Разработка и испытания вирусных энтомопатогенных препаратов для защиты растений

Колосов, Алексей Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка и испытания вирусных энтомопатогенных препаратов для защиты растений
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка и испытания вирусных энтомопатогенных препаратов для защиты растений"

4оЭ'

На правах рукописи

КОЛОСОВ Алексей Владимирович

РАЗРАБОТКА И ИСПЫТАНИЯ ВИРУСНЫХ ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ЗАЩИТЫ

РАСТЕНИЙ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 О ОПТ 2011

Кольцове - 2011

4857936

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Трошкова Галина Павловна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Теплякова Тамара Владимировна доктор биологических наук, профессор

Штерншис Маргарита Владимировна

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт систематики и экологии животных Сибирского отделения Российской академии наук (г. Новосибирск).

Защита состоится «11» ноября 2011 г. в Ц.ЗО часов на заседании диссертационного совета Д.208.020.01 при ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» по адресу: 630559, р.п. Кольцово Новосибирского района Новосибирской области, тел. 8 (383) 336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор».

Автореферат разослан « 5 » октября 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук

Трошкова Г.П.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Членистоногие являются самыми многочисленными и широко распространенными среди представителей царства животных. Количество их видов по всему миру оценивается в пределах 4-6 млн. И хотя лишь небольшая часть членистоногих классифицируется как вредители, именно они наносят наибольший вред, уничтожая около 18 % мирового годового производства сельскохозяйственных культур, и способствуют потере почти 20 % запасов зерна. Ежегодный ущерб, причиненный ими, составляет около 100 млрд. долларов США. Некоторые культуры (виноград, хлопчатник, рис, многие овощные) вообще не удается возделывать без применения пестицидов. Однако из-за использования агрохимикатов с узконаправленным действием, главным образом на нервную систему, членистоногие были поставлены под сильное давление направленного отбора, что привело к широкому распространению устойчивости к пестицидам среди их популяций. На сегодняшний день резистентность у насекомых проявляется ко всем химическим классам инсектицидов, а также к микробным препаратам и регуляторам роста насекомых.

В связи с этим в развитых странах предпринимаются попытки ввести альтернативные системы земледелия, предусматривающие сокращение внесения минеральных удобрений и замену традиционных пестицидов на биологические средства защиты растений. У насекомых есть много природных врагов - это различные хищники, а также патогенные организмы, к которым относятся нематоды, бактерии, грибы и вирусы. Применение этих микроорганизмов в качестве микробных пестицидов может эффективно подавлять популяции насекомых-вредителей.

Наиболее привлекательными среди биопестицидов являются препараты на основе бакуловирусов. Ввиду особенностей своего жизненного цикла бакуловирусы обладают достаточной устойчивостью и могут существовать вне организма насекомого длительное время (до нескольких лет). Их

специфичность часто ограничивается только одним видом насекомых, и они абсолютно безопасны для людей и животных.

Однако из-за медленного проявления эффекта действия бакуловирусов (в случае использования химических инсектицидов эффект проявляется быстро) основные пользователи рассматривают их как неэффективные, поскольку в первые 3-10 суток инфицированные гусеницы продолжают питаться и наносить ущерб. В настоящее время это отношение изменилось, и в качестве долговременной защиты сельскохозяйственных культур от вредителей все больше начинают применять именно бакуловирусные препараты. Для более активного развития этого вида биопестицидов необходимо повысить устойчивость вирусного агента в естественной среде и разработать эффективную технологию его производства. Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы являлась разработка бакуловирусных энтомопатогенных препаратов для повышения эффективности контроля численности хлопковой совки (Heliothis armígera Hbn.) и непарного шелкопряда (Lymantria dispar L).

В процессе работы решались следующие задачи:

1. Выделение природных изолятов вирусов ядерного полиэдроза (ВЯЛ) НШ и ВЯП ХС, проведение с ними селекционной работы с целью получения вирусных штаммов и создания на их основе энтомопатогенных препаратов.

2. Разработка композиции рабочего раствора для бакуловирусных инсектицидов, повышающей их устойчивость к УФ-излучению.

3. Создание препарата для борьбы с хлопковой совкой на основе ВЯП и разработка технологии его производства.

4. Определение путей горизонтальной передачи вирусной инфекции внутри популяции гусениц.

5. Оценка эффективности бакуловирусных препаратов против непарного шелкопряда и хлопковой совки в условиях полевых испытаний.

Научная новизна и практическая значимость работы

Получены и запатентованы новые штаммы бакуловирусов, высокопатогенные для вредителей сельского и лесного хозяйства.

Разработана новая композиция рабочего раствора для бакуловирусных препаратов, содержащая альгинат натрия, аскорбиновую кислоту, бычий сывороточный альбумин и хлорид кальция, значительно повышающая их устойчивость к УФ-облучению.

Создан и запатентован новый бакуловирусный препарат для борьбы с хлопковой совкой ВИРИН ХСК.

Впервые показаны пути горизонтального распространения инфекции ВЯП и необходимость искусственного внесения бакуловирусов в экосистемы для регуляции численности насекомых-вредителей.

Обоснована целесообразность применения высокопатогенных вирусных штаммов ВЯП НШ 2-85 и ВЯП ХС-17 для контроля численности непарного шелкопряда и хлопковой совки, соответственно.

Разработаны технические условия и новая технология производства препарата ВИРИН ХСК.

Проведены государственные полевые испытания препарата ВИРИН ХСК в республике Узбекистан, по результатам которых, в соответствии с «Положением о регистрационных испытаниях и регистрации пестицидов, агрохимбиопрепаратов и минеральных удобрений в Республике Узбекистан», на данный препарат получено регистрационное свидетельство № 1 А 123.

Практическая значимость данной работы: получены высокопатогенные вирусные штаммы, которые при использовании разработанной нами рецептурной формы рабочего раствора сохраняют свою эффективность в полевых условиях в течение длительного времени, что, в свою очередь, устраняет необходимость многократной обработки защищаемых культур. В настоящее время на основе разработанной технологии ведутся проектные работы по созданию опытного производства препарата ВИРИН ХСК.

Положения, выносимые на защиту

Метод массового отбора позволяет получить штаммы ВЯП, обладающие высокой биологической активностью, и поддерживать их высокую патогенность для целевых насекомых. Применение этого метода наряду с контролем биологической активности используемого штамма ВЯП является важнейшим элементом производства препаратов на основе бакуловирусов.

Устойчивость ВЯП к УФ-излучению можно значительно повысить, используя композицию рабочего раствора, содержащую альгинат натрия, БСА, хлорид кальция и аскорбиновую кислоту.

Бакуловирусная инфекция способна передаваться от больных гусениц к здоровым, и жизнеспособность последних существенно зависит от степени их контакта с больными гусеницами.

Препарат ВИРИН-НШ на основе ВЯП НШ-2-85 обладает высокой биологической эффективностью и способен конкурировать с химическими инсектицидами.

Экологически безопасный препарат ВИРИН ХСК, созданный на основе штамма ВЯПХС-17, превосходит по своим защитным и экономическим свойствам химические и биосинтетические инсектициды, применяющиеся для подавления численности хлопковой совки (Heliothis armigera Hbn.) на хлопковых полях.

Публикации и апробация работы

По материалам диссертации опубликованы 6 статей, из них 5 в журналах списка, рекомендованного ВАК, получено 5 патентов на изобретения. Результаты работы были представлены на 7 научных конференциях:

Отраслевое совещание «Биологические и технологические проблемы создания вирусных препаратов для интегрированной защиты растений», Кольцово, Новосиб. обл., 26-29 сент. 1989 г.; Международная научно-практическая конференция «Производство и применение биологических средств защиты растений от вредителей и болезней», Одесса, 12-16 сент. 1994 г.; Proceedings of the international conference: «Achievements of

biotechnology for the future of mankind», Samarkand, June 11-14, 2001; Международная научно-практическая конференция «Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование», Иркутск, 2728 окт. 2004 г.; Международная научно-практическая конференция «Технологии создания биологических средств защиты растений на основе энтомофагов, энтомопатогенов, микробов-антагонистов и применения их в открытом и закрытом грунтах», Краснодар, 20-22 сент. 2006 г.; 28th Pakistan congress of Zoology, Faisalabad, Pakistan, March 18-20, 2008; Международная научно-практическая конференция «Интегрированная защита растений: стратерия и тактика», Минск, 5-8 июля 2011 г.

Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на 131 странице машинописного текста, содержит 9 рисунков 23 таблицы. Состоит из введения, обзора литературы, 7 глав результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего 81 отечественных и 114 иностранных источников, и приложения.

Личный вклад автора

Получение штаммов энтомопатогенных ВЯП НШ и ХС, разработка технических условий выполнены лично автором. Лабораторный регламент производства препарата ВИРИН ХСК разработан автором при участии научного руководителя Трошковой Г.П. Рецептурная форма рабочего раствора препарата создана совместно с сотрудниками отдела «Коллекция культур микроорганизмов» ГНЦ ВБ «Вектор». Деляночные эксперименты и полевые испытания препаратов ВИРИН НШ и ВИРИН ХСК проведены автором совместно с сотрудниками НИИСиЭЖ СО РАН, ЗАО «Алтайвитамины» г. Бийск, Института Защиты растений и Института Зоологии АН республики Узбекистан. Исследования микроструктуры вирусов были выполнены в отделе микроскопических исследований ГНЦ ВБ «Вектор» при участии автора в подготовке образцов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Получение штаммов ВЯП НШ и ВЯП ХС для создания на их основе энтомопатогенных инсектицидных препаратов

Для получения штаммов ВЯП НШ обследовали 11 лесхозов Киргизии и Западной Сибири. Из образцов, собранных во время экспедиций, выделили 8 новых изолятов этого вируса. В табл. 1 приведены данные экспериментов по определению биологической активности изолятов вируса на гусеницах третьего возраста лабораторной популяции.

Таблица 1

Биологическая активность природных изолятов ВЯП НШ

Обозначение изолята Биологическая активность ЛД5о±2 о (пэ/гус.)

ВЯП НШ-Т1 (3,1±0,3)*104

ВЯП НШ-Н2 (1,2±0,4)х104

ВЯП НШ-К1 (1,9±0,8)х105

ВЯП НШ-К2 (2,0±0,4)х105

ВЯП НШ-КЗ (2,8±0,3)х Ю4

ВЯП НШ-К4 (0,9±0,6)х105

ВЯП НШ-НЗ (2,3±0,6)*104

ВЯП НШ-5 (2,7±0,5)*104

Установлено, что наибольшей биологической активностью обладает изолят ВЯПНШ-Н2: величина ЛД50 для него составляет 1,2х104 пэ/гус. и достоверно отличается от значений этого показателя у других изолятов.

С целью повышения биологической активности выбранного изолята бьша проведена селекционная работа. Для этого использовали метод массового отбора с учетом следующих параметров: возраст, в котором погибшая гусеница бьша инфицирована; время гибели (на какие сутки после заражения погибла личинка); дозу вируса, которой инфицировали личинку.

На первом этапе в течение 6 пассажей при индивидуальном заражении личинок 4-го возраста дозой 1х105 пэЛус. отбирали гусениц, погибших в течение 9 суток от момента заражения. Выделяли из них вирус, который использовали на следующем этапе.

На втором этапе снижали дозу заражения до 1х104пэ/гус. и на протяжении 5 пассажей отбирали гусениц по тому же принципу.

На третьем этапе дозой 1x104 пэ/гус. инфицировали личинок 5 возраста и продолжали вести отбор по тому же признаку.

Сравнительные характеристики вируса до и после селекции приведены в табл. 2.

Таблица 2

Сравнительные характеристики ВЯП НШ-Н2 до и после селекции

Изолят Активность вируса при заражении им личинок 3-го возраста, ЛД50±2ст Процент гибели гусениц, зараженных ВЯП в 5 возрасте

Дозы заражения (пэ/гус.)

