Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структура гена полиэдрина вируса ядерного полиэдроза кольчатого шелкопряда MALACOSOMA NEUSTRIA (BACULOVIRIDAE)

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структура гена полиэдрина вируса ядерного полиэдроза кольчатого шелкопряда MALACOSOMA NEUSTRIA (BACULOVIRIDAE)"

ВСЕСОЮЗНАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК им. В. И. ЛЕНИНА ВНИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ

На правах рукописи

ШАРИПО

Анатолий Викторович

СТРУКТУРА ГЕНА ПОЛИЭДРИНА ВИРУСА ЯДЕРНОГО ПОЛИЭДРОЗА КОЛЬЧАТОГО ШЕЛКОПРЯДА МАЬАСОБОМА ЫЕиЭТМА (ВАСиЬОУИНОАЕ)

(03.00.03. — Молекулярная биология)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА — 1991

./У

Работа выполнена в лаборатории биохимии вирусов Института микробиологии им. А. Кирхенштейна АН Латвии

Научный руководитель

кандидат биологических науй ВИЛНИС А. Э.

Официальные оппоненты

доктор биологических наук НАРОДИЦКИЙ Б. С. кандидат химических наук ЦИМАНИС А. Ю.

Ведущее учреждение — Институт молекулярной биологии и генетики АН Украины

Защита диссертации состоится €¡2» 1991 г. в

часов на заседании Специализированного совета Д 020.40 01. по защите диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.03. «Молекулярная биология» при ВНИИ сельскохозяйственной биотехнолгии ВАСХНИЛ (127253, Москва, ул. Псковская, 11, корп. 4).

С диссертацием можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии ВАСХНИЛ.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических каук

МЕЛИКОВА С. А.

■СуЛ:

..>сЧ i \

темм.. в связи с 'Сюстряющейся экологической вдеД-апГеи. все актуал1.гее становится вопрос сокращения и СТ4ЦИЙи;> химических средств защити сельскохозяйственных Г!УдТту|> от вредителей на экологически чистые биологические препарата. Среди них весьма г.ерспектггчы инсектициды на основе бакулсвнрусов, с в'.лсикол свевд'.^ичпс сгью пэражаюших гсичинок Le n 1 dop t га (бабочек).

■Еакуловирусные инсектициды в последнее время получили широкое распрсс-танаение в Канаде, СИЛ и н особенности в ч'итае; они избирательно и дефективно поражают насею ное-(оэяпна, безопасны для человека и при правильной организации производства обходятся дешевле, чем химические «нее ициды [Vogel, 1986). В ряде лабораторий Укрлины, ^оссии, Колдовы и Латвии создано несколько бакулоикрусных 1репаратов (БИРИН-ГЯП, ВИРИН-КШ и др.) однако внедрение их ! проззодстпо начинается с большими трудностями. При >рганизации производства в условиях рынка часть проблем южет бить решена. Но возникнет необходимость в изделии»:, юстаточио дешевых н точных методах обнаружения >ак/ловирусов для контроля производственных ттрпов. IfpoMt? ¡того, потребуются метоД1.1 паспортизаци.- пиру слых шеектицидев, а также постоянного мониторинга присустцця акуловирусов з сельскохозяйственной продукции и окружающей реде.

В последнее время в развитых странах разрабатываются нсектицидп на основе реконбиначт ujx вирусов с еленаправленно улучшенными на генетическом уровне войствами [Merryweather et al., 1990; Banning . et 1 . , 1990) .

, _ Без детального молекулярно-биологического изучения акуловирусов и их геномов невозможно работать ни в обл .стп еленаправленлого улучиения свойств бакулопирусных нсектицидов ни над созданием методов паспортизации и бнаружения. Кроме Того, мс.лекулярно-генетическин подход гкрывает еще и новые, биотехнологическне перспективы спользования бакуловирусов как эукариотических вектороп пя экспрессии белкой [Matauura et al., 196/).

Все вышеуказанное относится и к изучению вируса lepHoro полиздроза кольчатого шелкопряда (Mn>JPV). Пирус 1 HPV специфически поражает личинок экономически значимого ^едителя кроны яблони - кольчатого шел^эпряда Maljcosoaj

i

пеи.игп. На основе этого вируса в Институте биологии АН Латвии разработан и выпускается экспериментальными партиями вирусный инсектицид ЕЛРИН-КШ. Изучение генома вируса из латвийского изолята до настоящего времени не проводилось.

Поэтому представляется важным провес ги .кгреичный анализ генома МпКРУ, и на его основе получить данные для репения основных проблем внедрения, производства и улучшения вцрусног инсектицида, а также определить подходи для биотехнологического использования МпНРУ как сектора для экспрессии.

Основные успехи в области биотехнологии бакуловирусов дост'л^нуты при использовании генов поздней дельта-области генома, где сконцентрированы консервативные, наиболее сильно экспрессирукциеся вирусные гены; наибольший прогресс сгязан с использованием промотора полиэдрина - главного белка телец включений [Зиштг гг ег а1., 1987, .

Поэтому в качестве основной проблемы диссертационной работы мы выдвинули изучение гена полиэдрина МпКРУ - как наиболее консервативного и жизненно необходимого для инфекционного цикла вируса: л п У1У0, а также как источник сильного промотора для создания экспрессионных векторов.

Цели работы и падачи исследования. В рамках поставленной проблемы выдвинуты следующие цели:

- получение данных о гомологичности популяций МпКРУ.

- локализация гена основного белка полиэдров - полиэдгина в генсме МпМРУ;

клонирование гена полиэдрина, определение его нуклеотидной последовательности, с груктурный анализ;

- Разработка высокоспецифическлх методов определения МпКРУ в препаратах сектицида и в окружающей среде. Достижение поставленных целей требовало решения следующих задач:

- Разработка методов выделения ДНК МпИРУ.

- Сравнительный рестрикционный анализ МпКРУ географически удаленных изолятев

- Поиск фрагментов ДНК МпЫРУ, гомологичных гену полиэдрина наиболее изученного бакуловируса - АсМНРУ

- Клонирование данных Фрагментов в бактериальном плазмишюм векторе

- Рестрикционный анализ отобранных рекомбинантных плазьид

2

С ределение нуклеотидной последовательности и пьютерный анализ структуры гена полийдрина MnNPV, внительиый анализ с последовательностями аналогичных ов других бакуловирусов.

спользование гена полиэдрнн как зонда для разработку! -ДНК-гибридизационного теста на вирус ядерного и?дроза -кольчатого шелкопряда.

чная нозизня работы. Впервые определена полная пеотидная последовательность гена полиэдрнна вируса рного полиэдроза кольчатого шелкопряда Ma 1âcosom jl stria, MnNPV-L (латвийский и золят). Обнаружены сенсусные последовательности промотора транскрипции, 51-^евой нетранслируемой области мРНК, сигналов !аденилирования гена полиэдрина вируса.

