Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональная организация бакуловирусных геномов и гена полиэдрина и создание экспрессионной системы на основе вируса ядерного полиэдроза Malacosoma neustria

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональная организация бакуловирусных геномов и гена полиэдрина и создание экспрессионной системы на основе вируса ядерного полиэдроза Malacosoma neustria"

НАЦЮНАЛЬНА АКАДЕМIЯ НАУК УКРАПШ

1НСТНТУТ ЫОЛЕКУЛЯМГОГ Б10Л0Г1Г I ГЕНЕТИКИ

на правах рукопису УДК 578.841.1 р р ^ фД 578.233.64

575,224 2 7 ЯНВ 1997

СТРОКОВСЬКА Людмила !вашвна

СТРУКТУРНО ЧБУ11КЦ1 ОПАЛЬНА ОРГАН13АЦ1Я ГЕНОМ Ш БАКУ ЛОВ I РУС 1В I ГЕНА ПОЛ1ЕДРИНУ ГА СТВОРЕШМ ЕКСПРЕСШЮГ СНСТЕМН НА НА31 В1РУСУ ЯДЕРНОГО ГОШЕДРОЗУ Ма1ассяопа пеизЪг1а

03.00.03 - молекулярна бюлопя

АВТОРЕФЕРАТ

дисертацП на здобуття наукового ступени доктора бюлоПчних наук

и

г к

К И I В - 1996

Дисертац1ею е рукопиа

Роботу виконано в 1нститут1 молекулярно! 61ологП i генетики Нац1онально1 Академii Наук Украгни

0Ф1ц1йн1 опоненти:

член-кореспондент HAH Укра1ни, доктор б!олог1чних наук Б.П.МАЦЕЛЮХ

Пров1дна орган!зац1я: Кигвський державний ун!верситет

iM. Т.Г.Шевченка

ciiGuiajii30Baii0i вчено! ради Д. 01.86.01 з эахисту докторських дисертац!й в 1нститут1 молекулярной 61ологИ i генетики HAH Укра1ки за адресою: 252143, Ки1в, в.ул. акад. Заболотного, 150

3 дисертац1ею можна ознайомиткся у б1бл1отец! 1нституту моле-кулярно! б!олог11 1 генетики HAH Укравши

доктор б1олог!чних наук Е.О.КОЗЛОВ

доктор б1олог1чних наук А.П.ГАЛК1Н

Вчоний секратар слкч.ЦгиП.ронано! вчено! ради, кандидат й1олог!чних наук

Актуальность пробломи. Выявления моханизм!в регулювання генно! икоирееП в систем! про- 1 еукар1от!в с оди!ем з основних проблем молокулярно! бгологП. Одним з п1дход1в до вир\шення |Цс1 проблеми е вивчення структури .1 ФункцП генетичного ала-рату. 13акулов1руси, як 1 н'шнастч.ся до складу ДНК-вм1щуючих н.1рус!и, займають важливе м1сце як об'екти досл1джешш молеку-лнрно-генетично? орган1эацП геному, структурно-фушаиональног нзаемодП вирусного 1 кл!тинного геном1в, регуляторного впливу окремих гем1в 1 д!лшок ген1в на процеси репл1кацИ ДНК, транскршщП 1 трансляцИ. Кр1м того, бакулов1руси активно ви-користовуються в практнхй як б1о1нсекткциди 1 експресЬпи век-тори .

Досл1дження б!олог11 та генетики бакулов1рус1в було роз-почато на Укра1н1 у 50-х роках академ1ком С.М.Гершензоном 1 продовжено в 1нститут1 молекулярно! 61олог1П та генетики НАЛ

■укря11ш.

Дуже важливим для розвитку молекулярно! б1ологП баку-лов!русгв було вир!шення питания про природу б1лкових т!лець нключення, як1, як вважалося, складаютьея з к!лькох б5лк1в. В нашому 1нститут1 у 70-х роках вперше було встановлено, що пол1едри складаютьея практично з единого б1лка - пол!едрину, к1льк!сть якого в заражених кл!тинах стансвить до 50% в!д за-гально! маси б!лк!в кл!тини, що св!дчило про наявн!сть сильного промотору. 1Д результата зразу ж зробили актуальними досл1дження по локал!зацП гена пол!едрину, виявленню механ1з-му його експресИ та етворенто експрес!йних систем для синтезу гетеролог!чних б!лк!в р1зного походження. В цьому напрямку було розпочато 1 наш1 досл!дження, але !ш передувала не-обх!днзсть вир1шення питания про структурну орган!зац!ю геноыу бакулов!рус1в.

Нп той час дан! про розм!р геному i структуру в1русних

компонентiB були дуже суперечлив!. Визначення молекуляртп маси 1нфекцШ1их npenapaTiB ДНК в 2-10 MD i виявлення 1нфекц1йних субв!русних часток св1дчили про субодиничну будову влpiouÏB, але це протир1чило даним про суц!льний значно б1ль-иого розмдру ДНП BipioHy i результатам виявлення в препаратах ДНК великих кыьцевих молекул. НаявШсть таких суперечливих даних виыагала неодм!нного визначення розм!ру i структури АнФеквдйного бакуловярусного геному.

Досл1дження структурно'! орган1зацП геному бакуловipyciu, виявлення залежноот! 1нФекц1йност1 Bipycroix ДНК в!д третинног структур» молекул, локал1зац1я гена пол!едрилу та його Функ-ц1онально важливих д1лянок виявились тими характеристиками, визначення яких привело нас до розробки бакулов1русно! експре-ciiiiioï системи. Бакулов1русна система експресП являеться од-iiie» з сучасних б!отехнолог1й, яка дозволяе одержувати проце-сован1 б!лки pienoro походження. KpiM того, бакулов!русна система експресП може слугувати джерелом високоефективних inceK-тицид1в, що с особливо актуальним в сучасйй загострен1й еко-лог1чн1й обстановцЬ

К1льк1сть бакуловгрус1в, на яких проводились молекулярно-61олог1чн1 досл1дження i як! використовуиались, як вектори, дужа обмекена: в 61льшост1 лабораторш використовуються в1руси ядерного пол1едрозу (ВЯП) Autographa californica (Ас) i ВЛГ1 Bombyx шог! (Вт). Дослхдаоння дояких 1иших BipyciB виявило BiwlHHocTi в прояв1 окопресП геному та окремих reniB при репродукИ cipyclB в клЗгинах комах. KpiM того, к1лыс1сн! 1 як1он1 характеристики рекомбшаптних продукт1в, одержаних в pisirnx бакулов1русних системах, можуть суттево р1знитиоя в за-лежност! вЗд того який хазя'ш L лк.ий вектор використовуються. Для крхного б!лку мокна iiiA.i брата систему, до ni показники бу-

дуть оптималыпши, тому кожна новоотворена система розширюе коло моюшвоетей для одержання повних б1лк!в.

Як моделыи об'екти нами було обрано три в!руси: ВЯЛ Вт, ВЯЛ fialleria mellonella (Gm) i ВЯЛ Malacosoma neustria (Mn), як! продукуыться 1 в комахах, i в куль-rypi кл!тик.

Мета та завдання досл!джень. Метою uie'i роботи с вивчення структурно-функц1онально1 орган!задП бакулов1русних геномгв i гена пол!едрину та створення бакулов!русно1 експресишо! сис-тпми а використанпям промотору гена пол!едрину.

В1Дпов1дно до поставлено! мети було сформульовано сл!дую-4i задач!:

1) визначити макромолекулярну структуру i розм1р бакулов1-русних геном1в; останови™ залежн!сть м!ж структурою молекул i 1нфекц1йн1стю ДНК;

2) провести рестрикц1йний анал!з i Ф1зичне картупатш Bi-русних геном1в; локал1зувати ген пол1едрину, встановити його нуклеотидну посл1довн1сть, виявити регуляторну 1 структурну дглянки;

3) виявити продуктивну систему бакулов!рус, - кллтини комах i дослЗдити ступ1нь стаб!льност1 в1русного геному при пасиру-uainu;

4) стпорити транспорта! бакулов1русн! пекторн! конструкцП; отримати рекомб!нантн1 бакулов1руси з 1итегрованими готеро-лоНчними генами nifl промотором гена пол1едрину;

5) охарактеризувати створену бакулотруону векторну систему за показниками р1шш експресП рекомб!нантних гетеро-логАчних 6i.inciB.

Внукова новизна- Вперто встановлено, що :iнф<?кц1 йнми геном 1УШ це копалонтио-замкнена к1льцева молекула ДНК без 61лковик i пибонуклоотидних «ставок. Визначено, ir4o розм!р геному ск.ча-

дае ириблизно 140 kbp. Hi результата дали можлив1сть вперше побудувати модель структури в!р!ону ВЯЛ.

Вперив з препарат!в зр!лих BipioiiiB отримано катеиани, як! складаються з двох чи трьох зчеплених к!льцевих молекул ДНК pisiio'i форми; вперше встановлено, що катеиани входять до складу подовжених в!русних часток. Наявн!сть катенан:1в св1дчить на корпеть репл1кацИ Bipycuo'i ДНК за моделлю Кернса через npoMixHi репл1кативн! тета-структури. Досл!дження взаемозв'яз-ку структури i ФункцП бакулов!русних геном!в вперше виявило 1нфекц1шйстъ ковалентно-замкнених i в1дкритих к1льцевих Форм ДНИ, л1н1йн! ыолекули такого самого розм!ру не 1нФекц1йн1.

Проведено структурно-функц1ональне картування геном!в ВЯЛ Мп i ВЯЛ Gm: сконструйовано Ф1зичн1 карти геном!в цих Bipycie; локал!зовано ген пол!едрину на картах обох геном!в i вперие визначено нуклеотидау посл1довн!сть гена пол!едрину ВЯЛ Мп, локал1зовано його промоторну i структурну д!лянки.

Досл!джеиня стабЛльност! геному ВЯЛ Мп при пасируванн1 Blpycy в культур! кл1тин МСАр-1 виявило новий вид модиф!кац!1 бакулов!русного геному, яка являеться насл1дком взаемодП Bipycy з неперм!сивним хаэя'1ном.

Практична и!нн1сть робота. Результата вивчення !нФекц!йно-cri к1льцевих молекул ДНК, р!вня експресИ i локал1зац!'1 про-моторно! д!ляики гена пол!едрину привели до створення на основ! високопродуктивно! системи ВЯЛ Мп - культура кл!тин МСАр-1 ново! бакулов1русно1 експрес!йно! система для синтезу гетеролог!чних б1лк1в р!эного походження, в тому числ! ! оу-кар1отичних. Встановлено, що продуктивн!сть створено'1 баку-лов1русноХ системи, охарактеризовано! за р!внем синтезу ре-комб'шантноЧ бактер1ально! в-галактоз1дази, не поступаетьоя офектипноит! 1ншх бакулов!русних експресШшх систем. Цч дае

можлив!сть виксристовувати створену систему для синтезу б!лк!в

i ш;птид1в з л1кирсысою i д1агн0стичною метою. Кр1м того, моа-

ливо отримувати деф1ц1тн! i модиф1кован! б!лки для досл!дження

'ix структурно-Функц1оналышх взаемов!дносян.

