Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ранняя диагностика инфекционных заболеваний лесных чешуекрылых и ее использование для оценки состояния популяций

ВАК РФ 03.00.09, Энтомология

Автореферат диссертации по теме "Ранняя диагностика инфекционных заболеваний лесных чешуекрылых и ее использование для оценки состояния популяций"

р \ и « "

1 о М»Р

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ПО ВЫСШЕМУ ОБРАЗОВАНИЮ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ЛЕСА

На правах рукописи БАРАНОВ Алексей Юрьевич

РАННЯЯ ДИАГНОСТИКА ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЛЕСНЫХ ЧЕШУЕКРЫЛЫХ И ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ ОЦЕНКИ СОСТОЯНИЯ ПОПУЛЯЦИЙ

03.00.09 — Энтомология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертация на соискание ученой степени нидидата биологических игуж

Москва —

1 995

Работа выполнена па кафедре промышленной экологии и .защиты леса Московского государственного университета леса.

Научные руководители — доктор биологических наук,

профессор А. И. Воронцов;

кандидат биологических наук, доцент М. А. Голосова

Официальные оппоненты — доктор биологических наук

С. С. Ижевский;

кандидат биологических наук,, доцент Л. Н. Щербакова

Ведущая организация — Всероссийский научно-

исследовательский институт

■сельскохозяйственной

микробиологии

Защита состоится » ^'/у^2/1^. 1995 г. на заседании специализированного совета Д 053.31.03 при Московском государственном университете леса в У.^?. . час. . . мин, ауд. 313.

Отзывы на автореферат В ДВУХ ЭКЗЕМПЛЯРАХ С ЗАВЕРЕННЫМИ ПОДПИСЯМИ просим направлять по адресу: 141001, Мытищи-1, Московской области,. Московский государственный университет леса. Ученому секретарю.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного университета леса.

Автореферат разослан » 1995 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук,, доцент Е. Г. КУЛИКОВА

Подп. к печ. 15.03.95 г. Обьем 1 п. л. Зак. П5 Тир. 100

Типография Московского государственного университета леса

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. Прогноз динамики численности чешуекрылых фитофагов, многие из которых относятся к широко распространенным и значимым вредителям леса, имеет определяющее значение для системы принятая решения о целесообразности защитных мероприятий в их очагах. Прогноз, как известно,базируется на комплексе показателей, среди которых одним из главнейших является степень инфицирования насекомых энтомопатоген-ннми микроорганизмами.Их видовой состав чрезвычайно разнообразен, а степень воздействия на популяцию насекомого-хозяина варьирует в значительных пределах.

Для чешуекрылых особенно большое значение имеют внутриклеточные патогены- вирусы и микроспоридии,способность которых передаваться из поколения в поколение делает их особенно перспективными агентами регуляции численности вредителей леса. Особенно сложно выявление болезней в популяциях чешуекрылых на фазе яйца. При этом существующие метода диагностики болезней и определения степени й.характера проявления инфекции достаточно трудоемки и недостаточно точны. Это послужило'причиной поиска новых,более точных и универсальных методов анализа яиц чешуекрылых насекомых, требования к которым можно сформулировать следующим образом: . •

- метод должен быть надежен и фиксировать наличие патогенов по их непосредственному воздействию на клетки насекомых и их производные;

- метод должен быть применим к.любому из внутриклеточных патогенов, пере дающихся трансгенерационш;

- метод должен быть воспроизводим на различных видах чешуекрылых насекомых.

Цели и задачи исследований. Целью исследований явилась разработка универсального метода оценки пораженности популяций чешуекрылых насекомых болезнями, вызываемыми вирусами и микроспоридиями, на фазе яйца и основанного на выявлении признаков патологического изменения хориона яиц под воздей-

ствием патогенов. Постановка вопроса основана на гипотез« согласно которой: переход энгомопатогенов, находящихся в актш ной форме, невозможен без инфицирования клеток , напрям; соприкасающихся с ооцитом ( например , клеток фолликулярно] эпителия ). Следовательно,при инфицировании этих клеток доли произойти нарушение • их функциональных особенностей', чт< несо|дненно , скажется на морфологических и физиологичесм характеристиках яйца. В . процессе исследования ставили! следующие задачи:

. - изучить морфологию поверхностных структур хориона лесш чешуекрылых насекомых и разработать модифицировав: терминологию описания хориона;

- изучить условия возникновения трансгенерационной переда' вирусов и микроспоридий при эксперщентальном инфицирован популяций лесных чешуекрылых и при активации латентн инфекции " или. хронического заболевания;

- изучить патоморфологическое влияние внутриклеточных энтом> патогенов на хорион яиц чешуекрылых насекомых и огаса симптомы проявления заболеваний;

- изучить.связь между жизнеспособностью популяций - насекомых наличием патологических изменений хориона и показа принципиальную возможность использования этого явления прогнозе, динамики численности чешуекрылых .фитофаго

. Научная новизна исследований. Впервые проведено морф логическое.описание фазы яйца'для 20 видоЬ лесных фитофаго На основе литературных . данных и собственных исследован предложена, модифицированная терминология таксономическо описания поверхностных структур хориона Iepldopíeгa. Вперв для чешуекрылых насекомых показано патоморфологическое влиян трансгенерационной передачи внутриклеточных патогенов на ра личные структуры хориона и исследована симптоматика этого яв ления. Впервые показана связь патоморфологических изменен хориона и инфицирования популяции чешуекрылых в целом и сдел вывод о возможности использования полученных данных д прогноза численности . популяций чешуекрылых фитофагов.

