Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональная организация повторяющейся единицы генов 18S и 28S рибосомных РНК крысы

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональная организация повторяющейся единицы генов 18S и 28S рибосомных РНК крысы"

pro ОД

\ и UiiV.t

BI1HV ГЕНЕТИКИ II СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи УЖ 577.214.622

НОСИКОВ Валерий Вячеславович

СТРУКТУРНО - ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ПОВТОРЯЮЩЕЙСЯ ЕДИНИЦЫ ГЕНОВ 183 И 283 РИБОСОИНЫХ 1'НК КРЫСЫ

Специальность - 03.00.03 Молекулярная биология

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук d 1рориэ научного доклада

Москва - 19Í3

Основная часть работы выполнена в лаборатории белкового синтеза Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН (зав. лабораторией ч эн-корр. РАН Л.Л.Киселев) совместно с лабораторией молекулярной генетики Института молекулярной биологии ЛН Болгарии эав. лабораториеп академик А.А.Х&^жиолов>. Работа завершена в отделе биотехнологии ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов (зав. отделом член-корр. РАН В.Г.Дебабов).

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Член-корреспондент РАН.

доктор химических наук, профессор А.А,Богданов

доктор биологических наук, профессор А.П.Рисков

доктор биологических наук, профессор П.И.Рубцов

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ - Институт бнооргвнической хишш РАН имени

академиков М.М.Пеиякмна и Ю.А.Овчинникова

Защита состоится " ■ " 1993 г, в часов на заседании

Специализированного совета Д 025.01.01 при ВНИИ генетики и селекции промышленных микриорганизмов по адресу: 113545, г.Москва, 1-ый Дорожный проезд, д.1.

С диссертацией в форме научного доклада можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов -

Диссертация в форме научного доклада разослана

»й-И^в.ил" 1993 г.

УЧЕНЫЯ^ СЕКРЕТАРЬ СПЕЦИАЛИЗИРОВАННОГО СОВЕТА

кандидат биологических наук В.И.Щербакова

ОЫДАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Практически яг> всех клетках организма, за исключением некоторых клеток терминальной дифференцировки, име-зт место экспрессия генов 18S и 28S рРНК, продукты которых - IBS, ÎRS и 5,8S рРНК. - необходимы для фориироиания рибосом и поддержа-гля метаболических процессов. Гены больших рибосомных РНК от-•юсят^я к повторяишыся генам и присутств, jt в геноме млекопмтаю-Ш1Х в количестве 200 - 400 копия на гаплоидная геном. Они разбиты m несколько кластеров, расположенных на разных хромосомах и обра-ьуьимх ядрышковые организаторы. Внутри кластеров гены 183 и 26S зРНК гандемно повторяются, причем транскрибируемые области рПНК разделены нетранскрибируемыыи спеясераии (NTS). Обиая длина повто-шюаяхся единиц рДНК резко возрастает при переходе к высшим позво-ючным, особенно к млекопитавшим, причем, главным образом, за счет шины NTS. Значительное увеличение длинч и возможность поягчеиня ювых структурных и Функциональных элементов в повторяющейся еди-!ице рЛНК делает крайне важным изучение организации как собственно труктурных генов рибосомных РНК млекопитающих, так и их транскрибируемых и нетранскрибируемых спейсеров.

Бурное развитие методов молекулярного клонирования и возмож-:ость определения иуклеотидных последовательностей протяхвнных |рагментов ДНК сделало актуальным и практически возможным деталь-ое изучение структурно-функциональной организации типичного пред-тавителя повторяющихся генов млекопитающих - повторяющейся едини-ы генов 1SS и 2S3 рибосомных РНК крысы. . К началу этой работы рактически отсутствовала информация об организации рибосомных ге-ов млекопитающих, а данные об аналогичных генах других позвоноч-ых носили отрывочный характер. Высокий уровень экспрессии рДНК и интеэ больших количеств рибосомных РНК также делает актуальный: зучение механизмов транскрипции рибосомных генов и выявление тех собенностей организации рДНК, которые обеспечивавт высокую эффективность этого процесса.

Общее направление путей проивссинга <соэренания> предшаствен-[ÎKOB рибосомных РКК было достаточно подробно изучено на уровне роиегуточних продуктов распада молекул пре-рГНК крысы. Однако эти здходы не позволяли установить точную локализл '.ri и структуру

участков раннего созревания лре-рРНК. Решение этой задачи также стало возможно только после клонирования и определения нуклеотид-ных последов«: ельностея внутреннего транскрибируемого спенсера повторяющейся единицы рДНК. Таким образом, в настоящей работе . ,/едпринята попытка решить несколько принципиальных вопросов относительно структурно-функциональной организации и функционирования повторяющейся единица больших рибосомных РНК, эффективный синтез которых является непременным условием нормальной яэтзиедеятельности любоя клетки организма.

Цель и задачи исследования. Цель настоят?1 работы состояла в изучении структурно-функциональной организации повторяющейся единицы генов ICS и 26S рибосомных РНК крысы, являющихся типичными представителями повторявшихся генов млекопитающих. В работе ставились следующие задачи:

1 - определение обших принципов организации повторявшейся единицы

генов 18S и 28S рибосомных РНК.

2 - клонирование фрагментов рДНК, рестриктазное и гибридизационное

картирование клонированных фрагментов рДНК, локализация повторяющихся элементов генома.

3 - определение нуклеотидной последовательности внутреннего транс-

крибируемого спеясера и локализация участков эндонуклеэзного процессиига пре-рРНК

4 - определение нуклеотидной последовательности 285 рРНК по соот-

ветствующим фрагментам рДНК и изучение структурной организации 2öS рРНК.

5 - определение протяженных нуклеотидных последовательностей об-

ластей HTS, прилежащих к транскрибируемой области рДНК, н их изучение.

> 6 - идентификация функционально важных элемсн-ib повторявшейся единицы генов 18S и 2ÖS рРНК.

Научная новизна полученных результатов заключается в следующем:

1. Впервые получена обшая структурно-функциональная характеристика повторяйшейся единицы гено* 1й5 и 26S рРНК крысы: определены размеры повторяющейся единицы и ее транскрибируемой части, положение генов 10S и 283, участков инициации и терминации транскрипции, участха инициации репликации.

2. Определена нуклеотидчая последовательность и структурная ор-

'анизация внутреннего транскрибируемого спейсера. Впервые идентифицированы и локализованы участки раннего зндонуклеазного расшеп-1вния пре-рРНК внутри ITS.

3. Впервые определена полная нуклеотидная последовательность >8S рРНК крысы и проведено изучение ее структурной организации. :равнение последовательностей L-pPHK крыс^. и дрожжей позволило выявить высоко консервативные и вариабельные области данного гена.

4. Впервые определены протяженные нуклр-^тидные пбследователь-юсти нетранскрибируемого спейсера рДНК, оС аружены и идентифици->ованы в NTS рДНК крысы три пары подвижных элементов генома типа 52 ; ID, а также разные типы простых последовательностей.

5. Детально обсуждены возможности участия ппостых последовательностей в формировании, нуклеосом и функционально активной i-формы ДНК в определенных сегментах NTS рДНК крысы.

Практическая ценность результатов работы заключается в получении фундаментальных- данных о структурно-функциональной организации повторявшейся единицы генов 18S и ..dS рибосомных РНК крысы, ■соторые могут быть апроксимированы ко всем млекопитающим, в той •июле и к человеку. Определение протяженных нуклеотидных последовательностей позволило обнаружить новые принципы организации нетранскрибируемого спейсера рДНК: дупликация терминаторов и промоторов, сочетание подвижных элементов генома с простыми последо. г-гельностяии, которые в значительной мере являются общими для всех млекопитающих.

Полученные в ходе исследования рекомбинантные плазмиды, со-церяащие высоко консервативные последовательности структурных ге-лов, были использованы для отбо \ рибосомных генов человека и ряда аругих животных. Эти же плаэмиды нашли широкое применение при кар-.лровании локусов рибосомных генов на хромосомах человека и животных и при изучении топографии ядрышковых организаторов в различных типах клеток, а также при исследованиях пролиферации клеток млекопитающих. Во многих отечественных (ИМБ РАН, ИМГ РАН, ИБХ РАН, ЦБР РАН, ИМД РАМН) и зарубежных институ зх нашли широкое применение плаэмиды, содержащие клонированные последовательности повторяющейся единицы рибосомных генов, в том числе и при исследованиях по проекту 'Tei >и человека".

Основные результаты, изложенные в диссертации, получены в соавторстве с Э.А.Брага, Т.А.Авдониной, В.Б.Журкшши и Л.Э.Богомоло -

вой нз Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН, а тякже с Л.А.Хаджиоловым, К.П.Дуловым, О.И.Георгиевыы, Л.П.Яваше-вым, М.Б.Кер; экчиевым и К.В.Хадзкиоловой из лаборатории молекуляр-ксй генетики Института молекулярной биологии Болгарской АН (г.Со-

Болгария). Отдельные разделы диссертации выполнены солыестно с С.М.Миркиньш из Института молекулярной генетики РАН', Б.Б.Аначко-воп и Г.Х.Русевым из Института молекулярной биологии Болгарской АН. Всем коллегам автор приносит благодарность за участие в проведении представленного к защите исследования. Автор выражает признательность член-корреспондента« РАН Л.Л.Кист чеву и В.Г.Дебабову за постоянный интерес, поддержу и обсуждение работы.

Апробация работ. Диссертационная работа была апробирована на семинаре отдела биотехнологии ВНИИ генетики и селекции "промышленных микроорганизмов в 1S93 г. Представленные в диссертации результаты были доложены и обсуждены на различных Всесоозных и Маздуна-родных симпозиумах и конференциях, в том числе: на Всесоюзной конференции "Генетическая инженерия" (Пушино-на-Оке, 1980 г.); ка двусторонних Советско-итальянских симпозиумах "Макромолекулы в Функционирующей клетке" (Пущино-на-Оке, 19С0 у. Киев, 1934); на IV--OM двустороннем симпозиуме СССР-ФРГ "Структура я транскрипция генома" (Баку, 1981); на Всесоюзной конференции "Рекомбинантные ДНК" (Пудано-на-Оке, 1982); на V-ом Всесоюзном сиипозиууе "Молекулярные механизма генетических процессов" (Москва, 1963); на VII1-ом Всесоюзном симпозиуме "Структура и Функции клеточного ядра" (Пущшо-на-Оке, 1984); на XYI-on Конференции Европейских биохимических обществ (Москва, 1984); на Всесоюзной конференции "Макромолекулы клетки" (Москва, 1984); на VI-ом двустороннем Симпозиуме СССР-ФРГ "Структура и ф"нкции генома" (Ленинград, 1985); на ИИ-ом двустороннем Симпозиуме СССР-Франции "С-чуктура и Функция белков и нуклеиновых кислот" (Москва, 1966); па 16-ом Симпозиуме Европейской рабочей группы по пролиферации клеток (Милан, Италия, 1939), а такте неоднократно на конкурсах научных работ ИЫБ РАН.

Использованные сокращения. рРНК - рибосонная РНК; L-pPHK -молекула рРНК большой субъедимицы рибосомы; пре-рРНК - предшественники зрелых рРНК; рДНК - ДНК повторяющейся единицы генов 13S и I 3 рибосомшх РНК; ARr и pRr - Фаги к плазмиды, содержащие фрагменты рДНК крысы; ETS - внешней транскрибируемый спгйсер; ITS, ITS-1 и ITS-2 - внутренний транскрибируемые спенсер и его левая и

правая ч~;ти, разделенные геном 5.SS рРНК, соответственно; NTS -нетранскрибируемия спеясер; GC5 - сегменты 26S рРНК с- увеличенным содержанием G+C (более 75*!; ПААГ - полиакриламидный гель; V - область NTS слева от участка инициации транскрипции; D - область HTS справа от З'-конца гена 26S рРНК; п.н. и т.п.н. - пары и тысячи пар нуклеотидов, соответственно; ?0 и Р - основной и спейсерный промоторы; Т1 - Тв, Т , T_j - терминаторы транскрипции; Ри - пурины; Ру - пиримидины; orí - участок инициаци : репликации.

i.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ

ПОВТОРЯВШЕЙСЯ ЕДИНИЦЫ ГЕНОВ 163 И 203 РКБОСОМНЫХ РНК КРЫСЫ.

На начальном этапе развития настоящего исследования анализ структурной организации повторяющейся единицы рибосомных генов был проведен по методу Саузерна с использованием гибридизации рестрик-газных Фрагментов, связанных на фильтрах, с мечеными l^P) "ДНК, синтезированными на матрицах 185 и 28S рРНК с использованием "рас-:еяной" затравки. Между различными фрагментами рДНК; выявленными то гибридизации были обнаружены существенные различия в интенсивности связывания метки (рис.1), что могло быть следствием гетерогенности повторяющихся единиц по участкам узнавания рестриктаз. Размеры всех фрагментов приведены в таблице 1 и легко видеть, чго пля 6 рестриктаз иэ 9 характерно наличие полиморфизма. В связи с различиями в интенсивности гибридизации для построения рестриктаз-1ой карты сначала использовали только основные (ярко выраженные I фрагменты. Исходя из размеров фрагментов, образующихся при двойных засщэплениях рестриктазами, был. построена рестриктазная карта для хевяти рестриктаз, вначале для областей, в которых отсутствует по-шморфизм по положению участков узнавания. Затем карта была расии-эена и были локализованы участки частичного расщепления рестриктазами. Наиболее сложно было локализовать участки узнавания рестрик-газы EcoRI, при расщеплении которой образовывались четыре фрагчен--а с размерами от 2,0 до 11,9 т.п.н., ..»держащие фрагмент гена 16S )РНК и HlnctlII.

Анализ полученных результатов ■ позволил не только построить юстриктазн^ карту повторяющейся единицы генов рРНК (рис.2), но и ценить уровень полиморфизма, характерный для тандгчнык повторов шбосомных генов крысы. Полиморфизм по участкац узнавания рестрик-

. till! S il П ПП

50—в -

1.5— О

'i

■ч

t»

dii

ïïiH'Hï-

_ „__Л ~ - В -5 H S •„

Il и I ! I 1 II1if

-y...- ■ --4Î1

30.012

й

¡1

u :■■■

:

b'

РксЛ. Гибридизация по методу Сауэерна Фрагментов ДНК, образующихся при расщеплении геномной ДНК крысы рестриктазаыи, с меченой 132Р) кДНК, синтезированной на матрице 183 и 283 рРНК с использованием рассеяно« затравки.

таз обнаружен нами только для 6 рестрлктаэ, что, по всей видимости, связано с ограничениями использованного нами метода гибридизации. Например, в случае юстриктазы S&1GI последовательности обоих генов (18S и 28S рРНК) полностью входят в состав единственного SalGI-фрагыента, что не позволяет идентифицировать участки SalGI, расположенные вне этого фрагмента в спеисерных последовательностях. Таким образом, проведенный нами анализ позволяет заключить, что зоны выраженного полиморф: зма расположены только в областях NTS и ETS, б то время как кодирующие последователы сти и область IT3, по всей видимости, идентичны во всех повторяющихся единицах ганов 1SS и 28S рРНК крысы.

. Для локализации последовательностей, кодирующих 1ÛS и 23S рРНК. использовали гибридизацию рестриктаэных фрагментов с мечеными кД1!К, синтезированными раздельно на матрицах 18S ■ и 2ÔS рРНК (таблица 1). Ориентация последовательностей, кодирующих 1 OS и 283 рРНК, относительно рестриктазной карты была легко установлена пг?

Таблица 1.

Размеры рестриктазкых фрагментов геномной ДНК. крысы, содержащих последовательности гомологичные 133 и 283 рРНК (в т.п!н.>.

m га I м »5 tu :в ш a» m да ж us its its ж iw м»

но* ».о' uî' !Ï5' !12* Ш iii* — — ' UL! I?

1.И' (M 773 13-0 î-b

HJ e.10 in

117 16 100

Jï* Si 17, J • 101» £1* 1*' 10* 19 il' Ш*

a - данные фрагменты использовали для определения размеров повторявшейся единицы рДНК. В качестве стандартов молекулярной иассы использовали HindIII-фрагыенты ДНК фага Л.

Ь - подчеркнуты размеры главных (наиболее ясно видимых на автора-циограмме) фрагментов.

фрагментам Bam-C, Bant-D, Xba-B, Kpn-А и Bgl-B, Содержащим последо-зательности, кодирующие 28S рРНК. Положение 5'-конца гена 18S рРНК Зыло установлено на основании наблюдения, что Фрагмент Баю-А содержит только часть последовательности, кодирующей 18S рРНК, в то )ремя как -единственный фрагмент SalGI-A содержит эту последовательность целиком. И, наконец, „'-конец гена 26S рРНК был локализован на основании известных размеров 18S рРНК, ITS и 283 рРНК, а ^акже того факта, что последовательность гена 28S рРНК целиком »ходит в состав SalGI-фрагмента (рис.2).

Общий размер повторяющейся единицы рибосомных генов был уста-ювлен суммированием размеров наиболее протяженных рестриктазных фрагментов. Мы использовали и некоырые из минорных фрагментов, (ели их размеры превышали размеры основных фрагментов. Исходя из 1азмеров фрагментов, образуемых рестриктазаыи Xhol и Kpnl, можно включить; что общая длина повторяющейся единицы рибосомных генов :рысы не ыояает быть меньше, чем 37 т.п.к.

10__15_20_25_30

transcription

10S 28S

I 1

I i 1 (

U_I_^ u£

BamHl Xho I ■ SalG t f Pstl Xbol крп i .j

I

IT

ii i 1_|_1 EcorI

Рис.2. Рестриктазная карта повторяющейся единицы генов 18S и 285 рРНК, сконструированная по результатам гибридизации геномных фрагментов ДНК методом Саузерна. Пунктирные стрелки обозначают положение минорных участков растепления.

2. ОТБОР И РЕСТРИКТАЗНОЕ КАРТИРОВАНИЕ РЕКОИБИНАНТНЫХ 4АГ0Б, СОДЕРЖАЩИХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 18S И 263 рРНК.

Восемь независимых рекомбинантных фагов, содержащих последовательности генов 16S и 2QS рРНК, отобрали из геномной клонотеки крысы сконструированной на основе векторного фага Харон 4А и фрагментов частичного расщепления геномной ДНК крысы рестриктазоя EcoRI. Отбор проводили по гиб-чдиэации с мечеными 1Э2Р! кДНК, синтезированными на матрицах 18S и 28S рРНК с испо. зованием "рассея-ной" затравки. Индивидуальные фаги были получены после 3-4 пересевов, сопровождавшихся гибридизацией с меченой кДНК. Для рестрик-тазного картирования встроенных фрагментов ДНК фагов использовали три рекомбинантных фага ARrll, ARrV и \RrlV и те же рестриктазы, что и при анализе на уровне тотальной ДНК, за исключением рестриктазы Pstl, много участков узнавания которой расположены на ДНК иекториогс фага, что существенно затрудняет картирование. Параллельно с рестриктаэным картированием проводили гибридизацию по ме-

10

15

20

25 Kb

ARr II

Л Rr IV

transcription

18S

20 S

I I

r~i г

U_LLLL

EcoRI Ba mH I

Xho I Xba I

Kpn I Hind !H

Sale I

III! SmoI

!ис.З. Рестриктаэная карта повторяющейся . дкнииш генов 13S и '/.65 рРНК крысы (по данный картирования встроенных фрагментов фагов Ш-П и ARrIV, а также гибридизации с меченой кДНК, синтезированной на матрицах 165 и 283 рРНК). Прямоугольники темнып и в полоску обозначают, соответственно, области высоко повторяющихся ь геноме последовательностей и тандем m повтор; ромб - область гетерогенности по длине.

