Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение симбиоза энтомопатогенных нематод и ассоциированных с ними бактерий: биологическое разнообразие и специфичность взаимоотношений

ВАК РФ 03.02.11, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Изучение симбиоза энтомопатогенных нематод и ассоциированных с ними бактерий: биологическое разнообразие и специфичность взаимоотношений"

На правах рукописи

Шепелева Надежда Семёновна

ИЗУЧЕНИЕ СИМБИОЗА ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ НЕМАТОД И АССОЦИИРОВАННЫХ С НИМИ БАКТЕРИЙ: БИОЛОГИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ И СПЕЦИФИЧНОСТЬ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ

03.02.11 — паразитология

Автореферат на соискание учёной степени кандидата биологических наук 22 МАЙ 20и

МОСКВА 2014

005548677

005548677

Работы выполнена в лаборатории систематики и эволюции паразитов Центра паразитологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН

Научный руководитель:

Спиридонов Сергей Эдуардович, доктор биологических наук, заведующий лабораторией систематики и эволюции паразитов ЦП ИПЭЭ имени А. Н. Северцова

Официальные оппоненты:

Бенедиктов Игорь Иванович, доктор биологических наук, профессор, ГНУ ВИГИС имени К.И. Скрябина, ведущий научный сотрудник лаборатории биохимии и биотехнологии

Кручина Сергей Николаевич кандидат биологических наук, доцент, руководитель группы биологических испытаний УНКЦ «Агроэкологии пестицидов и агрохимикатов» РГАУ - МСХА имени К. А. Тимирязева

Ведущая организация: Кафедра зоологии беспозвоночных биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится «25» июня 2014 года в 14.00 часов на

заседании совета по защите диссертаций на соискание учёной степени

кандидата наук, на соискание учёной степени доктора наук Д 006.011.01,

созданного на базе ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт

гельминтологии имени К.И. Скрябина»

Адрес: 117218, г. Москва, ул. Б. Черемушкинская, 28

С диссертацией можно ознакомиться в ГНУ ВИГИС

Автореферат разослан «.Т^..» МФЯ_2014 года

Учёный секретарь Совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук,

д.б.н., профессор

Бережко Вера Кузьминична

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Актуальность проблемы исследования определяется, в первую очередь, значительным интересом к симбиотическому комплексу «энтомопатогенные нематоды - симбиотические бактерии», как к уникальному продукту биологической эволюции. Эти две группы организмов с хорошо прослеживаемыми филетическими связями с другими обитателями почвы, сформировали надорганизменную систему, вступающую в совершенно особые трофические отношения с другими компонентами экосистем (Hunt, 2007). Особый интерес представляет факт двукратного, или даже трёхкратного, с учётом патогенных для наземных моллюсков нематод рода Phasmarhabditis, возникновения в эволюции таких трофических отношений между нематодами и беспозвоночными-хозяевами (Poinar, 1994). Также в пользу актуальности проведенной работы говорит факт широкого использования энтомопатогенных нематод в качестве агентов биологического метода борьбы с вредителями. Применение биопрепаратов на основе нематод в нашей стране не достигло уровня Западной Европы и США, однако изучение биологических особенностей симбиоза энтомопатогенных нематод и их бактерий может способствовать развитию их практического применения и в нашей стране. Так, понимание разнообразия симбиотических бактерий есть необходимая предпосылка к массовой наработке энтомопатогенных нематод, поскольку методы культивирования предполагают использование чистых культур симбиотических микроорганизмов (Gaugler, Han, 2002). Необходимо отметить, что разнообразие симбиотических бактерий родов Xenorhabdus и Photorhabdus на территории Российской Федерации ранее не исследовалось.

Цели и задачи исследования. Целью наших исследований было изучение специфичности связи энтомопатогенных нематод с их симбиотическими бактериями, а также реконструкция эволюционной истории

взаимоотношений между этими бактериями и переносящими их нематодами семейств 81етегпета11с1ае и Не1егогЬаЬ<1к!(1ае.

В задачи исследования входило выделение новых культур почвенных энтомопатогенных нематод, их культивирование и молекулярно-таксономическое определение. Также мы выделяли из энтомопатогенных нематод симбиотических бактерий и исследовали их микробиологическими и молекулярными методами. На основании этих исследований проводилось видовое определение симбиотических бактерий. Данные молекулярно-филогенетического анализа взаимоотношений самих энтомопатогенных нематод, а также их симбиотических бактерий использовали для определения уровня специфичности взаимосвязи этих организмов и путей их ко-эволюции.

Научная новизна. На территории Российской Федерации в различных регионах: на Северном Кавказе, Поволжье, Якутии было выделено 14 культур почвенных энтомопатогенных нематод. Было проведено таксономическое определение этих культур. Полученные от других исследователей 22 культуры почвенных энтомопатогенных нематод из Болгарии, Великобритании, Непала, Кореи, и Китая нами были определены морфологическими и молекулярно-таксономическими методами. Были выделены чистые культуры симбиотических бактерий от 37 культур энтомопатогенных нематод, в том числе от 11 лабораторных культур, выделенных на территории Российской Федерации. Проведено молекулярно-таксономическое определение этих бактерий. Проведён молекулярно-филогенетический анализ таксономического положения обнаруженных в процессе исследований энтомопатогенных нематод и выделенных из них бактерий. На основании молекулярных данных по трём фрагментам ДНК проведён филогенетический анализ взаимоотношений, выделенных нами и ранее описанных бактериальных штаммов, а также специфичности взаимоотношений энтомопатогенных нематод и симбиотических бактерий.

Теоретическое и практическое значение работы.

Полученные нами молекулярно-таксономические данные по нескольким видам почвенных энтомопатогенных нематод дополняют существующие представления о разнообразии этих организмов на территории Российской Федерации и других стран. Сведения, собранные о специфичности взаимоотношений энтомопатогенных нематод и их симбиотических бактерий, дают дополнительный материал для понимания их ко-эволюции и самого феномена возникновения таких симбиотических отношений. Выделенные и сохраняемые штаммы симбиотических бактерий сами по себе могут составлять объект биотехнологических исследований, направленных на разработку новых методов культивирования энтомопатогенных нематод и использования полезных свойств их симбиотических бактерий.

Депонирование нуклеотидных последовательностей нематод и бактерий в Генбанке (NCBI GenBank) представляет собой вклад в создание всемирной базы данных, обеспечивающей надежное определение этих живых организмов.

Апробация работы. Материалы данного исследования были представлены на 2-м международном симпозиуме по энтомопатогенному и микробиологическому контролю в Мугле, Турция в 2009 г., на международной научной конференции «Теоретические и практические проблемы паразитологии» в Москве в 2010 г., на 9-м симпозиуме Российского общества нематологов с международным участием в Петрозаводске в 2011 г., на 7-ой молодежной школе-конференции с международным участие «Актуальные аспекты современной микробиологии» в Москве в 2011 г., на Международной научной конференции «Современные проблемы общей паразитологии» в Москве, в 2012г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи в международных рецензируемых журналах, включённых в базу Web of Science, одна публикация в региональном журнале, входящем в список изданий, рекомендованных ВАК, а также 5 публикаций в других изданиях (материалы научных совещаний и симпозиумов).

Положения, выносимые на защиту.

Уровень специфичности взаимоотношений между симбиотическими бактериями и переносящими их нематодами существенно различается между отдельными эволюционными линиями энтомопатогенных нематод.

Симбиоз энтомопатогенных нематод разных эволюционных линий с микроорганизмами одного бактериального вида может быть объяснён «горизонтальным» переносом симбионтов.

Территория Российской Федерации отличается низким уровнем биологического разнообразия энтомопатогенных нематод (9 видов, в том числе 2 неописанных) и ещё более низким уровнем разнообразия их симбиотических бактерий.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 240 страницах текста и подразделена на введение, 4 главы, заключение и выводы. Диссертация иллюстрирована 46 фотографиями, полученными в сканирующем электронном и световом микроскопе. В текст включено 11 таблиц.