Практическая значимость работы. Результата проведенных сследований могут быть использованы в различных областях лес-эго и сельского хозяйства: модифицированная терминология Ошанин яиц насекомых может быть использована для описания арантинных видов,так как таксономическое определение на фазе йца особенно затруднительно; метод оценки состояния популяций о структуре хориона может быть применен для составления рогнозов динамики численности лесных вредителей или для рогнозирования развития эгшзоотий в лабораторных популяциях, апример , при производстве вирусных бяоинсектицидов.

. Апробация работа. Основные положения диссертации окладывались на Всесоюзной конференции молодых ученых . Биологический метод в интегрированной системе защиты с'ельско-озяйственных (культур, от вредителей , болезней и сорняков"- . Кишинев,1985 г.). на Всесоюзной конференции по электронной икроскопии ( Москва,1988 г.),на XII Международном симпозиуме о энтомофауне Средней Европы ( Киев,1988 г.), на конференции олодых ученых и специалистов " Интенсификация • лесного озяйства в Западном регионе СССР ( Гомель,1990 г.), на XIX еждународаом конгрессе IUFR0 ( Монреаль, 1990 г.), на X Съезде ¡сесоюзного Энтомологического Общества ( Ленинград,1989 г.),на V Съезде Украинского Энтомологического Общества (Харьков, 992 г.), на Конференции по технологии защиты окружающей среда Хошимин, 1993 г-.). По материалам диссертации опубликовано 2 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из ведения ", трех глав , выводов ■ и практических рекомендаций, ¡писок использованной литературы включает 208 названий,в том :исле 112 иностранных авторов. Работа содержит 115 страниц шинописного текста , 42 рисунка , 14 таблиц. Общий объем иссертации 129 страниц.

СОДЕ^ЗЫЕК РАБОТЫ

I.Современное состояние пробльмы и метода исследований

Исторически морфологическое изучение насекомых ориентировалось преимущественно на имагинадьную фазу развития , реке на фазу личинки, или куколки. Морфология яиц насекомых почти не изучалась в связи с мелкими размерами объектов , трудностью поиска яиц в природе и малой разрешающей способностью светового микроскопа. В отечественной . литературе вопросы морфологии яиц освещены достаточно скудно. Наиболее удачным можно считать краткий обзор строения хориона чешуекрылых у Н.Я.Кузнецова / 1915 /, где приведена библиография того времени и основная терминология. Более полное исследование по морфологии яиц насекомых отряда Lepldoptera было представлено Дерингом / During ,1955 /, исследовавшим на уровне световой микроскопии большое количество видов из различных систематических групп.В настоящее время с развитием методов электронной микроскопии опубликовано большое количество работ по оотаксо-номии различных групп насекомых / Hjjiton , 1981;Krysan ,1987; Salkeld ,1983, 1984 ; Lillehammer,1987 ; Kula.1988"; Arbogast, Byrd,1982; Kopelke,Muller-Llebenau,1981; Halrston,Yoon,1982 ; Долинская,1987;1989 ; Baranov, 1988; Раевский,Баранов,1990 / и показана принципиальная возможность идентификации их видовой ( близковидовой ), подвидовой и популяционной принадлежности / Scall , Mazsini , 1982; Scall et al., 1987 /.

Для изучения морфологии хориона чешуекрылых и оценки влияния на .'нее трансовариальной передачи энтомопатогенов были использованы яйца , гусеницы и ■ бабочки следующих видов: лунка серебристая (Fhalera bucephala L.), шелкопряд-монашенка (Lymantria nanacha L.),златогузка (Euproctis chrysorrhoea L.), непарный шелкопряд {Lymantria diapar L.), кольчатый шелкопряд (ЫаХасозогю neustria i.),античная волнянка <Orgyta anttqua I.) американская белая бабочка {Hyphantrla cunea Drury,), сосновый шелкопряд ('■ Dendrollmus pint L. ) , сибирский шелкопряд (dendrol Шиз albirtcua Tschetw.), ивовая волнянка ( leucoma

aallcia L.), тутовый шелкопряд ( Bombyx morí L. ) , большая тополевая стеклянница- ( Aegeria api formte Cl.) , волосистая пяденица - шелкопряд (Phlgalla pedarla F.), сливовая хвостатка ( Strymon prvnl L. ), хвостатка ( Strymon spini Schiff'.), березовая хвостатка ( Thecla betulas L.), ореховая плодожорка ( Sarrothrlpus misculam Erhch.), китайский дубовый шелкопряд (AntTieraea pernyl Guer.), ильмовый ногохвосг ( Exaereta uMl Schff.) , собранные на территории СССР и СРВ.

Насекомые содержались по 10 особей в чашках Петри диаметром 100 мм при кормлении искусственной питательной средой (ИПС) или . в садках ( 200 х 200 х 200 им ) на букетах кормовых растений до окукливания . Отродившиеся или пойманные на свето- . ловушку бабочки содержались в лаборатории до откладки яиц; питающихся tmágo подкармливали раствором меда с добавками, фитогликозидов / Руснак .Балашова , Кинтя , 1988 /.