оду Саузерна связанных на фильтрах фрагментов с мечеными кЛНК, интезированныыи отдельно на матрицах 18S и 26S рРНК. Полученные езультаты суммированы на рис.3 на котором показана рестриктаэная арта для 8 рестриктаэ и положение генов 1S3 и 283 рРНК з клониро-анных фрагмактах повторяющейся единицы рибосомных генов крысы.

Фрагмент ДНК, клонированный в фаге \RrII (длина вставки около 3 т.п.н.), содер;хит почти полнуа последовательность гена 163 рРНК за исключением короткого участка на 3'-конце гена), а также, пос-едовательности ETS и часть NTS, при-ежащую к ETS. Фрагмент ДНК, локированный в фаге ARrIV (длина вставки около 13 т.п.н.), содер-ит 3'-концевую последовательность гена 16S рРНК, ITS, полную пос-едовательж ть гена 203 рРНК, а также последовательности той час-и NTS, которая прилежат к З'-концу гена 283 pFHK. Таким образок.

клонированные в фагах фрагменты повторяющейся единицы генов 1ÖS и 26S рРНК крысы содержат полностью все транскрибируемые последовательности, в том числе участки инициации транскрипции и термина-ции, а также протяженные участки NTS, прилежащие к транскрибируе-й области.

Фрагмент ДНК, ветроенныг. в фаг XRrV, подобен встроенному Фрагменту фага \RrII по размерам и рестриктазной карте, но имеет другую ориентацию по отношению к ДНК вектора. Кроме того было обнаружено, что один из фрагментов двойного расщепления рестриктаэа,-ми Ecoiil и BamHI ДНК фага XRrII длиннее на 0,3 -.п.н. соответствующего фрагмента фага \RrV. Такая же разница в размере фрагментов была обнаружена и при использовании ряда других рестриктаз, что позволило сделать вывод о наличии в соответствующей области NTS района гетерогенного по длине (рис.3).

Сравнение рестриктазных карт повторяющейся единицы рибосомных генов крысы, установленных по клонированным фрагментам ДНК и непосредственно по гибридизации с геномной ДНК, показывает, что все основные участки узнавания рестриктаз и значительная часть минорных участков, например все 5 участков XIîoI, совпадают (рис.2 и 3). Ясно теюкз, что рестриктазиая карта, построенная на базе клонированных фрагментов рио'осомнол ДНК, существенно более полна и содержит ряд дополнительных участков для рестриктаз EcoRI, HindIII, Kpnl и Xbal в сравнении с картой, построенной на основании данных, полученных методом Саузерна. Практически полное совпадение рестриктазных карт говорит о том, что клонированные фрагменты рибосок-ноп ДИК происходят от "типичной" повторяющейся единицы рибосошшх .генов крысы, широко представленной в кластерах генов 16S и 26S "рРНК. Наличие s клонированных IHK некоторых, но не всех, минорных участкоз узкаьания рестриктаз поддерживает идею о значительной гетерогенности некоторых областей повторяющейся единицы генов 18S и 245 рРНК.

Дополнительная информация о структурно-функциональной организации ркбосоыноп повторяющейся единицы была получена при использовании предшественника рибосоыных РНК - 45?> лре-рГНК.. Используя меченую кДНК, синтезированную на матрице 45S пре-рРНК, нам удалось л*, i-.алиэозатъ участок инициации транскрипции 45S рРНК по гибридизации с рестрмктазнчми фрагментами ДНК фага ARril пнутри 2а1С1-Фраг-

Рис.4. Локализация участка инициации транскрипции повторяющейся единицы рДНК г ) гибридизации рестрик-та-ных фрагментов рДНК. с меченой 43Б пре-рРНК. Параллельно приведены данные злектрофоретичес-кого разделения фрагментов и авторадиограммы, полученные после гибридизации .

цента с размером 2,0 т.п.н. ближе к его левому краю (рис.4). Таким эбраэом, в первой части работы нам удалось получить общую характеристику повторяющейся единицы генов 18S и 2SS рРНК крысы, что поэ-золило перейти к детальным исследованиям различных районов повто-зяюшейся единицы.

3. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ВНУТРЕННЕГО ТРАНСКРИБИРУЕМОГО СПЕПСЕРА ПОВТОРЯВШЕЙСЯ ЕДИНИЦЫ ГЕНОВ 13S И 263 рРНК.

Роль последовательностей, входящих в состав внутреннего тран-:крибируеыого спейсера (ITS) генов 1S5 л 2BS рРНК, в биогенезе ри-(осом еиз не достаточно изучена. Установлено, что практически отсутствует гомология ыеаду последовательностями ITS, происходящими it дрояскеп, :errapus laevls и млекопитающих. Значительные различия ¡или обнаружены иеаау ITS у двух видов Xenopus v лаге у разных

клонов одного вида. В то время, когда нами ухе была закончена работа по определению нуклеотидной последонательности ITS рДНК, поя-пилась работ . группы американских исследователей IСабрахманьяы я соавт.), в которой была опубликована нуклеотидная последователь-;осгь ITS генов рРНК крысы. Сравнение опубликованной ими последовательности с последовательностью ITS мыши показало, что между зтмми последовательностями существуют значительные различия, в отличие от высоко консервативных последовательностей 18S и 263 рРНК.

Учитывая все вышесказанное, значительный интерес представляло провести сравнение двух последовательностей 1Т~>, происходящих от независимо выделенных клонов. С нашей точки зрения, изучение полиморфизма ITS могло-бы помочь в понимании механизмов, поддерживающих стабильность генов в мультигенных семействах, с одной стороны, и способствующих появлению и распространению изменений (мутаций) среди всех членов данного семейства, с другой. Кроме того, определение нуклеотидной последовательности ITS позволяло перейти к изучение роли определенных последовательностей ITS в процессинге предшественника рРНК.

3.1. Опраделеаие нуклеотидной последовательности внутреннего транскрибируемого слеясдзра.

Все нуклеотидныр последовательности ITS входят в состав плаз-ми ди pErlЭ (рис.5), пол>ченной при реклонировании фрагмента EcoBI-

(с i ас вес bit

\ \ - II I J l Iii

-----eancty щ-^уциаРДчД- - ■■ ■ - -'

г- " и

С % $ И т М «<5Г S ? 55Д A4 Н А 5 ЦК 5 О

» lit IM« И» f Ml I < «МП» _ _ •

о.» 1.0 i.a J.J >.о ).>

kbo

Рис.?. Положение встроенного фрагмента плазмиды pRrl9 внутри повторяющейся единицы рДНК и стратегия определения его нуклео-тиднол последовательности. А - Avail; Б - BarnHI; Е 7 EcoRI; Н r- HinfJ; К - Kpnl; М - MvaJ; S - Sau3AI; Т - TaqI; X - Xhol.

СААТТСССЛС ТАЛСТССССС TCÁTAACCTT CCGTTCÄTTa cctccc'tccc стттстлслс ACCCl_cctc gctactaccc attgcatcct ttagtcaggc cctcccatcc cccccccccc

cgtcgcccca cgcccctcgc cgagccctca gaacacggtc caacttgact atctacagca

60 120 ! вп

астааластс ctaacaaggt ttccctacgt f'acctcccc aaggarcatrar^güásaag 2-10 ccccaccccctgtcctcgtcc cctcccctcî 'iccccctctc тслстстт&гтссттстссс 300 ccgcacgccc ctccccgcgt cgctccccct ctccgccctc ctcgcgtcgt ggcgcctccc 300 ctcccccgcc cccccaccgc gcctttcgcg acaggtgtgc cgtgccagcg tgtcgcctct 420 cctcctcccg cgggacctcc tccgttttcc ccctcttccc tccacgcctc cctgcccccc 130 cctccccctc cccccctccc ctcgccaccc cgacggcctt ctcccccttt cccaccggct 510 ccctgatctc gtctccaccg ggggtggtac gtgatctcc", cccgggcggt ggccggcacg 600 ccctccctct cctccacccg cctccccctc ctcccccccc cccgctctcc cgcactcacg 660 ctccccctcg ctcccccgcc tgccctcgcg cggcctgtgt gtccccgtcc cccgggtcgg 720 ctcccccccc ccgccgcgtc cttctccgcc tccctgtccg cccccctcct ctccccctac 760 ctcctctccc gttccggcgc ccacgt7tcg cgaccccggc . kgtccccc taccctcccc 640 cucctccccc ggcccgtcgg ccccgtaccg acgtccgtcc тг "scgccag ggcttccccg 900 tccctcccca cctccccccc. tccctcagac tcaccccccc aci.cctctcg cccccccccc 960 ttccccaccc cccccttccg gcccccctgt ccccagcccc ctctcggccc ccgagccgtt 1020 ccccccccca gcgcctccct tgtcccgccc gttggcggcc ccccgccgc.g tgcccgct7c 1060 gîgccgtccc gtctcccgtg tgtcccccct ttccctctcc сассстстст_тптгттттт 1140 mtcttacg tgtgtctcgt ttcctttctc cctcgccccc ctgacccgca cccccctccc 1200 cctccccccc ctcccatccc ccgcaccagg сGCCCCCGGG СССССТТПТТ cccgtcgtca 1260 gcaccccgtg tccggagtcc cgctcacacc tcagataaccgta íccac.ct taccgctgct) u.o

----------..---- ------------------------------ 1300

1440 1500

гсастсссст cgtgcctccätgaagaacgc acctagctgc gacaattaat gtgaattcca ggacacattg atcatcgaca cttcgaacgc acttgccccc cccggttcct ccccggccta

CCCCTCTCTG AOCCTCGCT fTCACCMCAM CCCCCCCCCC CTTCCCGUT CGCCGCCGCG

________IT

ggggcgatcg cctcccgccg ctcggagtct gctcgcaggg cccccctccc cccccccctc 1360

cgtctcccga ägttcacacg cgccccccgt cccccgttcg cccccccccc ctccgtccgc 1620

CCCCCCTCCT cctccctccc ccccgtcgtc ctcccccccc ccccccctcc tcccggctcc 16ö0

ttcccccccc cctccccccc tcccgctccc gtcctcgcc cctctccccc cccctgcgga 1710

cgcgtcggcg tgccccggtc ccgtgtctgg gcgccagacg ggccgggaaa gtcgcgtccc 1600

cggggtcgtt cgccgcgcct ccggtggggt gggaggcggg gacccccctg cccccccccc 1660

cgccccgccc ctcccccccc CCCCCCCCCC cgccccgtcc gtccgcagac acagagagag 1920

agagacaccc gcgagggtcg ttccggccgg ccctaccccg cccccccccc cggtctcgcg 1900

тссстстссг ccccccctcc CCCTCCGGGC ccacgctccg ctcccccccc cccccccccc 2040

ggcctccgtc cgccgacgcc acttcccccc cccatccgcg cccccccccc caacgagacg 2100

тссссшхс cgccctggct cccccggcgc cctccccccc tcgtcccgtc gttctcgctc 2160

tccctctcct ctcctctcct ctccttccgt cccccccccc cccccacctc tcctcctîct 2220

сстссг(лсса)ссссс;асст сдоатсдсдс gtggccaccc cctcaattta~ägcatattagi 2í-0

---------------- — ------------------- ---------- -------------2340

2400

tcacccca.cg аааасаалст aaccaggatt ccctcagtaa ccgcgagtga acacggkaga gcccaccgcc саатсссссс gcgccccccg ccccgcgaaa tgtggcgtac ggaagaccca ctcccccgcc cccctcctgc gcgccccaac tccttctgat с i--

Рис.6. Нуклеотидная последовательность внутреннего транскрибируемого спейсера повторяющейся единицы рДНК крысы. Фрагменты генов 18S, 5.8S и 2ÖS зь .лечены в рамки. Последовательность начинается с участка EcoRI, расположенного внутри гена 1ÖS рРНК (231 п.н. от З'-конца 183 рРНК). Подчеркнуты последовательности главного участка раннего эндонуклеаэного расщепления 41S пре-рРНК и участков первичного эндонуклеаэного расщепления 32S пре-рРНК.

ВатН1 фага \RrIV в векторную плазмиду рВИ322. стратегия определения нуклеотиднык последовательностей встроенного фрагмента приведена на том же рисунке.

Общая длина фрагмента, для которого определена нуклеотидная последовательность, составляет 2440 н.п. Данная последовательность включает З'-кг щевую часть гена 16S рРНК, ITS-1, ген 5,8S рРНК, ITS-2 и 5'-концевую часть гена 283 рРНК 1 рис.6). Положение З'-кон-ь гена 18S рРНК и границ гена 5.0S рРНК было определено на основании ранее опубликованных нуклеотидных последовательностей соответствующих рРНК. Положение 5'-конца гена 26S рРНК определено ними методом кзртиропания с использованием нуклеазы S1. Анализ нуклео-тидной последователыюст:! IT3 показал, что для лее характерно исключительно высокое содержание G+C: 75% в ITS-1 ч 00% в ITS-2. Для ITS характерны, гласный образом, протяженные блоки G+C смешанного состава, в то время как гомсиолимерние тракты длиной более ü н.п., состоящие только из оснований G или С, обнаружены не были..

Сравнение определенной нанк последовательности с данными других авторов, исполъэогазших независимо полученные клоны рДНК, пс-казысает высокий уровень консерватизма структурных последовательностей: генов lös, 2bS и 5,öS рРНК ¡обнаружена единственная замена в гене 185 pPfirC). В тояе время обнаружена значительная гетерогенность з областях собственно ITS при сравнении с нуклеотидноп последовательностью, опубликованной Сабрахманьямом и соавт. Основные различия представлены точечными мутациями,- включавшими 23 делеции к ли вставки и 14 замен. 'Замена Т~>С в положении 1279 в иашеи клоне рДНК приводит к образовании нового участка Hir.fi, наличие которого надежно установлено. Обнаружены также три области с относительно длинными различиями: шесть нуклеотидов (1844 - 1850) отсутствуют в последовательности Сабрахманьяна и соавт., а два тетрануклеотида отсутствуют в последовательности клона pRrl9 а положениях 1204 к •200S (рис.6). Обнаружение сущус-векных различий в последовательностях ITS между дсумя независимо выделенными кло- вполне укладывается в рамки представлений о наличии аыраженнол гетерогенности D последовательностях ITS и ETS дрожжей и X. iaevls. Быстрая дивергенция последовательностей как. ITS-1, так и ITS-2 у эукариот предполагает, что последовательности специфичный для вида или структуры более высокого порядка могут играть важную роль при Формировании участков лроцессинга пре-рРНК, осуществляемого васокос-пе.4ифичными эндонуклеазами.

3.2. Локализация гласного участка раннего эндоиуккеазного расщепления предшественника J8S « 2»S pl'HK крисн во внутренне« транскрибируемом спейсере.

Определение полной нуклеотидной последовательности IT3 и 5'-конца гена 28S рРНК в сочетании с определенной ранее последоза-тельностьо гена 16S рРНК. позволило перейти к локализации участков, по которым проходит созревание пре-рРНК. Г*и транскрипции рибосом-ных генов «лекопитаюиих образуется предиест экник рРНК, обозначаемый 453 пре-рРНК, после последовательного расшялленкя которого сп цифическими зндонуклеазами образуются молекула 183, 26S 5,8S рРНК. В большинстве клеток млекопитающих созревание пре-рРНК проходит по, так называемому, главному пути, хотя иногда обнаружва-ются и дополнительные пути созревания, что связано с различия)',« в последовательностях участков расцепления зндонуклеазами. О точной локализации и структуре участков эндонуклеазногс расщепления, такте как и о конкретных молекулярных механизмах действия зндонуклеаэ мало что известно. Показано, что при созревании пре-рРНК в клетках E.coli и дрожжей в последовательностях спеяееров образуются стабильные двухцепсчечные петли, однако в случае мыши структура сигнальных участков, обеспечиваюшях процесс созревания, принципиально отличается от таковых у E.coli и дролскеи.

Ранее было показано, что основной путь созревания предшественника рРНК, который в случае млекопитающих может быть изображен следующим образом: 45S —> 413 —> 323 + 21S —* 283(5,83) 18S рРНК., справедлив также и для созревания пре-рРНК в печени крысы. Таким образом., согласно этой с jmu расщепление 41S пре-рРНК приводит к образованию предшественников 18S (213 пре-рРНКt и 2SS +3,83 рРНК (32S пре-рРНК) и проходит по главному участку раннего эндо-нуклеазного расцепления пре-рРНК. Накопление о клетках печени крысы заметных количеств 323 и 21S пре-рРНК, которые могут быть достаточно обогащены последовательным центрифугированием в градиенте плотности сахарозы, в сочетании с кло лрованными фрагментами ITS с известной последовательностью, позволило нам провести детальное изучение главного участка раннего зндонуклеазного растепления 413 пре-рР! ; во внутреннем транскрибируемо» спейсере.

Для картирования использовали три препарата пр^-рРНК. Фракция

32S лре-рРНК имела форму отдельного гомогенного пика и содержала более 60S 32S и около 40% 2SS pPHK. 21S пре-рРНК не образует отдельного пика, однако может быть идентифицирована и отделена как плечо слева от пика.183 пре-рРНК. 12S пре-рРНК отделяли центрифу-чрованием в градиенте плотностн с taposu после денатурации 32S пре-рРНК, очищенный препарат которой содержит некоторую часть молекул, в которых 28S (Г 12S рРНК соединены за счет протяженных гомологичных участков. Фракция 12S пре-рРНК. не содержит РНК с размерами большими чем 12S, но немного загрязнена 5.8S рРНК. При интер-претац ш результатов, полученных при картировали с 12S пре-рРНК это учитывалось.

Чтобы определить положение 5'-концов 32S и 12S пре-рРНК и положение 3'-конца 21S пре-рРНК использовали подходящие субфрагмонты плазмиды pRrl9 (рис.5 и 6). Предварительные эксперименты с фрагментом, вышепляемым рестриктазами Mval (1035) и Sisal (1422)«, показали, что 32S пре-рРНК защишот от действия нуклеаэы S1 фрагмент длиной 270 - 290 н.п. Это означало, что 5'-конец 32S пре-рРНК расположен намного левее 5'-конца 5,83 рРНК. Для более точной локализации использовали субфрагмент Mval (1035) - Hinfl (12781, полученный из меченого по 5'-концам (Э2Р1 субфрагмента Hlnfl (9291 -Hlnfl (1278), расщеплением рестриктаэой Mval. После гибридизации этого меченого фрагмента с 32S и 12S пре-рРНК и удаления одноцепо-чечных фрагментов ДНК нуклеазой S1, "защищенная" ДНК была фракционирована в полиакрилс„шдном геле параллельно с фрагментами, образующейся после химической обработки того же самого субфрагмента Mval (1035) - Hlnfl (1278) по методу Максама - Гилберта. Легко видеть (рис.7), что положение 5'-концов 32S и 123 пре-рРНК практи-. чески совпадает, они расположены внутри длинного блока (Т)п (1130 - 1147), расположенного на 155 н.п. левее 5'-конич гена 5,ÖS рРНК (рис.6). Следует отметить, что локализация 5'-концов обеих форм 32S пре-рРНК (денатурированной и неденатурированной) совпадает. Детальный анализ позволил установить, что три участка эндонуклеаэ-н'ого растепления расположены в положениях 1141 - 1143 (рис.6).

» - здесь и далее цифры в скобках рядом с названием рестриктазы или конкретного нуклеотида указывают на их положение в последовательности ITS, приведенной на рис.6.

I r г ?■ i г < г Рис.7. Локализация 5'-кон-

с с с

ь цов 32S и 12S пре-рРНК <а>

р г, с с

" v

\ ■ 1и 3'-конца 215 пре-рРНК

■

| 1 .. .-.j • с t>) _ Горизонтальные стрел-

'■ 1гл к» показывают фрагменты

Ь'-

(К^ i -"наг -

—J*** f рДНК. защинринни от дейст-

пи.ч нуклеазы 51 гибридиза-

'! i

i. .en с 123 < pi, 32SI q) или

--И"' 2L 1г, з и tl nps-pITiK.

|| Ислсльоозали следующие уе-

^ ___ ^гчв!«;о по концам реетпи:;-

Г'1""" . Г"' т&знне фрагменты рДНК: р

' <]) Mvai (1035! - iiinr i 112701; r> Hinfl (920) -

„R

с.--','

Hinfl .(1273); s! EcoRIl (1034) - ccoRII (2117 i; t) ^ EcollII (1034 1-AvaII (1014!.

Для локализации -конца 21S пре-рРНК использовали: а) тот ;;,э саь.нй субфрагмент Hinfl - Hinfl, но после качения по З'-конца»? (наполнение липких концов с помощь» Фрагмента Кленова); Ы суб-tpa-гмент EcoRIl (1034) - EcoRIl (2117), меченный'-по С-конца»; с. тот »в субфрагмент EcoRIl (1034) - EcoRIl (2117), но расщепленный рес-триктазоп Avail (1614). После отжига меченых фрагментов с 213 пре-рРКК и удаления одноцепочечных участков Д!1;* нуклеазог. 31 анализ "эашиадэнны::" фрагиентов ДНК проводили тем газ методой, что п в случае 323 .и 123 пре-рРНК (¡,.;с.7). Конец "защищенного" £р~п.&нта находится на расстоянии 93+1 и.п. от участка EcoRil (1034) и на расстоянии 204;3 н.п. от участка Hinfl (S2S). Положение 3'-конца 213 пре-рРНК, определенное по гибридизации с тремя рестриктазны ч фрагментами совпадает и находится внутри того де олока !Т)и, что и в случав 32S и 12S пре-рРКК, но в положении 1133+i !p;;c,ti?.

Локализация концов пре-рРНК вн,гри блока (Tin, но на некото-рои расстоянии друг от друга могла бы быть связана с неполной завитой гибридов РНК:ДНК около этих участков. Однако протиз этого предположения говорит то, что при проведении реакции при 37°с (как

было в случае наших экспериментов) нуклеаза S1 практически не затрагивает двухиепочечные участки, а также достаточно высокая гомо-, генность концо" 32S и 21S пре-рРНК. Более вероятно, что небольшой разрыв между концами 323 и 21S пре-рРНК связан с дополнительным • лицевым процессингом, имевшим i..jcto после расщепления 41S пре-рРНК по главному участку раннего зндонуклеазного расщепления. Однако нельзя исключить и некоторое техническое несовершенство собственно метода картирования с использованием рестриктазных фрагментов ДНК меченых по 3'-концам. Как бы то ни было, мы можем заключ-.ть, что в случае повторяющейся единицы "енов 18S и 28S ри-босомных РНК крысы главный участок раннего эндонуклеазного расщепления 41S пре-рРНК расположен в левой части внутреннего транскрибируемого спеисера С ITS—1) внутри гомополимерного участка (Т)п с координатами 1130 - .1147, расположенного на 160 нуклеот'идов левее 5'-конца гена 5,8S рРНК.

Итак, нам удалось достоверно установить принципиальный факт: при созревании пре-рРНК в клетках печени крысы главный участск раннего зндонуклеазного расщепления расположен не у 5'-конца 5.8S рРНК, как это предполагалось по аналогии с некоторыми другими организмами, а значительно левее, внутри ITS-1. Отсюда следует, в частности, вывод, что главной .следующей стадией созревания 32S пре-рРНК является отделение 12S пре-рРНК и образование 28S рРНК и только после этого из 12S пре-рРНК образуется 5,63 рРНК. Локализация мест расщепления ьнутри протяженного тракта (U)n показывает^ что растепление проходит, главным образом, по связям UpU. У нас нет данных, чтобы решить играет ли единственный остаток А 11141) внутри этой области некую сигнальную роль, однако можно считать точно доказанным, что по связям UpA и Aplf также проходит зндонук-леазное расщэпление. Анализ нук^еотидных последовательностей, прилежащих к области (Tin, позволил еыявить гомологичные участки, которые способны образовать шпилечпую структуру, при этом последовательность (U in образует петлю (рис.8), внутри которой находятся все идентифицированные нами места эндонуклеазного расщепления.

Сравнение известных нуклеотидных последовательностей ITS повторяющихся единиц генов рибосомных РНК дрожявй, лягушки, мыши и к, ucu показало, что гомологичные участки между ними не обнаруживается, что подтверждает выраженную силовую специфичность последова-

Рис.6. Возможная вторичная структура молекулы 41S пре-рРНК в области локализации главного участка раннего- зндонуклеазного расщепления. Стрелки показывают положение мест разрыва, установленное по положению S'-концов 32S и 123 пре-рРНК (справа) .. 21S пре-рРНК (слева).

тельностей ITS. Следует отметить, что во всем ITS рибосомных генов лягушки обнаруживается единственный остаток U, что вполне коррелирует с тем, что у лягушки отсутствует аналог ?1S пре-рРНК и расщепление проходит сразу же около 3'-конца гена 18S рРНК. В ITS-1 рибосомных генов мыши имеется несколько блоков (Т)п с длиной 5 и более нуклеотидов, однако, как было показано двумя независимыми группами, 5'-конец -32S пре-рРНК в этом случае расположен в 6 - 7 н.п. от 5'- конца гена 5,8S рРНК, что подтверждается и размерами соответствующих пре-рРНК. Однако, достойно внимания то, что в случае рибосомных генов мыши обнаружены заметные количества 21S пре-рРНК, 3'-конец которой локализуется внутри ITS-1 и значительно удален от 5'- конца гена 5.BS рРНК. Эти данные делает неопределенным точную локализацию и структуру участка раннего расщепления пре-рРНК в случае рибосомных генов мыши.

3.3. Локализация и структура'участков первичного эндонуклеаэного расщепления 32S пре-рРНК.

В клетках печени крысы первой стадией созревания 32S пре-рРНК является ее распад на 28S рРНК и 12S пре-рРНК под действием специфической эндонуклеазы. 12S пре-рРНК при этом остается прочнг связанной с 28S рРНК за счет протяженных гомологичных последовательностей и при центрифугировании в градиенте плотности сахарозы соосаждается с нерасщепленнрй моле! ;лой 32S пре-рРНК. В связи с этим значительный интерес представляло определение локализации 5'-концов 26S рРНК, выделенной как из ядрышек, так и из цитоплазмы, и 3'-конца !£.. пре-рРНК. Критическим при проведении этого эксперимента является чистота используемых препаратов и целостность иоле-

и и У 'и и

' Ч

ис 1г и - А g-c UC-G

с - gu А - U -uccg - cucg-3

кул рибосомноя ИЖ. Препараты 285 рРКК из ядрышек и цитоплазмы, очищенные тремя последовательными центрифугированиями в градиенте плотности са"\ооэы, давали симметричный пик и были гомогенны по критерию электрофоретичзского разделения в геле. 123 пре-рРНК. от-элялм центрифугированием в гради; ге плотности сахарозу после денатурации 323 пре-рГНК. Фракция 12Э пре-рРНК не содержит РНК с размерами большими чем 125, ио немного загрязнена 5,83 рРНК. Однако присутствие 5,8Э рРНК не должно влиять на результаты эксперимента, так как участок зндонуклеазного расщепления расположен но~ далекь от 5'-конца гена 262 рРНК.

Для того чтобы определить положение концевых участков 263 рРНК и 123 пре-рРНК, мы использовали соответствующие рестриктазные Фрагменты плазмиды рВг15, включающие в свой состав часть 1ТЗ-2 и гена 263 рРНК (рис.5 и 61, Для картирования 5'-концов молекул 283 рРНК использовали субфрагыент Зюа1 (2070) - ШШЧ (2310), образующийся из меченого (Э2Р! по 5'-концам фрагмента Н1пП (1526) -Н1пГ1 (2310!, под действием рестриктаза Зиа1. Чтобы определить положение 3'-конца 12& пре-рРНК использовали мечены« по 3'-концам фрагмент ЕсоНП 12115» - НсоВИ (2306). После отжига и удаления с помощь» иуклеаэы 31 -одноцепочечннх участков ДНК, "завяленные" фрагменты использовали для элрктрофсретического анализа в пояиак-риламидпом геле, причем параллельно с фрагментами, образующимися после химической обработки того же самого субфрагмента ЗюаТ ¡20/0) - К1г.Г1 (2310) по методу Млксама - Гилберта (рис.9).

Легко видеть, что 5'-концы молекул 203 рРНК, выделенных по цитоплазми, гомогенны и находятся в положении 2231 и 2232, что полностью согласутсл с данными, полученными Сабрахмамьяыом и со-авт. Однако, совершенно неожиданно оказалось, что 5'-кониевые участим молекул 28Ь рИК, выделенных из ядрышек, гетерогенны и расположены в двух зона:; (Л и В) внутри ГГЗ-2, причем большая чссть молекул лмеег концевые последовательности, локализуемые в зоне Л (рис.3). Нуклеогидные последовательности обеих зон представляют собой различные комбинации мотива СЖ и расположены между позициями 2171 и 2184 (зона А) к 221В - 2230 (зона В), то есть наиболее удаленные .чуклеотиды ^он А и Б находятся, соответственно, 60 и 13 нуклеотидоз левее 0'-конца зрелой 285 рРНК. 3' концевые последовательности молекул 123 пре-рРНК оказались также гетероген-

+ ■+■ g g с

ад i

b'î м

~ ■ ir- '-j foi; -Г

(

j j c™- ï '

»ЧСГ9 g— «НИИ

»3S ГУ» •«•la

Сд» Cil

ta-5-»—

p..--о»сз

gp».

Ib)

8'

22?° ilili!!! i rf-

CUCOCCUCUCCUCUmJCUCCUUCCGUCGCCrGi:GCGCr.CCCACCUCUCCUCCUUCUCCUCCUCL'G(|/îpcG

III;

Рис.S. a) Локализация 5'-концов ядрышкосой ly) я цптоплазыатичес-icob (z) 28S pPHIC ' и .3'-конца 12S пре-рРНК i :: ). Горизонтальные стрелки показывает фрагменты рДНК, защищенные от действия нуклеазы 31 гибридизацией с цитоплазцатическог 26S рРНК. Сксбки охватывает гетерогенные фрагменты рДНК, защищенные ядрыиковок 20S рРНК (Л, BI к 123 Пре-рРНК. (Л', B'i. Использовали следующие меченые* по концам рестриктазные Фрагменты рДНК: у, г) 5ша1 (2070) - Hinfl (3210); X) EcoRII (2115) - EcoRII (2306).

b) Последовательность 32S про-рРНК в области участка начального эидонуклеазного расщэплэния. Сплогпные н пунктирные линии указывают на положение основных и минорных иест зндонуклаазнс j" расщзплзиия. 5* - обозначает конец цнтоплазматической 26S pPiir*.

ны и расположены внутри тех же зон, состоящих из комбинаций мотивов СиС (зоны А' и В' ). Положение границ зоны А' (2166 - 2182) и зоны В1 <2211 - 2218) несколько отличается от таковых у зон Л и В, однако положение мест расщепления в значительной мере перекрывает-я, особенно в случае зон А и А'.

Итак, при картировании первого участка эндонуклеазного расщепления 323 пре-рРНК нами получены неожиданные результаты, достоверность которых не вызывает сомнений, так как картирование проводили как бы "с дЕух сторон": определяли положение 5'-конца яд'рыш-ковоп -8.3 рРНК и 3'-конца 12Э пре-рРНК. Получегчые результаты показывает, что имеется множество равноценных мест эндонуклеазноЯ атаки, целиком сосредоточенных в двух областях (СиС)п, расположенных левее 5'-конца зрелой молекулы 263 рРНК в ХТЭ-г. Важно также отметить, что между зонами А и В, содержащими участки эндонуклеазного расшепления, расположена последовательность, обогащенная С+С, внутри которой не обнаружено ни одного участка эндонуклеазного расщепления. Локализация периого участка эндонуклеазного расщепления 323 пре-рРНК внутри 1ТЗ-2 говорит о том, что молекулы ядрышко-вой формы 285 рРНК и 12Б пре-рРНК должны быть процессированы дополнительно, чтобы образовать зрелые молекулы 286 и 5,83 рРНК, соответственно . ,

3.2. Локализация взаимно комплементарных последовательностей внутри молекули 323 пре-рРНК.

Изучение процесса денатурации комплекса 5,03:283 рРНК, выделенного из цитоплазмы, и комплекса 123 пре-рРНК с 283 рРНК, выде-. ленного из ядрышек, показало, что температура плавления комплекса 5,83;283 рРНК (50°С) более чем на 30°С ниже температуры плавлений комплекса 122:283 рРНК (80 - 65°С!. Этот результат свидетельствует о тон, что в комплексе 123:265 рРНК имеются дополнительные взаимно комплементарные последовательности в сравнении с комплексом 5,83: 283 рРНК, Определение полной нуклеотидной последовательности гена 283 рРНК.(см. главу <1) позволило провести поиск этих гомологичных участков. 6 дополнение к двум ожидаемым двухцепочечни« фрагментам, о; разуюшимся за счет взаимодействия комплементарных последоратель-ностея 5,83 и 283 рРЖ (рис.10, с и (1), нами были обнаружены также

2125 3162

j'-CGedc-CUÄCCCbJCGUCC(5lÄuCUCGCUCUC-llllll l'lll II • и • ! И • И 1 'lll-M —GCCGG^jGGGGGCG^pGCGGGGGGAAAGGCGIjjSGG- - 5 •

3212 3175

1611 If 6

I !

5'—GUGGGUCCGCGCGGGC— l II I (• I II Uli II I --CACCCGCGCGCGCCCG-- r>' I l

2207 2192

1335 130'.Г

—CGUGCUCGGCU— CACtfG(tjGGCGAUUCUCAGCp I II I II 11 II I II 11 I 111* II 1111 • 5'—GCACGA(j£CGA GUGA A ACCGUUAAGAGGU--

257) 2582 2644 2661

1459 1433

- -UCGCU&AGUCUGUCCGCAUCG-GGGC- - 5' 11 III II 1111 II I III -II 11 I I pACCGCGACCUCAG/pGACGUGGtj^CG--

2231 2261

Рис.10. Структуры двухцепочечных участков (предполагаемые), формируемые фрагментами молекулы 32S пре-рРНК и участвующие в процессинге. Цифры - указывают положение начала и конца Фрагментов согласно рис.6.

два других протяженных двухцепочечных фрагмента, образованных взаимно комплементарными последовательностями ITS-2, прилежаки«и к участкам начального расщепления 32S пре-рРНК (мотивы CUC) и двуая последовательностями, одна из оторых представляет собоп обогащенный G+C фрагмент 283 рРНК, а другая - последовательность IT5-2, расположенную в 150 нуклеотидах правее 3'-концевой последовательности гена 5,6S рРНК (рис.10, а и Ы.

Последняя дуплекс образован именно топ обогащенной парами G/C последовательностью, которая разделяет зоны А и В участка начального эндонуклеазного расщепления. Tei. более интересно отметить, что в последовательностях 26S рРНК и ITS-2 не удается обнаружить участков комплементарных мотивам CUC, представленным в зонах А и В. Отсюда ^ледует, что оба участка (к и В) начального эндонуклеазного расщепления 32S пре-рРНК существует в одноце-тчечной форме и

ш

<с|

м

с двух сторон ограничены двухцепочечными фрагментами РНК. Сравнение последовательностей сегментов рРНК (рис.10, с и d>, определяющих взаимодействие 5,8S рРНК с 283 рРНК, показало, что аналогичные структуры характерны такяэ для дрогавп м мыши и отличаются высоки« •"»овнем консерватизма в эволюииопн i аспекте.

3.5. Коде ль npoueccmira пре-рРНК, млекопитающих, освовашшк па г:;айтетической вторичной структуре атой молекула.

Г этой главе будет дано краткое описание гипотетической модели созревания пре-рРНК, основанной на предполагаемой вторичной структуре этой молекулы. Мы не Суден перечислять всех данных, положенных в основу данной модели (рис.111, которые были получены как в рамках настоящего исследования, так и ранее в лаборатории проф. А.Л.Хаджиолова, а также другими группами исследователей.

11 Процесс созревания rspe-pPHK может быть разделен на две четко различимые фазы, обозначаемые как быстрая <г) и медленная

--V

i_11_______i

tS.l 12 S

Рис. И. Модель предполагаемой вторичной структуры пре-рРНК илеко-питаювих и основанная на ней гипотетическая схема прочес-сиига. Стрелки указнваат на положение ><ест эндонуклеаэного расщепления в быстрой <rl - гЗ) и медленной (si - с5) фазах процессинга пре-рРНК. tSe и ts 1 - внешний и внутренний транскрибируемые спейсеры.

is). Во рсмя фазы V образуются 32S пре-рРНК и 18S рРНК. В финале фазы s образуются 233 и 5,35 рРНК. Участки зндонуклеазного расщепления внутри последовательностей спейсеров с пре-рРНК являются высоко специфичными для видов и родов. В противоположность этому окончательное формирование гомогенных 5'- и 3'-концевых последовательностей зрелых рРНК определяется их участием а зволюционно консервативных двухцепочечних структурах.

Ч) Выраженная видо- и родо-специфичн^-ть участков, по которым проходит эндонуклеазное расщепление в фазе г, приводит к тому, что обнаружено много альтернативных путей созревания пре-рРНК, характерных для различных организмов. Тем не менее анализ показывает, что расщепление в фазе г идет, главный образом, по связям типа UpU или MpU. Полотение участка г2 (рис.11) является зидо-специфичным, в то время как участки rl и гЗ всегда локализованы на 5'- и 3'-концах зрелой 135 рРНК. Мы предполагаем, что специфичность растепления по участкам rl и гЗ определяете в большая мере об; лзова-нием двухцепочечиого участка за счет собственно последовательностей 18S рРНК, чем за счет выражение дивергентных последовательностей в прилежащих спейсорах. Эндонуклеазное расщепление внутри блоков tUJn, присутствующих во внешнем транскрибируемом спейсере некоторых видов может еще более увеличивать гетерогенность молекул пре-рРНК во время фазы г.

ill) В фазе s, также как и в фазе г, окончательное формирование гомогенных 5'- и 3*-концов зрелых 28S и 5,83 рРНК происходит благодаря образованию эволяционно консервативных двухцепочечних структур, аклачасоих концевые последовательности этих рРНК. В противоположность этому участки начального расщепления s) и, возможно, зЗ относятся к типу видо-специфичных участков. Расщепление осуществляется одноцепочечноя эндонуклеазой, в основном, по связям UpU и CpU. Как показывают наши исследования, в клетках млекопитающих вы сокия уровень специфичности расщепления но участкам si достигается за счет образования двухцепочачных структур а н b (рис.10). Последнее наблюдение резко расширяет на^м представления об эволицкн спеисерных последовательностей рлбосомных генов и и>: участии а процессе созревания пре-рРНК. С нашей точки зрения предложенная модель мо», г полезна для дальнейшего изучения взаикодествий этого типа.

4. СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНА 2Р» рРНК..

Нуклеитид.ая последовательность гена 28S рРНК целиком входит g состав реномбинантного фага AKrIV. Для определения куклеотидноп 1 ,следовательности этого гена било проведено реклонирование четырех субфрагментов этого фага, образующихся при действии рестриктаэ EcoHI к Ба'йН! и содержащих все последовательности гена 28S рРНК, в векторную плазмиду рВГ;322. В результате получены четыре рекомби-нантных плазмиды pRrl9, 13, 20 и 22, расположение которых внутри повторяющейся единицы рибосомных генов показано на рис.12. На этом же рисунка приведена стратегия определения нуклеотидноя последовательности с использованием встроенных фрагментов этях четырех плазыид.

• Полная куклеотидиая последовательность 2SS рРНК приведена на рис.13. Общая длина молекулы 28S рРНК. составляет 4802 п.н. и содержание С->С равно 67,вй. Определенная на основании полной нуклео-тидноя последовательности молекулярная масса (1,66хЮ6) хорошо согласуется с данными, полученными с использованием физико-хими-чеслих кэтодоз (1,65 - 1,66x10®), что говорит в пользу надежности нашего определения нуклеотидноя последовательности. Это подвергается также сравнением с ьуклеотидной последовательностью 28S рРНК, определенной Чаном и соавт. параллельно с нами. Сравнение последовательностей позволило обнаружить всего около SO различий, большинство мз которых представляют собой точечные замены, делеции или вставки. Обнаружанназ различия могут быть связаны или с реально существующими различиями менду двумя клонами рДНК, или же с техническими оыпбками. Во всяком случае, идентифицированные при анализе последовательности 28S рРНК уч-'тки узнавания рестриктазы BstMI (положение первых нуклеотидов участков 3348, 4690), отсутст-

вующие в последовательности, приводимой Чаном и соавт., реально обнаружены нами при рестриктазном картировании плазыид. pRrlo pRr22, такжэ как и отсутствие участка узнавания TaqI (2335), обна-рузжзаемого в последовательности 26S рРНК, определенной в работе Чана ч соавт. Кроме того, последовательность длиной 72 п.н. между днумл участками Aval (положение 4546 - 4619) вообще не представлена в работе Чана и соавт.

Считается, что большие рибосомпые РНК (18S и 2t3S рРНК с слу-

Л i i I

п

h

С E £

I 1 I

it IT iF Tt и ¡it T"i MI v ■ itr

rJtLLiUJLi

Рис .12. Структура повторяющейся единицы рДНК крысы к положение фрагментов рДНК плаэмид pRr!9, 1о, 20 и 22. Стратегия определения нуклеотидиой последовательности гена 285 рРНК. а - Aval; 2 - Avail; В - BanHI; п - Bglll; b - BstHI; Е -Ecolil; h - Hinfl; и - l&pl; k - Mval; p - PvuII; s -Sau3Al; t - TaqI; x -- Xmal.

чае млекопитающих) играют роль скелета во время сборки большой к малой субъсдиниц рибосом. Поэтому определение первичной н на ее основе вторичной структур рибос'омных РНК является важной ступень» в понимании структуры и функции рибосоы. Сравнительное изучение последовательностей рибосоыных . Ц\, формирующих большие субъедини-ны риЗосом у разных организмов f2.es рРНК б случае крысы, пли обобщенно Ь-рРНК.), представляет значительный интерес, так как для Ь-рРНК характерны значительные структурные изменения в процессе эволюции. Определение полкой иуклеотиднои последовательности 263 рРНК крысы позволило провести сравнение нуклеотидных последовательностей Ь-рРНК крысы и дрожжей. Пос, ¿довательность 1,-рРНК дрох-гкей была определена ранее в лабораториях К.Г.Скрябина н А.л.Хаджи-олова.

Обшдя м.шна последовательности Ь-рРНК млекопитающих почти ¡га 1,5 т.п.и. превипзет длину ь-рРНК дрожжей, и кроне *">ео, как было

1.5

1-0

■ • i ■ . . i . y » > pCCCCt^CCUCMAUCAGAWIGGCMCCCCCUGAAtflWAGCAUAU^

с с с agc gccg a auc с с gc с gc g с gc с g с g ik g с g ggaa a ij gugg cguaççg mgacc с л съ с с с cgg cgîxccucg l/gg g g gg ccc a agoc с uu cugaucgaggcccagc

ccGUGGACGGittuGAGGCcikwGcswccccGCGCGcccoGcctGG^^^^^

UAAAUArCCGCACGAf.ACCGAUAGCCAACM^^

GGUCCGC&CÂC.UCL :1&^^шиАсссйш>&:ьЬисгъ&есос.ссос

С UC UCUC CCCC CUCCC CGC GUCC С GC С Gl)C G С С GUCCC £ G CUC CU С Ci. l'^CGG GGGGC 'J G UC6GCGG3CGCUCCGGC GGCGGCC&f. WGlHill GC'JG G GGGCC С GC CGC С G ÛGGCCGGGGGU GOGGOC G ''i,C GCG GG/1. CCGC С С С С CGG UC GllCG ACC GCC С GC С 6 С Г Gi ".GC Л CUOC CÀC C6UG&C GGtiG 5cc С g СО A С С G G С JCC S CGAC gg CUGGGA ^GGCCCGGCÎ-GCijAAGGliGGC^CGGGGGGrvjCG'iCCL/CACCCGXGGCGCCGGACC ,:CCCGAGUGuÛACAÛCÎCCCCGùGCAGCAGCCCOCGCCGAÀuCCCbGGGCC &A&GGAG С С ggatiac CCÛJCGCCJCGCUCÙCCCCCCGGCCUCUCCCCUCCCGCXCCUCCCCGUGGGGI/GG CGGAAA GGGG G g'C SCU С GCG 5SGG С CGGC CCCCCCCUC ACOGOlGt^CMamcCACCCr.CCGiGrXUCCM^

CGG6C С CGGGGGGCC GUCC Ûc AC GCG С UcÛ CC CCCCCCUÙC UtG&GGVGG&GGG G AGC GAA GCC G AGCGCAC GGGGUC GCC GGCC " UG:J CGGCUACC С AC CCG -.С С СГн-'С UUGAAAC af. ù GAC С AACG ag IjC U AACSCGll GC GC G AOUC A GGG GCU С GU CC GAAA GCCGCCGIIGGCCCAÀ' 'GAAGÛUGUGGGCCCCGU' '¿CCGGGGCC С С CGAGG'

ga GG сс uc UCCAGUC CGC С GAGGGCûCAt С * с CGGC с с GU CUC6C С CG cc pcg С С gbggAGGU G G* ûcACGAG CCU ac ÔCGL1) AG5AC с С сл aa 5 ¿UGGUGAA с u a UG CCUGûGCAGG&CGA AGC С AGAÛG A V> CÛ С l;S СЧ15 GAGGU CCG UAG С GGUC CUG A С GO G С A A АШ^^ AAAGAC l'AAUCGAACC AU

. . . , I If , . . . r

cu^f.scwjuyccuccc&wgwt'ccc'^ a5g-m1agc uggcgcucuc gc акс с cjuiicicm cc w-tf cgc aû'jlwu * vc cgg'j aaa gc g aauga u'j aûag3ucu* "jgg GCCGVACtouaXMCCIjÂuXWAMCÙWAAAdGGGlW

WUGÛCSCUttGGGAUl^foGWCGCCt^GUUMGGCGCCCW^ 'AGACAGCAGGACGGUGGCCAUGGAGG

UC GGAAIJC С G C'J AA6G&G f G 'JGL'АЛСААС 1С АС С UGCCGAAiXAACU AG С CC ObGGG UG GAU G6C Gt UGG/GCGUt GGGC С СAU ЛСС CGGC С GUC GC CG6C AC-UC GGA-AC GGG AC GC GAGCG GC CG CG G jCÛCÊCCACCCCGGGG&CC&GG Г GG CGU С GGCU UCG G С C'^GC CG £ С G CC CGUCC ACC CC f MGGC'JCCCCC С GCGGC GUC GG GCC С GCG(i GCCUACGC Йс G^C&fcG i^b&AG&GCCGtÛCiC&G\>t AGCCUOGAAGC CUÀGGGCGCGCCiCCCGGGUGG AGCCGCCGC ^GCA WJAU UC

AAACGAGA^CUUUr^{^bAftGyr.GAGÂAÛGGyiJCCAÛGUGAAM^

WGGCroCCGUUBCCCUCAGCCGA'JCGGAÂCUGGAGyCGG3G(JUCA5AUCCC CGAAU CCGG agog&CGGAwAUClAAGl/CGGGC&C С С GCG AGGC(jl'CC AG ii g ç С G50 ад С &C Al С GAlJC С Г G6A GAAGC CGGCGGGAGCCC GGGG AGAGlJ U С UC (jluucûuiwgug AA CGGC* ГтС gc GC С UUGGAAU GGGUUCGCCCC GAGAGAGGG GCC GU6C С GGA mgcc UCG CGfiUUC С CGC G G с GL'C С x1« A GC i/c UCGC UGGC С CUbGA aaauc Г, G g6gga G AG gguf-u AAA UClf CGC йс С G G G С С GUAC CC A U AUC CGC aoc AGGUCUC с

GG 6 CGC Gi AGCGGG GClf CG G CG CGC ОС С GC GG С UG С A С G A G GC G CC GC с о С !>C С С С С С С С A

CCGCGGGGCCCCGCCGUCCCCCGCGUCGL'c lccgv'gç^ccccuccl|CCCl'lCCCliUCLfUCCCCGUCCGCGGGCGûGACGGGGC5(>GyGCGG'ïGCGùGCGCGCG

gcccaùgc-gcggcggg'jccâacct.cgcgccggccggagcggôgggaacccgcg'âg'c ccg5guggggggggg cccggacaccc ggggg gggccg gcggcggc gg c5acuc

UCGACSCGWCGGGCCCWJCCCGUGG^CGCCCCAGC^^^

0CCCCCUUU4CC0CCGCGGGCl»r/,GCr,iiuuCCCt^^^^

GCCUCûCairGGCCûGCGCCU«mGCCGCtVJAC^UW

CGu^Gi^ÛjÙu'UGCCCAGÙGCUCJGAA'lGUC.WGtlG-'ÀtWAUUCAWGAAGCrX

• I • • > . I 36 . • »

AlfC U AAUU.1 ^ Ç &C6C AUG A AU&G AUUAAC GAGAIJ '-'С CC АС UGUC С С tMC С U АС U AU CC AGCGArACCC AC AviC CAMJGG ААС& G G С WJG GC GG AA UC AG С GG GGA АА

(sAAôiCCCyr.UUriAGCUl'GÂCfCACUACJGUGGCACGGUGAAGGGGCGAÛoAG^GGtJûU AGAAU AAGUGiG AGG С С С С С GGCGC С С CCC CGUUC CC CG CGAGGGUCGGGG

tW^tAjaGUGGCCUt&cUûCC&CCG&ÙGAAAUACCAC^^^

. J9 ..... •

gccgaagcgcccuôccgcgcgcgcggccgggcgcG'Vccc gcuccggggac a&u &c с a& g ugg sgagw£hïa с ugggs с gg'.'a слс с t w с a алсс guaacgcagggcucc

UAAG GCG A GCU С A G !>G A G GAC A6 AAAC eu С Г С G'J&GAG^GAAGGG С -*ЛАЛ G С UCG С Iftf ÀûAUCUUû AUÙt/U CACUA CGAAUACAG/ CCGUGA A AGC&GGGC CUCAC GAt'l С С UUC U G A С С U<AJ ' iS(àGt<U ùu AAGC AGG^ GG'J GUC AGMA AGlW АС CA CAGGG Ai' ЛАСУ GGCUUGU'jGCGGC LAAGCGUUCAU AGCG Ai GCUUUOUGAIJ CCtWCGAU GOCGGCUCIMCU«;CAUUGUGAAGCA|^

CCUACU^vic.bUG\)GOUu'"ri)GrtAOGa;A. .;CùCl!CAGOACGAf.AGGWCCGCAGwkAGACAU^O&GUU>A\»Vebt'GGCUG»G'>AOCCMUGGÇGCGWGCUAÎ CAUCI>GUGGJAJ|JAUGACUGM-GCCUCUÀAGI,'CA GAA I j<" С CG С с С AGG с GGAACGAU ACGGC AGCGC С GAAGGAG CCI/CG5UUGGCC CCGGA UAGCCGSC С CCCC 6UC С

cijccccgi'ucggcggguccccgccucûi'cgcccccccgggcccaccccccgccca&gggggcggcccgcÀgcccuggccccaggccac ¿w С 1С ucgguaag с ag3gc ccg

gg aaacgg ggugcggcc-sâaagggggc cgcccucucgcccgucacgcu'o aacgc ac guûcg'jgugga^cjggcgcu ¿aacc a'î ucgu àgacgaccugcuocugû&uti

ggguuucgoacguggcagagcggcucccucgcugcgaucÛaujgaaagucagcccucgacacaaggguuugu

?йс.13. Полная нуклеотидная последовательность 2bS рРНК крыси. Определена при анализе ..зонированных фрагментов рДИК. Поращены s рамки последовательности участков узнавания реет-риктаа EcoHI и ВаиН1, по которым проводили реклонирование Фрагментов рДНК.

показано методом электронной микроскопии, для L-pKHK млекопитающих характерно наличие обогащенных G+C сегментов, образуоисих устоичи-г (? образования типа шпилок. Для идентификации сегментов этого типа и i.-pPHK крысы мы провели, во-первых, сравнение пуклеитидннх

1 £ 5 в

Рис.14. Распределение консервативных и вариабельных сегментов в 1.-рРНК дрожжей и крысы. Темные участки - более 80% гомологии. Положние и размеры ССЗ (с длиной более 20 п.н. ) показаны горизонтальными линиями.

последовательностей Ь-рРНК крысы и дрожжей и выявили несколько областей с высоким или умеренным уровнем гомологии (рис.14). Области с высоким уровнем гомологии образуют три зоны г координатами 1405 - 1945, 3401 - 3703 и 3388 - 4307 (по последовательности 283 рРНК крысы). Области умеренной гомологии включают 5'-концевой сегмент (около 430 нуклеотидов) и не слишком четко очерченную область в средине молекулы 28Э рРНК (2130 - 2740).

Области с высокой или умеренной гомологией перемелются сегментами различной длины, в которых гомология вообще не обнаруживается. В случае 283 рРНК крысы характерной особенностью всех него нелогичных областей является высокий процентный состав й+С (выше 75%), в связи с чем они получили обозначение йСЭ - (С+С)-г1с1) еев-гсегЛв. Положение восьми ясно очерченных ССЗ в 203 рРНК крысы т....же показано на рис.14. Легко видеть, что длина идентифицированных ССЗ составляет от 30 п.н. для ССЭ-З до 760 п.н. в случае ССЗ-1. В таблице 2 показаны четыре ССЗ, заменивших соответствующие сегменты в 253 рРНК дрожжей, но со значительным увеличением длины. Единственное исключение ССЭ-7 (3716 - 3' 39), который встроился внутри полностью консервативной последовательности. Поэтому, нельзя рассматривать ССЗ в составе Т.-рРНК крысы в качестве истинных вставок. Значительное увеличение длины некоторых ССЭ в сумме почти полностью покрывает разницу в длинах между Ь-рРНК крысы и дрожжей (1400 н.п.).

Не менее важно отметить, что в д давление к ССЗ с увеличенными размерами, в 28Э рРНК крысы могут быть также вычленены четко очерченные и довольно протяженные тракты, обогащенные остатками С+С, эаиеш.лшие равные им по размерам сегменты дрожжевой 253 рРНК. Два наиболее характерных сегмента этого типа в 283 ^РНК располох-й-

Таблица 2.

Нуклеотидный состав четырех наиболее длинных GC3 в 28S рРНК крысы.

Координат сегментов 28S рРНК Общая длина в п.н. Содержание ( %) Содержание G + С ( S )

G С А и

Целая 28S рРНК 4302 35,7 32,1 16,2 16,0 67,8

GCS-1 (445-1204) 760 39,5 42,4 6,7 11,4 81,9

GCS-4 (1946-2169) 224 43,3 39,7. 9,4 7,6 83,0

GCS-'î (2761-3320) 560 40,9 43,7 3,4 12,0 84,6

GCS-8 ( 4463-4687) 225 35,1 43,1 10,7 11,1 78,2

ны в областях с координатами 2479 - 2552 (73% G+C) и 3018 - 3884 (85£ G+C). Так как не для всех GCS в 28S рРНК крысы могут быть очерчены четкие границы, более точный анализ нуклеотидного состава GC3 возможен только для четырех самых больших GCS (таблица 21. Из таблица видно, что содержание G+C составляет в GCS от 78 до 85%, что значительно превышает таковое в целой молекуле 28S рРНК. Дополнительный анализ такке показал, что хотя во всех GCS встречается достаточно протяженные (10-20 п.н.) тракты смешанного состава (G+C), длина гомомополимерных б'локов, состоящих только из G или С, не превышает 9 нуклеотидов. Проведенный анализ послужил основой ■ для создания модели вторичной структуры 28S рРНК, которая была рассчитана позже в лаборатории проф. А.А.Хадхиолова.

5. ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ НЕТРАНСКРКБН-РУЕНОГО СПЕНСЕРА ПОВТОРЯЮЩЕЙСЯ ЕДИНИИЫ рДНК КРЫСЫ.