1,7x104 1,7x105 1,7x106

До селекции (1,2±0,4)хЮ4 7% 17% 47%

После селекции (4,5±2,5)х Ю2 75% 100 % 100 %

Из приведенных данных следует, что в результате проведенной селекции нам удалось:

- значительно снизить ЛД50 до 4,5x102 пэ/гус. для личинок НШ третьего возраста;

- добиться 100 % гибели гусениц, зараженных в пятом возрасте, при дозе заражения 1,7x105 пэ/гус.

Полученный в результате вирус был депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского под номером ГКВ N 2156, запатентован как штамм ВЯП НШ-2-85 и впоследствии использован как активная основа инсектицидного препарата для ограничения численности непарного шелкопряда в природных популяциях.

В результате обследования хлопковых полей фермерских хозяйств Согдийской области Республики Таджикистан был выделен новый изолят ВЯП ХС. Проведенная селекция позволила получить новый штамм ВЯПХС-17, обладающий высокой биологической активностью ЛД5о= 1,5х102 пэ/гус. (для гусениц ХС 3-го возраста лабораторной популяции), ЛВ50=4,5 суток при заражении дозой 1х103 пэ/гус. Этот штамм в дальнейшем был запатентован как ВЯП ХС-17 и использовался в качестве активной основы препарата ВИРИН ХСК для борьбы с хлопковой совкой.

Разработка рецептуры рабочих растворов бакуловирусных препаратов

Эффективность вирусных энтомопатогенных препаратов при их практическом применении определяется не только свойствами действующего агента, но также различными факторами внешней среды, способами нанесения препаратов и рецептурой их рабочих растворов.

С целью разработки оптимальной композиции рабочего раствора вирусного инсектицидного препарата нами были протестированы варианты сочетаний наиболее перспективных компонентов. Большинство авторов, проводивших исследования в этой области, указывали, что готовый к применению рабочий раствор вирусного инсектицида должен иметь надежный инертный носитель и содержать антиоксидант, нейтрализующий химически активные продукты облучения и вещества, которые могут способствовать инкапсуляции вируса.

В качестве добавок, обычно применяемых для инкапсуляции, использовали альгинат натрия (Alg), диальдегидкрахмал (ДАК), хитозан (Хит), а также поверхностно активные вещества - 2-цетилпиридинхлорид (2 ЦХл) и проксанол (F127). В нескольких композициях были испытаны адсорбирующие агенты (адъюванты): хлорид кальция (СаС12) и гликохолат натрия (ГХолат). Для поддержания постоянного рН в препарат добавляли растворы бычьего сывороточного альбумина (БСА), а аскорбиновую кислоту (Ase) применяли как антиоксидант.

Споры В. ¡Ииг^^егкга использовали в качестве модельного объекта. Результаты испытаний защитных свойств исследованных композиций представлены в табл. 3.

Защитное действие этих композиций для В. thuringiensis оценивали по выживаемости спор после УФ-облучения в сравнении с контролем -суспензией спор в фосфатно-солевом буферном растворе.

Таблица 3

Результаты испытания экспериментальных композиций для защиты ВЯП и В. (hitringiensis от УФ-облучения

Степень защиты Композиции для вирусов Композиции для бактерий

Высокая: активность до и после облучения не различаются Alg, Ase, БСА, СаС12; Alg, Ase, БСА Alg, Ase, БСА, СаСЬ

Средняя: активность снижается только при длительном облучении Alg, Ase, БСА, ГХолат; Alg, Ase, БСА, Хит, F127; Alg, Ase, СаСЬ; Alg, БСА, СаСЬ; ДАК, Ase Alg, Ase, БСА, СаС12, ГХолат; Alg, Ase, БСА, ГХолат, Хит, F127

Низкая: активность достоверно снижается, но в отдельных случаях превышает контрольную. Alg, СаСЬ; Alg, СаС12,2 ЦХл; Alg, ГХолат; Alg, Ase, БСА, Хит; Сажа Alg, СаСЬ; Alg, БСА, СаСЬ; Alg, СаСЬ, ГХолат

Отсутствие защиты активность препарата после облучения не отличалась от контроля Хит; Хит, Ase, БСА; ДАК, Ase, БСА, ГХолат; Alg, F127; дак; ДАК, Ase, БСА; ДАК, ГХолат; ДАК, 2 ЦХл; ДАК, БСА Хит, F127; Хит, Ase, БСА, ГХолат

Эффективность защитного действия экспериментальных композиций по отношению к вирусу оценивали по выживаемости инфицированных вирусом

гусениц НШ в сравнении с контролем — суспензией вируса в дистиллированной воде.

Тестирование различных рецептур на бактериальных спорах показало, что лучшая рецептура включает 4 вещества: альгинат натрия, хлорид кальция, бычий сывороточный альбумин и аскорбиновую кислоту. Данный состав совпадает с составом лучших защитных композиций для вируса. Таким образом, из мицеллообразующих веществ наиболее предпочтительным является альгинат натрия. У диальдегидкрахмала, хитозана и ПАВ защитный эффект выражен значительно хуже. Также обязательными ингредиентами препарата являются антиоксидант -аскорбиновая кислота, хлорид кальция - как абсорбирующий агент и БСА. Следует обратить особое внимание на тот факт, что защитный эффект этой композиции проявлялся и при низких конечных концентрациях ее ингредиентов (ВИРИН ХСК - 0,4%, альгинат натрия - 0,03 %, БСА - 0,01 %, хлорид кальция - 0,03 % и аскорбиновая кислота - 0,01 %). Эта препаративная композиция использовалась в дальнейшем при проведении полевых испытаний энтомопатогенных вирусных препаратов.

Отработка методов культивирования личинок насекомых на искусственной питательной среде

С учетом огромной практической значимости инсектицидных препаратов на основе ВЯП была разработана технология производства бакуловирусов, которая включает следующие стадии: культивирование маточной линии насекомых, инфицирование насекомых, культивирование инфицированных гусениц на ИПС, сбор биомассы погибших гусениц, выделение и очистка вируса, получение готового препарата.

Одним из важнейших ее участков является культивирование насекомых-фитофагов - продуцентов бакуловирусов.

Искусственная питательная среда (ИПС) является одним из источников инфицирования насекомых в процессе их массового культивирования.

Контаминирующая флора снижает выход биоматериала и отрицательно влияет на его качество.

С целью подавления микрофлоры в ИПС обычно вводят ингибиторы роста микроорганизмов и консерванты, кроме того, для поверхностной стерилизации среды применяют УФ-облучение. Однако бактериостатический эффект, достигаемый этими приемами, значительно снижается за время жизненного цикла насекомого.

Многокомпонентность и сложность состава ИПС не позволяют применять традиционные тепловые методы стерилизации (автоклавирование, прокаливание), так как они вызывают необратимые изменения среды и ухудшают ее технологические свойства. Поэтому для этих целей нами было использовано электромагнитное поле (ЭМП) сверхвысокой частоты (СВЧ).

Мы провели эксперименты по определению эффективности применения СВЧ-обработки для стерилизации компонентов ИПС. Были протестированы ИПС, разработанные для питания личинок хлопковой совки с естественным уровнем загрязненности, а также модельные - с введением тест-культур Е. coli и В. thuringiensis в предварительно стерилизованные составляющие стандартной ИПС. Обработку 0,5 кг компонентов ИПС проводили в ЭМП СВЧ мощностью 500 Вт при варьировании длительности экспозиции от 15 до 120 с. Эффективность стерилизации оценивали по общему микробному числу. Критерием питательной ценности среды служила масса куколок, плодовитость имаго при содержании личинок на средах, обработанных СВЧ, и контрольных.

Было показано (рис. 1), что гибель бесспоровых микроорганизмов (Е coli) достигает 100 % через 90 с.

Спорообразующие бактерии в течение 90 с сохраняли жизнеспособность в СВЧ-поле, но через 120 с наступала их полная инактивация. На кривой, изображающей динамику гибели микрофлоры в стандартной среде, содержащей как споровые, так и бесспоровые микроорганизмы, имеется

«плато», соответствующее периоду устойчивости В. Жиг^епш, но через 2 мин также обнаруживается 100 %-ный бактерицидный эффект.

8 1

-1 -1 0 30 60 90 120

Время в секундах

Рис. 1. Изменение уровня контаминации ИПС в зависимости от экспозиции ЭМП СВЧ

Биологические показатели развития лабораторных культур хлопковой и капустной совок при содержании на среде, подвергнутой СВЧ-обработке, в сопоставлении с контрольными образцами свидетельствуют о сохранении питательных свойств ИПС для насекомых (табл. 4).

Таблица 4

Биологические показатели культур насекомых при развитии на ИПС, _1_подвергнутых СВЧ-обработке (2 мин)_

Варианты Heliothis armígera НЬп. Mamestra brassicae L.

Масса куколок ±2 а (мг) Плодовитость самок (кол-во яиц) Масса куколок ±2о (мг) Плодовитость самок (кол-во яиц)

99 66 99 с?с?

Контроль 402,2±7,8 385.2±11.4 1244±265 466,7± 11,5 411,3±9,3 1573±314

392,3±11,9 399,6±8,0 1198±279

Опыт (СВЧ) 355,4±13,1 361,5±7,6 1148±272 469,8±9,9 461,3±6,1 1395±253

Таким образом, данный способ может быть использован при промышленном культивировании насекомых для снижения контаминации ИПС микрофлорой.

При непрерывном размножении насекомых через 5-10 поколений обычно наблюдается снижение жизнеспособности лабораторных популяций, и культура насекомых вымирает. Разработанная методика позволяла

получать 30 генераций хлопковой совки с достаточно стабильными и высокими биологическими характеристиками (табл. 5).

Таблица 5

Основные показатели развития хлопковой совки при ее непрерывном ___культивировании____

Номер генерации Выживаемость гусениц (%) Выживаемость куколок (%) Плодовитость (количество яиц на 1 самку) Жизнеспособность яиц (%) Коэффициент размножения

1 2 3 4 5 6

2 29,0 58,7 1432,5 71,0 89

6 68,0 84,0 1753,2 85,4 418

9 77,4 85,4 1354,4 90,0 388

19 98,1 76,5 1308,5 81,0 403

21 93,9 81,2 1199,7 90,5 420

24 74,0 87,2 1138,2 70,6 260

26 90,7 81,7 1132,2 84,0 335

31 81,2 88,7 849,9 — —

Контроль качества маточной линии насекомых проводили, используя коэффициент размножения, который не должен быть ниже 200. Величину коэффициента размножения рассчитывали по следующей формуле: К=СхКхБхРхЕ, где II - коэффициент размножения; О - выживаемость гусениц; К - выживаемость куколок; Э - доля самок от общего числа имаго; Р - плодовитость одной самки; Е - доля фертильных яиц.

На основании этой методики были сформулированы исходные данные на проектирование установки по массовому разведению ХС, в состав которой вошли следующие элементы:

- климатический бокс - для создания необходимых режимов выращивания личинок насекомых (температура, влажность фотопериод);

- дозатор яиц жидкостной - для дозирования яиц совок в контейнеры (чашки Петри);

- камера для содержания имаго насекомых;

- контейнер 2-х ячеистый - для выращивания личинок насекомых;

- приставка дозатора ИПС - для распределения ИПС в контейнеры;

- устройство для стерилизации компонентов ИПС.

Разработка технологии производства бакуловирусных препаратов

Помимо культивирования маточной линии процесс производства инсектицидов на основе ВЯП включает в себя инфицирование насекомых, сбор и очистку вирусной биомассы.

Одним из наиболее трудоемких этапов культивирования ВЯП является инфицирование личинок насекомых вирусом.

1 - чашка Петри с ИПС и гусеницами; 2 - подставка для чашек с направляющими, по которой передвигаются чашки Петри с гусеницами; 3 - малая динамическая камера (МДК-2); 4 -распылитель прямого действия (РПД); 5 - отверстие, через которое из распылителя в камеру попадает аэрозоль, содержащий суспензию вируса; 6 - компрессор-установка УК25-1.6М (ТУ 641-2985-78); 7 - сборник с рабочей суспензией вируса; 8 -магнитная мешалка; 9 — перистальтический насос

Для упрощения и механизации этого процесса нами была разработана методика аэрозольного инфицирования гусениц. Аэрозольная установка (рис. 2) была специально изготовлена для инфицирования гусениц, находящихся на ИПС в чашках Петри диаметром 100 мм. В состав установки входят распылитель прямого действия РПД-1 (4), подставка для чашек с направляющими (2) и аэрозольная камера (3). Подача воздуха в распылитель осуществляется с помощью компрессора (6). Подача рабочего раствора с вирусом из сборника (7), установленного на магнитной мешалке (8), осуществляется с помощью перистальтического насоса (9).

