Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение ингибитора трипсина из люцерны и его влияние на физиологические функции организма собак

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Получение ингибитора трипсина из люцерны и его влияние на физиологические функции организма собак"

I

На правах рукописи

РЕДЬКИН ПАВЕЛ ПЕТРОВИЧ

ПОЛУЧЕНИЕ ИНГИБИТОРА ТРИПСИНА ИЗ ЛЮЦЕРНЫ И ЕГО ВЛИЯНИЕ НА ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ ОРГАНИЗМА СОБАК

03.00.13 - физиология 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

КУРСК-2005

Работа выполнена на кафедре физиологии и биохимии ФГОУ ВПО «Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора ИМ. Иванова».

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Фурман Юрий Васильевич

Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук,

профессор Кибкало Леонид Ильич

кандидат биологических наук Бабкина Людмила Александровна

Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Белгородская государственная

сельскохозяйственная академия»

Защита состоится « гз » /ч^У^ 2005 г. в « часов на

заседании диссертационного совета Д 220. 040. 03 при ФГОУ ВПО «Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И.И. Иванова» по адресу: 305021, г. Курск, ул. К. Маркса, 70, КГСХА.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Курской государственной сельскохозяйственной академии имени профессора И.И. Иванова.

Автореферат разослан « 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Г.Ф. Рыжкова

1006-V

MW

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Развитие экспериментальной физиологии и современной биохимии не представляется возможным без системного исследования в области энзимологии. Несмотря на то, что эта сфера научной деятельности в настоящее время претерпела значительный подъем, проблема ферментолиза остается малоизученной, в связи с чем, привлекает особое внимание многих исследователей (Атауллаханов Ф. И., 2000). Такой интерес связан в первую очередь с тем, что ферменты являются высокоактивными строгоспецифичными нетоксичными биокатализаторами белковой природы, широко распространенными в природе, без которых невозможно осуществление биохимических процессов, протекающих в живом организме (Филиппович Ю. Б., 1984).

Одной из самых актуальных проблем в энзимологии является изучение протеолиза, так как данный процесс играет важную роль в обмене веществ организма животных (Черников М. П., 1975). Избыточная активность протеоли-тических ферментов способна вызвать различные патологические состояния организма, такие как ревматоидный артрит (Schnebli H. P. et al, 1984), эмфизема легких (Bignon J. et al, 1980), пневмония (Abrams W. R. et al, 1984), перитонит (Ohlsson K. et al, 1977), панкреатиты (Зубовский Г. A. и др., 1982).

Одним из наиболее значимых ферментов, играющего значительную роль в организме, является трипсин (Циркина А. С., 1982, Остапчук Н. В., 1991, Вер-нигора А. Н. и др., 1996). При известных патологических процессах происходит его избыточный синтез в поджелудочной железе, и фермент становится существенным фактором, многократно усугубляющим течение многих заболеваний (Веремеенко К. Н., 1988). Например, при панкреатитах трипсин поступает в кровь и активирует один из факторов свертывания крови (Мосолов В. В., 1982).

В связи с этим изучение биологических механизмов регуляции избыточной активности трипсина приобрело особую актуальность (Laskowski M. Jr. et al, 1971). Заслуживает внимания процесс ингибирования трипсина (Hölzer H., 1975). Это обусловлено той регуляторной ролью, которую играют ингибиторы в обмене веществ живого организма (Локшина JI. А., 1977, Schreiber H. D. et al, 1973, Кудряшов Б. A., 1974, Heimburger N. et al, 1971, Wallner О. et al, 1974).

Ученым-биологам известны некоторые ингибиторы трипсина животного, растительного и микробного происхождения (Мосолов В. В., 1971, 1982). Среди них, наименее изученным остается ингибитор трипсина из вегетативных органов люцерны, который является наиболее перспективным препаратом для внедрения в фармакологическую практику (Толстогузов В. Б., 1978, Долгов И. А. и др., 1978, PirieN. W., 1971). Физико-химические свойства люцернового ингибитора трипсина изучались в лабораторных условиях in vitro (Ramirez J.S. et al, 1960, Chien T.F. et al, 1970, Chang H.Y. et al, 1978), при этом в литературе не встречается данных об исследовании его биохимических свойств in vivo.

Цель и задачи исследований. Целью нашей работы была разработка технологии получения ингибитора трипсина из люцерны и изучение его влияния на физиологические функции организма собак. Исходя из цели были поставле-

ны следующие задачи:

1. Разработать и экспериментально определить оптимальные технологические режимы получения ингибитора трипсина из люцерны с максимально высокой активностью к соответствующему ферменту.

2. Разработать методы иммобилизации полученного ингибитора трипсина на пектине для получения препарата пролонгированного действия.

3. Изучить воздействие люцернового ингибитора трипсина на биохимические свойства крови клинически здоровых собак.

4. Изучить динамику пролонгированного действия иммобилизованного ингибитора трипсина на ингибирующую активность сыворотки крови собак.

5. В сравнительном аспекте провести исследование влияния люцернового ингибитора трипсина и препарата «контрикал» на морфофункциональное состояние системы крови собак с острым деструктивным панкреатитом.

Научная новизна. Получен ингибитор трипсина из люцерны, новым, разработанным нами способом. Впервые произведена иммобилизация люцернового ингибитора на пектин. На основании биохимических, физиологических и гематологических исследований впервые получено комплексное представление о влиянии люцернового ингибитора трипсина на морфофункциональное состояние системы крови собак.

Теоретическая и практическая новизна работы. Новый способ получения ингибитора трипсина из люцерны дает возможность значительно увеличить выход продукта. Иммобилизованный ингибитор трипсина обладает пролонгированным действием, что значительно продлевает его влияние на организм животных. Данная работа создает перспективу для рекомендации люцернового ингибитора как лекарственного средства для лечения панкреатитов. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Способ получения люцернового ингибитора трипсина в оптимальных условиях, без потери его активности.

2. Способ иммобилизации полученного ингибитора трипсина на пектин.

3. Биохимические свойства крови клинически здоровых собак под влиянием ингибитора трипсина полученного из люцерны.

4. Результаты исследований о пролонгирующем действии иммобилизованного люцернового ингибитора трипсина на функциональное состояние системы крови собак.

5. Сравнительные данные о влиянии препарата «контрикал» и люцернового ингибитора трипсина на морфофункциональное состояние системы крови собак с острым деструктивным панкреатитом.

Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на:

- международных научно - производственных конференциях Белгородской государственной сельскохозяйственной академии 2003 и 2004 гг.;

- П международном симпозиуме «Современные проблемы ветеринарной диетологии и нутрициологии» (Санкт-Петербург, 2004 г.);

- научно-практических конференциях Курской государственной сельскохозяйственной академии им. проф. И. И. Иванова в период с 2001 по 2004 гг.

Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложений. Работа изложена на 125 страницах компьютерного текста, содержит 15 таблиц и 16 рисунков. Список литературы включает 215 источников, в том числе 55 иностранных авторов.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в период с 2001 по 2004 гг. Научные исследования проводились по прилагаемой схеме (рис. 1) в условиях Курской государственной сельскохозяйственной академии имени профессора И. И. ИВАНОВА и Курского государственного медицинского университета.

Объектом исследований служили беспородные клинически здоровые собаки, а так же собаки с моделью острого деструктивного панкреатита. Подопытные животные подбирались по принципу аналогов с учетом возраста, массы тела, условий содержания и кормления.

Материалом для исследований была люцерна, учебно-опытного хозяйства «Знаменское» КГСХА, а так же цельная кровь, сыворотка крови и поджелудочные железы подопытных собак, содержащихся в виварии КГМУ.

Ингибирующую активность ингибитора на всех стадиях очистки ингибитора определяли полуколичественным методом по методу Рейдермана. Белок определяли колорометрическим методом по Лоури с последующей фотоколо-рометрией на концентрационном фотоэлектроколориметре КФК-2.

В качестве матрицы для иммобилизации люцернового ингибитора трипсина использовали пектин, полученный в лабораторных условиях Беляевым А. Г., а так же в опытах in vitro использовали пектин производственный, полученный ООО «Курсккондитер».

Моделирование острого деструктивного панкреатита (ОДП) проводили по методу Шалимова.

Общую ингибирующую активность сыворотки крови определяли экспресс-методом, предложенным Веремеенко К. Н. с соавт. Активность трипсина в сыворотке крови определяли по методу Кунитца в модификации Черникова с последующей спектрофотометрией на спектрофотометре СФ - 26. Активность амилазы в сыворотке крови определяли по Каравею с последующей фотоколо-рометрией на концентрационном фотоэлектроколориметре КФК-2-УХЛА.2. Активность липазы в сыворотке крови определяли титрованием по Титцу.

Определение процентного соотношения белковых фракций сыворотки крови проводили методом электрофореза на ацетат-целлюлозных пленках. Остальное исследование крови проводили по общепринятым методикам.

Гистоморфологические исследования тканей поджелудочной железы про-i водили по методике Меркулова (окраска срезов гематоксилин-эозином).

Моделирование острого деструктивного панкреатита, забор крови и гистоморфологические исследования производили на кафедре оперативной хирургии КГМУ. Выделение, очистка, иммобилизация люцернового ингибитора трипси-

на, а так же исследование проб крови на ферментативную и общую ингиби-рующую активность проводили в условиях лаборатории кафедры физиологии и биохимии КГСХА. Гематологические исследования крови были проведены в лаборатории Курской городской поликлиники № 6.

Полученные данные подвергались математической обработке с использованием стандартных пакетов программ на ПЭВМ.

Рис. I. Общая схема исследований

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Способ получения люцернового ингибитора трипсина

При получении ингибитора трипсина из люцерны в качестве основной схемы использовали способ, разработанный Сухининым В.Н. с соавторами. Однако, в процессе получения были внесены изменения, которые упрощают вышеописанную методику и позволяют получить ингибитор в большем количестве. Но надо сказать, что его степень очистки несколько ниже, чем у ингибитора, полученного по методике Сухинина В.Н. Сравнительная схема получения люцернового ингибитора трипсина представлена в таблице 1.