Благодарности. Автор глубоко признателен своему научному руководителю Сергею Эдуардовичу Спиридонову за всестороннюю поддержку и ценные замечания при выполнении и подготовке рукописи. Мы приносим свою искреннюю благодарность всем коллегам, предоставившим нам живые культуры энтомопатогенных нематод для исследований: д-ру Денису Градинарову, главному ассистенту, доктору кафедры зоологии и антропологии биологического факультета Софийского Университета «Св. Климент Охридски» в Болгарии; д-ру Хари Бахадуру Кхатри-Четри из Министерства сельского хозяйства Непала; д-ру Ма Жуан из Академии сельского хозяйства провинции Хэбей в Китае; д-ру Миншаду Ансари из Университета Суонси в Уэльсе, Великобритания; д-ру Франсуазе Николь Нго Канга из Исследовательского центра сельского хозяйства Камеруна; гг. Владимиру Кочеткову, Сергею Климову и Марианне Щетининой, сотрудникам ООО «Биоранта»; д-ру Сольвейг Хаукелавд-Салинас из Института «Биофорск» Министерства сельского хозяйства Норвегии и д-ру Нгуену Ба Хыонгу из Университета Флориды в Гейнсвилле.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. ИСТОРИЧЕСКИЙ ОЧЕРК ИССЛЕДОВАНИЙ ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ НЕМАТОД И ИХ СИМБИОТИЧЕСКИХ

БАКТЕРИЙ

В главе описываются представления об основных компонентах и особенностях комплекса «энтомопатогенные нематоды - симбиотические бактерии». Кратко рассматриваются таксономическое разнообразие энтомопатогенных нематод и связанных с ними симбиотических бактерий. Также дано представление о функциональных механизмах, обеспечивающих существование этой симбиотической связи, как например, смена фаз в развитии симбиотических бактерий, генетические основы подавления бактериями иммунной системы насекомого и колонизации переднего отдела кишечника нематоды-хозяина.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИСЛЕДОВАНИЯ

Глава включает в себя пять разделов, в которых представлены методы сбора материала, выделения новых изолятов энтомопатогенных нематод, изучения морфологии обнаруженных нематод в световом и сканирующем электронном микроскопе, выделения, культивирования и хранения чистых культур симбиотических бактерий. Кроме того, в данном разделе описываются молекулярные методы исследования, примененные для определения изолятов нематод и бактериальных штаммов, а также филогенетические методы анализа полученных нуклеотидных последовательностей. В работе был исследован 41 изолят энтомопатогенных 17 видов нематод рода 81етегпета, в т. ч. 5 изолятов, неопределённых до вида, и 2 изолята от энтомопатогенных нематод рода Не1егогЪаЪ<Ий$ (Таблица 1). Что касается бактериальных штаммов, то от этих нематод нами было выделено 35 штаммов бактерий рода Хепог1гаЬс1№ и 2 штамма бактерий рода Рко1ог}гаЬ(1из (Таблица 2).

Исследование морфологии энтомопатогенных нематод проводилось в основном на стадии инвазионной личинки. В том случае, если по строению личинок нельзя было определить вид или группу видов, к которой относились нематоды, исследовали взрослые особи. Для изучения особенностей строения латеральных полей кутикулы инвазионных личинок использовали сканирующий электронный микроскоп (СЭМ).

Для выделения ДНК нематод использовали наборы фирмы «Promega». В качестве источника ДНК обычно использовали последние фракции при фильтрации взвеси мигрирующих личинок. При этом в осадок попадает значительное количество питающихся взрослых и личиночных стадий. Эти стадии легко и быстро разрушаются под действием протеиназы К, что обеспечивает экстракцию ДНК. Для проведения ПЦР использовали реактивы, входящие в набор фирмы «Силекс» - стерильная вода, 10х буфер для ПЦР, раствор dNTP, TAG-полимераза, праймеры АВ28 (5'-ATA-TGC-TTA-AGT-TCA-GCG-GGT-3') и TW81(5'-GTT-TCC-GTA-GGT-GAA-CCT-GC-3'). ПЦР - продукты реакции отправляли на секвенирование в ЦКП «Геном» («Генотех»),

Для анализа филогении использованы полученные самостоятельно и депонированные в Генбанке NCBI последовательности. Выравнивания получали с помощью программы ClustalX, с использованием программ GenDoc и FORCON их переводили в Nexus-формат и анализировали в программах PAUP*4.0bl0, MEGA5 и MrBayes. Для построения кладограмм применяли методы максимальной парсимонии (maximum parsimony - MP), присоединения соседа (=neighbor-joining - NJ), максимального правдоподобия (= maximum likelihood - ML) и Байесов анализ. Достоверность получаемых после проведения анализа данных филогенетических паттернов определяли по уровню статистической поддержки. При проведении MP, NJ и ML анализа определяли т.н. «бутстрэп-поддержку» (bootstrap), а при проведении Байесова анализа определяли т.н. «обратную вероятность» (posterior probability) с

помощью опции (команды) «sumt», которая и проводила оценку всех полученных и сохранённых деревьев.

Для получения изолированных колоний симбиотических бактерий на твёрдую питательную среду наносили суспензию, полученную гомогенизацией нескольких десятков поверхностно стерилизованным инвазионных личинок нематод. Стерилизацию проводили 2-х часовой инкубацией в 0,1 % растворе мертиолята. Суспензию шпателем распределяли по поверхности среды NBTA. Бактерии рода Xenorhabdus адсорбируют краситель бромтимоловый синий из питательной среды NBTA, образуя голубые колонии, поэтому для дальнейших пересевов были отобраны колонии с характерной голубой окраской. Для получения нуклеотидных последовательностей бактерий готовили бактериальный экстракт, помещая часть колонии для ПЦР в буфер (10 шм Tris -НС1 при рН 8, 1 шм ЭДТА, 1 % Triton Х-100) и нагревая до 95 °С в течение 30 мин. При постановке ПЦР использовались следующие праймеры: BabF 5'-GAAGAGTTTGATCATGGC ТС-3'; BabR 5' -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'; RecA-F 5' -СС A ATG-GGCCGTATTGTTG А-3'; RecA-R 5'-ТС ATACGGATCTGGTTGATGAA-3'; SerC-F 5'-

CCACCAGCAACTTTGTCCTTTC-3,; SerC-R 5' - АА AG A AGC AG-А А А А АТАТ TGCAC-3'. При прямом секвенировании 16S ДНК применяли внутренние праймеры 765R 5'.CTGTTTGCTCCCCACGCTTTC.3' и 704F-R 5'-GTAGCGGTGAAATGCGTAGA-3". Далее проводили очистку бактериального экстракта и отвозили полученные пробы на секвенирование в ЦКП «Геном».

Филогенетический анализ проводили теми же методами, что применялись для последовательностей нематод.

Для хранения полученных бактериальных культур применяли жидкую среду с глицерином в качестве криопротектора. После гомогенизации суспензию бактерий помещали в морозильник с температурой -70 °С.

Таблица 1. Виды нематод, использованные в данной работе.

Вид нематод Происхождение изолятов

БЬетегпета агепапит «Уржум», Россия; «Варна», Болгария

Б1е1пегпета ЫсогпиШт «1/2011», «Земен 2Лр2», Болгария

Б(е1пегпета сагросарзае «Мележа», Россия

БЬетегпета сегШорИогит «40», «Ш», Китай

Б1ететета с1ю1а$ ¡шпаке «БЬК-Ъ), Непал

Я/етегпета со,ч1апсеп$е «Буш-Августа», США

81ететета everesten.se «ВКР-4», Непал

Б(е1пегпета {еШае Изолят из Армении

Б1ететета /еШае «Маган», «Жатай», Россия

Б1етегпета (еШае «Захарово», Россия

БСетегпета /еШае «Шайтан-дере»; «Земен НОГМ», «Катунцы», «Земен Яр7», «Среднагора», Болгария

Б1етегпета /еШае «Камчатка, пляж», «Петропавловск-Камчатский»

81ететета /еШае «Каслувуд», США

Ъгететета /еШае «КЧР-4», Россия

Б1етегпета ЬеШае «М2», «МЗ», «М4», Великобритания

&ететета /еШае «Сен-Бернар», Швейцария

Б1ететета /еШае «Чупа 7», Россия

Б1етегпета кгашз& «Чёрный Верх», «Купена», «Мангарииэ», Болгария

Б1етегпета кгатве1 «Картеш», Россия

Б1етегпета кгаизяег «Маган, берёзы», Россия

Б1етегпета топйсо1ит Изолят из Республики Корея

БСетегпета БскИетаппи «Мекленбург», Германия

Б1ететета $1аткауш «КЬ-1», Непала

81ететета эр. «№ 137», США

Ле/иегиетид эр. «Камерун», Центральная Африка

81ететета эр. «Кедровая Падь 9», Россия

Б1елпегпета ер. «М\У8А», Танзания

Б1ететета Бр. «Троицк», Россия

Steinernema ер. «ЕЕ2», Эстония

Не1егог1гаЬсИИ$ те^сИя «Соттинцы», «Чувашия», Россия

и

Таблица 2. Симбиотические бактерии эитомопатогенных нематод, выделенные

в данной работе и депонированные в Генбанк NCBI.