Аэрозольная установка позволяла одновременно инфицировать до 15 гусениц, размещенных в чашке Петри. Время экспонирования насекомых в камере составляло 5-7 с.

Первоначально было проведено изучение устойчивости ВЯП при распылении. Для этого пробы аэрозоля отбирали на чистые чашки Петри, после чего устойчивость вируса определяли путем сравнения его биологической активности до и после распыления. Результаты этих исследований представлены в табл. 6.

Таблица 6

Сравнительные характеристики биологической активности изолятов

ВЯП НШ до и после распыления

Изоляты и пробы Биологическая активность

ЛВ50±2о(сут.) 1йЛД50±2а

ВЯП НШ 1 до распыления 11,3±0,7 4,4±0,3

ВЯП НШ 1 после распыления 11,5±0,6 4,2±0,4

ВЯП НШ 2 до распыления 7,5±0,5 2,6±0,3

ВЯП НШ 2 после распыления 8,0±0,5 2,8±0,3

На основании этих результатов был сделан вывод о высокой устойчивости ВЯП при распылении и витании в аэрозоле.

В следующей серии экспериментов было проведено сравнительное инфицирование гусениц оральным и аэрозольным способами. При этом учитывались следующие параметры:

- биологическая эффективность (процент гусениц, погибших через 14 суток после заражения);

- выход вируса в расчете на 1 инфицированную гусеницу;

- трудоемкость;

- расход материалов.

Полученные результаты (табл. 7) демонстрируют отсутствие достоверных различий в отношении «Выход вируса/Расход вируса» при использовании рассматриваемых способов инфицирования. Однако при использовании аэрозольной методики на 30 % снижается расход компонентов сред.

Таблица 7

Результаты сравнительного инфицирования гусениц оральным и _аэрозольным способами__

Изоляты и пробы Расход вируса (в пэ) в расчете на 1 инфицированную гус. Процент гус., погибших через 14 дней после заражения Выход вируса (в пэ) в расчете на 1 инфицированную гус. ±2 а Отношение показателей: выход вируса/расход вируса ±2а

ВЯП НШ 1 через корм 10s 85 (1±0,4)х108 (1±0,4)*103

ВЯП НШ 1 аэрозольное заражение 105 90 (1,5±0,4)*108 (1,5±0,4)х103

ВЯП НШ 2 через корм ю5 95 (6,1±0,6)х108 (6,Ш,6)х103

ВЯП НШ 2 аэрозольное заражение ю5 90 (5,6±0,5)х108 (5,6±0,5)*103

Применение аэрозольного метода дало возможность механизировать и, как минимум, в 6 раз ускорить процесс инфицирования гусениц.

Исследование путей распространения бакуловирусной инфекции в естественных условиях

Следующим этапом нашей работы являлось моделирование путей горизонтальной передачи вирусной инфекции в популяции непарного шелкопряда. Мы исследовали три возможные модели передачи вируса от зараженных гусениц непарного шелкопряда к незараженным:

1) Инфицированные и неинфицированные гусеницы содержались и питались совместно (возможен комплексный путь передачи инфекции: контактный, оральный, воздушный).

2) Инфицированные и неинфицированные гусеницы находились в непосредственной близости друг с другом, но были лишены возможности совместно питаться (возможен воздушный путь передачи инфекции).

3) Неинфицированные гусеницы питались на листьях, на которых ранее находились инфицированные гусеницы (возможен оральный путь передачи инфекции).

Оценка эффективности путей передачи вирусной инфекции проводилась в 3 этапа: 1) подготовка гусениц-носителей инфекции; 2) моделирование перечисленных вариантов; 3) учет гибели насекомых в лабораторных условиях.

Бакуловирусную этиологию гибели гусениц определяли с помощью светового микроскопирования содержимого погибших гусениц. Результаты исследования путей горизонтальной передачи инфекции ВЯП представлены на рис. 3.

В положительном контроле мы наблюдали типичную динамику гибели гусениц от полиэдроза. В тестовых пробах гибель гусениц происходила не только от полиэдроза, но и от сопутствующих заболеваний. Гибель гусениц в отрицательном контроле была достоверно ниже любого из опытных вариантов. Кроме того, в контроле с незараженными насекомыми (контроль «-») и в опыте 2 (т) гусениц, погибших от полиэдроза, не было.

80% -60% ■ 40%

20%

0%1-.-.-,-■-■-,-г-

0 4 8 12 16 20 24 28 Сутки

Рис. 3. Динамика гибели тестовых гусениц от полиэдроза. 1 - опыт 1 (т), комплексный путь передачи инфекции: инфицированные и неинфицированные гусеницы содержались и питались совместно; 2 - опыт 2 (т), воздушный путь передачи инфекции: неинфицированные гусеницы, содержались в непосредственной близости, но без контакта с инфицированными гусеницами; 3 -опыт 3 (т), оральный путь передачи инфекции: неинфицированные гусеницы питались на листьях, на которых ранее находились инфицированные гусеницы; 4 - контроль «+»: гусеницы, инфицированные вирусом; 5 - контроль «-»: гусеницы, не инфицированные вирусом

В положительном контроле мы наблюдали типичную динамику гибели гусениц от полиэдроза. В тестовых пробах гибель гусениц происходила не только от полиэдроза, но и от сопутствующих заболеваний. Гибель гусениц в отрицательном контроле была достоверно ниже любого из опытных вариантов. Кроме того, в контроле с незаряженными насекомыми (контроль «-») и в опыте 2 (т) гусениц, погибших от полиэдроза, це было.

Результаты наших исследований показали, что из рассмотренных моделей эффективными путями передачи бакуловирусной инфекции следует считать комплексный, при котором обеспечивался контакт между больными и здоровыми насекомыми при их совместном питании, и оральный, когда неинфицированные гусеницы питались на листьях, на которых ранее

находились инфицированные гусеницы. Однако даже в отсутствии таких контактов нахождение в непосредственной близости зараженных гусениц приводило к снижению устойчивости здоровых насекомых к другим заболеваниям.

Полученные результаты свидетельствуют также и о том, что эпизоотии в популяциях на стадии нарастания численности спонтанно возникнуть не могут. Чтобы контролировать вредителя, необходимо искусственно вносить вирус в популяцию.

Полевые испытания препарата ВИРИН НШ

С использованием разработанной нами технологии была изготовлена опытная партия препарата ВИРИН НШ на основе ВЯП НШ-2-85. Испытания вирусного препарата ВИРИН НШ были проведены на территории Абатского и Сорокинского лесхозов Тюменской области. Суммарно площадь обработанных очагов составила 15 тыс. га.

Испытания проводились с помощью наземно-очагового метода. Расход препарата составил 3 г на 1 га.

Интактные участки выбирались как в непосредственной близости от обработанных вирусом, так и на расстоянии десятков километров от них. Учеты численности показали, что гибель насекомых, у которых диагностировался полиэдроз, на участках, обработанных вирусом, варьировала от 21 % до 74 %, а на необработанных - от 0 % до 32 %. В большинстве интактных участков, расположенных рядом с обработанными, достоверных различий в количестве погибших насекомых по сравнению с инфицированными участками отмечено не было, что можно объяснить миграциями непарного шелкопряда.

Часть насекомых, у которых микроскопически диагностировался полиэдроз, была поражена энтомофагами, отмечалась также гибель от смешанной вирусно-бактериальной инфекции. Сходные результаты были получены при применении коммерческого препарата "СурсЬек" (США) против непарного шелкопряда в Германии.

На следующий год после дефолиации кроны деревьев практически полностью восстанавливались на всех участках. Численность непарного шелкопряда сокращалась до экономически незначимого уровня. Таким образом, испытания препарата показали, что наряду с недостатком, характерным для бакуловирусов, связанным с длительным инкубационным периодом, препарат обладает высокой биологической эффею-ивностью. Удовлетворительные результаты испытаний препарата ВИРИН НШ сделали возможным расширение зоны его применения: он использовался для биологического подавления непарного шелкопряда в Новосибирской области, Алтайском крае и Восточном Казахстане.

Полевые испытания препарата ВИРИН ХСК

Испытания препарата ВИРИН ХСК проводились в течение двух лет на хлопковых полях Наманганской и Ташкентской областях Республики Узбекистан: в 2007 - 2008 годах. Обработку проводили с помощью ручного опрыскивателя К-90 и тракторного опрыскивателя ОВХ-28. Результаты, приведенные в табл. 8 свидетельствуют, что во всех случаях снижение численности на обработанных участках было достоверно выше, чем на контрольном участке. И уже через 7 суток количество вредителей снижалось до экономически безопасного уровня. Применение препарата с более высоким содержанием вируса приводило к более значительному снижению количества гусениц. Результаты, полученные после обработки хлопковых полей вирусным препаратом и химическим препаратом «Регент», достоверно не различаются.

Повторные испытания, проведенные в 2008 г. в других фермерских хозяйствах, подтвердили высокую эффективность препарата ВИРИН ХСК.

Объем условно-сохраненного урожая хлопчатника при применении ВИРИН ХСК составил 2,3 ц/га по сравнению с контролем, в то время как применение эталонного препарата повышало урожайность только на 1,5 ц/га.

Таблица 8

Биологическая эффективность ВИРИН ХСК в борьбе с хлопковой совкой на

хлопчатнике в фермерском хозяйстве «Дилфуза-Хасанбай-Зухрахон» _Чартакского района Наманганской области в 2007 г._

Вариант, тип опрыскивателя Норма расхода Число гусениц на 100 растений и процент выживших гусениц относительно исходной численности

До обработки После обработки по суткам учета

2 8 11

ВИРИН ХСК, 1 х 10е пэ/л + NaKMH, К-90 5 л/сотку 30 35 7 (23±3) % 5 (17±3) %

ВИРИН ХСК, 1 х 108 пэ/л + глицерин, К-90 5 л/сотку 30 34 7 (23±3) % 6 (20±3) %

ВИРИН ХСК, 1 х 109 пэ/л + ИаКМЦ, К-90 5 л/сотку 33 34 5(15±3)% 4 (12±3) %

ВИРИН ХСК, 1 х 109 пэ/л + глицерин, К-90 5 л/сотку 40 43 6(15±3)% 1 (3±3) %

ВИРИН ХСК, 1 х 109 пэ/л + ЫаКМЦ ОВХ-28 200 л/га 32 35 6(19±3)% 4 (13±3) %

Эталон («Регент» 0,012 % КЭ) 200 л/га 32 39 8 (25±3) % 4 (13±3) %

Контроль - 35 28 24 (69±6) % 22 (63±6) %

Расчет экономической эффективности препарата ВИРИН ХСК, выполненный по стандартной методике по Э.И. Газиянц, представлен в табл. 9. Урожайность на поле, на котором не производились инсектицидные обработки, составила 29 ц/га. Стоимость хлопка взята по состоянию на июль 2010 г.-200$ США за 1 ц.

Рассчитанная экономическая эффективность в случае применения препарата ВИРИН ХСК оказалась почти на 25 % выше, чем при применении высокоэффективных пиретроидов, и составила около 425 $/га в сравнении с необработанным участком.

Следует отметить, что в 2008 г. при обследовании полей, обработанных препаратом ВИРИН ХСК в 2007 г., было установлено, что численность хлопковой совки не превышала экономически безопасного уровня. Таким образом, наблюдался пролонгированный эффект действия препарата ВИРИН ХСК. Следовательно, эффективность экологически безопасного

препарата ВИРИНХСК оказалась значительно выше, чем эффективность химических препаратов.