Таблица 1

Выделение и очистка ингибитора трипсина из люцерны

Этапы выделения и очистки ингибитора Удельная активность, МГ^ипсина/МГбетса Степень очистки

Способ разработанный Сухининым В. Н. с соавт. (1981)

Подкисление НС1 до рН 4,2 (коричневый сок) 0,02 -

Подкисление ТХУ до конечной концентрации 2 % 0,17 8,5

Ионообменная хроматография на КМ-целлюлозе 1,00 50,1

Аффинная хроматография на трипсин-сефарозе 4 В 5,41 270

Способ разработанный в ходе исследований

Высаливание (МН4)28С)4ДО 70 % насыщения 0,05 -

Очистка гель-фильтрацией на сефадексе в - 75 2,30 46

Длительный препаративный электрофорез на бумаге 11,00 220

Разработанный нами способ получения ингибитора трипсина из люцерны значительно упрощает и сокращает на один этап схему выделения и очистки препарата по сравнению со способом, разработанным Сухининым В. Н. Новый метод позволяет получить ингибитор, с меньшей степенью очистки, но с большей удельной активностью (11,00 в Сравнении с 5,41 МГтрщюипа/МГбипа)- Полученный эффект связан с тем, что мы использовали щадящие методы при выделении и очистке исследуемого ингибитора: применение одного буфера (0,05 М трис-глициновый буфер с рН 8,0) на всех этапах получения препарата; включе-I ние в систему буфера защитных добавок (восстановитель - аскорбиновая ки-

слота, специфический ингибитор полифенолоксидазы - диэтилдитиокарбамат и стабилизатор - ЭДТА); высаливание белка ингибитора сульфатом аммония 1 вместо двухэтапного подкисления кислотами и т.д.

3.2. Иммобилизация люцернового ингибитора трипсина на пектин

В качестве матрицы для иммобилизации полученного ингибитора использовали высокомолекулярные полисахариды - пектины. Для иммобилизации ингибитора трипсина использовали пектин, полученный в условиях лаборатории кафедры физиологии и биохимии КГСХА Беляевым А. Г. (пектин 1), и, полученный на ООО «Курсккондитер» (пектин 2).

Способ иммобилизации ингибитора на указанные пектины заключается в следующем: 1 - пектины разводили дистилированной водой, подкисленной НС1 до рН близкого к оптимальному значению данных полисахаридов (для пектина 1 рН - 6,9; для пектина 2 рН - 2.0) в соотношении 1:100 —раствор№1;

2 -ингибитор растворенный в 0,05 М трис-глициновом буфере с рН 8,0 (600 ЕД (1мл): 100 мл);

3 - раствор № 1 смешивали с раствором № 2 в соотношении 1:1;

4 - выдерживали растворы при 25" С в течение 30 мин. с медленным помешиванием реакционной смеси.

Оценку степени связывания пектинов с ингибитором осуществляли полуколичественным методом определения общей антитрипсической активности по Рэйдерману. Результаты опыта представлены на рисунке 2.

1 2 3

и

г,

са

Ж &

о С в

э-

ж

а> ш

1 - пектин 1 (Беляева А.Г.)

2 - пектин 2 (коммерческий)

3 -трис-НС1 буфер (контроль)

Рис. 2. Взаимодействие иммобилизованного на пектинах трипсина с желатиновой поверхностью рентгеновской пленки

Результаты, полученные в ходе опыта, показали, что пектин 2 меньше отдает иммобилизованный ингибитор (протеолитическая активность трипсина составила 0,250 мг/мл), чем пектин 1 (активность трипсина - 0,125 мг/мл). Данный эффект предположительно связан с кислым рН пектина 2, в результате чего имело место неспецифическая адсорбция белка ингибитора на лолисахарид-ной матрице.

3.3. Общая ингибирующая активность сыворотки крови собак после внутривенного введения люцернового ингибитора трипсина

Для проведения опыта было сформировано две группы собак по 6 голов в каждой. До опыта у собак обеих групп проведен отбор крови и в сыворотке определен исходный уровень активности ингибиторов, который составил 1,48 ± 0,04 г/л - опыт, 1,56 ± 0,05 г/л - контроль. Собакам опытной группы внутривенно ввели люцерновый ингибитор трипсина в дозе 300 ЕД на кг живой массы, на изотоническом растворе, контрольным - изотонический раствор.

Отбор крови производили через каждые 30 минут на протяжении четырех часов после введения ингибитора с последующим определением суммарной ин-гибигорной активности сыворотки.

Динамика изменения ингибирующей активности сыворотки крови у собак опытной группы приведена на рисунке 3.

■ опыт □ контроль

и ч

И

а. о " я

V© 5 и X Я

а

Рис. 3. Изменение общей ингибирующей активности сыворотки крови у собак после внутривенного введения люцернового ингибитора трипсина

Как видно из рисунка 3 через 30 минут после введения экзогенного ингибитора трипсина ингибиторная активность сыворотки крови собак опытной группы увеличилась и составила 6.63 ±0,12 г/л. В дальнейшем наблюдалась такая же тенденция, хотя темпы прироста были значительно меньше. В последующие периоды ингибирующая активность сыворотки крови снижалась и через 3 ч была на уровне показателей контрольной группы.

3.4. Исследование крови собак после внутривенного введения люцернового ингибитора трипсина

Кровь для исследований у собак опытной группы отбирали параллельно с исследованиями общей ингибирующей активности сыворотки крови. Результаты исследований представлены в таблице 2.

Таблица 2

Результаты исследования сыворотки крови собак после внутривенного введения люцернового ингибитора трипсина

Показатели и единицы измерения Доведения физ.р-ра (КОНфОЛЬ) До введения ЛИТ 1чпосле введения ЛИТ 2чпосле введения ЛИТ Зч после введения ЛИТ

Общий белок, г/л 67±1,72 65 ±2,23 68±221 67±1,93 66±1£4

альбумины 42£± 1Д) 42,9± 1,61 39,1 ±1,65* 40,8± 1£9 42,0 ± 1,52

ч? <й О4 а-пюбулины 15,4±0,17 15,6 ±0,26 21,8 ±035* 20Д±0,38* 16,7±0,23*

^ 4 (^-глобулины 21,8±0,60 21,7±0ДЗ 18,2 ±0,71* 18,9 ±0,77* 19,8 + 0,69*

у-глобулины 19,9±0,81 19,8 ±0,76 19,9 ±0,66 20,1 ±0,92 21,5 ±1,01

Ингибируюшая активность, ПЕ^/мл 1,49 ±0,06 1,48 ±0,05 6,87 ±0,25* 5,40 ±022* 1,51 ±0,06

* - Р < 0,05 (по сравнению с контролем)

Отмечаем прогнозированное повышение ингибирующей активности сыворотки крови со 1,48 до 6,87 ПЕ ка1Чс1, Так же произошло значительное увеличение а-глобулиновой фракции - более 6%. Эти изменения вероятно вызваны тем, что люцерновый ингибитор по химической структуре относится к а-глобулинам.

3.5. Модель острого деструктивного панкреатита у собак

Развитие острого деструктивного панкреатита (ОДП) моделировали посредством введения аутожелчи в проток поджелудочной железы с созданием внутрипротоковой гипертензии по методу Шалимова. Уже через минуту после введения желчи в выводной проток поджелудочная железа сильно увеличивалась в размерах и резко проявлялась ее дольчатость, что свидетельствовало о правильности проведения моделирования острого деструктивного панкреатита (рис. 4 - 5).

Рис. 4 Поджелудочная железа собаки до создания модели ОДП

Рис. 5 Поджелудочная железа собаки после создания модели ОДП

Собакам контрольной группы лечение не проводили, собакам опытной группы внутривенно вводили люцерновый ингибитор, собакам группы сравнения вводили контрикал. Забор крови производили до начала операции и через каждые два часа после введения аутожелчи в течение трех суток. В опытной группе и фуппе сравнения сразу после взятия крови в эту же вену вводили медленно люцерновый ингибитор и контрикал соответственно, в дозе 300 ЕД на кг. живой массы тела на изотоническом растворе.

Состояние оперированных животных первые 2 дня было тяжелым. Температура тела была выше нормы на 2 - 3 °С; пульс составлял 150 - 180 ударов в минуту; дыхание учащено - 40 вдохов в минуту. У всех собак отмечали рвоту, особенно после приема воды и мясного бульона. Из дренажа первые три дня поступал геморрагический выпот; в дальнейшем он осветлялся до соломенного цвета. Начиная с третьего дня, состояние собак, которым проводили лечение, значительно улучшилось.

3.6. Ферментативный фон сыворотки крови собак с моделированным ОДП после применения контрикала и люцернового ингибитора

В качестве объекта исследования служили беспородные собаки с моделью острого деструктивно! о панкреатита в количестве 18 цпук. Первые 6 собак служили контрольной группой (без введения ингибиторов трипсина), другие 6 собак являлись опытной группой (вводили люцерновый ингибитор) и последние 6 собак входили в группу сравнения (вводили контрикал).

Забор крови производили до начала операции и через каждые два часа после введения аутожелчи в течение трех суток. В опытной группе и группе сравнения сразу после взятия крови в эту же вену вводили медленно люцерновый ингибитор и контрикал соответственно, в дозе 300 ЕД на кг. живой массы тела на изотоническом растворе.

В пробах крови определяли изменения общей ингибирующей активности сыворотки крови и активность трипсина при данной патологии под действием люцернового ингибитора и контрикала. Динамика данных изменений графически отображена на рисунках 6 - 7.

•трипсин

иигибиругощая активность

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72

часы

Рис. 6. Изменение активности трипсина и общей ингибирующей активности сыворотки крови после внутривенного введения контрикала собакам с моделью ОДП

Из опытных данных видно, что контрикап способен резко снижать активность трипсина в крови (от 2,75 до 1,67 ПЕщ/мл), и пропорционально ему постепенно увеличивать общую ингибирующую активность сыворотки крови (с 0,09 до 3,42 г/л). Всякий раз при введении данного препарата отмечалось резкое падение до определенного уровня активности трипсина с одновременным подъемом общей ингибирующей активности сыворотки крови.

•трипсин

ингибируюнщя активность

3 ^ 2 й

» а

«о я и в

1111111 1111111 1111111 I

12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 часы

Рис. 7. Изменение активности трипсина и общей ингибирующей активности сыворотки крови после внутривенного введения люцернового ингибитора собакам с моделью ОДП

Анализ данных показал, что люцерновый ингибитор действует аналогично контрикалу и способен достоверно снижать активность трипсина в крови (от 2,89 до 1,67 ПЕи/мл), пропорционально увеличивая общую ингибирующую активность сыворотки крови (с 0,48 до 3,42 г/л). При этом графические изображения изменений ферментативной и общей ингибирующей активности сыворотки крови собак с моделированным острым деструктивным панкреатитом под воздействием контрикала и люцернового ингибитора практически совпадают. Однако, цифровые значения, отражающие это влияние, указывают на то, что люцерновый ингибитор обладает менее выраженным ингибирующим действием по отношению к трипсину, чем контрикал.