Вид бактерий Нематода-хозяин № депонирования последовательности 16S

Xenorhabdus sp. «Буш-Августа» Steinernema costaricense 16S - JQ975175

Xenorhabdus sp. «Камерун» Steinernema sp. «Камерун» 16S-KJ413066

Xenorhabdus hominickii «КП 9» Steinernema sp. «КП 9» 16S - KJ413072

Xenorhabdus bovienii «№137» Steinernema sp. «№ 137» 16S-KJ413064

Xenorhabdus nematophilla «Мележа» Steinernema carpocapsae 16S-KJ413073

Xenorhabdus bovienii «Армения» Steinernema feltiae 16S - KJ413065

Xenorhabdus bovienii «Сен Бернар» Steinernema feltiae 16S - KJ413077

Xenorhabdus bovienii «Захарово» Steinernema feltiae 16S - KJ413082

Xenorhabdus bovienii «Эльбрус-31» Steinernema kraussei 16S - KJ413069

Xenorhabdus japónica Steinernema everestense «ВКР-4» 16S - KJ413079

Xenorhabdus bovienii «КЧР-4» Steinernema feltiae 16S - KJ413071

Xenorhabdus bovienii Steinernema cholashanense 16S - KJ413078

Xenorhabdus bovienii Steinernema feltiae «3eMenRp7» 16S - KJ413083

Xenorhabdus bovienii Steinernema feltiae «Чупа 7» 16S - KJ413068

Xenorhabdus stockiae Steinernema siamkayai «KL-1» 16S-KJ413075

Xenorhabdus sp. «MW8A» Steinernema sp. «MW8A» 16S - KJ413074

Xenorhabdus budapustensis Steinernema ceratophorum «№40» 16S-KJ413067

Xenorhabdus bovienii Steinernema sp. «Троицк» 16S - KJ413080

Xenorhabdus bovienii Steinernema feltiae «Камчатка, пляж» 16S - KJ413070

Photorhabdus temperata Heterorhabditis megidis «Чувашия» 16S-KJ413076

Photorhabdus temperate Heterorhabditis megidis «Соттинцы» 16S - KJ413081

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИЗУЧЕНИЯ СИМБИОТИЧЕСКИХ ПАР «ЭНТОМОПАТОГЕННАЯ НЕМАТОДА - БАКТЕРИЯ»

В главе 3 даны краткие описания и морфометрические данные по исследованным изолятам энтомопатогенных нематод. Приведены сведения о тонкой морфологии поверхности нематод, полученные в световом и сканирующем электронном микроскопе. Глава разбита на отдельные пункты, в каждом из которых описывается один изолят. Помимо морфометрических описаний изолятов, рассматриваются результаты анализа нуклеотидной последовательности ITS-участка рДНК представителей этого изолята. Также в каждом пункте даны результаты анализа нуклеотидных последовательностей (как правило, 16S ДНК) симбиотических бактерий в программе BLAST (Altschul et al., 1990).

Глава 4. АНАЛИЗ ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИХ ОТНОШЕНИЙ ИЗУЧЕННЫХ ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ И ИХ СИМБИОТИЧЕСКИХ

БАКТЕРИЙ

4.1. Филогенетические взаимоотношения изученных изолятов энтомопатогенных нематод

4.1.1. Анализ филогенетических взаимоотношений изученных изолятов энтомопатогенных нематод рода Steinernema

В данном разделе описываются результаты филогенетического анализа последовательностей ITS участка рДНК изученных нематод рода Steinernema различными методами: максимальной парсимонии, присоединения ближайшего соседа, максимального правдоподобия и Байесовым методом. Кроме исследованных нами видов в кладограммах присутствуют и виды, последовательности для которых получены из Генбанка NCBI. Для каждой группы видов был определён уровень статистической поддержки.

4.1.2. Анализ филогенетических взаимоотношений изученных изолятов энтомопатогенных нематод рода Heterorhabditis

В данном разделе анализируются филогенетические деревья, полученные для изученных нами двух изолятов энтомопатогенных нематод Heterorhabditis megidis - якутского и чувашского. Для сравнения были использованы последовательности из Генбанка NCBI, оказавшиеся, по результатам BLAST-анализа самыми близкими к полученным нами. Анализ полученных данных был проведен методами максимальной экономии, связывания ближайшего соседа, максимального правдоподобия и методом Байеса. Также был проведён анализ нуклеотидных последовательностей ITS участка рДНК Heterorhadbitis megidis из Чувашии и Якутии в сравнении с последовательностями, полученными для других изолятов этого вида, выделенных на территории Российской Федерации. По нуклеотидному составу этого участка ДНК якутские Н. megidis оказались идентичными изолятам этого вида из Республики Чувашии, Горного Алтая и Новосибирской области.

4.1.3. Генетическая близость выделенных из различных географических точек изолятов энтомопатогенных нематод

Для филогенетического анализа взаимоотношений между видами энтомопатогенных нематод были использованы культуры этих организмов, выделенные нами за последние годы или полученные из других лабораторий. В работе присутствовали представители всех основных эволюционных линий нематод рода Steinernema. Полученный материал позволяет выявить некоторые таксономические связи и оценить генетические дистанции между нематодами, выделенными в разных географических точках. Есть несколько случаев явной генетической близости (установленной по сходству нуклеотидных последовательностей) между изолятами нематод, выделенными в одном регионе мира. Так естественной представляется близость нематод изолятов Steinernema feltiae, выделенных в Болгарии и в Армении. В то же время существуют и обособленные формы Steinernema feltiae. Например, изолят «Сен-

Бернар», выделенный на одноимённом перевале в Швейцарии, пока нигде более не обнаружен. В исследованном нами материале можно выделить и другие примеры близости нематод, обусловленные, скорее всего, единым регионом обитания. Так, выделенные нами нематоды Згетгтета ер. «Кедровая Падь 9» близки к выделенным в Восточной Азии видам штейнернематид группы «топйсоЫтУ): корейскому Б1ететета топйсо\ит и Б1етегпета айсМиете из Японии.

Отмечены случаи генетического сходства изолятов, выделенных в удалённых друг от друга местах. Так изолят 51етегпета /еШае «Чупа 7», выделенный в Карелии объединяется с двумя изолятами этого вида из Якутии. Изоляты 31ететета /еЫае из Уэльса и Болгарии стабильно оказываются в одной группе с заметным уровнем поддержки (84-89%).

В пределах некоторых видов штейнернематид существуют отдельные гаплотипы (особые внутривидовые формы). Как мы выяснили в процессе данной работы, формой близкой к гаплотипу «В2» 81етегпета кгатя^ является изолят этого же вида «Эльбрус-31». В единую группу с уровнем поддержки 99% попадают изоляты 81е'тегпета кгашзе1 из Болгарии, Великобритании, Словении и Карелии.

В процессе работы на территории Уржумского лесничества в Республике Марий-Эл была обнаружена довольно редкая нематода 81е'тегпета агепапит. Анализ последовательностей 1Т8-участка рДНК, полученных от одной особи инвазионной личинки, выявил присутствие двух гаплотипов. Различия между этими гаплотипами составляет 12 п. н. Анализ полученных последовательностей показал, гаплотипы 5. агепапит изолята «Уржум» ближе к рязанскому изоляту 5. агепапит, чем к болгарскому. Филетические связи известных к настоящему времени гаплотипов 5. агепапит представлены на рис. 1.

Анализ полученных нами кладограмм показал, что такие большие группы видов как ^^feltiae-kraussei-oregonense», «а^Гте-ШегтесНит» получают значительно меньшую поддержку по сравнению с более «компактными» по

таксономическому составу эволюционными линиями («тош1со!ит»). По нашему мнению, значительный уровень внутривидовых нуклеотидных различий в пределах вида /еШае является свидетельством более высокой скорости микроэволюционных процессов в этом видовом таксоне. Именно у вида с таким широчайшим распространением могут возникать временные изолирующие механизмы, приводящие к генетическому обособлению отдельных географических групп изолятов. При последующем воссоединении таких обособленных генетически групп и возникают формы штейнернематид с гетероплазмией (сочетанием в одном организме различных копий рибосомальных последовательностей), и в целом повышается уровень внутривидовых различий.

