Молекулярно-генетические характеристики рибосомных генов и процессы гибели клеток у больных ревматоидным артритом

Шубаева, Наталья Олеговна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетические характеристики рибосомных генов и процессы гибели клеток у больных ревматоидным артритом
ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетические характеристики рибосомных генов и процессы гибели клеток у больных ревматоидным артритом"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ГУ МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи УДК 57721

Шубаева Наталья Олеговна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ РИБОСОМНЫХ ГЕНОВ И ПРОЦЕССЫ ГИБЕЛИ КЛЕТОК У БОЛЬНЫХ РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ

03.00.26 молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссер I ации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2005

Работа выполнена в ГУ Медико-Генетическом Научном Ценгре РАМН РФ

Научный руководитель:

доктор биологических наук Н Н Вейко

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук В А.Мякоткин кандидат медицинских наук Е А Калашникова

Ведущее учреждение:

ФГУП ГосНИИ Генетика РФ

Защита состоится «_»_ 2005 г в_часов на заседании

Диссертационного Совета Д 001 016 01 при ГУ МГНЦ РАМН по адресу 115478, Москва, ул Москворечье д 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Медико-Генетического Научного Центра РАМН

Автореферат разослан «_»_2005 года

Ученый секретарь Диссертационного совета Доктор биологических наук, професоор

JIФ Курило

,Ш>С -' ///V/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1. Актуальность проблемы.

В качестве объекта исследования в работе выбраны рибосомные гены (РГ) человека Продуты этих генов (28S, 18S, 5 8S рРНК) являются составными частями рибосом - структур, в которых происходит трансляция генетической информации. Рибосомные гены имеют принципиальное значение для функционирования эукариотической клетки В последние годы показано, что известные наследственные заболевания (синдромы Трише-Коллинза, Блюма, Вернера и др ) связаны с изменениями транскрипции РГ и процессинга рРНК вследствие мутаций в генах белков, принимающих участие в работе рРНК - синтезирующего аппарата Изучение закономерностей организации и функционирования рибосомных генов в клетках человека является одной из актуальных проблем молекулярной биологии и молекулярной генетики в настоящее время

В геноме человека содержится в среднем 400 копий РГ, которые гетерогенны с точки зрения их функциональной активности, конформации, метилирования CpG -последовательности, локализации в структурах ядра и ядрышка Обнаружена выраженная внутривидовая вариабельность молекулярно-генетических характеристик комшекса РГ человека, к которым относят общее число копий рибосомных повторов, количество активные копий, уровень метилирования транскрибируемой области РГ Вместе с тем практически нет данных о том, как влияют индивидуальные свойства комплекса РГ на количество рРНК в нормально функционирующей клетке и на способность клетки выживать при стрессе Согласно современным представлениям, воздействие стрессорных факторов самой разной природы вызывает в клетках неспецифический ответ, выражающийся в изменении нормального синтеза белков и переключении на синтез комплекса защитных белков Способность клетки синтезировать в ответ на стресс быстро и в нужном количестве необходимые для выживания белки определяется рядом факторов - наличием соответствующих мРНК, эффективностью трансляции и количеством рибосом Количество рибосом, в свою очередь, зависит от общего уровня транскрипционной активности РГ, который определяется молекулярно-генетическими характеристиками копий РГ генома

Таким образом, исследование количественных показателей гибели клеток при повреждающих воздействиях в связи с индивг " омплекса РГ

человека является важной задачей молекулярной генетики и клеточной биологии и позволяет приблизиться к пониманию причин высокой индивидуальной чувствительности клеток на действие повреждающих агентов

2. Цели и задачи исследования.

Цель настоящей работы - изучение возможной взаимосвязи между индивидуальными молекулярно-генетическими характеристиками комплекса рибосомных генов человека и количественными показателями гибели клеток при окислительном стрессе Были поставлены следующие экспериментальные задачи

1) Разработать экспериментальные подходы, позволяющие определять количественно уровень гибели клеток организма и культуры клеток по продуктам деградации клеточной ДНК,

2) Определить молекулярно-генетические характеристики комплекса РГ больных ревматоидным артритом, при котором ра'¡пинается окислительный стресс, в сравнении с РГ здоровых доноров, сопоставить эти характеристики с показателями гибели клеток при данной патологии,

3) Исследовать in vitro взаимосвязь между показателями гибели клеток и свойствами комплекса РГ в штаммах фибробластов кожи человека, культивируемых в присутствии малых доз окислителя - хромата калия

3. Научная новизна.

Впервые изучены молекулярно-генетические характеристики комплекса рибосомных генов больных ревматоидным артритом (РА) в сравнении с комплексом рибосомных генов практически здоровых доноров - общее число рибосомных повторов, относительное количество активных копий рибосомных генов, уровень метилирования транскрибируемой области рДНК, количество продукта гена - рРНК Обнаружен ряд неизвестных ранее особенностей комплекса РГ больных РА Впервые показано, что на количественные показатели гибели клеток в организме больных РА существенно влияет общий уровень активности комплекса РГ

На примере культивируемых фибробластов кожи больных РА и здоровых доноров впервые показано, что интенсивность процесса апоптоза клеток при окислительном сгрессе коррелирует с количеством активных копий рибосомных генов в геноме

4. Научно-ирактическая значимость работы

Предложен метод оценки общего уровня гибели клеток в организме, включающий определение концентрации ДНК и рибосомной ДНК в сыворотке крови, а также анализ длин фрагментов ДНК сыворотки Показано, что определение общей концентрации ДНК и содержания «нуклеосомных» фрагментов в сыворотке крови может быть использовано в качестве дополнительного маркера воспалительных и деструктивных изменений при ревматоидном артрите

Предложена схема количественного определения уровня апоптоза клеток при действии повреждающего агента на культивируемые клетки, предполагающая кинетический анализ изменения количества клеточной ДНК на носителе, в среде культивирования и определение активности каспазы 3.

Обнаружено, что у больных РА низкий уровень активности РГ лимфоцитов крови в ряде случаев ассоциирует с более выраженным проявлением патологии

5. Апробация работы

Диссертационная работа была апробирована 3 ноября 2004 г на совместной конференции сотрудников ГУ МГНЦ РАМН и ГУ Института ревматологии РАМН Основные результаты диссертации представлены сообщениями на 8-м Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов (Москва, 2002), 1-м Всероссийском Съезде гематологов-трансфузиологов (Москва, 2003), I Всероссийском Конгрессе ревматологов (Саратов, 2003), VII Всероссийском научном форуме "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" (Санкт-Петербург, 2003), 3-м Съезде ВОГиС (Москва, 2004), на международном Съезде ревматологов ("EULAR 2004" Берлин, 2004) Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант 02-04-49227) По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ (2 статьи и 15 тезисов)

6. Структура и объем работы.

Диссертация состоит из следующих разделов введения, обзора литературы, описания материалов и методов, раздела собственных исследований и обсуждения результатов, выводов и библиографии Материалы изложены на 132 страницах машинописного текста, включая 16 таблиц, 21 рисунок Библиографический указатель содержит 197 наименовании, из которых 175 иностранных

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Обзор литературы.

Обзор литературы посвящен анализу известных молекулярно-генетических характеристик рибосомных повторов человека Рассматриваются структура рДНК, полиморфизм последовательности, вариабельные и консервативные участки рДНК, общее число копий РГ в геноме, относительное количество активных копий РГ, метилирование рДНК Анализирую юя данные об изменении этих характеристик при патологии и при старении Описаны наследственные заболевания, при которых происходит изменение функционирования рРНК - синтезирующего аппарата клетки

2. Материалы и методы.

Сбор образцов крови, сыворотки и биоптатов кожи проводился в Институте ревматологии РАМН в Лаборатории клинической иммунологии (руководитель проф , д м н А И Сперанский) Обследовано 66 больных достоверным РА (в соответствии с критериями ARA 1982 года) и 56 здоровых лиц Иммунологические и биохимические показатели ревматоидный фактор (РФ), С-реактивный белок (СРБ), циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК), фактор некроза опухоли (ФНО-а), интерлейкин 6 (ИЛ-6). иммуноглобулины G, А, М (IgG, IgA, IgM), антитела к кардиолипину (AKJI), определены сотрудниками лаборатории клинической иммунологии Института ревматологии РАМН

Штаммы перевиваемых диплоидных фибробластов кожи человека были получены и культивировались сотрудниками группы клеточных сгруктур МГНЦ РАМН (руководитель к б н СМ Терехов) Цитогенетический анализ относительного количества активных копий РГ проведен сотрудниками лаборатории Общей цитогенетики МГНЦ РАМН (руководитель проф д б н НА Ляпунова) на препаратах метафазных хромосом, полученных из культур ФГА - стимулированных лимфоцитов или фибробластов Препараты окрашивали азотнокислым серебром (Ag-окраска) по методу (Deren/im 2000) в разрабозашгой в лаборатории модификации (Ляпунова и соавт . 2001) Размер каждого AgHOP оценивали визуально в условных единицах от 0 до 4 Общее количество активных копий рДНК в ядре (ЛкРГ) выражали как суммарный размер десяти AgHOP

В работе использованы след}тощие методы исследования выделение ДНК и РЖ из сыворогки и лейкоцитов периферической крови и из культивируемых фибробластов кожи с использованием протеиназы К и экстракции органическими растворителями, спектрофотометрическое и флуориметрическое определение концентрации ДНК и РНК, метод нерадиоактивной количественной дот-гибридизации ДНК и РНК с биотинилированными олигонуклеотидными и ДНК-зондами, определение уровня метилирования рДНК с использованием чувствительной и нечувствительной к метилированию последовательности ДНК эндонуклеазы (Мяр1 и НраП), гель-электрофорез ДНК В качестве рДНК - зонда использовали фотобиотинилированную ДНК плазмиды рНТШЯЕ-285 Этот зонд детектирует участок гена 288 рРНК, расположенный между нуклеотидами с порядковыми номерами 8288 и 10701 (длина фрагмента 2413 пн) Статистическую обработку результатов проводили с использованием стандартного пакета программ $1а1§гарЫея и Б^йвйса 6 0 Анализировали распределение выборок по методу Холмогорова-Смирнова, средние значения величин сравнивали с использованием I - критерия

3. Результаты и обсуждение.

Для исследования возможной взаимосвязи между свойствами комплекса рибосомных генов и количественными показателями гибели клеток мы выбрали две модельные системы (1) аутоиммунное заболевание - ревматоидный артрит, для которого характерен интенсивный окислительный стресс, и (2) культивируемые в присутствии малых доз окислителя (К2Сг207) фибробласты кожи человека Ревматоидный артрит — хроническое системное воспалительное заболевание, сопровождаюшееся поражением суставов, реже— серозных оболочек и мелких сосудов В сыворотке крови больных РА тестируют очень высокий уровень активных кислородсодержащих радикалов и одновременно фиксируют низкий уровень активности антиокислительных ферментов Показано, что окислительный стресс ингибирует ферменты репарации двунитевых разрывов ДНК у больных РА Препараты, используемые для лечения РА, способствуют индукции апоптоза в клетках больных РА Таким образом, в организме больного РА, благодаря окислительному стрессу и в процессе терапии, имеет место гибель большого количества клеток Действие солей Сг(У1) на культивируемые фибробласты кожи человека изучено в работе Притчарда и соавт (РгйсЬагс! е1 а1, 2001) Авторы

показали, что небольшие дозы хромата вызывают гибель клеток молодой культуры (до 9-12 пассажей) по механизм> апогпоза

Были определены основные свойства комплекса РГ изучаемых объектов и разработаны экспериментальные подходы, позволяющие определягь уровень гибели клеток в обеих системах

3.1. Характеристика рибосомных генов больных ревматоидным артритом. Общее чиста копий рДНК (К) определено методом нерадиоактивной количественной дот-гибридизации В геномах больных РА К варьирует о: 216 до 670 (среднее значение 402 ± 103, п = 56), в геномах здоровых доноров - от 205 до 607 (среднее значение 418 ± 103, п = 52) Соответствующие распределения по числу копий приводятся на рис 1а Наблюдается значительная внутривидовая вариабельность числа копий рибосомных повторов человека, что подтверждает выводы других авторов (ОаиЬа1г е1 а1, 1976, Вейко НН, 2001) Анализ средних значений с использованием I - критерия и анализ распределений по методу Колмоюрова-Смирнова позволяет сделать вывод об отсутствии различий но анализируемому параметру между выборками ЗД и больных РА