Впершо за допомогою бакулов1русно1 експрес1йно1 система

отримапо рекомб1нантний гормон про л актин людшш: його р1вень

В

станавив 1,5-2 мг на 10 кл!тин (на 1 л середовгаца).

Апробахця роботи. Матер1али дисертацП допов!далися на III Всесоюзному симпозиум! "Колекулярн! механ1зми генетичних стро-neciB" (Москва,. 1976), на III Всесоюзному з'5зд! В0Г1С (JleniH-град,1977), на III Украхнському бгох!м1чному з'1зд1 (Донецьк, 1977), на 1 Шжнародному коллокв!ум1 з патологП безхрсбетних (Прага,1978), на IV Всесоюзному п!ох1м1чному з' '1зд1(Лен1нград, 1979), на Всесоюзному симпоз!ум1 "Макромолекул!! кд1тини:Структура, функгЦя, взаеыод!я" (Москва, 1979), на VI м!жнародному в1русолог1чному KOHrpeoi (Сендай, 1984), на XVI м1®1ародн1й конференцИ ФЕБО (Москва, 1984), на Всесоюзнгй конференцИ "Нов! напряыки б1отехнологП" (11ущ1но, 1988).

Публ1кацП. За матер!алами дисертацП опубл!ксгвано 40 роб1т.

Структура 1 об'ем роботи. Дисертац1я складазться з вступу, огляду латератури, метод.гв досл1джеш!я, трьох розд1л1в резуль-татгв досл!джень та íx обговорення, заключения, bhchobkíb та списку лггератури за темою дисертацП.

Роботу викладено на 2?2- стор!нках машнопису. Вона м1стить ^ таблиць 1 5"¿ малюнкзв, Список л1тератури вклшае 3 $f б!бл1о-граф1'шик посилань.

Boi досл1дженпя Biwonaiii з 1н1ц1ативи автора та за його безпосередньою у тетю в експериментах та анал1з! результат!в.

- 6 -

Матер1али та методи посл!джень.

В робот! було використаио !золяти i клони BipyciB ВЯП Вт, Gm 1 Мп, отриман! в наш!й лабораторП. Моношаров1 культури клхтт комах Anteraea periiyi КСАр-1 [Сухорада и др., 1982] i Lymantria dispar SCLd-135 вирощувалм, користуючись методичними пос!бникаш [Summers & Smith,1987; King & Possee,1992].

ДНК Bíin Gm видiляли фенольно-детергентким чи детергент-но-солъовиы методом, ДНК ВЯП Мп - лужним методом [Черепенко и Март1шенко,1985] з привнесениям деяких модиФ1кад1й. Роздпод!л пренарат1в ДНК в град1ент1 густини CsCl з бромистим етидгеы проводили за [Radloí'f et al., 1967], в град1ент1 концентрацП цукрози за [Noll, 1967]. Включения mítkh в ДНК зд!йс:нювали за допомогою неспещ1ф.1чно1 розс!яно! затравки [ Feinberg, 1984]. Отримання пласм!дно1 ДНК, рестрикцпЧну обробку, лагування, скршпнг рекомб1нантних плазм!д, електрофорез ДНК, вид!лення Фрагментов ДНК зд!йонювали за [Mariiatis, 198*1] .Компетентн1 tuii-тини E.coli отримували за [Nishimura,1990], <Изичне картування ДНК проводили за методом сум!сних переварок [Матвиенко,1979]. Модиф!кацИ в транспорта! вектори вносили за допомогою иол1ме-разно! ланцюгово! реакцп" з використанням в!дпов1дних прай-wepiB [Саики,1990]. Розд1лення б1лк1в проводили за допомогою електрофорезу в пол1акрилам1дному гел1 [Laemmli,1972]. Brnipw-, вання piBfíiB активное:1! в~галактоз!дази зд!йснювалп за методом [.Миллер, 1977]. Виявлення рекомб1нантних бакулов!русних клон1в удгйстшали за допомогою методу дот-г!брицизацП, котрансФек-ц1ы кл1тин комах в1русною i плазм!дною ДНК, одержання Ripycimx бляшок в моношар! кл!тин комах эд!йснювали зг1дно [ Smith & Sumtnere, 19R7; O'Raiíly et al.,1992]. Визначення р!вня актив-пост! пролактину проводили «а допомогою комарц1йного набору "PIА-»рол".

- 7 -

РЕЗУЛЬТАТА ТА IX ОБГОГОРЕННЯ.

1. Макромолекулярна структура 1 1нФекц!йн1сть бакулов1русних ДНК.

В 1968 poní вперше в naiaiñ лабораторП було виявлено в препаратах ДНК з в!р1он!в ВЯН Вт велик! к1льцев! молекули, мо-лекулярна вага яких складала близько 100 MD [Kok et al.,1968]. Це були nepmi дан!, як1 припускали великий роэм!р для баку-лов1руспих renoMiB. Але ui результата не сп1впадали з !ншш даними наш! лаборатор!! 1 фактами, в!домими з л!тератури. Поперто, на цей час припускалася субодтшчна будова в1р!он!в, запропонована Бергольдом. Кр!м того, Айзавою при ядерному пол!едроз! було виявлено невелик! !н$екц1йн1 частки. Також в1дом1 були дан! про 1нфекц!йн!сть препарат!в Blpyciioi ДНК; середня молекулярна вага яких становила приблизно 2-10 MD, що св1дчило про каявн!сть в цих препаратах молекул ДНК або з на-тивним в!русним геномом, або з неповним геномом, але здатних рекомб!нувати з в!дновленням нативного геному. При подалыпих досл!дженнях було показано, що кр!м великих к!льцевих молекул в препаратах присутн1 к!лыдев! молекули ДНК менших розм!р!в [Кок и др.,1972]. Щоб з'еднати ус! суперечлив! дан!, було висунуто г!потезу про пол!геномн!сть, яка припускала, що в!русна ДНК складаеться 1з субодиниць невеликого розм!ру, спроможних репл!куватися незалежно. Але необх!дним було визна-чення розм!ру ! структурно! орган!зац!1 в!русного геному.

При вивченк! структури геном!в ВЯЛ велику роль з1грала на-явн1сть тако! характеристики б1олог!чно1 активност! бакулов!-русного геному, як 1нфекцШн1сть в!русно! ДНК для личинок ! культур кл!тин комах. Саме ця властив!сть ДНК ВЯЛ в сполучонн!

plaiiraii методичними п!дходами дозволила Ruplimmi питания про структуру .1 розм!р бакулои!русного 1нфекц1йного геному.

1.1. Виявлення р1зних структурних Форм молекул ДНК ВЯЛ.

Е.(1ектронно-м1кроскоп1чне досл1дження виявило в препаратах в1русно'1 ДНК к1льцев! молекули велико! довжипи 1 л!н1йн1 Форми р1зних розм1р1в.

Для розд1лення препарат1в ДНК ВЯЛ за структурою молекул було використано метод центрифугування ДНК у град!ент1 густши СаС1 з бромистим етид1ем.

Цей метод дозволив виявити, що к1льцев1 молекули в препаратах в1р!ошю1 ДНК знаходяться у двох формах: и1дкрит1 кольце в г 1 ковалентно-замкненЬ Контурна довжина в1дкритих к1льце~ вих молекул стаиовила 48-52 мкм, що при6лизно в1дпов1дае 100 МЛ або 140 кЪр. Л1н1йн1 молекули мали разну довжину - в!д 1 до 50 мкм. Було виявлено, що процентний вмхст ковалентно-замкне-них молекул залежить в!д методу вид1лення препарату ДНК. Так при використанн! для вид1лення ДНК фенольно-детергентного методу к1лък!сть ковалентно-замкнеких млекул становить 10-20%, а при використанн! б1льш м'якого детергентно-сольового метода 1х к!льк1еть зростае до 30%.

При застосуванн! ще б1льи м'якого методу зв!льнення ДНК з в!р1он1в, тобто при центрифугуванн1 в град!ент1 СвС1 з барвинком л!зат1в в1р!он1в, було виявлено ол1гомерн! зчеплен1 Ф>орми, як! складалися з двох чи трьох к!лыдевкх молекул, пов'язаних м1ж собою. Коли л!зати в1р!он1в розпод!лялися в град!ент! на три УФ-пог.линаюч1 зони, то в пром1жн1й зон! було виявлено 5060% иодв1йних зчеплешх Форм, кожпа з яких складалася з су-перс'лпрально1 1 в!дкрито1 к!льцево! молокул (мал. 1а). У випад-ку отримчнпя при розпод1л! л!зат!в пЗр1он1в п'яти УФ-поглинаю-чих зон (мал.16), у промахпих зонах було виявлоно кр!м подвШшх потр1йн1 зчеплен1 молекули (мал.1в). Для того, щоб н'ясув-'пи, чи не инапл1док накладання молокул з'явлнкш.-ся так!

пчеплен! форми, ми проводили електронно-м1кроскоп1чне досл1дження пром!жних зон при розведенн! 1х у 3 1 5 раз!в. Бу-ло показано, що к!льк1сть ольцевих зчеллених Форм при розвв денн! но зм1нюеться.

Д. '»

Мал. 1. Зчеплен! молекули ДНК ВЯЛ з пром1шШх зон град1енту густини СйСИ з бромистим етид1ем: а - гюцв1йи1 зчеплен1 молекули;

б - розпод!л л1зату в!р1он1в на п'ять УФ-ноглдааючих зон; в - потр!йн1 зчеплен! молекули.

а

Спираычись на електронно-м1кроскоп!чн! досл!дження 1 на п:нувашш дискретних смуг у град1ент1 густини СзС1 з бромистиы етид!ем ми вважаемо, цо зчеплен! подвхйн! 1 потрпаи молекули явяяють собою тополог1чно пов'язан! молекули - катенани ДНК ВЯП. Через р1зне зв'язувашш барвинка суперсп!ральниш 1 в1д-критими к1льцевкш молекулами ДНК ол1гоморн1 фории розташову-ються у град1ент1 густини СзС1 з барвинком (див.мал.16) таким чином: 2 зона- потр1йн! катенани, як1 складаються з од!пе! су-персп!рально"1 1 двох вадкритих ольцевих молекул; 3 зона - по-дв1йн! ол!гопери, до складу яких входять одна суперспгральна 1 одна в!дкрита к1льцева ^ояекули; 4 зона-потршн! катенани, як1 складаються з двох суперсгиральких I одн1е'1 в1дкрито1 к!льце-во1 форми. Поодшюк! к1льцев! 1 л1н1йн] молекули, як1 присутн! у цих зонах, з'являються внасл1док руйнувашш катенан!в.

Електронно-м1кроскоп1чне досл!джешш в1русних препарат1в, з яких було отримано так1 ол1гомерн1 структури ДНК, виявило, окр!м в!р!он!в звичайно'1 довжшш розм!ром ириблизно 350 нм (монсшерн! частки), в!русн! частки, довжина яких перевищуе довжину звичайних в!р1он1в у 2 1 3 раз!в. Наш було в!дм1чено, що виявлення ол1гомер1в ДНК залежить в1д особливостей методхв концентрування 1 очищения в1русних иренарат!в.

Тому ми перев!рили, чи не в1др!зняються ц! нрепарати м!ж собою за к1льк!стю подовкених в1рус!шх часток г як це пов'яза-но з наявп1стю ол1гомер;шх молекул ДНК (табл.1).