зедложен вариант выравнивания 5'-концевой

плнслируемои лидерной последовательности мРНК

1эдринов, в результате которого выявлен возможный :енсус лидера для £Г известных генов полиэдрина. юкислотная последовательность полчэдрлна MnNPV, длиной :'(6 а.к. .предсказанная из первичной структуры ДНК, |руживает высокую степень гомологии с белками телец >чений других вирусов ядерного полиэдроза (80 ) и ■улеза (50*). Выявлены особая консервативность С-конца [эдренного белка бакуловирусов и вариабельность Н-,евой последовательности. На основе анализа последней ложена модель возможного филогенез вирусов ядерного эдроза.

Выявлена геномная гетерогенность географически синих изолятов MniiPV

ктическая ценность рабопд ■.На основе клонированного и енированного нами гена лолиэдрина MnNPV создан ДНК-ДНК-идизационный тест для специфического и

кочувствшельного обнаружения зируса. ядерного

:<дроза кольчатого шелкопряда в препаратах вирусного ктицида и в окружающей среде. Тест применяется в двух Фикациях - с использованием радиоактивной метки или гнтативной реакции и показал пригодность как в ?атор!!ы> так и в полепых условиях.

эедложен способ стандартизации вирусного инсектицида 1-КШ, на основа картин гидролиза • геномной ДНК эихтазами. Разработан метод быстрого выделения ДНК

3

MnKflPV из лизированных гусениц.

Клонированный ген полиэдрина, а также данные анали его нуклеоткдной последовательности планирует

использовать для создания и развития экспресс» н; векторов на основе бакуловирусов.

Структура работы. Диссертация изложена на 7 7 ст

машинописного текста и содержит следующие разделы введение, обзор литературы ( посвящен бакуловирусным бёлк телец включений ), материалы и методы, результат обсуждение результатов, выводы. Материал рабо иллюстрирован 20 рисунками. Библиографический указате включает в себя 150 источников.

АпроРация работы. Результаты работы доложены на Межреспубликанской конференции "Защита растений и охра природы", Дотнува, Литва, 1969; на Всесоюзной конференц "Новые направления биотехнологии", 1990, Пущино-на-Оке; Всесоюзном совещании "Молекулярная биология ДНК-содержаи вирусов, имеющих. практическое значение для сельскс хозяйства и медицины", 1990, Киев. Материалы и методы

Препараты природных изолятов вируса ядернс полиэдро'за кольчатого шелкопряда были получены канд.Оиол.наук И.Я.Зариньша (Институт биологии АН Латви! Очистку бакуловирусных полиэдров в градиенте сахарозы, выделение ДНК бакуловирусов проводили по методу [Smith * 1., 1982], с модификациями.

В работе использовали штаммы E.coll К-12 DH5 и !ГМЫ Для выращивания бактерий использовали жидкую среду LJ агаризованную среду LBA [Miller. 1576]. Ампициллин (] соль, Di feo, США) применяли 2 концентрации 20-40 икг/i Для подготовки компетентных клеток E.coll использов, жидкую среду SOB [НапаЪап, 1987], для отбора клон содержащих вставки в полилинкерной последовательно вектора PUC19 использовали индикаторные среды LBA с X-(20 мкг/мл), IPTG (20 мкг/мл) и ампициллином (50 мкг/м Приготовление компетентных, клеток E.coll и трансформа плазиидной ДНК проводили по методу [Hanahan, 1989]. Мече ДНК методом ник-трансляции проводили с использован -ЗгР-dATP("Изотоп" Ташкент). Для введения нерадиоактив метки в ДНК, в реакции использовали биотинил-дезоксиуридилтриФосфат (НПО "фермент", Вильнк

4

.оВялизацкю ДНК и гибридизацию ДНК, иммобилизованных на меновых фильтрах, с мечеными ДНК-зондами проводили по 'оду [Melnkoht 8. Wanl, 1834]. Ачалитическое вчделение .змидной ДИК из небольших обьемоь проводили по [Birnboim ю 1 у, 1981]. Препаративное выделение г.лазмиднои ДНК, :ролиз ДНК рестриктазами, выделение фрагментов ДШС из [розы, дефосфорилировакие фрагментов Д ПК, легирование irHenTots ДНК электрофорез в агарозных гелях, скрининг гомбилантных ллазмия методом гибридизации колоний in situ »водили, как описано [Нанпатис 1 др., 193')). ферменты для [ной инженерии были получены от НПО "фермент", Вильнюс.

Нуклеотиднке последовательности ДНК определяли le эоксиметодом [Sanger, 1977] на двухцепочечной ДНК с шмерами НПО "фермент", Вильнюс, с использованием [35SJ-'Р и секепеназы (Sequenase Version 2.0, 3oerln<;her I he ira), в условиях, рекомендуемых изготовителями

Компьютерны;} анализ нуклеотиднпх и аминокислотных :ледовательностей провопили при помощи пакета программ ikroGenie, BecKman Inc. Version 3.2 1393. «ультаты и их обсуждение

При помощи модифицированного нами метопа из 10^ 1иэдров MnîïPV-L и MnîiPV-A были пглучены препараты ДНК с ще.чтрацией 0.2 ni'.iу.чкл и общим количеством 300 мкг ДНК 1 каждого изолята. Препараты ДНК подвергались гидролизу :триктазами для проверки гомогенности.

Мы провели сравнение электорофоретических картин теления Фрагментов после гидролиза рестрикционными юнуклеазами ДНК, выделенных из двух изолятов вируса арного полиэдроза кольчатого шелкопряда Mj1acoscaa jstru - MnNPV-A (Армении) и MnUpv-L (Латвия), ;рис.1. Анализируя гидролиз ДНК MnNPV-A (Армения) и JPV-L (Латвия) рестриктазами BamHI и Hindtll о :ледук)щим злектрофоретическим Фракционированием в 1Р03НЫХ гелях, мы показали следующее :

при расщеплении ДНК каждого изолята обеими рестриктазами «но наблюдать субполярные полосы фрагменте»?, что азывает на геномную гетерогенность внутри изолятов; 2) ?тшш гидролиза рестриктазами ВашН! и Hindi II выявляет ï общих фрагментов ДНК для обоих изолятов, однако у едого изолята имеются и дополнительные фрагменты, что взывает на гетерогенность между изолйтами.

5

A L A L A L Bgl II HindlH BamHI

R НЭИ

JTCS^Yj -

M

Г

t - Л V" ' I

- i

rT^I

\ ¿.-Г..

J

23.7

9.50

6.66 4.26

2.25 i .96

Рис■1, Электорофоретическое разделение фрагментов ДН KnIIPV-A (Армения) и MnNPV-L (Латвия), обозначены соответственно, Л и L, после гидролиза рестргкционным эндонуклеазами Bgl II, BamHI и Hind III. Слева показан с ¿сположение маркеров длины ДНК - Фрагменты ДНК Фаг после гицролиза Hind III.