! 35

ЗД

300 400 500 600 Число копий РГ в геноме

14 16 18 20 22 Количество АкРГ, усл.ед

Рис 1 (а) Часютное распределение образцов ДНК, полученных от ЗД (п = 52) и больных РА (п = 56), по числу копий РГ (б) Частотное распределение группы контрольных ЗД (п = 49) и больных РА (п = 49) по относительному количеству АкРГ в ФГА - стимулированных лимфоцитах

100

£ 20

(О

о 0

ыоо

т 80

РА

Группа метилирования

0,4 0,8 1,2 1,6 2 Количество РНК/1 ми-ДНК

Рис 2

Рис.3

Рис 2 Частотное распределение выборки образцов ДНК ЗД (п = 30) и больных РА (п = 27) по группам метилирования рДНК

РисЗ Частотное распределение группы ЗД (п = 15) и больных РА (п = 18) по содержанию общей РНК в лимфоцитах

Таким образом, геномы больных РА содержат в среднем такое же общее количество рибосомных повторов, что и геномы ЗД

Относительное количество активных копий РГ (АкРГ, а). Для оценки количества АкРГ в геномах больных РА и ЗД использовали относительные размеры 10 А^ОР метафазных хромосом ФГА-стимулированных лимфоцитов (Ляпунова и соавт. 1996. 2000), выраженные в уел ед Величина а в выборке больных РА изменяется от 14,4 до 20,7 уел ед (среднее 17,6 ± 1,3, п = 49), для ЗД - от 17,0 до 22,1 уел ед (среднее 19,0 ±1,3, п = 49) Соответствующие распределения приводятся на

рис 16 Анализ средних значений с использованием I - кршсрия и атализ распределений по методу Колмогорова-Смирнова позволяет сделать вывод о том, что больные РА в среднем содержат в геномах существенно меньшее количество АкРГ, чем здоровые доноры 80 % больных РА содержат количества АкРГ, меньшие, чем среднее для контрольной группы

Низкое количество АкРГ в геномах больных РА является, по-видимому, генетической особенностью этих индивидов и не связано с инактивацией транскрипции рДНК в лимфоцитах вследствие болезни (например, при взаимодействии белков ядрышка с антителами) или лечения цигостатическими препаратами Об этом юворят следующие факты (1) Анализ данных литературы и собственные данные не выявили антител к белкам ядрышка Антинуклеарный фактор, обнаруженный у 9% больных РА, представлен антителами, которые направлены против комплекса ДНК-гистон (2) У нескольких «первичных» больных анализ проводили до начата лечения и в курсе терапии Параметр а для этих больных не изменялся Количество АкРГ не зависело от вида базисной терапии больных РА (метогрексат или лефлюнамид, соответственно 17,11 + 0,35 (ЭЕ) п=10 и 17,34 + 0,47 п=12 услед) (3) количество АкРГ в культивируемых фибробласгах кожи и в лимфоцитах периферической крови одних и тех же больных РА практически одинаково

Уровень метилирования фрагмента 28Б рДНК. Для сравнительной количественной оценки метилирования повторяющейся последовательное га рДНК, которая содержит многочисленные МзрЬсайты ранее (Вейко, 2001) было предложено использовать известное свойство нитроцеллюлозных мембран малую способность сорбировать короткие (<200 п н) фрагменты ДНК Образцы ДНК гидролизовати эндонуклеазами Сьр61 + МБр1 (пробы 1) и СБрбН-НраП (пробы 2) Показатель метилирования, М = А2/А1, где А! и Аг -гибридизационные сигналы, полученные для проб 1 и 2 соответственно 30 образцов ДНК здоровых доноров были разделены на 3 группы, отличающихся по показателю метилирования М и по составу фрагментов рДНК НраИ-гидролизата анализируемой области фрагмента гена 288 рРНК 50% образцов ДНК отнесены к группе 1М показатель метилирования 1,4 - 1,7 соответствует тому, что в НраН-гидролизате присутствуют преимущественно фрагменты длиной менее 500 п н , т е уровень, метилирования низкий 23 % образцов попати в группу ЗМ, для которой показатель метилирования составил 2.5 - 3,1

(высокий уровень метилирования), НраП-гидролизат содержит значительное количество фрагментов длиной более 20 тин 27 % образцов составили группу с промежуточным гипом метилирования M изменяется от 1,7 до 2,5, в Ilpall -гидролизате преобладают фрагменты длиной от 0,5 до 15 тпн Мы определили показатель метилирования фрагмента 28S рДНК для 27 больных РА и сравнили результат с данными для ЗД Оказалось, что анализируемый фрагмент гена 28S рРНК мало метилирован в подавляющем числе образцов ДНК больных РА (рис 2)

Обнаруженное нами гипометилирование рДНК больных РА находится в соответствии с данными других авторов, которые тестировали понижешгое общее количество 5- метилцитозина в тотальной ДНК больных РА по сравнению с контролем Согласно общим представлениям, гипометилирование способствует активации генов Однако при исследовании некоторых конкретных генов при РА было показано, что гипометилирование не приводит к активации транскрипции гена Это совпадает с полученными нами результатами гипометилирование структурной области рибосомного повтора у больных РА не коррелирует с активацией транскрипции РГ о чем свидетельствует низкое количество АкРГ у больных Причины этого явления пока не ясны

Количество продукта рибосомного гена - рРНК в лимфоцитах При анализе изменений количества рРНК в клетках при дейсгвии различных факторов в литературе обычно используют общее количество РНК. поскольку рРНК составляет более 85-95% от общей РЖ клетки Мы проверили это предположение для нескольких доноров, показав, что количество рРНК в клетках индивидов пропорционально количеству общей РНК В дальнейшем для оценки уровня рРНК в лимфоцитах определяли общее количество РНК, отнесенное к единице количества ДНК клетки.

Количество РНК в клетках больных РА варьировало от 0,1 до 1,0 мкг / мкг ДНК (среднее 0,4±0,3, п=18), в клетках ЗД - от 0.8 до 1,9 мкг/мкг ДНК (среднее 1,4±0 3, п=15) Соответствующие распределения представлены на рис 3 Количество РНК (рРНК) в выделенных лимфоцитах больных РА снижено в среднем в три раза по сравнению с клетками ЗД. Данный результат дополнительно был подтвержден в опыте по одновременной гибридизации РНК лимфоцитов 4-х ЗД и 2-х больных РА с зондом на 18S рРНК Снижение общего уровня РНК (рРНК) в интерфазных лимфоцитах больных РА не является следствием (1) терапии цитостатическими препаратами, (2)

наличия в выделенных лимфоцитах большою количества апоптошческих клеток или (3) заметного ингибирования транскрипции РГ По-видимому, в клетках больных РА нарушается процессинг 45S рРНК, что приводит к ее быстрой деградации В пользу этого предположения говорит факт обнаружения некоторыми авторами усиленной деградации PIIK и рРНК в клетках больных РА В моче больных РА обнаружен высокий уровень метаболитов рРНК и остальных типов PIIK (Tebib et al, 1997), свиде1ельствующий об усилении оборота рРНК (РНК) в ор1анизме больных РА Имеются также данные об увеличение экспрессии генов некоторых РНКаз при ревматоидном артрите (Bovin et al, 2004)

Таким образом, комплекс РГ больных РА имеет ряд особенностей по сравнению с РГ практически здоровых людей Клетки больных РА содержат меньшее количество активных копий рибосомных генов, несмотря на неизмененное общее число копий рДНК и низкий уровень метилирования транскрибируемой области рДНК Эти факт позволяет спрогнозировать снижение количества рРНК в клетках больных пропорционально снижению количеств АкРГ Однако, в силу пока неясных причин, лимфоциты больных содержат аномально низкое количество рРНК (а значит и рибосом), не соответствующее количеству АкРГ Количество рибосом в клетке важно, как с точки зрения ее нормального функционирования, так и для ответа на различные экзо - и эндогенные факторы стресса

3.2. Количественная оценка уровня гибели клеток организма.

Количественно оценить уровень гибели клеток целого организма независимо от типа этих клеток возможно, определив концентрации, размеры и последовательности фрагментов внеклеточной ДНК, циркулирующей в периферической крови Концентрация и размеры фрагментов ДНК. циркулирующей в крови в момент взятия пробы для анатиза определяются количеством клеток, подвергающихся апоптозу, и активностью систем элиминации Активизация нуклеазной активности крови, наблюдаемая при ряде аутоиммунных заболеваний, способствует деградации ДНК до очень коротких фрагментов, которые выводятся с мочой В этом случае мы будем получать заниженные значения концентрации межклеточной ДНК, которые не отражают истинною количества гибнущих клеток организма Ранее сотрудниками лаборатории Молекулярной биологии МГНЦ РАМН установлено, что транскрибируемая область рибосомного повтора сравнительно устойчива к двушлевым разрывам, возникающим вследствие накопления одцонитевнх разрывов,

вызываемых как химическими повреждающими агентами, так и нуклеазами (Вейко,

Сшгпсовский, 2000) Рибосомальная ДНК циркулируете периферической крови в виде

фраг ментов большей длины, чем большинство последовательностей геномной ДНК и,

следовательно, медленнее выводится из организма Это свойство рДНК мы

использовали при анализе ДНК сыворотки крови больных РА

Концентрация и размер фрагментов ДНК в сыворотке крови больных РА.

ДНК сыворотки крови больных РА представлена фрагментами различной длины

Наряду с фрагментами длиной 15 - 20 тпн часто присутствуют фрагменты,

образующиеся при гидролизе хроматина по межнуклеосомным спейсерам -

«нуклеосомная лесенка» В табл 1 приводятся данные о количестве «нуклеосомных»

фрагментов и концентрации ДНК в образцах ДНК сыворотки крови ЗД и больных РА

Табл 1 Характеристика образцов ДНК сыворотки крови больных РА и иммунологические показатели

Анализируемый показатель Здоровые доноры (норма) N=30 Больные РА

Р5н-N=40 РФ-N=26 Р

Концентрация ДНК, нг/мл 120±113 2185±2594 1011±1191 0,035

Отн кол-во олигонуклеосомных фрагментов, уел ед * 0 1,8±U 1,4±1,0 0,16

Отн кол-во мононуклеосомных фрагментов, уел ед 0 2,1±1,2 1,5±1,3 0,059

Количество образцов с концентрацией ДНК превышающей норму (более 220 нг/мл), % - 92 78 -

Ревматоидный фактор (РФ), титр 0 233±391 0 -

С-реактивный белок (СРВ), мг% <1,0 4,4±0,5 1,6±2Д 0,0001

Циркулирующие иммунные комплексы, ЦИК, ед 011 < 130 156 ±110 224±159 0,0439

Иммуноглобулин G, М1/мл 9 ± 2 16 ±7 16±6

Иммуноглобулин А, мг/мл 3±1 4,1 ±4,0 4,1 ±4,1

Иммуноглобулин М, мг/мл 1,6 ±0,7 1,9 ±0,3 1,8 ±0,3

* Оценку количества «нуклеосомных» фрагментов проводили приблизительно по 4-х бальной шкале на основании измерения интенсивности полос в геле с помощью цифровой фотокамеры и программы анализа изображений

Нуклеосомцые фрагменты в ДНК сыворотки ЗД не детектируются Более чем у 80% больных РА в процессе заболевания увеличивается концентрация ДНК сыворотки по сравнению с нормой Наши данные соответствуют данным других авторов, обнаруживающих повышенные уровни циркулирующей ДНК при РА (Galeazzi et al, 2003) Больных разделили на две подгруппы - серопозитивную (РФ+) и серонегативную (РФ-) то РФ, так как РФ является иммунологическим критерием этого заболевания (РФ+) РА характеризуется высокой концентрацией ДНК сыворотки с преобладанием фрагментации до мононуклеосом Для (РФ-) РА характерно более умеренное повышение концентрации ДНК. Основное количество больных анализируемой выборки составляли больные, принимающие метотрексат или лефлюнамид У 10 человек анализ проводили до назначения терапии Количество ДНК в сыворотке этих больных варьировало от 360 до 1130 нг/мл, причем все больные содержали в сыворотке «нуклеосомные» фрагменты ДНК Таким образом, высокий уровень ДНК в сыворотке больных РА связан не только с действием лекарственных препаратов