Результата, наведен! в таблиц!, св1дчать, що коли в лре-ааратах в!р1он1в к1льк!еть подовжених часток складае 5-8% (1), то в л!затах в!р1он!в можна виявити тХльки тномерн! кыъцев! молекули ДНК. Коли к!льк!сть нодовжених в.1р1он!в складае 20 -28%, то в л!затах виявдяються ол!гомерн1 форми ДНК. Коли в1р1-он!в подв!йно1 довкини б!лыЕе1 н!» потр1йШ1Х в!р!он!в(Н),

Таблиця 1.

Си1вв1днош.ення к1лысост1 BipioHin (X) písho'í довжияи i виявлення'мсномерних 1 ол1гомериих Форм ДНК при розпод!л1 л!зат!в в!р1он1в

Bipycui прэ- DipioiM pisHoi довпши Кзль- Мльцев! Форми

парати pig- ICÍCTb ДНК, виявлен! в

noro ступе- моно- [10ДВ1Й- потр1й- зон зонах град!енту

ня очистки* wepHi HÍ ui ДНК CsCl з барвинком

I 92 7 1 2 мономери

95 1 4 2

II 75 18 7 3 мономери i

72 ' 17 11 3 димери

79 15 6 - 3

III • 77 9 14 5 мономери,

73 9 18 5 димери i

74 8 18 5 тримори

* nlpycni препарата очищали центрифугуванням у град1ент1 концонтрацИ цукрози 30-50Ж (I) та подальмкм проведениям н1ру«но1 зони через шар 30Х(II) та 20Ж (II) цукрози.

тод1 виявляються подв1йн1 зчеплен! Форми ДНК. А коли к1льк1сть вiploülo гготр1йно! довжшги перевищув к1льк.1сть подвШнис rsipi-ohíb (III), в л1затах в1русних преиарат1в виявляються кр!м подв1йних ол1гокер1в 1 потр1йн! зчоилен! молекули ДНК.

Сит фпкт, що збагачення nipyomix npenapa'rin чистками

1юдв1йно1 та потр!йноК довжини (до 30%) приэводить до виявлен-ня ол1гомерних зченлених молекул ДНК, дозволяе зробити висно-вок, що подв1йн1 зчеплен1 Форми ДНК входять до складу в1р1он1в подв!йно1 довжини, а потр1йн1 ол!гоыери - до складу в1р!ошп иотр1юю1 довжини. Очевидно, спочатку вс1 молекули, як1 входять до складу катенаи1в, являють з себе ковалентно-замкнен1 молекули ДНК. Наявн1сть в IX склад! в!дкритих к1льцевих форм можна иояснити появою односп1ралышх розрив1в в процес! звлль-нення ДНК з в1р1он1в.

Таким чином, було встановлено, що препарата ДНК ВЯЛ вм1щу-ють р1зноиан1тн1 форми молекул ДНК. Але метод центрифугування в град!ент1 густини СзС1 з барв1шком не дозволяе подглити препарата ДНК за розм!ром молекул. Тому з ц1ею метою ми застосу-

600т

400-•

300 -■

200

100

.100

50

30 № проб

Мал.2. Розпод1л препарат!в ДНК ВЯН при иентрифугуванн! в град1ент1 5-20% цукрози з високо» Зонною силою:

- - рад!оактивн1сть;

-......р!вень 1нфокц1йност1.

О

на-im метод розд!лення в град!ент1 концентрац!! цукрози 5-20% з нисокою ioHnoto силою - IM NaCl. В таких умовах препарата ДНК ВЛП д1лилися на чотири Фракц!! (мал.2).

Електронно-м1кроскоп1чне досл1дження показало, що перш! три фракцIi (I-III) м!стять к1льцев! молекули ДНК. однаково! контурно! довжики - 48-52 мкм. В III Фракц!!, кр1м к1льцевих молекул (50-60%), виявлено також л1н!йн! ыолекули того самого розм1ру (48-52 мкм). У Фракц!! IV метились иевелик1 л!н!йн! молекули ДНК poawipoM 1- 10 мкм.

Для з'ясування питания, чим в!др!зняються м!ж собою к!ль-noui молекули в цих трьох Фракц1ях, було використано метод електронно-м!кроскоп1чного досл!дження до ! п!сля додавакня надлишсу бромистого етщЦю. Було встановлено, що в перших двох Фракц1ях розм!щуютьея ковалентно-замкнен! молекули ДНК, як!, можливо, в!др1зняються за суперсп!раяькоп ц!льн!етю. В трет1й Фракц И - BiflKpiiTi к!льцев1 ДНК.

Пк було виявлено для деяких в!русних ДНК, к!льцев1 Форш молекул можуть утворюватися за рахунок ковалентного зшивання к i (!Ц! в молекули б1лком ! так! Форш е необх!дииш для •грансфекцП. KpiM того, деяк1 ДНК вм!щують Фрагмента РНК. Вбу-дова б!лка i РНК можуть змшювати деяк! властивост! молекул ДНК, в тому числ! ! сеД1шентац!йн! характеристики. Наш було показано, що обробка препарат!в ДНК ВЯЛ проказою ! РНК-азою не •лмишс Ix 6iojiori4Ho"i aKTHBHocTi, не впливае на седиментац1йн1 властивост! ДНК, не викликае розрив!в в суперспгральних молекулах, Тобто, ковалентно-замкнен! молекули ДНК ВЯЛ не вм!щують 61лкових i рибонуклеотидних вставок.

На основ! поданих результат!в було зроблено висновок: препарата ДНК ВЯП складаються з молекул ДНК р!зноман!тких форм - п!дтсритих к!льцевих розм1ром 48-52 мкм, ковалентно-яамкнених

ДНК, як1 в1др1эняються за третинною структурою, л1к!йних дво-сшральних молекул р1зно1 довжшш. 0кр1м того, виявлено к!ль-цев1 олггом1рн1 форми молекул ДНК ВЯЛ - катенани, до складу нких входять двГ або три к!лцдев! молекули р!зно! форми 1 як! вмХщуються в в!р!онах подв!йно! або потр!йно! довжини, в1дпо-в!дно.

Подан! дан! св!дчать, що ДНИ, яка входить до складу в!р1о-н1в - це двоегпральна к1лыдева ковалентно-заыкнена молекула ДНК. 1нш1 форми молекул - продукта одно- чи двосп!ральних роз-ршив у пол!нуклеотидних нитках ДНК, як! не вмхщують Н1 б!л-кових, н! рибонуклеотидних вставок.

Виянлена нами р1зномак1тн!сть структурних Форм молекул ДНК ВЯП розширила наш! знания про х!д репродукцП в!русу. Так, наявн1сть катенан!в у в!русних частках дозволяв ирипустити, що реил1кац!я в1русно'1 ДНК проходить через тета-структури за Кернсом, ! це добре пов'язуеться з виявленням к!лькох точок !н!ц1ац!! репл!кац1'1. Катенани можна в!днести до молекул ДНК, як! п!зно репл!куються, як 1 катенани в!рус1в групи папова. Але, на в!дм!ну в1д представник!в ц!е! групи, бакулов!русн1 катенани входять до складу подовжених в!русних часток. Можли-во, це пов'язано з особливостями репродукцП бакулов!рус1в ! може вадбуватися внасл!док недостатньо! д!1 топо!зомераз на етагй терм1нацП репл1кац!1 ! комплексоутворення катенан1в з

61.ЯКОМ.

1.2. Залежн!сть 1нФекн1йност1 в!д Форми молекул ДНК.

Наступив завдання, яке стояло перед нами, складалося !з э'ясування питания яко! форми молекули ДНК ВЯП 1нФекц1йн1.

Ус1 використан! в робот! сумарн1 препарата ДНК ВЯП От буди 1нФекц!йними для личинок велико! вовднно! мол!, препарата ДНК РИГ! Мл буди 1нфекц1йниш для культури тканин МСАр-1.

Одним з п1дход1в, акт дозволив нам з'ясувати як! Форми молекул ДНК ВЯЛ 1нфекц1йн1, виявився метод термально! денату-рацП. В денатуруючих умовах ковалентно-заыкнен! молекули ДНК мають ряд характерних особливостей, як! дозволяють в!др1зняти ix в!д молекул ДНК 1ншо1 Форми: т1льки молекули ДНК ц1е! Форми вктримують умови ' денатурацП 1 одразу ж вгдновлюють свою структуру кав1ть при швидкому знятт1 денатуруючих умов. Тому, збереження чи втрата 1нфекц1йност1 препарат1в ДНК п1сля

Таблиця 2.

Структура молекул ДМ? 1 1нфекц1йнЗсть.

Препарат ДНК До денатурацм ГИсля денатураци

Форма молекул Ыфекцмжсть (% пол1ед.) Форма молекул 1нфекц1й-' жсть (% полгёд.)

Вихщж препарати ДНК Суперсшра-льж, вщкрит! ктыдев1, л1-ншж двоспь ральж 97 Суперсп1ра-льм, односгм-ральн1 юлыдев11 л1н!йн1 90

ДНК з нижньоТ зони град1енту* Суперстра- ЛЬЖ 1 В1ДКрИТ1 кшьцев1 90 Суперстра-ЛЬЖ юльця Одност'раль-ж ктьцп 1 Л1Н1ЙН1 20

ДНК з верхньо! зони град!бнту* В|Д<рит1 млыдев1, л1-н!йн1 дносп!-ральн! 87 Односшраль-н1 к1льцев11 л!Н1ЙН1 0

* використано фракци, огриман! при розд1ленн1 препарата ДНК в град1енл густини СбС1 з бромистим егидгем.

денатурацИ i швидког ренатурацН може внести певну яснеть у в!дпов1дь на питания - яка Форш молекул ДНК 1нфекц1йн1.

Результат«, як1 одержали при визначенн! píbhíb !нфекц!йно-ctí до i П1сля термально! денатурацИ вихздних препаратiв ДНК та Фракц1й, отриманих п1сля розд!лення цих препарат!в в град!-ент! густини CsCl з барвником, наведено в таблиц! 2.

Вих1дн! препарата ДНК майже повн!стю збер1гають свою íh-Фекц!йн1сть п!сля термально! денатурацИ. Часткова 1нфекц1й-н1сть такох залишаеться п!сля проведения термально! денатурацИ i у ДНК з нихньо! зони. Верхня зона, яка була !нФекц1йною до термально! денатурацИ, повн!стю втрачае !нфекц!йн!сть п!с-лл не!, що св!дчить про в!дсутн!сть !нФекц!йност! у односп!-ральних Форм ДНК ВЯЛ. Зберезкення 1нфекц!йност1 п!сля термально! денатурацИ пропарат!в ДНК з нижньо! зони ч!тко визначило, що ковалентно-замкнен! молекули ДНК ВЯЛ - 1нфекц1йн!. 3 !ншого боку, оск1льки препарати ДНК з верхньо! зони 1нфекц1йн1, але ковалентно-замкнен! молекули в них в!дсутн!, !нфекц!йн!сть ui-s'i зони сл!дуе в!дяести за рахунок 1нфекц1йност! або л!н!йних, або в!дкритих к1льцових Форм.