Таблица 9

Расчет экономической эффективности применения препарата ВИРИН ХСК и пиретроидов по сравнению с контролем (не обработанным инсектицидами

участком)

Показатели «Вертимек 1.8 %КЭ» «Регент 20 % КЭ» ВИРИН ХСК

Урожайность, ц/га 30,5 30,8 31,3

Условно сохраненный урожай ц/га 1,5 1,8 2,3

Всего затраты на защиту, $/га 57,50 9,68 17,53

Затраты на уборку и транспортировку сохраненного урожая с 1 га, $ 11,45 13,73 17,55

Реализационная стоимость прибавочного урожая хлопка-сырца с 1 га, $ 300,00 360,00 460,00

Экономическая эффективность по условно чистому доходу, $/га 235,00 341,32 424,97

По результатам испытаний данный препарат был включен в список разрешенных к применению в качестве инсектицидного препарата в Республике Узбекистан. На препарат ВИРИН ХСК получены патенты РФ и Казахстана. Выводы

1. Получены и запатентованы высокопатогенные для целевых насекомых вирусные штаммы ВЯП ХС-17 и ВЯП НШ-2-85. Показано, что важнейшими элементами производства вируса ядерного полиэдроза являются контроль биологической активности используемого изолята и проведение работ по поддержанию его высокой патогенности к целевому насекомому.

2. Разработана новая высокоэффективная композиция рабочего раствора для бакуловирусных препаратов, содержащая альгинат натрия, бычий сывороточный альбумин, хлорид кальция и аскорбиновую кислоту, значительно повышающая их устойчивость к УФ-излучению.

3. Создан и запатентован новый энтомопатогенный препарат ВИРИН ХСК для борьбы с хлопковой совкой, качественные характеристики которого

отражены в технических условиях ТУ-2441-016-05664012-10. Разработаны и испытаны макеты оборудования для крупномасштабного культивирования насекомых и производства энтомопатогенных препаратов на основе ВЯП НШ и ВЯП ХС. Разработан лабораторный регламент на производство препарата «ВИРИН ХСК» ЛР 05664012-007-11.

4. Показаны пути горизонтального распространения инфекции ВЯП и необходимость искусственного внесения бакуловирусов в экосистемы для регуляции численности насекомых-вредителей.

5. Показана высокая эффективность препаратов ВИРИН ХСК и ВИРИН НШ при их полевых испытаниях как средства контроля популяций целевых насекомых (хлопковой совки и непарного шелкопряда). По результатам проведения государственных испытаний препарат ВИРИН ХСК рекомендован Государственной комиссией республики Узбекистан к применению для борьбы с вредителем хлопка - хлопковой совкой. В соответствии с «Положением о регистрационных испытаниях и регистрации пестицидов, агрохимбиопрепаратов и минеральных удобрений в Республике Узбекистан» на данный препарат получено регистрационное свидетельство № 1 А 123.

По своим защитным и экономическим показателям препарат ВИРИН ХСК превосходит традиционные химические и биосинтетические инсектициды.

Список научных работ опубликованных по теме диссертации

1. Горбунова Е.Е., Колосов A.B., Борисова О.Д., Зайцев Б.Н., Божко H.A. Сравнительная характеристика изолятов вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда // Вопросы вирусологии. - 1997. - № 1. - С. 41-43.

2. Ильиных A.B., Мамонтова С.А., Петров B.C., Колосов A.B. Регуляция численности непарного шелкопряда (Ocneria dispar L.) в Западной Сибири // Биотехнология. - 1997. - № 3. - С.45-47.

3. Колосов A.B., Ильиных A.B., Золина Е.Д., Борисова О.Д., Сергеев А.Н., Рыжиков А.Б., Ананько Г.Г. Сравнительное изучение аэрозольного и орального методов инфицирования гусениц непарного шелкопряда

сLymantria dispar L.) вирусом ядерного полиэдроза // Вопросы вирусологии. -1999. -№ 4. -С. 183-186.

4. Хашимова М.Х., Ахмедова З.Ю., Хамраев А.Ш., Колосов A.B. Биологическая эффективность препарата ВИРИН ХСК в борьбе с хлопковой совкой (Helicoverpa armígera Hbn.) на посевах хлопчатника // Вестник НУУз. - Ташкент, 2008. - № 4. - С. 124-125.

5. Колосов A.B., Косогова Т.А., Булычев JI.E., Сергеев А.Н. Пути горизонтальной передачи бакуловирусной инфекции у непарного шелкопряда (Lymantria dispar L.) II Вопросы вирусологии. - 2010. - № 5. - С. 43-47.

6. Колосов A.B., Кошелев Ю.А., Агзамова Х.К., Артыкбаев П.К., Залесов A.C., Трошкова Г.П. Исследование устойчивости вируса ядерного полиэдроза в окружающей среде // Современные наукоемкие технологии. - 2010. - № 9. -С. 131-132.

Материалы научных конференций

7. Горбунова Е.Е., Караваев B.C., Иванова В.П., Колосов A.B. Технология получения вирусной биомассы ВЯП непарного шелкопряда. Отраслевое совещание «Биологические и технологические проблемы создания вирусных препаратов для интегрированной защиты растений». - Новосибирск, Россия, -сент. 26-29,1989.-С. 32.

8. Колосов A.B., Горбунова Е.Е. Технология получения вирусной биомассы вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда. Международная научно-практическая конференция «Производство и применение биологических средств защиты растений от вредителей и болезней» - Одесса, Украина. -сент. 12-16, 1994.-С. 180.

9. Божко H.A., Колосов A.B., Горбунова Е.Е. Научно-технические аспекты разработки вирусных энтомопатогенных препаратов. Международная научно-практическая конференция «Производство и применение биологических средств защиты растений от вредителей и болезней» -Одесса, Украина. - сент. 12-16,1994.-С. 182.

10. Kolosov A.V., Ilyinykh A.V., Bakhvalov S.A., Petrova I.D., Petrov V.S., Kuzminov S.V. Regulation of Gypsy Moth (Lymantria dispar L., Lepidoptera: Lymantriidae) Number in Birch Forests. Proceedings of the international conference: «Achievements of biotechnology for the future of mankind». -Samarkand, Uzbekistan. - June 11-14,2001. - P. 76.

11. Колосов A.B., Тотменина О.Д., Косогова T.A., Пугачев В.Г., Клячко H.JL, Репин В.Е. Разработка систем защиты вирусов ядерного полиэдроза от влияния УФ-излучения и высыхания. Международная научно-практическая конференция «Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование». - Иркутск. - окт. 27-28, 2004. — С. 33-34.

12. Колосов A.B., Косогова Т.А. Изучение передачи бакуловирусной инфекции между личинками непарного шелкопряда (Lymantria dispar L.). Материалы международной научно-практической конференции «Технологии создания биологических средств защиты растений на основе энтомофагов, энтомопатогенов, микробов-антагонистов и применения их в открытом и закрытом грунтах». - Краснодар. - сент. 20-22, 2006. - С. 147148.

13. Косогова Т.А., Колосов A.B., Ананько Г.Г., Теплякова Т.В., Репин В.Е. Исследование инфекционности бактерий, выделенных из погибших личинок колорадского жука, инфицированных энтомопатогенными нематодами. Международная научно-практическая конференция «Технологии создания биологических средств защиты растений на основе энтомофагов, энтомопатогенов, микробов-антагонистов и применения их в открытом и закрытом грунтах». - Краснодар. - сент. 20-22,2006. - С. 198-200.

14. Колосов A.B., Пугачев В.Г., Клячко H.JI., Косогова Т.А., Репин В.Е. Разработка систем защиты вирусов ядерного полиэдроза от влияния УФ-излучения и высыхания. Международная научно-практическая конференция «Технологии создания биологических средств защиты растений на основе энтомофагов, энтомопатогенов, микробов-антагонистов и применения их в

открытом и закрытом грунтах». - Краснодар. - сент. 20-22, 2006. - С. 460461.

15. Kolosov A.V., Hashimova М.Н., Hamraev A.Sh. The effect of the preparation VIRIN HSK against Helicoverpa armígera Hbn. 28th Pakistan congress of Zoology. March 18-20,2008. - GC University. - Faisalabad, Pakistan. - P. 45.

16. Кошелев Ю.А., Колосов A.B., Хамраев А.Ш., Хашимова М.Х., Ахмедова З.Ю., Залесов A.C., Ильиных A.B. Контроль численности хлопковой совки (Helicoverpa armígera Hbn.) с использованием бакуловирусов. Международная научно-практическая конференция посвященная 40-летию со дня организации РУП «Институт защиты растений» «Интегрированная защита растений: стратерия и тактика». - Минск. - июль 5-8, 2011. - С. 882885.

Патенты на изобретения

17. Божко H.A., Горбунова Е.Е., Петрова И.Д., Колосов A.B., Караваев B.C. Штамм вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда, используемый для получения инсектицидов. Патент РФ № 2117701 от 31.07.1996, опубл. 20.08.1998 г.

18. Божко H.A., Горбунова Е.Е., Петрова И.Д., Караваев B.C., Колосов A.B. Штамм вируса ядерного полиэдроза капустной совки, используемый для получения инсектицидов. Патент РФ № 2153258 от 08.02.1999, опубл. 27.07.2000, БИ № 21.

19. Кошелев Ю.А., Рыжиков Г.А., Репин В.Е., Колосов A.B. Штамм вируса ядерного полиэдроза хлопковой совки Helicoverpa armígera Hbn., используемый для получения инсектицидного препарата. Патент РФ № 2359031 от 10.12.07, опубл. 20.06.2009.

20. Кошелев Ю.А., Рыжиков Г.А., Репин В.Е., Колосов A.B. Залесов A.C. Препарат для борьбы с хлопковой совкой. Патент РФ № 2396750 от 07.10.2008, опубл. 20.08.2010, БИ № 23.

21. Кошелев ЮЛ., Рыжиков Г.А., Репин В.Е., Колосов А.В. Залесов А.С. Препарат для борьбы с хлопковой совкой. Патент КХ № 23714 от 24.08.2009, опубл. 23.12.2010.

Список сокращений

БСА - бычий сывороточный альбумин

ВЯП - вирус ядерного полиэдроза

ИПС - искусственная питательная среда

КЭ - концентрат эмульсии

ЛВ50 - время, за которое погибают 50 % насекомых

ЛД50 - доза вируса, вызывающая 50 % гибель насекомых

МДК - малая динамическая камера

НШ - непарный шелкопряд (Lymantria dispar L.)

ПАВ - поверхностно-активные вещества

пэ — полиэдры

СВЧ - сверхвысокие частоты

УФ - ультрафиолетовое (излучение)

ХС - хлопковая совка (Helicoverpa armígera Hbn.)

ЭМП - электромагнитное поле

Bt - Bacillus íhuringiensis

КОЛОСОВ Алексей Владимирович

РАЗРАБОТКА И ИСПЫТАНИЯ ВИРУСНЫХ ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ

ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ

Автореф. дисс. иа соискание ученой степени кандидата биологических наук. Подписано в печать 28.09.2011. Закаэ №100. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1. Тираж 100 экз. Ошечатаио в типографии Инсплута катализа СО РАН 630090 Новосибирск, пр-т Академика Лаврентьева, 5

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Колосов, Алексей Владимирович

Список сокращений

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Глобальные проблемы, связанные с насекомыми-вредителями.

1.2. Биологические агенты, использующиеся для контроля численности вредителей.

1.3. Характеристика бакуловирусов.

1.4. Организмы-хозяева бакуловирусов.

1.5. Классификация бакуловирусов.

1.6. Бакуловирусы как инсектициды.

1.7. Совершенствование рецептурных форм вирусных инсектицидных препаратов.

2. Материалы и методы.

2.1. Материалы.

2.2. Приготовление растворов.

2.3. Методика культивирования лабораторных популяций гусениц.

2.4: Выделение и очистка вируса ядерного полиэдроза.

2.5. Инфицирование гусениц в лабораторных условиях.

2.6. Методики проведения деляночных и полевых испытаний вирусных препаратов.

3. Результаты и обсуждение.

3.1. Получение штаммов ВЯП НШ и ВЯП ХС для создания на их основе энтомопатогенных инсектицидных препаратов.

3.2. Разработка рецептуры рабочих растворов бакуловирусных препаратов.

3.3. Отработка методов культивирования личинок насекомых на искусственной питательной среде.