Для изучения использовали фертильные и стерильные яйца. Часть материала получена при анатомировании самок по следующей методике: насекомое замаривается , его крылья сжимают мягким пинцетом , выделяя нижнюю • часть брюшка; делается надрез гиподермы в районе VI - VII стернита , после' чего брюшко разрезается до II - III стернита; разрезается медиальный или латеральные .яйцеводы и филаменты в районе прикрепления к мембране; пинцетом извлекаются яйцевые трубочки и помещаются в воду; при потряхивании пробирки сформированные яйца выходят из яйцевода. '

Энтомопатогенные микроорганизмы для проведения исследований были получены из лабораторий МГУЛ, ВНИИ биологических методов защиты растений (.Кишинев ), Российско-Вьетнамского Тропического Центра ( Ханой ) или выделены из природных популяций насекомых. Выделение проводили по общепринятым методикам / Шгейнхаус.1955; Полтев,I969;ВеЙзер,1972; Евлахова, 1974; Гулий.Рыбина, 1988 /. Видовая 'принадлежность патогена определялась по ' морфологическим .-характеристикам ■ структур микроорганизма в пораженных тканях хозяина при использовании методов световой и сканирующей электронной микроскопии,а также методов электронной гистохимии / Reynolds ,.1963;

- в -

Гайер,1974; Уикли,1975; Nation, 1983; Иванова - Казао.1986 /

Для проведения экспериментов отбирали гусениц целевь насекомых старших возрастов. Инфицирование проводили нуте ' внесения в корм (в ИПС или на листовую пластинку ) часп патогена. В ряде экспериментов инфицированное потомст! получали при провоцировании латентных вирусных инфекций микррспоридиозов. В качестве стресс - факторов использона.) изменения • температурного режима , режима питания , повышен! плотности содержания гусениц , заражение патогенами с болыи инкубационным периодом ( например , вирус цитоплазматичесюл полиэдроза (ВЦП). Оценка активности патогенов проводилась i смертности яиц и гусениц , по присутствию патогена экскрементах и меконии насекомых. Статистический анаж полученного материала проводили по общепринятым методакг ' /Терентьев,Ростова,1977;Доспехов,1979;Лакин,1980;Менчер,1981/ При проведении экспериментов по активности патогенов рассчет вели по формулам Кербера и Аббота.' Всего в экспериментах. Ouj использовано более 15000 гусениц, 800 имаго и проанализирова! более 2500 яиц.

2.Морфология хориона чешуекрылых насекомых

Накопленные более чем за сто лет результаты изучеш оболочек яиц насекомых заложили основу развития оотаксоном» как самостоятельного направления систематики насекомы? Различное толкование,а иной раз и несовпадение терминов,силы усложняют морфологическое описание структур,особенно если pev идет о сопоставлении данных световой и электронной микрс скогши. Кроме этого , при интерпретации данных электроннс микроскопического анализа описание структур и оеобеш структурированности объектов может бить чисто субъективным лишенным . смысла без . приведения электроннограммы.

С целью унификации терминологии при таксономическс описании хориона чешуекрылых на основе анализа научнс литературы и собственных дайшх можно предложить следу ющ ■ схему и . терминолог}по описания ( рис. 1,2 ) :

антериальный полос* аэропиле*' латеральная поверхность яйца вертикальное ребро горизонтальное ребро ПОЛИГОН' постериальный полюс* основание яйца

кикропиле микропилярная розетка* микропиллрная впадина лепесткообразная клеткам переходный пояс* микропилярная зона

Рис Л Морфология поверхностных структур хориона яиц чешуекрылых насекоиых ( по During, 1955¡модифицировано).

I. Тип откладки яиц.

II. Тип яйца ( стоячий или лежачий ),его размеры .

III. Микрошишрный аппарат - описание может включать в себя: полюса - верхняя и нижняя точки яйца; указывается положение

микропиле на антериальном (anterial) - верхнем или постериальном ( posterlal) нижнем полюсе яйца; ыикршиле - отверстия в хорионе , обеспечивающие прохождение I сперматозоида внутрь яйца¡указывается количество и

* диаметр отверстий;

ыикропилярная розетке -состоит из микропиле и лепесткообразных клеток; указывается количество лепесткообразных 'клеток и количество порядков лепесткообразных клеток; чаще всего лепесткообразные клетки хорошо выделены морфологически и от них берет свое начало система аэропиле и система ребер; лепесткообрэзная клетка - структурный элемент микропилярной

I розетки;

шшропилярная впадина -впадина в центре микропилярной розетки, на дно которой открываются отверстия микропиле; переходный пояс - отмечен у некоторых чешуекрылых и представ-• ляет' собой плохо- или неструктурированную поверхность между микропилярной розеткой и системой ребер;

иикропилярнйя зона - охватывает, микропилярную розетку и переходный пояс;

IV.Система аэропиле

аэропиле - отверстия в хорионе,связанные с трабекулярным слоем хориона и обеспечивающие газообмен в процессе развития эмбриона¡указывается тип строения аэропиле, размеры структурных компонентов и тип расположения ( одиночно, парами и т.д. ) в зависимости от места расположения относительно полюсов; подсчитывается общее' количество аэропиле в. системе; латеральная поверхность яйца -боковая поверхность между микропилярной зоной и основанием яйца; основание яйца - место прикрепления яйца к субстрату ;по

микропиле

иикропилярная' розетка

микротишрная: впадина

лепесткообразкая клетка

аэропиле

/7^

трабекулярный* слой

щ0{

Щ00

Рис .2 Морфология и структурная организация. хориона яиц чешуе!фылы2 насекомых .