Роз!братися з цшл питаниям нам дозволили результати визна-чення !нфекц!йност! ФракцШ ДНК, отриманих при розд1ленн! пре-парат!в у град!ент1 5-20% цукрози з високою íohhokj силою(див. мал.2). Ц! результата подтвердили, що ковалентно-заыкнон! молекули ДНК !нфекц!йн!, причому незалежно в!д в1дм1нностей за третинною структурою (ФракцИ I i II). У III ФракцИ, яка и1с-тить сум!и к1льцевю: i л!н!йш1х молекул, крива !нфекц1йност! зм1щена в б!льш щ!льну зону цукрозного град!енту пор1вняно з кривою розпод!лу рад1оактивсого ыатер1алу. Як в!домо, кЬпьцэв! молекулы ДНК мають б!лыпий ксеф!ц1ент сэдиментацИ, н1ж л1н1й-iii Форми того самого po3MÍpy [Pagano & Hutchison,1071]. Це до-

-.шолило нам зробити висновок, що л1н!йн1 молекули ДНК ВЯЛ не 1нФекцШн1. Результата про в!деутн1сть 1нфекц1йност1 для л1-н1йних Форм ДНК ВЯЛ п!зн1ше було падтверджено в 1нших лабораториях [Bud & Kelly,1980; Kelly & Wang,1981].

Таким чином, при ядерному пол1едроз! 1нфекц1йшми е т1льки к1льцев! Форми BipioHHo'l ДНК - ковалентно-замкнен! i в1дкрит1 к1льцев1.

Схож1сть за макромолекулярною структурою .1 б1олог!чною активист», за po3Mipow к1льцевих ДНК показало, що ц! характеристики е, очевидно, загалыпши для геном1в Bcix ВЯЛ.

I т1льки застосування метод!в рестрикц!йного анал1зу 1 Ф1зичного картування виявило ч1тк! в1дм1нност! м!ж геномами ВЯЛ р!зних вид!в 1 дозволило достов1рно встаиовити розм!р гоном i в [?ЯП.

2.. Структурно-Ф.ункц1ональне картування геном!в ВЯЛ.

2.1. Ф1зичне картування.

Використання методу рестрикцЬшого анал1зу дозволило нам иобудувати Ф1зичн1 карти i визначити розм1р геном!в досл!джу-ваних BlpyciB.

'ia допомогою методу подв!йних обробок при використанн1 ре-сгриктаз BamHI i Smal нами було побудовано ор1ентовн1 карти геном!в ВЯГ1 Gm i ВЯП Вт. Застосування двох додаткових рестрик-таз Hlndlll i EcoRI, а такок методу блот-г1брид1зацП за Сау-зерном з використаншш окремих м!чених Фрагмент1в ДНК ВЯП Gm, дозволило нам картувати геном ВЯЛ Gm i отриыати його Ф1зичну карту. Розм1р геному, встановлений за сумою розм1р1в фрагментов, складае 138-140 kbp.

Для побудови ф1зич1Ю1 карти геному ВЯП Мп нами було за-стосовано три рестриктаяи: BamHI, Kpnl та Pstl. Результата об-

робок ДНК циш Ферментами 1 розм1р отриманих Фрагмент!в подано на малюнку 3 1 в таблиц! 3. Фрагмента кожно! обробки поэначено Л1терами. При оброб1_ц ВашН1 отримано 8 Фрагменте, при обробц1 Крп! ! - по 9 Фрагмент1в.

Таблиця 3. Ропм1р Фрагментов ДНК ВЯП Мп

Х+Ш.П(ПТ1 ВашНХ Крп1 PstI Щ КГ

сз

(в кЬр)

та

1Т

•л«

Ш

Хч

_ 23.1

9.4

6.5

2.3 2.0

А

В

С

- в

- Е

- р

в

_ н

А - В С Б

-X

Л

Б

' Е - ?

G -Н

I

-в,с

Фрагмент ВатШ Крп1 РзП

А 68,1* 54,8* 44,1*

В 21,4* 27,0 22,0*

С 17,2* 21,2* 21,0

п 8,9 15,4* 17,2*

Е 6,6 6,3 14,0

Р 6,3 5,2 8,7

в 6,3 4,6 4,7

II 4,1 3,4 4,0

I - 0,9 2,9

мол.вага 138,9 138,7 138,6

Мал.З. Електрофорез в агарозному гел! та розм!р Фрагмент!в. (табл.3), отриманих при обробц! ДНК ВЯП Мп рестрикта-зами ВашН1, Крп1, РвИ. Маркер-Н!псШ1-фрагменти ДНКА: * - позначено Фрагмента, розм!р яких було встановлено п!с-

ля додатково! рестрикцП. Розм1р геному ВЯН Мп було визначено за сумою розм1р1в Фрагмент1в, отриманих при д!1 кожно! рестриктази: в!н стано-

нить приблнзно 140 kbp. Цей розм!р сп!впадас з розм1ром гено-Miu ВЯЛ Ас 1 ВЯЛ Вт [Lee & Miller,1978; Maeda & Majima,1990].

Через досить велику к!льк!сть сайт!в вп1знавашш для рес-триктаз BamHl, Kpnl i PstI на геном! ВЯЛ Мп сконструювати карту на основ! т1льки визначення розм!ру Фрагмент!в при 1ндив1-дуальн!й та сум!сн!й обробц1 рестриктазами не вдалося. Тому, з геля видiляли !ндив1дуальн! BamHI-фрагмента i використовували 'ix, як зонди при блот-г!бридиэацП з в!русною ДНК, розщеплено! Ьгпшми рестриктазами. Докал!зац!ю в!дпов!дних рестрикц!йних сайтов, виявлену цим методом, було п!дтверджено прямим пор1в-

BamHI

ADFGCEB Н А

II 1 * Í 1 1 ■ i it > Kpn 11

EI GH A FC B D E

11111 t i i i i i

» » PstI

С I в Н F G Е D A Vj

i i ■ iiii i i i i

* t

kbp

i 1 i i i i i f

0 20 40 60 80 100 120 140

X геному

1 i 1 i i ... t ,. i _ i i ........i ..... i

О 20 40 60 80 100

Мал.4. Ф!зична карта геному ВЯЛ Мп, отримана методом подв1й-них обробок рестриктазами BamHI, Kpn I та Pst I: * - иозначино гон гюл!одрину (див.розд.2.3.); 1 - дЬжшса модиФ1кац1'| геному (див .розд.2.?.).

нннням 1ндив1дуалышх i оушсних обробок. Фгзичну карту геному ВЯЛ Мп в л1н!йному вар1ант! подано на малюнку 4.

Карта геному ВЯЛ fin за розм1щенням i розм1ром Фрагмент1в В1др1зняеться в!д карт геном!в ВЯЛ Ас, ВЯЛ Вт i ВЯЛ Gm.

Нульову точку карти ми позначили на одному з к!нц1в BglII -Фрагменту вздповхдно до загальновживано! пропозицП [ Vlak & Smith,1982], оск!льки, саме цей Фрагмент мае найменьший розм!р серед Фрагмент1в, як1 вм1щують ген пол1едрину (див.розд. 2.3). За рестриктазою BglII наш проведено часткове картування геному ВЯЛ Мп, тому на KapTi сайти для не! не позначено.

Таким чином, рестрикцШшй анал!з i ф!зичн! карти геном1в показали, що, не зважакт на схож1сть геном1в ВЯЛ за макромо-лекулярною структурою i розм!ром, bcí bohîi В1др1эняються за посл!довн1стю нуклеотид1в, тобто за первинною структурою.

2.2. Локал1зац1я д1лянки модиФ1каиИ генома ВЯЛ Мп.

Рестрикд1йпий анал!з дозволив також виявити вяутр1вдьови-дову гетерогенн!сть бакулов1рус1в. Нами було виявлено, що BipycHi препарата, отриман1 з хворих на ядерний пол!едроз гусениць Gm i Мп, гетерогенн!, що виэначалось за наявн!стю в рестрикованих препаратах в1русних ДНК Фрагмент1в, як1 знаходи-лиоь у субмолярн1й кглькоот i. 1ндип'1дуальн1 клони було отри-мано нами при розмножвнн! цих BipyciB в культур! кл1тин комах з використанням методу бляшок. При цьому нами було проведено пор1вня;шя Знфекц1йност1 i мвидкост! репродукцН цих BipyciB в культур! кл1тин. Було виявлено, dio клон W-1 ВЯЛ Мп в культур 1 кл!тин МСАр-1 мае найб1льиий титр i иайб1лыиу шпидк!сть репро-дукцП п иор1внянн1 з 1ншими вгруспими препаратами. Саме цей Bipyc i ni к.п1тини було обрако нами для подальше! роботи над стпоррцнда чкспресшно! систоми.

- г\ -

При робот1 з клоном №-1 ВЯЛ Мп було пом1чено, що при пасируванн! цього варусу в культур! кл!тин в!н стае гетерогеншш, що виявлялося за появою субмолярпих Фрагмент!в в рестрикованих препаратах ДНК. При цьому субмолярн! Фрагмента з'являються вже на 2-3 пасаж! 1 при лодальшому пасируванн! 1х к!льк1сть зростае (мал.5).

г Ваш111(б). В1рус клону М-1 прошлое один (1), три (2),

ш!сть(3) або десять*4) пасаж!в. Маркер-Фрагменти ДНК : -- - позначено субмолярн! Фрагменти; * - позначено фрагменти, к1льк1сть яких зменшуеться при пасируванн!.

Як було нами в!дм!чено, в той же час к5льк!сть б!лып висо-комолекулярних фрагментов- Есои1-А(24 Мэр) та ВатНГЩ8,9 кЪр) зменшуетьоя. Лналог1чна картина спостер1галася 1 для 1нших ви-кориотаних наш рестриктаз: ШгкЦП, Есой!, В^Ш та РвИ.

Ми прилустили, що поява MinopiB в!дбуваеться внасл!док jiKoï-небудь модиФЗ-кацП д!лянок б!льш вцсокомолекулярних Фраг-мент1в. Для перев1рки цього припущення з гелю було вид!лено MiHopni BamHI-фрагменти розм!ром 5,5 i 3,4 kbp, як1 було вико-риотано як зонда для блот-г1бридизац11 з гетерогенною ДНК ВЯГ1 Мп, рестрикованою р!зними рестриктазами (мал.6).

а .6 в ,

123^56 123456 12J456

Мал.6. Електрофореграма (a) i г!бридизац1я (б,в) ДНК ВЯЛ Мп, рестрикоплно! EcoRI(l), BamHI(2) ,KpnI(3), IlindIII(4), BßlII(5), Pstl(6) та маркерн! Фрагмента ДНК " ( 7 ). Блоти було г!бридизовано з 32Р -BamHI -фрагментами 5,5 kbp (б) i 3,4 kbp (в). Стрелками позначено суб-молярн1 Фрагмента.

Результат« блот-г 1бридиэац1'1 визначшш, що м!норн1 Фраг-

монти, як1 виявляються при рестрикуванн! гетерогенних препаратов ДНК, е складовиш в1дпов1дного мажорного Фрагменту з гомогенного препарату ДНК.