3.4. Разработка технологии производства бакуловирусных препаратов

3.5. Исследование путей распространения бакуловирусной инфекции в естественных условиях.

3.6. Полевые испытания препарата ВИРИН-НШ.

3.7. Полевые испытания препарата ВИРИН-ХСК.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка и испытания вирусных энтомопатогенных препаратов для защиты растений"

В связи с ростом населения планеты спрос на продукцию растениеводства будет неуклонно увеличиваться, и одним из методов получения больших объемов высококачественной сельскохозяйственной продукции является улучшение стратегии управления численностью вредителей. Развитие мирового сельского хозяйства свидетельствует, что нежелание или неспособность земледельцев.использовать защиту растений от вредных организмов неминуемо влечет за собой резкое снижение как валового производства, так и качества сельскохозяйственной продукции. Потери от вредных организмов в агрономии составляют в< среднем 30 %, а в период хранения продукции растениеводства — 10 %. Некоторые культуры (виноград, хлопчатник, рис, многие овощные) вообще не удается возделывать без- применения пестицидов. Однако из-за использования агрохимикатов с узконаправленным действием, главным образом на нервную систему, членистоногие были подвергнуты сильному давлению направленного отбора, что привело к широкому распространению устойчивости к пестицидам среди их популяций [97, 118]. На сегодняшний день резистентность у насекомых проявляется ко всем химическим классам инсектицидов, а также к микробным препаратам и регуляторам роста насекомых.

В связи с этим, в развитых странах предпринимаются попытки ввести альтернативные системы земледелия, предусматривающие сокращение внесения минеральных удобрений и замену традиционных пестицидов на биологические средства защиты растений. У насекомых есть много природных врагов — это различные хищники, а также патогенные организмы, к которым относятся нематоды, бактерии, грибы и вирусы. Применение этих микроорганизмов в качестве пестицидов может эффективно подавлять популяции насекомых-вредителей. Численность естественных врагов может возрастать вслед за ростом количества вредителей, так как последние являются для них источником питания, а это, в свою очередь, приводит к постепенному снижению популяции вредителя. Потенциально биологический контроль может быть постоянным, потому что естественные враги, внесенные извне, будут внедряться в популяции целевых видов вредителей и становиться безопасным и долгосрочным регулятором их численности. Идеальным инсектицидом должен стать агент, действующий строго избирательно против конкретного- вредителя и непосредственно не затрагивающий других членов биоценоза.

Наиболее привлекательными среди биопестицидов являются препараты на основе бакуловирусов. Ввиду особенностей своего жизненного цикла, бакуловирусьг обладают достаточной» устойчивостью и могут существовать вне организма насекомого длительное время (до нескольких лет). Их специфичность часто ограничивается только одним видом насекомых, и они абсолютно безопасны для людей и животных. [14, 15].

При использовании бакуловирусов в борьбе с вредителями применяются две стратегии. Чаще всего это опрыскивание пораженных вредителем районов высококонцентрированным бакуловирусным препаратом. Взят также на вооружение и колонизационный подход, результатом которого является создание циркуляции бакуловируса в популяции вредителя в течение более одного поколения [119]. Однако из-за медленного проявления эффекта действия бакуловирусов, (в случае использования химических инсектицидов эффект проявляется быстро) основные пользователи рассматривают их как неэффективные, поскольку в первые 3-10 суток инфицированные гусеницы продолжают питаться и наносить ущерб. В настоящее время это отношение изменилось, и в качестве долговременной защиты сельскохозяйственных культур от вредителей все больше начинают применять именно бакуловирусные препараты. Для более активного развития этого вида биопестицидов необходимо повысить устойчивость вирусного агента в естественной среде и разработать эффективную технологию его производства.

Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы являлась разработка бакуловирусных энтомопатогенных препаратов для повышения эффективности контроля численности хлопковой совки (Heliothis armígera НЪп.) и непарного шелкопряда (Lymantria dispar L.).

В процессе работы решались следующие задачи:

1. Выделение природных изолятов вирусов ядерного полиэдроза (ВЯП) НШ и ВЯЛ ХС, проведение с ними селекционной работы с целью получения вирусных штаммов и создания на их основе энтомопатогенных препаратов.

2. Разработка композиции^ рабочего раствора для бакуловирусных инсектицидов, повышающей их устойчивость к УФ-излучению.

3. Создание препарата для борьбы с хлопковой совкой, на основе ВЯП и разработка технологии его производства.

4. Определение путей горизонтальной передачи вирусной инфекции внутри популяции гусениц.

Научная новизна и практическая значимость работы

Создан и запатентован новый бакуловирусный препарат для борьбы с хлопковой совкой ВИРИН ХСК.

Впервые показаны пути горизонтального распространения* инфекции ВЯП и необходимость искусственного внесения бакуловирусов в экосистемы для регуляции численности насекомых-вредителей.

Обоснована целесообразность применения высокопатогенных вирусных штаммов ВЯП НШ 2-85 и ВЯНХС-17 для контроля численности непарного шелкопряда и хлопковой совки, соответственно.

Разработаны технические условия и новая- технология^ производства препарата ВИРИН ХСК.

Проведены государственные полевые испытания препарата ВИРИН'ХСК в республике Узбекистан, по результатам которых, в-соответствии с «Положением о регистрационных испытаниях и регистрации пестицидов, агрохимбиопрепаратов и минеральных удобрений в Республике Узбекистан», на данный препарат получено регистрационное свидетельство № 1 А 123.

Практическая значимость работы

Получены высокопатогенные вирусные штаммы, которые при использовании разработанной нами рецептурной формы рабочего раствора сохраняют свою эффективность в полевых условиях в течение длительного времени, что, в свою очередь, устраняет необходимость многократной обработки защищаемых культур. В настоящее время на основе разработанной технологии ведутся проектные работы по. созданию опытного производства препарата ВИРИН ХСК.

Положения, выносимые на защиту

Устойчивость ВЯЛ к УФ-излучению можно значительно повысить, используя композицию рабочего раствора, содержащую альгинат натрия, БСА, хлорид кальция и аскорбиновую кислоту.

Экологически безопасный препарат ВИРИН ХСК, созданный на основе штамма ВЯП ХС-17, превосходит по своим защитным* и экономическим свойствам химические и биосинтетические, инсектициды, применяющиеся для- подавления численности хлопковой совки (Heliothis armígera Hbn.) на хлопковых полях.

Публикации и апробация работы

По материалам диссертации опубликованы 6 статей, из них 5 в. журналах списка, рекомендованного ВАК, получено 5 патентов! на изобретения. Результаты работы были представлены на 10 научных конференциях:

Отраслевое совещание «Биологические и технологические проблемы создания вирусных препаратов для интегрированной, защиты растений», Кольцово, Новосиб. обл., 26-29 сент. 1989 г.; Международная научно-практическая конференция «Производство и применение биологических средств г защиты растений от вредителей и болезней», Одесса, 12-16 сент. 1994 г.; Proceedings of the international conference: «Achievements of biotechnology for the future of mankind», Samarkand, June 11-14, 2001; Международная научно-практическая конференция «Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование», Иркутск, 2728 окт. 2004 г.; Международная научно-практическая конференция

Технологии создания биологических средств защиты растений на основе энтомофагов, энтомопатогенов, микробов-антагонистов и применения их в открытом и закрытом грунтах», Краснодар, 20-22 сент. 2006 г.; 28th Pakistan congress of Zoology, Faisalabad, Pakistan, March 18-20, 2008; Международная научно-практическая конференция- «Интегрированная защита растений: стратерия и тактика», Минск, 5-8 июля 2011 г.

Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на 131- странице машинописного текста, содержит 9 рисунков, 23 таблицы. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 7 глав результатов и обсуждения, выводов, списка литературы, содержащего 81 отечественных и 114 иностранных источников, и приложения.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Колосов, Алексей Владимирович

Выводы

Получены и запатентованы высокопатогенные для- целевых насекомых вирусные штаммы ВЯП ХС-17 и ВЯП НШ-2-85. Показано, что важнейшими элементами производства вируса ядерного полиэдроза являются контроль биологической активности используемого изолята и проведение работ по поддержанию его высокой патогенности к целевому насекомому.

Разработана новая высокоэффективная композиция рабочего раствора для бакуловирусных препаратов, содержащая альгинат натрия, бычий сывороточный альбумин, хлорид кальция и аскорбиновую кислоту, значительно повышающая их устойчивость к УФ-излучению. Создан и запатентован новый энтомопатогенный препарат ВИРИН ХСК для борьбьь с хлопковой совкой, качественные характеристики которого отражены в технических условиях ТУ-244Г-016-05664012-10. Разработаны и испытаны- макеты оборудования для крупномасштабного культивирования» насекомых и производства энтомопатогенных препаратов на основе* ВЯП НШ и- ВЯП ХС. Разработан новый лабораторный регламент на производство препарата «ВИРИНХСК» ЛР 05664012-007-11.

Показаны пути горизонтального распространения инфекции ВЯП и необходимость искусственного внесения бакуловирусов в экосистемы для регуляции численности насекомых-вредителей. Показана высокая эффективность препаратов ВИРИН ХСК и ВИРИН НШ при их полевых испытаниях как средства контроля популяций целевых насекомых (хлопковой совки и непарного шелкопряда). По результатам проведения государственных испытаний препарат ВИРИН ХСК рекомендован Государственной комиссией республики Узбекистан к применению для борьбы с вредителем хлопка -хлопковой совкой. В соответствии с «Положением о регистрационных испытаниях и регистрации пестицидов, агрохимбиопрепаратов и минеральных удобрений в Республике Узбекистан» на данный препарат получено регистрационное свидетельство № 1 А 123. По своим защитным и экономическим показателям препарат ВИРИН ХСК превосходит традиционные химические и биосинтетические инсектициды.

Заключение

В настоящее время развитие биопестицидов начинает свой решительный подъем. В первую очередь это вызвано тем, что все большая часть населения понимает необходимость защиты окружающей среды от опасного влияния антропогенного фактора. В качестве агентов интегрированной системы управления вредителями интенсивно изучаются бакуловирусы, поскольку они» способны наиболее бережно осуществлять регуляцию численности отдельных видов насекомых. Во многих странах разрабатываются технологии создания и поддержания, вирусных эпизоотий в популяциях насекомых вредителей в лесных- и агроценозах. Ввиду растущего недоверия' населения к генетически модифицированным организмам во многих странах ведется работа по повышению биологической активности штаммов селекционным путем. Динамика развития производства^ бакуловирусных препаратов ¿показывает, что все большее количество стран старается избегать импорта этого класса инсектицидов- и стремится производить собственные. На Российском рынке препараты на основе вируса ядерного полиэдроза в списках, разрешенных к применению пестицидов, отсутствуют. .

В настоящее время есть все предпосылки для организации производства препаратов на основе ВЯЛ: огромная потребность в препаратах этого типа, законченные научно-технические работы, развита система прогнозирования, наработан опыт применения, имеется огромный опыт создания, препаратов, показана высокая- экономическая эффективность препаратов этого типа и их перспективность. Поэтому создание технологии производства на основе ВЯП является одной из важнейших задач современности.

Используя метод массового отбора, нам удалось получить < штаммы ВЯП, обладающие высокой биологической активностью и показать, что важнейшими элементами производства вируса ядерного полиэдроза являются контроль биологической активности используемого изолята и проведение работ по поддержанию его высокой патогенности к целевому насекомому.

Тестирование различных композиций рабочих растворов на бактериальных спорах и ВЯЛ показало, что в состав их рецептуры должны входить мицеллообразующие вещества, наиболее предпочтительным из которых является альгинат натрия. Кроме того, для лучшей защиты от УФ в рабочий раствор препарата следует включать аскорбиновую кислоту, хлорид кальция и бычий сывороточный альбумин. Показано, что защитный эффект этой композиции проявлялся и при крайне низких конечных концентрациях ее ингредиентов.