Для дальнейшего поиска геш л лаиэдрина, по причин большей доступности материала был выбран латвийский изоля вируса ядерного полиэдроза кольчатого шелкопряда MnMPV-L на основе которого разработан инсектицид БИРИН-К1?

2_. Локализация гена полиэдрина МпИРУ, его клонирование и определение нукльотидной последовательности

Первым этапом явилось выявление фрагмента геномно ДКК НпЫРУ, содержащего ген полиэдрина. Мы исходили и сходного строения генов телец включения вирусов ядерног полиэдроза и близлежащих к ним районов [ЕоЛгтапп, 1966 ) поэтому проводили поиск в геноме МпНРУ-!, Фрагмента ДНК гомологичного гену полиэдрина АсИЫРУ - наиболее изученног из всех бакуловирусов. В качестве зонда для ДНК-ДН гибридизации использовали плазниду рАсУШ, содержащую

6

0.0 pUC 8 =4-

pAcYMi 10.2 kbp

1.9 2,2 2.6

- .. ffttftttttttSga: E==-------1

5 ' -p2 9 BamHI 3 1 -p£ 9

Рис.2 A - Гибридизация ДНК MnNPV, гидролиэовакной рестриктазами BamHI, Hind III, Sail и xnol, Фракционированной в О.е у- агарозном геле и перенесенной на нейлоновый фильтр, с 32Р-меченой плазмидой PAMY1

В- физическая карта плазмиды pAcYMi - зонда для гибридизации. Плазмида содержит последовательности гена полиэдрина AcHNPV - промотор (коорд.1.9 -2.2), 5'- и 3'-Фланкирующие области (коорд. 0.0 - 1.9 и 2.2 -2.6, соответственно), промоторную область и фланкирующие 5'- и 3'-районы гена полиэдрина AcMNPV [ Matsuura et.al., 1967].

промоторную область и Фланкирующие 5'- и 3'-районы гена полиэдрина. AcMNPV [ Matsuura et.al., 1987].

ДНК, выделенную из полиэдров латвийского изолята MnNPV-L, гидролизованную рестриктазами BamHI, Hindlll, Sali и Xhol после электрофореза в 0.6 агарозном геле

переносили на нейлоновый фильтр и гибридизовали с плазмидой pAcYMl, (Меченной 32Р в реакции ник-трансляции.

Результаты радиоавтографа видны на рис.2. Зоны гибриди зации соответствуют фрагментам Xho-A, В (25 т.п.н.), BamHI-E (9.г т.п.н.) Hindlll-I (6.5 т.л.н.) и Hindi 11-Р(2.0 т.п.н.), а также Sall-R (3.2 т.п.н.). Для клонирования был выбран Sa 1I-R-фрагмент ДНК MnNPV-L. Клонирование проводили в бактериальном векторе pUC19 [Norrander et al., 1983], позволяющем проводить Фенотипический отбор рекомбинантов по Ферментативной реакции бета-галактозидазы. ДНК вектора pUC19 гидролизованную Sali, обрабатывали фосфатазой для удаления 5'-концевых фосфатов с целью воспрепятствовать восстановлению вектора при последующем лигировании. Sall-R-фрагмент ДНК MnNPV-L выделяли из геля агарозы низкой температуры плавления и лигировали с вектором; смесью после лигирования трансформировали компетентные клетки NM522, отбирали бесцветные колонии-рекомбинанты на среде, содержащей ампициллин и X-gal, и после выращивания в 5 мл среды SOB выделяли ДНК для анализа при помощи быстрого щелочного метода. Среди отобранных 3 0 рекомбинантных клонов 5 содержали вставку длиной 3.2 т.п.н., гибридизующуюся .с 32Р-меченой pAcYMl в блот-гибридизационных экспериментах.

Параллельно мы создали нерепрезентативную библиотеку BarnHI-Sa 1 I-фрагментов ДНК MnNPV-L в pUC19, и отобрали из нее клоны, гомологичные EcoRI-A-фрагменту pAcYMl, содержащему промоторную область и фланкирующие 5'- и 3'-районы гена полиэдрина AcMNPV. ДНК MnNPV после совместного гидролиза BamHI и Sali лигировали с вектором pUC19, обработанным теми же рестриктазами и выделенным из агарозного геля для освобождения препарата вектора от короткого олигонуклес-тидного BamHI/Sal I-фрагмента в целях предотвращения рециркуляризации вектора при дальнейшем лигировании. Смесью после лигирования трансформировали компетентные клетки E.coli DH1 и проводили гибридизацию ампициллин-устойчивых колоний in situ с 32Р-меченным EcoRI-А-фрагментом pAcYMl. Из 200 клонов были отобраны 14, дающих

игнал на радиоавтографе; все рекомбинантнпе плазмиди одержали вставку искомого фрагмента в одинаковой риентации, показанной на рис.3.

Таким образом, в результате клонирования были олучени плазмнды рМпР18 и рМпРЗО, содержащие ©ответственно, ВатШ-БаН фрагмент (1.6 т.п.н.) и За11-И-рагмент ДНК МпНРУ-Ь. Клонированные фрагменты

ибридиэ^иались между собой блот-гибридизациошшх

кепеч-имента: Было проведено картирование данных плазмид 'естриктазами Ват.Н1, НикЗЩ Крп1, В е 1 ;1. Сайты 'естрикт'13 Р5*.1, Есо!?1, ХЬа1 внутри инсертов отсуствуют. •изические карты плазмид приведены на рис.3,

19 PUC19

Rl Hindi I I

;-----------------------------;---------------------------; Borr.HI

; --------------------------------------;-----------------; Bg I II

------------------;-----------------------------------; КГЛ I

;-----------------;---------------------------------------; ||hn| III

---------------------;---------;--------------— ; Kbp

.05 0.9 .15 0.5 0.5 1.1

; . ■. . — ■:-: a pHnPi в

: .. .. ... . ........ =:рнпРзо

Рис.3 физические карты Sa 1 I-R-фрагмента генома InMPV, клонированного) в pUC19 по сайту Sali, для рестриктая iartiHI, Hindlll, Bglll и Kpnl . Показаны ориентации концов юлилинкера pUC19 и взаимное расположение вставок плазмид >МпР18 И рМпРЗО.

Расположение сайтов рестриктаз ВатШ и Hindi II по сраинению : известными последовательностями генов полиздрина AcHHPV и 3mNPV, а таже результаты гибридизации позволили предположить 1ам возможную ориентацию аналогичного гена MnKPV.