Б1льш детальне картування ЕсоИ-фрагменту 1 локал!зац1я м1нор1в на карт1 геному визначила, що додатковий сайт для кож-но! застосовано! нами рестриктази розм1щуеться в единому м!сц1 геному (мал.7). Це дозволило нам прилустити, то в цьому м1сц! в!дбуваеться неспециФ1чний розрив в1русно! ДНК.

ИТ ЕйВН К Bg РК ШйРВ К И а есои-а"--ч" " " '---1

10 14 б

ЕсоГМ-А'--1-'

5,5 3,4 BaniHI-D 1-1-

5,0 1,2

HindII[-J

4,1 0,5

Kpnl-G 1-H

0,9 2,0

BglIT-K i-|-'

i_i__i_i_i_i_i_i_i_i_i i., i i i_i i_■ » i ' » ' » »

0 4 3 | 12 16 20 24 kbp

Мал.7. Ф1зична карта EcoRI-Д.-фрагменту генома ВЯЛ Mn (а) 1 Фрагмента в1русного геному (б), розщеплення яких при-зводить до утворення и!норних Фрагмент!в при розд! ленн1 рестрикованих препарат1в BipycHoï ДНК 4: | - позначена точка розщеплення.

Ця "гаряча точка" зааходиться поблизу в1д сайту для PfitI

- 24 -

- на BiMcrani ОД kbp (див.мал.4).

Для бакулов1рус1в в!домо к!лька тшпв геномних перебудов при пасируванн! в культур! кл1тин. Деяк! в!руси п1сля cepl'i nacaxiB ыали вставки у вигляд! або транспозоногкдобних еле-MSH'riB геному кл!тин-хазя1в [Miller & Miller,1982], або дупл1кованих д1лянок в!русного геному [Burand & Summers,1982]. В деяких популяц1ях з'являлись делецпш! мутанта [Kumar & Miller,1987]. Але Bei мутантн! в!русн! форми з'являлися п1сля велико! к!лькост1 пасазив. Особлив!стю в!русного клону ВЯЛ Мп W-1 виявшюся те, що вже через 2-3 пасаж! з'являеться м!норна Фракц!я Bipycy, геном яко'1 модиФ!кований. Виявлений нами ввд модиФЗкацИ ран!ше не було визначено у бакулов1рус!в.

Bei спроби вид1лення гомогенних клон!в Miiiopnol ФракцП Bipycy були невдал!. Тому ми зробили припущення, що м1норна Фракц1я, яка утворюеться п1сля cepi'i nacaxiB Bipycy в кл!тинах дубового шовкопряду, не е життездатною у в1дсутност! в!русу дикого типу. Це е ще одним доказом на користь появи саме роз-риву в геном! Bipycy, тому що не!нфек1дйними е саме л!н!йн! молекули ДНК ВЯЛ (див.розд.1.2).

Доки не ясно, яке функц!ональне навантаження несе така мо-днфисац1я геному. Але ясно, що ця модиф!кац1я в1дбуваеться внас;л!док взаеыодИ Bipycy з неспециф1чним хазяхном - культурою кл!тин МСАр-1, оск!льки при !нф1куванн1 гусен! к!льчастого шовкопряду BipycoM гетерогенно! популяцП н!коли не спостер!-гали под!бного ефекту.

Таким чином, нами було виявлено нестаб!льн!сть геному ВЯЛ Мп при пасирування Bipycy у клатшах МСАр-1, яка проявляеться у появ! нового ВЯЛ !з зм!неним генотипом. Цей новий генотип характеризуеться ыодиФ1кац!ею далянки геному, в як!й в!дбува-«тьоя розщеплення геному в един!й певн1й точц! при дИ вс!х

заотосованих нами рестриктаз. Цю "гарячу точку" локал1зовано на карт! геному ВЯЛ Мп. Виявлена модиф1кац!я являвться новим видом модиФ!кацП бакулов!русних геном1в.

Нестаб!льн!сть геному ВЯП Мп могла б стати на перешкод! ' при створэнн! eiccnpeclflHOÏ систеыи. Але ми встанояили, що па-оирування в!русу ВЯЛ Мп W-1 в культур! кл!тин МСАр-1 принайм1 на протяз! 10-15 пасаж!в не впливае на титр в!русу ! к!льк!сть б!лка пол!едрину, вм1ст якого в заражения кл!тинах складае 5070% в!д вм1сту загально^о кумас!-пофарбованого б1лка. Саме та-кий високий вм!ст пол!едрину спонукав нас для створення век-TopHoï бакулов1руснох систеш використати ген пол1едркну ВЯП Мп i його сильний промотор.

2.3. Локал1зан1я гена пол1едрину ! його Функц1онально-важливих д1лянок.

Приступаючи до локал!зацП гена пол!едрину, ми базувалися на тому, що близько 75% нуклеотидних посл1довностей вивчених ген!в пол!едрину р!зних бакулов!рус1в е консервативними [Rohr-mann,1986]. Тому для локал1зац!1 гена пол1едр!шу в геномах ВЯП От та ВЯП Мп ми використали як зонд плазм!ду pOMS-Q, яку було надано нам лаборатор!ею Рормана [Rohrmann ut al.,1982]. И Q-Фрагмент являе собою д!ляпку ДНК ВЯП Orgyia pseudotsugata з геном пол1едрину.

Використовуючи цю плазм!ду, нам вдалося локал!зувати ген пол1едрину на карт! геному ВЯП Gm: було ппяплено поодииок! Фрагменти, як! г!бридизувалися з зондом, тобто вм!щували гон nanio/ipniiy.

Для виявлення ! локал1аац.Ш гена пол!едрину ВЯ1! Мп ми використали Фрагмент геному ВЯП Gm -HindIII-R, розм!ром 1,0 kbp, я кий вм!щувас ген пол1одрипу ВЯП Gm. За допомогою блот-г.1бри-

дизацП ДНК ВЯЛ Мп, роэщеплено! Bglll, Smal, Sali, Hindill, Pstl та EcoRI, було виявлено поодинок! Фрагмента, як! г!бриди-

При оброб!ц рестриктазами ВашНТ 1 Крп1 з зондом г!брвдизу-валося по два Фрагмента в1русно1 ДНК, що могло св!дчити про наявн!сть сайт!в для цих рестриктаз в середин! гена пол!едри-ну, що 1 було п!дтверджено пгзнше.

Таким чином, гени пол1вдрилу ВЯЛ Мп та ВЯЛ йш було виявлено 1 локал!повано на карт! геном!в.

Необх!дним кроком при конструтованн! експрес1йного баку-лов!русного вектору з використанням гона пол!едрину с виявлен-ня Функц1онально важливих д!лянок щ.ого гону, тобто промотор-ноХ, кодуючоХ 1 терм!нально'1 областей.

Для проведения с!квенсу було клоновано в р\1С1В окром! д!ляшш 3.2 кЬр-БаИ-фрагменту. Схему (шсвенеа центрально!' д!лянки цього фрагменту подано на малмику 9.

зувалися з зондом (мал.8). 12 3^5 7 О 9 Ю11

Мал.8. Блот-г1бридизац!я ре-стриковано! ДНК ВЯЛ Мп з 32Р-HindIII-R-фрагментом ВЯЛ Gm. ДНК рестриковано Bglll(1);

NcoI(2); Smal(3); Sall(4);

EcoRI(5);XhoI(7);H!ndlII(8); Pstl(9); Kpnl{10);BamHI(11).

S К H К В Bg S

i_i_l_i_I-1-1

0,1 0,9 0,1 0,5 0,5 1,1 kbp

s — S

l________l-j______i-_- - -x--------------------i

Мал.9. Схема с1квенування центрально! д1лянки 3.2 kbp-SalI-Фрагменту. Стр1лками вказано напряыок читання клоно-паиих субфрагиентхв. Л1т:ерами позначено сайта для ре-отриктаз: S-Sall, K-Kpnl, H-HlndIII, B-BamHI, Bg-BglI.

lia малюнку 10 подано нуклеотидну i аы1нокислотну посл1дов-niuTb гена пол1едрину ВЯЛ Мп.

Визначено промоторну область, яка вм!щуе 48 нуклеотщцв i починаеться з висококонсервативно! посл1довност1, кодуючу носл1довн1сть, яка складаеться 1з 735 нуклеотид!в 13'- к!нце-ву д1лянку гена. Bel ni д1лянки високо гомолог.1чн1 аналог1чним областям ген!в пол!едрину 1нпмх бакулов!рус1в.

Таким чином, нами було встановлено макромолекулярну структуру бакулов1русних геном!в, визначено 1нфекц1йность т1льки к1льцевих молекул ДНК, виявлено продуктивну в!русну систему, локал!зовано ген полдедрину 1 його регуляторн1 д1лянки. Все це дозволило нам перейти до створення векторно! бакулов1русно! о.истеми на баз! ВШ1 Mn i культури кл!тин МСАр-1.

3. Створення бакуловарусно! експрес1йно! системи.

0ск1льки одноетапне ввйдення гетеролог!чного гену до складу бакулов1русного геному немокливе, необх1дннм кроном при створенн! бакулов1русно! експрес!йно1 системи е конструюванкя транспорттис вектор!в.