О

8

S. arenarium РФ, "Уржум 1"

S. arenarium РФ, "Рязань"

39

S. arenarium

Болгария, клон 1 и 2 Л s. arenarium

w РФ, "Уржум 3"

Рис. 1. Парсимониальная сеть, отражающая взаимоотношения гаплотипов Steinernema arenarium. Число нуклеотидных отличий между гаплотипами дано на каждой из ветвей. Медианная сеть создана в программе Network 4.6.

4.2. Филогенетические взаимоотношения изученных штаммов бактерий, выделенных из энтомопатогенных нематод

В данном разделе анализируются филогенетические деревья, построенные по результатам проведённого анализа молекулярных данных, полученных для последовательностей 16S ДНК, Ree К (белок, участвующий в

рекомбинации ДНК) и SerC (фосфосерин аминотранфераза) бактерий рода Xenorhabdus и Photorhabdus. В разделе приведены табличные данные по нуклеотидным различиям между исследованными нами штаммами симбиотических бактерий рода Xenorhabdus, а также имеющиеся в свободном доступе в базе данных Генбанка NCBI последовательности 16S, Ree А. и SerC, определенные с помощью BLAST, как самые близкие к полученным.

Анализ нуклеотидных данных по штаммам симбиотических бактерий энтомопатогенных нематод

Данные кладограмм и таблиц дают определенную информацию для понимания биологического разнообразия симбиотических бактерий энтомопатогенных нематод. Все изученные нами штаммы Xenorhabdus bovienii образовывали единую группу при всех видах анализа. Несмотря на то, что этот вид ассоциирован с разными видами энтомопатогенных нематод (Steinernema feltiae, S. kraussei и штейнернематидами группы «afflne-intermedium»), большая часть штаммов X. bovienii, выделенных из нематод разных видов и групп, почти не отличаются друг от друга. И всё же существуют штаммы X bovienii, показывающие значительный уровень нуклеотидных отличий от всех остальных штаммов (на 6-7 и даже на 10 п. н. последовательности 16S ДНК). Еще более заметны отличия отдельных штаммов X. bovienii по последовательностям генов RecA и SerC.

4.2.7. Специфичность симбиотической связи между энтомопатогенными нематодами и их бактериями

Были проанализированы полученные нами и имеющиеся в открытом доступе (литература, международные базы данных) сведения о связях энтомопатогенных нематод и их бактерий (Рис. 2). Как правило, отдельным группам видов нематод соответствует один или несколько близких видов бактерий. Такое проявление специфичности связи нематод и их

симбиотических бактерий соответствует параллельному видообразованию у этих организмов: при обособлении таксонов нематод происходило генетическое обособление и переносимых ими бактерий. Однако, совмещение двух филогенетических деревьев: построенного для нематод семейства Steinernematidae и построенного для их симбиотических бактерий показывает, что наблюдается целый ряд бактериальных симбионтов, показывающих связь с нематодами из разных эволюционных линий рода Steinernema. В ходе наших исследований мы показали связь бактерий Xenorhabdus bovienii не только с Steinernema feltiae, S. kraussei, но также с ранее не изученным в бактериологическом отношении видом S. cholashanense и с изолятом неясной видовой принадлежности (вероятно - новым видом) Steinernema sp. «№ 137» из Небраски, США. Подтверждена в нашем материале, и симбиотическая связь этих бактерий со штейнернематидами группы <f.affine-intermediumv>. Можно предположить, что отношения двух удалённых групп нематод - <<feltiae-kraussei-oregonense» и mffine-intermediumy> - с одним бактериальным видом свидетельствуют о «горизонтальном обмене» бактериальными симбионтами. Определённая экологическая близость нематод этих двух групп могла способствовать такому обмену симбионтами при совместном заражении одного почвенного насекомого инвазионными личинками двух сосуществующих видов. Значительное видовое богатство штейнернематид группы <<feltiae-kraussei-oregonense», а также тот факт, что последовательности Xenorhabdus bovienii занимают терминальные, а не базальные позиции в филогенетическом древе бактерий этого рода, подталкивают к мысли, что обмен бактериями произошел давно и закрепился в эволюции ещё до того, как у штейнернематид произошло бурное видообразование. Есть ещё несколько случаев явной близости симбиотических бактерий у довольно далёких друг от друга нематод: сходство бактерии Xenorhabdus japónica - симбионта видов «kushidai-everestense» и симбионтов Steinernema costaricense; выделение бактерии вида Xenorhabdus hominickii от штейнернематид двух разных эволюционных линий -

Steinernema karii (группа «glaseri») и Steinernema monticolum (группа «monticolum»).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

За время выполнения работы были получены нуклеотидные последовательности ITS- участка (ITS1+5.8S+ITS2) рибосомального кластера ДНК 41 изолята почвенных энтомопатогенных нематод рода Steinernema и 2 изолятов почвенных энтомопатогенных нематод рода Heterorhabditis. Таксономическое положение исследованных изолятов нематод первоначально определяли по совокупности морфологических признаков, а окончательно подтверждали по результатам анализа нуклеотидных последовательностей ITS -участка. Наряду с широко распространенными в Палеарктике видами Steinernema feltiae, Steinernema kraussei, Heterorhabditis megidis были выявлены и редко встречающиеся формы энтомопатогенных нематод. Например, в Республике Марий-Эл, были обнаружены нематоды довольно редкого вида Steinernema arenarium (группа видов «glaseri»), а в Приморском крае -неопределённый до вида изолят Steinernema sp. «Кедровая Падь 9», близкий к японским Steinernema ashiuense.

При обработке материала, полученного от иностранных коллег, молекулярными методами было подтверждено первичное определение по морфологическим признакам видов: Steinernema siamkayai (изолят «KL-1», Непал), двух изолятов Steinernema bicornutum из Болгарии, двух изолятов Steinernema ceratophorum из Китая, Steinernema everestense из Непала.

Представители важной в филогенетическом отношении группы «.affine-intermedium» были представлены в нашем материале изолятами Steinernema sp. из Эстонии и Steinernema sp. из подмосковного города Троицка. Таким образом, в материале, послужившем для изучения коэволюции энтомопатогенных нематод и бактерий, присутствовали представители всех основных эволюционных линий рода Steinernema.

Было проведено изучение нуклеотидных последовательностей генов 16S, RecA. и SerC бактерий рода Xenorhabdus, полученных от изученных нами нематод. Всего за время выполнения проекта было получено 37 последовательностей от этих симбиотических бактерий. Одна из культур нематод (Steinernema sp. из Эстонии) в двух повторных выделениях давала только бактерий рода Providencia, которые не являются симбионтами энтомопатогенных нематод. Все остальные изученные нами изоляты штейнернематид показали симбиотическую связь именно с бактериями рода Xenorhabdus. а две культуры, полученные от гетерорабдитид, оказались штаммами вида Photorhabdus temperata.

Наиболее полные данные были получены для последовательности 16S ДНК. Большая часть последовательностей были получены от штейнернематид группы «felíiae-kraussei-oregonense». Все бактерии, полученные от штейнернематид этой группы, относятся к виду Xenorhabus bovienii. В пределах данной эволюционной группы не наблюдается почти никаких обособленных группировок, за исключением: пары бактериальных штаммов от Steinernema cholachanense из Непала и Steinernema feltiae, выделенной в окрестностях посёлка Чупа в Карелии и трёх штаммов Xenorhabus bovienii от штейнернематид группы <<feltiae-kraussei-oregonense» из Северной Америки. В эту группу со штаммами, выделенными от Steinernema jollieti из США и Steinernema feltiae из Канады, попадает и полученный нами штамм бактерий от нематод Steinernema sp. «№ 137» из Небраски. Этот факт можно толковать как свидетельство в пользу существования штаммов бактерий вида Xenorhabus bovienii, характерных для определенного региона в пределах биогеографической области (Голарктики).