Результаты пробного секвенирования инсерта плазмиди эМпР18 в направлении от сайта лолилилкера р1>С19 (прянда)

9

праймер) подтвердили это предположение - компьютерный анг показал 6Y ¡í гомологии прочитанных 2S0 оснований кукдеотидной последовательностью генов полиэдрина AcMIIí BraNPV в районе с 50 по ¡34 а.к.

Поэтому в целях проведения дальнейшего секвеилрова было осуществлено субклоннрованче плазмиды рМпРЗО. Пс гидролиза рестриктазами и выделения необходимых Фрагмен из гелей легкоплавкой агарозы, лигирования с обработанной теми же рестриктазами pXJCig к трансформации E.coli Drl5, С получены плазмиды pMí¡P12, рМпР5, ?МпР6 рМпРТ рМпГЗ рНпР pMnPll, взаимное расположение инсертоз которых приведено рис.4.

S К .05

О,

Н К .15 0.5

Вз

0.5

1. '

S

-¡Длина (т.п.н.

pKnpie -—=_> рнпР12

pMnPtl ===> рМпР15 ==>—< —;-------->------

pt1nP9

: —<-

■■ :.....> РМПРСЗ

рМпРЬ рМпР5

!---<=

=— ¡ —<-pMr.PCI

GGC-богатый район

----------------<4Ш##т«ШйШй: tt— предполагаемый ген полиэг

Рис.4 Схема секвенирования центральной области Sal Г фрагмента ДНК MnllPV клонирозань„го в pUC19. Показ, расположение клонированных в pUC19 субфрагментов. Двойш линиями показаны направления чтения субклонироваш фрагментов. S, К, Н, В и Bg означает, соответственно: ca¡ рестриктаз Sali, Kpnl, HindIII, ВапШ и Bglll. Показ; ориентация предполагаемого гена полиэдрииа и GGC-повто]

10

-220 -151

СТТСААА0АССАСАААААТАТ6ТТ6ССТА6ТСААССТТТААТТТТТЛАААСАСТСТАСАТТТТСАА0ТСА -150 -01

САААТСА6ССАА6СС6С6С66СССАТССТТТАТАА6ТСАТС6СС0СТС6САС6САСАСАТС6ТААСААТ6

-80 -67 -45 ^-21

ТААААТТАТААТТАТАС6СТСАСАТАСАСА6АТАА6ТАТТТТТАТТСТТТС6ТАААААААТТАСАААААТ = = 0 * к к к 1

-20 +1----ОНИ (Р29)------) ' 60

ААААТАТААААТ6ТАТАСАС6ТТАСА6ТТАТААТСССАСАСТ666СС6САССТАТ0ТТТАТ6АТААТААА МеНугТЬгАгдТугБегТуг АгпРгоТГт 1.еи61 уЛгдИчгТуг У а 1 ТугАзрАзгНуэ 61 130

ТАТТАСАААААССТС66АСАТ6Т0ААСАААААССССАА6С6СААСАА6ААТ6ССССС6АССАС6А6СТА6 ТугТуг1у5А5п1еи61уН15Уа1А5п1у5АБпА1а1у5Агд1.у5!.узАбпА1аА1а61иЖ5б!и1-еиС

;<-------01^2 (-»66)------

131 200 АА0А6СССААСТТССАТССССТС6АСАССТАСТТАСТС6СССАА6АТССТТТСТТСС6АССТ6ССААААА IиС1иАгдА5п1еиАБрРго1еиАзрАгдТуг ЬеиУа1А1а61иА5рРгоРЬе1_еиС1 уРгоб!у1.у5АБ 201 270 ССЛЛЛЛЛСТСАСАТТ6ТТСЛА66ЛААТТС6ТААТ0ТСЛЛАССС6ЛСЛС6АТСАААСТСЛТССТЛЛЛСТС6 пС1п1.у51.еиТГ1г 1.еиРЬе1.у5б1и I 1еАгдАзпУа1[.уБРгоАзрТЬгКеНуБЬеиIIеУа1АзпТгр 271 340 АеС66СААА6А6ТТТСТ6ССТ6АААСТТССАССС6ТТТСА666АА0АСАЗСТТССССАТТ0ТСААС6АСС Бег61 у1у5б1иРЬе1еиАгдЗ I иТИгТгрТГ1г АгдРГ1еАгдС1 иАБрЗегРИеРго I 1 еУа ] АбпАбрС 341 410 АССАААТААТСЗАССТСТТССТАСТС6ТСААСАТСС6СССААСС6ААССС6АСС6ТТ6ТТТСА6АТТТТТ 1п61и1 1еМегАБрУа1РЬе1_еиУа1 Уа 1 АБпИегАгдРгоТМгб 1 иА 1 аАБрАгдСуБРГ1еАгдРГ|е1.е <--------0(^2 (+374)-------:

Рис.5 .Нуклеотидная последовательность центральной области Ба)I-й-фрагмента ДНК МпНРУ, Отмечены направление, зачало и конец для двух противоположно ориентированных открытых рдлок считывания( ОКП и СЖГ2). Для первой из них, зероятно кодирующей полиэдрин (Р29), показана аминокислотная юследовательность. Нумерация последовательности ДНК зачинается со старта ОКП(+1). Двойными линиями обозначены зозможные промоторные консенсусы ТААС-мотив начала транскрипции указан звездочками(к***). Сайты

юлиаденилирования (Ро1уА) подчеркнуты.(см.продолжение )

1 1

411 480

GGCTCAACACGCGTTACGGTGCGACTCTGACTATGTCCCGCACGAGGTGATCAGGATTGTGGAACCTTCG uAlaGlnHisAlaLeuArgCysAspSerAspTyrValProHisGluValIleArglleValGluProSer 481 550

TACGTAGGTAGCAACAACGAGTACCGCATCAGTTTGGGCAAACGATACAACGGATGCCCAGTTATGAACT TyrValGlySerAsnAsnGIuTyrArgl1eSerLeuGlyLysArgTyrAsnGlyCysProVaI MetAsnL 551 620

TGCATTCAGAGTACACCAATTCCTTTGAAGATTTCATCAACCGAGTGATCTGGGAAAACTTCTACAAACC euHisSerGluTyrThrAsnSerPheGluAspPhelleAsnArgValIleTrpGluAsnPheTyrlysPr 621 690

TCTCGTGTACATTGGTACCGATTCTGCCGAAGAAGAGGAAATTCTCTTAGAGGTGTCTTTGGTGTTCAAA oLeuVaITyrIleGIyThrAspSerAlaGluG!uGluGluI 1eleuLeuG1uVaISerleuVaIPheLys

691 ------0RF1---->.738 760

ATCAAAGAGTTC6CTCCCGACGCACCTCTATACACGGGACCCGCATACTAAGCTTCACTTTCTCTATATT I IeLysGIuPheA1aProAspA 1 aProLei/TyrThrG I уРгоА I а Туг