b'- ngat cttpgatcgc | Bglll

-240 cgccaccggt gttcaaagac gacaaaaata tgttgcgtag tgaacattta atttttaaaa

-180 cactgtacat tttcaagtca caaatgagca aggegegegg cggatcgttt ataagtcatc

-120 gccgctcgca cgcacacatc gtaacaatgt aaaattataa ttatacgctc acatacacad

- 60 acatacacad tataagtatt tttattcttt cgtaaaaaaa ttagaaaaat aaaatataaa

**********

met tyr trp arg tyr ser tyr asn pro trp leu glu arg trp tyr val tyr asp

+ 1 ATG TAT ЛСА CGT ТЛС AGT TAT ЛАТ CCC АСА CTG GGC CGC ACC TAT GTT TAT GAT

I ЛссХ HacIII

asn lys tyr tyr lys asn leu glu his val ile lys asn ala lys arg lys lys

53 AAT АЛЛ TAT ТАС АЛЛ AAC CTC GGA CAT GTG ЛТС AAA AAC GCC AAG CGC AAG AAG

ala ala ala glu his glu his glu glu arg asn arg asp pro leu asp lys tyr

109 ЛЛТ GCC GCC GAG САС GAG СТА GAA CAG CGC AAC CTG GAT CCC CTC GAC AAG TAC

1 Alul EcoRII! 1 Bamlll TaqI

leu Viil gly glu asp pro phe leu glu pro gly lys asn his lys leu thr leu

163 ТТЛ GTG GCC GAA GAT CCT TTC TTG GAA CCT GGC AAA ЛАС CAA AAA CTC АСА TTG

Ctrl I | HaellX 1 EcoRII

phe lys glu lie arg ur.n val lys pro asp tre met lys leu ilo val asn trp

217 TTC AAG GAA ATT CGT ДАТ GTC АЛЛ CCG GAC ACG ATG AAA CTC АТС GTA AAC TGG

sec gly lys glu phe leu arg glu thr trp tre arg phe mot glu asp ser phe

271 AGC GGC AAA GAG TTT CTG CGT GAA ACT TGG ACC CGT TTC ATG GAA GAC AGC TTC

Alul

pro ile val nsn asp gin glu ilo met asp val phe leu val val asn met arg

325 CCC ATT GTC AAC GAC CAG GAA ATA ATG GAC GTG TTT СТА GTG GTC AAC ATG CGC

Hindll| ! EcoRII 1 Hindll

pro thr lys pro asn tre cys ser val leu ala gin hys ala leu org cys asp

379 CCA лет AM CCG AAC ACT TGT TCG GTT TTG GCT CAA CAC GCG TTA CGG TGC GAC

Hinfl

ser asp tyr val pro hys glu val ile arg ile val lys pro ser tyr val gly

433 TCT GAC TAT GTC CCG CAC GAG GTG АТС AGG ATT GTG AAA CCT TCG TAC GTA GGT

ser asn asn asp asp arg ile ser leu gly lys arg tyr asn gly cys pro val

487 AGC AAC AAC GAT GAC CGC АТС AGT TTG GGC AAA CGA TAC AAC GGA TGC CCA GTT

met asn leu hys ser glu tyr thr asn ser phe glu asp phe ile asn arg val

541 ATG AAC TTG CAT TCA GAG TAC ACC AAT TCC TTT GAA GAT TTC АТС AAC CGA GTG

lie trp glu asn phe tyr lys pro leu val tyr ile gly thr asp ser ala glu

595 ЛТС TGG GAA AAC ТГС TAC AAA CCT СГС GTG TAC ATT GGT ACC GAT TCT GCC GAA

Kpnl | 1 Hinfl

glu glu glu ile leu .1 PU glu val ser leu val phe lys ile lys glu phe ala

649 GAA GAG GAA ATT CTC TTA GAG GTG TCT TTG GTG TTC AAA АТС AAA GAG TTC GCT

pro asp ala pro leu tyr thr gly por ala tyr

703 ccc GAC GCA ССТ СТА TAC ACT GGA CCC GCA TAC taa gcttcacttt ctctatattt

| HlndHI

757 aacgagattca tgacgttttc caacagacga atatagtttt tattagttgg acgcaatcta togct

Мял.10.Нуклеогидиа I аы1нокислотна посл1довн1сть гена полд.ед-рину ВЯЛ Ып. Шдкреслено консервативну посл1довн1сгь, в межах яно! знаходиться точка luiijiaiUI транскрипцИ.

- 29 -

3.1. Конструювання транспортних вектор1в. Локал!зац!я сайт!в на посл!довност! гена пол!едрину визна-чила, що для конструювання транспортного вектору можна викори-стати EcoRI-Pstl-фрагмент розм1ром 10 kbp, який було проклоно-• вано в pUC18 i отриыано плазм!ду рМРЕА (мал.11)..

Ее ort

Hlndlll

PÜC10

Vßlll

sali

Hlndlll, Pstl _

Ш111

*pnl Hlndlll

Sali KpdI

Мал.11. Ф1зична карта транспортного вектору рМРЕ-А: ^ 4 4 s s.-д - ген пол1едрину;

tarn - промоторна д1лянка гена пол1едршу.

Розтааування гена пол!едрину в центр! в!русного Фрагменту, достатня довжина д!лянок в!русно! ДНК, що фланкують ген 1 не-обх!дних для гомолог!чно! рекомб!нац!1, а також наявн1сть в ген! пол!едрина,сайт1в для рестриктаз BamHI i Kpnl дозволили розглядати дану нлаэиЛду як транспортний вектор для клонування гвтеролог1чних renin у кодувч1й посл!довност1 гена пол!одрину.

При нлонупаин! за ВатШ-сайтоы, який роэм1иуеться з положена! +144 (дав.мал.10), готеролог!чний ген набуватиме додат-

ков! нуклеотиди на 5'-к1нц1. Результатом експресП цього гену в бакулов1русн!й систем! мае бути химерний б1лок, який буде мати 48 додаткових кмшо кислот б!лка гюл1едршу на Ы-кхнш..

Для того, щоб одержати транспортн! вектори для продукуван-ня чистих б1лк1в, необх1дно було ввести безпосередньо п1д промотор гена пол1едрину в район 1н!ц1юючого кодону л1нкерну Д1лянку з сайтами для певних рестриктаз, щоб мати можлив!сть клонувати за цими сайтами гетеролог1чн! гени.

За допомогою пол!меразно1 ландюгово! реакцИ 1 синтетичних праймер!в було модиф1ковано фрагмент гена пол1едрину, який м!стить промоторну дълянку, обмежену BglII-caйтoм з 5'-к1нця ! прилеглу до промотору посл1довн!сть, яка вм1щуе 1н1ц!юючий ко-дон. В результат! було одержано плазм!ди*сер!! рМ (мал.12).

+1 +144 +631

рМРЕА .ЛагаааАТС...........в йАТ СС____СйТ АСС____ТААесП

ВашН! Н1п<3111

+1 +144 »631

рМ1.2 .. 1агаааАаесИеёа1сс..................вОТ АСС____ТААвси

Н1псПП ВагаН! Крп1 ШпсЗШ

+1 ♦144 +631

рМ1.3 .. tataaaЛTGaagcttggatcc...............СИТ АСС____ТАА?;с«

ШпсИИ ВатН1 Крп! 111гк11 П

+1 +144 +631

рМ1.4 . Ла!аааШеа1сс......................йСТ АСС... TAAgctt

ВагаН! Крп! ШгкШ!

Мал.12. Посл1довн!сть нуклеотид!в трансиортних вектор!в ое-рИ рМ 1 рМРЕ-А в район! сайт1в !нтограц1! гетероло-г!чнопо гену. ГИдкреслено 1н!ц!юючий кодон.

рМ1.2 можо бути використано для клонування ген1в о власним

ЛТС-кодоном. В плазм!дах рМ1.3 1 рМ1.4, де збережено !н1ц!юю-чий кодои, можна клонувати гени без власного АТС-кодону. рМ1.2 1 рМ1.3 мають по два сайти для клонування гетеролог!чних ген!в - ВатН1 1 ШшПП. рМ1-4 м!стить один клонуючий сайт для рест-риктази Ват111. Сайт для рестриктази ВатН1 в плазм1дах рМ1.3 1 рМ1.4 :з находиться в р!зних-рамках зчитування вЗдносно 1н1ц1юю-чого кодону.

Таким чином, нами одержано сер!ю транспортних вектор!в для клонування гетеролог1чннх ген!в п!д промотором гену пол!едри-ну. Результатом експресП цих ген!в в бакулов!русн1й систем! мае бути, як химеркий, так ! чистий б1лок.

Ьжспрес1я бактер1ально"1 в-галактозидази в кл1тинах комах.

Для аналгзу активност! промотор1в в р!з1шх експресЩшх системах, як еукар1отичних, так ! прокар!отичних, широко вико-ристовуеться, як моцельний, ген бактер!ально! в-галактозидази (в-йа1).

При конструюванн! рекомб!нантних транспортних вектор!в нами було використано ген в^а! розм!ром 3072 Ьр 1з плазм!ди рАс-360-501-в-еа1, надано'1 нам лаборатор!ею Самыерса. У цьому гаи були в1дсутн1 перш! 27 нуклеотид!в 5'-к!нця, тому для клонування було використано транспорта! вектори, як! мають власний АТО-кодои ! у яких рамка зчитування сп!впадае з геном в-§а1 - плазм!ди рМРЕА 1 рМ1.4. Ген в^а1 було вбудовано в ц! плазм!ди ! було отримано рекомб1нантн! транспорта! вектори -pMPEA-в-gal и рМ-в-еа1.

Для одержання експрес!йних бакулов1русних вектор!в моношар кл1тин МСАр-1 котрансф!кували оуы!вша ДНК ВЯ11 Мп У-1 1 ДНК в1-дпов!дного рекомб!нантного транспортного вектору у сп!вв1дно-

шенн! 1:2. Появу рекомб1нантного вирусу з вбудованим геном в-£а1 виявляли в1зуально за появою сшпх бляшок в присутност1 Х^а! в моношар! кл1тин, !нф1кованих в1русним матер1алом,отри-маниы п!сля котрансфекц!!. Приблизно 1-2% бляшок було утворено рекомб1нантним в!русом, який експресував в-галактозидазу.

Для очищения в1д дом1шок в1русу дикого типу рекомб1нантн! в!руси було трич! проведено через бляшки. Рестрикцшний анал1з в сполучеша з методом блот-г1бридизац1'1 дозволив нам в1д1бра-ти в!русн1 клони, як1 вмщували ген в-ва1 в очпсуваному м1сц1 I в яких не було дом!шок в1русу дикого типу.

В результат! нами було одержано два клони рекомб1нантних бакулов!рус1в, як! являють собою експресШи вектори з геном в-галактозидази п!д контролем промотору гена пол!едрину: ВЯЛ Mn'B-gal1 призначений для експресИ химерно! в-галактозидази, з Н-кнщя яко! будуть присутн! 48 ам1нокислотних залипла ь б1лка пол1едр1шу; ВЯЛ Мп1.4-в~еа1, призначений для експрес!! чисто! (не хгшерно!) в-галактозидазй.

Анал!з експресИ в-галактозидази було проведено шляхом вивчення б!лкового складу кл1тин, !нф1кованих рекомб1налтними в!русами та вим!рюванням р!вн!в ферментативно! активност! ре-коиб1нантно! в-галактозидази в кл1тиннмх екстрактах ! середовищ! через певн1 иром1жки часу п!сля шфакування (мал.13).

Вже на 24 годину п!сля !нФ1кування в-галактозидаза виявля-еться в середовищ!'1 клатинному екстракт!. До 96 години п1сля 1нф!кування р!вн! активност! ферменту в кл1тинних екстрактах зб!лыпуються, а пот!м починають 31шжатися, що, очевидно, пов'язано з б!льи 1нтенеивниы виходом в-галактозидази в сере-довище внасл!дак руйнування кл!тииних мембран на пгзних етапах розвитку 1нфекц!1. Р!вн! активност! ферменту в середовищ! зроптають до 168 години п1сля 1нф!кування. Максимальний сумар-

1 2 3 4 .5 6 7 8. 9 10

пп

Б

-Mí. 2 3 4 5 6.....7 8.10

• l i >-—. u-j "•»■> -— t

—< Г j_j ¡..ttáífeá'úba «к» fca> —'

чГ^йВЕШ--

i-i"

9 ot

.........,

i'fí И ;'• '

-i-r-

0 24 48 72 96 120 144 168

години

Мал.13. Динам1ка накопичення в-галактозидази в моношаров1й культур i кл1тин МСАр-1, 1нФ1ковано1 рекомб1нантними Ярусами Mn-gal(I) i Mnl.4-gal (II) через певн1 про-м1жки часу п1оля 1нф1кування: 1- О; 2- 24; 3- 48; 472; 5- 96; 6- 120; 7-144; В- 168; 9- 192 год. п,б - олектрофорез л!зат1в кл1тин в ПЛАГ1; я - сумарн! р5вн1 актишюпт! в-галактозидапи.

ний р!вень активност! в-галактозидази в кл1тинах 1 середовшц окладае 5.2 МО для чистого б1лка та 15.4 МО - для химерно! в-галактозидази (малЛЗв).