Найдены оригинальные конструкторские решения, касающиеся снижения микробной обсемененности искусственных питательных сред, культивирования маточной линии насекомых, автоматизации дозировки яиц, инфицирования гусениц. Показано, что разработанная.' методика позволяет получать стабильную жизнеспособную популяцию хлопковой совки на протяжении 30» генераций. На основании этой методики были сформулированы исходные данные и спроектированы экспериментальные образцы опытного оборудования для культивирования маточных линий насекомых. Основные технические и конструктивные решения (стерилизация сухих компонентов ИПС с помощью СВЧ, влажная дозировка яиц, конструкция камеры для содержания* имаго, аэрозольная камера для инфицирования гусениц и др.) были реализованы при создании элементов опытной установки для производства ВИРИН ХСК.

Результаты наших исследований, посвященных изучению горизонтального развития бакуловирусной эпизоотии, показали, что инфекция активно распространяется по популяции насекомых, когда здоровые гусеницы питаются на ветках, где находятся или находились ранее зараженные вирусом особи. При отсутствии таких контактов бакуловирусная инфекция у не инфицированных личинок не развивалась, однако нахождение поблизости с ними зараженных гусениц приводило к снижению жизнеспособности здоровых насекомых. Таким образом, при проведении инсектицидных обработок, учитывая к тому же способность личинок некоторых насекомых к пассивной миграции, не следует ставить целью заражение всех насекомых данной экосистемы. Достаточно создать несколько очагов инфекции, которые станут не только источником распространения» эпизоотии, но также будут способствовать и общему снижению жизнеспособности популяции вредителя.

Полученные нами результаты свидетельствуют также и о том, что на стадии нарастания, численности популяции* насекомого-вредителя вирусные эпизоотии спонтанно» не возникают. Следовательно, искусственное внесение вируса в популяцию необходимо для сдерживания- роста численности вредителя.

Созданные нами препараты на основе ВЯП показали свою высокую эффективность. В ходе проведения полевых испытаний» препарата ВИРИН НШ удалось подавить очаги вспышек численности непарного шелкопряда в Тюменской и Новосибирской областях, Алтайском крае и Восточном Казахстане. Испытания препарата ВИРИН- ХСК, проведенные совместно с Институтом зоологии и Институтом защиты растений в, 2007 - 2008 гг. на хлопковых полях в Республике Узбекистан показали, что эффективность препарата ВИРИН ХСК значительно выше, чем эффективность химических препаратов. Согласно проведенным расчетам экономическая эффективность в случае применения препарата ВИРИН ХСК оказалась на 24,5 % выше, чем при применении высокоэффективных пиретроидов и составила 424,97 $/га в сравнении с необработанным участком.

При обследовании (с использованием прямого подсчета гусениц на 100 растениях и при помощи ферамонных ловушек) в 2008 г. полей, обработанных вирусом ранее (в 2007 г.) было установлено, что численность хлопковой совки на этих полях не превышала экономически безопасного уровня, т.е. наблюдался пролонгированный эффект действия препарата ВИРИН ХСК.

По результатам проведения государственных испытаний препарат ВИРИН ХСК рекомендован Государственной комиссией республики Узбекистан к применению для борьбы с вредителем хлопка — хлопковой совкой. В соответствии с «Положением о регистрационных испытаниях и регистрации пестицидов, агрохимбиопрепаратов и минеральных удобрений в Республике Узбекистан», на данный препарат получено регистрационное свидетельство № 1 А 123.

Организовано сотрудничество с научно-производственными компаниями, готовыми вести непосредственные работы по проектированию и созданию опытной установки для производства бакуловирусов.

Нами получены патенты Российской Федерации на изобретения штаммов ВЯП непарного шелкопряда, капустной и хлопковой совок. На препарат ВИРИН ХСК получены патенты России и Казахстана.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Колосов, Алексей Владимирович, Кольцово

1. Айлер Р.К. Химия кремнезема. Пер с англ. — М: Мир. — 1982. — Ч. 1. — 416 с.

2. Ангус Т.А., Лути П. Рецептура микробиологических инсектицидов. В кн.: Микроорганизмы в борьбе с вредными насекомыми и клещами. — -М.: Колос. 1976. - С. 495-506.

3. Андреева И.В., Джалилов Ф.С. Биологическая защита растений. — М.: Колос. 2004. - 264 с.

4. Бахвалов С.А., Мартемьянов В.В., Подвайт Д. Сравнительная характеристика биологической активности вирусных препаратов Вирин-ЭНШ и Джипчек (Gypchek) // Евразиатский энтомологический журнал-2005.-Т. 4.-№3.-С. 183-186.

5. Брек Д. Цеолитовые молекулярные сита. Пер. с англ. Клечко А.Н. и др. М: Мир. - 1985. - 781 с.

6. Булл Д.Л. Формы микробных инсектицидов. Микрокапсуляция и адьюванты // Формы микробных инсектицидов и методы их применений М.: Колос. - 1981. -№ 6.-С. 17-281

7. Васильева В.Л., Лебединец H.H. Итоги изучения безопасности1 вирусных инсектицидов для человека и животных в условиях производства и применения // Защита растений на рубеже XXI века: Материалы научно-практической конференции. Минск. - 2001. -С. 347-349:

8. Васильева В.Л., Лебединец H.H. Основы микробиологического метода защиты растений и безопасность биопестицидов на основе бакуловирусов // Ахова раслш: Двухмесячный научно-производственный журнал. 2001. - № 5. - С. 11-13.

9. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологичеких мембранах М.: Наука. - 1972. - 132 с.

10. Воробьева H.H. Спонтанные и искусственные эпизоотии, вызываемые энтомопатогенными вирусами // Вирусы насекомых. Новосибирск: Наука.-1974.-С. 93-111.

11. Воробьева H.H., Барановский В.Н., Ларионов Г.В., Литвина Л.А. Вирусы, изолированные от насекомых вредителей сельского хозяйства Сибири // Вирусы насекомых. — Новосибирск: Наука. — 1974.-С. 3-8.

12. Воробьева Т.В: Энтомопатогенные вирусы — М: Наука — 1976. — 218 с.20: Газиянц Э.И: Экономическая реформа в орошаемом земледелии —1. Ташкент. 2008. - 147 с.

13. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. — М.: Мир. 2002. — 589 с.

14. Горбунова Е.Е., Колосов A.B., Борисова О.Д., Зайцев В.Н., Божко НА. Сравнительная характеристика изолятов вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда Lymantria dispar L. II Вопр. вирусол. 1997. -N 1. - С. 41-43.

15. Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации. — М: Минсельхоз России. 2004.

16. Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории* Российской Федерации. М: Минсельхоз России. - 2011. - 932 с.

17. Гулий В.В., Теплякова Т.В., Иванов Г.М. Микроорганизмы полезные для биометода. — Новосибирск: Наука. — 1981. — 172 с.

18. Гулий В.В., Штерншис М.В., Северина Н.И. Поиск путей'повышения эффективности вирусных препаратов. // В кн.: Микробиологические методы борьбы с вредителями растений. Новосибирск. - 1977. -С. 5-15.

19. Данилов Л.Г., Айрапетян В.Г., Антонова И.А., Нащекина Т.Ю., Турицин B.C. Технология производства и применения биопрепаратов на основе энтомопатогенных нематод. // Главный агроном. — 2006. — № 9. С. 20-25.

20. Жесткова Т.Я. Исследование физико-химических свойств наполнителей с целью рекомендации их для производства смачивающихся порошков пестицидов // в сб. Исследование в области пестицидов. М: НИИТЭХИМ, ВНИИ ХС ЗР. - 1981. - С. 68 -89.

21. Жимерикин В.Н., Воробьева H.H. Искусственные эпизоотии в очаге рыжего соснового пилильщика и условия их возникновения // Труды Всесоюзной научно-технической конференции (МЛТИ). — Москва. — 1971.-Т. 2.-С. 46-47.

22. Заикина И:Н. Тенденции' в разработке микробных препаратов // Сельское хозяйство за рубежом. 1979. - № 9. - С. 25 -28.

23. Зайцев В.Н., Кандрушин Е.В. Электронная микроскопия сухих биопрепаратов // Биотехнология. 1990. - № 2. - С. 74-76.

24. Заринш И.А., Эглите Г. Антиоксиданты — перспективные вещества для защиты энтомопатогенных вирусов от УФ-лучей // Труды Латвийской СХА. Елгава. - 1985. - Вып. 222. - С. 15 - 21.

25. Злотин А.З. Техническая энтомология. Справочное пособие. — Киев: Наукова думка. 1989. - 184 с.

26. Игнатов В.В., Папасенко В.И., Пиденко А.П. Влияние электромагнитных полей сверхвысокочастотного диапазона на бактериальную клетку. — Саратов: СГУ. — 1978. 80 с.

27. Ильиных A.B. Оптимизированная искусственная питательная среда для культивирования непарного шелкопряда // Биотехнология. — 1996. — № 7. — С. 42—43.

28. Ильиных A.B., 2007 Эпизоотология бакуловирусов // Известия РАН. Серия биологическая Сентябрь-Октябрь 2007. - № 5. — С. 524-533.

29. Ильиных A.B., Мамонтова С.А., Петров B.C., Колосов A.B. Регуляция численности непарного шелкопряда (Ocneria dispar L.) в Западной Сибири // Биотехнология. 1997. - № 3. - С.45-47.

30. Кириллова Н.Е., Левитин Е.И., Войцеховская Я:А., Юдина Т.Г., Залунин И.А., Честухина Г.Г. Рекомбинантный Сгу9А способен образовывать кристаллы в спорулирующих клетках Bacillus thuringiensis // Биотехнология. — 2010. — № 3. — С. 34^-42.

31. Колосов A.B., Косогова Т. А., Булычев Л. Е., Сергеев А. Н. Пути горизонтальной передачи бакуловирусной инфекции у непарного шелкопряда (Lymantria dispar L.) // Вопросы вирусологии. — 2010. — № 5.-С. 43^7.

32. Колосов- A.B., Кошелев Ю.А., Агзамова Х.К., Артыкбаев П.К., Залесов A.C., Трошкова Г.П. Исследование устойчивости вируса ядерного полиэдроза в окружающей среде // Современные наукоемкие технологии. 2010. — № 9. - С. 131-132.

33. Круглицкий H.H., Мороз Б.И. Искусственные силикаты Киев: Наукова думка. - 1986. - 236 с.

34. Лакин Г.Ф. Биометрия. М. — Высшая школа. — 1990. — 352 с.

35. Ларченко К.И. Экология хлопковой совки и сроки борьбы с ней -Ташкент: Фан. 1968. - С. 57-91.

36. Монастырский А.Л., Горбатовский В.В. Массовое разведение-насекомых для биологической защиты растений — Мл Агропромиздат. 1991.-240 с.

37. Неймарк И:Е. Синтетические минеральные адсорбенты и носители' катализаторов Киев: Наукова думка. - 1982-396 с.

38. Нурлыбаева Р.Н. Вирусы ядерного полиэдроза капустной совки, гранулеза капустной? и< репной; белянок ш возможности их использования; против? этих, вредителеш в условиях; Казахстана; -Автореф. дис. канд. биол. наук. Ленинград. — 1973. — 25 с.

39. Орловская Е.В. Вирус ядерного полиэдроза в; борьбе с вредными насекомыми // Биологические средства защиты растений. М.: Колос. -1974.-106 с.

40. Орловская Е.В; Определение условий создания препарата В ИРИН ОС с ограниченным* количеством микрофлоры. Отчет о НИР, ВНИИ бакпрепарат. Foc № 01840063405, инв. № 02840020296 Москва. -1985.-33 с.

41. Орловская Е.В. Основные итоги и направления в разработке технологии и применения вирусных энтомопатогенных препаратов. // Итоги и перспективы производства и применения вирусных препаратов ? в сельском; и лесном хозяйстве. Москва. - 1984. - С. 3— 14.

42. Орловская E.B., Шумова Т.А. // Вирусные препараты в борьбе с насекомыми — вредителями сельского и лесного хозяйств. — М.: ОНТИТЭИ Микробиопром. 1980. - 64 с.

43. Патыка Т.И., Ермолова В.П., Кандыбин Н.В. К вопросу формирования резистентности насекомых к Bacillus thuringiensis II Вестник-защиты растений. — 2008. № 2. — С. 19-24.