3.7. Исследование картины крови собак с моделью ОДП после внутривенного введения люцернового ингибитора и контрикала

Кровь для гематологического исследования брали по ходу изучения ферментативного фона и общей ингибирующей активности сыворотки крови до создания модели ОДП (контрольная группа) и после введения люцернового ингибитора через каждый час на протяжении трех часов (опытная группа). Полученные в ходе опыта данные представлены в таблицах 3-4.

Таблица3

Результаты исследования крови собак с моделью ОДГ7 _после внутривенного введения контрикала_

Показатели и едшицы измерения До модели одр (котраль) Д° щэименения котрикала Суп® применения котрикала Двое суток применения котрикала Трое суток применения котрикала

Общий белок, г/л 68 ±1,44 67 ±1,64 68 ±2,05 69 ±2,13 68±2,15

8$ и 5 альбумины 425 ± 1,63 42,6± 1,16 40,6± 1,54 41,0± 1,62 41,5±1,63

а-плобулины 15,5±0,18 15,7 ±0,29 13,5± 036* 15,6 ±0,44 16,5±0,23*

1| ^-глобулины 21,7 ±0,56 21,9 ±0,84 213±0,71 19,9 ±0,85* 21£±1,01

у-пюбулины 203±0,67 19,8 ±0,54 24,6± 1,13* 23,6± 1,08* 21,0 ±0,93

Ингибирующая активность, ПЕд/мл 1,43 ±0,01 1,42±0,02 0,90 ±0,01 * 1,48±0,02* 1,42 ±0,03

1 Амилаза, мг/(ч-мл) 52±2Д) 51 ±2,18 275±7,42* 258 ±5,84* 117±4,53*

Липаза, усл. ед 1,7 ±0,06 1,6 ±0,08 4,0 ±0,12* 4,0 ±0,12* 2Д±0,09*

Трипсин, ПЕн/мл 1,45 ±0,07 1,44±0,04 2,62 ±0,11 * 236±0,10* 1,90±0,08*

* - Р < 0,05 (по сравнению с контролем)

Анализ данных таблицы 3 показал, что изменения гематологических показателей у собак с моделью ОДП при внутривенном введении контрикала указывает на более благоприятное течение патологического процесса по сравнению с контрольной группой. Вначале отмечали снижение (до 13,5 %), а затем постепенное повышение а-гтюбулиновой фракции (до 16,5 %), при росте общей ин-гибирующей активности сыворотки крови на фоне пропорционального понижения активности трипсина в крови.

Таблица4

Результаты исследования крови собак с моделью ОДП после внутривенного введения люцернового ингибитора трипсина_

Показатели и единицы измерения До модели одп (контроль) До фименения ЛИГ Супси применения ЛИГ Двое суток применения ЛИТ Трое суток применения ЛИТ

Общий белок, гУл 67±136 66±1,84 67 ±2,42 68 ±2,67 68 ±1,72

а £ альбумины 41,8 ± 1,24 42,7± 1,86 40,0± 1,98 40,8 ±1,53 413 ±1,84

а-глобулины 153±0,15 15,5±0,18 12,4±0ДЗ* 15,4± 0,25 16,0±0,!3*

Р-гпобулины 21,7 ±0,39 21,8± 1,01 21,6±0,71 19,2 ±0,62* 21,4 ±0,83

у-пюбулины 21,2±0,54 20,0 ±0,86 26,0± 1,10* 24,6 ±0,92* 213 ±0,79

Ингибируюшзя активность, ПЕщ/мл 133 ±0,05 132 ±0,05 0,83±0,03* 1,49 ±0,06* 135 ±0,04

1 Амилаза, мг/(ч-мл) 55 ±1,94 56±1,58 281 ±63* 264±734* 123 ±4,08*

Липаза, усл. со. 1,6 ±0,07 1,5±0,0б 4,0±0,17* 4,2±0,16* 2Д±0,И*

Трипсин, ПЕга/МЛ 1,46±0,06 1,45 ±0,05 2,79±0,12* 2^5 ±0,08* 2,10 ±0,09*

* - Р < 0,05 (по сравнению с контролем)

Проводя анализ данных, представленных в таблицах 3-4, можно сделать вывод, что изменения гематологических показателей приметно схожи, однако их динамика интенсивней при применении контрикала, чем при воздействии люцернового ингибитора на организм собак с моделью ОДП. Как и в предыдущем опыте вначале происходит понижение (до 12,4 %), а затем постепенное повышение а-глобулиновой фракции (до 16,5 %), при потенцированном росте общей ингибирующей активное™ сыворотки крови на фоне пропорционального снижения активности трипсина в крови.

3.8. Общая ингибирующая активность сыворотки крови у собак после внутримышечного введения иммобилизованного на пектин люцернового ингибитора трипсина

Изменения общей ингибирующей активности сыворотки крови при воздействии иммобилизованного на пектинах люцернового ингибитора на организм подопытных животных графически отображены на рисунке 8.

I ЛИТ В ЛИТ на пектине 11 ЛИТ на пектине 2

О 1 2 3 4 5 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72

пяти

Рис. 8. Изменение общей ингибирующей активности сыворотки крови у собак после внутримышечного введения иммобилизованного на пектин люцернового ингибитора трипсина

Установлено, что пектины обладают различной степенью пролонгации и способностью отдавать ингибитор. Действие пектина 1 менее продолжительное (30 ч), чем пектина 2 (60 ч). Однако, первый способен отдавать почти весь иммобилизованный на нем препарат - до 83,8 % ингибитора, в то время как второй иммобилизант только 69,1 %. Очевидно, пектин 2 необратимо связывает большую часть (по сравнению с пектином 1) иммобилизованного на себе люцернового ингибитора за счет неспецифической адсорбции, так как обладает сильными кислотными свойствами.

3.9. Исследование крови собак после внутримышечного введения иммобилизованного на пектин люцернового ингибитора трипсина

Гематологические показатели картины крови у клинически здоровых собак при внугримышечном введении иммобилизованного на пектинах люцернового ингибитора представлены в таблице 5.

Таблица 5

Исследование крови у собак после внутримышечного введения иммобилизованного на пектинах люцернового ингибитора трипсина

Показатели и единицы измерения Введение пектинов (контроль) До введения ингибиторов Введение вдгавнош ЛИТ Введение ЛИТ на пектине 1 Введение ЛИТ на пектине2

Общий белок, т/л 66±1,84 65 ±2,75 69 ±3,40 67±2Д) 66 ±2,97

Белковые фракции, %: альбумины 42,7 ±2,05 42,6 ±2,02 39,7± 1,83 40,4± 1,82 42,7 ±1,53

ос-глобулины 15,4 ±0,22 15,8 ±0,53 20,7 ±0,86* 19,0 ±0,62* 17,7 ±0,34*

Р-гаобулины 21,8±0,84 21,7 ±0,85 19,6 ±0,55* 20,5 ±0,93 19,4 ±0,63*

у-гтюбулины 20,1 ±0,72 19,9 ±0,56 20,0 ±0,96 20,1 ±0,73 20,2 ±0,84

Ингибируюшэя активность, ПЕи/мл 1Д)±0,04 1,50 ±0,02 6,87 ±0,12* 5,76 ±0,23* 4,75±0,18*

* - Р < 0,05 (по сравнению с контролем)

Анализ данных таблицы 5 показал, что гематологические показатели у клинически здоровых собак при внутримышечном введении иммобилизованного на пектинах люцернового ингибитора трипсина примерно соответствуют таковым при внутривенном введении нативного ингибитора, с той лишь разницей, что пропорциональное повышение общей ингибирующей активности сыворотки крови и а-глобулиновой фракции значительно продлено.

ВЫВОДЫ

1. В лабораторных условиях определены оптимальные технологические режимы получения ингибитора трипсина из люцерны, обладающего высокой активностью к соответствующему ферменту. Одноэтапное осаждение белка ингибитора проводили сульфатом аммония, с последующей тонкой очисткой при помощи гель-хроматографии и электрофореза.

2. В результате экспериментальных исследований разработан способ иммобилизации полученного ингибитора на пектиновую матрицу. Пектин, имеющий кислые свойства (рН 2,0), связывал 31,25 мг ингибитора/г сухого вещества, а нейтральный пектин (рН 6,9), связывал 18,5 мг/г. Кислый пектин в .меньшей степени отдает ингибитор (протеолитическая активность .трипсина составила 0,250 мг/мл), чем нейтральный пектин (активность трипсина - 0,125 мг/мл).

3. Установлено, что внутривенное введение люцернового ингибитора клинически здоровым собакам в дозе 300 ЕД/кг живой массы увеличивает общую ингибируюшую активность сыворотки крови с 1,48 до 6,63 г/л.

4. Люцерновый ингибитор трипсина по химической структуре относится к а-глобулинам, и его внутривенное введение в терапевтической дозе собакам увеличивало на 6% а-глобулиновую фракцию общего белка сыворотки крови.

5. Использование люцернового ингибитора трипсина иммобилизованного на пектине значительно пролонгировало его воздействие на организм собак. Установлено, что пектины обладают различной степенью пролонгации и способностью отдавать ингибитор, что зависит от их физико-химических свойств. Действие ингибитора, иммобилизованного на нейтральном пектине, менее продолжительное (30 ч), чем с пектином, обладающим кислыми свойствами (60 ч). При этом первый способен отдавать почти весь иммобилизованный на нем препарат - до 83,8 % ингибитора, в то время как второй - только 69,1 %.

6. Гематологическое исследование показало, что использование пектина в качестве иммобилизирующей матрицы не оказывают отрицательного влияния на общую картину крови клинически здоровых собак. Отмечали лишь прогнозированное пролонгированное действие иммобилизированного на них экзогенного ингибитора трипсина. При этом зафиксировано повышение общей инги-бирующей активности сыворотки крови и а-глобулиновой фракции относительно влияния нативного ингибитора.

7. Внутривенное введение люцернового ингибитора трипсина собакам с острым деструктивным панкреатитом в дозе 300 ЕД/кг живой массы понижало уровень протеолитической активности трипсина в крови с 2,89 до 1,67 ПЕ^/мл, пропорционально увеличивая общую ингибирующую активность сыворотки крови от 0,48 до 3,42 г/л.

8. Применение люцернового ингибитора трипсина собакам с острым деструктивным панкреатитом вызывало первоначально незначительное снижение (до 12,4 %), а затем постепенное увеличение а-глобулиновой фракции сыворотки крови (до 16,5 %), с пропорциональным снижением в ней активности трипсина. У животных опытной группы наблюдали более быстрое выздоровление по сравнению с контролем.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Фармакологическим предприятиям для производства лекарственных препаратов, содержащих ингибиторы трипсина, предлагается использовать более доступное и дешевое сырье, а так же технологию получения ингибитора трипсина из люцерны.