Визначення калькос.т! синтезовано! в-галактозидази методом денснтометрування електрофореграм, отриманих при розд1ленн1 б!лк!в 1з заражених юитин, виявило, що максимальна к!льк1сть химерно! в-галактозидази в кл!тинах спостер1гаетьсл через 96

л

годин и!сля 1нф1кування 1 складае 70-75 мкг на 1x10 кл!тин. К}льк1сть чисто! в-галактозидази досягае максимуму тех через 96 годаш 1 склада-" 40-45 мкг на 1x1О9кл!тин (мал.13а,б).

Р1вн1 активност! 1 к!льк1сть химерного б1лка в наш1й екс-прес1йя1й систем1 вищ1, н1ж р!вн1 чистого б1лка, що сп!впадае з даними, одержаними в експрес1йних системах на основ! ВЯЛ Ас. Наш було проведено пор!вняльний анал!з даних про р!вень синтезу в-галактозидази в !нпмх експрес1йних системах 1 виявлено, що рДвн1 активности в-галактоздиази, отриман! в наш!й систем!, пор!вкюван1 з р!внями експрес!! цъого Ферменту в !нших бакуло-в1русних системах.

Одержан! наш дан1 дозволяли вважати нову бакулов!русну систему перспективною для одержання гетеролог!чних б1лк!в р1зиого призначення.

Ми зосередили свою увагу на б!лку людини - гормон! пролак-тин!, оскЛльки отримання очищеного рекомб!нантного пролактину перспективно як для д!агностики деяких патолог!й, так 1 для рчгулювяння р!вня лактацН.

3.3. Екс.пис1с1я текомб!нантного пиолактипу людини в кл!тинах комах.

Гекомб!нан'пшй в!рус було одержано в два отапи: спочатку Пуло скинструйовано човникопу п.пазм1ду з вбудованою кДНК про-

.пактину, а почйм за допсмогою методу котрансфекцП сп!лыго з ДНК дикого ВЯП Мп було отримано рекомб!нантний Bipyc. У робот1 було використано кДНК пролактину людини, люб'язно надану лабораторию А.Д.Шведа [Золотухи та in.,1989].

За вектор для конструювашш човншсово! плазм!ди було обра-ко один з модифхкованих транспортних вектор1в- плазм!ду рМ1.2, що дозволило ввести ген пролактину беапосередньо п1д промотор гена пол1едрину для одержання чистого 61лка.

Вюадна кДНК пролактину обмекена ВатШ-сайтом з 5'-к!нця i Kpnl-сайтом з 3'-к!кця, тому введения з човникову плазм1ду проводили за BamHl- i Kpnl-сайтами. В результат! було отримано човникову векторну пла;'м1ду (pM-prol), в як1й м!стилася кДНК гену пролактину людини розм!ром 0.69 kbp безпосередньо н1д промотором гона пол!едрину i яка практично новн!стю зам.1щувала структурну частину гена пол!едрину.

Цы плазм 1ду разом з ДИК Bipycy клону W-1 було використано для котрансфекцП клЗтин МСЛр-1 в моношаров!й культур!. Сум1ш препарат!в BipycHo'i 1 плазм1дно'1 ДНК для котрансфекцИ готува-ли у дек!лысох cniBBiдношеннях. Найб!льш вдалим для ефективно! котрансфекцП виявилось сп1вв!дноиення Bipycuoi ДНК до плазм!-дно1 1:5. Вих!д рекомб1нант!в в цьому вар!ант1 склацав до 2%.

Для аналгзу локал!зацП 1нтегровано1 кДНК гена пролактину з (плькох 1зольованих клон!в, в яких не було виявлено пол1ед-piB, було вид!лено Bipycuy ДНК. За допомогою рестрикц!иного анал!зу i блот-г!бридазацП було вiдiбрано nipycid клони, ДНК яких вм!щувала кДНК пролактину ! в яких не було дом!иок вЗрусзу дикого типу.

Для внявлення експресП пролактину в культур! кл!тин, 1нф!кованих рекомб!нантнш BipycoM, було використовано метод рад!о1Ммунного анал1пу з застосуванням набор!в "Pla-прол" з

м!ченим 1251 пролактином.

Пролактия виявляли в середовщ! 1 в л!затах кл!тин через невн! пром!жки часу п1сля !нф1кування (мал. 14).

години

Нал.14. Динам1ка накопичеш1я рекомб!нантного пролактину в л!затах(а) та середовищКб) кл1тин комах, !нФ!кова-них рекомб!нантшш в1русом.

Вже через 24 годили пролактин виявляеться в кл1тинах комах. Вм1ст його у шитииах к1льк!сно зроотав до 48 год и!сля 1нФ1кувашш 1 складав 9500-11000 мкМО на мл, п1сля чого р1вень пролактину у кл1тинних л!затах трохи спадав. У середовищ! спо-ствр!галася 1нша картина: гюступове зростання р1вня пролактину у перш1 дв1 доби та р1зкий сплеск його на 3 добу 1 зростання до 7 доби (7000-13000 мкМО/мл).

Таким чинок, як 1 при синтез! в-галактозидази, пролактин спочатку накопичуеться у кл!тинах, а пот!м в!дбуваеться його

и«ирец1я у середовище, що можливо пов'язано 1з руйпуванням кл1тинних мембран.

Суыарна к1льк!сть пролактину синтезованого в кл1тинах комах становить приблизно 20 МО на мл середовща або на 10^ кл!-тин. Пор1внююч1 з питомою активн1стто комерцШгих препарат!в к!льк!сть пролактину синтезованого в наш!й систем1 становить 1,5 - 2 мг пролактину на 1 л середовища або на Ю*1 кл1тин. Та-ка к!льк!сть синтезованого рекомб!нантного б!лку сввдчить про ефективну експрес!» кДНК гена пролактину в наш!й баку-лов1русн!й систем!. Для переважно! б!льшост1 еукар1отичнш( ре-комбпг-антних б!лк!в, синтезованих в бакулов!русн!й систем!, к!лыс!сть Зх становить в!д 1 до 10 мг на 10^ кл!тин.

Таким чином, на баз! високопродуктивно'1 системи в!рус ВЯП Мп - культура кл!тин МСАр-1 створено нову ефективну бакулов1-русну систему (третю- в св!т!) для синтезу гетеролог!чних б!лк!в р!зного Походження, серед ¡шх 1 еукарштичких. Наша експрос1йна система за р!внем синтезу бактер!ально1 в-галак-тоз!дази не поступаеться ефективност! !нпшх в!домих баку-лов!русних систем. Рекомб1нантний гормон пролактш людини, синтезований в наи!й систем!, 1мунолог!чно активний. Ус! поручен! вице дан! св!дчать, що розроблена нами нова бакулов!-русна.експрес!йна система може використовуватися для б!отехно-лог!чного одержання гетеролог!чних б!лк!в р!зного походаекня.

ЗАКЛЮЧЕНИЯ.

Подан! в робот! дан! св1дчать, ¡до мета, яка була поставлена на початку досл!джень, досягнута: встановляна мпкромолеку-лярна структура !нфвкц!йного геному бакулов!рус!п - не двосп1-ральна к1льцо.ва ковалентио-замкнена молекула ДНК. Роям1р гоном] в дослзджуваних м1руг:1ч теладае приб.ттпно НО кЪр.

Ц1 дан1, а також 1нш1 дши, отриман! в нашому 1нститут1, завершили багатор!чну дискус!ю про морфологз-Ю бакулов1рус1в. Бона завершилась створенняы модел1 структури в1р!ону, яка д!йсна 1 на сьогодн1. •

Комплексы! досл1дження, як! було проведено в нашому 1нсти-тут1, 1 як1 призвели до визначення д1йсного розм!ру генома ба-кулов1рус1в та структури пол1едрину, вперие зробшш реальним досл!дження зв'язку структури 1 ФункцИ нуклешових 1 б1лкових компонент1в бакулов!рус1в. Само з цих досл!джень почався роэ-виток молекулярно! б1ологП бакулов1рус1в. 0триман1 дан1 стали основою для розвитку нового напрямку - досл!дження молекуляр-1шх механизм!в репродукцП бакулов!рус1в>.

Сл1д сказати про перспективу використання проведених до-сл!джень 1 отриманих результат!в в Фундаменталышх 1 приклад-них аспектах.

■Перш за все, перспективним являеться продовження досл!д-ження виявлено! нами нестаб1льност! генома ВЯЛ Мп. Розкриття природа цього явища - виявлення первиино! структури в д1лянц! модифАкацИ геному, з'ясування як! гени 1 з якими Функц1ями зач!пае ця модиф1кац1я, 1 яким чином в 1дбуваяться репл1кац.1я цього модиф!кованого геному - це т! питания, в!дпов1дь на як1 привнесе нову 1нформац1ю про механ1зм взаемодП двох гетероло-г1чних геном1в, про репл!кац1ю ДНК.

Кр1м того, можливе використання створено! наш системи для напрацювання деФ1цитних 1 модиф1кованих б1лк.1в, отриманих за допомогою опрямованого сайт-мутагенезу, для структурно-функц1-оналыдах досл!джень.

У прикладному аспект! - використання пекторно! системи у вироПництв1 б1лк.1в 1 петид1в для потреб ыедицини та для роп-робки попих ефективних 1нсак:тицид1п, створоних нп баз! ШТ.

ВИС] ЮБКИ.

1. Виерше низиачена структура гнФекц!йного бакулов1русного геному: це ковалентно-замкнена к!льцева молекула ДНК без б!л-кових i ри б о н у к л е о т идни х вставок. Розмгр геному досл!джувапих BipyciB складае 138-142 kbp.

2. Вперше виявлено гетерогеннгсть к1льцевих молекул ДНК ВЯЛ: виявлено ковалентно-замкнен! суперсп!ральн1 молекули, BiflMiiuii за третинною структурою, В1дкрит1 к!льцев! форми та катенани, HKi входять до складу подовжених в!руених часток.

3. Вперие показано !нфекц!йн!сть ковадентно-замкнених та в1дкритих к1льцевих молекул ДНК. Jlinimii форми не imfeicuiftni.

4. Визначено Ф1зичн1 карти геном!в BipyciB; локал!зовано ген гюл1едрину ВЯП Мп, встановлено його нуклеотидну посл1дов-н1сть, локал1зовано ФункцЮнально важлив1 д1лянки гена.

Ь. Показано нестаб1льн!сть геному ВЯП tar. виявлено новий тип модиФ1кац1'1 бакулов1русного геному при пассируванн! його в культур! кл i тин комах.

6. На баз! Bipycy ВЯП Mn i культури кл1тин МСАр-1 створена нову бакулов!русну eKcnpeciimy систему для синтезу гетеро-лог1чних б1лк1в разного походження.

7. Сконструйовано cepiio транспортних бакулов!русш1Х вектор« для eKcnpeciï хшерних i чистих б!лк!в з м!сцем !нтег-рацП re'repoJiori4HHX ген!в п!д промотором гена пол!едрику. За р!внем синтезу бактер!алыю'1 в-галактозидази створена нами си-тема не поступаеться ефективност1 1шшм в!домиы бакулов!русиим екпресшним системам.

8. Вперша за допомогою бакулов!русно! вкспрес1йно1 система отркмано рекомб!нантний гормон пролактин людинк.