Выше ухе упоминалось, что гены рибосомчых П . зукариот расположены в геноме в виде тандемных повторов, причем последователь-ними, кодирующие предшественник рибосокных 111;"., разделены нетран-крибирус-мым спонсором (NTS'. Предполагается, что резкое увеличс— ,:ис дойны этого спонсора при переходе от низших эукариот к высшим У ;¡¡;,-.-r«-B oiki составляет всего 10%, а у млекопитающих - До 70% от . т -и <1лит; повторяемся единицы ) связано с необходимость« более . .. ■;.;■■:•. г-i-i у.чяпии генов у высших орг.-ыизмов . 1; связи с этим значи-..е..ü и.", i г; продотаг.ляло определение пук.леотндьои ппеледова-! ■;.!!!'■■'•. Ч П("1 Г 1Ж- ÜHU4 у ЧИСТ 1 О Í! Ш;", В1.ЫНЛ." НПО р,1. ¡ЛИЧНЫХ i-rpyi.'TVp

1«S

Т"Г

'l I '■■■'l Mlllllllllllllllj Jl

ИИЩМЩЦ

II 'feto

¿-Д-,

гт-

тттттг

t > к t st

к к •> ■

"ТГ-1 а

Рис.15. Структурная организация повторяющейся единицы рДНК крысы, а) вставки рекомбинантных фагов, их рестриктазные карты и фрагменты, реклонированные в pBR322. 45S - транскрибируемая область. Ь> рестриктаэная карта и положение част ■ повторяющихся последовательностей А и В, а также тандемного Mspl-повтора во встроенном Фрагменте плазмиды рРг5б. с ) рестриктаэная карта и положение часто повторяющихся последовательностей С и В, а также тандемного Sail-повтора во встроенном Фрагменте плазмиды pßrl51. Av - Aval; Ва - BamHI; Н - Hindlll; Не - HincII; К - Kpnl; М -Mval; Ms - Mspl; P - PvuII; Ps - PstI; HI - EcoRI; HV - EcoHV; S -Sail; Sa - Saul; Sm - Smal; X - Xliol.

ii

к

А к

4

2

ных и функционально важных - тементов этой последовательности, в том числе и локализация различных типов повторяющихся последовательностей. На первой стадии этой работы фрагмента ДНК рекомбинан-тных фагов \RrII й ЛПг1У, описанных ранее, реклонировали в плазми-де рВЙ322 по участкам узнавания рестриктаз ЕсоЕЯ и ВааН1. В результате был получен набор рекомбинантных плазмид, содержащих различные фрагменты повторяющейся единиц'- рДНК крысы, и составлены их рестриктазные карты, две из которых приведены на рис.15.

5.1. Блр! ! коротких повторов.

У.те предварительное рестриктазное .картирование позволило

т.п.«

T'f.........::r

<,S

1 '—*■,*Л_ / (Ti

j—ом

1

Рис.16. Реетриктазный анализ тамдемного Mspl-повтора. а) Электрофоретическое разделение в 1%-ном агарозном геле Sall-фрагментов ДНК фагов Mir II (2 1, КЕг2И \3), Mir311 (4!. Контроле: НХпйШ-фрагиенты ДНК фага Я (1) и МуаХ-фрагменты ДНК рВЕ322 (5). Фрагменты, различавшееся по длине, указаны стрелками слева.

Ы Электрофоретическое разделение в 4Ж-ном Г1ЛАГ фрагментов ДНК, образующихся при полной (3) и частичной (1, 2) расахзпленин Фрагмента Saul - HindiII ДНК пльзницы pftr56 рестриктааои Mspl. Контроль: Mval-tpar.'.iehtu ДНК pBR322 (4 1.

и ^нтифииироьать в NTS две области гаидеиньк повторен. При частичном рас шелленчи ДНК фага XBrXV рестриктазои Sail удалось обиару-

дать блок тандемиых позторов состоящий из семи коротких I около 50 н.п. ) повторов, расположенный в D-облясти NTS, прилежащей к i'-концевой последовательности reía 28S р^НК (рис.151.

Кроме того, при сравнительном изучении ДНК двух различных фа 'оз \RrlI и ARrV было обнаружено, что область рДН!С слева от участ :а инициации транскрипции (фрагмент EcoRX-HlndlII) ДЧК фага ЛНг11 (линнее соответствуюиего фрагмента ДНК ;\RrV. При рестриктазном шалнзе ДНК, выделенной из двух других ре;:омбинантных фагов ХЕг211 и ХКгЗН), содержащих фрагменты, гомологичные ДНК вставки ;ага ÄErll, показано, что у соответствующих SaZI-фрагментоз этих •рех вставок разница по длине достигает 0,9 т.п.н. (рис.16а). Детальное изучение фрагмента Saul-HlndlII (рис.ЗбЫ^с помощью часто ¡асшепляюкнх рестриктаз позволило обнаружить большое количество 'частков узнавания рестриктазы Mspl. При неполном расщеплении фрагмента Saul-HindiII рестриктазоя MspI образуется набор фрагмен-•ов, отличающихся по размерам на величину, кратную 130 п.н, рисЛбЬ), что указывает на наличие з данной-области нетранскриби->уемого спейсера блока коротких повторов. . /

Определение размеров фрагментов, фланкирующих этот блок ко-ютких повторов, и размеров фрагментов неполного расщепления поз-юлило составить рестриктазную карту этой области нетранскрибируе-(ого спеяеера. Блок коротких повторов содержит в случае ДНК фага iRrll девять повторяющихся единиц длиной по 130 н.п., причем саздый повтор содержит по два'участка узнавания рестриктазы MspI рис. 15b). Соответствующие обл асти ДНК фагов ХПт*211 и 311 содержат 1ять и одну повторяющуюся единицу. Итак, гетерогенность по длине в iTon области NTS сэяэана с разным числом копии (по 130 п.н.) в ■андэыном повторе. Однако, проведение гибридизации SaII-фрагмэнтов •еномноа ДНК KpHctJ с меченым Sall-фрагмйнтон плазмиды pRi'56 по методу Саузерна показало, что в геноме крысы гетерогенность по длине : области Мзр1-повтсров отсутствует. Нами ;5ыл обнаружен единственна Sali-фрагмент, содержавши 9 копия MspI-nonTopa (представлен в >аге ARrII и плазмиде рйг56). Таким образом, гетерогенность по хллне з данной области N'TS, но всей гидкмести, связана с делениями '.асти тандемнн;; ífenl-позторов по гомологичным последовательностям s процессе клонирования н размножения рекомбииантныя фагои в клетях K.C"lt.

5.2. Распространение часто повторяющихся последовательностей ДНК в геноме ьриси.

Число копий часто повторяющихся последовательностей или, другими словами, гомологичных им участков в геноме крысы, определяли по гибридизации фаговых колоний банка генов крысы с меченными [32РШК плазмид рВг19, рйг22, рВг24 и рНг56. В таблице 3 приведены значения повторяемости различных последовательностей в геноме и данные, на.основании которых они были рассчитаны. При этом средний размер вставки в рекомбинантных фагах принимали равным, приблизительно, 11 т.п.н. Размер г-=>ноыа крысы >N1 равен З.ОхЮ6 т.п.н. и, следовательно, 2x10 фаговых колоний примерно соответствуют одному гаплоидно, у геному. Легко видеть (таблица 3), что чи ло копий последовательности, представленной в плаэмиде рйг19 и соответствующей транскрибируемой области генома, совпадает с количеством ри-босошшх генов ( 200 ) в геноме крысы, определенных независимыми методами. В то же время число копий повторявшихся последовательностей, представленных в плазмидах р8г22, рИг24 и рйг56, намного превышает эту величину (таблица 3 1. Отсюда следует, что значитель-1я часть этих повторяющихся последовательностей находится вне семейства рибосомных генов.

Таблица 3.

Расчет числа коп: 1 повторяющихся последовательностей в геноме крысы.

Рекомби- нантная плазмида Число фаговых колоний Число гибри-диэушихся колоний Количество гибридизуюшхся колоний, % Число копий на гаплоидный геном

рйг19 6000 8 0,1 200

рйг22 ... 500 50 60 е 14 Зх.О4

рИг24 500 50 100 10 20 4х104

р!?г56 70 50 >50 >1x105

Для того чтобы охарактеризовать распределение этих последовательностей в геноме крысы, была проведена гибридизация рзстриктаз-ных фрагментов геномной ДНК с меченой 1згР1 ДНК. плазмид рйг19, р!?г22, рйг24 и рЕг56. , ¡К плазмиды рйг!.9 (транскрибируемая об-

ласть) гибридкзуетсч толь-7 с одним фрагментом геномной ДНК Напротив, при гибридизации с 132Р1ДНК пл?эмид рЯг22, 24 и -56 видно несколько достаточно интенсивных, хотя и размытых полос и высокий "фен". Это означает, что часто повторяющиеся последовательности расположены в некоторых участках генома в виде блоков и (или) входят в состав крупных тандемных повторов. Вероятно, они принадлежат к разннм семействам повторяющихся последователь! тетей, и лишь малая доля - к семейству рибосомных генов. Высокий фон в свою очередь указывает ла то, что значительная часть этих повторяющихся последовательностей разбросана по всему геному и входит в состав малокопияных, тандемно не повторявшихся областей.

Локализацию участков, гомологичных часто повторяющимся последовательностям, в нетранскрибируемом спейсере рибосомных генов

кЬ а Ь кь с а

Рис.17. Локализация в ДНК плазмиды pRr24 участков, гомологичных часто, повторяющимся в геноме крысы последовательностям ДНК. а и с - электрофоретнческое разделение в 1%-ном агарозном геле рестриктаэних фрагментов ДНК плазмиды pRr24: a) EcoRI+XhoI (1), ЕсоП! + HlnrtI II (2), PvutI < 3 ), PvuII + EcoHV (4); в) Xhol (1), Pvull* HIriclIII 12!, Pstl + Hindl 11 ¡3), EcoRV+Hlndlll (4), EcoRV+XhoI 15', FooRV' + Pvul I (6), i'coPV+Pstl (7). t> и d - гибридизация фрагмен гон, 1'шязаяичх на innрзвзллелозних фильтрах, с чеченом !"'?) тотальной дш; крисы.

1 2 3 4 1 2 3 4

1234567 1234567

крьсы проводили по гибридизации меченой тотальной ДНК крысы с рес-' триктазными фрагментами ДНК плазмид рйг5б, рйг22, рйг24 и рНг151, связанными на нитроцеллюлозных фильтрах. Ряд фрагментов ДНК плазмиды рйг24, образующихся при действии рестриктаз ЕсоЙ1+ХЬо1 (два фрагмента по 0,75 т.п.н.), ЕсоК1+Н1пАП1 (оба фрагмента) и Руи11 (оба фрагмента), гибридизуется с меченой ДНК крысы (рис.17, а и Ь>. Из этих данных следует, что повторявшиеся последовательности расположены вблизи обоих концов вставки рйг24 (рис.15с I. Для уточнения положения повторяюшкся последовательностей использовали другие рестриктазь и показали, что гибридизуется только большие фрагменты, образующиеся при р"~шеплении 1.-рами рестриктаз: РуиП + Ш.шШ1, Рягх + НтйНХ, ЕсоВУ + Н1псШ1, НсоЙУ + руиХI, ЕсоНУ + РБг1 (рис 7, с и (1). То, что мелкие фрагменты, образующееся при действии этих рестриктаз, не давали гибридизации с меченой ДНК крысы, позволило установить, что в рДНК между участками узнавания рестриктаз Hind.HI и РсИ (РуиХ1) не содержатся часто повторяющиеся последовательности (рис.15). Аналогичные результаты получены

Рис.16. Локализация в ДОК плазмиды рйг56 участков, гомологичных часто повторяющимся в геноме крысы последовательностям ДНК. а) электрофоретическое разделение в 1%-ном агарозном геле рестриктазных фрагментов ДНК плазмиды. рйг56: Н1п<Ш (3!, ЕсоН1+ЕсоНУ+Заи1 (4), РуиН (5). (II Н1п(1Х11-фрагменты ДНК фага Г (2) Муа1-фрагментч ДНК РВИ322.

Ь и с) гибридизация фрагмитов, связанных на нитроцеллопозных фильтрах, с меченой зг • тотальной ДНК крысы(Ь) и с меченой ДНК плазмиды рМм14 (последовательность элемента В2 мыши) (с).

'2345345345

^ Ь

аз.1-

6.64.4-

1.01.9"

Р

1.1

0.9-

> ё & о

& £

;ри изучении гибридизации пестриктаэных фрагментов ЛЫК плазмидн |Вг56 с меченой ДКК крысы (рис.16). В этом случае часто повторяю-¡иеся последовательности располг чсены впутри двух областей нет-анскрибируемого спенсера, ограниченных участками узнавания рест-:иктаз EcoRI-PvuII (область А) и ЕсоНУ-Заи1 (область В) (рис.15Ь). Экспериментальные данные по локализации часто повторяющихся после-ювательностея в ДНК плазмид рЯг22 и рйг151 не ппизодятся, их по-а

кЬ

2 3.1

12 3 4

|о 12 3 4

12 3 4

5ис.19. Локализация в ДНК фагоя Ш"П, IV и плазмид рНгЗб и рйг15!

взаимно гомологичных последовательностей и областей, содержащих последовательности гомологичные элементу В2 мыши. Злектрофоретическое разделение в 1%-ноы агарозком геле: а) фрагме-1тов ДНК фага \RrII, расщепленной ЕсоР1+Крп1 (1), и фага \RrIV, >асшэпленноя Есой1+ВапШ (3). Гибридизация с элементом В2 (2) и )Кг56 141. Ь) РииП-фрагиентов рНг!51 (2), гибридизация с мечеными ЕсоМ-ЕсоНУ »-фрагментом рйг56 (3) и элементом Е2 (4). с) фрагыен- ■ гов рПП51, полученных растеплением с PvuII+EcoRI+SaaI'^HlridIII 2). Гибридизация с мечеными (Есой1 - ЕсойУ»-фрагментом рйг56 13) 1 элементом В2 ''4'.

ложение в областях С и В.было установлено с помощью тех же методов' (рис.15Ь). Также ^ыла проведена характеризация часто повторяющихся последовательностей с помощью перекрестной гибридизации. При гибридизации рестриктазных фрагментов ДНК фагов ARrll и \ErIV с 132Р1ДНК плазыид рМшЗ1, рМт14 и pRn20, содержащими последовательности В1, В2 мыши и В1 крысы, обнаружено, что только фрагмент EcoRI-Kpnl ДНК фага ХНгП, расположенный слева от участка -нициа-ции транскрипции (рис.15), гибридизуется с последовательностью В2 мыши (рис.19а). Более точно область ДНК, содержащая эту часто повторяющуюся последовательность, локализована по гибридизации фрагментов ДНК плазмиды рВг5б г [згР!ДНК плазмиды рМаН (рисЛВс). Она расположена между участками узнавания рестриктаз EcoRV и Saul и соответствует последовательности В (рис.15Ъ).

При перекрестной гибридизации меченой 132Р) ДНК плазмиды рйг56 с фрагментами ДНК фага ARrlV обнаружена гибридизация только двух фрагментов ДНК этого фага, соответствующих вставкам плазмид pRr22 л 24 (рис.19а). Более точно области гомологии локализовали после гибридизации меченого (EcoRI - EcoRV)-фрагмента плазмиды pRr56 (область А) и меченого встроенного фрагмента плазмиды рМмН 'элемент Е2 мыши) со связанными на фильтре фрагментами ДНК плазмиды pRi ^51 (рис.19, Ъ и с). Анализ полученных данных показал, что последовательности гомологичные элементу Е2 мыви находятся в области С (рис.15с), а гомологичные области А в обеих областях С к D. Следовательно, повторяющиеся последовательности, расположенные по обе стор ш от транскрибируемой области, содержат гомологичные участки ДНК.

5.3. Определение нуклеогидних последовательностей областей HTS., прилежащих к транскрибируемой бластм повторяются "дияицы рД}!К и содержащих часто повторяющиеся в геноме последовательности.

Нуклеотидные последовательности >..;ределяли по методу Макса-ма-Гилберта с использованием большого набора различных рестриктаз. Стратегия определения нуклеотидной последовательности Фрагмента ДНК, содержащегося в плазыиде pRr56, и установленная нами последо-вател ность длиной 2501 н.п. представлены на рис.20 и 21.

г-1-,--—т-,-г—

5 10 15 70 JS К!)

15_I_ W ^ 9 ? 5 вв ? ^

Рис.20. Структура повторявшийся единицы рДНК крысы и положение фрагментов рДНК плаэмид рКг56, 22,"24, 151. Стратегия определения нуклеотидноа последовательности суОфоагмента HcoRI - Saul плазмиды рйг56. В - BanHI; С - Cfr6Í; С* -Cfrl31; В - Ddeí; Е - EcoBI; Е* - Eco47I; Н - HindIII; h -Hlnti; M - Ms vi; ЯУ - EcoRV; S - Saül; s - Sau3AI.

7«GKCGCriGCCTAeCAAG7GCAAGGCCOGSCTOGkcCCitCTCCGAAAAAAAA^«A^^ АААГАМСМАСАААСМ>£АМСЛМСАССА7САПТО^ 7CmACC7nC7£«rG!kAMCTC/.Gh7A»J7A.«hnm7re CTU'ATC77K7GAGGTCAfcTG7C№iC/AXI\;GCieCO.ACC«TCC^^

А7А7АымчАтттссгпс7ПтстггстгстпЫеА5шсссАбС7б^^

7TrG7CnAC7G7CTC7STCTG7C7C7GTnG7C7C7G7C1C7CTttCTiSTCTClGro^

Т0ТС75Т7КПМТС7СА&МСАСТ4С7СтеСмта^

GSCAGA7ATD£CCAy«AGGWS7AC£ACGGAttG3TtAAAAO^KACC7a^

CAonAGCAAWGGCAGCsfccmclCCGTCGrSASC^^^

CCGATGiy~^dG&AGGCGGCGT7GTCG77G77CTCT6ncC7CSCCCCCACCGC^

GrArCTCTGrGTG7aGGTSG5GCAG5M£C;£GIM^"KGACGG«S<MGC №6GSGACAnA«7Mtt«nAA7GCATmCMSUGCCAC.A^^

AGi7ArCCAG7ACCACCATfcCCACTnGTT7GTT7G1GGGT77GTTrGCTTGC7TGTTACATTAGT7TCA7CCCAAGT7AA7AAT7A7A7AT77T7TT7C7AIGCACG7 . . . . ¡7 i < . i . i

. . t

71GTTCGGGAC7GCCGAGAACGGCTCAGCGG7GAAGA.uCACTGA.CTGCTCTTCCGA7C7AAG7TCAAATCCCAGf AACCAC^TGG7GGC7CACAACCA7C7G7AATGGAA 7CC7C7CCTTG7G7GnGiUGArAG7GACAGTG7GCTCA7AAM7AAATAAACAA7AAAAAA7A7G777GAAGATTAAAGAAAAAACTC7CTC7C7C7C7C7CTC7C7C7

2! , , 31

G7C7CACACACACACACACACACACACACACACAC;UATrA\C7rc7G7AA7MAMT£M7GTGACCTfCA7GATCAMnCCA7Afir,CAA7AGGAACCAGAGAGAACA CA7GTC7G7AAA7AAAAGCAGMrCT7T7C7GCT7fCr7f7uT7?7£CC7TAAGG7ACG^7C7T77f.G7A7AGC£CA.flG^ fAGCCTCAAGHCACAG£GG7CC.*£'iC7G££rGCCTiGGCCAC£CACACAGG7r.7£7CTGCTGAG^^ CACCACATr^C7CCTG.AG.^TCCAAGi7T7GACT77AAAVAA,VkAAAAAAAAAA7TC7GACAGCATA£AGGG7AGCCifiA

Рис.2!. Нуклеотидная последовательность U-области NTS рЛКК, расположенной слева от участка инициации транскрипции. Начинается от участка узнавания рестриктазы EcoRI <см. ряс.20).

©L

i 2$S

J_

t S

—*— 0.5

t.s

—7—

го

2,5 ¡Ci

Рис .22. Стратегия определения нуклеотидноя последовательности Фрагмента рЛИК. плаэодды plirl51. Общая последовательность разделена на два субфрагмента (22 и 24). К фрагменту 24 ^лева присоединен <BaoHI-BaisHI )-фрагмент. А - Aval; а -Avail; В(Ы - BamHI; С - Cfrol; D - Ddel; Е - EcoKI; Н -Hindlll; h - Hlnfl; ш - Mval; S - Saul; S^ - Sail; s -Sau3AI; T - Taql; X - Xhol.

Часто повторяющиеся последовательности, расположанные справа от транскрибируемой области, были реклонированы в плазииды pRrlSl, 22 и 24 (ри .22!. Плазмида рЕг151 содержит З'-концеауо часть гена 28S рРНК. и прилежащую к неп D-область NTS длиной около 4 т.п.и. Стратегия определения иуклеоти'дной последовательности этой области HTS и установленная нами последовательность с общей длиной 4025 и.п. представлены, соответственно, нг рис.22 и 23.

5.4. Компьютерный анализ нуклеотидних последовательлостей НТЗ.

Подвижные элемент генома. Комт ;теркый банк нуклеотидных последовательностей (ЕМВ1. - Гейдельберг) был использован для сравнительного анализа последовательностей МТЙ. Удалось идентифицировать 6 подвижных элементов генома, относящихся к семействам последовательностей В2 и II). В то-ед время не удалось найти гомология с

CfCCGCSCGCCGGSfCGCCMCCO/.CKCCKCCC-CACCCGCC ACCCGCGCGTOGGTGGCG7GGTGGGGGGGGCG7CTCTCTCGC7CCCGCCCCCACCACS7ACG CGKTCtrCCGTCTttCGACGiCGaCIGiaCITCTabclCTITCtinCCTCCCGGCGACGGGCGkcCTCGGCCCACCCGrGCTrCGncCranCGrCrCCTT CCCGGCCTrGGCCAAAGCCGGTGTGGiGTGTCGCGGIGGAGGTGTCGCGGCGGTCGGTGGTTGGGTCT 4CGCGCG7GGA7CT»TTGC7GCCCCCCCCACACACJCA.M T71GGAAAGAAAAGCMCT7GATCGCGACCGCGCGCCCG7CCCGACACGG(iGGG"i _CTTCTTGCCCGGAGCGCGGGAGGGAAGAAGGCGfTCCCGGCCTGTC7TCTCTCC C?nCTCTTCTTTCCTCTcfrTC7fCTCTfc7WTC7CCGTTCCCGCGCCGGCGCCAT7CCCGCGCGCCACC£ACGGCGCGTG*ICCGAGGAGGCGITGCACCCGGAAGCC 7CCTTTTCCTTTT7T7CCGGCCAACGGG(£TAGACCAGT^C7CCCGGC(^AC7C7GTCTT7TTT7CCC7CT7GAAGGACGGTC^^

CGbGGGCCCCCCCGCGCGGTCGACTAGAT.'xCGGCiTTGGACTCCTTTTHTTTnTTTnnTTTITrilTTtTCTTTATATGTtATATATACTATATATATATATCAT , • fl < . > i t . , • ATATATACACACACACACACACACACACACACACACACACArAAACTCT77CC7C7GA!iC/7CTC^GAGGTCtiACCAGTACTCCCTGCCGGGACTCTGTCTTTnTTTTT

7TTfCCTC^T&A&GGAGGTCGACCAGATGTCTGAAGTAKCG&CGACGAGCGCCC7CGCftCGGC777GGACTn^

ATCTATCTATCTiTCTATCTATCTATnATCTATLTATCTGTATCCArGTATATCTTTcfTTCTTCTGAGATTCiCGGAG CGACCGGTAGTTCCGACGGCACTTTGCC УТОЛ7СА7ГССГС7СШП0таСАС57АГгА7СМ757ССС7ААСА7А70ССС6757АСтС7ССА7СС^

■ ■ ■ i i ■ i i i J • ■

T7AA7GATA7A7CTATAA7ATAlAA7A7ATAA7A7AAAAAATATAnATATA7CGACCAG7TGGAAAACGAGGTCGAC7^G7TGTCCA7bCCTTACATACAAAGCAGlGA .

CTC57AC77CAr,TAA7ATGATTlr7T7TGTTTTTbTTTCTTTCTCTTTT7TnCG6AGCTGGGGGACCGAACGCAoGGCCTGCCiTCCGCCCCCCnGGCT^

C/^17CTCTC7crir£7C7t7C7CiCT£TCTC7C7C7C7CTCTCTC7C7C7C7C7CTCTC7C7CTC7C7fTC7CTG7G7GrG7firGr57iACAflMGAGGGTCGG7CAGT

TGTCCCTTTCAnATMGCAAACTGAAG&7ATCMTCGGTCAGCTGAACAGnCTCTGC7TTTCAn&TTClCACAATCTCTCCAGTCGTATTTT77ATW)A7TGAA7A . . . i 17 , . t > . <

TTAMTATA7G7Grc7G75GGGGGG7GTCflC7GT£TGTGCA7GAGTTCCTAGGTACrW\CC7£ACGGAGGGAGGGAGGGAGGAGGGAACGAA^AAGGGAGSGAGGGAAS

GAAG5TCGACCAG7CASCcfccrr7C7rrir777AA^77ATTTCCTcfTCTTTTCCAGAi.nAnTAfTT7GTuACTATGA67ACAcfGTAACrA7C^M5AWCAC .. 19 ....... <

CACiAAGA^iGGCCTCACCCiTrACCGA7GGr76GGA.GCCACCATGTGCT7GC7GGGGA7TGAAAACTCAGGACC7CTGGAGW,GCGGCCAGGGCTC7TAACCGC7GWACA

. 1Q t . i , . i i . •

TCTCTCCAGCCCTCTTTT7fCAG'iT7TAAATAA.GCC7CG77AG7TGAGCGA7C7GG6GAGTTGCTT7TCT7TCCAATT76TG7GTGTGGGGGGGGCA6CAG7GGATCCAG

ТАТССААПс'сССтСТСГССДТААСАТСГГАтС;«ГдлаГ5КГСгЛ7ПСД7П^ GGTCCA7&^£AGCGA.WWMTAA7ATnGGC7/GG7C7A7A77CC77CA7777A7T7CTCT77GTr7CnGTCCTTTC^

GTArCACO\CCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCGA577G7AGGWTCCA^A7GGGCCCCTGTCTGTC7GCCTG7CT£A7T

CAnC6rGT77A7TTA.MCG7CC7CCAATGATGGH6TGCAGiGAAAGAM7fKG7GCCCGAGC7CGAGC7CCrGCGCAMCACACACACACArACACAC^

ACACACCACACGGWGGGGkwGGffiGGTGAGGAGGAGGAC«GGAGGAG&U^

TT7£A&GA7TTGAAGGTnAuCCCTGCAATGnCCTTACMCT7AAAAACTT7GTGACACACA*AGCGA7AT7CAn77Cft^

rGGCAGAtrArA7C/£CCmGTGGAUljaCCTO7A7Tr>CmGCCCTACTCTGCICTGCrcTGCrcrGC7CrGCTC7GC7C«C7'' *'VfAGACGTGHTTTGC777 Г67ГгеШт7ПС-П7к116СТ1«таСТС1ХТ$СА7САСПсктСТССтСК

A=GCCfXACGMTtrTr777CTIM^CrGAeArjACA7ACCAGCCGA7TTGGAGGAAAAGA7ATKC7CTCTCCC7C7CCCraC7C^

CC7CCC7CCCrCCCTCCC7CCC7CC77GACCCA77TTCrCTCTTrCCCGATACACTCAA7AAATTTAAAG7AAATCAATGAAtCAAGTC7C7AG7AA77TA7T7GTTGGG .1? . . . . . ■ < • • 3J

A7TlATTrGtTuGAAAT7ArCCC7CCACACC7TCGCCCC7CCCCCCACCAC7CGAGGA7GTC7CCC7GC<iGGGG6GGGCGGGGGGGTTGGG7GGAC7CG7G7AGf»CA7AC

CTC7r£7CCCTTCGCmCCGG7CCACTrCGC7ttAGCAM£CTMC7CnTGGAMT(^

CACTWJTCGCTCTCACrCAGCC7CGCCC77GACA5C7CAGKA7GTC7MA7CCGAA7GTGGGCAA7AT7TAr.ATGAC7TGACTIGG7GCrTCTAACTf7TTC7C7C7C nATTTTnfnTC7TC7T7AG7ATTn7TTCT77ACCC7ACMAC7GCACAC7GCACC7GTCnCGGACACACACCAG^TCGA7CCCA7AACAGACGGfTGTGAGCCAC CATGtMTIBAAGTCAGGACC7CTGGAGGAAtACGGTCAGMCTCn/«C7GCTMCICCA7TAmrXGAnAAW TKGGACCTCGG£ACC0A»CCCAGGGCCinGT!OTCC7AGGCAAGC^^^

AAGAAAnAAGCATCnAAAACCA7AGGCA7G7tCATCCCC7CCTCA7TCS77CA77CCC7CGCTCA77M77CAT7CA'T7CAnCAG7CAGACAGACA6ACAGACAGAC

. . . 4Э < •

AbCAACCAiACTCTAGCCTrTAACAAAGCAAGAAAtjCA7ACCC7GC&GGACGCACAGA7GAA77C

Рнс.23. Нуклеотидная последовг-ельность В-области NTS рЛНК, расположенной справа от 3'-конца гена 28S р?НХ. Начинается с первого нуклеотида, прилежащего к З'-геокиу гена 282 рРИК. Лза участка ВавНХ внутри рДЯК, встроенной в pPtrl51 н раз-деляюшие ее на'фрагменты, клонированные в pRr22 и pSr24 Юм. рис.20), имеот координаты 20S3 - 208В и 2382 - 2337. Подчеркнуты два прямых позтора, фланкирующие элемент ID.

элементами типа 81, 11 и snPNA подтипов Ul - U6. Три из шести, обнаруженных нами подвижных элементов, расположены в U-области МТЗ, прилежащей к участку инициации транскрипции, а три других з D-об-

ласти NTS, находящейся справа от гена 28S рРНК (таблица 4). Они' могут быть сгруш. .рованы попарно: две парь из элементов В2 и одна из элементов ID, причем в каждой такой паре один из элементов расположен справа, а другой слева от транскрибируемой области. Элементы В23 и В24 (таблица 4), гомологичны каноническим последовательностям элементов В2 крысы и мыши на 85S и ориентированы в противоположных направлениях. В другой паре элементы В22 и В25 (таблица 4) значительно больше дивергировали от канонической последовательности и ориентированы в одинаковом направлении. В третью пару можно объединить элементы IDj и IDg, идентифицированные как члены семейства ID чрысы (табл1.^а 4). Эти последовательности наиболее удалены от транскрибируемой области в обоих областях NTS и ориентированы в противоположных направле' tax. Оба элемента IB высоко консервативны и практически идентичны между собой. Их гомология с канонической последовательностью составляет 98%, Элемент IDg, расположенный в правой части NTS (от транскрибируемой области I, фланкирован полностью гомологичными прямыми 15-члень..ми повторами, в то время как к элементу IB^ с обеих сторон непосредственно прилежат две микросателлитные последовательностями типа (GTAA)n и (GCAA(п (рис.21 ). Вокруг всех четырех эле-ментоь ¿2 не обнаружено прякых повторов, даже со значительной степенью вырожденности.

Таблица 4.

Характеристика подвижных элементов генома,-обнаруженных в NTS повторяющейся единицы рДНК крысы.

N п/п Тип Координаты Общая длина в п.н. Процент гомологии с каноническими после-дова-ностями Е2 и ID Ориентация

1. • ID U 67-182 96 98 ->

2. В2 U Ыб - 957 152 51 <-

3. В2 U 1877 - 2066 190 65 ->

4. В2 В 1799 - 1992 194 85 <-

• 5. В2 В 3524 - 3703 180 65 <-

6". ID В 3719 - 3817 99 98 i-.-

Проекте последовательна 'ш i микросателлиты) и лолилуриновые/ полипиуитдииовыв блоки. В этих же областях NTS, фланкируотх транскрибируемую область, обнаруж но множество "простых последовательностей" различных типов и длинные гомопуриновые (гомопиримиди-диновые ) блоки, которые занимают около 20г в этих последовательностях. Данные о простых последовательностях разных типов, часто называешь также микросателлитами, обнаруженных i NTS повторяющейся единицы генов 155 и 28S рибосо.мных РНК, приведены в таблице 5. Анализ динуклеотидных простых последовательностей показал, что из четырех, возможных типов в NTS представлены практически только, два: !AC)n/iTG)n и (AG)n/(TC>n. Самокомплеыемтарная последовательность (АТ)п найдена только в одном месте NTS в его правой части около одного из Sail-блоков (D 747-776), в то время как другая самокомплементарная простая последовательность (GC)n вообще не обнаружена в исследованных областях NTS. Из намного более многочисленных три-нуклеотидных простых последовательностей в NTS рибосомных генов обнаружены только два типа: I АСОп и !АСС)п.- Обнаружены также несколько тетра-, пента- и гексануклеотидных микросатег -чтных последовательностей (таблица 5>.

Многочисленные полипуриновые/полипириыидиновые блоки (с длиной более 20 н.п.) обнаружены в обоих областях NTS. Часто эти блоки состоят из нескольких типов moho-, ли-, три- и тетрануклеотид-ных простых последовательностей. .Длина некоторых из этих блоков довольно значительная: S8 н.п'. в случае блока с координатами (Ü 1340 - 1437) и 124 н.п. tU 1706 - 1629). В основном они состоят из простых последовательностей типа tAGln и (AGGG)n, перемежаемых и окруженных мотивами AG. Аналогичные последовательности обнаружены и в правой области NTS (D) с длиной около 70 н.п. и координатахи (D 1434 - 1505, » 2555 - 2621, D 3037 - 3107). В заключение мояно сказать, что общая длина простых последовательностей и полипурино-вых/полипиримидиновых блоков составляет около 24S и 22%, соответственно, для левой и правой областей NTS. Различные типы простых последовательностей также обнаружены в области NTS рДНК человека, прилежащей к 3'-концу гена 28S рРНК (Ла Вольпе и соавт.) Это позволяет говорить об общих принципах организации NTS млекопитающих.

Облаешь тандемного повтора .(Sali !.. Ранее с использованием рестриктазного анализа в области NTS, прилежащея к 3'-концу гена 26S рРНК, был обнаружен тандемныя повтор, содержаний семь участков

Таблица ü.

Характеристика простых последовательностей (микросателлитов), обнаруженных в KTS повторяющейся единицы pii'iS крысы.

Тип*

Простая последовательность

Обкае число единиц, в блоках, j Обже --------------1--------;;o;;n'-iCCTCt>

Область "U"

Область "D'

Mono (А )п/( Т)п 21:19 30 14:13:10 10-

(Gin/íOn i 9 3 4

Дм ( АС >п/ ( TG )П 15:5:16 5 17:7:20 65

(ЛТ>п — 14 14

(GC)n — — —

(АС. In/(ТС in 8:12.26:24:14 35 113

Тетра (TAAG)n 12 — 12

¡АТТС )n — 5 í>

(AGGGIn 10:7 8 25

(TCCCIn — 14 14

1СAAA)n 10 — 10

(CAAOn EL . — b

t ATCT )r¡ — 15 15

(CAGA>n 5 5

Пента (CTCTG1n — 6 6

(ATTTT)n — 5 5

Геке (CTCTGT)n 7 — 7

* - в таблицу вклочены только блоки длиной более 10 нуклеотидов для моно- и 5 единиц для ди-, три- и т.д. Точечные мутации -считались допустимыми.

узнавания рестриктазы Sali. Анализ определенной нами нуклеотидио!*. последовательности правой части NTS подтвердил наличие в этой области 7 участков узнавания рестриктаэы Sail в районе с координатами 630 - 1770 и.п. (рис.23!. Однако, ясно выраженных та^пемных повторов обнаружить не удалось. Только детальный компьютерный поиск гомология позволил идентифицировать восемь гомологичных последовательностей , семь из которых содержат участок узнавания рестриктаэы Sali (рис.24). Другой характерно., чертой этой области является наличие гомополиыерных блоков Тп рядом с некоторыми из Sall-боксов. Между ЗаП-боксами обнаруживается также много простых последовательностей типа (АТ)п, (АС)пи (АТСТ)п. Таким образом, вряд . ! можно говорить об чст'чно« тандемном повторе в этой области NTS, Аналогичная структурная'организация обнаружена и ь случае

iT3 ыышм ч человека, прилет ах к 3'-концу гена 29S рРНК. Б них 'акле обнаружены комбинации нескольких qi1I-6okcob в сочетании с юлияиримидиновыми трактами (Груы>,.г и соавт., Ла Больпе и соавт.).

3.5. Структурно-Функциональная организация транскрмпвдн.

области теркмнациа

Итак анализ нуклеотидних последовательностей двух фрагментов 4ТЗ, прилежащих к транскрибируемой области рДНК крысы показал, что с настоящим тлндемнкм повторам относится только Мзр1-повтор; Область, так hаоьшаемых, Saîl-позторов не содержит истинных тандемах повторов, а наличие нескольких уч&сткйв узнавания рестриктазы Sali связано с многоксатноп дупликацией относительно короткой пос-■едовательности, включающем и участок Sali (рис.24). Следует отметить, что первая из этих последовательностей (положение D 532) не ¡одержит участка Sali, .«-за точечкой замени. Другой характерной »собеиностыи этой области MIS является наличие Т-трактов, в некоторых случаях правильнее сказать полипиримиднневнх бл- сов с нерегулярной структурой (Т, On, перед большинством Sall-боксов (в 15 - 25 к.п. леьее). Именно зчутри одного из таких Т-трактов (1) 560 ->66), расположенного перед первим Sall-боксом, был локализован S'-конец 453 пре-рРНК при проведении эксперимента и условиях In ,'lvo ( Э 563 - 365 ).

Примерно в TOJKs самое вреня в лаборатории Ингрид Грушт были доведены эксперименты по локализации участка терминации транск-

!.W4ib Т (i-6)

1 2 о 4 5 G 7 8 10 12 14 16 1С

Термннация

A G <; T С G A С с А G ( Л/Т )N T С с G транскрипции In vitro

TÎ [G G G T A G A С с А G TAC T С с С л-

Т2 |с с G T С г; A с с А i.» A T G T с с G +

та С с, G T С G A г* ъ т i А G ATA с с G G -

Т1 A G G T С G A KJ с А G TAC т с С С -s-

Т5 |A G G T г• a A с с А G ■A T G т с т G CL-

Т6 ¡A G G T с nr A с с G G TAG T T с С +

Т? |A G G T с G A с г А G T T G T с с А -

га 'A G G T с G A г* с с Л G T С Л G С с Г -

>мс.24. Сравнение нуклеотидных последовательностей ЗаИ-боксоа крмсу и ниши. Биологическая активность Sail-боксой крмси.

рипции в NTS рДНК мыши, И.в этом случае участок терминации транск- •' рипции также расположен внутри Т-тракта в 565 н.п. правее 3"-конца гена 28S рРНК. И непосредственно за ним (положение 589) расположен первый из восьми полностью гомологичных Sall-боксов, обнаруженных ь NTS повторяющаяся единицы рибосомных генов мыши (рис.25). В нескольких последующих работах Грумыт и соавт. было показано, что все Sail-боксы в NTS рДНК мыши функционально равноценны, связывают один и тот же белковый фактор и одинаково эффективно осуществляет терминацию транскрипции. Сравнение нуклеотидных последовательностей Sall-боксов крысы и мыши показало, что в отличие от высоко гомологичных Sall-боксов мыши в случае красы наблюдается определенная дивергенция между разными повторами, однако следует отметить, что каноническая последовательность Sail-бокса крысы идентична с последовательностями Sall-боксов мыш (рис.24).

Для того чтобы установить, имеются ли функциональные различия между отдельными Sail-боксами крысы М.Кермекчиевым совместно с лабораторией И.Груммт были проведены эксперименты по терминации транскрипции на отдельных Sail-боксах рДНК крысы с использованием субфрагментов ллазмиды рВг22, содержащей З'-концеву» часть гена 2"S и фрагмент NTS обшей длиной 2036 н.п. (рис.22). Отдельные рестрт,.аэные фрагменты рДНК NTS подсоединили к промоторной последовательности рДНК мыши и порученные гибридные ллазмиды использовали для изучения эффективности процесса терминации транскрипции в клеточных экстрактах, полученных из асцитных клеток мыши. Полученные результа i суммированы на рис.24. Легко видеть, что замена остатка С на Т в 9-ом положении Sall-боксов ТЗ и Т7 приводит к их инактивации, также как и три замены в положениях 13, 15 и 16 инак-тивируют Т6, что вполне согласуется с данными о заменах в Sail-боксах мыши, приводящих к их инактивации, полученных методом направленного мутагенеза (Груммт и соавт.). Однако следует отметить, что изучение эффективности терминации транскрш.аии на отдельных Sali-боксах крысы проводилось с использованием гетероло-гичного экстракта (клетки асцита мыши) и, следовательно, реальная ситуация в условиях In vivo может быть несколько инок.

Сравнительный анализ фрагмента NTS рДНК человека, прилежащего к 3'■-концу гена 28S рРНК, нуклеотидная последовательность которого била о ределена в работе Ла Вочьпе и соавт., показал, что и в этом

иыкъ

2Ö3 *l

крыса 263

человек

Рис.25. Сравнение егрукгурдоя организации области терминации пов-

случае на расстоянии около 500 н.л. от 3'-концатени 2ÖS рРНК обнаруживается блок из пяти участков Sali. За'счет дупликации Фрагмента NTS длиной около 700 н.п., содержащего три участка Sali из пяти, что характерно для отдельных повторяющихся единиц рДНК человека, блок из трех Sail-боксов может быть повторен один или два раза в NTS. Сравнительный анализ . нуклеотидных последовательностей, окружающих участки Sali, и проведение экспериментов по изучению терминации транскрипции в условиях in vitro позволили выявить каноническую последовательность для Söll-бокса человека 1рис.26), для которого харак^рна высокая степень гомологии с Sall-боксаыи иыши и крысы. Любопытно отметить, что остаткам в положении 15 - 16 Sail-боксов мыши и крысы соответствует практически идентичная последовательность в Sail-боксе человека, но расположенная слева от участка узнавания рестриктазы Gall. По мнению Груммт, показавшей, что из пяти Sail-боксов человека терминирующей активностью обладают только два, основную роль б связывании фактора терминации играет 11-членная последовательность, общая для Sail-боксов мыши, крысы и человека. Консерватизная последовательность TCCiC/G) с координатами 1 - 4 не играет существенной роли в проявлении терминирующей активности в условиях In vitro.

Таким образом, можно говорить об общих структурных особеннос-

торяющихся единиц рДНК крысы, мыши и человека.

Крыса/мышь

Человек T С Ctu/G) N 0-3

AGGTCGACCAG GCGTCGACCAG

(A/T It! T С С G

Рис.26. Сравнение нуклеотидних последовательностей Snll-боксоа крысы/мыши и человека (канонические последовательности). Обведена рамкой 11-члеина.я последовательность, существенная для проявления терминирующей активности з рДНК человека и обыач для рДНК. человека,- ыыыи и крыса.

тях организации района HTS, обеспечива' чего терминаци» транскру.л-ции в повторяющаяся единице генов 1SS и 283 рРНК цлекопитаюших.' 1) терминация транскрипции, происходит не у 3'-конца гена 265 рРНК, а на 360 - 580 к.п. правее внутри NTS; Ii) характерно наличие нескольких (5 - 6) высоко гомологичных и функционально активных Sall-боксов, необходимых, но всей видимости, для надежно* терминация транскрипции, чтобы при "проскоке" одного из первых Sall-боксос избежит' считывания РНК со всего HTS, длина которого составляет более 20 т.п.н.

Ь.6. Структурио-фуикционалы'лл организации сбя&сти ilïii, ьрклеха-киза к участку инициации транскркнцип.

Нукпеотидные последовательности U-обдастм NTS рДНК крысы, прилежащей к.участку инициации транскрипции были, определены как в нашей работе, так и в работах, опубликованных несколькими группами исследователей в Венгрии и США- (группы Хидпеги, Харрингтон и Ротб-лша >. Встроенный фрагмент плазмиды plirbo содержит такте промотор-нув последовательность, которая находится па его правой кран мезду участками Sail и Н1шШ1.

Детальный компьютерный анализ есой протяженное области (5,2 т.п.н.) выявил несколько интересных особенностей, характерных для этой последовательности. Ео-первых, обнаружено, что сравнительно короткая 13-члекная последовательность, которая входит в состаБ основного промотора PQ (координаты -18/-6), повторена в NTS (-1344/-1632, рис.27). Слева и справа от нее также расположены сегыенты с выраженной гомологией. Данный сегмент NTS получил- название спейсерного проыот ia • Р_^). Во-вторых, обнаружены две пос-

ледовательностл, гоьологич ые последовательностям терминаторов (Sail-боксы), один из которых (TQ, -157) оасположен непосредственно перед промотором PQ, а второй <T_j, -1763) обнаружен рядом с промотором P_j. Возникает аналогия со структурной организацией NTS рЛЖ лягушки, у которой промоторная последовательность повторена два раза и, кроме того, терминатор ТЗ расположен непосредственно перед основным промотором (Лабхарг и Ридер). Последовательности соответствующих Sail-боксов мыши и человека также обнаружены в положении -167 и -181 их генов (рис.27). В ряде работ, выполненных в лабораториях Груммт, Харрингтон и Ротблша, была показана функциональная полноценность терминаторов TQ мыши, крысы и человека, а так*н терминатора T_j и спейсерного промотора PQ крысы.

а) -1862 -1Й15

ATCTCTAGCTAGGAGG-----TTGTACCTGGAGA-ACT-TCAGGGGAGGAGGGTG-GCT

ATCTTT-GCTATCTGTCCTTATTGTAC^TAT-GCTG-AC-ACGCTGTCCT -30 . +i +10

b) Мышь - T (-167) Консенсус: мвшь/крыса Крыса - Т. (-157) Т°. (-1763)

А G G Т С G А С С А G Т Т G Т Т с с

А G G Т С G А С С А G 1 А/Т Ж т С с G

А G G Т С G А С С А G Т Т G т т с С

А G G Т С G А С С А С A A G G с г Г

с)

Т С CIC/G) N 0-3 Т С С Т Т

GGGTCGACCAG GGGTT'GACCAG

Человек (конс-сус) Т0 (-181)

Рис.27. Сравнение нуклеотидных Последовательностей спейсерного и основного промоторов крысы (а), а также терминаторов Т0 и (За11-боксы) крысы, мыши 1Ь> и человека (с). +1 - первый нуклеотид пре-рРНК.

Для локализации функционально важных участков NTS, а также мест прочного связывания белковых факторов А.Э.Богомоловой было' проведено районирование субфрагментов плазмиды pRr56 и полученные зубфрагменты были использованы для изучения способности различных фрагментов NTS к специфическому эзаимодеиетрию с белками клеточных экстрактов крясы. мыши и человека метолом торможения комплексов

ДНК-белок в полиакриламидном геле (ПААГ). Следует сразу оговорить,' что речь идет не белковых факторах транскрипции РНК.-попимеразы I. В ряде работ было показано, что эти факторы не способны образовывать прочные комплексы устойчивые при зпектрофоретическом разделении в ПААГ. В последовательностях NTS, представленных в плазмиде рйг56 (рис.28), удалось обнаружить три области прочного связывания белковых факторов с фрагментами ДНК: области основного промотора с прилежащим к нему терминатором (TQPQ), спеясерного промотора (P_j ) и фрагмент между участками Hpal и Kpnl, для которого по данным лаборатории Джекоба предполагается проявление эихансерной активности (область Е). Область T0PQ (фрагмент Ваь. .í-HlndIII) связывает дна различных белка одинаковых по размеру у крысы, мыши и человека, ни один из которых не идентичен двум другим белкам, связырчюшимся с областью P_j. С областью Е также связываются два белка, молекулярные массы которых идентичны у icpucu и мыши, но отличаются в случае человека (Богомолова и соавт.)..

О'ласть тандемных Mspl-повтороз, расположенная между участками Sali .. ВашШ (рис.28) и состоящая из 9 повторяющихся единиц, не образует прочных комплексов с белками клеточных экстрактов. Компьютерный анализ показал, что данный тандемныи повтор (MspI), прилезшими участку инициации транскрипции состоит из достаточно гомологичных между собой повтопос (в среднем на 60£). Проведение детального компьютерного а ализа позволяет также говорить о некоторой гомологии отдельных сегментов последовательности Mspí-повтора с последовательностью промоторов генов рДНК мы'ши и крысы, а также о крайне слабо выраженной гомологии с тандемными повторами типа 60/61 NTS рДНК лягушки, прилежащими к области промотора. Функциональная роль • повтора 60/81 лягушки была установлена ранее в ряде работ Т.Мосса: при транскрипции генов IBS и 2ÖS рРНК лягушки в области этого повтора происходит формирование и накопление комплексов РНК-полимеразы, которые по мере необходимости сдвигаются к участку инициации транскрипции и вступают в процесс транскрипции.

Данные о значительном усилении тр нскрипции в присутствии аналогичного Mspl-поатору крысы тандемного повтора мыши получены недавно в лаборатории И.Груммт. Эффективность транскрипции прямо зависела от числа копне и не зависела от ориентации тандемного повтог-v. в этой ко работе показано, что повтор 60/81 X. iaevis

конкурирует с тандемным повт ром мыши за связывание факторов транскрипции, что говорит о высоком уровне консервативности определенных сегментов данного элемента NT^. По всей видимости, аналогичная ситуация имеет место и в случае крысы. 3 пользу этого предположения говорит и связывание белков Р16, относящихся к семейству HMG и усиливающих транскрипцию с прилежащих промоторов, именно с этой областью NTS I Янг Иен и Ротблюм), а также края:,' низкая вероятность образования нуклеосоы в области Mspl-повтора, рассчитанная по методу Журкина.

-S -I

т.п.я. ,

-1

_I—

1

fr

ill

жж

л,

V,

• Я'

i I ! I I Л Iff

П2 S3 Kl' s3 S3 S3 <1 S S

!4>pi- поьтлр

if

Рис.Структурно-функциональная организация U-области NTS, при-лежацей к основному промотору повторяющейся единицы рДНК крысы. 1 - 2 - додомжные элементы ID и Ь2. В - ВаггШ; Н -Hlndlll; К - Kpnl; HI' - EcoRI; HV - EcoRV; S - Sali; Sa -Saul; S3 - SauoAI. <153 - начало синтеза 45S пре-рРНК.

Область МГй между учэетк ми Есой1 ч Нра1 наиболее удалена от основного промотора л содержит множество часто повторявшихся з гб-номе последовательностей: три подвижных элемента (Е2 и ХВ) и различные типы простых последовательностей или микросателлитов. Отдельные фрагменты этой области (ЕсоЕ1-ЗаиЗА1, Ь'соНУ-ЗаиЗА! я . при-лелэимй к нему йаиЗЛХ-срагмент ! могут связывать небольшие по размеру белковые Факторы, однако эти комплексы неустойчивы и разрушаются уже при 100-кратном избытке поли!¿1АТ) ). По всей видимости, эти комплексы образуются за счет белков, имейшкх некоторое сродство к элементам 1С, Б2 и простым последовательностям.

5.7. Локализация участка инициации репликации.

Метод, использованный нами для идентификации участка инициации репликации (orí), разработан в лаборатории Г.Русева в ИМ6 БАН и основан на обработке клеток крысы в условиях In vivo триметил-псораленом с последующим облучением ультрафиолетом. Условия обработки были подобраны таким образом, чтобы между комплементарными цепями ДНК образовывалась одна сшивка на фрагмент ДНК длиной 1-2 т.п.н. После введения сшивок в ДНК клеток в культуральную среду добавляли I HJ-тимидин и клетки культивировали 1 час. Этого времени. было достаточно, что'а синтезировались новые цепи ДНК между сшивками. Новосинтезированные (меченые) молекулы ДНК очищали и обогащали методом денатурации - ренатурации, сопряжении" с удалением одноцепочечных фрагментов ДНК нуклеазой S1, что позволило значительно повысить удельную активность ДНК ori, и использовали для гибридизации с ДНК рекомбинантных фагов и плаэыид, содержащих Фрагменты рДНК крысы.

Наиболее выраженная гибридизация была обнаружена с сегментом ДНК, происходящим от ДНК фага KRrII и пяазьэды pRr56 и расположен' мм между участками узнавания рестриктаз EcoRI й Saul (рис.2в). Оба фрагмента этой зоны: EcoRI-EcoRV и EcoRV-Saul содержат последовательности, гомологичные ori (данные не приводятся). В этой же области NTS рДНК находятся подвижные элементы генома IB, В2 и множество простых последовательностей. Слабая гибридизация была обнаружена такай с отдельными фрагментами плазмидй pRrlSl, содержащей последовательности правой области NTS (U), главным образом, с теми Фрагментами, которые'содержат часто повторяющиеся в геноме последовательности. Избежать полностью загрязнения ДНК orí часто повторяющимися в геноме последовательности :и практически невозможно в силу определенных ограничений, заложенных в самом методе. Значительно более высокий уровень гибридизации с фрагментами плаэмиды рйг56 позволяет сделать вполне обоснованный вывод о том, что участок инициации репликации генов 16S и L^S рРНК крысы расположен в области NTS с координатами -5Û70/-2570 (рис.20), прилежащей слева к блоку функционально важных элементов повторяющейся единицы рДНК, осуществляющих и регулирующих процесс транскрипции.

5.G. Созможние роли прос их последовательностей: распределение нуклеосом и переход в Z- и "-формы.

Некоторые фрагменты NTS, содержащие протяженные блоки (АС)п и протяженные гомопуриновые/гомопиримидиновые блоки типа (AGGin, были использованы для изучения перехода £-формы ДНК в Z- и Н-формы совместно с группой Миркина из ИМГ РАН. Удал сь показать, что Фрагменты этого типа, реклонированные в плазмиды, способны к переходу в Z-форму (последовательности типа (АС)п) и в Н-форму (тип (AGG)n и подобные ей последовательности), когда плазмиды находятся з состоянии отрицательной сверхспирализации. Состояние отрицательной сверхспирализации в какой то мере моделирует физиологические условия в клетке и делает переход в Z- и Н-формы термодинамически возможным. В ряде последующих работ группы Миркина было показано, что переход в Z- и Н-формы возможен и в случае фрагментов ДНК, содержащих регуляторные последовательности генома. Переход в Н-форму сопровождается образованием протяженных одноцепочечных участков ДНК, легко обнаруживаемых по расщеплению нуклеаэои S' По всей видимости, именно переходом в Н-форку и Объясняется чуствительность трех участков рДНК в NTS lU-область) к действию нуклеазы S1, обнаруженная на клонированных в плазмиды фрагментах рДНК, находящихся в состоянии отрицательной сверхспирализации (Фянанчек и соавт.). Нуклеотидные последовательности этих участков, для которых характерна чуствительность к нуклёазе SI, представляют собой протяженные гоыопуриновые/гомопиримидиновые блоки.

Определение протяженных нуклеотидных последовательностей повторяющейся единицы рДНК позво.'-чло провести работы по теоретическому предсказанию распределения нуклеосом на рДНК. Метод, предложенный и развитый В.Б.Журкиным в ИМБ РАН, позволяет вычислять вероятность образования нуклеосом внутри конкретной нуклеотидкой последовательности и основан на данных рентгено-структурного и конфор-мационного анализа двухцепочечных ДНК. Предложенный метод позволяет рассчитать жесткость данного сегмента ДНК на основании его нук-леотидной последовательности. Максимальной жесткостью обладают сегменты ДНК, в которых преобладают длинные полипиримидиновые/по-липуриновые блоки, и, напротив, наибольшая гибкость характерна для последовательностей, в которых дммеры PuPy и РуРи чередуются через

каждые 5-6 нуклеотидов. Предполагается, что сродство гистонов к." ДНК определяется олько ее гибкость». Гибкие участки ДНК обладают максимальным сродством к гистонам и представляют собой зоны предпочтительного связывания нуклеосом, в то время как жесткие сегменты ДНК входят в состав спейсеров. Значения использованной нами Функции íMm) прямо пропорциональны вероятности образования нуклеосом на данной последовательности ДНК.

Для анализа использовали следующие нуклеотидные последовательности рДНК: 1) U-области NTS I определены нами и в лаборатории Хидвеги); 11) Mspl-повтора и прилежащих к нему последовательностей (лаборатория Харрингтон >; И1> области сновного промотора и приблизительно пятой части ETS (лаборатория Ротблюма); iv) гена 18S рРНК (Азад и Дикон, Буш и соавт. ); v) ITS-I, гена 5.6S рРНК и ITS-2 (наши данные); vi) гена 23S рРНК (навва данные); vil) D-об-ласти NTS, прилежащей к 3'-концу гена 26S рРНК (наши данные). Общая длина последовательностей, которые использовали для анализа, составпяет 17,5 т.п.н., то есть значительную часть повторяющейся единицы ¿ДНК крысы.

Проведенный анализ показал, что для рДНК транскрибируемой области (ген IBS рРНК + ITS + ген 2SS рРНК) характерно отсутствие резко зараженных максимумов и минимумов функции Р(в) (данные не приводятся). Согласно теории, это говорит о том, что позиции нуклеосом в этой области н; фиксированы. По всей видимости, подобный тип распределения нуклеосом характерен в Целой для транскрибируемых облаете" структурных генов. Аналогичные результаты получены и при анализе транскрибируемых последовательностей дрозофилы; генов гистонов Н2а/Н2Ъ и теплового вйка (белок 70). Совсем другой характер распределения максимумов и минимумов функции f'(m) наблюдается в последовательности NTS, прилежащей у 3'-концу гена 26S рРНК. Общая длина этой последовательности 4025 п.н. и для нее характерно чередование резки выраженных максимумов и минимумов с периодом около 200 п.н., что близко к длине стандартного нуклеосомного повтора (рис.29). Известно, что в состав со птвенно нуклеосомы входит Фрагмент ДНК длиной 146 п.н., а длина линкеров может колебаться от 15 до 100 п.н. В D-области NTS положение большинства из 1S нуклеосом- жестко фиксировано, хотя на некоторых из сегментов рДНК, образовавшееся нуклеосомы (2 - 3), могут скользить внутри этого сег-

о кхо '¡от . зхо т. а. к. «к>

Рис .29. Значения функции f'lrn), определенные для нуклеотидноя последовательности D-области N15 общей длиной 4025 п.н. (рис. 23 ), прилежащей к 3'-концу гена 233 pFHK. Наиболее вероятное положение нухлеосом показано прямоугольниками.

мента, границы которого тем не менее закреплены глубокими и широкими минимумами функции Р(щ) (рис.29).

Жссгко фиксированное по. эжзние' нуклеосом определяется, главным образом, сочетанием различных типов простых последовательностей. Б отличие, от .нуклеотидных последовательностей со случайным распределением нуклеотидов, различные типы простых последовательностей могут резко увеличивать или уменьшать значения функции Г(а). Простые последовательности, которые состоят только из пири-мидинов или пуринов в одной цепи (например, (AG)п, (ТСС)п и т.д.), резко уменьшают вероятность образования нуклеосоя и, если их длина достаточна, то линкер может целиком состоять из одной такой последовательности. С другой стороны, проетие последовательности, в которых пурины и пирииидины s одной цепи чередуется (наприиар, (AC In,

(TGCT)n и т.д.! увеличивают значение функции f'(m), что говорит о" том, что они д0л...1Ы участвовать в формировании нуклеосом. Вычисление значении функции f'lm) для другой области NTS рДНК IU>, расположенной слева от основного промотора и имеющей координаты -5070/-2570, показало, что и для этой области NTS характерно наличие выраженных минимумов и максимумов, определяемое сочетанием различных типов простых последовательностей (данные не приводятся). Следовательно, и в этом случае нуклеосомы находятся в фиксированном положении, определяемом конкретной последовательностью нуклеотидов.

Анализ нуклеотидной пооледователы ,сти области рДНК, содержащей Mspl-повторы показал стабильно низкое значение функции f'(ra) по всей длине этой области, что говорит о низкой вероятнлсти образования .нуклеосом. Эти данные вполне согласуется с экспериментально полученными данными о накоплении комплексов РНК-полимеразы I именно в этой области. В настоящее время трудно сделать какие-либо выводь-, базирующиеся на прямых экспериментальных доказательствах, относительно функциональной роли простых последовательностей ДНК. Однако предложенная нами гипотеза объясняет многие особенности '■труктуриой организации NTS рДНК млекопитающих. Другая возможная функц. , простых последовательностей - участие в процессе- рекомбинации, которое может сопровождаться переходом в Н-форму, вполне сочетается с первой и может объяснять высокий уровень консервативности повторяющихся единиц рДНК в пределах одного вида.

. 6. ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ ОРГАНИЗАЦИИ ПОВТОРЯЮЩИХСЯ ЕДШШЦ ГЕНОВ IBS И

263 РИБОСОННЫХ РНК НА ПРИМЕРЕ рД1!К КРЫСЫ,.

Данные о структурно-функциональчой организации повторяющейся единицы рДНК крысы суммированы на рис.30. На этом же рисунке приведены данные об организации повторяющихся единиц рДНК дрожжей, дрозофилы и лягушки. Легко видеть, что в процессе эволюции происходит некоторое увеличение длины re: ib 16S и 28S рРНК, однако обшие принципы структурной организации транскрибируемой области оставались неизменными. Этого нельзя сказать о нетранскрибируемом спейсере, общая длина которого и сложность организации значительно увели"ились в процессе эволюции. В NTS дрозофилы появляется тан-

«Я яр»тРМС

ИВ

, '-1 в

* ?.э\гх/ у„

[

гге кью;

413 ЗК

I_II

III- г

-г

Пвр1

ПОВТОРУ

I

5,33

ДРОЖЖИ

. I

И

|1ькЯ р ЙКЕЙА I

I I 1

5,й 53

Рис.30. Сравнение структурно-функциональной организации повторяющихся единиц генов 183 и 233 рибосомных РНК крысы, лягушки, дрозофилы и дрожжей.

демно повторяющаяся последовательность, содержащая элементы гомология с промотором и игравшая роль энхансера. Аналоги этой после-

довательности сохранены a NTS лягушки (повтор 60/61) и крысы.' (Mspl-повтор). Ь NTS лягушки в свою очередь появляются дополнительные тандемные повторы 11 и 2), а, главное, возникает дупликация промоторов и терминаторов, также получившая дальнейшее разви-1ие у млекопитающих. В отличие от лягушки, в рДНК которой имеется только один терминатор недалеко от 3'-конца гена 28S рРНК (Т21, в NTS рДНК крысы в этой же области расположен блок из восьми терми-наторных последовательностей. Терминаторы ТЗ лягушки и Т0 крысы локализованы непосредственно перед основным промотором и, видимо, "функционально идентичны, однако у крысы появляется дополнительный терминатор T_j в D-области HTS рядом со .-пейсерным промотором P_j.

Однако основное усложнение организации NTS млекопитающих связано с появлением подвижных элементов генома типа В2, ID ч простых последовательностей. Элементы В2 и ID были сгруппированы попарно на основании уровня их гомологии с канонической последовательностью: две пары из элементов 52 и одна из элементов ID, причем в каждой такой паре один из элементов расположен справа, а другой слева от транскрибируемой области (рис.30). Исходя из уровня гоио-логии можно говорить об одновременном встраивании этих элементов ггпарно в рДНК. Видимо, после встраивания следующей пары, более древни, элементы теряли функциональное значение и начинали дивер-гировать от канонической последовательности. Последними встроились элементы ID, которые практически идентичны.между собой и с канонической последовательностью. Элемент IDg, расположенный в D-области NTS, даже Со ранил прямые повторы по границам.'

И, наконец, появление множества простых последовательностей (около 23Ж- от общей длины, в установленных нами последовательностях NTS) также-резко увеличило размеры NTS и усложнило его организацию. О некоторых возможных функциях простых последовательностей мы говорили выше. В U-области MTS нами также локализован orl р.ЦНК, возможно, некоторые из вышеперечисленных элементов связаны с инициацией репликации в повторяющейся единице рДНК. В любом случае, обнаружение нового типа структурно-фуккц. шальной организации NTS рДНК открывает большие возможности для более глубокого понимания и дальнейшего изучения организации генома млекопитающих.

С ы В О д н

1. Получена обшая структурно-фу.жциональная характеристика повторяющейся единицы генов 18S и 20S рРНК крысы: определены размеры повторяющейся единицы и ее транскрибируемой части. Обнаружен полиморфизм в нетранскрибируекых областях рДНК с использованием метода рестриктазного картирования в сочетании с гибри, лэациеа по методу Саузерна.

2. Проведено клонирование фрагментов рДНК, рестриктазное и гиб-ридизационное картирование этих фрагментов рДНК, установлена локализация генов 183, 28S рРНК, участка инициации транскрипции, тан-демных повторов и ряда повторявшихся элементов генома.

3. Определена полная нуклеотидная последовательность (1930 п.н.) внутреннего транскрибируемого спейсера и гена 5.8S рРНК. Идентифицированы участки раннего эндонуклеаэного расщепления пре-рРНК и определена их структурная организация.

4. Предложена модель предполагаемой вторичной структуры пре-рРНК млекопитающих и основанная на ней гипотетическая схе. лроцессинга пре-рРНК.

5. Определена полная нуклеотидная последовательность (4802 п.н.) 2SS рРНК по соответствующим фрагментам рДНК и изучена структурная организация 28S рРНК. Сравнение последовательностей L~рРНК крысы и дрожжей позволило выявить высоко консервативные и вариабельные области данной последовательности.

6. Определены нуклеотидные последовательности 0-области NTS (общая длина 4025 п.н. ), прилежащей к 3'-концу гена 203 рРНК, и и-об-ласти NTS (длина 2500 п.н'.), расположенной слева от основного промотора в районе с координатами -5070/-2570.

7. Проведен компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей областей NTS, выявлены шесть подвижных элементов генома типа В2 и ID, которые могут быть разбиты на три пары по уровню гомологии к каноническое: последовательности, и множество простых последовательностей разного типа.

8. На расстоянии 532 - 1770 п.н. справа от Э'-конца гена 283 рРНК в районе D-области NTS обнаружены восемь высоко гомологичных последовательностей (gall-бокс), обеспечивающих надежную терминале транскрипции.

9. По гибридизации с фрагментами ДНК, обогащенными последовав тельностями учас.лов инициации репликации крысы, установлено положение участка инициации репликации рДНК. в U-области NTS.

10. Обсуждена возможная роль простых последовательностей ДНК, обнаруженных в NTS рДНК крысы, в формировании нуклеосом и переходе в функционально активную Н-форму.

11. На основании полученных результатов предложена обобщенная модель структурно-функциональной организации повторяющейся единицы генов 16S и 20S рРНК млекопитающих.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

1. Braga, Е.А., Yusslfov, T.N., Noslkov, V.V. "Structural organization of rat ribosomal genes. Restriction endonuclea.se analysis of genoalc and cloned ribosomal DNAs", Gene,. 1962, v.20. No 2, p,145 - 156.

2. Носиков, В.В., Брага, Э.А. "Гены рибосомных РНК", "Итоги науки и тьлшш". Серия "Молекулярная биология", 1962, т.16, стр. 110 - 215.

Ч. Георгиева, Е., Носиков, В.В., Иванов, И.Г., Пашев, И.Г. "Фрак-ш. .нирование хроматина ядер клеток печени после ограниченного расщепления микрококков^й нуклеазой", Молекулярная биология, 1982, т.16, вып.2, сгр.392 - 397.

4. Georgiev, O.I., Nosikov, V.V., Braga, Е.А., Hadjiolov, A.A. "Sequen, з heterogeneity in the internal transcribed spacers of two rat ribosomal DNA clones", Blochem. Internal., 19.84, v.8, p.225- 229.

5. Georgiev, 0.1., Noslkov, V.V., Hadjiolov, A.A. "Sequence of the 3'-half of the Rattus Norve ;icus 26S rRfIA gene, ^omptes renflus de l'Academle bulgare des Sciences, 1984, v.37. Mo 5, p.673 - 675.

6. Hadjiolov, A.A., Georgiev, O.I., Nosikov, Y.V., and Yavachev, L.P. "Primary and secondary structure of rat 23S ribosomal RNA", Nucl. Acids Res., 1984, v.12, No 6, p,726 - 728.

•7. Hadjiolova, K.V., Georgiev, 0.1., Nosikov, V.V., and Hadjio-• lov, A.A. "Mapping of the lsajor early endonuclease cleavage s'te of the rat precursor to rRNA within the internal

- 61 .transcribed spacer sequence or rINA", Blochira. et Biophys. Acta, ¡901, v.782, p.195 - 201.

8. Hadjlolova, K.V., Georgiev, C.I., Noslkov, УЛ., and Hadjio-lov, A.A. "localisation and structure of endonucleaseelea-vajje sites Involved in the processing of the rat 32S precursor to rlhosonal RNA", Biochea. J., 1984, v.220, p.105 - 116.

9. Avdonlna, T.A., Braga, E.A., Noslkov, V.V. "Structural organization of rat ribosoiaal ffanss, Repetitive and satellite-like sequences in the nontransclbed spacer", Proceedings of the Fifth international symposium on matabollsn and enzyraology of nucleic acids including gene manipulations (Sjuolenice Castle, Chshoslovakial, 1964, v.5, p.215 - 223.

10. Авдонина, Т.А., Брага, Э.А., Носиков, Б.В. "Структурная организация нетранскрибируемого спеясера рибосоыного повтора красы", Молекулярная биология, 1965, т.13, Но 2, стр.412 -

■424. '

11. Braga, Р.Л., ' Avdonlna, Т.A., Zhurkin, V.B.,' Noslkov, V.7. "Structural organization of rat rlbosoraal .RHA r^nes: interspersed sequences end their putative role in the аПяпмеяЬ of nucleosoffiss", 1985, Cene, v.36, Ho 3, p,249 - 262.

12. Бродский, В.Я., Носиков, В.В., Брага, Э.А., Маршак, Т.Л., Караванов, А.А., Корочкнн, Л.И., Садыкова; М.К. "Пространственная организация рибосалтж генов в йитер^азном ядре", ЛАН АН СССР, 1986, т.285, No 2, 'стр.455 - 458.

13. Маршак, Т.Л., Караванов, А.А., Ксрочкин, Л.И., Брага, Э.А., Носиков, В.В., Садыкова, М.К., Бродский, В.Я., "Внутри- и меж-популяционная гетерогенность нервных клеток мозжечка по топографии и содержаний рибосомных генов", Цитология, 1986, т.XXVIII, Вып.З, 360 - 366.

14. Yavachev, L.P., Georgiev, O.L., Braga, Е.А., Avdonlna, Т.A., Bogon»lova, A.E., Zhurkin, У.В., Noslkov, V.V., Kadjiolov, A.A. "Nucleotide sequence analysis of the spacer regions flanking the rat rRNA transcription unit and; Identification of repetitive elements", Hucl. Acids Pes,, 1985, v.14, p.2799 -2810.

[5.. Anachkova, B.B. , Noslkov, У.У-, fiussev, G.C. "Localization of a DUA replication origin in the ncntranscribed spacer of rat

rlbosomal RNA genes", Comptes rendus de 1'Acadeole hulgare des; Sciences, 19..,, v.39, p.113 - 116.

16. Mirkln, S.M., Lyamichev, V.X., Kumarev, V.P., Kobzev, V.F., Noslkov, V.V., and Vologodskll, A.V. "The energetics of the B-Z transition In UNA", J. ВЮШ01. Struct. By nam., 1987, v.5, No 1, p.79 - 88.

17. Brodsky, V.Y., Marshak, T.L., Karavanov, A.A., Zatseplna, O.V., Noslkov, V.V., Korochkin, L.I., Braga, E.A. "Cell differentiation as assayed by the topography and number of rlbosomal genes", Cell Differentiation, 1988, v.24, No 1, p.201 - 208.

18. Marshak, T.L., Mares, V., Karavai v, A.A., Noslkov,. V.\., Brodsky, V.Y. "Cell differentiation according to maturation of nucleolar apparatus and topography of rlbosoiaal penes", In Nuclear Structure and Function, Ed. J.R.Harris and I.B.Zbarsky, Plenum Press, 1990, N-l, p.133 - 137.

ТЕЗИСЫ ДОКЛАДОВ:

19. Брага, Э.А., Носиков, В.В. "Структурная организация рибосошшх 1 генов крысы", Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Генети-41 кая инженерия", I960, стр.46, Пушино-на-Оке.

20. Брага, Э.А., Носиков, В.В. "Молекулярный анализ рибосомных генов крысы", Тезисы докладов и стендовых сообщений Второго двустороннего Советско-итальянского симпозиума "Макромолекулы в функционирующей клетке", 1980, стр.12, Пущино-на-Оке.

21. Брага, Э.А., Носиков, В.В. "Клонирование и структурно-функциональная организация рибосомных генов крысы", IY-ый двусторонний симпозиум СССР-ФРГ "Структура и транскрипция генома", 1981, стр.46, Баку.

22. Брага, Э.А., Станчев, Б.С., Носиков, В.Б. "Рекомбинантные молекулы ДНК, содержащие гены рибосомных РНК крысы" Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Рекомбинантные ДНК", 1982, стр. 41 - 42, Пуиино-на-Оке.

23. Брага, Э.А., Авдонина, Т.А., Носиков, В.В. "Повторяющиеся участки генома в нетранскрибируемом спейсере рибосомных генов

• крысы", Тезисы докладов V Всесоюзного симпозиума "Молекулярные механизмы генетических процессов", 1983, стр.11, Москва.

24. Брага, Э.А., Авдонина, '..А., Носиков, В.В. "Распределение различных типов повторяющихся послед' ^ательностея в рибосомном опероне крысы", Тезисы докладов VIII-ого Всесоюзного симпозиума "Структура и функции клеточного ядра", 1984, стр.196, Пущи-но-на-Оке.

25. Носиков, В.В., Брага, Э.А., Авдонина, Т.А., Хаджиолов, A.A., Русев, Г., Явашез, Л.П. "Структурная oprai':зация рибосомных генов крысы. Идентификация различных типов повторяющихся последовательностей в нетранскрибируекои спенсере (NTS)", Тезисы докладов XVI-oa Конференции Европейских биохимических обществ, 1984, стр.258, Москва.

26. Авдонина, Т.А., Брага, Э.А., Носиков, В.В. "Рибосомные гены крысы. Повторяющиеся и сателлито-подобные последовательности в нетранскрибируемом спеясере", Тезисы докладов и стендовых сообщений ГУ-oro двустороннего симпозиума СССР-Италия "Макромолекулы в функционирующей клетке", 1984, стр.4, Киев.

27. Брага, Э.А., Авдонина, Т.А., Журкин, В.В., Носиков, В.В. "Тан-демные и рассеянные в геноме повторы риб<?сомного терона крысы", Тезисы докладов ' и стендовых сообщений Всесоюзной конференции "Макромолекулы клетки, 1984, стр.18, Москва.

28. Авдонина, Т.А., Брага, Э.А., Журкин, В.Б., Носиков, В.В. "Сочетание простых последовательностей и элементов подобных В2 определяет положение.нуклеосом в повторявшихся областях генома ", Тезисы докладов Vl'-oro Симпозиума СССР-ФРГ "Структура и функции генома", 1985, 11-28, Ленинград.

29. Брага, Э.А., Авдонина, Т.А., Богомолова, А.Э.,, Журкин, В.Б., Носиков, В.В., Георгиев, 0.11.,-Явашев, Л.П., Хаджиолов, A.A. "Особенности структурной организации и возможные функции последовательностей . ДНК, прилежащих к транскрибируемой области рибосомных генов крысы", Тезисы докладов VIII-ого Двустороннего Симпозиума СССР-Франция "Структура и функция белков и нуклеиновых кислот", 1986, стр.24, Москва.

30. Nosí.kov, V.V., Marshal;, T.L., Karavanov, A.A. "Spatial organisation of ribosoraal genes in the interfase nuclei", Abstracts of 16th Meeting of European Study Group for Ceil Proliferation, 1989, N 83, .Milan, Italia.