Последовательности гена RecA. были получены для 30 выделенных нами штаммов бактерий рода Xenorhabdus. Как и в анализе по предыдущей последовательности, основную долю полученных нами последовательностей составляют сведения по виду Xenorhabdus bovienii.

100

100х Ч.

77

61

100/ 32 Ю0 100

96

Хт*1/\1<>к11% рпхм'пн

Хичмпн'та С ШЛ. Па-рчика. • \ Уии/и-питча (А/шк 1Ф. \

/11'Ф. Пар «КдчЧ'Льк \ ^иЧш-питш[с¡шит ¡'Ф. Кщнчл&М'Чс]* \ Ьимггмепш I Ф.' Камч-та, и ¡ял." \ г Ф. Кмръ*. :ил. ' Ни и7 • \ Ъкинтти {сЬме С ')*.{Ч15гр

Ь'/еНь-ппиш/¿Ьинг \ЩЧ1'4. С\v.uui щи" Нигмгпеггм¡¿¡¡и* ¡к- нт»<\г,ц "\12 $нтегм*ш {Ли,* ! Ч: I

Уигшггмти /¡ ¡1нне \л*» щк*. "Хаки III Ж* I Ма/цгиппаI»»¡»И4, 11\>ЩI*IКV Рнннтгта крТ

Ъиингтгчи Шни* 'Хлииил"

Ничтчнспш Ajni4.ii т

Хмшгтяш г/нЖнкин-пч' I |»яи I, МП* Ъеимнтм 1г/ппии \,н н (ff.il! *и-ии-тсгш кптьчч 1"Ф. "Ш<1Л«~%Г

Ъигшггпе Ыенн-пи-

%>*1тг/нпн1 Ъанепь-пш

Ыгшмж Ъи-иитпспш

У и-и/,

{Ынтшшп I срмитл ¡».1*1».-К! Ь"

/тпшсЫит К±-\к:Я ■ггШ1Ц>1ь>гит Кк>.*>1 "Ш ггаЬуЬипип КииЙ "ИГ *мт\ипш \ (•лил К1.-Г" {(/гркирыг ГФ/Лк: Iспи «р." К.ЛкТМ1 ' V' ЬииШиГМ'ЛчЛ" 1Ф

^Ьпикчн Ш

\, т» Ын Ь< % и»** | * ■? П ИЛ II <.<< '»* * • \yilfrfl-jf•,}/!* И ! Л/ * \eiutrfhif\lu* »»л/ Л'//,*- Др^мя

ХечтгкЖЖн т?<1 к7/Ля* (•»>'?* -

\ сг/огМч/п* И* Л/ Л7//,*.- (к 'К '

\nHitiutftihniU.4 ¡г</1/»ч-Г' < *1»"г1шМти*,Ч и^ин' )"Ф. "'Чум ? '

Хнн^иМ» И»V/ /«■7^7//' '

Хм/ИиМн Н ■■ St М'" I *

,/,/„> ,м V I":- и ц. «

Лг/*'гМ',/н* НеЛ> А и*;*' <->/(•• < И> V/

(• < Л/ /'■//!,и \'Ф *»^

Х»'1Р*)1н1*,1чъ И<Л/ /<'////<

и к »Л/ /< Ним' I»;'. КлМЧ ГГ

\miduЛ///» К ( Л/ кпмтч I*/' «¿^ч - З < \ffhff// ///.А/* чЬ/ь ПЬИНШ /(¿>«1/11/*

Л»-«////лЛЛ/» и^А). СП /' '

\ituir1iith, (и* и (Л/ птпШ />!шн ^ •{ч.я ' нД/ ьимЬ/ьм ¡кчи - Г ' . I ои/гЬ, !и • и I -V/ У.ГЛ КЛ4 '

\rimriuiilt/* н;Л/, игемгтт 1'Ф. \Upí'/i'/>i 4

/н*г1нён 1ч» и ? V < КтоЙ ''-У *' '

>1; Л> аггии'риптим Кш.М ' *)> « \t4mtluduhi4 «».V/ ьр ¡Г '

100

73

100

ю о

100

,.„/,//■( III

Лг/А'Д'А/.М II (Л/ , \'<1> ; 4

Рис. 2. Филетичсские отношения исследованных видов нематод рода ЯЫпегпепш в сравнении с филогенией их симбиотичсских бактерий рода ХепоНюЬЖ/х. Цветными линиями выделены случаи, рассматриваемые как обмен симбионтами между филстичсски далёкими группами в пределах рода Я/ешепкта,

Анализ совокупности данных по всем трём участкам ДНК показывает единство последовательностей бактериального вида Xenorhabdus bovienii, вне зависимости от того, от какой нематоды был выделен штамм. Симбиоз с бактериями этого вида представителей нескольких близкородственных видов (Steinernema feltiae, Steinernema kraussei, Steinernema cholashanense) представляется доказанным. Важно отметить, что бактерии этого же вида, по молекулярно-таксономическим данным, не отличающимся от основной массы штаммов, выделены также от нематод Steinernema sp. из группы uaffine-intermedum», т.е. эволюционной линии рода, наиболее далеко отстоящей от всех остальных групп видов штейнернематид. Большая часть изученных нами штаммов бактерий относится к описанным видам, для которых имеются последовательности (в основном 16S ДНК) в Генбанке. Поэтому их определение возможно с помощью BLAST, хотя пределы вариабельности этих последовательностей для вида бактерий рода Xenorhabdus, всё ещё следует определить.

Одной из целей нашей работы было изучение коэволюции нематод и бактерий. В связи с этим наибольший интерес для нас представляют не собственно случаи выделения специфичных симбиотических бактерий из различных видов штейнернематид, а исключения из этой специфической связи. Можно выделить случаи, когда филетические связи бактерии находится в очевидном противоречии с таксономическим положением нематоды. Наиболее явный такой случай - связь с Xenorhabdus bovienii представителей двух разных эволюционных линий штейнернематид. Также от штейнернематид двух разных эволюционных линий - Steinernema karii (группа «glaseri») и Steinernema monticolum (группа «monticolum») выделены бактерии вида Xenorhabdus hominickii.

Мы предполагаем, что в данном случае мы сталкиваемся с результатами «горизонтального переноса» бактериального симбионта, передачей его от одной нематоды к другой. Захват бактерий в норме связанных с другим видом

возможен, например, при одновременном заражении одной особи насекомого двумя видами штейнернематид. Обитание в почвах одних и тех же экосистем делает такое совместное заражение одного хозяина вполне возможным событием.

ВЫВОДЫ

1. Наряду с широко распространёнными в Евразии видами, в фауне России отмечаются и редкие формы, отмеченные лишь в нескольких точках на территории Российской Федерации и приуроченные к специфичным для них экосистемам и типам почв (например, Steinernema arenarium). На территории Российской Федерации выявлены формы, которые по данным секвенирования ITS-участка рибосомальных последовательностей, не могут быть отнесены ни к одному из известных видов. К числу таких видов относится изолят Steinernema sp. «Кедровая Падь 9», выделенный нами в заповеднике «Кедровая Падь -Земля леопарда» в Приморском крае, а также широко распространенные представители неописанных видов рода Steinernema из группы «qffine — intermedium».

2. Видовое разнообразие симбиотических бактерий почвенных энтомопатогенных нематод на территории Российской Федерации ниже, чем видовое разнообразие переносящих их нематод, поскольку, по крайней мере несколько видов штейнернематид, относящихся к разным эволюционным линиям в пределах рода (Steinernema feltiae, S. kraussei и Steinernema sp. -неописанный вид из группы «qffine - intermedium») переносят бактерий вида Xenorhabdus bovienii. Наиболее распространённым видом энтомопатогенных нематод семейства Heterorhabditidae на территории Российской Федерации является Heterorhabditis megidis, находящийся в симбиотической связи с бактериями Photorhabdus temperata. По данным секвенирования российские штаммы этих бактерий близки к таковым из западной и центральной Европы.

3. Последовательности löS-фрагмента ДНК бактерий рода Xenorhabdus, позволяют проводить видовое определение этих бактерий, однако дают недостаточно информации для надежного разграничения отдельных штаммов (внутривидовых групп) в пределах распространенных видов. Для выявления различий между отдельными штаммами вида Xenorhabdus bovienii более информативными оказываются последовательности генов RecA (белок, участвующий в рекомбинации ДНК) и SerC (фосфосерин аминотранфераза), дающие иногда количество нуклеотидных различий между отдельными штаммами приблизительно в 5-6 раз большее, чем по результатам секвенирования 16S ДНК. Анализ совокупности данных по всем трём участкам ДНК показывает близость всех штаммов бактериального вида Xenorhabdus bovienii, вне зависимости от того, от какой нематоды был выделен штамм.