2. Для производственных отделов ветеринарных лабораторий предлагается технология получения пролонгированных препаратов на основе пектина.

3. Материалы исследований могут быть использованы для разработки научно обоснованных рекомендаций при изучении курсов биохимии и физиологии в высших учебных заведениях.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Редькин П. П. Динамика изменения активности трипсина / П. П. Редькин // Материалы научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов по итогам научно-исследовательской работы за 2001 год. - Курск, 2002. - С. 20-21.

2. Редькин П. П. Получение ингибитора трипсина из люцерны / П. П. Редькин, Н. А. Клецова, Ю. В. Фурман // Материалы IV международной научно-производственной конференции: Проблемы сельскохозяйственного производства на современном этапе и пути их решения. - Белгород, 2002. - С. 152 - 153.

3. Редькин П П. Некоторые аспекты очистки ингибитора трипсина / П. П. Редькин, Ю. В. Фурман II Материалы V международной научно-производственной конференции: Проблемы сельскохозяйственного производства на современном этапе и пути их решения. - Белгород, 2003. - С. 132 - 133.

4. Редькин П. П. Получение ингибитора трипсина методом электрофореза / П. П. Редькин // Материалы научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов по итогам научно-исследовательской работы за 2003 год. - Курск, 2004. - С. 9 - 10.

5. Редькин П. П. Технология получения ингибитора трипсина методом электрофореза / П. П. Редькин // Материалы П международного симпозиума: Современные проблемы ветеринарной диетологии и нутрициологии. - СПб., 2004.-С. 11-12.

Сдано в набор 23 05 2005 г Подписано в печать 23 05 2005 г Формат 60x84 1/16 Бумага Айсберг. Объем 1,0 уел печ л Гарнитура Тайме. Тираж 100 экз. Заказ № 53.

Издательство КГСХА им. проф. И И. Иванова 305021, г. Курск, ул. К. Маркса, 70

Отпечатано в множительном центре ВНИИЗиЗПЭ 305021, г. Курск, ул. К. Маркса, 70-6

2006-4 IM 2 74 Z 14628 4

f

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Редькин, Павел Петрович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Роль ингибиторов протеолиза

1.2. Методы выделения и очистки ингибиторов протеаз

1.3. Состояние поджелудочной железы у собак в норме и при патологии и методы ее изучения

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы исследования

2.2. Результаты исследования

2.2.1. Способ получения люцернового ингибитора трипсина

2.2.2. Иммобилизация люцернового ингибитора трипсина на пектин

2.2.3. Общая ингибирующая активность сыворотки крови собак после внутривенного введения люцернового ингибитора трипсина

2.2.4. Исследование крови собак после внутривенного введения люцернового ингибитора трипсина

2.2.5. Модель острого деструктивного панкреатита у собак

2.2.6. Ферментативный фон сыворотки крови собак с моделью острого деструктивного панкреатита и его изменения после внутривенного введения контрикала и люцернового ингибитора

2.2.7. Изменение картины крови собак с моделью острого деструктивного панкреатита и ее изменения после внутривенного введения контрикала и люцернового ингибитора

2.2.8. Гистоморфологическое исследование поджелудочной железы собак с моделью острого деструктивного панкреатита и ее изменения после внутривенного введения контрикала и люцернового ингибитора

2.2.9. Общая ингибирующая активность сыворотки крови собак после внутримышечного введения иммобилизованного на пектин люцернового ингибитора трипсина

2.2.10. Исследование крови собак после внутримышечного введения иммобилизованного на пектин люцернового ингибитора трипсина

3. Обсуждение результатов исследования

4. Выводы

5. Практические предложения

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение ингибитора трипсина из люцерны и его влияние на физиологические функции организма собак"

Актуальность темы. Развитие экспериментальной физиологии и современной биохимии не представляется возможным без системного исследования в области энзимологии. Несмотря на то, что эта сфера научной деятельности в настоящее время претерпела значительный подъем, проблема ферментолиза остается малоизученной, в связи с чем, привлекает особое внимание многих исследователей (Атауллаханов Ф.И., 2000). Такой интерес связан в первую очередь с тем, что ферменты являются высокоактивными строгоспецифичными нетоксичными биокатализаторами белковой природы, широко распространенными в природе, без которых невозможно осуществление биохимических процессов, протекающих в живом организме (Филиппович Ю.Б., 1984).Одной из самых актуальных проблем в энзимологии является изучение протеолиза, так как данный процесс играет важную роль в обмене веществ организма животных (Черников М.П., 1975). Избыточная активность протеолитических ферментов способна вызвать различные патологические состояния организма, такие, как ревматоидный артрит (Schnebli Н.Р. et al, 1984), эмфизема легких (Bignon J. et al, 1980), пневмония (Abrams W.R. et al, 1984), перитонит (Ohlsson K. et al, 1977), панкреатиты (Зубовский Г.А. и др., 1982).Одним из наиболее значимых ферментов, играющих значительную роль в организме, является трипсин (Циркина А.С., 1982, Остапчук Н.В., 1991, Вернигора А.Н. и др., 1996). При известных патологических процессах происходит его избыточный синтез в поджелудочной железе, и фермент становится существенным фактором, многократно усугубляющим течение многих заболеваний (Веремеенко К.Н., 1988). Например, при панкреатитах трипсин поступает в кровь и активирует один из факторов свертывания крови (Мосолов В.В., 1982). в связи с этим изучение биологических механизмов регуляции избыточной активности трипсина приобрело особую актуальность (Laskowski M.Jr. et al, 1971). Заслуживает внимания процесс ингибирования трипсина (Holzer Н., 1975). Это обусловлено той регуляторной ролью, которую играют ингибиторы в обмене веществ живого организма (Локшина Л.А., 1977, Schreiber H.D. et al, 1973, Кудряшов Б.А., 1974, Heimburger N. et al, 1971, Wallner O. et al, 1974).Ученым-биологам известны некоторые ингибиторы трипсина животного, растительного и микробного происхождения (Мосолов В.В., 1971, 1982). Среди них наименее изученным остается ингибитор трипсина из вегетативных органов люцерны, который является наиболее перспективным препаратом для внедрения в фармакологическую практику (Толстогузов В.Б., 1978, Долгов И.А. и др., 1978, Pirie N.W., 1971). Физико-химические свойства люцернового ингибитора трипсина изучались в лабораторных условиях in vitro (Ramirez J.S. et al, 1960, Chien T.F. et al, 1970, Chang H.Y. et al, 1978), при этом в литературе не встречается данных об исследовании его биохимических свойств in vivo.Цель и задачи исследований. Целью нашей работы была разработка технологии получения ингибитора трипсина из люцерны и изучение его влияния на физиологические функции организма собак. Исходя из цели, были поставлены следующие задачи: 1. Разработать и экспериментально определить оптимальные технологические режимы получения ингибитора трипсина из люцерны с максимально высокой активностью к соответствующему ферменту.2. Разработать методы иммобилизации полученного ингибитора трипсина на пектине для получения препарата пролонгированного действия.3. Изучить воздействие люцернового ингибитора трипсина на биохимические свойства крови клинически здоровых собак.4. Изучить динамику пролонгированного действия иммобилизованного ингибитора трипсина на ингибирующую активность сыворотки крови собак.5. В сравнительном аспекте провести исследование влияния люцернового ингибитора трипсина и препарата «контрикал» на морфофункциональное состояние системы крови собак с острым деструктивным панкреатитом.Научная новизна. Получен ингибитор трипсина из люцерны, новым, разработанным нами способом. Впервые произведена иммобилизация люцернового ингибитора на пектин. На основании биохимических, физиологических и гематологических исследований впервые получено комплексное представление о влиянии люцернового ингибитора трипсина на морфофункциональное состояние системы крови собак.Теоретическая и практическая новизна работы. Новый способ получения ингибитора трипсина из люцерны дает возможность значительно увеличить выход продукта. Иммобилизованный ингибитор трипсина обладает пролонгированным действием, что значительно продлевает его влияние на организм животных. Данная работа создает перспективу для рекомендации люцернового ингибитора как лекарственного средства для лечения панкреатитов.Основные положения, выносимые на защиту: 1. Способ получения люцернового ингибитора трипсина в оптимальных условиях, без потери его активности.2. Способ иммобилизации полученного ингибитора трипсина на пектин.3. Биохимические свойства крови клинически здоровых собак под влиянием ингибитора трипсина, полученного из люцерны.4. Результаты исследований о пролонгирующем действии иммобилизованного люцернового ингибитора трипсина на функциональное состояние системы крови собак.5. Сравнительные данные о влиянии препарата «контрикал» и люцернового ингибитора трипсина на морфофункциональное состояние системы крови собак с острым деструктивным панкреатитом.Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на: - международных научно - производственных конференциях Белгородской государственной сельскохозяйственной академии 2003 и 2004 гг.; - II международном симпозиуме «Современные проблемы ветеринарной диетологии и нутрициологии» (Санкт-Петербург, 2004 г.); - научно-практических конференциях Курской государственной сельскохозяйственной академии им. профессора И.И. Иванова в период с 2001 по 2004 гг.Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Редькин, Павел Петрович

4. ВЫВОДЫ

1. В лабораторных условиях определены оптимальные технологические режимы получения ингибитора трипсина из люцерны, обладающего высокой активностью к соответствующему ферменту. Одноэтапное осаждение белка ингибитора проводили сульфатом аммония, с последующей тонкой очисткой при помощи гель-хроматографии и электрофореза.

2. В результате экспериментальных исследований разработан способ иммобилизации полученного ингибитора на пектиновую матрицу. Пектин, имеющий кислые свойства (рН 2,0), связывал 31,25 мг ингибитора/г сухого вещества, а нейтральный пектин (рН 6,9) связывал 18,5 мг/г. Кислый пектин в меньшей степени отдает ингибитор (протеолитическая активность трипсина составила 0,250 мг/мл), чем близкий к нейтральным пектин (активность трипсина - 0,125 мг/мл).

3. Установлено, что внутривенное введение люцернового ингибитора клинически здоровым собакам в дозе 300 ЕД/кг живой массы увеличивает общую ингибирующую активность сыворотки крови с 1,48 до 6,63 г/л.

4. Люцерновый ингибитор трипсина по химической структуре относится к а-глобулинам, и его внутривенное введение в терапевтической дозе подопытным собакам увеличивало на 6% а-глобулиновую фракцию общего белка сыворотки крови.