площади может варьировать до точки постериального полюса; обычно граничит с системой аэропиле; гадропиле -аналог аэропиле,отвечает за водоснабжение эмбриона;

V.Система ребер

ребра - структурные элементы хориона , образованные выпячиваниями или впадинами хорионного матрккса и создающими систему грубой структурированности поверхности хориона; могут быть вертикальными и горизонтальными или создавать сетчатую структурированность; указываются размеры ребер и тип их строения; при вертикально-горизонтальном расположении ребер указывается их количество;

VI.Система полигонов

полигон - поверхность хориона,образованная пересечением ребер;

указывается.форма полигонов .размеры и их структурированность (степень структурированности,характер). Естественно , что предлагаемые термины не охватывают всех возможностей описания хориона насекомых. Экстрахорион (extrachorion), эпихорион ( eplchorion) и. другие , по поводу которых идет дискуссия в научной литературе / Longo et al., 1982;Vlscuso et al.,1984/, еще не описаны для чешуекрылых.

К аномальным изменениям хориона можно отнести изменения в ультраструктуре и морфологии хориона,появившиеся ъ результате споцганных или направленных мутационных процессов.В частности, у тутового шелкопряда как у наиболее изученного представителя чешуекрылых,отмечены подобные изменения: хорконовая мутация Gr16 нарушает структурную организацию хориона /Gautreau et al, 1989/; мутации sm.Sme изменяют форму яйца / Tazlroa, 1964 / ; мутация npl - "сосковое яйцо" нарушает морфологическую организацию хориона 'в зоне микропиле и препятствует оплодотворению / Ратькин.Кузенкова, Габер.1981; Ратькин, 1981 / ; мутация Ge индуцирует формирование особенно крупных яиц' / Kaviamura.Nakada, 1981 / ;у полиплоидных линий шелкопряда увеличиваются размеры полигональных структур в центральной части латеральной области оболочки яйца; у триплоидаых яиц рисунок микрогалярной области становится более крупным,чем в норме и. имеет композиционные

нарушения / Katsuno, 1984а; 1984fc /.

Для Pyrodercea rlleyl в качестве аномалий Арбогастом и Бирдом /Arbogast, Byrd,1986 / было описано наличие на хорионе косых и продольных ребер,не достигающих обоих полюсов яйца,в результате чего на латеральной части яйца появлялись полигоны неправильной формы. Отмеченные у РугаЛз fartnalis нарушения в структуре микропилярной розетки- - вмятины, срастания краев сильных вмятин - названы аномалиями / Arbogast, Byrd, 1981 /, хотя , вероятно , речь идет о повреждениях или инфекционной патологии.

В процессе изучения хориона аномалии микропиле .наблюдались у непарного шелкопряда,соснового шелкопряда, китайского дубового шелкопряда и большой тополевой стеклянницы. Они выражались в увеличении количества микропиле и непропорциональному разрастанию микропилярной розетки с увеличением количества лепесткообразных клеток. Иной тип аномалий может проявляться в расположении аэропиле на поверхности полигонов или их неправильное распределение на системе peöep (отмечен у непарного шелкопряда и ореховой плодожорки ).

Основной чертой,объединяющей аномальные изменения хориона является то, что все они не носят деструктивного характера и являются следствием изменения , а не нарушения программы хориогенеза.

3.Патология хориона чешуекрылых насекомых

Трансгенерационная передача внутриклеточных патогенов.

Вопрос о патологических изменениях хорионннх структур яиц чешуекрылых насекомых прямо связан с передачей эитомопятогенов из поколения в поколение, так как подобные изменения хориона, по-видимому, являются исключительно следствием заражения дочернего поколения инфицированными родителями. Ранее трансгенерационная передача энтомопатогенов и симбионтов отмечалась многими авторами.Она может быть реализована различными путями: трансспермольно / Ефименко ,1989; Afzellus et al , 1989 /, трансоварпально и трансовально / Brooks ,1968; Hamm .Young ,

1974 ; A1-Khalifa ,1984; Nair, Jacob, 1985; Kltajlma et al., 1985; Yoshlo,Yasuhlsa, 1987 /, трансгенно / Гершензон,1969 /.

По, литературным данным можно сделать вывод , что передача стбпоттвстх микроорганизмов у самок насекомых происходит в гермарии на ранней стадии развития ооцита. Инфицирование вирусами и микроспоридиями может происходить практически на любо^ этапе оогенеза .Напротив, в случав обширного поражения яйцерых' трубок развитие ооцитов практически не происходит, и,соответственно,не происходит откладки яиц.Это характерно для случаев, когда инфекционный процесс начинается еще в гермарии.

' При инфицировании ооцитов ввителлярии развитие ооцитов и откладка яиц происходит , хотя их количество часто сильно снижается. О реализации трансгенерационной передачи патогенов можно судить по степени отроадения ? яиц из грены и гибели гусениц дочернего поколения /Stelnhaus, 1949,1954¡Smith et al., 1956; Дикасова, 1958 ;Bergoll, 1958; Орловская, 1961; Bird, 1961; Ермакова, Тарасавич, 1968; Воробьева, Нурлыбаева, 1974; Михайлов, 1984; Исси, 1986 /. Именно в этом случае будут иметь место патоморфологические изменения хориона яиц. насекомых.

Сшттокы инфекционной патологии хориона насекомых.

В классической патологии насекомых приняты следующие симптомы заболевания насекомых на фазе яйца:изменение цвета покровов, ненормальность размеров .аномалии формы , 'травмы и ранения, неспособность к отрозденив .неспособность к развитию,заражение паразитами и патогенными микроорганизмами / Stelnhaus , 1965/. Все эти определения носят достаточно общий характер и обязательно должны быть конкретизированы в каждом случае. Например, "неспособность к отроаденшо и развития" чаще всего является следствием либо ранений и травм , либо заражения энгомо-патогенами. Вероятно, более детальное описание симптоматики заболевания яиц насекомых, должно включать в себя непосредственное описание структур хориона или тканей эмбриона, имеющих патологические изменения.

Т,паевые о патологических изменениях хориона насекомых

при микроспоридиозе сообщил Солдан / Soldan,1982 /.Он наблюдал сильные повреждения хориона палочника Dlxlppua тогозиз Вг. (Dictyoptera,Pha3vilda) при инфицировании клеток фолликулярного эпителия микроспоридией Pleiatophora dlxlpl. Это проявлялось как изменения структуры микропиле и оперкулярного шва .нарушение процесса секреции хориона и разрывы хориона , а также в изменении размеров яиц ( гипер- и гипоплазия,образование особо мелких яиц ).

Для представителей отряда чешуекрылых Дерингом / During, 1955 / отмечалась достаточно сильная структурная вариабельность хориошшх систем( система ребер) вплоть до отсутствия структуры (микропилярная розетка), однако это явление не было интерпретировано как патология. Чаще всего подобные изменения трактовались как аномалии / Arbogast, Byrd, 1981 / или вообще не отмечались,хотя и присутсвовали на электроннограммах.

В процессе исследований патологические изменения хорион-ных структур при трансовариальной передаче патогенов отмечены у непарного иелкопряда,златогузки, американской белой бабочки, тутового шелкопряда,античной волнянки,болотной совки. Hydraecta mlcaceavi других / Баранов, 1990 а, б; Baranov, 199Q, 1992,/. Это проявлялось как отсутствие микропиле, деструкция микро-пилярной розетки .заращивание аэропиле,деструкция аэропилярной ' системы, деструкция отдельных ребер и системы ребер, нарушение формы полигонов и их структурированности,нарушение целостности хориона или появление новообразований ( в результате гипо- или гиперпродукции хорионного матрикса инфицированными клетками ' фолликулярного эпителия ), появление характерных "оспин" на на поверхности хориона. •

Патология хориона npjt экспериментальном инфицировании и активации латентных и хронических инфекций.

В опытах по получению инфицированной грены златогузки исходным инфекционным материалом слукил ВЦП Deridrol ¡mu.5 apectabtlla .пассированный через гусениц соснового шелкопряда. Инфицирование и стрессовое воздействие активизировало развитие микроспоридии Nosema muacularta Weiser.,что обусловило в неко- '

торых случаях протекание смешанной формы инфекции. Заболевание сопровождалось-характерными симптомами: вялость гусениц,снижение трофической активности и постепенный отказ от пищи,появление в экскрементах красноокрашенных включений, а впоследствии кашицеобразных выделений из ротовой полости и анального отверстия. Перед гибелью покровы гусениц истончались и произвольно разрывались. В анальном отверстии образовывалась пигментированная пробка . При изучении патологических изменений внутренних органов гусениц на ранних стадиях заболевания отмечено увеличение мальпигиевых сосудов и их красно-коричневая пигментация , затем увеличение и пигментация кишечника. В ■ конечном итоге кишечник и мальпигиевы сосуда частично лизировались , жировое тело увеличилось в объеме и, приобрело фарфорово - белую окраску с красноватыми включениями. Инкубационный период заболевания составил 12 дней.

, " Таблица I

Гибель златогузки при смешанной инфекции и наличие патологических изменений хориона у дочернего' поколения

Гусеница Предкуколка Куколка Бабочка Яйцо Пат.изменения" % . % % % % хориона *

опыт . 88,3 475 П2 6 91 +Т~+ контроль 5 О 0 0 6,3 ' ---

Часть насекомых . погибла при окукливании. Это сопровождалось нарушением метаморфоза и образованием куколочной кутикулы на дорсальной части грудных сегментов. Насекомых, погибших на фазе куколки можно было заметить по потемневшей кутикуле. При вскрытии куколки ее содержимое представляло собой гомогенную красноокрашенную массу , содержащую споры микроспоридии и полиэдры ВЦП. Впоследствии куколки с меланизированными пятнами погибали ( высыхали ). Имаго , отродившиеся из сохранившихся куколок, имели различные аномалии: у некоторых особей крылья

* Условные обозначения для таблиц Г - 8 : -+++деструкция микрогшле,аэропиле.летальная деструкция хориона, ¡н-. деструкция хорионных структур средней тяжести. V ■ наличие "оспин",деструктивных изменений не влекущих гибель, -—отсутствие патологических изменений на поверхности хорииня.

были недоразвиты или вообще отсутствовали,наблюдалось наличие куколочной кутикулы на брюшных сегментах. Среди отродившихся имаго преобладали самки. При анализе яиц дочернего поколения у инфицированных особей обнаружены патологические изменения хориона: деструкция микропилярной розетки, нарушение системы ребер, в контроле хорион интактных яиц не имел морфологических изменений. Смертность на фазе яйца составила:в контроле fi,3%, в опыте 91%, причем гибель отродившихся гусениц нового поколения достигла 100% уже к третьему возрасту (рис.3).