4. Характерные для каждого из видов и штаммов последовательности ДНК симбиотических бактерий оказываются ценным дополнением к морфологической и молекулярно-таксономической характеристике видов и отдельных таксономических групп нематод, выявляя как сходство географически удалённых, так и различия, обитающих рядом популяций почвенных энтомопатогенных нематод. Так, по молекулярно-генетическим особенностям бактерии, выделенные из культуры Steinernema costaricense из заповедника «Буш Августа» в штате Миссури, США оказались близки, но не идентичны бактериям, выделенным из вида Steinernema costaricense (Коста-Рика). Сходство бактерий становится дополнительным аргументом в пользу отнесения двух этих изолятов нематод к одному виду, даже при недостаточно полном первичном описании этих нематод.

5. Уровень специфичности симбиотических отношений энтомопатогенных нематод и переносимых ими бактерий существенно различается между отдельными эволюционными линиями рода Steinernema. Так, представители Xenorhabdus nematophila выделяются только из энтомопатогенных нематод вида Steinernema carpocapsae. В то же время есть

виды (Xenorhabdus bovienii, Xenorhabdus hominickii), выделенные к настоящему времени от нескольких видов, относящихся к двум эволюционным линиям рода Steinernema (<<feltiae-kraussei-oregonense» и «affine-intermedium»; «monticolum» и «glaseri», соответственно). Наличие у штейнернематид групп «feltiae-kraussei-oregonense» и «affine-intermedium» симбиотических бактерий одного вида рассматривается как результат «горизонтального переноса» симбионта (перехода бактерий от типичного хозяина к другому виду нематод). Фактором, способствующим такому «горизонтальному переносу», могло быть обитание в сходной среде обитания (почвы умеренного пояса).

6. В процессе работы из нематод рода Steinernema были выделены бактерии, не относящиеся к роду Xenorhabdus-. от Steinernema arenarium, изолят «Варна» (Болгария) были выделены бактерии вида Pseudochrobactrum asaccharolyticum, а от Steinernema sp. изолят «Эстония» - бактерии, принадлежащие к роду Providencia spp. Поскольку и в литературе имеются сообщения о связи этих почвенных Enterobacteriaceae с энтомопатогенными нематодами, мы считаем, что такие представляют собой неспецифичную связь, изредка возникающую и в природных условиях.

7. Впервые на территории Российской Федерации для энтомопатогенных нематод вида Steinernema arenarium выявлено существование двух гаплотипов, различающихся по последовательности ITS участка рДНК. Выявленные гаплотипы не идентичны таковым изолятов Steinernema arenarium, выделенными в других странах Европы.

8. На территории Республики Саха (Якутия) выделены три вида почвенных энтомопатогенных нематод: Steinernema fehiae, S. kraussei и Heterorhabditis megidis. По результатам филогенетического анализа ITS-участка рибосомальных последовательностей этих нематод выявлены их родственные связи с энтомопатогенными нематодами из других регионов РФ и сопредельных стран. Якутские S. feltiae сходны по последовательности ITS участка рДНК с изолятов этого вида из Карелии, а якутские Н. megidis

представляют собой форму широко распространенную по всей территории России, и отличаются по последовательности ITS участка рДНК от группы дальневосточных изолятов («Находка», «Шкотово»). Таким образом, разнообразие родов энтомопатогенных нематод Якутии из почв, залегающих над вечной мерзлотой и подвергающихся полному промерзанию в зимний период, не уступает разнообразию в регионах умеренного пояса Российской Федерации лежащих вне пояса вечной мерзлоты.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

В изданиях, входящих в список ВАК (международную базу WoS):

1. Shepeleva N.S. Characterisation of a new isolate of Steinernema arenarium (Steinernematidae, Rhabditida) from Man El Republic of the Russian Federation / Shepeleva N.S., Efeykin B.D., Spiridonov S.E. // Russian Journal of Nematology.- 2013. - Vol. 21. -№ l.-P. 59-60.

2. Шепелева НС. Энтомопатогенные нематоды Республики Саха (Якутия): видовой состав и филетические отношения / Шепелева Н.С. // Наука и образование. -2013.-№69.-С. 102-106.

3. Shepeleva N.S. Morphological and molecular characterization of Steinernema costaricense Uribe-Lon'o, Mora & Stock, 2007 (Panagrolaimorpha: Steinernematidae) isolate from Bush Augusta State Park, Missouri, USA / Ivanova E.S., Shepeleva N.S., Spiridonov S.E. // Systematic Parasitology. - 2013. - Vol. 85. - P. 219-234.

Публикации в других изданиях:

Shepeleva N.S. Dipteran (Cyclorapha) larvae as 'in vivo' substrate for the propagation of entomopathogenic nematodes / Shepeleva N.S., Pitel E.A., Shinkarev S.M., Spiridonov S.E. // Second International Entomopathogen and Microbial Control Symposium, Mugla, Turkey. - 2009. - P. 84.

Шепелёва H.C. Выделение и молекулярно-таксономическая идентификация бактерий рода Xenorhabdus Thomas and Poinar 1979 (Enterobacteriaceae, Proteobacteria) -симбионтов энтомопатогенных нематод рода Steinernema (Steinernematidae, Rpabditida)

/ Шепелева Н.С. // Материалы Международной научной конференции «Теоретические и практические проблемы паразитологию). Москва - 2010. - С. 431-435.

Шепелева Н.С. Молекулярно-таксономический анализ симбиотических отношений энтомопатогенных нематод рода Steiner пета и бактерий рода Xenorhabdus /Шепелёва Н.С. // Нематоды естественных и трансформированных экосистем. Сборник научных статей. Петрозаводск: Карельский научный центр РАН - 2011. - С. 107-108.

Шепелёва Н.С. Влияние инсектицидных белков Bacillus thuringiensis на бактерий - симбионтов энтомопатогенных нематод / Го Даньян, Шепелёва Н.С. II Материалы VII молодежной школы-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва -2011. -С. 56-58.

Шепелёва Н.С. Молекулярно-таксономическое изучение новых культур энтомопатогенных нематод Heterorhabditis Poinar 1975 из республик Саха (Якутия) и Марий - Эл / Шепелёва Н.С., Ефейкин БД // Материалы Международной научной конференции «Современные проблемы общей паразитологии». Москва -2012. -С. 391395.

Подписано в печать: 06.05.14

Объем: 1,0 п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 238 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинский проспект, д.2 (495) 978-66-63, www.reglet.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шепелёва, Надежда Семёновна, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ПРОБЛЕМ ЭКОЛОГИИ И ЭВОЛЮЦИИ

имени А.Н. Северцова РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

04201458484

Шепелева Надежда Семёновна

ИЗУЧЕНИЕ СИМБИОЗА ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ НЕМАТОД И АССОЦИИРОВАННЫХ С НИМИ БАКТЕРИЙ: БИОЛОГИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ И СПЕЦИФИЧНОСТЬ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ

03.02.11 - паразитология

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: Доктор биологических наук С.Э. Спиридонов