Максимальные количества сывороточной ДНК и «нуклеосомных» фрагментов детектировались в (РФ+) - группе с высоким уровнем СРБ СРБ относится к острофазовым белкам, образование которых индуцируется в ответ на инфекцию и тканевые повреждения Уровень СРБ отражает процессы деструктивных изменений суставов, активность болезни и используются в клинике как маркер эффективности противовоспалительной терапии На примере 4-х больных РА было показано, что после проводимого в стационаре лечения (метотрексат 7,5 мг/неделю) наряду со снижением комбинированного индекса активности PA (DAS) и уровня СРБ достоверно снижается концентрация сывороточной ДНК Таким образом, высокие концентрации ДНК в сыворотке крови больных РА коррелируют с н&тичием выраженно1 о воспалительною процесса и активным проявлением болезни Наличие «нуклеосомных» фрагментов ДНК может свидетельствовать о массовой гибели клеток по механизму апоптоза и / или замедленной элиминации коротких фрагментов

Концентрация фрагментов рДНК в сыворотке крови больных РА, Для 22 больных РА определено относительное содержание рДНК в сыворотке ДНК сыворотки крови больных РА и ЗД обогащена последовательностями рДНК по сравнению с ДНК, выделенной из ядер Среднее содержание рДНК в сыворотке

больных РА в 7,6 раза превышает среднее содержание рДНК в сыворотке ЗД По этому показателю образцы ДИК больных разделили на три груш ил Данные приводятся на рис 4 У больных, для которых определены очень высокие концентрации рДНК в сыворотке крови, снижены концентрации общей ДНК, РФ и 1§А, что указывает на снижение уровня острой воспалительной реакции и на уменьшение токсических эффектов Повышение уровня ЦИК может говорить о более эффективной утилизации фрагментов погибших клеток Высокие концентрации рДНК в сыворотке на фоне низких концентраций общей ДНК, ассоциируют с уменьшением воспалительной реакции и со снижением уровня активности патологического процесса, который в прошлом был повышен и сопровождался гибелью большого числа клеток организма больного РА

450 -| %

300 -

150

Конц Нуклео- Сигнал рф ЦИК 1дЭ |дА '9М

----- -омныв ......

агмент ДНК

ДНК сомные рДНК фрагменты

Анализируемый показатель

Рис 4 Сравнение данных иммунологического анализа образцов сыворотки больных РА, содержащих в сыворотке малое (группа 1 - белые столбики), умеренное (группа 2 - серые столбики) и большое (группа 3 - черные столбики) количество рДНК За 100% приняты значения соответствующих параметров для больных 3-й группы Отмечены параметры, для которых вероятность сходства между 1 и 3 группами р < 0,1

р = -0,83 р = 0,0004

^ 0,8

*. 0,6

в 0,4 О

р = -0,26 Р = 0,4

0,2

18 20 АкРГ, усл.ед.

Рис 5 Зависимость концентрации ДНК (нг/мл) в сыворотке больных РА от относительного количества АкРГ Цифры на рис - данные линейной регрессии

Таким образом, интенсивность процессов гибели клеток, сопровождающих заболевание - ревматоидный артрит, может быгь оценена по двум взаимодополняющим количественным показателям концентрация общей ДНК в сыворотке крови и концентрация рДНК При низких значениях концентрации общей ДНК вывод об отсутствии или наличии в момент исследования или в недавнем прошлом интенсивной гибели клеток в организме больного РА может быть сделан после тестирования количества рДНК в сыворотке 3.3. Характеристики комплекса РГ больных РА и количественные показатели

Мы не обнаружили статистически значимых корреляций при сравнении общего числа копий РГ и уровня метилирования рДНК с содержанием общей ДНК и рДНК в сыворотке Сопоставление данных о количестве АкРГ в геномах 24 больных РА и концентрацией циркулирующей ДНК позволяет построить зависимость, представленную на рис 5 На кривой можно выделить два участка У больных, для которых количество АкРГ изменяется от ~ 17 до 20,2 услед (группа ам1„), в сыворотке циркулирует относительно мало фрагментов ДНК (однако, это количество в несколько раз превышает норму) При малых количествах АкРГ в геноме (менее 17 уел ед, группа амах) в сыворотке крови обнаруживается значительно больше фрагменте ДНК, при этом выявлена линейная корреляция между анализируемыми

гибели клеток организма.

параметрами Анализ длигг фрагментов ДНК из сыворотки крови больных РА показал, что чем меньше ЛкРГ в геномах тем больше «иуклеосомных» фрагментов содержится в сыворотке крови Таким образом, малое количество АкРГ в геноме больных РА, ассоциирует с усиленной гибелью клеток

Интересные данные получены при сравнительном анализе содержания рДНК в ДНК сыворотки больных РА двух групп Индивиды группы ам,„ содержат на единицу ДНК сыворотки в среднем в 5 раз меньше рДНК У больных с низкими количествами АкРГ. вероятно, нарушено равновесие между количеством ДНК погибающих клеток и скоростью процесса элиминации фрагментов хроматина Количество поступающей в межклеточное пространство ДНК превышает возможности организма элиминировать эту ДНК Об этом говорят очень высокие значения концентраций ДНК в сыворотке В крови накапливаются все фрагменты ДНК, независимо от последовательности При этом относительное содержание рДНК. естественно, снижено

160

120

40 -

17 усл.ед. атах> 17усл.ед.

ФНО-а ИЛ-6 СРВ РФ АКЛ ЦИК Анализируемые показатели

Рис 6 Сравнение данных иммунологического анализа образцов сыворотки больных РА, содержащих в геноме количество АкРГ меньше и больше 17 уел ед За 100% приняты значения соотве1ствующих параметров для больных группы а„¡п Отмечены параметры с вероятностью сходства между группами р < 0,1

Был проанализирован ряд иммунологических показателей, которые обычно используются для оценки выраженности патологического процесса (рис 6) Больные группы ашп содержат в сыворотке повышенное количество белков-цитокинов (фактора некроза опухолей и интерлейкина 6), ревматоидног о фактора, С-реактивного белка и антител к кардиолипину Все перечисленные парметры рассматриваются ревматологами как маркеры активности воспалительного процесса при данной патологии Таким образом, можно сделать предварительный вывод, что патологический процесс при ревматоидном артрите, более выражен у больных, в геномах которых содержится малое количество АкРГ Для окончательного решения вопроса необходимы дальнейшие исследования на больших выборках больных

3.4. Взаимосвязь уровня гибели культивируемых фибробластов кожи и количества АкРГ в клетке при окислительном стрессе.

Для ответа на вопрос имеет ли геномная доза АкРГ фенотипическое проявление в эффективности ответа на окислительный стресс и в последующем выживании клеток исследован ответ штаммов перевиваемых фибробластов кожи, полученных от здорового индивида (штамм 1608) и трех больных ревматоидным артритом (штаммы PAL РА2 и РАЗ) на действие окислителя Доноров клеток кожи выбирали на основе анализа количества АкРГ в лимфоцитах В лимфоцитах донора клеток штамма 1608 и больного РА - донора клеток штамма РА1 была определено примерно одинаковое количество АкРГ (18 9 и 19 1 уел ед), в лимфоцитах доноров клеток штаммов РА2 и РАЗ - значительно меньше П6 8 и 14 4 уел ед) Для всех штаммов определены общее число копий РГ, количество АкРГ а также содержание общей РНК и продукта транскрипции РГ -18S рРНК в клегае (табл 2)

В качестве индуктора окислительиого стресса выбран хромат калия, дейсгвующий в диапазоне концентраций (4-12 мкМ) в течение 24 ч Конфлуентные клетки инкубировали 24 ч в присутствии разных концентраций хромата и, после смены среды, продолжали к\льтивирование клеток еще 96 - 120 часов

Табл 2 Количество общей РНК, 18S рРНК, число копий рДНК в диплоидном ядре и геномная доза активных рибосомных генов в 4-х штаммах фибробластов

№ Штамм, (номер пассажа) Количество общей РЖ, Ro, мкг/мкгДЖ (±SD) Количество 18S рРЖ, rRo, А522/мкгДЖ (±SD) Ro/rRo Число копий РДНК (±SD) Относит-ное количество АкРГ, а, усл.ед (±SE)

1 1608(7) 2 9 ±0 1 0 26 ± 0 04 11,2 340 ±20 19 1 ±05

2 РА1 (4) 2 9 ±0.1 0 23 ± 0 02 12,6 360 ±28 19,4 ±0 3

3 РА2 (4) 2 4 ±0 1 0 18 ±0.01 13,3 300 ±15 16 0 ±0 2

4 РАЗ (4) 2 1 ±0 1 0 13 ±0 01 16,1 260 ±20 14.4 ±0.2

Для фибробластов здорового донора подробно изучена кинетика изменения количества вновь синтезируемой ДНК клеток, количества ДНК в среде культивирования и активность каспазы 3 в течение 4-х суток после замены среды, содержавшей различные количества хромата Было обнаружено, что интенсивные процессы разрушения клеток тестируются через двое суток после смены среды с бмкМ хромата калия снижается количество ДНК в лунке, возрастает количество фрагментов ДНК в среде культивирования и увеличивается уровень активности каспазы 3 (измеряемый как маркер апогггоза) в сохранившихся клетках На рис 7 показаны параметры, характеризующие процесс гибели клеток через 48 часов после смены среды, содержащей 6 мкМ хромата Клетки штамма здорового донора в этих условиях потеряли около 15 % ДНК, в штаммах РА1-3 потери составили 35-70% всей ДНК При этом количество фрагментов ДНК в штамме 1608 увеличилось только на 10%, а в штаммах РА 1-3 на 30-60% Уровень активности каспазы 3 в штамме 1608 увеличился в 2 раза, а в штаммах РА 1-3 - в 3-10 раз Чем больше активных копий РГ содержат клетки, тем медленнее деградирует культура при действии хромата калия, те тем большую стрессовую нагрузку способны преодолеть клетки (рис7) При одинаковом количестве АкРГ клетки, полученные из кожи здорового человека (штамм 1608) более устойчивы к хромату, чем клетки больного (РА1), однако различия в данном случае меньше, чем различия межд\ штаммами РА с различным количеством АкРГ

в,в ■

С,С

0,2 О

0.6

0,4 -

й й а,г -

гЬ

1608 ' РА1 РАЙ РАЗ Анализируемые клепочные линии

Рис 7 Изменения количества ДНК клеток (а), количества ДНК в среде культивирования (б) и уровня активности каспазы 3 (в) в клетках штаммов 1608 и РА1-3 В течение 24 ч клетки культивировали в присутствии 6 мкМ хромата калия, после смены среды культивирование клеток продолжено еще 48 часов М0^, М2д -соответственно среднее количество ДНК клеток из одной лунки через 48 ч после смены среды с хроматом и сразу же после смены среды без хромата, тСг72 -количество фрагментов ДНК в среде к>льтивирования, определенное через 48 ч после смены среды с хроматом, АСг72, А72 - поглощение субстрата каспазы 3, гидролизованного белковым лизатом клеток, соответственно через 48 ч после смены среди с хроматом и среды без хромата Каждая точка на графике - среднее для трех -шести параллельных лунок штншета Объединены результаты двух опытов Показана стандартная ошибка измерения (БЕ)

4. Заключение.