- 40 -

OcHQBHl роботи. надрукован! за темою дисертацП:

1. Кок И.П., Скуратовская И.Н., Строковская Л.И. Молекуляр-

ные основы репродукции бакуловирусов//Киев: Наук.думка.-1980.- 175 с.

2. Гудзь-Горбань О.П., Чистякова А.В.,Олакс1енко О.П., К1ш-

ко Я.Г., Пономаренко-Строковська Л.1., Кок 1.П. Елек-тронно-м1кроскоп1чне досл1дкення ДНК в1русу ядерного пол!едрозу тутового шовкопряду //М1кроб1ол.жури.-1969.

- 31, ИЗ.-с.275-279.

3. Zherebtsova Е.Н., Strokovskaya L.I., Gudz-Gorban А.P.

Subviral infectivity in nuclear polyhedrosis of the great wax rnoth (Gallería mellonella L.) //Acta Virol. -1972.- 16, N5,- p.427-431.

4. Strokovskaya L.I., Skuratovskaya I.N., Zherebtsova E.N.,

Gudz-Gorban A.P. Purification of free polyhedrosis virus infecting Gallería mellonella L. // Acta Virol.

- 1977,- 21, N1-2. p.157-160.

5. Skuratovskaya I.N., Strokovskaya L.I., Zherebtsova E.N.,

Gudz-Gorban A.P. Supercoiled DNA of nuclear polyhedrosis virus of Gallería mellonella L. // Arch.Virol.-1977.- 53, N1.- p.79-85.

6. Строковская Jl.И. Размер генома вируса ядерного полизд-

роза большой вощинной коли // Микробиол.журн. - 1978.40, N4,- с.508-509.

7. Скуратовская И.Н., Строковская Л.И. Получение суперспи-

ральной ДНК вируса ядерного полиэдроза большой вощинной моли //В кн.: Методы молекулярной биологии. Киев: Наук.думка.- 1979.- с.69-74.

8. Строковская Л.И. Очистка бакуловирусов и их высокополи-

- 41 -

мерных ДНК //В кн.: Вирусы насекомых и их практическое значение. Киев: Наук.думка.-1979.-с.33-42.( Молекуляр. биология; Вып.22). 9. Strokovskaya L.I., Skuratovskaya I.N., Gudz-Gorban Л.P., Kok I.P. Hacromolecular structure of a nuclear polyhe-drosls virus genome Ц Arch.Vlrol. -1979. -59, Ш/Ц,-p.331-343.

10. Строковская Л.И., Скуратовская И.H., Гудзь-Горбань А.П., Кок И.П. Кольцевые олигомерные формы молекул ДНК вируса ядерного полиэдроза большой вощинной моли // Докл. АН СССР.- 1979.- 245, N2.- с.486- 489. И. Скуратовская Й.Н., Строковская JI.И., Гудзь-Горбань А.П., Кок И.П. Особешюсти получения суперспиральной ДНК вируса ядерного полиэдроза тутового шелкопряда // В кн.: Вирусные болезни растений и насекомых. J1CXA, Елгава. -1980.с.-37-39.

12. Строковская Л.И., Скуратовская И.Н., Гудзь-Горбань А.П.,

Кок И.П. Вирусоподобные частицы двойной и тройной длины и их связь с кольцевыми сцеплеными ДНК при ядерном полиэдрозе // В кн.: Вирусные болезни растений и насекомых. ЛСХА, Елгава. -1980.е.- 43-45.

13. Строковская Л.И. Применение метода электрофореза в ага-

розном геле для характеристики препаратов высокополимерной ДНК бакуловирусов // В кн.:Энтомопатогенше вирусы и их практическое значение. Киев: Наук.думка. -1981.-с.19-24.(Молекулярн.биол.; вып.29).

14. Строковская Л.И., Скуратовская И.Н., Кок И.II. Обнаруже-

ние нуклеотидных последовательностей ДНК вируса ядерного полиэдроза тутового шелкопряда в геноме клеток хозяина при латентной инфекции //Микробиол.журн.-1082.

- 4.4, N1.- с.86-87.

15. Skuratovskaya I.N., Fodor I..Strokovskaya L.I. Properti-

es of the nuclear polyhedrosis virus of the great wax moth: oligomeric circular DNA and the characteristics " of the genome // Virol.-1982,- 120, N2.- p.465-471.

16. Кок И. П., Скуратовская H.H., Строковская JI. И. .Мирюта Н.,

Алексеенко Л.П. Обнаружение интеграции бакуловирусного и клеточного геномов (ДНК) при латентной инфекции // В кн.: Энтомопатогенные вирусы и их практическое значение. Киев: Наук.думка. -1983. -с.67-69. (Молекулярн. биол.; вып.34).

17. Мирюта Н.Ю..Строковская Л.И.,Кок Й.П., Скуратовская И.Н.

Обнаружение ковалентно связанного с ДНК клетки генома бакуловируса. у большой вощинной моли // Биополимеры и клетка.-1985.-1, N2.- с.106-108.

18. Строковская Л.И., Менделава Н.В., Кихно И.М. Физическое

картирование геномов вирусов ядерного полиэдроза тутового шелкопряда и большой вошинной моли // Макромолекулы клеток и вирусов.К.: Наук.думка.-1986.-с.101.

19. Скуратовская И.Н., Строковская Л.И., Комиссаренко C.B.,

Мендолева Н.В. Структура и Функционирование генома пи-руса ядерного полиэдроза кольчатого шелкопряда // Цитология и генетика.-1986.-20, N1.- с.31-36.

20. Строковская Л.И. Физическое картирование генома бакуло-

вирусов // Методы молек. биол.К.: Наук.думка. -1980.-с.73-80.

21. Строковская Л.И..Веселовский О.В.,Кихно И.М.,Мирюта Н.Ю.

Клонирование гена полиэдрина вируса ядерного полиэдро-3!i кольчатого шелкопряда //Биополимеры и клетка. -1990. Г., НЗ.с.81-84.

22. Строковская JI.И., Веселовский О.В., Кихно И.М., Скура-

товская И.Н., Мирюта Н.Ю., Петренко Л.И., Соломко А.П. Экспрессивный бакуловирусный вектор на основе вируса ядерного полиэдроза кольчатого шелкопряда Malacosoma neustria // Биополимеры и клетка. - 1990. - 6, N3.-с.84-90.

23. Мирюта Н.Ю.. Строковская Д.И., Скуратовская И.Н. Струк-

турные характеристики областей интеграции ДНК вируса ядерного полиэдроза и ДНК клетки-хозя!ша в геноме большой вощинной моли // Биополимеры и клетка.- 1990.6, N4.- с.51-59.

24. Petrenko A.I., Strokovskaya L.I.,Solomko А.P. Nucleotide

sequences of Malacosoma neustria nuclear polyhedrosls virus polyhedrin gene // Биополимеры и клетка.-1994. -10,N3-4. - с.105.

25. Кихно И.М., Строковская Л.И. Бакуловирусная система

экспрессии чужеродных генов - настоящее и будущее биотехнологии получения биологически активных белков различного происхождения // Биополимеры и клетка.- 1994.10, N5.- с.31-49.

26. Строковская Л.И.,Кихно И.М., Калинина Н.О., Чащина Л.И.,

Соломко А.П. Экспрессия гетерологичннх белков в баку-лопирусной векторной системе: вирус ядерного полиэдроза Malacosoma neustria - клетки Anteraea регпу1//Цито-логия и генетика.-1996,- 30, N1.- с.42-48. 2.7. Строковская Л.И. Физическое картирование генома вируса ядерного полиэдроза кольчатого телкопряда//Биополимеры и клетка.- 1997,- 13, N2.-(в печати). 28. Скуратовская И.11. .Строковская Л.И. Деребцова Э.Н.,Гудзь-Горбань А.П.Суперкольцевая ДНК вируса ядерного полиэд-

- 44 -

роза большой вощинной моли // III Всесоюзн-Симп. "Молекулярные механизмы генетических процессов". Тез.докл.-Москва.-1976.-с.232.

29. Строковская Л.И., Скуратовская И.Н., Жеребцова Э.Н.,

Гудзь-Горбань А. 11. Инфекционность высокополимерной ДНК вируса ядерного полиэдроза большой вощинной моли // III Всесоюзн.Съезл ВОГиС. Тез.докл.- Ленинград.-1977.-с.67.

30. Komissareriko S.V., Skuratovskaya I.N. .Strokovskaya L.I.,

Kok I.P. Established cells SCLdl35 (Quiot): a system for infecttvity testing for Galleria mellonella L. nuclear polyhedrosis virus and its DNA // Iri.Int.Colloq, Invertebr.Pathol. -Praque.- 1978.- p.125.

31. Кок И.П., Скуратовская И.H., Жеребцова Э.Н., Строковская

Л.И. ,Гудзь-Горбань А.II. Кольцевые формы ДНК вирусов ядерного полиэдроза //IV Всесоюзн. !чюх.Съезд.Тез.докл. Т.1.- Ленинград.-1979.

32. Скуратовская И.Н., Строковская Л.П., Фодор И., Кок И.П.

Характер первичной структуры ДНК бакуловирусов//В кн.: Всесонзн.симпоз."Макромолекулы клетки: Структура,функ-• ция,взаимодействия". Москва 5-7 дек.1979 г.: Тез.докл. М.: Изд.АН СССР,- 1979,- с.30.

33. Skuratovskaya I..Strokovskaya L..Alexeenko L..MiriutaN.,

Kok I. Replication of baculovirus genome at productive and latent infection: structural aspects//In: Sixth Internat.Congr.Virol.Senday.Japan.Abstr.-1984. -p.334. (W38-10).

34. Кок И.П., Строковская Л.И., Алексеенко JI.П., Скуратовс-

кая И.Н. Репликация генома вируса ядерного полиэдроза (ВЯЛ) //16 Конф.ФЕБО.Москва.Тез.докл.-1984.-с.231.

Строковская JI.И. Структурно-функциональная организация баку-ловирусных геномов и гена полиэдрина и создание экспрессион-ной системы на основе вируса ядерного полиэдроэа Malacosoma neustria.

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.03 - молекулярная биология, Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 1996.

Защищается 34 научных работы, которые содержат материалы экспериментальных исследований структурно-функциональной организации генома бакуловирусов на моделях трех вирусов ядерного полиэдроза. Установлено, что инфекционный геном бакуловирусов является ковалентно-замкнутой молекулой ДНК, обнаружен новый вид модификации бакуловирусных геномов, создана новая экспрес-сионная система для синтеза гетерологичных белков. Ключевые слова: бакуловирус, геном, система экспрессии,вектор.

Strokovskaya L.I. Structure-functional Organization of Baculo-virus Genoms and Polyhedrin Gene and Creation of an Expression System Based on Malacosoma neustria Nuclear Polyhedrosis Virus.

Doctor of Science Dissertation, specialization 03.00.03 -molecular biology, Institute of Molecular Biology and Genetics, National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev, 1996.

Materials of 34 scientific publications contain experimental results on structural and functional organization of baculovi-rus genomes of three nuclear polyhedrosis viruses. It was established that infectious baculovirus genome is the supercol-led DNA molecule. The new type of baculovirus ропоте modification has been detected. The now expression system for the synthesis of heterologous proteins has been created.

Key word:;: baculovirus, gonome, expression system, vector.