761 630

TAACGAGATTCATGACGTTTTCCAACAGACGAATATAGTTTTTATTAGTTGGACGCAATCTTATCGCTTC 831 900

TGTTAGACACTCTTGTGCAACGCTCAAATGGTCCGTCATGGCTAAATGTTCTACGAAATCGACAAACGCG 901 970

CCGAGTCATCGTTTAACAACTCGCCCAGTTTTAAAGTGGACACCGCAGTCGGGTCGATGTCATCGAATTT PolyA site PolyA site 1040

GAAATAATACATGCCGTCTGTTCAATAAAGTTAACGATTCGGATGTTGAGACTTTATTATTTTGTCTTCA

Рис.5 (Продолжение, начало на стр.11)

Мы проводили секвенирование с расчетом чтения последовательности по двум цепям в районе вероятного расположения гена полиэдрина с использованием как стандартных условий для синтеза секвеназы, так и с применением смесей для увеличеня длины чтения. Схема определения последовательностей субклонов приведена на рис.4. В сумме было проведено 14 синтезов, данные радиоавтографов электрофоретического разделения которых были совмещены, используя пакет программ MicHroGenie (Merge Gels). В результате мы расшифровали нуклеотидную последовательность длиной 2300 п.н., первые 1300 п.н. которой приведены на рис.5.

1 2

3_. Анализ нуклеотидной последовательности центральной области Эа]I-И-фрагмента ДНК МпЫРУ

3.1 Последовательность кодирующей части гена полиэдрина

В составе определенной последовательности обнаружены две открытые рамки считывания с +1 по +741 и с +374 по +66 нуклеотид. Результаты предсказания первичной аминокислотной последовательности кодируемых ими грелков позволили предположить, что первая из этих рамок кодирует полиэдрин. Последовательность этого полипептида, длиной 2 46 а.к. приведена на том же рисунке. Вычисленная молекулярная масса данного белка ( 29.057 кД), а также аминокислотный состав предсказанного полипептида и других белков

Нол.вес Процентный состав белков ТВ (У-)

Вфус белка 1В Азр+С1и Агё+Ьуб РГ)е+Тгр+Туг+11е+Ьеи+Мег+Уа1

(КД) кислые ОСНОЕН. ароматич. ; гидрофобн.

МпЫРУ 29.0 ' 15.0 13.4 13.4 36.2

Астеру 28.6 14.7 13. 1 13.5 36.7

ВтЫРУ 28.8 14.3 13. 1 13.5 37.6 Д

НЬЫРУ 28.9 14.2 13.0 13.4 37.4 А

ОрНЫРУ 28.8 14.7 13. 1 13. 1 37. 6

SfNPV 28.9 14.2 13.0 13.0 38.2

РЬСУ 29.2 13.8 12. 1 13.8 37.2 [)

ТпСУ 29.2 13.7 12. 1 12.9 36.7 С

Рис.Ь Сравнение белков ТВ бакуловирусов группы А (АсМИРУ, ВтЫРУ, НЬЫРУ, ОрМЫРУ, SfNPV) и группы В ( РЬ6У и ТпвУ ) с предсказанным полиэдрином МпЫРУ по молекулярному весу и аминокислотному составу.

телец включений бакуловирусов практически совпадают (см.рис.6).

Вторая открытая рамка считывания (обозначенная 0КГ2 на рис.б) потенциально может кодировать белок молекулярным весом около 12 кД с основными свойствами. Не было обнаружено никаких существенных гомологии между нуклеотидными и аминокислотными последовательностями известных генов бакуловирусов и 01^2. 13

Рис.7 Гомология (отношение числа совпадающих

аминокислот к общему числу аминокислот, выраженное в процентах) между аминокислотными последовательностями белков телец включений восьми бакуловирусов, выравненных при помощи функции Protein alignment программы MicroGenie Version 5.2. Последовательности белков ТВ вирусов ядерного полиэдроза AcMNPV, BmNPV, OpMNPV, OpSNPV, MbNPV, и SfNPV показывают от 7 5 до 92 z , а вирусов гранулеза TnGV и FbGV - около 50 >■ гомологии с аминокислотной последовательностью ORF1 MnNPV.

Используя Функцию выравнивания белковых

>следо^ательчостей (protein alignment) пакета программ c!;roGer:ie мы определили процент гомологии (отношение числа впадающих оснований к общему числу оснований, выраженное в юцентах) предсказанной аминокислотной последовательности >лу т.рина HnllPV с последовательностями восьми Солкоз 13ЛИЧНЫХ бакуловирусов - вирусов ядерного полиэдроза ;MIirV, EmllP'v, MbHPV, SfNPV, OpHKPV п OpSHPV, а также фусок гранулеза PbGV и TnGV. Гомологии между полиэдрином I IIP V и полиэдринами других NPV достигал:: около 80 * а по ■несению к грануллнам - около 50 К.

Результаты вычисления , гомологии между

1Следовательностя!^л белков ТВ, известных к настоящему >емени и предсказываемой нами аминокислотной

>следователы;ости для полиэдрина MnI!PV-L приведены на [с.7. Обнаруживается явно Еыра>::енна' похожести

• слеповательностей полиэдриноз я.эуг на друга (около 35-90-''j отличия всех полиэуринов от гранулинов (гомология - около | У- ) . Такая же картина наблюдается и для гранулинов, но •нология мезкду последовательностями гранулинов ниже (77 v.).

Нас интересовали различия между последовательностью ■лиэдрина MntiPV и другими белками ТВ . для выяснения |зможных путей происхождения изучаемого вируса. Поскольку >п равнении полных последовательностей полиэдриков между бои явно выраженных отличий не наблюдалось, мы рассмотрели мологию отдельны*: регионов аминокислотной

'следовательности полиэдрина MnKPV с аналогичными регионами вестных белков ТВ.

Были выявлены обширные районы с гомологией, близкой к 0Z - среди них выделялся С-конец белка длиной около 50 к. с высококонсерЕатдвным. последовательностями, очень хожими у зсех бакуловирусных белков ТВ. Зариабельные йоны были локализованы с 1 по 25, с 40 по 56, со 107 по 1 и со 186 по 196 а.к. Мы обратили внимание на зариабель-й N-Конец белка, ответственный за взаимодействие с нукле-овыми кислотами [Козлов, 1981), и провели выравнивание N-нцевых регионов длиной в 25 а.к. всех девяти белков телец лючения. Один из вариантов выравнивания приведен на рис.8, и определенном'. порядке расположения последовательностей прашиваются выводи о ряде изменений следующих аминокислот белках ТВ вирусов ядерного полиэпроза:

15

1)- замена серина(12) на треоний у МпИРУ,

2 ) - деледия тирозина (4), а также замена треонина (5) па пролин, аргикина(б) на аспарагин и лейцина(13) на изолейцин у ВгаНРУ;

3)- замена аспарагина(5) на аспарагиновую кислоту и аспарагина(10) на аргинин у АсМНРУ.

1

ЫРУ-с (пег)

ормм>у . -

АсМ№У . -

&г№У . -

МпКРУ . -

МЬМРУ . -

5<ИРУ . -

Ор£№У . -

- РгоАгр

- РгоАгр

- РгоАэп ТугТЬгАгд ТугТггАгд ТугТЪгАгд ТугИгАгд

10

Туг$ггТуг Рго . Агд . Агд . Агп . Агп . Абп . А$п . Абп

20

С1уЛгдТЬгТугУа1ТугЛ5рАзШ.убТугТуг!.узЛ5П|.еи

ТПгИе..............

■тгПе..............

ТПгПе..............

ТЪПеи ..............

БеПеи..............

5ег1_еи ..............

Ьсг1си..............

. СУ-с 11егС1уТугА5п ЦеиАгдТугЭег РМУ .... АгдА1а . . . .1/5 ТпСУ .... 1.у53ег .... Агд

«¡г (ИуТГн-ТТи-СузУаП 1еАзрА5п Же 1уз 1еи

01и........С1п . Туг . Бгг .

Азп ........ Lys.Leu.Thr.

Рис.О Я-концевые последоват льности генов белков теле включения вирусов ядерного полиэдроза и вирусов гранулеза РЬСУ ТпОУ. НРУ-с и СУ-с означают, соответственно, консенсусы дл полиэдринов и гранулинов. Звездочками («) отмечены совпадет! между этими консенсусами. Горизонтальные линии(-) поставлены некоторых последовательностях для наилучшего, выравнивания.

3 ■ 2 Лидеркая последовательность

Компьютерный поиск гомологий выявил в составе определенно нами последовательности район с 176 по 221 Н. на 75-60 * гомо логичный 5'-нетранслируемым лидерным районам мРНК известных гено ТВ Сакуловирусов.

Мы предприняли попытку выравнивания таких лидерны последовательностей четырех известных генов белков ТВ вирусов АсМНРУ, ВпШРУ, КЬНРУ и 3<ЫРУ. а также последовательности ген полиэдрина МпЯРУ. Результаты предложенного нами вариант

16

-60 -40 -20 +1

««a««

SfNPV - TGCGGGAATTGTAAGTAATTTTT-TCCTTTCGTAAAACATTGTGAAAAAATAAA—TATA----ATC

lililí lili I I I I l I I I I l II <1 i « i i i i >

lililí lili I I I I I I I I l i ti ti III lili

HbNPV - TTTGGGAAATGTAAGTAATTTTC-TCCTTTCGTAGAAGATTGTGAAAAATAAAA--TATA----ATG

lililí lili I I l l l l l l » i II II lll lili

lililí I < 1 1 » » I I I I I I > .i li il lll lili

MnNPV - ACATACACAGATAAGTATTTTTA-TTCTTTCGTAAAAAAATTAGAAAAATAAAA--TATAAA—ATG

lililí lili I I I i l l I I i i II II lll I i i I

lililí I I I I I I I I I I I I l l l i II lll lili

AcMNPV - TCGCAAATAAATAAGTA-TTTTACTGTTTTCGTAACAGTTTTGTAATAAAAAAACCTATAAAT-ATG

lililí lili I I I I I I I I l i II II lll I t l t

lililí lili I I I I I I I I i l II II lll lili

BmMNPV - TCGCAAATAAATAAGTA-TTTTACTGTTTTCGTAACAGTTTTGTAATAAAAAAACCTATAAATAATG

Рис.9 Выравнивание нетранслируемой лидерной

хедовательности шРНК пяти бакуловирусов. Стартовый кодон 5эдренного белка обозначен в позиции +1. Консенсус 5'-1а поздних транскриптов бакуловирусных генов обозначен

* *х ). Строгая гомология во всех пяти выровненных ¡едовательностях показана вертикальными линиями. Число 1адений между всеми пятью последовательностями в каждой 1ции показано на гистограмме.

тнивания приведены на рис.9. В качестве точек отсчета i были" выбраны TAAG-консенсус для лидеров мРНК многих 'ловирусных генов [Possee et а 1 . , 1990; Pullen & Possee, i; Leisy et al ., 1966; Russell & Rohrraann, 1 990; Bickneli 1987; Theilmann & Stevart, 1990; Craftword, 1988) а се сайт начала трансляции ATG.

Выявляются несколько зон строгой гомологии у всех 5-тн ров. Кроме этого, по сравнению с последовательностью,

лежащей выше TAAG-консенсуса, уменьшается "вырожденность" на протяжении всей лидерной последовательности, а число совпадений в каждой позиции для всех лидеров обнаруживает тенденцию к увеличению.

Возможный консенсус для лидерных последовательностей, выведенный на основании такого сравнения, выглядит следующим образом:

G А ССТТ GCATAGTT Т ТТ СО ДАТА

5 >-ATAAGTA-TTTTA-TCCTTTCGTAAAAGATTTGGAAAAAAAAAA--TATAJ---ATG

Т Т G ,-j С А |

Таким образом, мы предполагаем, что 5'-конец мРНК полиэдрина 1 локализован в позиции -45 от начала трансляции белка. Основы: на литературных данных о взаимном расположении промот< последовательностей у бакуловирусных генов [Summers & Smith, и других эукариотических" генов [Siebenlist et al., i960], попытались найти канонические- консенсусы, расположенные до н; транскрипции полиэдрина HnNPV.

3.3 Промотор гена полиэдрина MnNPV

В случае последовательности гена полиэдрина Mr определенного нами, можно предварительно говорить о возможном блоке в позиции -67 от старта трансляции (ТААТТАТА) и о с; блоке в позиции -78 (TAACAATGT). ( на рис.5 эти блоки поме двойной линией). Расстояния между этими блоками нескс отличаются от таковых, какие были обнаружены ' у гена полиэг прототипного вируса ядерного полиздроза AcMI-iPV.

Точная локализация промоторных консенсусов тре дальнейшего изучения на уровне транскрипции мРНК полиэдрина.

3.4 Сигналы полиаденилирования полиэдриновой мРНК MnNPV

По данным [Kang, 1967] ААТАА-последовательность

бакуловирусных генах служит сигналом полиаденилирования ы также как и у большинства эукариотических генов. В обла непосредственно лежащей за С-концом кодирующей рамки полиэд были обнаружены две ААТАА последовательности в позициях 97 5 и на рис.5. Эти возможные сайты полиаденилирования мРНК полиэдрина MnNPV находятся приблизительно на 100 п.н. ближ терминаторному кодону кодирующей последовательности по сравнен геном полиэдрина BmNPV.