В настоящей работе мы задались целью выявить возможную взаимосвязь между свойствами РГ клетки (организма) и способностью противостоять факторам стресса Были изучены две модели заболевание ревматоидный артрит и культивируемые фибробласты кожи человека при действии небольших доз хромата калия При РА фактором стресса (помимо цитокинов, синтезируемых аномально активированными клетками иммунной системы) является высокий уровень кислородсодержащих радикалов (окислительный стресс) Фибробласты также подвергали действию окислителя - хромата калия

Было обнаружено, что характеристики РГ больных РА изменены по сравнению со здоровыми донорами Несмотря на одинаковое число копий РГ в геномах, относительное количество активных копий РГ у больных РА снижено Вместе с тем к уровню синтеза рРНК в клетках больных РА должны предъявляться повышенные требования, поскольку, в силу пока неизвестных причин, наблюдается снижение количества рРНК в лимфоцитах больных РА по сравнению с лимфоцитами ЗД Мы обнаружили отрицательную корреляцию между количеством АкРГ в геномах больных РА и общим уровнем гибели клеток организма, который тестировали, измеряя размеры фрагментов, общее количество ДНК сыворотки крови и количество устойчивого к фрагментации рибосомного повтора Количества АкРГ в геномах больных РА, ниже адаптивной нормы (17-19 уел ед ), как правило, приводят к очень высоким показателям деградации клеток При этом системы элиминации фрагментов ДНК деградированных клеток не справляются с большим количеством фрагментов На это указывают низкие значения концентраций рДНК в сыворотке Для группы больных с низкими значениями АкРГ иммунологические показатели также указывают на усиление активноеш патологическою процесса Если геном борного содержит много АкРГ (более 18 уел ед ). то, даже в активной стадии болезни, количественные показатели гибели клеток существенно снижены, хотя и отличаются от нормальных значений (ЗД) Анатогичные данные были получены при исследовании действия окислителя на культивируемые фибробласты ЗД и больных РА Линии клеток, полученные от больных РА с низкими количествами АкРГ, при действии окислителя подвергаются апоптозу в существенно большей степени, чем линия с высокими количествами АкРГ

Таким образом, на двух модельных системах in vivo и т vitro мы обнаружили признаки влияния количества активных копий РГ в геноме на интенсивность процессов гибели клеток В рамках проводимого исследования для лимфоцитов ЗД и культивируемых фибробластов кожи человека мы впервые обнаружили, что количество общей РНК и рРНК (а значит, и число рибосом) в клетке при физиологических условиях пропорционально количеству АкРГ в геноме (см например табл 2) Эти данные позволяют предположит!., что количество активных копий РГ, возможно, оказывает влияние на показатели клеточной устойчивости к стрессу не только в анализируемых нами системах

ВЫВОДЫ

1 Впервые охарактеризован комплекс рибосомных генов больных ревматоидным артритом в сравнении с комплексом рибосомных генов практически здоровых доноров Установлено, что

(1) больные в среднем содержат такое же общее число рибосомных повторов, что и здоровые доноры,

(2) больные в среднем содержат меньшее относительное количество активных копий рибосомных генов,

(3) уровень метилирования транскрибируемой области рДНК комплекса рибосомных генов больных существенно снижен;

(4) в лимфоцитах больных определяется значительно меньшее количество рибосомной РНК

2 Пред южен новый метод оценки общею уровня гибели клеток в организме Метод предполагает определение размеров фрагментов и общей концентрации ДНК в сыворотке крови в сочетании с определением концентрации фрагмента транскрибируемой области рДНК

3 Впервые показано, что на количественные показатели гибели клеток в ор1анизме больных РА влияет общий уровень активности комплекса рибосомных генов

4 Впервые показано что интенсивность процесса агоштоза клеток при окисли к- 1ьном стрессе коррелирует с количеством активных рибосомных генов в i о(юме

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1 Спиридонов Л А , Сперанский А И, Иванова С М, Шубаева НО, Сухарева Т В К вопросу о роли апоптоза в генезе образования аневризмы аорты Материалы 8-го Всероссийского съезда сердечно-сосудистых хирургов Доклад Москва, 2002 С 256

2 Спиридонов А А , Аракелян В С , Иванова С М , Сухарева Т В , ПТубаева Н О . Самсонова Н П, Самуилова Д Ш Высокий апоптотический индекс, сдвиги в иммунной системе и нарушение системы гемостаза у больных аневризмой аорты Материал 1-го Всероссийского Съезда гематологов-трансфузиологов Стендовый доклад Москва, 2003 С 214

3 Спиридонов А А , Аракелян В С , Иванова С М. Сухарева Т В , Шубаева НО Иммуновоспалительные реакции при "апоптотической" аневризме, возможные причины периоперационных осложнений при операциях на аорте Материалы 9-го Всероссийского съезда сердечно-сосудистых хирургов Доклад Москва, 2003 С 145

4 Шубаева НО , Иванова С М , Вейко Н Н , Рязанцева Т.А, Сперанский А И Изучение ДНК в сыворотках больных СКВ Научно-практический журнал ревматология Материалы I Всероссийского конгресса ревматологов Стендовый доклад Саратов, 2003 №2 С 113

5 Вейко Н Н , Еголина Н А , Радзивилл Г Г , Нурбаев С Д . Косякова П В , Шубаева НО. Ляпунова Н А Количественное определение повторяющихся последовательностей в геномной ДНК человека Обнаружение увеличенного количества рибосомных повторов в геномах больных шизофренией (результаты молекулярного и цитогенетического анализа) Молекулярная биология 2003 Т37 С 409-419

6 Иванова С М, Зацепина О В , Карпова Г Г , Шубаева НО Антинуклеарные антитела при системных заболеваниях соединительной ткани Медицинская иммунология. Материалы VII Всероссийского научного форума "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" Доклад Санкт-Петербург, 2003 Т.5 №3-4. С 254

7 Харлашина JI Я, Марчук Н В , Смирнов А В , Шубаева Н О , Иванова С М Клинико-иммунологические аспекты Clamydia trachomatis (Ct) в развитии урологической и ревматологической патологии Материалы Пленума Российского общества урологов Тезисы докладов Саратов, 2004 С 369-370

8 Иванова С М, Рязанцева Т А , Шубаева НО, Сперанский А И Клинико-иммунологические механизмы развития РА и СКВ Медицинская иммунология Материалы Съезда иммунологов России Тезисы докладов Екатеринбург, 2004 Т 5 №3 С 254.

* 9 Шубаева НО, Цветкова ТГ, Иванова СМ, Сперанский А И* . Цветкова 1 Г,

Вейко Н Н , Спитковский Д М, Ляпунова Н А Взаимосвязь интенсивности процессов апоптоза клеток в организме и количества активных рибосомных генов в геноме при i заболевании ревматоидным артритом Тезисы докладов Третий съезд Вавиловского

общества генетиков и селекционеров России "Генетика в веке современное состояние и перспективы развития" Москва, 2004 С 254

10 Терехов С М, Вейко Н Н, Смирнова Т Д , Иванова С М. Шубаева Н О , Еголина Н А , Ляпунова Н А , Спитковский Д М Ранний и поздний о гвет культивируемых

фибробластов человека на окислительный стресс Тезисы докладов Третий съезд Вавилонского общества генетиков и селекционеров России "Генетика в веке' современное состояние и перепек гивы развития". Москва, 2004 С 211

11. Шубаева Н О. Иванова С М, Вейко Н Н , Рязанцева Т А Алоптоз при РА и СКВ XI Материалы Российского национального конгресса "Человек и лекарство" Тезисы докладов Москва, 2004 С 597

12 Shubaeva NO. Veiko NN, Ivanova SM, Speransky A I. Spitkovsky DM, Lyapunova N A Intensity of the cell apoptosis against the number of active nbosomal genes in the genomes of rheumatic arthritis patients Stand report Annual European Congress of Rheumatology "EULAR 2004" Berlin, Germany 2004 Abstract P 166

13 Terekhov S M, Veiko N N . Smimova T D , Ivanova S M , Shubaeva N О . Egolina N A , Lyapunova N A , Spitkovsky D M. "Early" and "late" response of cultivated human fibroblasts for oxidative stress Stand report Annual European Congress of Rheumatology "EULAR 2004" Berlin, Germany 2004 Abstract P 165

14 Иванова С M, Щубаева Н О. Прусов А Н , Сперанский А И Алгоритм АНФ при обследовании больных с системными заболеваниями соединительной ткани Клиническая лабораторная диагностика Материалы конгресса "Национальные дни лабораторной медицины России " Тезисы доклада Москва, 2004 №9 С 13

15 Купавцева О А, Иванова С М, Рязанцева Т А , Шубаева Н О, Сперанский А И Артериальная гипертония (АГ) и клинико-иммунологические ассоциации при ревматоидном артрите (РА) Клиническая лабораторная диагностика Материалы конгресса "Национальные дни лабораторной медицины России " Тезисы доклада Москва, 2004 №9 С 21

16 Вейко Н Н , Терехов С М. Шубаева Н О . Смирнова Т Д, Иванова С М , Еголина Н А, Цветкова Т Г , Спитковский Д М, Ляпунова Н.А «Ранний» и «поздний» ответ культивируемых фибробластов кожи здоровых доноров и больных ревматоидным артритом на окислительный стресс Взаимосвязь между интенсивностью гибели клеток и количеством активных копий рибосомных генов Молекулярная биология. 2005 Т 39 №2.

17 Ivanova SM, Veiko ТТ, Shubaeva N О, Speransky AI Nucleosomes and autoantibody International Journal of Immunoreabilitation Materials of II International Congress on Immunopatologv and Allergology 2004 Vol 6 №2 P 227

Формат 60x84/16 Гарнитура Times New Roman Уел п л 1.05 Гираж70экз

»-б 09 5

РНБ Русский фонд

2006-4 4197

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шубаева, Наталья Олеговна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Структурно - функциональная организация рибосомных повторов человека (млекопитающих).

1. Структура рибосомных повторов человека.

2. Число копий рибосомных повторов в геноме человека

2.1. Определение содержания рДНК в геноме человека.

2.2. Изменение числа копий рДНК при патологии и при старении.

3. Метилирование рибосомных повторов.

3.1. Метилирование рибосомных повторов человека и мл екопитаю щих.

3.2. Влияние метилирования на транскрипцию РГ. Изменение метилирования рДНК при патологии и старении.

4. Активные копии рибосомных генов в геноме человека.

Ag - окраска ЯОР хромосом.

5. Генные болезни, связанные с нарушением транскрипции и процессинга рРНК.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Пациенты.

2. Определение биохимических и иммунологических показателей.

3. Определение общего числа копий РГ в геномной ДНК человека.

3.1 Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови.

3.2. Определение концентрации ДНК.

3.3. Нерадиоактивная дот-гибридизация образцов ДНК с зондом на рДНК.

3.4. Определение гибридизационного сигнала.

3.5. Построение калибровочных зависимостей для зонда.

3.6. Определение количественного показателя метилирования.

3.7. Стандартная ошибка метода.

4. Исследование ответа культивируемых фибробластов на окислительный стресс.

4.1. Культуры клеток.

4.2. Схема эксперимента.

4.3. Определение общего количества РНК и ДНК.

4.4. Определение количества рРНК в образцах нуклеиновых кислот, выделенных из клеток.

4.5.0пределение ферментативной активности каспазы 3.

5. Выделение и анализ фрагментов ДНК сыворотки больных РА и среды культивирования фибробластов кожи.

6. Определение относительного количества активных РГ (АкРГ).

7. Статистическая обработка результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Характеристика комплекса рибосомных генов больных ревматоидным артритом.

1.1. Общее число копий РГ в геномах больных РА.

1.2. Относительные количества активных копий РГ в геномах больных РА.

1.3. Кластеры молчащих рибосомных генов в геномах больных РА.

1.4. Уровень метилирования транскрибируемой области РГ больных РА.

1.5. Количество продукта транскрипции РГ в лимфоцитах больных РА.

1.5.1. Сопоставление относительного количества АкРГ (а) и количества РНК (рРНК) в неделящихся клетках.

1.5.2. Уровень РНК (рРНК) в лимфоцитах больных РА.

2. Разработка количественного метода оценки уровня апоптоза клеток организма.

2.1. Определение концентрации и размера фрагментов ДНК в сыворотке крови больных РА.

2.2. Изменение концентрации ДНК сыворотки в процессе лечения.

2.3. Определение фрагмента гена рРНК в сыворотке крови больных РА.

3. Характеристики комплекса РГ больных РА и количественные показатели гибели клеток организма.

4. Ответ культивируемых фибробластов кожи здоровых доноров и больных РА на окислительный стресс. Взаимосвязь скорости гибели клеток и количества активных копий РГ в геноме.

4.1. Ответ культивируемых фибробластов кожи здоровых доноров на окислительный стресс.

4.2. Количество активных рибосомные генов в геноме и интенсивность гибели клеток при действии хромата калия.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетические характеристики рибосомных генов и процессы гибели клеток у больных ревматоидным артритом"

Гены, кодирующие рибоссжные РНК (рРНК), имеют принципиальное значение для функционирования эукариотической клетки. Продукты этих генов (28S, 18S, 5.8S рРНК) являются составными частями рибосом -структур, в которых происходит трансляция генетической информации. Молекулы рРНК должны синтезироваться в больших количествах, так как для трансляции одной копии мРНК необходимо несколько рибосом, а в клетке содержится несколько сотен или тысяч mPIIK и каждая из них представлена множеством копий. В геноме человека содержится примерно 250 - 650 копий рибосомных генов. Активность рибосомных генов определяется не только общим количеством копий, но и наличием эпигенетических мутаций - метилирования цитозинового основания [Bird 1981]. Изменение количества РГ и уровня их метилирования, и, как следствие, изменение активности, может существенным образом сказываться на функционировании клетки и организма в целом.