Инфицированная грена тутового шелкопряда была получена при заражении вирусом ядерного полиэдроза ( ЁЯП ) гусениц старших возрастов. Часто для анализа использовалась грена из лабораторных или промышленных линий тутового шелкопряда , где отмечалась высокая активность .энтомопатогенных микроорганизмов. При инфицировании лабораторной популяции тутового' шелкопряда (Молдавия) ВЯЛ в концентрации '109полиэдр/мл практически 100% яиц дочернего поколения имели патологические изменения хориона и ни одна особь не отродйласъ из отложенных яиц. Из промышленной выкормки в провинции Шон Ла ( Северный Вьетнам ) были отобраны гусеницы с признаками, заболевания. Основными симптомами были: отставание в росте, вялость, появление черных мела-низированцых пятен на поверхности покровов гусениц,прекращение питания,отсутствие жирового тела. Анализ в световом'микроскопе слюнных желез, жирового тела, кишечника и гиподермы показал наличие смешанной инфекции микроспоридиоза и ВЯЛ. Анализ яиц из этой . популяции показал наличие патологических изменений хориона у 10055 яиц;

В опытах с непарным шелкопрядом были использованы гусеницы старших возрастов Московской и Южно-Уральской популяций. Для получения инфицированного потомства использовали заражение ВЦП D.pint в концентрации 2хЮ9 полиэдр/мл и ВЯЛ ¿.dispar в концентрации I08- 10 полиэдр/мл или воздействовали стресс-факторами для активации латентных и хронических заболеваний. Результаты экспериментов представлены в таблицах 2-4.

Таблица 2

Жизнеспособность яиц дочернего поколения непарного шелкопряда при инфицировании ВЯЛ "

Патоген Вариант Кол-во Отроздение Смертность Пат.измене-опыта особей гусениц ,% гусениц Д ния хориона

ВЯЛ I 100 0 0 +++

2 100 0 0 +++

Контроль I 100 96 • 0 ---

2 100 99 I

Таблица 3

Жизнеспособность яиц дочернего поколения непарного шелкопряда

при инфицировании ВЦП

Патоген Кол-во Отровдение Смертность Пат.измене-

особей .яиц, % 1 гусениц ,% ния хориона

ВЦП О.р. 300 64 ■ 100 +++

Контроль 100 100 I .

Таблица 4

Жизнеспособность яиц доче рнего поколения непарного шелкопряда

при активации латентного ВЯЛ

Патоген Вариант Кол-во Отрождение . Смертность Пат.измене -

опыта особей яиц, % гусениц, % ■ ния хориона

ВЯЛ I е 250 0 0 . +++

ВЯЛ - 2 250 77 49

Контроль 100 98 0 —

Из таблиц видно , что присутствие патогенов и патологические изменения хорионных структур являются сопряженными явлениями и смертность насекомых коррелирует с уровнем повреждений хориона. Так , наличие "оспин" на поверхности хориона указывает на.наличие трансовариальной передачи вируса, но еще не говорит о количестве патогена. Более серьезные повреждения хориона - заращивание»микропиле, ■ аэропиле, повреждения системы ребер показывают степень поражения организма патогеном и

обуславливают, как следствие гибель организма (рис.4).

При инфицировании гусениц античной волнянки и активации латентной инфекции ВЯЛ получены следующие резулътаты(таблицы 5 - 6). • . ■ '

Таблица 5

Жизнеспособность яиц дочернего поколения античной волнянки при инфицировании ВЯЛ

Патоген Вариант Кол-во Отроадение Смертность Пат.измене-

опыта особей яиц, % гусениц, % ния хориона

ВЯЛ ' I 50 0 0 + + +

2 50 0 0 + + +

Контроль I 50 99 0 _ _ _

: 2 50 100 I — — _

Таблица 6

Жизнеспособность яиц дочернего .поколения античной волнянки при

активации латентного ВЯЛ

Патоген Вариант Кол-во . Отроадение Смертность. Лаг.измене-

опыта особей яиц., % гусениц, % ния хориона

ВЯЛ I 150 0 0 + + +

2 150 13 100 + + +4- '

3 . 50 0 0 + + +

4 50 •зз 49 - + +

Контроль . 1 50 98 0 - - -

2 50 . 100 0 _ — —

Из таблиц видно , что отрозвдение яиц и .жизнеспособность гусениц дочернего поколения тесно связана с активностью патогена, в частности , с. активностью его трансгенерационного пере-т' мещения , что вполне коррелирует с наличием патологический изменений хорионных структур (рис.5).

Таким образом,при инфицировании родительского поколения оболочки эмбриона, в том числе хорион,являются барьером между поколениями , необратимо .повреждаемым при трансовариальной передаче внутриклеточных патогенов. Это выражается в появлении дефектов микропилярной розетки, аэропилярной системы , системы ребер. Наличие подобных патологических изменений может быть

«

С 100

м

е

Р

т

н

о БС

с

т

ь

X 0

88,3

5

контроль

6,3 —

Яйцо Гусеница . Куколка Имаго Яйцо Гусеница

Рис.3 Состояние популяции златогузки при трансгенерационной передаче шкроспоридаи Ковеш швси1аг1в.

Рис.4

Яйцо :ИГ

Возраст гусеницы Состояние популяции непарного шелкопряда при трансгенерационной передаче ВЯЛ и ВЦП.

100

Яйцо I" ' : 2 ' ~!Г~ ^

Возраст гусеницы. Рис.5- Состояние популяции античной волнянки при трансгенерационной передаче вируса ядерного долиэдроза.

»бъяснено тем, что передача активной формы энтомопатогенных вирусов и простейших осуществляется при контакте фолликулярного эпителия с ооцитом в процессе формирования хориона.. При инфицировании клеток, синтезирующих белок хориона , происходит нарушение.их функций, что отражается на поверхности хориона в виде дефектов. Используя схему хориогенеза шелкопрядов,предложенную Мазур с соавторами / Masur,Regler .Kaíatos ,1980/,можно предположить , что особенно тяжелые деструктивные изменения практически всех хорионных структур .происходят при сильном инфицировании оварлолы на стадии III - IV,а наличие "закрытых" аэропиле объясняется более слабым воздействием патогена и обуславливает присутствие "пломб" , не отделившихся на стадии Xa - Xd, на вершинах аэропиле. Частично это подтверждается результатами, получеными при экспериментальном заражении куколок тутового шелкопряда препаратами,содержащими вирионы вируса ядерного полиэдроза. Было показано деструктивное- влияние патогена на клетки фолликулярного эпителия, отмечено нарушение процесса вителлогенеза и'формирования xopnoHa/Smith-Johamsen, Wltkiewlcz , Iatrou, 1.986 /. В половине исследованных случаев частицы патогенов ■. присутствовали на поверхности яиц , что позволяет предположить сопряженность трансовальной и ' транс-овариальной передачи энтомопатогенов. На основе - полученных данных может быть предложен способ обнаружения энтомопатогенов на фазе яйца .

4.Сравнительные испытания различных методов обнаружения энтоиопатогенов чешуекрылых на фазе яйца

Условно современные способы.обнаружения энтомопатогенов можно разделить на прямые .и косвенные. При. прямом" способе ведется поиск' микроструктур патогена в. пораженных тканях насекомого ( или в экскрементах, меконии и др. ) и его видовая идентификация. Как правило , причиной поиска патогенов служит повышение процента-смертности насекомых. Косвенный способ позволяет сделать вывод о присутствии в популяции патологического

агента но изменению некоторых физиологических или морфологических особенностей культивируемого вида насекомого. Наиболее ярким примером "прямого" метода является метод "целлюлярного гренажа",разработанный Л.Пастером /Pasteur.1870/. Коротко он заключается в- получении потомства от определенных родителей с последующим анализом тканей самки с целью' нахождения микроструктур патогена. В настоящее время применяется несколько вариантов этого способа, в том числе'с-использованием светового, трансмиссионного и сканирующего электронных микроскопов. Применение трансмиссионной электронной микроскопии ограничено в связи со сложностью подготовки объектов для микроскопии. Наиболее распространен световой вариант , однако он имеет ряд недостатков: недостаточно точен , так как световая микроскопия имеет ограниченное разрешение и не всегда предоставляет возможность точной идентификации патогена. Кроме этого, патоген может находится в яйце на различных стадиях развития , что создает дополнительные трудности при его обнаружении (так, вирус ядерного полиэдроза может находится в яйце в виде полиэдров,вирионов и вирогенных стром / Тарасевич, 1975 / ). При малом количестве частиц патогена в теле самки его поиски могут быть затруднены, что увеличивает временные затраты "при использовании данного способа.

Для сравнения •таких показателей как точность и временные затраты были проведены испытания двух способов обнаружения энтомопатогенов на фазе яйца.

В лабораторных условиях было проведено заражение ВЯЛ гусениц американской белой бабочки последних возрастов.Обнаружение патогена проводилось на 20 самках и 100 яйцах,отложенных этими самками.

• Таблица 7

Сравнительное испытание методов обнаружения энтомопатогенов на фазе яйца ■ -

Спо.срб Количество особей . Время анализа ,мин. Обнаружен патоген кол-во особей

целлгсяр-ниЯ тренах анализ хориона оо Oí С' ' 200'- " 100 16 100

Патоген обнаружен только у 80% самок, тогда как дефекты хориона обнаружены у 100% яиц. Достоверность анализа контролировали при сравнении отрождения и жизнеспособности яиц, отложенных инфицированными и интактными самками.

Таблица 8

Патология хориона и жизнеспособность яиц дочернего поколения американской белой бабочки после инфицирования ВЯЛ

Кол-во Дефекты особей риона , хо- ОТ <0 Отрождение яиц, % Гибель гусениц к 3 возрасту,%

инфициро- 200 100 (- - - +) 37 99

ванные яйца

интактные 200 0 (- - - -) 100 3

яйца

Очевидно, яйца дочернего поколения, имеющие оспоподобные образования на поверхности хориона,содержат патоген и гусеницы из них либо не отрождаются.либо погибают от ВЯЛ в. отличив от гусениц.отродившихся из яиц с нормальной поверхностью.хориона.

Таким образом , предложенный способ обнаружения энтомо-патогенов успешно конкурирует со способом • " целлюлярного. гренажа " и может быть применен для оценки состояния популяций чешуекрылых насекомых.

ВЫВОДЫ.И РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Морфологическое, строение поверхностных структур хориона чешуекрылых насекомых является надежным таксономические признаком и может быть использовано для определения видовой принадлежности. . .