5. Использование люцернового ингибитора трипсина, иммобилизованного на пектине, значительно пролонгировало его воздействие на организм собак. Установлено, что пектины обладают различной степенью пролонгации и способностью отдавать ингибитор, что зависит от их физико-химических свойств. Действие ингибитора, иммобилизованного на нейтральном пектине, менее продолжительное (30 ч), чем с пектином, обладающим кислыми свойствами (60 ч). При этом первый способен отдавать почти весь иммобилизованный на нем препарат - до 83,8 % ингибитора, в то время как второй -только 69,1 %.

6. Гематологическое исследование показало, что использование пектина в качестве иммобилизирующей матрицы не оказывает отрицательного влияния на общую картину крови клинически здоровых собак. Отмечали лишь прогнозированное пролонгированное действие иммобилизированного на них экзогенного ингибитора трипсина. При этом зафиксировано повышение общей ингибирующей активности сыворотки крови и а-глобулиновой фракции относительно влияния нативного ингибитора.

7. Внутривенное введение люцернового ингибитора трипсина собакам с острым деструктивным панкреатитом в дозе 300 ЕД/кг живой массы понижало уровень протеолитической активности трипсина в крови с 2,89 до 1,67 ПЕ-каз/мл, пропорционально увеличивая общую ингибирующую активность сыворотки крови от 0,48 до 3,42 г/л.

8. Применение люцернового ингибитора трипсина собакам с острым деструктивным панкреатитом вызывало первоначально незначительное снижение (до 12,4 %), а затем постепенное увеличение а-глобулиновой фракции сыворотки крови (до 16,5 %), с пропорциональным снижением в ней активности трипсина. У животных опытной группы наблюдали более быстрое выздоровление по сравнению с контролем.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Фармакологическим предприятиям для производства лекарственных препаратов, содержащих ингибиторы трипсина, предлагается использовать более доступное и дешевое сырье, а также технологию получения ингибитора трипсина из люцерны.

2. Для производственных отделов ветеринарных лабораторий предлагается технология получения пролонгированных препаратов на основе пектина.

3. Материалы исследований могут быть использованы для разработки научно обоснованных рекомендаций при изучении курсов биохимии и физиологии в высших учебных заведениях.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Редькин, Павел Петрович, Курск

1. А. с. 698623 СССР: М.Кл2 А 61 К 37/64. Способ получения ингибитора трипсина / И.М. Вайсблай (СССР). № 2620955/28-13; Заявл. 22.05.78; Опубл. 25.11.79, Бюл. № 43. 4 с.

2. А. с. 1581321 СССР: 5 А 61 К 37/64. Ингибитор протеолиза / Г.А. Суханова (СССР). № № 4418602/30-14; Заявл. 03.05.88; Опубл. 30.07.90, Бюл. № 28.-6 с.

3. Акаевский, А.И. Анатомия домашних животных / А.И. Акаевский, Ю.Ф. Юдичев, Н.В. Михайлов. М.: Колос, 1984. - С. 567 - 654.

4. Акбашева, O.E. Оценка состояния системы протеолиза в диагностике заболеваний / O.E. Акбашева, Г.А. Суханова, Е.В. Дюкова // Клиническая лабораторная диагностика. 1997. - № 6. - С. 21 - 22.

5. Акбашева, O.E. Показатели протеолиза в оценке резорбции при опухолях кости / O.E. Акбашева, Г.А. Суханова, И.И. Щепеткин // Клиническая лабораторная диагностика. 2000. - № 11. - С. 23 - 33.

6. Андреев, В.В. Производство кормового растительного белка / В.В. Андреев. М.: Россельхозиздат, 1979. С. 16, 48 - 69, 96 - 97.

7. Антонов, Б.И. Лабораторные исследования в ветеринарии: биохимические и микологические / Б.И. Антонов. М.: Агропромиздат, 1987. - С. 1556.

8. Асатиани, B.C. Биохимический анализ / B.C. Асатиани. Тбилиси, 1953.-С. 7-35.

9. Асатиани, B.C. Методы биохимических исследований / B.C. Асатиани. -М.: Наука, 1956. С. 6- 15.

10. Асатиани, B.C. Ферментативные методы анализа / B.C. Асатиани. М.: Наука, 1969.-С. 11-22.

11. Асланян, Н.Л. О некоторых факторах, влияющих на точность определения белковых фракций сыворотки крови методом электрофореза на бумаге / Н.Л. Асланян // Лабораторное дело. 1964. - № 4. - С. 17 - 19.

12. Атауллаханов, Ф.И. Каскады ферментативных реакций и их роль в биологии / Ф.И. Атауллаханов // Соросовский образовательный журнал. 2000. -№7.-С. 2- 10.

13. Афонский, С.И. Биохимия животных / С.И. Афонский. М.: Высшая школа, 1970.-С. 7- 12.

14. Баландин, A.A. Принципы структурного и энергетического соответствия в ферментативном катализе / A.A. Баландин // Биохимия. 1958. - № 23. -С. 456-468.

15. Баррет, А.Дж. Лизосомные ферменты / А.Дж. Баррет // Лизосомы: Методы исследования. М.: Мир, 1980. - С. 25 - 156.

16. Бассалык, Л.С. Лизосомальные протеолитические ферменты в процессах инвазии и метастазирования меланом / Л.С. Бассалык, П.Е. Цанев, С.М. Паршикова, Л.В. Демидов // Вопросы онкологии. 1992. - Т. 38, № 4. -С. 418-424.

17. Бейли, Дж. Методы анализа белков / Дж. Бейли. М.: Мир, 1965. - С. 14-50.

18. Белозерский, М.А. Аминокислотные последовательности анионных ингибиторов протеаз из семян гречихи / М.А. Белозерский, Я.Е. Дунаевский, А.Х. Мусалямов, Ц.А. Егоров, // Биохимия. 1996. - Т. 61, № 10. - С. 1743 -1749.

19. Бенкен, И.И. Белок и белковые ингибиторы пищеварительных протеи-наз в семенах различных сортов нута / И.И. Бенкен, Р.Д. Демина, Т.А. Ко-мендантова // Труды по прикладной ботанике, генетике, селекции. 1981. — Т. 70, №3.

20. Берстон, М. Гистохимия ферментов / М. Берстон. М.: Наука, 1965. -С. 10-55.

21. Биохимические методы исследования в клинике: Справочник / Под ред. A.A. Покровского. -М.: Медицина, 1969.

22. Бирнбауэр, JI.H. К методике определения белков плазмы крови методом электрофореза на бумаге / JI.H. Бирнбауэр // Лабораторное дело. 1963. -№6.

23. Битюков, И.П. Основные физиологические и биохимические константы организма домашних и диких животных / И.П. Битюков, Е.И. Битюков, A.A. Евглевский, H.A. Миненков, Ю.Н. Горобец. Курск: КГСХА, 1997. - С. 3-22.

24. Богачева, Т.И. Некоторые физико-химические свойства модифицированного трипсина / Т.И. Богачева, O.A. Миргородская, Б.В. Москвичев // Биохимия. 1977.-Т. 42,№4.-С. 609-615.

25. Болдырев, A.A. Как регулируется активность мембранных ферментов / A.A. Болдырев // Биологические науки. 1985. - № 9. - С. 5 - 13.

26. Братчик, A.M. Клинические проблемы фибринолиза / A.M. Братчик. -Киев: Здоровье, 1993. С. 40 - 83.

27. Браунштейн, А.Е. «Активные центры» и природа каталитических ферментов / А.Е. Браунштейн // Журнал Всесоюзного химического общества. -1963.-№8.-81 с.

28. Браунштейн, А.Е. Ферменты / А.Е. Браунштейн. М.: Наука, 1964.

29. Брейн, Д Кинетика и термодинамика биохимических процессов / Д. Брейн, К Уайт. М.: ИЛ, 1959. - С. 30 - 33.

30. Булычев, А.Г. Лизосомные ферменты и активность естественных киллеров / А.Г. Булычев, Т.В. Блинова // Цитология. 1991. - Т. 33, № 2. - С. 76 -79.

31. Бышевский, A.M. Биохимия для врача / A.M. Бышевский, O.A. Терсе-нов. Екатеринбург: Уральский рабочий, 1994. - С. 11 - 25.

32. Валуев, О.Л. Ингибиторы протеолитических ферментов в терапии сахарного диабета / О.Л. Валуев // Вопросы медицинской химии. 2001. - Т. 47, - № 1.-С. 132- 139.

33. Валуева, Т.А. Белки-ингибиторы протеиназ из клубней картофеля, относящиеся к семейству соевого ингибитора Кунитца / Т.А. Валуева, Т.А. Ре-вина, В.В. Мосолов//Биохимия. 1997.-Т. 62, № 1.-С. 1600- 1607.

34. Васильев, В.А. Клиническая биохимия сельскохозяйственных животных/В.А. Васильев.-М.: Россельхозиздат, 1974. С. 4 - 83, 148- 151.

35. Величенко, В.М. Острый панкреатит в эксперименте и клинике / В. М. Величенко. — Минск: Беларусь, 1971. С. 19 - 29, 55 - 61.

36. Веремеенко, К.Н. О возможности определения трипсина, добавленного к сыворотке крови / К.Н. Веремеенко, А. И. Кизим // Лабораторное дело. -1966. № 10.-С. 612-615.

37. Веремеенко, К.Н. Определение протеолитической активности сыворотки / К.Н. Веремеенко, JI.M. Погорелова // Лабораторное дело. 1973. - № 5. -С. 287 - 289.

38. Веремеенко, К.Н. Протеолиз в норме и при патологии / К.Н. Веремеенко.-Киев, 1988.-С. 7-35.

39. Веремеенко, К.Н. Ферменты протеолиза и их ингибиторы в медицинской практике / К.Н. Веремеенко. Киев.: Здоров'я, 1971. - С. 36 - 69, 127.

40. Веремеенко, К.Н. Экспресс-метод определения ингибиторов трипсина в сыворотке крови человека / К.Н. Веремеенко, Л.И. Волохонская, С.И. Ханю-ченко, В.Н. Пилинчук, O.A. Романенко // Лабораторное дело. 1975. - № 7 -С. 531 -533.

41. Вернигора, А.Н. Протеолитические ферменты: субклеточная локализация, свойства и участие в обмене нейропептидов / А.Н. Вернигора, М.Т. Ген-гин // Биохимия. 1996. - Т. 61, № 5. - С. 771 - 782.

42. Вилкинсон, Д. Принципы и методы диагностической энзимологии / Д. Вилкинсон. М.: Мир, 1981. - С. 14 - 50.

43. Витфильд, Р. Реакции белков / Р. Витфильд, В. Велли // Химические реакции полимеров-М.: Мир, 1967.-Т. 1.-С. 330 333.