Согласно современным представлениям, воздействие стрессорных факторов самой разной природы вызывает в компетентных клетках неспецифический ответ, выражающийся в прекращении нормального синтеза белков и переключении на синтез комплекса защитных белков. Способность клетки синтезировать в ответ на стресс быстро и в нужном количестве необходимые для выживания белки определяется рядом факторов -наличием соответствующих мРНК, эффективностью трансляции и количеством рибосом. Количество рибосом в клетке зависит от транскрипционной активности рибосомных генов и важно, как с точки зрения ее нормального функционирования, так и для ответа на различные экзо - и эндогенные факторы стресса. Предполагается, что скорость синтеза рибосом определяется скоростью синтеза 45S рРНК [Hannan К.М. et al., 1998], которая, в свою очередь, может зависеть от числа транскрибируемых копий РГ. Вышеизложенные соображения позволили нам высказать предположение о том, что свойства комплекса РГ клетки, и в первую очередь количество активных копий РГ, могут существенным образом влиять на интенсивность процессов гибели клеток при действии стрессорных факторов.

В работе была поставлена задача: исследовать возможную взаимосвязь между свойствами комплекса рибосомных генов и количественными показателями гибели клеток при действии широко распространенного в природе окислительного стресса. В качестве модельных систем для исследования мы выбрали аутоиммунное заболевание — ревматоидный артрит, для которого характерен интенсивный окислительный стресс, и культивируемые в присутствии малых доз окислителя фибробласты кожи человека. Для решения поставленной задачи были разработаны экспериментальные подходы, позволяющие определять уровень апоптоза клеток организма и культуры клеток по продуктам деградации клеточной ДНК.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Структурно-функциональная организация рибосомных повторов человека (млекопитающих).

1. Структурарибосомпого повтора человека.

Во всех организмах реализация генетической информации, заключенной в ДНК, в конкретные белковые структуры происходит на клеточных органеллах - рибосомах. Рибосомы катализируют трансляцию молекул мРНК в белки. Их число колеблется от 20 ООО до 50 ООО в зависимости от активности синтеза белка данной клеткой. Тип синтезируемого рибосомой белка в каждом синтетическом цикле диктуется mPIIK, с которой рибосома оказалась связанной. Рибосомы эукариот, находящиеся в цитозоле, состоят из малых (40S) и больших (60S) субчастиц. Малые субчастицы содержат 1 молекулу РНК (18S) размером ~ 1900 нуклеотидов и 30-35 белков; большие - 3 цепи РНК длиной 120 (5S), 160 (5.8S) и -5000 (28S) нуклеотидов и 45-50 белков.

Гены трех рибосомных РНК (18S, 28S и 5,8S) организованы у большинства организмов в виде тандемно повторяющихся последовательностей, при этом транскрибируемые области чередуются с нетранскрибируемыми участками (спейсерами). Иногда в состав повторяющейся единицы входит ген 5S рРНК. Однако, в геномах большинства эукариотических организмов (в том числе и у человека) кластеры генов 5S рРНК и трех рРНК располагаются в разных, не связанных между собой участках генома. 18S, 28S и 5,8S молекулы рРНК человека транскрибируются в виде единой молекулы предшественника - 45S рРНК в результате работы фермента РНК-полимеразы I.

Одна копия рибосомного повтора человека (РП) содержит 42998 пар оснований. Первичная последовательность РП человека полностью определена в 1995 году [см. NCBI Sequence Viewer, HSU13369, Human ribosomal DNA complete repeating unit]. В структуре РП выделяют транскрибируемую область (длина 13369) и нетранскрибируемый межгенный спейсер (NTS). Кодирующие области генов 18S-, 5,8S- и 28S-pPHK эукариот сгруппированы в указанном порядке в одну транскрипционную единицу. Все три РНК образуются из длинного транскрипта - предшественника в результате процессинга, включающего расщепление РНК эндонуклеазами, введение псевдоуридина и метилирование. Транскрибируемая область (полная транскрипционная единица) содержит два некодирующих спейсера (называемых внутренними транскрибируемыми спейсерами, ITS), которые разделяют три кодирующие области, а также имеет некодирующие участки перед первым геном 18S-pPHK и за последним геном 28S-pPHK (эти участки называются внешними транскрибируемыми спейсерами, ETS) (см. схему на рис.1). При процессинге рибосомной РНК транскрибируемые спейсеры удаляются [Long et.al, 1980]. В целом внутри рибосомного повтора человека и большинства эукариот наблюдается чередование консервативных и вариабельных участков. Замечено, что консервативные последовательности в рДНК соответствуют двухспиральным структурам РНК в составе рибосом,

18S 5.8S 28 S

77" са тяшш m гл яшшттт m ал ran v5 v8

Рис.1. Транскрипционная единица РП человека (цитируется но работе Kuo el all. 1996). Показаны вариабельные районы 28S рДНК (VI - VII). 5*ETS - внешний транскрибируемый спейсер (основания 1- 3656): 3'ETS - внешний транскрибируемый спейсер (основания 12970-13314); ITS1 - внутренний транскрибируемый спейсер (5527-6623); ITS2 - внутренний транскрибируемый спейсер (6779-7935); NTS - нетранскрибируемый межгенный спейсер (основания 13314-42999). вариабельные участки - односпиралъным структурам РНК. В процессе эволюции наблюдается увеличение длины генов 18S- и 28S рРНК и транскрибируемых спейсеров, однако общие принципы структурной организации повтора остаются неизменными. Особенно сильно варьирует размер гена большой субъединицы рибосом: дрожжи (26S) - 3788 п.н. [Otsuka et а!., 1983], дрозофила (26S) - 3945 п.н. [Tautz et al., 1988], мышь (28S) - 47L2 п.н. [Hassouna et al., 1984], человек (28S) - 5035 п.н. [Gonzalez et al., 1985]. Эта изменчивость обусловлена наличием вариабельных по длине и последовательности районов, диспергироваными между консервативными основными последовательностями, которые сохраняют общую пространственную структуру кодируемой молекулы 28S рРНК [Hancock et al., 1988]. У человека наблюдаются инсерции и замены нуклеотидов в 1 1 вариабельных участках 28S рРНК. Наиболее изучен один из самых вариабельных районов - V5 (порядковые нуклеотиды 2065-2244, рис. 1) [Kuo et al., 1996]. Из 7 случайно отобранных клонов, содержащих этот участок - 6 обнаружили полиморфизм последовательности. Показаны существенные межиндивидуальные различия в последовательности этого района. Однако в пределах одного генома также были выявлены несколько типов последовательностей У5-района. Авторами обнаружен интересный феномен: количественные пропорции транскриптов различной последовательности одинаковы в разных тканях одного и того же организма. Неодинаковое содержание вариантов 28S рРНК У5-района в суммарном образце рРНК авторы объясняют различиями в регуляции транскрипции. Леффер и Андерсен [Leffer, Andersen, 1993] исследовали 111 фрагментов У8-района (рис.1) из 9 культивируемых линий и тканей человека и обнаружили 35 вариантов последовательности. Вариации затрагивают в основном два участка, которые разделены 170 нуклеотидами, но пространственно в третичной структуре рРНК сближены.

Точечные мутации найдены в консервативных районах гена 28S рРНК. Вариант наличия А или G нуклеотида в положении +60 встречается с разной частотой у человека. Замена А на G произошла сравнительно недавно и не обнаруживается у других приматов. Авторы сообщают о преимущественной транскрипции с одного из вариантов копии рДНК. В геноме Hela содержится 15% копий рДНК с А-нуклеотидом в положении +60 гена 28S рРНК, при этом продукта этой копии гена в клетке содержится всего 1% от общего количества копий 28S рРНК [Qu et all., 1991].

Внутривидовая вариабельность транскрибируемых спейсеров человека приблизительно соответствует вариабельности 28S рДНК [Gonzalez et all.,

1990]. Последовательности содержат простые повторы и микросателлитные мотивы. Спектры микросателлитных повторов разных видов частично перекрываются, при этом встречаются и видоспецифичные варианты повторов [Nanda et. all., 1991; Брага и соавт., 1995; Рысков и соавт., 1993]. ITS-1 человека, мыши, крысы и обезьян имеют сходство, 1TS-2 и 3 - внешний транскрибируемый спейсеры этих видов негомологичны [Gonzalez et. all. 1990]. Наибольшая внутривидовая вариабельность характерна для межгенных нетранскрибируемых спейсеров. Длина этих спейсеров варьирует у разных особей одного вида и даже внутри генома одного организма [Gonzalez et all., 1995; Kupriyanova et all., 1982; Ranzani et all., 1984; Castro et all., 1997]. Полиморфизм обусловлен неодинаковым числом определенных повторов в кластерах, составляющих нетранскрибируемый спейсер. При изучении структуры рДНК в космидных клонах хромосомы 13 человека найдены варианты клонов с крупными делениями в области нетранскрибируемого спейсера с точками разрыва в (ТС)п-кластерах [Kirilenko et.al., 2000]. Авторами одной из работ при исследовании образцов ДНК 51 индивида обнаружено 8 структурных вариантов BamHl- фрагментов области нетранскрибируемого спейсера, прилегающей к точке терминации транскрипции [Garkavtsev et all., 1988]. Два варианта оказались общими для всех индивидов и 6 вариантов присутствовали в геномах в различных количествах копий на геном и в разных комбинациях. Вариабельность обусловлена различным числом копий повтора. Показано наследование определенных вариантов структуры описываемого участка. Другой тип полиморфизма - точковые замены оснований на всем протяжении рибосомного повтора. Особенно часто замены встречаются в предпромоторной области [Arnheim et all., 1980; Kuick et all., 1996].

Основной принцип организации РГ эукариот - это тандемные повторы. Однако в ряде случаев в геноме были обнаружены отдельно расположенные вне тандемного повтора участки рДНК, которые называют орфонами. Например, на отдаленном от тандемного повтора рДНК участке 22 хромосомы человека выявлены внекластерные рДНК - подобные последовательности (гомологичные 28 S рДНК и районам нетранскрибируемого спейсера) [Gonzalez et all., 1997а]. Амплификация отдельных фрагментов нетранскрибируемого спейсера и изменение их мест локализации наблюдается в опухолевых клетках [Crossen et all., 1985; Solomon et all., 1991]. В геноме человека выявлено более 50 гибридных участков, включающих отдельные фрагменты гена 28 S рРНК и последовательности, негомологичные рДНК [Gonzalez et all., 1997]. Имеются данные о клонировании четырех гибридных фрагментов генома человека с фрагментами 18S рДНК [Brownell et all., 1983]. Как правило, последовательности рДНК, обнаруживаемые вне кластера тандемных повторов неактивны, т.е. являются псевдогенами. Однако имеются данные о том, что наличие промоторной области в искуственно встроенном в геном участке рДНК может приводить к транскрипции этого фрагмента РНКполимеразой 1 [Nadjiargyrou et al., 1994].

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Шубаева, Наталья Олеговна

ВЫВОДЫ.

1. Впервые охарактеризован комплекс рибосомных генов больных ревматоидным артритом в сравнении с комплексом рибосомных генов практически здоровых доноров. Установлено, что

1) больные в среднем содержат такое же общее число рибосомных повторов, что и здоровые доноры;

2) больные в среднем содержат меньшее относительное количество активных копий рибосомных генов;

3) уровень метилирования транскрибируемой области рДНК комплекса рибосомных генов больных существенно снижен;

4) в лимфоцитах больных определяется значительно меньшее количество рибосомной РНК.

2. Предложен новый метод оценки общего уровня гибели клеток в организме. Метод предполагает определение размеров фрагментов и общей концентрации ДНК в сыворотке крови в сочетании с определением концентрации фрагмента транскрибируемой области рДНК.

3. Впервые показано, что на количественные показатели гибели клеток в организме больных РА влияет общий уровень активности комплекса рибосомных генов.

4. Впервые показано, что интенсивность процесса апоптоза клеток при окислительном стрессе коррелирует с количеством активных рибосомных генов в геноме.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В настоящей работе мы задались целью выявить возможную взаимосвязь между свойствами системы РГ клетки (организма) и способностью эффективно противостоять факторам стресса. Были изучены две модели: заболевание ревматоидный артрит и культивируемые фибробласты кожи человека при действии небольших доз хромата калия. При РА фактором стресса (помимо цитокинов, синтезируемых аномально активированными клетками иммунной системы) является высокий уровень кислородсодержащих радикалов (окислительный стресс). Фибробласты также подвергали действию окислителя - хромата калия.