44. Питательная среда для гусениц хлопковой' совки: пат. 14993 СССР. № 01722338: заявл. 30.03.1992 г.

45. Препарат для борьбы с хлопковой совкой: пат. 2396750 Рос Федерация. № 2008139622/13: заявл. 07.10.08; опубл. 20.08.2010, Бюл. 23.

46. Симонова Э.Ж., Новикова JI.K., Никитина Н.И. Вирусы для защиты леса // Биологическая и, интегрированная- борьба с вредителями в лесных биоценозах. М.: - 1989. - С. 105-109.

47. СкобеевИ.К. Фильтрующие элементы М: Наука. — 1978, - 312 с.

48. Соколов Г.И. Непарный шелкопряд в Челябинской области и борьба с ним // Непарный шелкопряд: Итоги и перспективы исследований. — Красноярск: 1988. - С. 28-29.

49. Старец В.А. Методы разведения совок фитофагов на искусственных питательных средах Кишинев: Госкомцен. -1981.-13 с.

50. Тарасов С.И., Иванова Г.А. Пленкообразующая форма бензофосфата и ее свойства // В сб.: Исследования в области пестицидов- М: НИИТЭХИМ, ВНИИХС ЗР. 1981. - С. 90-154.

51. Хашимова М.Х., Ахмедова З.Ю., Хамраев А.Ш., Колосов A.B.

52. Шагов Е.М., Новикова А.К. Особенности формирования культурit1.насекомых с заданными свойствами в условиях техноценоза //

53. Сельскохозяйственная биология. 1985. — № 6. - С. 86-89.г

54. Шарова Е.В. Влияние технологических процессов переработки наактивность вируса ядерного полиэдроза капустной совки и непарногоtшелкопряда // Тезисы докладов Первой Всесоюзной научной конференции Микробиологические методы защиты растений.

55. Кишинев. 1976. - С. 164-165.

56. Биологическая защита растений основа стабилизации

57. Штамм вируса ядерного полиэдроза для производства1инсектицидного препарата: пат. 1638161 СССР. № 4618465: заявл. 08.12.1988, опубл. 30.03.91.

58. Штамм вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда, используемый для получения инсектицидов: пат. 2117701 Рос. Федерации. № 96115819: заявл. 31.07.96; опубл. 20 08.1998.

59. Штамм вируса ядерного полиэдроза' хлопковой совки Heliothis armigera Hbn., используемый для получения инсектицидного препарата: пат. 2359031 Рос Федерация. № 2007145778/13: заявл. 10.12.07; опубл. 20.06.2009, Бюл. 17.

60. Штерншис М.В. Биологический контроль численности насекомых // Патогены насекомых: структурные и функциональные аспекты. Под ред. В.В.Глупова. М.: Круглый год. - 2001. -С. 562-610.

61. Aoki D:, Owashi Е. and Yazaki S. Ukiyoe VR-Museum. 2001. URL: http://www.biblio.tuat.ac.jp/vr-museum/ukiyoeEng.htm. (дата обращения: 24.03.2011).

62. Arthurs S.P., Lacey L.A., and Behle R.W. Evaluation of spray-dried lignin-based formulations and adjuvants as solar protectants for the granulovirus of the codling moth, Cydia pomonella (L.) Il J. Invertebr. Pathol. 2006. - № 93. - P. 88-95.

63. Attaran A., Roberts D.R., Curtis C.F. and Kilama W.L. Balancing risks on the backs of the poor // Nat. Med. 2000. - № 6. - P. 729-731.

64. Bates S.L., Zhao J.Z., Roush R.T. and Shelton. A.M. Insect resistance management in GM crops: past, present and future // Nat. Biotechnol. -2005.-№23.-P. 57-62.

65. Beard A. DDT and human health // Sei. Total Environ. 2006. - № 355. -P. 78-89.

66. Beckmann' A. and Haack K.J. Insektizide für. die Landwirtschaft: Chemische Schädlingsbekämpfung. Insecticides for agriculture: chemical pest control. // Chemie in unserer Zeit: 2003". - № 37. - P. 88-97.

67. Behle, R.W., Tamez-Guerra P. and' McGuire M.R. // Field activity and storage stability of Anagrapha falcifera (4/MNPV) in spray-dried lignin-based formulations // J. Econ: Entomol. 2003. - № 96: - P. 1066-1075.

68. Bergold, G.H. Die isolierung des polyeder-virus and die natur der polyeder -Z. Naturforsch. 1947. - P. 122-143'.

69. Bergvinson E. and Garcia-Lara S. Genetic approaches to reducing losses of stored grain to insects and' diseases // Curr. Opin. Plant Biol. 2004. - № 7.-P. 480-485.

70. Betarbet R., Sherer T.B., MacKenzie G., Gärcia-Osuna M., Panov A.V. and Greenamyre J.T. Chronic systemic pesticide exposure reproduces features of Parkinson's disease // Nat. Neurosci. 2000. — № 3. - P. 13011306.

71. Bideshi D.K., Bigot Y., Federici B.A. Molecular characterization and phylogenetic analysis of the Harrisina brillians granulovirus granulin gene // Arch. Virol. 2000. - № 145. - P. 1933-1945.

72. Black B.C., Brennan L.A., Dierks P.M. and Gard I.E. In: L.K. Miller, Editor. The Baculoviruses. New York: Plenum Press. - 1997. — P. 341387.

73. Bonning B.C. and Hammock B.D. Development of recombinant baculoviruses for insect control // Annu: Rev. Entomol. 1996. - № 41. -P. 191-210.

74. Braunagel S.C., Summers M.D. Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus, PDV, and ECV Viral Envelopes and Nucleocapsids: Structural Proteins, Antigens, Lipid and Fatty Acid Profiles // Virology. -1994. V. 202. - № 1. - p. 315-328.

75. Brogdon W.G. and McAllister J.C. Insecticide resistance and vector, control // Emerg. Infect. Dis. 1998. - № 4. - P. 605-613.

76. Brooks E.M., Hines E.R. Viral biopesticides for heliothine control — fact or»fiction // Today's Life. Sci. 1999. - P. 38-44.

77. Bull D.L., Ridgway R.L., House V.S. Improved formulations of the Heliothis polyhedrosis virus // J. Econ. Entomol. 1971. - V. 64. - № 4. -P. 850-853.

78. Bull D.Z. Formulation of microbial insecticides microencapsulation and adjnrants // J. Econ. Entomol. 1978. - V. 105. - P. 1-10.

79. Carlini C.R. and Grossi-de-Sa M.F. Plant toxic proteins with insecticidal properties. A review on their potentialities as bioinsecticides // Toxicon. -2002.-V. 40.-P. 1515-1539.

80. Carriere Y. and Tabashnik B.E. Reversing insect adaptation to transgenic insecticidal plants // Proc. Biol. Sci. 2001. - № 268. -P. 1475-1480.

81. Chakraborty S., Monsour C., Teakle R. and Reid S. Yield, biological activity, and field performance of a wild-type Helicoverpa nucleopolyhedrovirus produced in H. zea cell cultures // J. Invertebr. Pathol. 1999. -V. 73. - P. 199-205.

82. Chen X., Zhang W.J., Wong J., Chun G., Lu A. and McCutchen B.F. Comparative analysis of the complete1 sequences of Helicoverpa* zea and Helicoverpa armigera single-nucleocapsid nucleopolyhedroviruses // J. Gen. Virol. 2002. - V. 83; - P. 673-684.

83. Cory J.S., Hirst M.L., Williams T., Hails R.S., Goulson D., Green B.M., Carty T.M., Possee R:D., Cayley P.J. and Bishop D:H.L. Field trial of a genetically improved baculovirus insecticide // Nature. — 1994. — V. 370. -P. 138-140.

84. Couch J.A. An enzootic nuclear polyhedrosis virus of pink shrimp: ultrastructure, prevalence, and enhancement // J. Invertebrate Pathol. — 1974.-V. 24.-P. 311-331.

85. Cunningham J.C. Baculoviruses as microbial pesticides In: R. Reuveni, Editor, Novel approaches to integrated pest management. — Lewis. — Boca Raton, FL. 1995. - P. 261-292.

86. Degli G., Esposti. Inhibitors of NADH-ubiquinone reductase: an overview // Biochim. Biophys. Acta. 1998. - V. 1364. - P. 222-235.

87. El Salamouny S., Shapiro M., Ling K.S., and Shepard B.M. Black tea and lignin as ultraviolet protectants for the beet armyworm nucleopolyhedrovirus // J. Entomol. Sci. 2009. - V. 44. - P. 1-9.

88. Entwistle P.E., Evans H.E. Comprenensive insect pathology biochemistry Ed. Kevnut H.I. Cilbert Insect control. Oxford: Pergamon press. - 1985. -V. 12.-P. 347-412.

89. Entwistle P.F., Forkner A.C., Reen B.M. and Cory J.S. Avian dispersal of nuclear polyhedrosis virus after induced epizootics in the pine beauty moth, Panolis flammea (Lepidoptera: Noctuidae) // Biol. Control. — 1993. -V. 3. — P. 61-69.

90. Falcon L.A., Hess R.T. Electron microscope observations of multiple occluded? virions in the granulosis virus of the codling, moth, Cydia pomonella l! J. Invertebr. Pathol. 1985. - V. 45. - P. 356-359.

91. Fang W., Leng B., Xiao Y., Jin K., Ma J. and Fan Y. Cloning of Beauveria bassiana chitinase gene Bbchitl and its application to improve fungal strain virulence // Appl. Environ. Microbiol. — 2005. ~ V. 71. — P. 363370.

92. Federici B.N. The Baculoviruses New York. - London. - 1997. - P. 3359.

93. Feyereisen R. Molecular biology of insecticide resistance // Toxicol. Lett. 1995.-V. 82/83.-P. 83 -90.

94. Fuxa R. Ecology of insect nucleopolyhedroviruses. // Agr. Ecosyst. Environ. 2004. - V. 103. - P. 27-43.

95. Gershburg F, Stockholm D., Froy O., Rashi S., Gurevitz M. and; Chejanovsky N. Baculovirus-mediated expression of a scorpion depressant toxin improves the insecticidal efficacy achieved with excitatory toxins // FEBS Lett. 1998. - V. 422. - P. 132-136.

96. Goettel M.S., Johnson D.L. and Inglis G.D. The role of fungi in the biological control; of grasshoppers // Can. J; Botany. 1995. - V. 73 (Suppl. 1).-P. S1-S75.

97. Hall D.W., Hazard E.I. A nuclear polyhedrosis virus of a caddisfly, Neophylax sp. /l J. Invertebr. Pathol. 1973. - V. 21. - P. 323-324.

98. Hemingway B. and Ranson H. Insecticide resistance in insect vectors of human disease // Annu. Rev. Entomol. 2000. - V. 45. - P. 371-391.

99. Henry J.E., Jutila J.W. The isolation of a polyhedrosis virus from a grasshopper // J. Invertebr. Pathol. 1966. - V. 8. - P. 417-418.

100. Herniou E.A. Luque T., Chen X., Vlak J.M., Winstanley D., Cory J.S., O'Reilly D.R. Use of whole genome sequence data to infer baculovirus phylogeny // J*. Virol. 2001. - V. 75. - № 17. - P: 8117-8126.

101. Herniou E.A., Olszewski J.A., Cory J.S. and O'Reilly D.R. The genome sequence and evolution ofbaculoviruses // Annu. Rev. Entomol. 2003. — V. 48.-P. 211-234.

102. Herniou E.A., Olszewski J.A., O'Reilly D.R., Cory J.S. Ancient coevolution ofbaculoviruses and their insect hosts // Jl Virol. 2004. - V. 78.-№7.-P.1 3244-3251.

103. Hughes K.M., Addison R.B. Two nuclear polyhedrosis viruses of the Douglas-fir tussock moth // J. Invertebr. Pathol. 1970. - V. 16. - P. 196204.

104. Hughes P.R., Wood H.A., Breen J.P., Simpson S.F., Duggan A.J. and Dybas J.A. Enhanced bioactivity of recombinant baculoviruses expressing insect-specific spider toxins in lepidopteran crop pests // J. Invertebr. Pathol.-1997.-V. 69.-P. 112-118.