44. Владимиров, Г.А. Энзимология / Г.А. Владимиров, С.Н. Лызлова. Л., 1962.-С. 9- 18.

45. Войтенко, Г.Н. Панкреатопротективное действие растительных полифенолов и их композиций с пектином / Г.Н. Войтенко // Третья Украинскаяконференция по медицинской ботанике: Тез. докл. Киев, 1992. - Ч. 1. - С. 34-35.

46. Вольф, М. Лечение ферментами / М. Вольф, К. Рансбергер. М.: Мир, 1976.-С. - 130.

47. Гауровиц, Ф. Химия и функции белков / Ф. Гауровиц. М.: Мир, 1965. -С.6-33.

48. Гешелин, С.А. Протеолитические ферменты и их ингибиторы в клинической и экспериментальной онкологии / С.А. Гешелин // Вопросы онкологии.- 1984.-№ 10.-С. 9- 18.

49. Грачева, И. М. Технология ферментных препаратов / И. М. Грачева, А. Ю. Кривова М.: Элевар, 2000. - С. 391 - 398.

50. Губайдулин, X. Г Люцерна на корм и семена. / X. Г Губайдулин, Р. С. Еникеев. М.: Россельхозиздат, 1982. - С. 61 - 63.

51. Гугешашвили, Ш.И. Электрофорез белков сыворотки крови на бумаге в клинической лаборатории / Ш.И. Гугешашвили. Тбилиси, 1957.

52. Долгов, И.А. Протеиновые концентраты из зеленых растений / И.А. Долгов, Ю.Ф. Новиков, М.А. Яцко. М.: Колос, 1978. - С. 21 - 43.

53. Донченко, Л.В. Технология пектинов и пектинопродуктов / Л.В. Дон-ченко. М.: ДеЛи, 2000. - С. 21 - 34, 234 - 257.

54. Ефименко, A.M. Простой метод длительного препаративного электрофореза на бумаге / A.M. Ефименко // Лабораторное дело. 1958. - С. 21 - 25.

55. Журавлева, Т.Б. Количественная гистохимия гидролаз / Т.Б. Журавлева // Введение в количественную гистохимию ферментов М.: Медицина, 1978. -С. 115-120.

56. Заводник, И.Б. Влияние температуры на скорость ферментативных реакций / И.Б. Заводник. // Биофизика. 1994. - Т. 36, № 1. - С. 46 - 48.

57. Запорожан, В.Н. Протеолитический и ингибиторный потенциал сыворотки крови при гиперпластических процессах матки: Сборник статей / В.Н. Запорожан, О.В. Хайт, C.B. Руденко. Симферополь, 1987. - С. 60 - 61.

58. Зубовский, Г.А. Концентрация трипсина и С-пептида в сыворотке крови больных хроническим панкреатитом / Г.А. Зубовский, С.А. Васильченко // Клиническая медицина. 1982. - №9. - С. 56-59.

59. Иванов, В.И. Как работают ферменты / В.И. Иванов // Соросовский образовательный журнал. 1996. - №9. - С. 25 - 32.

60. Игнатьев, P.P. К методике электрофореза белков сыворотки крови на фильтровальной бумаге: Сборник трудов Бурятского СХИ / P.P. Игнатьев. -1964. -№17.

61. Иммунохимия в клинической лабораторной практике / Под ред. A.M. Уорда, Дж.Т. Уичера. М.: Наука, 1981. - С. 21 - 34.

62. Изучение некоторых физико-химических и энзиматических свойств полимерных производных трипсина на основе декстрана / Линденбаум Г.М., Богачева Т.И., Миргородская O.A. и др. // Прикладная биохимия и микробиология. 1977. - Т. 13, № 5. - С. 685 - 691.

63. Иммобилизованные ферменты / Под ред. И.В. Березина. М., 1976. -Т.2.-С. 11-16.

64. Казанская, Н.Ф. Выделение панкреатического ингибитора трипсина из пантрипина / Н.Ф. Казанская, Н. И. Ларионова // Вопросы медицинской химии. 1970. - Т.16, №4. - С. 368 - 371.

65. Киселева, Е.М. О влиянии полимерной модификации на специфические свойства ингибитора из соевых бобов / Е.М. Киселева, Т.Б. Тенникова, Б.В. Москвичева//Биохимия.-1981.-Т.46, №7.-С. 1188 1193.

66. Клесов, A.A. Ферментативный катализ / A.A. Клесов. М.: МГУ, 1980. -С. 111 - 164.

67. Клиническая лабораторная диагностика в ветеринарии: Справочное издание / И. П. Кондрахин, Н. В. Курилов, А. Г. Малахов и др. М.: Агропром-издат, 1985.-С. 57-75.

68. Колб, В.Г. Интерпретация некоторых энзимологических показателей при заболеваниях внутренних органов / В.Г. Колб, Е.Т. Зубовская // Здравоохранение Белоруссии. 1976. - №9. - С. 62-66.

69. Комаров, Ф.И. Биохимические исследования в клинике / Ф.И. Комаров, Б.Ф. Коровкин, В.В. Меньшиков М., Элиста: АПП Джангар, 2001. - С. 5-49.

70. Кондрахин И.П. Клиническая лабораторная диагностика в ветеринарии: Справочное издание / И.П. Кондрахин, Н.В. Курилов, А.Г. Малахов и др. -М.: Агропромиздат, 1985.

71. Костюк, Г.Я. Морфологические изменения протоков поджелудочной железы при экспериментальном панкреатите / Г.Я. Костюк // Клиническая хирургия. 1987. - №11. - С. 33 - 34.

72. Кочетов, Г.А. Практическое руководство по энзимологии / Г.А. Кочетов. -М.: Высшая школа, 1980.

73. Кретович, B.JI. Биохимия растений / B.JI. Кретович. М.: Высшая школа, 1971.-С. 17-48,255-256.

74. Кретович, B.JI. Введение в энзимологию / B.JI. Кретович. М.: Наука, 1974. С.

75. Крицман, М.Г. Влияние ингибиторов протеолиза на включение меченых аминокислот в изолированные белки / М.Г. Крицман, A.C. Коникова, Р.Н. Короткина//Биохимия.- 1975.-Т.40, №6.-С. 1131 1133.

76. Кудряшов, Б. А. Биологические проблемы жидкого состояния крови и ее свертывания / Б. А. Кудряшов. М.: Медицина, 1974. - С. 12-34.

77. Ларионова, Н.И. Ингибирование катепсина G и эластазы гранулоцитов человека множественными формами соевого ингибитора типа Баумана-Бирк / Н.И. Ларионова, И.П. Гладышева, Т.В. Тихонова, Н.Ф. Казанская // Биохимия. 1993. - Т.58, №9. с. 1437-1444.

78. Ларионова, Н.И. Методы определения равновесных и кинетических параметров взаимодействия белковых ингибиторов с протеиназами / Н.И. Ларионова, Н.Ф. Казанская, Р.И. Якубовская // Биохимия. 1979. - Т. 44, №1. -С. 3- 17.

79. Ларионова, Н.И. Конъюгирование классического соевого ингибитора типа Баумана-Бирк с сополимером окиси этилена и окиси пропилена / Н.И.

80. Ларионова, И.П. Гладышева, Н.И. Топчиева, Н.Ф. Казанская // Биохимия. -1993. -Т.58, №10. С. 1658-1663.

81. Леделер, М. Введение в электрофорез на бумаге и родственные методы / М. Леделер. М.: Мир, 1965 - С. 6 - 36.

82. Лобачев, C.B. Острые панкреотиты / C.B. Лобачев. М.: Медлит. -1953.-С. 123- 135.

83. Логинов, A.C. Новое в диагностике и лечение болезней желудка и двенадцатиперстной кишки / A.C. Логинов, Н.Ш. Амиров. М.: Медицина. -1985.-С. 5- 15.

84. Локтина, Л.А. Протеолитические ферменты в процессах онкогенеза / Л.А. Локтина // Вопросы медицинской химии. 1991. - №6. - С. 15-21.

85. Локтина, Л.А. Химические факторы регуляции активности и биосинтеза ферментов / Л.А. Локтина. М., 1969. - С. 99 - 123.

86. Локшина, Л.А. Выделение и свойства нейтральной SH-зависимой про-теиназы селезенки быка / Л.А. Локшина // Биохимия. 1979. - Т. 44. - № 2. -С. 264-271.

87. Локшина, Л.А. Регуляторная роль протеолитических ферментов / Л.А. Локшина // Молекулярная биология. 1979. - Т. 13, № 6. - С. 1205 - 1220.

88. Маждраков, Г.М. Болезни поджелудочной железы / Г.М. Маждраков. -София, 1961.-С. 220.

89. Малых, Е.В. Изучение антипротеазного действия ацилированных производных соевого ингибитора протеиназ типа Баумана-Бирк / Е.В. Малых, Н.И. Ларионова//Биохимия.-2002.-Т.67, №12.-С. 1676- 1681.

90. Мантьев, В.А. Аппарат для препаративного разделения веществ методом непрерывного электрофореза / В.А. Мантьев, В.Н. Орехович // Вопросы медицинской химии. 1959.-Т. 5, №5.-С. 381 -387.

91. Марокко, И.Н. Активность некоторых лизосомальных ферментов в печени и плазме крови при острой анафилаксии / И.Н. Марокко. М., 1971. - С. 321 -333.

92. Методы биохимического анализа растений / Под ред. В. В. Полевого и Г. Б. Максимова. Л.: Издательство ленинградского ун-та, 1978. - С. 34 - 82.

93. Методы биохимического исследования растений / Под ред. А. И. Ермакова. -Л.: Агропромиздат, 1987. С. 36 - 85.

94. Мишин, Ю.Б. Протеолитические ферменты раковых клеток и их участие в иммунологических взаимодействиях опухоли и организма / Ю.Б. Мишин.-М., 1982.-80 с.

95. Морозова, В.Т. Определение ферментов / В.Т. Морозова // Медицинская сестра. 1967. - № 4. - С. 37 - 39.

96. Москаленко, C.B. Влияние пектиновых веществ на биохимические процессы детоксикации при химической патологии печени / C.B. Москаленко. Автореф. дис. канд. фарм. наук. - Пятигорск, 1995. - 19 с.

97. Мосолов, В.В. О специфичности действия протеиназ / В.В. Мосолов // Успехи современной биологии. 1957. - №44. - С. 300 - 303.

98. Мосолов, В.В. О строении активного центра трипсина их химотрипси-на / В.В. Мосолов // Успехи современной биологии. 1960. - №50. - С. 277278.