Было обнаружено, что система РГ больных РА изменена по сравнению со здоровыми донорами. Несмотря на одинаковое число копий РГ в геномах, относительное количество активных копий РГ у больных РА снижено. Вместе с тем к уровню синтеза рРНК в клетках больных РА должны предъявляться повышенные требования, поскольку, в силу пока неизвестных причин, наблюдается снижение количества рРНК в лимфоцитах больных РА по сравнению с лимфоцитами ЗД. Мы обнаружили отрицательную корреляцию между количеством АкРГ в геномах больных РА и общим уровнем апоптоза клеток организма, который тестировали, измеряя размеры фрагментов, общее количество ДНК сыворотки крови и количество устойчивого к фрагментации рибосомного повтора. Количества АкРГ в геномах больных РА, ниже адаптивной нормы (17 - 19 усл.ед.), как правило, приводят к очень высоким уровням деградации клеток. При этом системы элиминации фрагментов ДНК деградированных клеток не справляются с большим количеством фрагментов. На это указывают низкие значения концентраций рДНК в сыворотке. Для группы больных с низкими значениями АкРГ иммунологические показатели также указывают на усиление активности патологического процесса. Если геном больного содержит много АкРГ (более 18 усл.ед.), то, даже в активной стадии болезни, количественные показатели апоптоза клеток существенно снижены, хотя и отличаются от нормальных значений (ЗД).

Аналогичные данные были получены при исследовании действия окислителя на культивируемые фибробласты ЗД и больных РА. Линии клеток, полученные от больных РА с низкими количествами АкРГ, при действии окислителя подвергаются апоптозу в существенно большей степени, чем линии с высокими количествами АкРГ.

Таким образом, на двух модельных системах мы обнаружили признаки влияния количества АкРГ в геноме на интенсивность процессов гибели клеток. В рамках проводимого исследования для лимфоцитов ЗД и культивируемых фибробластов кожи человека мы впервые обнаружили, что количество общей РНК и рРНК (а значит, и число рибосом) в клетке пропорционально количеству АкРГ в геноме. Эти данные позволяют предположить, что количество активных копий РГ, возможно, оказывает влияние на показатели клеточной устойчивости к стрессу не только в анализируемых нами системах.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шубаева, Наталья Олеговна, Москва

1. Барышников АЛО., Шишкин Ю.В. Иммунологические проблемы апоптоза. // Москва. 2002. - УРСС. - С.263-271.

2. Вейко Н.Н. Структурно-функциональная организация рибосомных повторов человека. // Дисс. д-ра биологических наук. М. 2001. -121с.

3. Вейко Н. Н., Карпухин А. В., Салимов А. Г., Немцова М. В., Спитковский Д. М. // Биотехнология. 1989. - Т. 5. - С. 414-418.

4. Дерффель К. Статистика в аналитической химии. // Изд-во «Мир». Москва. 1994.

5. Ю.Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. «Мир». 1991.

6. П.Егорова В.П., Власов А.П., Досин Ю.М., Курило Г. И., Ландо Д.Ю. Влияние чистоты и молекулярной массы ДНК на свойства растворов и высокоориентированных пленок // II съезд биофизиков России. Тезисы. -М., 1999.

7. Ковальчук Л.В, Чередеев А.Н. Апоптогенез иммуно дефицитных заболеваний. //Russian J. Immunology. 1999. - Vol.4 (1). - P. 1-9.

8. З.Ляпунова H.A., Вейко H.H. Рибосомные гены в геноме человека: структурно-функциональная организация, фенотипическое проявление и связь с патологией. // 2004. Сайт РАМН.

9. Мхитарова Е. В., Еголина Н. А., Гарькавцев И. В. Ляпунова Н.А. Захаров А.Ф. // Бюл. эксп. биологии и медицины. 1988. - Т. 105. - С.63-65.

10. Подопригорова В.Г., Бобылев А.А., Иванова С.М., Сперанский А.И. Дисрегуляция оксидативных и аутоиммунных процессов у больных системной красной волчанкой и ревматоидным артритом. // Ревматология. 2004.

11. Программированная клеточная смерть. // Под ред. Новикова B.C. СПб. «Паука». 1996.

12. Уоллис Д., Метцгер А., Эшман Р. Г., Лолор-мл., Т. Фишер, Д. Адельман (ред.). Клиническая иммунология и аллергология. // Пер. с англ. Москва, «Практика». 2000.

13. Цой П.К. Свободнорадикальное окисление в медицине и фармации. // Фармацевтический вестник. 2002. - Т.153, № 5.

14. Antequera F., Boyes J., Bird A. High levels of de novo methylation and altered chromatin structure at CpG islands in cell lines. // Cell. 1990. -Vol.62.-P.503-514.

15. Araujo V, Arnal C, Boronat M, Ruiz E, Dominguez C. Oxidant-antioxidant imbalance in blood of children with juvenile rheumatoid arthritis. // Biofactors. 1998. - Vol.8. - P.l55-159.

16. Arnheim N., Krystal M., Schmickel R., Wilson G., Ryder O., Zimmer E. Molecular evidence for genetic exchanges among ribosomal genes on nonhomologous chromosomes in man and apes. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. - Vol.77. - P.7323-7327.

17. Attardi G, Amaldi F. Structure and synthesis of ribosomal RNA. // Annu. Rev. Biochem. 1970. - Vol.39. - P.183-226.

18. Aubry J.P., Blaecke A., Lecoanet-Henchoz S., Jeannin P., Herbault N., Caron G., Moine V., Bonnefoy J.Y. Annexin V used for measuring apoptosis in the early events of cellular cytotoxicity. // Cytometry. 1999. - Vol.1. - P. 197204.

19. Bagchi D., Bagchi M., Stohs S.J. Chromium (Vl)-induced oxidative stress, apoptotic cell death and modulation of p53 tumor suppressor gene. // Mol. Cell Biochem.-2001. Vol.222. - P. 149-158.

20. Baier A., Meineckel I., Gay S., Pap T. Apoptosis in rheumatoid arthritis. // Curr. Opin. Rheumatol. 2003. - Vol. 15. - P.274-279.

21. Bird A.P. DNA methylation versus gene expression // J. Embryol. Exp. Morphol.- 1981. -Vol.83. -P.31-34.

22. Bird A.P. Methylation of the genes for 18S, 28S, and 5S ribosomal RNA. // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1984. - Vol.108. - P. 129-141.

23. Bird A.P. The relationship of DNA methylation to cancer. // Cancer Surv. -1996.-Vol.28.-P.87-101.

24. Birnstiel M.L. Sells B.H., Purdom I.F. Kinetic complexity of RNA molecules. // J. Mol. Biol. 1972. - Vol.63. - P.21-39.

25. Branderburger Y., Jenkins A., Autelitano D.J., Hannan R.D. Increased expression of UBF is a critical determinant for rRNA synthesis and hypertrophic growth of cardiac myocytes. // FASEB J. 2001. — Vol.15. — P.2051-2053.

26. Bridgewater L.C., Manning F.C., Woo E.S., Patlerno S.R. DNA polymerase arrest by adducted trivalent chromium. // Mol. Carcinog. 1994. - Vol.9. -P.122-133.

27. Bross К., Krone W. On the number of ribosomal RNA genes in man // Humangenet. 1972. - Vol. 14. - P. 13 7-141.

28. Bross K., Krone W. Ribosomal cistron and acrocentric chromosomes in man. // Human Genet. 1973. - Vol.18. - P.71 - 75.

29. Brownell E., Krystal M., Arnheim N. Structure and evolution of human and African ape rDNA pseudogenes. // Mol. Biol. Evol. 1983. - Vol.1. - P.29-37.

30. Buys H.M., Osinga J. Abundance of protein bound sulfhydril- and disulfide group at chromosomal nucleolus organizer regions // Chromosoma. 1980. -Vol.77. -P.l-11.

31. Carlisle D.L., Pritchard D.E., Singh J., Patierno S. Chromium(VI) induces p53-dependent apoptosis in diploid human lung and mouse dermal fibroblasts. // Mol. Carcinog. 2000. - Vol.28. - P.l 11-118.

32. Chen F., Ding M., Lu Y., Leonard S.S., Vallyathan V., Castranova V., Shi X. Participation of MAP kinase p38 and IkappaB kinase in chromium (VI)-induced NF-kappaB and AP-1 activation. // J. Environ. Pathol. Toxicol. Oncol. 2000. - Vol. 19. - P.231-238.

33. Chen J., Thilly W.G. Mutational spectrum of chromium(VI) in human cells. // Mutat. Res. 1994. - Vol.323. - P.21-27.

34. Cheng R., Hockman Т., Crawford E., Anderson L.M., Shiao Y.H. Epigenetic and gene expression changes related to transgenerational carcinogenesis. // Mol. Carcinog. 2004. - Vol.40. - P. 1-11.

35. Chuang S.M., Liou G.Y., Yang J.L. Activation of JNK, p38 and ERK mitogen-activated protein kinases by chromium(Vl) is mediated through oxidative stress but does not affect cytotoxicity. // Carcinogenesis. 2000. -Vol.21. -P.1491-1500.

36. Clark S.J, Harrison J., Frommer M. CpNpG methylation in mammalian cells. // Nat. Genet. 1995. - Vol.10. - P.20-27.

37. Conconi A., Widmer R.M., Koller Т., Sogo J.M. Two different chromatin structures coexist in ribosomal RNA genes throughout the cell cycle. // Cell. -1989,-Vol.2.-P.753-761.

38. Corvetta A., Delia Bitta R., Luchetti M.M., Pomponio G. 5-Methylcytosine content of DNA in blood, synovial mononuclear cells and synovial tissue from patients affected by autoimmune rheumatic diseases. // J. Chromatogr. -1991. Vol. 31. - P.481-491.

39. Cote B.D., Uhlenbeck O.C., Steffensen D.M. Quantitation of in situ hybridization of ribosomal ribonucleic acids to human diploid cells. // Chromosoma. 1980. - Vol.80. - P.349-367.

40. Courtney P.A., Crockard A.D., Williamson K., McConnell J., Kennedy R.J., Bell A.L. Lymphocyte apoptosis in systemic lupus erythematosus: relationships with Fas expression, serum soluble Fas and disease activity. // Lupus. 1999.-Vol.8.-P.508-513.

41. Crossen P.E., Godwin J.M. Rearrangement and possible amplification of the ribosomal RNA gene sites in the human chronic myelogenous leukemia cell line K562. // Cancer Genet. Cytogenet. 1985. - Vol.18. - P.27-30.

42. Cutler R.G. Redundancy of information content in the genome of mammalian species as a protective mechanism determining aging rate. // Mech. Ageing Dev. 1973. - Vol.2. - P.381-408.

43. D'Auria F., Rovere-Querini P., Giazzon M., Ajello P., Baldissera E., Manfredi A.A., Sabbadini M.G. Accumulation of plasma nucleosomes upon treatment with anti-tumour necrosis factor-alpha antibodies. // J. Intern. Med. 2004.A1. Vol.255.-P.409-418.

44. De Castro C.M., Rabe S.M., Langdon S.D., Fleenor D.E., Slentz-Kesler K., Ahmed M.N., Qumsiyeh M.B., Kaufman R.E. Genomic structure and chromosomal localization of the novel ETS factor, PE-2 (ERF). // Genomics. 1997. - Vol.42. - P.227-235.

45. Dclany M.E., Muscarella D.E., Bloom S.E. Effects of rRNA gene copy number and nucleolar variation on early development: inhibition of gastrulation in rDNA-deficient chick embryos. // J. Hered. 1994. - Vol.85.1. P.211-217.

46. Derenzini M. The AgNORs. // Micron. 2000. - Vol.31. - P. 117-120.

47. Diala E.S., Cheah M.S., Rowitch D., Hoffman R.M. Extent of DNA methylation in human tumor cells. // J. Natl. Cancer Inst. 1983. - Vol.71. -P.755-764.

48. Dittes H., Krone W., Bross K., Schmid M., Vogel W. Biochemical and cytogenetic studies on the nucleolus organizing regions (NOR) of man. II. A family with the 15/21 translocation. // Humangenetik. 1975. - Vol.26.1. P.47-59.