2. Хорионные структуры могут-иметь морфологические изменения деструктивного и недеструктивного характера. В .первом случае причиной изменений • могут быть ранения, травмы или заражение энтомопатогенами. Во втором . случае причиной изменений, могут быть аномалии хориона, являющиеся следствием мутационных изменений программы хориогенеза.

3. При трансовариальной передаче вирусов и микроспоридий происходит инфицирование клеток тканей, граничащих с ооцитом, что и обеспечивает передачу патогена.

4. Патологические процессы вызывают в пораженных клетках изменения функционального характера. В процессе хориогенеза это проявляется как изменение строения, хориошшх систем и нарушение оболочек яйца насекомого.

5. Симптомами , характерными для трансовариальной передачи внутриклеточных знтомопатогенов являются патологические изменения хориона: заращивание микропиле и деструкция структур микропилярной розетки , заращивание и деструкция аэропиле, нарушение или деструкция системы ребер , нарушение структурированности поверхности хориона.'-

6. Количественные данные о патологии хориона., могут быть использованы при прогнозе численности лесных вредителей и влиять на принятие решений в системе защиты леса.

7. Наличие патологических изменений хориона непосредственно связано с состоянием популяции лесных фитофагов и 'отражает степень активности патогенов - -вирусов и микроспоридий.

8. Способ анализа хориона чешуекрылых может быть применен для оценки состояния популяций лесных фитофагов на фазе яйца. Наличие большого количества яиц с симптомами тяжелого поражения хориона (закрыто 100% аэропиле,закрыто микропиле,имеются нарушения целостности хориона Указывает на сильную активность патогенов.Это может быть причиной отмены истребительных мероприятий даже в период нарастания численности насекомых.

9. Отсутствие патологических изменений хориона указывает на низкую активность знтомопатогенов в популяции и подразумевает планирование мероприятий по сдерживанию численности насекомых.

10. Наличие большого количества аномалий хориона говорит о том, что популяция находится в начальной стадии резкого наращивания численности и требует постоянного внимания со стороны службы защиты леса..' ...

11. Данные по патологии хориона могут быть хорошим контролем чистоты лабораторной культуры, насекомых,например,при-наработке вирусных инсектицидов.

12. Осгаксономлческое -списание карантинных видов лесных фитофагов может облегчить видовую диагностику и способствовать улучшению карантинного контроля.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Лабораторные испытания вируса - возбудителя цитоплазмати-ческого полиэдроза соснового шелкопряда DenörolImиз pint Ъ. на златогузке Еuproctla chrysorrhoea L. // В сб.:Микроорганизмы в защите растений. -Кишинев:Штшнца ,1985.-С. 17-19.

2. Эффективность вирусного инсектицида ВИРИН-АББ-3 в борьбе с американской белой бабочкой Hyphcntria cunea Drury. на плантациях шелкрвицы в Молдавии /У Всесоюзная школа молодых ученых и специалистов ■: Биологический метод в интегрированной защите сельскохозяйственных культур от вредителей,сорняков и болезней: тез.докл.- Кишинев,1985.-С.44-45.

3. Электронномикроскопическое.изучение влияния гипохлорида натрия на хорион яиц насекомых // XÏII Всесоюзная конференция по электронной микроскопии.( биология и медицина ) : Тез.докл.-Звенигород,1988.-С.107. Соавт.Габер Е.С.

4. Morphology oí the aeropylar system of the chorion of Mameatra braaalcae, Uamestra auasa, Agrotis segetvm ( seaming electron microscopy) // Proc.XII International Symposium über Entomofamistilt In'Mitteleuropa-Klew, 1988.-P.20.

5. Морфология поверхностных структур хориона ореховой плодожорки ( Sarratfirtpus muscuïana Eraçh,Lepldopteni,Nôctuldae) // Известия АН КССР,1989.-т.0-С.50-54. Соавт.Джаперов Э.Б.

6. Ранняя диагностика -инфекционных заболеваний лесных фитофагов (Leptdóptera;Orgytdae)//V¡ñTencw$mam,ia лесного хозяйства в Западном регионе СССР:тез,докл.-Гомель,1990.-С.167-169.

7. Ультраструктура хориона яиц Eplcopeia mène la ( Lepldoptera; Bplcopeidae) из Южного Приморья//Весгник. зоологии,1990.- Н.5.-С.62-63. Соавт.Раевский B.D.

8. Патоморфология хориона чешуекрылых при инфекционных забо-.леваниях//В сб.:Успехи энтомологии в СССР. - Ленинград, 1990.-

С.146-148.

9. Морфология хориона (.Rtiopaloceratlycaenidae ) Strymon. prunl, S.apinl, Thechla betuloe // В сб.'.В сб.: Успехи энтомологии в СССР.- Ленинград,1990.-С.148-149. Соавт.Швецова Л.Н.

•10. Early diagnosis of forest Insect pest outbreaks//Ргос. XIX IUFRO Worll Congress.-Montreal,1990.

11. Прогноз массового размножения л1сових ф1тофаг1в: транс-генераЩйна передача ентомопатоген1в // В сб.: IV ЗЫЗД Укра1нського ентомолоПчного ,товариства.-Харьк1в,1992.-С.20-21.

12. Cotton bcllworm Uellothla armigera: a new data lor Insect outbreaks forecastlng//Proc.Conf.oi Environmental Technology.-Hochlmin,1993.-P.120.