Москва 2014

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 6

Глава 1. ИСТОРИЧЕСКИЙ ОЧЕРК ИССЛЕДОВАНИЙ

ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ НЕМАТОД И ИХ

СИМБИОТИЧЕСКИХ БАКТЕРИЙ 12

1.1. Основные компоненты и особенности

комплекса «энтомопатогенные нематоды -

симбиотическне бактерии» 12

1.1.1. Особенности организации энтомопатогенных

нематод и их положение в системе нематод 12

1.1.2. Жизненный цикл энтомопатогенных нематод 17

1.1.2.1. Особенности жизненного цикла

штейнернематид 18

1.1.2.2. Особенности жизненного цикла гетерорабдитид 19

1.1.2.3. Сравнительный анализ адаптаций

штейнернематид и гетерорабдитид 20

1.1.3. Применение в сельском хозяйстве 22

1.2. Таксономическое разнообразие

энтомопатогенных нематод 24

1.3. Таксономия бактерий, симбиотически

связанных с энтомопатогенными нематодами 32

1.3.1. Неспецифические бактерии энтомопатогенных

нематод 36

1.4. Современные представления о функциональных

механизмах симбиотической системы

«энтомопатогенные нематоды-бактерии» 40

1.4.1. Основные особенности симбиоза

энтомопатогенных нематод и бактерий 40

1.4.2. Смена фаз в развитии симбиотических бактерий

энтомопатогенных нематод 41

1.4.3. Генетические основы подавления

симбиотическими бактериями иммунной системы

насекомого-хозяина 42

1.4.4. Адаптации, обеспечивающие

функционирование симбиотической системы

«энтомопатогенные нематоды - симбиотическне

бактерии» 44

1.4.4.1. Адаптации, обеспечивающие перенос клеток

симбиотических бактерий энтомопатогенными

нематодами 45

1.4.4.2. Бактериальные гены, требуемые для колонизации 49

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИСЛЕДОВАНИЯ 51

2.1. Изучение таксономического разнообразия энтомопатогенных нематод 51

2.1.1. Выделение новых изолятов энтомопатогенных нематод 52

2.1.2. Определение таксономической принадлежности энтомопатогенных нематод 56

2.1.3. Изучение тонкой морфологии поверхности нематод 57

2.1.4. Изучение морфологии энтомопатогенных нематод 58

2.2. Получение нуклеотидных последовательностей энтомопатогенных нематод 59

2.2.1. Проведение полимеразной цепной реакции 60

2.2.2. Очистка полученных продуктов ДНК 62

2.2.3. Метод векторного клонирования 64

2.3. Изучение таксономического состава симбиотических бактерий 65

2.3.1 Выделение чистой культуры микроорганизмов 67

2.4. Получение нуклеотидных последовательностей бактерий 71

2.4.1. Приготовление неочищенного бактериального экстракта для ПЦР 71

2.4.2. Амплификация с помощью ПЦР 16S ДНК 72

2.4.3. Очистка продуктов ПЦР 74

2.5. Хранение культуры симбиотических бактерий 77 Глава 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИЗУЧЕНИЯ

СИМБИОТИЧЕСКИХ ПАР

ЭНТОМОПАТОГЕННАЯ НЕМАТОДА БАКТЕРИЯ 79

3.1 Исследованные виды энтомопатогенных

нематод семейства Steinernematidae и их симбиотические бактерии 79

3.1.1. Steinernema arenarium (Artyukhovsky, 1967) Wouts, Mracek, Gerdin, Bedding, 1982 79

3.1.2. Изученные изоляты Steinernema bicornutum Talossi, Peters, Ehlers, 1995 81

3.1.3. Steinernema carpocapsae (Weiser, 1955) Wouts, Mracek, Gerdin, Bedding, 1982 82

3.1.4. Изученные изоляты Steinernema ceratophorum

Jian, Reid, Hunt, 1997 84

3.1.5. Steinernema cholashanense Nguyen, Puza, Mracek, 2008 85

3.1.6. Steinernema costaricense Uribe-Lorio, Mora, Stock, 2007 86

3.1.7. Steinernema everestense Khatri-Chhetri, Waeyenberge, Spiridonov, Manandhar, Moens, 2011 87

3.1.8. Изученные изоляты Steinernema feltiae (Filipjev, 1934) Wouts, Mracek, Gerdin, Bedding, 1982 90

3.1.9. Изученные изоляты Steinernema kraussei (Steiner, 1923) Travassos, 1927 112

3.1.10. Steinernema monticolum Stock, Choo, Kaya, 1997 117

3.1.11. Steinernema schliemannii Spiridonov, Waeyenberge, Moens, 2010 119

3.1.12. Steinernema siamkayai Stock, Somsook, Reid, 1998 120

3.2. Исследованные энтомопатогенные нематоды, не определенные до вида, и их симбиотические бактерии 123

3.3. Исследованные виды энтомопатогенных нематод семейства Heterorhabditidae и их симбиотические бактерии 134

3.3.1. Heterorhabditis megidis Poinar, Jackson, Klein,

1987 134

3.4. Выделение чужеродных (не симбиотических бактерий) из энтомопатогенных нематод 145

Глава 4. АНАЛИЗ ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИХ

ОТНОШЕНИЙ ИЗУЧЕННЫХ

ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ НЕМАТОД И ИХ СИМБИОТИЧЕСКИХ БАКТЕРИЙ 148

4.1. Филогенетические взаимоотношения изученных энтомопатогенных нематод 148

4.1.1. Анализ филогенетических взаимоотношений изученных изолятов энтомопатогенных нематод

рода Steinernema 148

4.1.2. Анализ филогенетических взаимоотношений изученных изолятов энтомопатогенных нематод

рода Heterorhabditis 157

4.1.3. Генетическая близость, выделенных из различных географических точек изолятов энтомопатогенных нематод 161

4.2. Филогенетические взаимоотношения изученных штаммов бактерий, выделенных из энтомопатогенных нематод 165

4.2.1. Анализ филогенетических деревьев

симбиотических бактерий рода Xenorhabdus, построенных по последовательностям 16S 165

4.2.2. Анализ филогенетических деревьев симбиотических бактерий рода Xenorhabdus, построенных по последовательностям гена Ree А 177

4.2.3. Анализ филогенетических деревьев симбиотических бактерий рода Xenorhabdus, построенных по последовательностям гена SerC 186

4.2.4. Анализ филогенетических деревьев симбиотических бактерий рода Photorhabdus, построенных по последовательностям 16S 189

4.2.5. Нуклеотидные различия между штаммами симбиотических бактерий рода Xenorhabdus 189

4.2.5.1. Нуклеотидные различия между штаммами Xenorhabdus bovienii по последовательности 16S

ДНК 191

4.2.5.2. Нуклеотидные различия между штаммами видов Xenorhabdus: X. kozodoii, X. stockiae, X. ehlersii, X. griffinae и X. budapestensis по последовательности

16S ДНК 194

4.2.5.3. Нуклеотидные различия между штаммами видов Xenorhabdus: X. nematophila, X. miraniensis, X szentirmai, X. mauleonii, X. doucetiae, X. beddingii, X. cabanillasi, X. hominickii, X. koppenhoeferi и X. japónica по последовательности 16S ДНК 196

4.2.5.4. Нуклеотидные различия между штаммами вида Xenorhabdus bovienii по гену Ree А 198

4.2.5.5. Нуклеотидные различия между штаммами видов Xenorhabdus: X. stockiae, X. budapestensis, X. japónica, X. beddingii, X. ehlersii, X. griffiniae, X. romanii, X. kozodoii по гену Ree A 200

4.2.5.6. Нуклеотидные различия между штаммами видов Xenorhabdus bovienii, X. budapestensis, X. stockiae,

X. kozodoii по гену SerC 202

4.2.6. Анализ нуклеотидных данных по штаммам симбиотических бактерий энтомопатогенных нематод 202

4.2.7. Специфичность сим биотической связи между энтомопатогенными нематодами и их бактериями 206

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 211

ВЫВОДЫ 214

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 218

ВВЕДЕНИЕ

Нематоды (класс Nematoda) обитают на нашей планете почти повсеместно. В процессе эволюции многие, первично свободноживущие нематоды превратились в паразитов животных и растений. Особое место среди нематод занимают т.н. энтомопатогенные нематоды, относящиеся к двум семействам отряда Rhabditida: штейнернематиды (сем. Steinernematidae) и гетерорабдитиды (сем. Heterorhabditidae). Личинки этих нематод проникают в полость тела различных насекомых, где и развиваются во взрослых особей, порождающих следующее поколение личинок. Представители этих двух семейств находятся в симбиотической связи с бактериями двух разных родов: Xenorhabdus и Photorhabdus (соответственно), размножение которых в полости тела насекомого и является непосредственной причиной гибели насекомых. Само существование энтомопатогенных нематод было научно описано лишь в XX веке, хотя довольно точные описания их находок приводились натуралистами и в XIX веке (Мечников, 1879). Первые научные описания этих нематод связаны с именем Г. Штейнера, который описал два (валидных и по сей день) вида этих нематод из Германии (Steiner, 1923) и США (Steiner, 1929). Первое описание энтомопатогенной нематоды из России принадлежит Ивану Николаевичу Филипьеву (Filipjev, 1934), заложившему основы исследований по нематодам в нашей стране. Описанная им нематода Steinernema (syn. Neoaplectana) feltiae оказалась самой распространенной энтомопатогенной нематодой на Земле и эффективным регулятором численности почвенных насекомых. Понимание тонких биологических механизмов существования энтомопатогенных нематод пришло позднее. В 30-е годы XX века Проспер Бовьен (Bovien, 1937) первым заметил присутствие палочковидных бактерий в инвазионных личинках штейнернематид, но лишь Джордж Пойнар Младший и его сотрудники

доказали особую важность бактерий в жизнедеятельности энтомопатогенных нематод (Poinar, Thomas, 1966). Было показано, что бактерии обеспечивают гибель насекомого после проникновения в него личинок энтомопатогенных нематод, обеспечивают трансформацию содержимого хозяина в питательный субстрат и защиту развивающегося очага нематод от других компонентов почвенной биоты. Энтомопатогенные нематоды оказались довольно разнообразными. Каждый год описывают все новые виды этих нематод. И всё же многие стороны функционирования этой симбиотической системы остаются не изученными. Недостаточной остается и исследованность этих организмов на территории Российской Федерации.

Актуальность исследования. Актуальность проблемы исследования определяется несколькими моментами. Значительный интерес к сим биотическому комплексу «энтомопатогенные нематоды -симбиотические бактерии» как к уникальному продукту биологической эволюции. Две группы организмов с хорошо прослеживаемыми филетическими связями с другими обитателями почвы, сформировали надорганизменную систему со сложными адаптациями, вступающую в совершено особые трофические отношения с другими компонентами экосистем (Hunt, 2007). Особый интерес представляет факт двукратного, или даже трёхкратного, с учётом патогенных для наземных моллюсков нематод рода Phasmarhabditis, возникновения в эволюции таких трофических отношений между нематодами и беспозвоночными (Poinar, 1994). Также в пользу актуальности проведенной работы говорит и факт широкого использования энтомопатогенных нематод в качестве агентов биологического метода борьбы с вредителями. Применение биопрепаратов на основе нематод в нашей стране ещё не достигло уровня Западной Европы и США, однако изучение биологических особенностей симбиоза энтомопатогенных нематод и их бактерий может способствовать развитию их практического применения и в нашей стране. Так, понимание

разнообразия симбиотических бактерий есть необходимая предпосылка к массовой наработке энтомопатогенных нематод, поскольку все эти методы предполагают использование чистых культур симбиотических микроорганизмов (Gaugler, Han, 2002). Необходимо отметить, что разнообразие симбиотических бактерий родов Xenorhabdus и Photorhabdus на территории Российской Федерации ранее не исследовалось. Изучение биологического разнообразия энтомопатогенных нематод и их бактерий связано также с оценкой специфичности этих симбиотических отношений.

Цели и задачи исследования. Основной целью наших исследований было изучение специфичности связи энтомопатогенных нематод с их симбиотическими бактериями, а также реконструкция эволюционной истории взаимоотношений между этими бактериями и переносящими их нематодами семейств Steinernematidae и Heterorhabditidae.

В задачи исследования входило выделение как можно большего числа новых культур почвенных энтомопатогенных нематод, их культивирование и молекулярно-таксономическое определение. Также мы выделяли из энтомопатогенных нематод симбиотических бактерий и исследовали их микробиологическими и молекулярными методами. На основании этих исследований проводилось видовое определение симбиотических бактерий. Данные молекулярно-филогенетического анализа взаимоотношений самих энтомопатогенных нематод, а также их симбиотических бактерий использовали для определения уровня специфичности взаимосвязи этих организмов и путей их ко-эволюции.

Научная новизна. На территории Российской Федерации в различных регионах: Северный Кавказ, Поволжье, Якутия было выделено 14 культур почвенных энтомопатогенных нематод. Было проведено таксономическое определение 11 из этих культур, по трем культурам данные получить не удалось. Полученные от других исследователей 26 культур энтомопатогенных нематод из Болгарии, Великобритании, Непала, Кореи,

Китая поддерживались во время выполнения работы в лаборатории систематики и эволюции паразитов, и поддерживаются до сих пор. Из них 22 культуры нами были определены морфологическими и молекулярно-таксономическими методами. Были выделены чистые культуры симбиотических бактерий от 37 культур энтомопатогенных нематод, в том числе от 11 лабораторных культур, выделенных на территории Российской Федерации. Проведено молекулярно-таксономическое определение этих бактерий. Проведен молекулярно-филогенетический анализ таксономического положения обнаруженных в процессе работы энтомопатогенных нематод. На основании молекулярных данных по трём фрагментам ДНК проведён филогенетический анализ взаимоотношений, выделенных нами и ранее описанных бактериальных штаммов. По полученным данным проведён анализ специфичности взаимоотношений энтомопатогенных нематод и симбиотических бактерий.

Теоретическое и практическое значение работы.

Полученные нами молекулярно-таксономические данные по нескольким изолятам почвенных энтомопатогенных нематод дополняют существующие представления о разнообразии этих организмов на территории Российской Федерации и других стран. Сведения, собранные о специфичности взаимоотношений энтомопатогенных нематод и их симбиотических бактерий, дают дополнительный материал для понимания их ко-эволюции и самого феномена возникновения таких симбиотических отношений. Выделенные и сохраняемые штаммы симбиотических бактерий сами по себе могут составлять объект биотехнологических исследований, направленных на разработку новых методов массового культивирования энтомопатогенных нематод и использования полезных свойств их симбиотических бактерий.

Депонирование нуклеотидных последовательностей нематод и бактерий в Генбанке (ЫСВ! ОепВапк) представляет собой вклад в работу по

созданию всемирной базы данных, обеспечивающей надежное определение этих живых организмов.

Апробация работы. Материалы данного исследования были представлены на II международном симпозиуме по энтомопатогенному и микробиологическому контролю в Мугле, Турция в 2009 г., на международной научной конференции «Теоретические и практические проблемы паразитологии» в Москве в 2010 г., на IX симпозиуме Российского общества нематологов с международным участием в Петрозаводске в 2011 г., на VII Молодёжной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» в Москве в 2011 г., на Международной научной конференции «Современные проблемы общей паразитологии» в Москве в 2012 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи в международных рецензируемых журналах, включенных в базу Web of Science, одна публикация в региональном журнале, входящем в «список ВАК», а также 5 публикаций в других изданиях (материалы научных совещаний и симпозиумов).

Положения, выносимые на защиту.

Уровень специфичности взаимоотношений между симбиотическими бактериями и переносящими их нематодами существенно различается между отдельными эволюционными линиями энтомопатогенных нематод.

Симбиоз энтомопатогенных нематод разных эволюционных линий с микроорганизмами одного бактериального вида может быть объяснён обменом симбионтами между представителями эволюционных линий нематод.

Территория Российской Федерации отличается низким уровнем биологического разнообразия энтомопатогенных нематод (около 8-9 видов, в том числе 2-3 неописанных) и ещё более низким уровнем разнообразия их симбиотических бактерий.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 240 страницах текста и подразделена на введение, 4 главы, заключение и выводы. Диссертация иллюстрирована 46 фотографиями, полученными в сканирующем электронном и световом микроскопе. В текст включено 11 таблиц.

Благодарности. Автор глубоко признателен своему научному руководителю Сергею Эдуардовичу Спиридонову за всестороннюю поддержку и ценные замечания при выполнении и подготовке рукописи. Мы приносим свою искреннюю благодарность всем коллегам, предоставившим нам живые культуры энтомопатогенных нематод для исследований: д-ру Денису Градинарову, главному ассистенту, доктору кафедры зоологии и антропологии биологического факультета Софийского Университета "Св. Климент Охридски" в Болгарии; д-ру Хари Бахадуру Кхатри-Четри из Министерства сельского хозяйства Непала; д-ру Ма Жуан из Академии сельского хозяйства провинции Хэбей в Китае; д-ру Миншаду Ансари из Университета Суонси в Уэльсе, Великобритания; д-ру Франсуазе Николь Нго Канга из Исследовательского центра сельского хозяйства Камеруна; гг. Владимиру Кочеткову, Сергею Климову и Марианне Щетининой, сотрудникам ООО «Биоранта»; д-ру Сольвейг Хаукеланд-Салинас из Института «Биофорск» Министерства сельского хозяйства Норвегии и д-ру Нгуэну Ба Хыонгу из Университета Флориды в Гейнсвилле.

Глава 1. ИСТОРИЧЕС