49. Ellis N.A., Groden J., Ye T.Z., Straughen J., Lennon D.J., Ciocci S., Proytcheva M., German J. The Bloom's syndrome gene product is homologous to RecQ helicases. // Cell. 1995. - Vol.83. - P.655-666.

50. Ferraro M., Prantera G. Human NORs show correlation betweentranscriptional activity, DNase I sensitivity, and hypomethylation. // Cytogenet. Cell Genet. 1988.-Vol.47.-P.58-61.

51. Froebel К., Dickson R., Lewis D., Jasani M.K., Sturrock R.D. Characteristics of spontaneously proliferating mononuclear cells in rheumatoid arthritis. // Ann Rheum Dis. 1984. - Vol.43. - P.703-709.

52. Galeazzi M., Morozzi G., Piccini M., Chen J., Bellisai F., Fineschi S., Marcolongo R. Dosage and characterization of circulating DNA: present usage and possible applications in systemic autoimmune disorders. // Autoimmun Rev. 2003. - Vol.2. - P.50-55.

53. Garkavtsev I.V., Tsvetkova T.G., Yegolina N.A., Gudkov A.V. Variability of human rRNA genes: inheritance and nonrandom chromosomal distribution of structural variants of nontranscribed spacer sequences. // Hum Genet. 1988.- Vol.81. -P.31-37.

54. Gaubatz J., Cutler R.G. Hybridization of ribosomal RNA labeled to high specific radioactivity with dimethyl sulfate // Biochemistry. 1975. - Vol.14.- P.760-765.

55. Gaubatz J., Prashad N., Cutler R.G. Ribosomal RNA gene dosage as a function of tissue and age for mouse and human. // Biochim. Biophys Acta. -1976.-Vol.418.-P.358-375.

56. Genestier L., Paillot R., Fournel S., Ferraro C., Miossec P., Revillard J.P. Immunosuppressive properties of methotrexate: apoptosis and clonal deletion of activated peripheral T cells. // J. Clin. Invest. 1998. - Vol. 15. - P.322-328.

57. German J. Bloom syndrome: a mendelian prototype of somatic mutational disease. // Medicine (Baltimore). 1993. - Vol.72. - P.393-406.

58. Ghoshal K., Majumder S., Li Z., Dong X., Jacob S.T. Suppression of metallothionein gene expression in a rat hepatoma because of promoter-specific DNA methylation. // J. Biol. Chem. 2000. - Vol.275. - P.539-547.

59. Goenechea L.G., Rendon M.C., Iglesias C., Valdivia M.M. Immunostaining of nucleolus organizers in mammalian cells by a human autoantibody against the polymerase I transcription factor UBF. // Cell Mol. Biol. (Noisy-le-grand).- 1992.-Vol.38.-P.841-851.

60. Gonzalez I.L., Gorski J.L., Campen T.J., Dorney D.J., Erickson J.M., Sylvester J.E., Schmickel R.D. Variation among human 28S ribosomal RNA genes. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. - Vol.82. - P.7666-7670.

61. Gonzalez I.L., Sylvester J.E. Beyond ribosomal DNA: on towards the telomere. // Chromosoma. 1997. - Vol.105. - P.431-437.

62. Gonzalez I.L., Sylvester J.E. Complete sequence of the 43-kb human ribosomal DNA repeat: analysis of the intergenic spacer. // Genomics. 1995.- Vol.27. -P.320-328.

63. Gonzalez I.L., Sylvester J.E. Incognito rRNA and rDNA in databases and libraries. // Genome Res. 1997. - Vol.7. - P.65-70. (a)

64. Gonzalez I.L., Sylvester J.E., Smith T.F., Stambolian D., Schmickel R.D. Ribosomal RNA gene sequences and hominoid phylogeny. // Mol. Biol. Evol.- 1990.-Vol.7.-P.203-219.

65. Goodpasture C., Bloom S.E. Visualization of nucleolar organizer regions in mammalian chromosomes using silver staining // Chromosoma. 1975. -Vol.53.-P.37-50.

66. Hadjiargyrou M., McDowell K.A., Henderson A.S. A transfected human ribosomal RNA gene is present in the nucleolus of human cells. // Cytogenet. Cell Genet. 1994. - Vol.66. - P.58-62.

67. Halle J.P., Muller S., Simm A., Adam G. Copy number, epigenetic state and expression of the rRNA genes in young and senescent rat embryo fibroblasts. // Eur. J. Cell Biol. 1997. - Vol.74. - P.281-288.

68. Hancock J.M., Dover G.A. Molecular coevolution among cryptically simple expansion segments of eukaryotic 26S/28S rRNAs. // Mol. Biol. Evol. 1988.- Vol.5.-P.377-391.

69. Hannan K.M., Hannan R.D., Rothblum L.I. Transcription by RNA polymerase I. //Frontiers in Bioscience. 1998. - Vol.3. - P.376-398.

70. Hassouna N., Michot В., Bachellerie J.P. The complete nucleotide sequence of mouse 28S rRNA gene. Implications for the process of size increase of thelarge subunit rRNA in higher eukaryotes. // Nucleic Acids Res. 1984. -Vol.12. - P.3563-3583.

71. Jaenisch R., Bird A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. // Nat Genet. 2003. -Vol.33. -P.245-254.

72. Jaswal S., Mehta H.C., Sood A.K., Kaur J. Antioxidant status in rheumatoid arthritis and role of antioxidant therapy. // Clin. Chim. Acta. 2003. — Vol.338.-P.123-129.

73. Jones P.A., Gonzalgo M.L. Altered DNA methylation and genome instability: a new pathway to cancer? // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - Vol.94. -P.2103-2105.

74. Kamanli A., Naziroglu M., Aydilek N., Hacievliyagil C. Plasma lipid peroxidation and antioxidant levels in patients with rheumatoid arthritis. // Cell Biochem. Funct. 2004. - Vol.22. - P.53-57.

75. Karatas F., Ozates I., Canatan H., Halifeoglu I., Karatepe M., Colakt R. Antioxidant status & lipid peroxidation in patients with rheumatoid arthritis. // Indian. J. Med. Res. 2003. - Vol. 118. - P.178-181.

76. Kawasaki K., Minochima S., Kudoh J., Fukuyama R., Shimizu N. Methylation status of ribosomal RNA gene clusters in the flow-sorted human acrocentric chromosome // Mamm. Genome. 1992. - Vol.3. - P. 173-178.

77. Keystone E.C., Poplonski L., Miller R.G., Gorczynski R., Gladman D. In vivo activation of lymphocytes in rheumatoid arthritis. // J. Rheumatol. 1986. -Vol.13.-P.694-699.

78. Kim Y.I., Logan J.W., Mason J.B., Roubenoff R. DNA hypomethylation in inflammatory arthritis: reversal with methotrexate. // J. Lab. Clin. Med. -1996.-Vol.128.-P.165-172.

79. Kirilenko P.M., Kupriyanova N.S., Ryskov A.P. Detection and characterization of extended deletions in cosmid clones of ribosomal DNA of human chromosome 13. // Dokl. Biochem. 2000. - Vol.371. - P.60-62.

80. Kirsch-Volders M., Hens L., Susanne C. Telomere and centromere association tendencies in the human male metaphase complement. // Hum Genet. 1980. - Vol.54. - P.69-77.

81. Kitas G.D., Salmon M., Allan I.M., Bacon P.A. The T cell system in rheumatoid arthritis: activated or defective? // Scand. J. Rheumatol. Suppl. -1988. Vol.76. -P.l61-173.

82. Kochanek S., Hosokawa K., Schiedner G., Renz D., Doerfler W. DNA methylation in the promoter of ribosomal RNA genes in human cells as determined by genomic sequencing. // FEBS Lett. 1996. - Vol.388. - P. 192194.

83. Koutouzov S, Jeronimo AL, Campos H, Amoura Z. Nucleosomes in the pathogenesis of systemic lupus erythematosus. // Rheum. Dis. Clin. North Am. 2004. - Vol.30. - P.529-558.

84. Kunnath L., Locker J. Variable methylation of the ribosomal RNA genes of the rat. // Nucleic Acids Res. 1982. - Vol.10. - P.3877-3892.

85. Lai F.P., Tsukada Y., Ichikawa H., Dunster K., Sentry J.W., Toh B.H. Autoantibody to DNA excision repair enzyme hMYH in a patient with rheumatic disease. //Clin. Immunol.-2001. Vol.99. -P.291-297.

86. Laird P.W., Jaenisch R. DNA methylation and cancer. // Hum. Mol. Genet. -1994.- Vol.3. -P.1487-1495.

87. Lee S.H., Chang D.K., Goel A., Boland C.R., Bugbee W., Boyle D.L., Firestein G.S. Microsatellite instability and suppressed DNA repair enzyme expression in rheumatoid arthritis. // J. Immunol. 2003. - Vol.15. - P.2214-2220.

88. Lichtenstein M., Keini G., Cedar H., Bergman Y. В cell-specific demethylation: a novel role for the intronic kappa chain enhancer sequence. // Cell. 1994. - Vol.76. - P.913-923.

89. Long E.O., Dawid I.B. Repeated genes in eukaryotes // Ann.Rev. Biochem. 1980. - Vol.49. - P.727-764.

90. Machwe A., Orren D.K., Bohr V.A. Accelerated methylation of ribosomal RNA genes during the cellular senescence of Werner syndrome fibroblasts. // FASEB J. 2000. - Vol.14. - P.1715-1724.

91. Manning F.C., Xu J., Patlerno S.R. Transcriptional inhibition by carcinogenic chromate: relationship to DNA damage. // Mol. Carcinog. -1992.-Vol.6.-P.270-279.

92. Maurice M.M., Verweij C.L., Breedveld F.C. Characterization of the hyporesponsiveness of synovial T-Cells in rheumatoid arthritis: role of chronic oxidative stress. // Drugs Today (Bare). 1999. - Vol.35. — P.321-326.

93. Mikelsaar AV, Ilus T. Populational polymorphisms in silver staining of nucleolus organizer regions (NORs) in human acrocentric chromosomes. // Hum. Genet. 1979. - Vol.51. - P.281-285.

94. Miller D.A., Breg W.R., Warburton D., Dev V.G., Miller O.J. Regulation of rDNA genes expression in a human 14p+ marker chromosome // Hum. Genet.- 1978. Vol. 43.-P.289-297.

95. Miller D.A., Dev V.G., Tantravahi R., Miller O.J. Suppression of human nucleolus organizer activity in mouse-human somatic hybrid cells // Exp. Cell Res. 1976. - V.101. - P.235-243.

96. Misra M., Alcedo J.A. and Wetterhahn K.E. Two pathways for chromium(VI)-induced DNA damage in 14 day chick embryos: Cr-DNA binding in liver and 8-oxo-2'-deoxyguanosine in red blood cells. // Carcinogenesis. 1994. - Vol.15. - P.2911-2917.

97. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. // J. Immunol. Methods. -1983. -Vol.65.-P.55-63.

98. Mountz J.D., Hsu H.C., Matsuki Y., Zhang H.G. Apoptosis and rheumatoid arthritis: past, present, and future directions. // Curr. Rheumatol. Rep. 2001.- Vol.3.-P.70-78.

99. Nagler R.M., Salameh F., Reznick A.Z., Livshits V., Nahir A.M. Salivary gland involvement in rheumatoid arthritis and its relationship to induced oxidative stress. //Rheumatology (Oxford). -2003. Vol.42. - P. 1234-1241.

100. Panoskaltsis A., Anderson C.C., Sinclair N.R. Regulation of an anti-self response: lack of influence of exogenous DNA on the in vitro anti-DNA response. //Autoimmunity. 1992. - Vol.11. - P.281-287.

101. Peterson C.R., Cryar J.R., Gaubatz J.W. Constancy of ribosomal RNA genes during aging of mouse heart cells and during serial passage of WI-38 cells. // Arch. Gerontol. Geriatr. 1984. - Vol.3. - P.l 15-125.

102. Pich A., Chiusa L., Margaria E. Prognostic relevance of AgNORs in tumor pathology. //Micron. -2000. -Vol.31. -P. 133-141.

103. Powell M.A., Mutch D.G., Rader J.S., Herzog T.J., Huang Т.Н., Goodfellow P.J. Ribosomal DNA methylation in patients with endometrial carcinoma: an independent prognostic marker. // Cancer. 2002. - Vol.94. - P.2941-2952.

104. Qu L.H., Nicoloso M., Bachellerie J.P. A sequence dimorphism in a conserved domain of human 28S rRNA. Uneven distribution of variant genes among individuals. Differential expression in HeLa cells. // Nucleic Acids Res. -1991. -Vol.19. -P.1015-1019.