99. Мосолов, В.В. Природные ингибиторы протеолитических ферментов / В.В. Мосолов // Успехи биологической химии. 1982. -Т 22. - С. 100 - 118.

100. Мосолов, В.В. Протеолитические ферменты / В.В. Мосолов. М.: Наука, 1971.-С. 145-267.

101. Мосолов, В.В. Растительные белки ингибиторы ферментов / В.В. Мосолов / Растительные белки и их биосинтез. - М.: Наука, 1975.

102. Мосолов, В.В. Растительные белковые ингибиторы протеолитических ферментов / В.В. Мосолов, Т.А. Валуева. М.: ВИНИТИ, 1993.

103. Мосолов, В.В. Выделение ингибитора трипсина из фасоли с помощью специфического связывания на трипсин агарозе /В.В. Мосолов, Н.В. Фе-дуркина // Биохимия. - 1973. - Т.39. - №3. - С. 624 - 628.

104. Мосолов, В.В. Выделение и свойства изоингибиторов трипсина из фасоли / В.В. Мосолов, Н.В. Федуркина, Т.А. Валуева // Биохимия. 1977. - № 42.-С. 1201 - 1210.

105. Нагорная, В.Ф. Роль энзимов в патогенезе опухолей гениталий / В.Ф. Нагорная // Акушерство и гинекология.-1984.-№4.-С.11-15.

106. Нежута, А. А. Теоретические и практические основы технологии сублимационного высушивания биопрепаратов / А. А. Нежута, Э. Ф. Токарик, А. Я. Самуйленко, В. М. Безгин, Е. С. Сербис. Курск: КГСХА, 2002. - С. 76156.

107. Нейландс, Дж. Очерки по химии ферментов / Дж. Нейландс, П. Штумпф.-М.: ИЛ.-1958.-С.35.

108. Никифоров, А.П. Активность сыворотки крови у мужчин и женщин при некоторых патологических состояниях / А.П. Никифоров // Клиническая лабораторная диагностика.-1995.-№ 1 .-С. 14-15.

109. Нортроп, Д. Кристаллические ферменты / Д. Нортроп, М. Кунитц, Р. Херриотт.- М.: ИЛ.-1950.

110. Орехович, В.Н. Химическое строение протеолитических ферментов и специфичность их действия / В.Н. Орехович // Актуальные вопросы современной биохимии. 1962. - Т. 2. - С. 28 - 37.

111. Орехович, В.Н. Некоторые вопросы изучения четвертичной структуры белков / В.Н. Орехович, В.О. Шпикитер // Украинский биохимический журнал.-1965 .-№37.-С.769.

112. Остапчук, Н.В. Участие лизосомальных ферментов в лекарственном ульцерогенезе / Н.В. Остапчук // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1991. - Т. 111. - №4. - С.384 - 386.

113. Петровский, Б.В. Избранные лекции по клинической хирургии / Б.В. Петровский. М., 1968. - С. 356 - 364.

114. Плешков, Б.П. Биохимия сельскохозяйственных растений / Б.П. Плеш-ков. -М: Колос. 1965. С. 7-21.

115. Повстяной, Н.Е. Протеолитическая активность у обожженных больных как показатель течения раневого процесса и развития рубца / Н.Е. Повстяной, Г.П. Козинец, В.М. Лосицкая и др. // Сборник статей. Симферополь. - 1987. - С. 69.

116. Подильчак, М.Д. Клиническая энзимология / М.Д. Подильчак. Киев: Здоровье. - 1967. - С. 35 - 45.

117. Поединок, В. Е. Производство растительных белковых кормов / В. Е. Поединок. М.: Колос, 1994. - С. 6 - 85.

118. Покровский, A.A. Некоторые проблемы медицинской энзимологии / A.A. Покровский. М.: Медицина, 1971. - С. 15-25.

119. Поляк, М.С. Регуляторы активности ферментов и их применение в медицине / М.С. Поляк, Т.И. Рожанская, Е.П. Яковлева. М. - 1989. - С. 128.

120. Прокопенко, Л.Г. Ферментная иммуномодуляция / Л.Г. Прокопенко, И.Г. Чалый, И.Г. Хмелевская, И.Л. Ласкова, А.И. Конопля, H.A. Конопля. -Курск: КГМУ. 1998. - С. 6 - 63.

121. Протасова, Т.Н. Гормональная регуляция активности ферментов / Т.Н. Протасова. М.: Медицина. - 1975. - С. 11 - 41.

122. Прочуханов, P.A. Введение в количественную гистохимию ферментов / P.A. Прочуханов, Г.В. Щанова. М.: Медицина, 1978. - С. 115 - 120.

123. Пыльнева, П.Н. Изучение активности ингибитора трипсина в зерне обычной и высоколизиновой кукурузы / П.Н. Пыльнева, А.П. Левицкий // Физиология и биохимия культурных растений. 1982. - вып. 14. - № 4.

124. Ревина, Т.А. Характеристика реактивных центров нового ингибитора трипсина и химотрипсина из клубней картофеля / Т.А. Ревина, Т.А. Валуева, Н.В. Ермолова, В.В. Мосолов // Биохимия. 1996. - Т. 61. - № 1. - С. 126 -129.

125. Рейдерман М.И. Полуколичественный метод определения общей анти-триписической активности крови / М.И. Рейдерман // Лаб. дело. 1971. - № 1 -С. 36-37.

126. Рыбакова, Л.П. Активность некоторых лизосомальных ферментов в белых клетках крови при лейкозах / Л.П. Рыбакова, М.Ф. Харченко // Вопросы онкологии. 1996. - Т.42. - №1. - С. 62 - 65.

127. Саянова, В.В. Ингибиторы протеолитических ферментов в семенах сои / В.В. Саянова, Л.С. Павлова, А.И. Бронштейн / Биохимическая генетика и селекция бобовых и злаковых культур. Кишинев: Штиинца.-1982.

128. Современные методы в биохимии / Под ред. В.Н. Ореховича. М.: Медицина, 1964. - С. 37 - 123.

129. Соловьева, Н.И. Протеолитические ферменты и их биологические функции / Н.И. Соловьева, Л.А. Локшина, Ю.А. Елисеева // Вестник Российской АМН. 1995. - №2. - С. 3 - 9.

130. Стоцик, Н.Л. Острый панкреатит в клинике внутренних болезней / Н.Л. Стоцик. М.: Здоровье, 1960. - С. 21 - 43.

131. Сухинин, В.Н. Очистка и некоторые свойства ингибитора трипсина из вегетативных органов люцерны / В.Н. Сухинин, В.А. Березин, Ю.Ф. Новиков, А.Д. Рева, A.B. Лагутенко, Н.И. Пройдак // Биохимия. 1981. - Т. 46. - № 7. -С. 1183 - 1186.

132. Сыновец, A.C. Ингибиторы протеолитических ферментов в медицине / A.C. Сыновец, А.П. Левицкий. Киев, 1985. - С. 5 - 25.

133. Тараненко, Л.Д. Динамика активности лизосомальных ферментов у больных механической желтухой в пред- и послеоперационном периоде / Л.Д. Тараненко, В.И. Бондарев, Н.В. Свиридов // Сборник статей. Симферополь. - 1987. - С. 170.

134. Таранов, М.Т. Биохимия кормов / М.Т. Таранов, А. X. Сабиров. М.: Агропромиздат, 1987. - С. 94 - 99, 108 - 125.

135. Техника биохимического исследования субклеточных структур и биополимеров / Под ред. А. С. Вечера // Минск: Наука и техника, 1977. С. 74 -75.

136. Технология производства люцерны / Под ред. Виноградовой Е. В. М.: Агропромиздат, 1985.-С. 104 - 155.

137. Токарская, З.Б. Нормальные уровни активности сывороточных ферментов, наиболее часто используемых в клинике / З.Б. Токарская, Г.В. Чернова // Лабораторное дело. 1973. - №5. - С. 283 - 286.

138. Толстогузов, В.Б. Искусственные продукты питания / В.Б. Толсогузов. М.: Наука. - 1978. - С. 137 - 138.

139. Тривен, М. Иммобилизованные ферменты / М. Тривен.- М.: Мир. -1983.-С. 6-15.

140. Троицкий, Г.В. Электрофорез белков / Г.В. Троицкий. Харьков: ХГУ, 1962.-С. 42-86.

141. Урбах В.Ю. Математическая статистика для биологов и медиков / В.Ю. Урбах. М.: Медицина, 1963. - С. 22 - 50.

142. Усольцева, В.А. Ферменты и их клиническое значение / В.А. Усольце-ва. Иваново, 1969. - С. 35 - 45.

143. Уэбб, Jl. Ингибиторы ферментов и метаболизма / JÏ. Уэбб. М.: Мир, 1966.-С. 101 - 118.

144. Филиппович Ю. Б. Основы биохимии / Ю. Б. Филиппович. М.: Высшая школа, 1984. - С.125 - 138.

145. Фомина, JÏ. С. Чувствительный метод определения трипсина в дуоденальном и панкреатическом соке / J1. С. Фомина, H. Н. Басаргин, В. П. Конд-рашева. // Лабораторное дело. 1970. - № 6. - С. 350 - 354.

146. Циркина, A.C. Клинико-диагностическое значение определения активности некоторых ферментов / A.C. Циркина // Лабораторное дело. 1982. -№6.-С. 373 -376.

147. Чазов, Е.И. Современные проблемы тромбозов и эмболий / Е.И. Чазов. -М., 1978.-С. 39-42.

148. Черников, М.П. Действие аминокислот на протеолитическую активность трипсина и химотрипсина / М.П. Черников // Биохимия. 1963. - Т.28, №2. - С. 285 - 287.

149. Черников, М.П. Протеолиз и биологическая ценность белков / М.П. Черников. М.: Медицина, 1975. - С. 24 - 68.

150. Чечеткин, В. А. Практикум по биохимии сельскохозяйственных животных / В. А. Чечеткин, В. И. Воронянский, Г. Г. Покусай, Н. И. Карташев, Н. Л. Докторович, И. В. Кириченко. — М.: Высшая школа, 1980.

151. Шакалов, К.И. Патогенетическая терапия заболеваний животных / К.И. Шакалов. Л. -М.: Сельхозгиз, 1961. С. 288-378.

152. Шалимов, A.A. Атлас операций на печени, желчном пузыре, поджелудочной железе и кишечнике / A.A. Шалимов, А.П. Радзинховский, Т.Н. По-лупан. М.: Медицина, 1979.

153. Шалимов, A.A. Экспериментальная хирургия / A.A. Шалимов. М.: Медицина, 1979.-С. 190-200.

154. Шеклин, Э. Клиническая ферментология / Э. Шеклин. Варшава: Польское государственное медицинское издательство, 1966. - С. 400 - 432.

155. Шелагуров, A.A. Панкреотиты / A.A. Шелагуров. М.: Медицина, 1967.-С. 12-34.

156. Якимчук, Е.Ф. К методике электрофоретического фракционирования белков / Е.Ф. Якимчук Киев, 1968. - С. 108 - 124.

157. Яковлев, В.А. Кинетика ферментативного катализа / В.А. Яковлев. -М.: Наука, 1965.-С. 5 14.

158. Abrams, W.R. Bacterial pneumonia / W.R. Abrams, A.M. Fein, U. Kucich, F. Kueppers, M. Yamada, T. Kuzmowyez, L. Morgan, M. Lippmann, S.K. Cold-berg, G. Weinbaum // Amer. Rev. Respir. Dis., 1984. Vol. 129. - P. 735-741.

159. Ainan, P. Chemical modification of straw by alkaline treatment P. Ainan, O. Theander - Quality of Forage, 1980. - Vol. 54. - P. 151 - 166.

160. Alexander, A. Laboratory Manual of Analysitics Methods of Protein Chemistry / P. Alexander, P. J. Block. Oxford: Pergamon Press, 1991. - Vol. 2. - P. 151, 167.

161. Bailey, J.L. Techniques in Protein Chemistry / J.L. Bailey. Amsterdam, London, New York: Elsevier Publishing Compan, 1967. - P. 12 - 24.

162. Bernhard, S.A. The structure and function of enzymes / S.A. Bernhard. -New York, Amsterdam, 1968. P. 26 - 79, 143 - 186.

163. Bignon, J. Role of ferments at emphysema light / J. Bignon, H. de Cremoux // Bull. Europ. Physiopathol. Respir., 1980. Vol. 16. - P. 13 - 25.

164. Chang, H.Y. Alfalfa trypsin inhibitor / H.Y. Chang, A.R. Reeck, H.L. Mitchell // J. Agr. and Food Chem., 1978. Vol. 28. - № 6. - P. 1463 - 1464.

165. Chien, T.F. Purification of a trypsin inhibitors of alfalfa / T.F. Chien, H.L. Mitchell // Phytochem., 1970. Vol. 9. - P. 717 - 720.

166. Heinemann, T. Chromatographic and Electrophoretic Techniques / T. Heinemann. London, 1969. - P. 123 - 234.

167. Coleman, W. H. Inhibitors of animal cell-free protein synthesis from grains / W. H. Coleman, W. K. Roberts // Biochim. et Biophys. Acta., 1982. № 3. - P. 239-244.

168. Darbre, A. Practical Protein Chemistry / A. Darbre. John Wiley & Sons Ltd, 1987.

169. Davidson, J. Note on the lysinoalanine content of alkali-treated barley / J. Davidson // Anim. Feed Sc. Technol, 1982. Vol. 7. - P. 217 - 220.

170. Dawson, R. M. C. Data for Biochemical Research / R. M. C. Dawson, D. C. Elliott, W. H. Elliott, K. M. Jones. Oxford: Clarendon Press, 1986.

171. Devenyi, T. Amino Acids, Peptides and Proteins / T. Devenyi, J. Gergely. -Budapest: Academiai Kiado, 1974.-P. 7- 116, 187-231.

172. Devenyi, T. Enzymatic Degradation of Peptides Containing Alfa-aminooxy-carboxylic Acids / Devenyi T. // Acta Biochim. Biophys. Acad. Sei. Hung, 1971. -Vol. 6. 393 p.

173. Devenyi, T. Thin layer ion exchange chromatographic reining test for ami-noacids in blood-samples dried on filter paper / T. Devenyi, I. Bati, P. Kiss // Acta Biochim. Biophys. Acad. Sei. Hung, 1972. Vol. 7. - P. 234 - 246.

174. Dickerson, R.E. The Structure and Action of Proteins // R.E. Dickerson, I. Geis. New York, London: Row Publ, 1969. - P. 15 - 20.

175. Dittmer, A. Papierelektrophorese / A. Dittmer. Jena, 1956. - P. 12 - 21.

176. Dixon, M. Enzymes / M. Dixon,E. C. Webb. Longman Group Ltd, 1979.

177. Edman, P. Protein Sequence Determination / P. Edman, S. P. Needleman // Springer Verlag. Berlin-Heidelberg, New York, 1970. - P. 211 - 256.

178. Geckeier, K.E. Analytische und Praparative Labormethoden / K.E. Geckeier, H. Eckstein. Braunschweig: Friedr. Vieweg & Sohn, 1987. - P. 5 - 25, 33 - 55.

179. Goldstein, G. Immobilized Enzyme Principles / G. Goldstein, G. Manecke. New York: Academic Press, 1976. P. 12-23.

180. Graham, J.S., Accumulation of a metallocarboxypeptidase inhibitor in leaves of wounded potato plants / J.S. Graham, C.A. Ryan. // Biochem. and Biophys. Res. Commun, 1981.-Vol. 101.-№4.-P. 1164- 1170.

181. Hans, G.N. Praktikum der Hundeklinik / G.N. Hans, F.S. Peter. Verlang, Berlin: Blackwell Wissenschafts, 1994. - P. 575 - 577.

182. Hass, G.M. Primary structures of two low molecular weight proteinase inhibitors from potatoes / G.M. Hass, M.A. Hermodson, C.A. Ryan // Biochemistry, 1982. Vol. 21. - № 4. - P. 752 - 756.

183. Hegsted, M. Protein quality of high and low saponin alfalfa protein concentrate / M. Hegsted, H. Linkswiler // J. Sc. Food Agr., 1980. Vol. 31. - P. 777-781.

184. Henderson, P.J.F. Alinear equation that describes the steady-state kinetics of enzymes and subcellular particles interacting with tightly bound inhibitors / P.J.F. Henderson//Biochem., 1972. Vol. 127. - P. 321 - 333.

185. Holzer, H. Mechanism of Action and Regulation of Enzymes / H. Holzer. -Budapest: Akademikai Kiado, 1975. Vol. 32. - P. 181 - 193.

186. Immobilised Cells and Enzymes / J. Woodward. Florida: Press, Boca Raton, 1985.-P. 12-29.

187. Kabat, E.A. Experimental Immunochemistry / E.A. Kabat, M.M. Mayer. -Springfield: Thomas Publ., 1971. P. 22 - 24.

188. Keilowa, H. Naturally occurring inhibitors of intracellular proteinase / H. Keilowa, V. Tomaser// Acta boil. med. germ., 1977. Vol. 36. - P. 1873 - 1881.

189. Kunitz, M. Crystalline soybean trypsin inhibitor / M. Kunitz. // J. Gen. Physiol., 1947. Vol. 30. - № 4. - P. 291 - 310.

190. Kunket, H. Methods of Biochemical Analysis / H. Kunket. New York, 1954.-P. 56-78.

191. Laidler, K.J. The Chemical Kinetics of Enzyme Action / K.J. Laidler. Oxford University Press, 1958. - P. 21 - 43.

192. Laskowski, M. Jr. Proteinase inhibitors / M. Laskowski // Bayer-Symposium V «Proteinase inhibitors». Springer - Verlag, Berlin - Heidelberg - N. Y., 1974. -P. 344-354.

193. Laskowski, M. Jr. The Enzymes / M. Jr. Laskowski, R. W. Sealock. N. Y. -London: Acad. Press, 1971. - Vol. 3. - P. 375.

194. Lowry, O. Protein measurement the Folin phenol reagent. / O. Lowry, N. Rosebrough, A. Farr, R. Randall // J. Biol. Chem., 1951. V. 193. - P. 265 - 275.

195. Neurath, H. In: Proteinases and biological control / H. Neurath. N. Y.: Cold Spring Harbor, 1975. - Vol. 2. - P. 51.

196. Ohlsson, K. Influence of ferments on development of peritonitises / K. Ohls-son, I. Olsson // Scand. J. Haematol., 1977. Vol. 19. - P. 145 - 152.

197. Pirie, N. W. Leaf Proteins / N.W. Pirie //Annual Rev. Plant Physiol., 1959. -Vol. 10.-P. 33.

198. Pirie, N.W. Leaf protein: its agronomy, preparation, quality and use. N.W. Pirie // N. Y.: Pergamon Press, 1971. - Vol. 5. - P. 3 - 7.

199. Ramirez, J.S. The trypsin inhibitor of alfalfa / J.S. Ramirez, H.L. Mitchell // Agr. Food Chem., I960. Vol. 8. - № 5. - P. 393 - 395.

200. Richardson, M. The proteunase inhibitors of plants and microorganisms / M. Richardson // Phytochem., 1977. Vol. 16. - P. 159 - 169.

201. Richter, W. Grundwerte der Tiergesundheit und Tierhaltung / W. Richter, E. Werner, H. Bahr. VEB Gustav Fischer Verlag Jena, 1979. - P. 79 - 86.

202. Schnebli, N.P. Mechanisms of development of arthritis. / N.P. Schnebli, P. Christen, M. Jochum, R.K. Mallya, M.B. Pepys // Adv. Exp. Med. Biol., 1984. -Vol. 167.-P. 355-362.

203. Steiner D.F. Proteinases and biological control / D.F. Steiner, W. Kemmler, H.S. Tager. N. Y.: Cold Spring Harbor, 1975. - Vol. 2. - P. 531.

204. Schreiber, H. D. Inhibitors and immunity / H. D. Schreiber, A. P. Kaplan, K. F. Austen. J. Clin. Invest., 1973. - P. 1402 - 1409.

205. Tietz, N. W. Clinical Guide to Laboratory Tests / N. W. Tietz. W. B. Saunders Company, 1983.

206. Wallner, O. Processes of fertization. Hoppe-Seylor's / O. Wallner, H. Fritz. Z. physiol. Chem., 1974. P. 709 - 715.

207. Williams, B. L. Principles and Techniques of Practical Biochemistry / B. L. Williams, K. Wilson. London: Edward Arnold, 1975. - P. 17 -41, 65 - 165.

208. Woodward, J. Immobilised Cells and Enzymes. Methods / J. Woodward. -IRL Press Limited, 1985. P. 12 - 30, 53 - 65.

209. Wunderly Ch. Die Papierelektrophorese, Frankfurt-an-Maine., 1954.

210. Zaborsky O R In: Immobilised Enzymes, CRC Press, Boca Eaton. Florida, 1973.

211. Zweig G., Whitaker J. R., Paper Chromatography and Electrophoresis, Vol. Academic Press, New York, London, 1967.