18

---• 638 т.п.н. от С конца ОЯП

-------->1300 т.п.н. от Н конца 0!?Р1

300 ЛОТАвААС-ТА ТССССТТТТб АТТТСАСАТС ОТСССААТТТ СаТССААТСС ТСОТССТТСТ

361 СПСССАССА АСАССАСОАС АТТТТАТТСС СТТААААССА ГТТТТААСеС ССТТССТАТТ

421 СССССТОТСТ ССЮТТСААТ ОСТТТТТТТС ОТСОТТАСТб АСАСАСОТТТ ТЛАТТТАСвТ

<81 ТТАТСАТТТС СТССААААбТ АААСТТСТС& ААТСТСТТТО СОААТТОТТС ССТТТСАС'.Т

541 ЮТТТАСАСС ТСОйТТТСАА ТТТТАТАССС ТОСТ* ТА Ш? АЛСССАЛСАЛ А ТС Г. СС ТС ТА

Ь01 СССТСССААА АССАСОАТСО ТСССС.ОССТТ бТАТТССТАС ТТСТАТТОТС АТОлТААТСА

Ь61 ААССТТТеТС ГОССОТССТ СОССССССАв ССССЛССТАС СААСввААСО бллстввссо

ТбеСССТОСС СС/^ГСССС 0Т6СЛ/|-)С0Л ТССТОССОСС ТССОЛССОТО СЗТААТССТб

Г81 ОТ^ССОСОй СбСАООСООТ ССЛСОСОТТА ЗСЛАТСйОАС АТвАТСТТСТ ССАТССААСТ

141 6ТТСТТСТТС йЛАТАТТАТТ ССТССТСААТ АТТАТСбСАС ТАСААТТСАТ АОТТТСАТТТ

'01 АСААСААСАС СОГСАТСйТТ ТАТСССАСС! СОТСбАССТб САОбСАТССА АССТТТСССТ

600

700

800

900

1000

юо

2 3 Э 2322 32 223

кнрч----------;: ¡-;:-------------:-:-;-:;;:: : — !:;-

з

2

2 2 332 2323 2233 2 2 ирч --------!-:;-:------:--:-;::::----:;:::::: — :::: :: — :: — : —

Рис.10 А - Нуклеотидкая последовательность ввИ-богатого >айона, расположенная в координатах + 1 300; 1900 (см.рис.3, 4).

В - распределение СбЫ-повторов, расположенных за :-концок кодирующей части гена полиэдрина ИРУ Ощуа 1веибо1хи£а1а и ИРУ Мл]асояота пеих1гла. Нумерация ¡уклеотидо, начинается от С~;онца гена полиэдрина ОрМИРУ и 1пИРУ */- 20 п.н. ССМ-повторы показаны вертикальными линиями ! ). а случае расположения рядом нескольких повторов, над ертнкальной линией указано их число.

19

3 . S 3 ' -терминальные GGN-повторьг гена полиэдрина Mnj(ОТ

На расстоянии приблизительно 700 п.н. от 3 -конца открытой рамки считывания были обнаружены GGN-богатые повторяющиеся области. Аналогичные последовательности обнаружены зг геном полиэдрина OpMKPV [Chen et а!., 1988). Распределение GGN-повторов для OpMíiPV в районе 3' фланкирующей области полиэдрина и последовательности, определенной нами, приведены на рис.10. Роль Этих повторов ждет еще отдельных исследований, которые могут оказаться интересными, т.к. подобные районы найдены вблизи многих сверхэкспресоирующихся генов.

Создание тест-системы на сирус MnNPV

" Кы создали тест на вирус ядерного полиэдроза кольчатогс шелкопряда MnHPV на основе обнаружения специфически: последовательностей ДНК MnNPV, поскольку наличие вирусны: ДНК с высокой долей вероятности позволяет судить о наличи! вируса, способного к инфекции, а Д::К-ДНК-гибридизационн1л подход позволяет достичь высокой чувствительности i специфичности. В качестве зонда для гибридизации был выбра! клонированный и секвенированныи нами консервативны! облигатный (для репродукционного цикла вируса in vivo) reí полилдрина MriHPV. Данный ген (длина Кедирующей «асти 73 ( п.н.) содержится в центральной часст вставки длиной 3.; т. п.н, плазмиды рМпРЗО, созданной нами путем к.юнировани: Sal I-R-Фрагмгнта ДНК KnííPV (см. рис.3, 5)

Сам метод определения был основан нами на ДНК-ДНК-спот гибридизации на капроновых фильтрах - производства "Hiji Kallur" (Эстония) и отработан в двух Модификациях - н основе радиоактивно меченного и на основе биотинилированног зонда рМпРЗО.

Мы разработали простой и быстрый способ поцготоик образцов перед нанесением на Фильтр: к исследуемой аликвот добавляли равный обьем щелочного раствора 0.2 N НаОН в 2 кратном SSPE. Таким образом достигалось растворсни полиэдров и разрушение вирионов с одноврепенны высвобождением из капсида и денатурацией вирусной ДНК способной ковалентно связываться с нейлоновым Фильтром.

Подготовленные образцы (0.05 - 1.00 мл) наносили н фильтр при помощи проточного спог-аппарата собственной кон струкции. Гибридизации проводили в течение 12 часов в среде содержащей 4XS5PE, 7% SDS, o~CU формамид, 100 мкг/мл гепарин

го

10 '/. декстран-сульфдт и ДНК-зонд. Отмывали дважды по 15 мин в 2xSSC, О. IX 3D3 и дважды в растворе 0 . 5xSSC, 1.0 У. SDS.

Для мечения использовали реакцию ник-трансляции ДНК ЦНК-полимеразой I (Enzimas, Вильнюс). В первой модификации в качестве предшественника брали ЗзР-меченные НТР (Ташкент). После гибридизации и отмыва Фильтр радиоавтографировали.

Во второй модификации в качестве предшественника использовали биотинил-11-dUTP (НПО"фермент"). После гибридизации и отмыва прозодили реакцию с коньюгатом стрептавидин-пероксидаза (НПО "фермент") и выявление Ферментативной активности пероксидазы о-дианизидином в присуствии перкосида водорода.

Результаты гибридизации с радиоактивно меченым зондом и с биотинилированным зондом приведены на рис.12. Видно, что в данных условиях гибридизации с последующей жесткой отмывкой, положительный сигнал дают лишь препараты, содержащие специфические ДНК-HnNPV (как очищенный препарл-г, так и интактные полиэдры); вирус ^ранулеза(гранулы и ДНК) и контрольные ДНК Фага EMBL3 не обнаруживаются тест-системой.

Абсолютное значение количества полиэдров в известном обьеме нанесенной пробы можно определить либо путем визуального сравнения сигнала гибридизации с серией разведений стандартной супензии известной концентрации, либо более точно - путем сканирования зон потемнения на рентгеновской пленке при помощи сканирующего

спектрофотометра BecKman UV-Vis U3, построения калибровочной Функции зависимости суммы оптической плотности от количества полиэдров на спот и вычисления из этой Функции количества полиэдров в точке нанесения. Зная обьем нанесенной аликвоти, можно вычислить концентрацию полиэдров в исходном препарате.

Первал модификация ( использование ник-транслироаанного

згР-мечеНног"о зонда - плазмиды рМпРЗО ) позволяет достичь чувствительности 10 пг ДНК/спот или Юи полиэдр/спот. Применение меченого биотинил-11-dUTP-зонда дает меньшую чувствительность (100 пг ДНК/спот или 1000 полиэдров/спот), но зато более удобно в лабораторной практике(нет необходимости работать с радиоизотопами; срок применимости зонда Ьозрастает с нескольких дней до 4-6 месяцев; общее время анализа от подготовки зонда до получения изображения уменьшается с 3-х суток до 24 ч.)

¿1

А Е С С £ ? 6

О.

с- - о

^ о

&

11.

1 , -

Рис.11 Результаты ДНК-ДНК гибридизации: I. - с 32-1-меченной плазмидои рМьР30( гена полиэдрина Ка1асовоша пеияпа)

последовательног'

г, 3, г. з,

4 ) 10, 100, 1000, 10000

4 ) ю, юо, юоа, юооо

г, з, 4 ) 1, ю, юо, юоо пг

А - полиэдры МпЛРУ - (1, Б - гранулы РЬСУ - (1, С - буфер для нанесения Б - ДНК . ЬйУ • " (1,

2 - ДНК МпНРУ -. ' >

Г - ДНК фага - ''

у - длк рМпрзо

II. - с биотинилированной плазмидой рМпРЗО, с последук-щ обработкой коньюгатом стрептавидин-пероксид-аза и цветн реакцией с о-дианизид! ом.

А - полиэдры МпМРУ - I -10 .10 ,10 ,10 ,10 ,10 ,10 ,10 ) В - ДНК ИпНРУ - (10 ,10 ,10 ,10 ,10 ,10 ,10 ,10 ) 11Г

С - гранулы РЬйУ - ' '

С - ДНК РЬбУ - ' •

га

По тем же причинам применение Слотинилированного зонда :омендуется нами для практического количественного и .ественного контроля при производстве инсектицида на ове KnliPV. ;оды

Путем рестрикционного анализа генома Еыявлена ■ерогенность двух изолятов вируса ядерного полиэдроза ¡¡¿läcosnma neustria - MnííPV-L (Латвия ) и MnHPV-A >мения ) .

В Sa 1I-R'фрагменте генома HnHPV-L локализован ген Шадрина.

Определена нуктеотидная последовательность гена Шадрина MnNPV и прилегающих" к нему областей; обнаружена :рыта.ч рамка считывания, предсказанная аминокислотная ¡ледовательность котором показала высокий процент ЮЛОГ11Н с известными последовательностями белков телец иочения Оакулозирусов.

b прочитанной юследоват^льности обнаружены консенсусы i промоторов транскрипции, нетралслируемых 5'-концезых 1астей и саитои полиаденилпрования поздних бакуловирусных

юв.

В геноме 'MnHPV выявлены GGII-noBTopHKcyiecH участки, ¡положенные на расстоянии 700 п.н. за концом кодирующей следовательностл гена долиэдрина.

Па базе рекомбинантной плазмиды рМпРЗО, содержащей ген Шадрина, разработаны высоксспецифические ДНК~ДНК-гибрили-Uioiiüue тесты на MnílPV в насекомых, препаратах инсектиц да в окружающей среде. Чувствительность метода, используя '-меченные зонды составляет 10 полиэдр/мл, а Радиоактивные биотинилированные зонды - 100 полиэдр/мл.

теме диссертации опубликованы следующие 7;»боты: 11 U арипо A.B., Эглите l'.A. Геномная гетерогенность дгух элятов вируса ядерного полиздроза кольчатого шелкопряда // ).конф."Проблемы создания и применения микробиологических гдств защита растении", Велегож-1969.- с.179

Шарило A.B., Эглите Г.А. Сравнение картин :пределения рестрикционных фрагментов ДНК географически 1ленных изолятоа вируса ядерного полиздроза кольчатого чкопряда // Latvijas ZA Zinatnes vestís -1969.- С.120-121 3. Эглите Г., Шарипо А Биохимические исследования приро-

23

дннх иэолятов вируса ядерного полиэдрог кольчат шелкопряда Malacosoma neustria // " Эксперимент лль:

биология", АН Литвы -1990.- т..2.- C.lfl5-ie6

4. Эглите Г.А., Иарипо А.В., Зариньш Ji.A. Влит наполняющих вещест иа качество вирусного инсектицида ЬИР) КГ // Тез.конф."Защита растений и охрана•природы", Дотну1 Литва - 1909.- Т.1.- С.109-110

7 . A.Shanpo, A.Leonchiks, A.Vilnis The structure о: polyhednn gene from Malacosoma neustria nucli po 1 yb «-1ros i 5 ' virus Latvian isolait (Mulil

L¡//Pi oc.Lat.Ak.Se 1.- 199l.-No 6." P.34-37

6. L.'Jankevica, A.Sanpo. Petijucni par enUmopatoui virusu saglabasanos daba uz ciazaniem substratiera atkariba piiîietota însekticida preparacivas forna; //Konf.te; "Augu • un kukainu vîruss 1 uni bas", Jelgava.% Latvija - 19S 17.1pp.

5. А.Э.Вилнис А.В.13арипо, A. Э. Леоичикс, Е.В.Лесих;!' Разработка .специфических методов определения бакуловирусо! окружающей среде Тезисы Всесоюзной конференции "Нои направления биотехнологии".-1990.-, Пущино-на-Оке.

6. А.Э.Ьилнис, А.В.Шарипо, А.Э.Леоичикс, Е.В.Левицка И.А.Друка Исследование випуса ядерного полиэдре кольчатого шелкопряда MnîlPV и конструирование количе£тсенн методов его определения в окружающей среде и вирусн инсектицидах ВИРИН-КЫ.// Тез. Всесоюзного 'совещан

Молекулярная биология ДНК-содержащих вирусов, имеющих практическое значгние для сельского хозяйства и медицины 1990, Киев, с.112.

Автор выражает признательность канд. биол.наук. Я. Нелдрайсу за содействие в выборе темы, канд. биол.на И.Зарнню, канд.биол.наук Г. Эглите за обеспечение вируса материале , канд. биол .наук. 'А.Авотсу и Я ■ Рима л за поношь освоении методик секзенировання, канд.^ед.наук В. Ого канд. биол.наук. А.Друка за ряд полезных замечании к рас-от канд. фкз. -пат. паук В.Савенкову за консультации программному обеспеченно. Постоянной во все время выполнен, работы Сила всесторонняя пс-ыощь руководителя раОо к.'.нд, биол.наук А.Билнис

24