа-связывающей петлей. 18-я школа-конференция молодых ученых «Биология - наука 21 века», Пущино, Россия, 20-26 апреля, 2014, материалы конференции, 144-145.

5) Korneeva V.A., Trubetskov М.М., Ataullakhanov F.I., Panteleev M.A. Proteinase-binding loop does not significantly contribute to the specificity of recognition of serine protease factor Xlla by its canonical inhibitor. 38lh Federation of European Biochemical Societies (FEBS) congress, St. Petersburg, Russia, July 6-11, 2013, FEBS Journal, 280, 109-110.

6) Корнеева B.A. (2015). Ингибитор из кукурузы на страже свертывания крови. Природа, 2(1194), с. 31-37

Подписано в печать 16.03.2015 г. Формат А5 Бумага офсетная. Печать цифровая.

Тираж 100 Экз. Типография ООО "ПринтСайдАп"

115093, г. Москва, ул. Большая Серпуховская, д.31 к.11 Тел. 8-495-587-71-31 www.printside.ru