105. Hukuhara T. Genetic variation of polyhedrosis viruses of insects in Proc. Jount U.S.-Japan Seminar on< microbial control-of insects pests. 1967. -Fukuoka. - p. 711.

106. Ignoffo C.M. and Couch T.L. The nucleopolyhedrosis virus of Heliothis species as a microbial pesticide In: H.D. Burges, Editor, Microbial control of pests and plant diseases. — London: Academic Press. — 1981. P. 329362.

107. Ignoffo C.M., Hostetter D.L., Smith D.B. Gustatory stimulant, sunlight protectant evaporation retardant: three characteristics of a microbial insecticidal adjuvant // J. Econ. Entomol. 1976. - V. 69. - № 2. - P. 207 -210.

108. Inceoglu A.B., Kamita S.G., Hinton A.C., Huang Q., Severson T.F., Kang K. and Hammock B.D. Recombinant baculoviruses for insect control // Pest. Manag. Sci. 2001. - V. 57. - P. 981-987.

109. Jaques R.P: Tests on protectants for foliar deposits on polyhedrosis virus // J. Invertebr. Pathol. 1971. -V. 17. -№ 1. - P. 9-16.

110. Jaques R.P. The inactivation of the nuclear polyhedrosis* virus of Trichoplusia ni by gamma and ultraviolet radiation // Can. J. Microbiol. — 1968.-V. 14.-№ 10.-PI 1161-1163.

111. Jehle J.A., Blissard G.W., Bonning B.C., Cory J.S., Herniou E.A., Rohrmann. G.F., Theilmann D.A., Thiem S.M. andVlak J.M. On the classification and nomenclature of baculoviruses: A proposal for revision // Virology.-2006.-V. 151.-№. 7.-P. 1257-1266^

112. Jehle J.A., Lange M., Wang H., Hu Z., Wang Y., Hauschild R. Molecular identification and.phylogenetic analysis of baculoviruses from Lepidoptera //Virology.-2006.-V. 346. № l.-P. 180-193.

113. Lacey L.A. and Kaya H.K. Field manual of techniques in invertebrate pathology: application and evaluation of pathogens for control of insects and other invertebrate pests Kluwer: Dordrecht. - 2000. - p. 527-546.

114. Lager RJ. St., Joshi L., Bidochka MJ. and Roberts D.W. Construction of an improved mycoinsecticide overexpressing a toxic protease Proc Natl Acad. Sci. USA. 1996.-V. 93.-P. 6349-6354.

115. Langewald J., Ouambama Z., Mamadou A., Peveling R., Stolz I. and Bateman R. Comparison of an organophosphate insecticide with a mycoinsecticide for the control of Oedaleus senegalensis Krauss

116. Orthoptera, Acrididae) and other Sahelian grasshoppers in the field at the operational scale // Biocont. Sci. Technol. 1999. - V. 9. - P. 199-214.

117. Larsson R. Insect pathological investigations on Swedish Thysaura: A nuclear polyhedrosis virus of the bristletail Dilta hibernica II J. Invertebr. Pathol. 1984. - V. 44. - P. 172.

118. Longnecker M.P., Klebanoff M.A., Zhou H. and Brock J.W. Association between maternal serum concentration of the DDT metabolite DDE and preterm and small-for-gestational-age babies at birth // Lancet. — 2001. — V. 358. — P. 110-114.

119. Lu A., Seshagiri S. and Miller L.K. Signal sequence and promoter effects on the efficacy of toxin-expressing baculoviruses as biopesticides // Biol. Control. 1996. - V. 7. - P. 320-332.

120. Martignoni M.E. and Iwai P.J. A catalog of viral diseases of insects, mites, and ticks Fourth ed. 1986: USDAForest Service PNW-195. - 51 p.

121. Mettenmeyer A. Viral insecticides hold promise for bio-control // Farming Ahead. -2002. V. 124.-P. 50-51.

122. Miller L.K., Lingg A.J. and Bulla L.A.J. Bacterial viral and fungal insecticides // Science. 1983. - V. 219. - P. 715-721.

123. More virulent biotype isolated from wild-type virus United States Patent 5132220: Filing Date: 06/30/1989; Publication Date: 07/21/1992.

124. Morris O.N. Compatibility of 27 chemical insecticides with Bacillus thuringiensis var. Kurstaki // Can. Entomol. 1977. — V. 109. - P. 855 -864.

125. Morris O.N., Moore A. Studies on the protection of insect pathogens from sunlight inactivation: Republic Chemical Control Research Institute, Environment Canada, Ottawa, Ontario. 1975. — CC-X-113. - V. 34. -P. 8.

126. Moscardi F. Assessment of the application of baculoviruses for control of Lepidoptera // Annu. Rev. Entomol. 1999. - V. 44. - P. 257-289.

127. Moscardi G. and Santos B. Producao comercial de nucleopoliedrosis de Anticarsia gemmatalis HUBNER (Lep.: Noctuidae) em laboratorio,

128. Proceedings of the IX Simposio de Controle Biologico, Recife, Brazil, 2005. P. 42.

129. Myers J.H., Simberloff D., Kuris A.M. and Cary J.R. Eradication revisited: dealing with exotic species // Trends Ecol. Evol. — 2000. V. 15. — P. 316— 320.

130. Oerke E.C. and Dehne H.W. Safeguarding production-losses, in major crops and the: role of crop protection // Crop. Prot. 2004. - V. 23; -P. 275-285;

131. Paillot A. Sur une nouvelle maladie du noyau au grasserie des chenilles de P. brassicae et un nouveau groupe de microoganismes parasites // Compt. Rend. 1926. - V. 182. - P. 180-182. ■

132. Pearson M.N., Rohrmann G.F. Transfer, incorporation, and substitution of envelope: fusion, proteins among members of the Baculoviridae, Orthomyxoviridae, and Metaviridae (insect,retrovirus); families // J. Virol. 2002. - V. 76. - P. 5301-5304.

133. Peng P.P. and Argyropoulos D.S. On the interaction of UV screens with the lignocellulosic matrix // Photochem. Photobiol. 2007. - V. 71. P. 149-156;

134. Prabakaran: G., Hoti S.L. Immobilization of alginate-encapsulated Bacillus thuringiensis var. israelensis containing different multivalent counterions for mosquito control // Curr. Microbiol. 2008. - V. 57. - P. 111-114.

135. Raymond-Delpech V., Matsuda K., Sattelle B.M., Rauh J.J. and Sattelle D.B. Ion channels: molecular targets of neuroactive insecticides // Invert. Neurosci. 2005. — V. 5. - P. 119-133.

136. Reardon, R., Podgwaite J.P., Zerillo R.T. GYPCHEK — the gypsy moth nucleopolyhedrosis virus product USDA Forest Service Publication FHTET-96-16. 1996. - 33 p.

137. Regev A., Rivkin H., Inceoglu B., Gershburg E., Hammock B.D., Gurevitz M. and Chejanovsky N. Further enhancement of baculovirus insecticidal efficacy with scorpion toxins that interact cooperatively // FEBS Lett.2003. -V. 537. P. 106-140.

138. Rose R.I. Pesticides and* public health: integrated methods of mosquito management // Emerg. Infect. Dis. 2001. - V. 7. - P. 17-23.

139. Rowe H. and Margaritis A. Bioprocess design and-economic analysis for the commercial production- of environmentally friendly bioinsecticides from Bacillus thuringiensis HD-1 kurstaki // Biotechnol. & Bioeng.2004.-V. 86. -P. 378-388.

140. Shapiro M.', El Salamouny S., Shepard B. M: Green tea extracts as ultraviolet protectants for the beet armyworm, Spodoptera exigua, nuclepolyhedrovirus // Biocontrol. Sci. Technol. 2008. - V. 18. - P. 605617.

141. Shelton A.M., Tang J.D., Roush R.T., Metz T.D., Earle E.D. Field tests on managing resistance to ^/-engineered plants // Nat. Biotechnol. — 2000. — V. 18.-P. 339-342.

142. Smith D.B., Hostetter D.L., Ignoffo C.M. Formulation and equipment effects on application of a viral (Baculovirus heliothis) insecticide // J. Environ. Entomol. 1978. -V. 71. -N 5. - P. 814-817.

143. Smith D.B., Hostetter D.L., Pinnel R.E. Laboratory formulation comparisons for a bacterial {B.th.) and viral (i/aNPV) insecticide // J. Econ. Entomol. 1980. -V. 73. - P. 18-21.

144. Smitt D.B., Nostetter D.L., Pinnel N.E., Ignoffo C.M. Laborators studies viral adjuvants. Formulation development // J. Econ. Entomol. — 1982. — V. 75.-P. 12-20.

145. Soeda E., Maruyama T., Arrand J.R., Griffin B.E. Host-dependent evolution of three papova viruses // Nature. 1980. — V. 285. — P. 165— 167.

146. Sun X., Chen X., Zhang Z., Wang H., Bianchi F.J., Peng H., Vlak J.M. and Hu Z. Bollworm responses to release of genetically modified Helicoverpa armígera nucleopolyhedroviruses in cotton // J. Invertebr. Pathol. — 2002. -V. 81.-P. 63-69.

147. Sun X., Peng H. Recent advances in biological' control'of pest insects by using viruses in China // Virolog. Sinica. 2007. - № 22. - P. 158-162.

148. Szewczyk B, Hoyos-Carvajal L, Paluszek M, Skrzecz I, Lobo de Souza M. Baculoviruses — re-emerging biopesticides // Biotechnol. Adv. — 2006. — V. 24.-P. 143-160.

149. Tabashnik B.E., Gould F. and Carriere Y. Delaying evolution of insect resistance to transgenic crops by decreasing dominance and heritability // J. Evol. Biol. 2004. - V. 17. - P. 904-912.

150. Tanada Y., Himeno M., Omi E.M. Isolation of a factor, from the capsule of a granulosis virus, synergetic for a nuclear polyhedrosis virus of army worm // J. Invertebr. Pathol. 1973. - V. 21. - P. 31-90.

151. Trzebitzky C., Bogenschuts H., Hubner J. // Mitt. Dtsch. Ges. Allg. und Angew, Entomol. 1988. - V.6 - № 4. - P. 525-530.

152. Uribe D. and Khachatourians G.G. Restriction fragment length polymorphism of mitochondrial genome of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana reveals high intraspecific variation // Mycol. Res. -2004.-V. 108.-P. 1070-1078.

153. Virus insecticide composition: пат. 137668 Великобритании. A 01 № 15 / 00: заявл. 16.07.1976; опубл. 12.12.1979.

154. Winston M.L. Nature Wars: People vs. Pests, Harvard University Press, Cambridge, MA. 1997. - 210 p.

155. World Health Organisation, Vector resistance to insecticides. 15th Report of the WHO Expert Committee on Vector Biology and Control. 1992. -World Health Organization Technical Report Series 818. - P. 1-62.

156. Xeros N. Cytoplasmic polyhedral virus diseases // Nature. 1952. — V. 170.-P. 1073.

157. Zanotto P., Kessing В., Maruniak J. Phylogenetic interrelationships among baculoviruses: evolutionary rates and host associations // J. Invertebr. Pathol. 1993. - V. 62. - P. 147-64.

158. Zhang G.Y., Sun X.L., Zhang Z.X., Zhang Z.F. and Wan F.F. Production and effectiveness of the new formulation of Helicoverpa virus pesticide-emulsifiable suspension // Virologica Sinica. 1995. - V. 10. - P. 242247.

159. Zohar-Perez C., Chemin L., Chet L., Nussinovitch A. Structure of dried cellular alginate matrix containing fillers provides extra protection for microorganisms against UVC radiation // Radiation Res. — 2003. V. 160. -P. 198-204.

160. Общие характеристики рынка биопестицидов США и Канады — Аналитика // Abercade декабрь 2009 URL: http://www.abercade.ru/research/analysis/3194.html (дата обращения: 24.03.2011).

Информация о работе

Колосов, Алексей Владимирович
кандидата биологических наук
Кольцово, 2011
ВАК 03.01.06

Диссертация

Разработка и испытания вирусных энтомопатогенных препаратов для защиты растений - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы