Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка экспрессивной системы на основе вируса ядерного полиэдроза Malacosoma neustria и клеток Anteraea pernyl линии МСАр-1

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Разработка экспрессивной системы на основе вируса ядерного полиэдроза Malacosoma neustria и клеток Anteraea pernyl линии МСАр-1"

- ' РГ5 ОД РГБ ОД

13 г

1 ^ п >

' ' ' НАЦИОНАЛЬНА АКАДЕМ1Я НАУК УКРА1НИ

1НСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНО! Б10Л0ГП ТА ГЕНЕТИКИ

На правах рукопису УДК 575 +578.663.1

К1ХНО 1РИНА МИХАИЛ1ВНА

Р03Р0БКА ЕКСПРЕСИВН01 СИСТЕМИ НА ОСНОВ1 В1РУСУ ЯДЕРНОГО ПСШ1ЕДР03У Ма1асозст пеизЬПа ТА КЛ1ТИН Ап1егаеа регпу1 Л1Н1Г МСАр-1

Спец1альн1сть 03.00.03 - молекулярна бЮлоПя

Автореферат . дисертацп на здобуття наукового ступени) кандидата СЮлоПчних наук

Ки1в - 1995

Дисертац1ею е рукопис.'

Робота виконана у в1дд1л1 61ох1м1чно1 генетики ¡нституту молекулярно! б!олог1I i генетики HAH Укра1ни.

Науковий кер1вник - кандидат 61олог1чних наук Л.I. Строковська

0ф1ц1йн1 опоненти - доктор б1олог1чних~наук Е.А. Козлов

кандидат бЮлоПчних наук О.Ы.Живолуп

Пров1дна орган1зац1я - Ки1вський державний ун1верситет 1м. Т.Г. Шевченка

зас1данн1 спец1ал1зовано1 ради Д.016.11.Ol Iнституту молеку-лярно1 б1олог11 та генетики HAH Укра1ни за адресою: 252143, Ки1в-143, вул. Заболотного, 150.

3 дисертац1ею можна ознайомитися в б!бл1отец1 1нституту молекулярноI б1олог11 та генетики HAH Укра1ни аа адресою: 252143, Ки1в-143, вул. Заболотного, 150.

Автореферат роз!слано "¿У" igg5 р

Захист в!дбудеться

2

1995 р. о 'HZ._ год. на

Вчений секретар спец1ал1зовано1 ради, кандидат б!олог1чних наук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ АктуальнЮть проблеш. На сьогодн!шн1й день в усьому cbítI прид1ляеться велика увага питанию одержання рекомб!на-нтних б1лк1в за допомогою сучасних б1отехнолог1й. Вид1лення багатьох б1лк1в 1з природних джерел утруднене, характеризуется низьким виходом продукту або погребуе значних матер1а-льних витрат. В таких випадках бЮтехнологП на ochobI експ-ресивних систем р1зного походження е б1льш дешевими, менш трудом1сткими, а часом,! единими методами одержання певних 61лк1в. Поряд а 1ншими причинами саме в1дставання у розвитку 1 впровадженн1 сучасних бЮтехнолоПй спричинило р1зке вни-ження р1вня науково! 1 практично1 медицини 1 с1льськогоспо-дарського виробництва в Укра1н1. 0дн1ею з галузей бЮтехнологП, яка дозволяв одержувати б1лки piaHoro походження, е бакулов!русна система експресП, що, починаючи з 1984 року, широко використовуеться на Заходi ELuskow,19883. Найб^льш використовуваною бакулов^русною системою е система, що базу-еться на Bipyci ядерного пол1едрозу (ВЯЛ) Autographe cal ifornica [Milier, 19883. KpiM того, як продуцента рекомбтантних б1ЛК1В, знаходять застосування ВЯЛ Bombix morí ÍMiyajima, 19873, ВЯЛ Gallería melonella [Щелкунов,19903, ВЯЛ Lymantria dispar [Yti,19923.Сл1д в1даначити, що в1тчизняних аналог 1 в бакулов1русних систем, як1 використовуються на Заход1, на сьогодн1шн1й день немае. 1нтерес до вищезгадано! системи зу-мовлений деякими П особливостями, як1 дозволяють перемогти обмеження, притаманн! 1ншим системам експресП (др1жджов1й, прокар1отичн1й, системам л1н!й кл1тин ссавц1в). KpiM того, бакулов1русна система експресП може слугувати джерелом ви-сокоефективних инсектицидiв,нешкiдливих для людини i тварин,

що е особливо актуальним в сучасшй загостренШ еколоПчН1Й обстанонц! [МеггеуиеШег, 199СИ.

Щль роботи. За мету дано1 роботи було поставлено розроб-ку ново! бакулоЕ1русно! системи експресП на основ 1 ВЯЛ Ма.1-асозота пеиз(л-1а (Мп) (клльчастого шовкопряду) 1 шитик Ап-1егагеа регпШ (дубового шовкопряда) лшП МСАр-1. Для досягнення поставлено! мети необх1дно було вир1шити так1 за1 вдання:

1. Локал1зувати ген пол1едрину в геном! ВЯЛ М.пеиз1г1а, проанал1эувати посл1 довнють нуклеотщив промоторно1 1 коду-ючо1 облает1 даного гену.

2. Створити сер1ю транспортних вектор1е на основ1 плазм1-дно! ДНК 1 фрагменту генома ВЯЛ Мп а геном пол1едрину.

3. Клонувати в одержаних векторах модельний ген р -галак-тозидази, проанал1зувати його експресш в прокарютичн^й систем! .

4. Ввести ген^3-галактозидази в геном ВЯЛ Мп, локал1зува-

ти м1сце його 1нтеграц11 у в1русний геном.

/

5. Одержати очищен1 клони рекомб1нантних в!рус1в.

6. Проанал1зувати р1вн1 експресП р -галактоэидаэи в систем! кл1тин дубового шовкопряда. '

Наукова новизна 4 практична тюасть роботи. Створено нову систему експресП на основ! ВЯЛ Мп 1 кл 1 тин МСАр-1. Це перша в1тчизняна бакулоырусна система експресП, що в кроком у напрямку створення вйсокоефективно! бютехнологп для одержання рекомбанантних б^лкпв р1зного походження. 0ск1льки к1льклсн1 1 якюн! характеристики рекомб 1 нантних продукт1 в бакулов^русних систем експресП можуть суттево р1знитися в залежност1 В1Д того, який хазя!н г який вектор

використовуеться CWickham,1993], для кожного б!лку можна пшбрати систему, де щ показники будуть оптимальними. Тому •кожна новостворена система, зокрема i описувана в дангй робот:.розширюе коло можливостей по одержанню певних б1ЛК1В i пептидiB.

Апробация роботи. Результата роботи докладалися i обгово-рювалися на ceMiHapax 1нституту молекулярно1 бюлоги i генетики HAH Укра1ни.

Оьобистий внесок автора. В дисертац1йН1й робот! наведено результата екепериментальних досл1джень, виконаних безпосере-дньо автором.

Публ1кац1I. За матер1алами дисертацП опубЛ1Ковано 3 роботи.

Структура i об'ем дисертацИ. Дисертац1Я складаеться 1з Уступу, огляду лиератури, експериментальноI частини та II об говорения, BiicHOBKiB, списку л^тератури. Об'ем дисертацП Hl. CT0piH0K, список лиератури включаеЛУнайменувань. ДисёртаЩя включав малюнк i в, EMi щених в текстi, ¿Г таблиць.

МАТЕРIАЛИ ТА МЕТОДИ Д0СЛ1ДЖЕНЬ

BipycHy ДНК видiляли, користуючись стандартною методикою [Черепенко,1985] з привнесениям деяких модиф1кащй.' Плазм^д-ну ДНК в препаративних к1лькостях вид¿ляли за методом основного Л1зису, користуючись пособником фгрми Promega CPromega Cataloque, 1986], е анал1тичних К1ЛЬК0стях - за Шаниатис, 1984]. Ген пол^едрину локал1зувайи за допомогою методу ri6-ридизацИ, описаному в [Summers, 1987]. Пошук рекомбшантних клонiв KJiiTHH E.coli зд1йснювали, користуючись методом пбр-идизацП in situ [Маниатис,1984]. Виявлення i розчистку ре-комб i нантних в^русних клонiв проводили за допомогою методу

дот-ПбридизацП [Summers, 1987]. Включения мики в ДНК для одержання радюактивних зонд1в зд1йснювали за допомогою нес-пециф1чно1 posciHHOI затравки [Feinberg,19843. Рестрикщйну переварку ДНК, лтрування, вид1лення фрагментiв ДНК а гел1В здайснювали за [Maniatis,19843.Для приготування компетентних кл¿тин використовували метод, описаний в [Nishimura,19903. Сайти рестрикцП видаляли за допомогою методу неповних переварок [Маниатис,19843. зичне картування ДНК проводили эа методом cyMiсних переварок Шаниатис", 19843. Модиф^кацЛ в транспортн1 вектори вносили за допомогою поЛ1Меразно1 ланцю-гово! pearaui ССаики, 19903. Роздиення б1лк1в проводили за допомогою електрофорезу в полi акрилам i дному гел1 в денатуру-ючих умовах [Laemmly,19723, фрагментов ДНК - за допомогою електрофорезу в 0.8% агарозному гел! з використанням трис-боратного буферу [Ыаниатис,19843. Вимiрювання piBHiB актив-Hocri р -галактозидази зд1йснювали за Шиллер, 19773. Котран-сфекцш кл1тин комах ' вирусном i плазм1дною ДНК, одержання в1русних бляшок в M0H0mapi кштин комах ЕД1йснювали 'ва [Summers, 19873.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРИЛИ Локалаащя гену пол!едрину в геном i ВЯЛ Мп. Як було показано ран1ше в роботах нашо! лабораторП, ВЯЛ Мп ефективно розмножуеться в культур1 кл1тин МСАр-1 (Скуратовська, 1985). Висока продуктивн1сть дано! системи хазя1н-в1рус дозволила нам взяти II за основу при робот1 над створенням бакулов1ру-сно! системи експресП для одержання гетеролоПчних 61лк1в р1зного походження. Для виконання поставленого завдання нео-6x1дно було локал1зувати ген пол1едрину в геномi ВЯЛ Мп. Для

- Б -

цього ми використали як зонд плазм1ду pOMS-Q, яку було нада-но нам лабораторию Рормана (Rohrman,1982). II Q-фрагмент являе собою д1лянку ДНК ВЯЛ Orgyia pseudotsugata з геном по-л1едрину.Блот-г1бридизац!я рестриковано1 в1русно1 ДНК в 32P-Q -фрагментом плазм!ди pOMS-Q показала наявн!сть 3-х Sali-, 4-х EcoRl-, 3-х Xhol-, 3-х PstI- i 4-х Hindi I I-фрагмент i в BlpycHoI ДНК, яка Пбридизуеться з зондом (мал.1). Як було показано, наявн^сть велико! kíлькоси фрагмент!в, що пбридиауються э зондом, обумовлене гомолог i ею областей, що фланкують ген пол1едрину в ДНК ВЯЛ Mn 1 ДНК ВЯЛ 0.pseudotsugata. Було зроблено висновок про те,що при використанн! зонду на основ! плазм1ди pOMS-Q можливе лише ор1ентовне визначення м!сця розташування гена пол1едрину в одному або к!лькох з' певно1 к1лькост1 фрагмент1в, як1 Пбридизуються з зондом. Для точно1 локшнзащ I гену використали Q-фрагмент як зонд не прямо, а опосередковано через фрагмент генома ВЯЛ Galleria melonella. Як було показано ран1ше в роботах нашо! лабораторП, ДНК ВЯЛ Мп мае лише 5Z гомолог!I в ДНК ВЯЛ Q. melonella. Фрагмент ДНК цього Blpycy, який включае ген пол1едрину, було виявлено за допомогою блот-г!бридизад1I рестриковано1 ДНК Blpycy з 32P-Q -фрагментом (мал.2). Найменший HindiII-R-фрагмент, який г1-бридизуеться з зондом розм1ром 1 т.п.н., було використано як зонд для виявлення гена пол1едрину в геном! ВЯЛ Мп.

За результатами блотибридизащ I рестриковано! ДНК ВЯЛ Мп з радшактивяим вондом на ochobí Hindin-R-фрагменту ВЯЛ G. melonella (мал.З) м1сцеэнаходження гена пол1едрину нами було сп!вв1днесено з одним 1з фрагмент!в ДНК Blpycy Мп,оброблено1 рестриктазами BglII, Smal, Salí, EcoRI, Hindi 11, PstI.

Б .1

2 3 4 ,5

т- f.

.f'f-r-ii

V* -Л"

л»

I"

О

t> ftn-

f.) M

Maa.l. Г1бридизад1я ДНК ЕЯП M.neustria, рестри-кованоI ферментами: Sali (1); EcoRI (2); XhoI(3); Pstl(4);HindI11(5) з 32P -ДНК Mn (A) i 32P-pOMS-Q (Б). Крапками на мал.А в1дм1чено фрагмент», як1 Пбридизуються з 32Р -p-OMS-Q.

А В

■i1. 2 3.4 R 6 7 1 2 3-4 '5 .6 7

•h

Nte'WimiSthi

О

о

ИМ)!«»«

m^.Lm

Мал.2. Г1бридизац1я ДНК ВЯЛ G.melonella, рестри-ковано1 ферментами: Slal (1); SalI(2); EcoRV(3); Hindi11 (4) ; Pstl(5) i ВашНЦб); Smal(7) з 32P-ДНК Qu (А) 1 32P-pOMS-Q (Б). Крапками на мал.А в1дм1чено фрагмента, як1 г1бридизуються з 32Р -p-OMS-Q.

A g Мал.З. Електро-

123 45 6789 10 311 23466789 1011. — - — --------- --------фореграма рест-

рикоЕано! ДНК ВЯЛ Mn(A) 1 блот -Пбридизац1я niel ж ДНК з 32Р-HindIII-R -фрагментом BfflIGm (Б). ДНК рестрикована ферментами:BglII С1);Neo1(2);SmaI (3); Sali (4) ; EcoRI (5) ¡Xl'iol (7) Hindi II CS); Pstl (9) ; Kpnl (10); BamHI(ll). (6) -

маркерна ДНК фага X . На мал.А крапками в1дм1чено фрагменти, що Пбридизуються з 32P-HindI IIR-фрагментом.

Колен з цих фрагмент1в м1г бути використаний для констру-юзання транспортного вектору за умови.що ген пол!едрину зна-ходиться в центральна облает 1 фрагменту i фланкований до-сить допгими областями Blpycuol ДНК (в1дсутн1сть досить дов-гих фрагмент Bipycuol ДНК а одн1е1 або обох сторШ в:д гену пол1едрину обмежуе в^роидшеть peiiOMOiHauiI Mix транспо-ртним вектором i Bipycuoio ДНК). Ми обрали EcoR-A 1 Hind III -J-фрагменти для подалыгаго клонування 1х в плазм1д1, припустивши, що хоч один з них Суде в!дпов1дати вищезазначеним ви-могам.

Клонування фрагменту ДНК ВЯЛ Мп з геном пол!едрину.ЕсоЯ!-А- фрагмент (18.2 т.н.п.) 1 ШпсИП J-фpaгмeнт (4.9т.н.п.) було проклойовано в плазм1д1 рВЙ325. В результат1 було одержано плазм!ди рМЕ-А 1 рМН-.Ь в1дпов1дно.

Ф1зичне картування цих плазм:д показало що вмцезазначеним вимогам вхдпов^дае рМЕ-А (мал.4). Центральне розташування гена пол1едрику 1 достатня протяжн!сть фланкуючих ген в!русних фрагмент1в дозволили нам розглядати плазм1ду рМЕ-А як основу для створення транспортного вектора.

ЛокаЛааШя промоторно! облает 4 гену пол!едрину. анал1з II нуклеотилно! поел!довност!. Для того щоб, клонувати гетероролог1чн1 гени в транспортному вектор! п1д контролем промотору гена пол1едрину, нам необх1дно було визначити локал!зац1ю цього промотора в ген!. В наш1й лабораторП було проведено с1квенс Вг1П-ВашН1 фрагменту ДНК плазм1ди рМЕ:--А' в геном пол!едрину(мал.5). Анал!а промоторно! облает! гену демонструе, що в положены 1 -50в1д 1н1ц!юючого трансляц!ю ко дону энаходиться 12-членна консервативна нуклеотидна посл!-довн1сть,характерна для вс1х п1зн1х 1 дуже п1зн!х промотор!в бакулов1русних ген!в (Ио!1гтап,1986). 3 не1 починаеться 1н1-ц!ац1я транскрипцП. Проведено пор1вняння л!дерно1 поел!дов-ност1 гену шшедрину ВЯЛ Мп ! в^дпов^дних посл!довностей гензв тшедрин!в 13 р^зних ВЯЛ. Найвищий ступень гомологи спостер1гаеться з лхдерною посл1дов!пстю ВЯЛ МатезЬгае Ьгазз1сае ( сшвладання нуклеотид1в по 41 позицп ¿з 47). 3 л1дерною посл1довн!стю гену полЩедрину А.саНГогШса в!дсо-ток гомологи дещо нижчий (сп!впад1ння нуклеотид1в по 28 по-зиц!ях з 48). При цьому посл1довн1сть Мм е б1льш АТ-збага-ченою (90% АТ-пар) у П0р1внянн1 з 5'-некодуючою областю ге-

EcoRI

feg Iii

PBR325

BamHi

KP11I HindiII

крщ

EcoRI

Sail

Sali

"indllI

Kpnl —

/Памп I ' Hind I n Fsu

Мал.4." Знзична карта рНЁ-А. Штриховою jnHleio позначено ople-нговну локал1зац1ю гену пол1едрину.

ну ггсипедрину ВЯЛ Ас (80% АТ-пар). Консенсусна поел!довн1сть нуклеотид1в в. облает! ATG-кодону аналог1чна консенсусним посл1довностям 1шшх бакулов1рус1в CRohrman,19863 з А.в -3 положений. 1 Т в +4-положенн1. В -28 положёнШ в1д точки 1н1ц1ац11 транскрипцП знаходиться канон1чна посл1довн1сть' блоку Хоггнеса. В положенаi -85 знаходиться СААТ-под1бна посл1довн1сть.

Одержання транспортного вектора для клонування гетероло-Нчних ген!в в кодуюч1й облает! гену пол1едрину ВЯЛ Мп. С1к-Еенс гена пол1едрину дозволив ор1ентувати ген на карт1 плазм1ди рМЕА. Локал1зац1я сайт1в для р!зних рестриктаз в кодуюч1й облает! гена пол1едрину дозволила розглядати плазм!ду рМЕ-А як транспортний вектор для клонування гетеролог!чних ген1в ва вищезгаданими сайтами. Проте рМЕ-А мае великий розм!р-24,2т.п.н.. Кр!м того, вона мае додатков!

- 10 -

-220 ,.-210 -200 -190 -180 . 5'-ГТЦЦГГТГТТЦАААГАДГАЦАААААТАТГТТГЦГТАГТГААЦГТТТААТТТТТАААА -170 ;. -160 -150 -140 -130 -120 ЦАЦТГТАЦАТПТЦААГТЦАЦМАТГАГЦЦААГГЦГЦГЦГГЦГГАТЦГТТТАТААГТЦАТ -110 -100 -90 ' -80 -70 -60

ЦГЦЦГЦТЦГЦАЦГЦАЦАЦАТЦГТААЦААТГТААААТТАТААТТАТАЦГЦТЦАЦАТАЦАЦА -50 -40 -30 -20 -10

ГАТАМТАТТТТТАТТЦТТТЦГТАААААААТТАГАААААТААААТАТААА АТГ TAT трп арг тир сер тир асн про трп лей глу арг трп тир вал тир АЦА ЦГТ ТАЦ АГТ TAT ААТ ЦЦЦ ADA ЦТГ ГГЦ ЦГЦ АЩ TAT ГТТ TAT асп асн лиз тир тир лиз асн лей глу гис вал иле лиз асн ала ГАТ ААТ ААА TAT ТАЦ ААА ААЦ ЦТЦ ГГА ЦАТ ГТГ АТЦ ААА ААЦ ГЦЦ лиз арг лиз лиз ала ала ала глу гис глу гис глу глу арг асн ААГ ЦГЦ ААГ ААГ ААТ ГЦЦ ГЦЦ ГАГ ЦАЦ ГАГ ЦТА ГАА ГАГ ЦГЦ ААЦ BamHI

(ГГАТЦЦ)-З'

Мал.5.Нуклеотидна 1 ам1нокислотна посл1довн1сть област1 гену пол1едрину, що включав промотор 1 область, яка к.одуе 5'-к1н-цеву'частину 61 яку пол!едрицу.

сайти для фермент!в, як! рестрикують ген пол1едрину - BamHI i Kpnl. Це могло утруднити подальшу роботу по клонуванню в транспортному вектор1 гетероло г1чного гена. Тому ми вир1зали з рМЕ-А Pstl-EcoRI фрагмент з геном пол1едрину розм1ром 10 т.п.н., проклонували його в плазм1д! pUC18, в результат! чого одержали плазм1ду рМРЕ-А розм!ром 12,7 т.п.н. (мал.6). Таким чином, одержана наш плазм!да рМРЕ-А

EcoEI Hind Ш

Bglli

P3tl

Belli

'—Sail

Belli

Kptu Hlndiu

Kpni

Мал.6. Ф1вична карта транспортного вектору рМРЕ-А. я- ген пол!едрИну; И - промоторна область гену.

представляв собою транспортний вектор для клонування гетеролог1чних ген1в по сайтах для рестриктаэ ВашН1 1 Крп1 в кодуюч1й посл1довпост1 гену шШедрину.

Конструювання сер11 транспортних вектор!в для клонування гетеролоПчних' ген!в безпосередньо п!д промотором гена пол1-едрину, Можливост1 використання рМРЕ-А як транспортного вектора досить обмежен1. Це вумовлено тим, що результатом експресИ гену, клонованого за сайтом ВатН1 абоЛ Крп1 буде химерний б!лок, М-к1нець якого буде м)стити частину ам1ноки-слот б1лка пол1едрину. Кр1м того, при клонуванн1 за цими сайтами нуклеотидна посл!довн1сть гетеролог1чного гена у двох випадках з трьох може не зб1гатися з рамкою зчитування АТ13-кодону ; гену пол!едрину. Для того, щоб подолати вказан!

обмеження 1 одержати транспорта1 вектори для екепрес1йно1 системи, яка продукуе чистий б1лок, необх1дно було ввести л!нкерну д1лянку в район 1н1ц1юючого кодону в р1зних рамках ачитування 1з збереженням АТВ-кодону (для клонування ген!в без власного ATG-кодону) або з усуненням 1н1ц1юючого кодону (для клонування ген! в з власним ATG- кодоном).

Ман1пуляц1ям з метою внесения модиф1кац1й було Шддано фрагмент гена пол1едрину, який м1стить промоторну область, обмежену BgllI-сайтом, i прилеглу до промотора область, яка включае 1н1ц1юючий кодон. Ман1пуляц1ям з ц1ею д!лянкою на геном1 рМРЕ-А заважали два додатков1 сайти для рестриктази Bglll (мал.Б). Тому для операц1й з метою модиф1кац1Т ц1е1 д1лянки нами було використано плазм!ду pME-ASE, одержану в наш1й лабораторП ран1ше. Плазм1да pME-ASE представляв собою Sail-фрагмент плазм1ди рМРЕ-А, клонований в плазм1д1 pUC18 (мал.'?).

За допомогою пол!мераэно1 ланцюгово1 реакцН було ампл1ф1ковано фрагмент, який м1стить промоторну область з внесениям при цьому додаткових сайтiв рестрикдП (EcoRI - в область, що межуе э сайтом Bglll i Hindi 11 i/або Ваш HI в область, що межуе а АТГ-кодоном).Ампл1ф1ковану ДНК було оброблено рестриктазами EcoRI i BamHI. 0держан1 у такий спос1б фрагмента було клоновано в плазм1д1 Blue Script (SK+) за в!дпов1дними сайтами з метою с1квенування дано1 посл1дов-ност1. За допомогою с1квенування одержаних фрагмент1 в було встановлено, що вони в!дпов1дають промоторн1й облает1 гена пол1едрину а прилеглими д1лянками 1 мають структуру,яку схематично подано на мал. 7.

Для одержання cepll модиф!кованих транспортних вектор!в

PUC10

(¿4 • ' **

w)/////////)k

Мал.7 Введения додаткових сайт1в рестрикцП в район ЛТГ-кодону гену пол1едрину. А - локал]зац1я гену пол1е-дрину в Sal-фрагментi рМЕ-А5Е; Б - карта гену пол1ед-рину з промоторною об-ластга; В - фрагмента з мо-диф1кац1ями в област1 BglII -сайту та 1н1ц1юючого кодо-ну гену пол1едрину. F¡ - промоторна область гену пол1едрину; 223 - кодуюча область гену пол1едрину; (ИЗ - 3 -регуляторна область гену пол1едрину; Q - л!нкерн1 посл1довност1, привнесен! в конструкц!ю.

OS1H о г* и и ыи

os"

О-"1 1(9 ufa

■о«

U S

необх1дно було Ве111-ВатН1-фрагмент гена пол1едрину розм!ром 0,4 т.п.н. в рМРЕ-А зам1нити одержаними фрагментами розм1ром 0,25 т.п.н. Через наявн1сть на плазм1д1 рМРЕ-А додаткових сайт1в для рестриктази як посередиика було використано

рМЕ-А5Е. Схему конструювання плазм¡д представлено на мал.8.

Мал.8. Схема конструювання транспортам вектор1 в з сайтами 1нтеграц11 гомолог1чних ген!в п!д пол!едриновим промотором.

Ц1 плазм!ди являгать собою транспорта! вектори для клонування в них ген1в безпоеередньо п!д промотором гена пол1едрину. Модиф1кац1! облает!, яка межуе з промотором (мал.9), в!дкривае можлив1сть використання цих Еектор1в для клонування ген!в,результатом експресП яких в бакулов1русн1й систем1, буде чистий б!лок, який не м1стить у соб1 ам!нокислотних посл!довностей пол!едрину.

ВатН 1-1-161 Н1пс1111

рМР£А ' .. ТАТААААТГтатацацгтаац.......ГГАТЦЦТЦ......ТАА... ААЩТТ

НапсИ 11ВагеН1+161 Н!пс1Ш рВД~А1.2 ..ТАТААААаГцттггатвдЦЦТЦ .......ТАА.. .ААГЦТТ...'

ШпсП11ВатН1 ШпсПП рМН=А1. 3 ..ТАТААААТГаагцттггатцц .......ТАА...ААГЦТТ...

ВашН1 +161 ШпсНП рМРЕА1.4 .. ТАТААААТГгатдцЦЦТЦ .......ТАА.. .ААТЦТТ...

Мал.9. Посл1довн1сть нуклеотид!в транспортних вектор¡в в' район1 сайту 1нтеграц!I/гетеролог1чного гена. Крапками поз-начено ну1Спеотиди, не вказан1 на мал. Проб1ли означають ' делец! I. Маленькими лИерами позначено нуклеотиди, привнесен! в конструкц1ю.

рМРЕ-А 1.2 моле бути використано для клонування генГв в власним АТБ-кодоном. В плазм1дах рМРЕ-А 1.3 1 рМРЕ-А 1.4, де збережено !н1ц1юючий кодон', можна клонувати гени без власного АТв-кодону. рМРЕ-А 1.2 1 рМРЕ-А 1.3-маю'ть по два сайти для клонування гетеролоПчних ген1в - ВагаШ 1 ШпсШ1. рМРЕ-А 1.4" м!стить один клонуючий сайт для рестриктази ВатН1. Сайт для рестриктази ВатН1 з плазм1дах рМРЕ-А 1.3 1 рМРЕ-А 1.4 знаходиться в р!зних рашеах зчитування в!дносно

1н!ц1юючого кодону. ВатН1-сайт е ун1кальним в геном! рМРЕ-А i в1н може бути використаний для клонування беэпосередньо у цьому вектор!. Додатковий сайт для рестриктази Hindi II розташований п1сля терм1нуючого кодону гена пол1едрину. Тому при клонуванн1 за цим сайтом гетеролог!чного гена, кодуюча поел1довн1сть гена пол1едрину, буде повн1стю делетована. При цьому 3'-область, яка не транслюеться 1 м1стить в соб1 сигнали пол1аден1лювання буде збережена. Проте клонування за цими сайтами беэпосередньо в плазм1д1 рМРЕ-А е неможливим, тому що плазм1да у своему склад1 мае ще два додатков! сайти для цього ферменту (мал.6). Тому при клонуванн1 ген1в за HindIII-сайтом необх!дно буде використовувати у рол! пром1жного вектора плазы!ду pME-ASE, яка мЮтить один додатковий сайт для Hindi II, що можна легко видалити. . В плазм1дах Ще1 cepil можливе також двохстад1йне клонування ген1в за сайтами BamHI-KpnI.

Конструювання рекомб!нантних транспортних вектор!в.При конструюванн1 рекомб1нантних транспортних вектор1в нами було використано ген fi -галактозидази а плазм1ди рАС-360-501 J3-gal, надано! лаборатор1ею Саммерса, у якого в!дсутня л1дерна посл1довн1сть 1 1н!ц1юючий кодон. Ген ^-галактозидази за BamHI- сайтом було клоновано в кожному з чотирьох одержаних нами транспортних вектор1в cepll рМРЕ-А. В результат! було одержано чотири рекомб1нантн1 транспорта! Еектори -pMPE-A^-gal, pMPEA 1.2J3-gal, рМРЕА ■ 1.3-^-gal, pMPEA1.4^-gal.

При в1дбор! трансформант 1 в, як! несуть рекомб!нантну плазм1ду з геном JB-галактозидази, виявилося, що колонИ кл!тин E.coli, як! магать у своему склад! плазм!ди

pMPE-A-^-gal i pMPE-A 1.4-J3-gal, характеризуются 1нтенсивно син1м забарвленням в присутност! X-gal у поживному середовщ1 ( ген Jî-галактозидази в цих векторах мпвпадае за рамкою зчитування з АТГ-кодоном гену пол1едрину ). Цей факт св1дчить про те.що промотор бакулов!русного гена пол!едрину, п!д контролем якого знаходиться ген jS-галактозидази, виявляе активн1сть у неспециф1чн1й для нього прокар!отичн1й систем1.

Одержання в!оусних експресивних вектор!в.В робот1 по одержанню експрес1йних в1русних вектор1в було використано два з чотирьох транспортних рекомб1нантних вектор1в, як1 несуть ген -галактозидази, а саме рМРЕ-А^З-gal i рМРЕ-А1.4 -J3-gal. В обох випадках посл1довн1сть нуклеотид!в гена ^-галактозидази зб1гаеться э рамкою зчитування ATG гена пол1едрину. В pMPE-A-JB-gal ген ^-галактозидази м1стить 155 додатков1 нуклеотиди 5'-к1нця гена пол!едрину. рМРЕ-А-1.4^-gal не несе додаткових посл1довностей п1сля ATG-кодону (якщо не Срати до уваги 6-нуклеотидну л1нкерну посл1довн1сть).

S метою одержання експресивного бакулов!русного вектора моношар кл!тин МСАр-1 котрансф!кували сум1шшю ДНК ВЯЛ Mn i ДНК рекомб1нантного транспортного вектора у сп1вв!дношенн1 1:2. Експрес1ю -галактозидази еиявляли в1зуально за появою син1х бляшок в моношар1 кл!тин в присутност! X-gal. Пор1вняння моношару кл!тин, пофарбованого нейтральним червоним, i моношару, пофарбованого X-gal, св1дчило про те, що приблизно 1-2% бляшок експресував J3-галактозидазу.

Для очищения в!д дом1шок Bipyey дикого типу рекомб!нант-ний Bipye Mnp-gal (в!дпов1дний транспортний вектор рМРЕ-А^З -gal) було трич1 проведено через блякки.

При робот! з }Лп 1.4-j3-gal (в1дпов!дний транспортний век-

тор рМРЕ-А 1.4^3-да1) було використано 1нший метод очищения за допомогою дот-г1бридизац11.

0чищен1 у такий спос1б клони в1рус1в Мп^-еа1 1 Мп 1.4-^3-йа1 е перспективними для використання 1х як вектор1в для ек-спресП р-галактоэидази в культур1 кл!тин дубового шовкопря-да. Для остаточного надання вшцезгаданим рекомб!нантним в1русам статусу екепресивних вектор1в необх1дно було впевнитися у 100-процентному ступен1 1х очищения в1д дом1шок в1русу дикого типу 1 в1рн!й локал1зац11 гетеролоПчного гена в геном в1русу.

Анал1з ДНК рекомб)нантних в!рус1в з геном А-галактоэидази, ДНК рекомб!нантних в1рус1в а Мп було вид!лено, очищено 1 п1ддано рестрикц!йному анал!зу з наступ-ною блот-г1бридизац1ею з метою визначення м1сця 1нтеграц11 гена ^-галактоэидази п1д контролем промотору гена пол1едрину у в!русному геном1, а також для того, щоб переев1дчитися у в1дсутност! дом1шок ДНК в1русу дикого типу.

Анал1з електрофореграм 1 результата бдот-ПбридизацП рестриковано! в1русно1 ДНК з _^-галактозидаэним зондом св1д-чить про те, що ген £-галактоэидази 1нтегрував у в1русний геном в оч1куваному м1сц1. За результатами електрофорезу 1 блот-пбридизацП рестриковано! ДНК в1русу з пол1едриновим зондом було зроблено висновок про чистоту одержаних препаратов. Таким чином, одержан1 два очищен! клони рекомб1нантних бакулов1рус1в Мп-^-га1 та Мп1.4-^-да1, як! являють собою ек-спресивн1 вектори з геном р -галактоэидази п1д контролем промотору гена пол1едрину.Мп-^-еа1 призначений для експресП в бакулов!русн1й систем1 х1мерно1 р -галактоэидази, И-к1нець яко! представлено ам!нокислотною посл!довн!стю б!лка пол!ед-

рину. Mill.4-j3-gal приэначений для експрес!I чистого б1лка.

Анал1з експресП J3 -галактозидази в клiтинах Antheraea pernyi л1н11 МСАр-1 1нф1кованих рекомб1нантними в1русами. 3 метою з'ясування динам1ки експресП J3 -галактозидази у баку-лов1русн1й систем!, нами було проанал1эовано б!лковий склад кл1тин, заражених рекомб!нантними в!русами Mn-^-gal i Mnl.4-^ -gal через певн1 пром1жки часу п1сля 1нф1кування (мал.10 А,Б). Анал1з електрофореграм 61лк1в !нф!кованих кл1тин, розд!лених за допомогою 303-пол1акр!лам1дного гель-електро-форезу, св1дчить про те, що в кл1тинах, 1нф1кованих рекомб1-нантним BipycoM Mn-^-gal i Mnl.4-^-gal л1н!ю, що в!дпов!-дае ji -галактозидаз1, виразно стае видно на 48 годину п!сля заражения. 1нтенсивн1сть II наростае на 96-120 годину, п1сля чого починае спадати. Ця тенденц!я збер1гаеться до 192 години для обох використаних в експеримент1 рекв1рус1в. Було показано, що динамiка накопичення пол!едрину в клi тинах, ¡нфжованих вирусом дикого типу дещо в1др1зняеться в!д динам!ки накопичення J-галактозидази (мал. 10 В). К!льк1сть пол!едрину неухильно аростае а 24 до 192 години п1сля 1нф1кування. Причину пад1ння р 1вн1в J3-галактозидази в кл1-тинах через певний пром!жок часу п1сля 1нф1кування було досл1джено нами у подальших експериментах.

Анал1з piBHlB ферментативно1 активност1 JS- галактозидази в кл!тинних екстрактах i в середовищ1. Б1льш точний к!льк1сний анал1з експресП J3-галактозидази було проведено шляхом вим1рювання р!вн1в активност1 ферменту в кл1тинах екстрактах i в середовищ1 у динам1ц1 через ptsiii пром1жки часу п1сля 1нф1кування. При вим1рюванн1 р1вн1в активност1 ферменту в систем! на основ! Bipycy Mnl.4-^ -gal, було

•1 2 ,3 4.5 6 7 8 ~ 1СТ

i i—±,___ ^

i I '••i

Б 1_

í-jvs-

t

YtVid

n, л

3 4 5 6 1ST

|

h-t

-Z 8 JL

i

"1-ü

£5

i— S3 pS U-J te-1

— Ел t-<-3 "i, á r-^ J*

^ tS -- » ^

» ^ f.J *........

V!

tí

■ i v v!**, «"-j*.

Г i' **

"i

B/ljU

í Л J

«u ^ í-

Мал. 10.Динамика синтезу: A-J - галактозидаэи в iрусом Mn-J5 -gal; Б- j3 -галактозидаэи в1русом Mn-1.4-j3 -gal; В- пол1едрину в1 русом дико-j го типу через р1зн1 пром1ж-ки часу п1сля 1нф1кування (2 - 24; 3 - 48; 4 - 72;5 -96;6 - 120;7 - 144;8 - 168; 9 - 192 год.). 1 - б1лковий склад не1нф1кованих кл1тин. Стр1лками позначено м1сце-знаходження пол1едрину (р) i J> -галактозидйзи (J>)-

1 2' .3 4 5. 6 7 8- 9.

Pf

виявлено, що вже на 24 годину п1сля 1нф1кування Jí-галактози-

даза присутня в поживному середовищ1 у к1лькост1, що п1ддае-

ться вим1рюванню, i до 168 годйни к1льк1сть II у середовищ1

зростае. Отже, зменшення к1лькост1 ферменту, пом1чене нами

при анал1з1 б1лкових електрофореграм, зумовлене секрец1ею fi-

галактозидази з кл1тин у середовице. Це спостереження

зб!гаеться з даними заруб1жних автор!в,що в1дм1чали секрец1ю

f> -галактозидази з кл1тин у середовище в експресивних бакуло-

в1русних системах на основ 1 ВЯЛ A. cal i fornica [Нага,1992].

При цьому сл!д в1дм1тити, щоуЗ-галактозидава в внутр1шньо-

кл1тинним ферментом. Граф1к залежност1 р1вн1Е активност1 fi -

галактозидази в!д часу пост1нф!кування кл1тин в1русом №\-j¡ -

gal подано на мал.НА. Макс'имальний р1вень активност1

/i-галактозидази в кл1тинному екстракт1 спостер1гаеться на 96

годину п1сля 1нф1кування 1 складае 26х103 умовних одиниць

б

активност1 (у.о.а.) на 10 кл1тин на 1 мл середовища. Це . в1дпов1дае 6.9 м1жнародним одиницям активност1 (м.о.а.), як к1льк1сть м!л1мол1в-0-н1трофенолу, що напрацьовуеться в 1мл середовишда за 1хв за стандартних умов. Максимум активном 1 р-галактозидази в середовищ1 спостер1гаеться на 1G? годину

з

п!сля 1нф1кування 1 складае 37x10 у.о.а. Це в1дпов1дае 9.8 м.о.а. Сумарний максимальний р!вень активност! ¡Ь -галактозидази кл1тин 1 середовища на 168 годину п1сля 1нф1кування

смадае 41х1С?у.о.а. або 10.8 м.о.а. К1льк1сть ^-галаитозй-

6

дази, виражена у вагових одиницях, в1дпов1дае 36 мкг/10 кл х мл, що було визначено на ochobI питомо1 активност1 ферменту. Аналог1чний граф!к залежност! р!вн1в актиЕНост! Д-галак-

t •

час (год) час (год)

Мал.11. Р1вн1 активност-галактозидази в кл1тинах □ 1 в поливному середовищ1 И через р1эн1 пром1жки часу п1сля 1нф1кування кл1тин МСАр-1 рекомб!нантним в1русом Мп-^З - gal (А) 1 Mn ÍA-fl -gal (Б). Активн1сть виражено в умовних оди-ницях на 1 мл поживного середовюца, що м1стить 106 кл1тин 1 розраховано за формулою: A=1000xD420/txv.

тозидази в1д часу, що пройшов п1сля 1нф1кування кл1тин в!ру-сом Mnl.4^9-gal, продемонстровано на мал.НБ. Максимальний р1вень активност1р-галактозидази в кл1тинному екстракт1 до-сягаеться на 96 годину п1сля 1нф1кування 1 складае 7.8Х103 у.о.а., що в1дпов1дае 2.1 м.о.а. Загальний максимальний pl-

з

вень активност1 на 168 годин! лост1нф!кування складае 13x10 у.о.а.,що в1дпов!дае 3.4 м.о.а. або 11 vr&rfi-галактозидази. Динам!ка накопичення ферменту в кл!тинах 1 середовищ! в сис-

тем1 на основ1 Мп1.4-^9-¡*а1 сп!впадае з динам!кою накопичен-ня його в систем1 на основ1 Мп^-еа1, при цьому сумарн1 мак-симальн1 р1вн! активност1 однак нижч! в 3.3 рази. Виходячи в л1тературних даних, можна припустити, що додаткова посл1дов-н!сть 1з 155 нуклеотид1в гену пол1едрину в Мп^-еа1 може зд!йснювати еплив на ефективн1сть трансляцП або стаб1ль-н!сть РНК в бакулов1русн1й систем1, що виражаетьея у зб1ль-шенШ к1лькост1 експресованого б!лку. Одержан! р1вн1 експре-С11 рекомб1нантно! ^¡-галактозидази дозволяють вважати нову бакулов^русну систему перспективою для одержання гетеролог!-чних бхлклв р1зного призначення.

ВИСНОВКИ

1. Локализовано ген пол!едрину 1 його промоторну область в геном! ВЯЛ №.

2. Сконструйовано серш транспортних вектора рМРЕ-А: рМРЕ-А - для клонування гетеролопчних ген!В в кодукшй облает! гену пол!едрину; рМРЕ-А1.2, рМРЕ-А1.3, рМРЕ-А1.4 для клонування гетеролопчних ген!в безпосередньо П1Д промотором гену пол!едрину.'

3. Показано можлив1сть функцЮнування промотору гену пол1едрину в прокар!отичн1й систем1.

4. Створено нову бакулов1русну експресивну систему на основ! ВЯЛ Ма1асозота пеиБ^а ! кл1тин АгЛегапа регпу! л!н11 МСАр-1. Одержано два рекомб1нантних в1русних клона, що несуть ген -галактозидази п1д контролем промотору гену

. пол1едрину: Мп-_/9~еа1- для експрес11 химерно1 рекомб1нантно1 ^-галактозидази; Мп1.4-уЗ-еа1 - для експресП чистого ферменту.

Б. Проанашзовано експресш чисто! ! химерно! ^д-галакто-

зидааи в юл тинах Antherarea perniii лШ1 MCAp-i: р1вень ак-

6

тивностд чисто1 ^J-галактозидази - 3.4 м.о.а. на 10 кл на 1мл середовища; р1вень активност1 химерного б1лку 10.8 м.о.а. на 10 кл на 1мл середовища.

Основн! роботи, надрукован! за темою дисертацП:

1. Строковская Л.И., Веселовский О.В.-, Кихно И.М., Мирюта Н.Ю. Клонирование гена полиэдрина вируса ядерного полиздроза кольчатого шелкопряда// Биополимеры и клетка.-1990.- 6.N3.-с. 81-84.

2. Строковская Л.И., Кихно И.М., Веселовский О.В., Скуратовская И.Н., Мирюта Н.Ю., Петренко А.И., Соломко А.П. Экспрессивный бакуловирусный вектор на основе вируса ядерного полиздроза кольчатого шелкопряда Malacosoma neustria// Биополимеры и клетка.- 1990.-6,N3,- о.84-90.

3. Кихно И.М., Строковская Л.И. Бакуловирусная система экспрессии чужеродных генов - настоящее и будущее биотехнологии получения биологически активных белков

г

различного происхождения // Биополимеры и клетка.- 1994.-5,N10,- с.31-49.

Кихно И.М. Разработка експрессионной системы на основе вируса ядерного полиздроза Malacosoma neustria и клеток Anteraea pernyi линии МСАр-1.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.03 - молекулярная биология, Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 3995.

Защищается 3 научные работы,которые посвящены разработке экспрессивной бакуловирусной системы.Создана новая система экспрессии на основе вируса ядерного полиэдроза Malacosoma neustria и клеток Anterarea pernyi.Проанализирована экспрессия гена бактериальнойjg-галактозидазы в данной системе. Ключов] слова: система екслресп, бакулов!рус, вектор'.

Kikhno Irina М. Elaboration of an expression system based on Malacosoma neustria nuclear polyhedrosis virus and established celi line mcAp-1 originated from Antheraea pernyi. Candidate of Sciences Dissertation, specialization 03.00.03-Molecular Bioloogy, Institute of Molecular Biology & Genetics, National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev, 1995. The materials are to be defended contained in 3 scientific papers concerning the elaboration of an expression system on the basis of a baculovirus. This new expression system has been created using Malacosoma neustria nuclear polyhedrosis virus and an established cell line originated from Antheraea pernyi tissues. The expression of bacterial j9-galactosidase -coding gene has been analyzed in the system studied. Key words: baculoviruses, vectors, expression system.

П1дписанс до друку 23.OI.95r форнат 60x84/16 Пап1р дртк. Умов, дтгтк. л. 1.0. Тираж 100 примените. Заказ MIOI

Надруковано ЦУОП ДНПП "Плодвлнконсерв" и. Кя1в , Саксаганського,1