105. Rabinovich G.A. Apoptosis as a target for gene therapy in rheumatoid arthritis. // Mem. Inst. Oswaldo. Cruz. 2000. - Vol.95. - P.225-233.

106. Ramsahoye B.H., Biniszkiewicz D., Lyko F., Clark V., Bird A.P., Jaenisch

107. R. Non-CpG methylation is prevalent in embryonic stem cells and may be mediated by DNA methyltransferase 3a. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2000. Vol.97. - P.5237-5242.

108. Ranzani G.N., Bernini L.F., Crippa M. Inheritance of rDNA spacer length variants in man.//Mol. Gen. Genet. 1984.-Vol.196. - P.141-145.

109. Richardson В., Scheinbart L., Strahler J., Gross L., Hanash S., Johnson M. Evidence for impaired T cell DNA methylation in systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis. // Arthritis Rheum. 1990. - Vol.33.1. V -P.1665-1673.

110. Robertson K.D., Jones P.A. DNA methylation: past, present and future directions. // Carcinogenesis. 2000. - Vol.21. - P.461-467.

111. Roussel P., Sirri V., Hernandez-Verdun D. Quantification of Ag-NOR proteins using Ag-NOR staining on Western blots // J. Histochem. Cytochem. 1994.-Vol.42.-P.1513-1517.

112. Ruggero D., Grisendi S., Piazza F., Rego E., Mari F., Rao P.H., Cordon-Cardo C., Pandolf! P.P. Dyskeratosis congenita and cancer in mice deficient inribosomal RNA modification. // Science. 2003. - Vol.299. - P.259-262.

113. Salmon M., Scheel-Toellner D., Huissoon A.P., Pilling D., Shamsadeen N., Hyde H., D'Angeac A.D., Bacon P.A., Emery P., Akbar A.N. Inhibition of Tcell apoptosis in the rheumatoid synovium. // J. Clin. Invest. 1997. - Vol. 99. -P.439-446.

114. Salnikow K., Zhitkovich A., Costa M. Analysis of the binding sites of chromium to DNA and protein in vitro and in intact cells. // Carcinogenesis. -1992. Vol.13. -P.2341-2346.

115. Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T. // Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edn. Cold Spring Ilarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 1989.

116. Santoro R., Grummt I. Molecular mechanisms mediating methylation-dependent silencing of ribosomal gene transcription. // Mol. Cell. 2001. -Vol.8. -P.719-725.

117. Schawalder J., Paric E., Neff N.F. Telomere and ribosomal DNA repeats are chromosomal targets of the bloom syndrome DNA helicase. // BMC Cell Biol. -2003.- Vol.4. -P.15.

118. Schirmer M., Vallejo A.N., Weyand C.M., Goronzy J.J. Resistance to apoptosis and elevated expression of Bcl-2 in clonally expanded CD4+CD28-T cells from rheumatoid arthritis patients. // J. Immunol. 1998. - Vol.15. -P. 1018-1025.

119. Schmickel R.D. Quantitation of human ribosomal DNA hybridization of human DNA with ribosomal RNA for quantitation and fractionation. // Pediatr. Res. 1973. - Vol.7. - P.5-12.

120. Schwab J., Illges H. Regulation of CD21 expression by DNA methylation and histone deacetylation. // Int. Immunol. 2001. - Vol.13. - P.705-710. (6)

121. Schwab J., Illges H. Silencing of CD21 expression in synovial lymphocytes is independent of methylation of the CD21 promoter CpG island. // Rheumatol. Int.-2001.-Vol.20.-P. 133-137. (a)

122. Shiraishi M., Sekiguchi A., Chuu Y.H., Sekiya T. Tight interaction between densely methylated DNA fragments and the methyl-CpG binding domain of the rat MeCP2 protein attached to a solid support. // Biol. Chem. 1999. -Vol.380.-P.l 127-1131.

123. Sinclair D.A., Guarente L. Extrachromosomal rDNA circles—a cause of aging in yeast. // Cell. 1997. - Vol.91. - P. 1033-1042.

124. Singer J., Roberts-Ems J., Riggs A.D. Methylation of mouse liver DNA studied by means of the restriction enzymes msp I and hpa II. // Science. -1979. -Vol.203. -P.1019-1021.

125. Sirri V., Roussel P., Gendron M.C., Hernandez-Verdun D. Amount of the two major Ag-NOR proteins, nucleolin, and protein B23 is cell-cycle dependent // Cytometry. 1997. - Vol.28. - P. 147-156.

126. Slater T.F., Sawyer В., Strayli U.D. Studies on succinate-tetrazolium reductase systems. III. Points of coupling of four different tetrazolium salts. // Biochem. Biophys. Acta. 1963. - Vol.77. - P.383-393.

127. Solomon E., Borrow J., Goddard A.D. Chromosome aberrations and cancer. // Science. 1991. - Vol.254. - P.l 153-1160.

128. Stancheva I., Lucchini R., Koller Т., Sogo J.M. Chromatin structure and methylation of rat rRNA genes studied by formaldehyde fixation and psoralen cross-linking. //Nucleic Acids Res. 1997. - Vol.25. - P. 1727-1735.

129. Stirzaker C., Millar D.S., Paul C.L., Warnecke P.M., Harrison J., Vincent P.C., Frommer M., Clark S.J. Extensive DNA methylation spanning the Rb promoter in retinoblastoma tumors. // Cancer Res. 1997. - Vol.57. - P.2229-2237.

130. Strehler B.L. Roles and mechanisms of rDNA changes during aging. // Birth. Defects Orig. Artie. Ser. 1978. - Vol.14. - P.449-462.

131. Strehler B.L., Chang M.P. Loss of hybridizable ribosomal DNA from human post-mitotic tissues during aging: II. Age-dependent loss in human cerebral cortex-hippocampal and somatosensory cortex comparison. // Mech. Ageing Dev. 1979.-Vol.11.-P.379-382.

132. Strehler B.L., Chang M.P., Johnson L.K. Loss of hybridizable ribosomal DNA from human post-mitotic tissues during aging: I. Age-dependent loss in human myocardium. // Mech. Ageing Dev. 1979. - Vol.l 1. - P.371-378.

133. Sulik K.K., Smiley S.J., Turvey T.A., Speight H.S., Johnston M.C. Pathogenesis of cleft palate in Treacher Collins, Nager, and Miller syndromes. // Cleft Palate J. 1989. - Vol.26. - P.209-216.

134. Swisshelm K., Disteche C.M., Thorvaldsen J., Nelson A., Salk D. Age-related increase in methylation of ribosomal genes and inactivation of chromosome-specific rRNA gene clusters in mouse. // Mutat. Res. 1990. -Vol.237.-P.131-46.

135. Szodoray P., Alex P., Dandapani V., Nakken В., Pesina J., Kim X., Wallis G.L., Wilson P.C., Jonsson R., Centola M. Apoptotic effect of rituximab on peripheral blood В cells in rheumatoid arthritis. // Scand. J. Immunol. 2004. -Vol.60.-P.209-218.

136. Szodoray P., Jellestad S., Nakken В., Brun J.G., Jonsson R. Programmed cell death in rheumatoid arthritis peripheral blood T-cell subpopulations determined by laser scanning cytometry. // Lab. Invest. 2003. - Vol.83. -P.1839-1848.

137. Tang X., Yocum D.E., Dejonghe D., Nordensson K., Lake D.F., Richard J. Increased activation-induced cell death in peripheral lymphocytes of rheumatoid arthritis patients: the mechanism of action. // Immunology. -2004.-Vol.112.-P.496-505.

138. Tautz D., Hancock J.M., Webb D.A., Tautz C., Dover G.A. Complete sequences of the rRNA genes of Drosophila melanogaster. // Mol. Biol. Evol. 1988.-Vol.5.-P.366-376.

139. Taysi S., Polat F., Gul M., Sari R.A., Bakan E. Lipid peroxidation, some extracellular antioxidants, and antioxidant enzymes in serum of patients with rheumatoid arthritis. // Rheumatol Int. 2002. - Vol.21. - P.200-204.

140. Tebib J.G., Reynaud C., Cedoz J.P., Letroublon M.C., Niveleau A. Relationship between urinary excretion of modified nucleosides and rheumatoid arthritis process. // Br. J. Rheumatol. 1997. - Vol.36. - P.990-995.

141. Toussaint О., Medrano E.E., von Zglinicki T. Cellular and molecular mechanisms of stress-induced premature senescence (SIPS) of human diploid fibroblasts and melanocytes. // Exp. Gerontol. 2000. - Vol.35. - P.927-945.

142. Trere D. AgNOR staining and quantification. // Micron. 2000. - Vol.31. -P.127-131.

143. Van Dyke D.L, Palmer C.G, Nance WE, Yu P.L. Chromosome polymorphism and twin zygosity. // Am. J. Hum. Genet. 1977. - Vol.29. -P.431-437.

144. Varley J.M. Patterns of silver staining of human chromosomes. // Chromosoma. 1977. - Vol.61. - P.207-214.

145. Vilcheck S.K., O'Brien T.J., Pritchard D.E., Ha L., Ceryak S., Fornsaglio J.L., Patierno S.R. Fanconi anemia complementation group A cells are hypersensitive to chromium(VI)-induced toxicity. // Environ Health Perspect. 2002. - Vol.110. - P.773-777.

146. Wahle M., Pierer M., Krause A., Kolker S., Baerwald C.G. Decreased catecholamine-induced cell death in В lymphocytes from patients with rheumatoid arthritis. // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2002. - Vol.966. - P.425-428.

147. Wang Y., Cortez D., Yazdi P., Neff N., Elledge S.J., Qin J. BASC, a super complex of BRCA1-associated proteins involved in the recognition and repair of aberrant DNA structures. // Genes Dev. 2000. - Vol. 14. - P.927-939.

148. Warburton D., Atwood K.C., Henderson A.S. Variation in the number of genes for rRNA among human acrocentric chromosomes: correlation with frequency of satellite association. // Cytogenet. Cell Genet. 1976. - Vol.17. - P.221-230.

149. Wedrychowski A., Ward W.S., Schmidt W.N., Hnilica L.S. Chromium-induced cross-linking of nuclear proteins and DNA. // J. Biol. Chem. 1985. -Vol.260.-P.7150-7155.

150. Wilson V.L., Jones P.A. DNA methylation decreases in aging but not in immortal cells. // Science. 1983. - Vol.220. - P. 1055-1057.

151. Yan P.S., Rodriguez F.J., Laux D.E., Perry M.R., Standiford S.B., Huang Т.Н. Hypermethylation of ribosomal DNA in human breast carcinoma. // Br. J. Cancer. 2000. - Vol.82. - P.514-517.

152. Yang J.-L., Hsieh Y.-C., Wu C.-W., Lee T.-C. Mutational specificity of chromium(VI) compounds in the hprt locus of Chinese hamster ovary-Kl cells. // Carcinogenesis. 1992. - Vol.13. - P.2053-2057.

153. Yankiwski V., Marciniak R.A., Guarente L., Neff N.F. Nuclear structure in normal and Bloom syndrome cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. -Vol.97. -P.5214-5219.

154. Yoder F.E., Bias W.B., Borgaonkar D.S., Bahr G.F., Yoder I.I., Yoder O.C., Golomb H.M. Cytogenetic and linkage studies of a familial 15pplus variant. // Am. J. Hum. Genet. 1974. - Vol. 26. - P.535-548.

155. Young B.D., Hell A., Birnie G.D. A new estimate of human ribosomal gene member. // Biochim. Biophys. Acta. 1976. - Vol.454. - P.535-548.

156. Zafiropoulos A., Tsentelierou E., Linardakis M., Kafatos A., Spandidos D.A. Preferential loss of 5S and 28S rDNA genes in human adipose tissue during ageing. // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2005. - Vol.37. - P.409-415.

157. Zhang H.G., Hyde K., Page G.P., Brand J.P., Zhou J., Yu S., Allison D.B., Hsu H.C., Mountz J.D. Novel tumor necrosis factor alpha-regulated genes in rheumatoid arthritis. // Arthritis Rheum. 2004. - Vol.50. - P.420-431.

Информация о работе

Шубаева, Наталья Олеговна
кандидата биологических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.26

Диссертация

Молекулярно-генетические характеристики рибосомных генов и процессы гибели клеток у больных ревматоидным артритом - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы