Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурная организация и регуляция потоков и концентраций в полиферментных метаболических системах: теоретическое рассмотрение

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Структурная организация и регуляция потоков и концентраций в полиферментных метаболических системах: теоретическое рассмотрение"

^ г " л

I i iJ v И

2 з gut

Московский Государственный Университет имени М.В. ЛОМОНОСОВА

На правах рукописи

ШШ Олег Владимирович

Структурная организация и регуляция потоков и концентраций в подифзрмзнтньп. метаболических системах: теоретическое рассмотрение.

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва 1995

../ Iii J L- С

"■1 OJd

Работа выполнена в отделе био энергетики института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. Ы.В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор физико-математических, наук Б.Н. Холоденко

Официальные оппонента: доктор физико-математических наук Ю.Ц. Романовский

доктор фшико-математических наук Б.Н. Гольдштейн

Ведущая организация: Институт .биохимии им. А.Н. Баха

Защита состоится "_" _ 1995 года в_часов

на заседании специализированного совета К.053.05.68 при Московском государственном университете по адресу: 119899, г. Москва, Воробьевы горы. Биологический факультет МГУ, кафедра биофизики.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан "_"_;_ 1995 года.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

Характеристика работы.

Актуальность темы. Важность исследования регуляции в полиферментных [етаболических системах связана прежде всего с ее ролью в формировании щекватных изменений' характеристик . метаболизма -клетки в ответ на вменяющее я условия внешней среда. В частности,- эта регуляция может )ыть направлена на стабилизацию концентрат^ ключевых метаболитов и шимизацию отклонения от нормы основных физиологических свойств клетки Добьем, форма, ионный состав и т.д.), то есть на поддержание клеточного ■омеостаза. Как и любые другие клеточные явления регуляция метаболизма злеет под собой определенную структурную основу, которая с одной стороны ираяается в четко определенной схеме превращений веществ составляющих [анную метаболическую цепь, а с другой стороны определяется авискмостями скоростей ферментативных реакций от концентраций ютаболитов этой цепи. Выяснение структурных основ соответствующих тем ли иным регуляторным свойствам является задачей первостепенной ажности.

Количественное изучение механизмов регуляции необходимо для

снимания фундаментальных закономерностей жизнедеятельности клетки. Оно

олнно включать в себя углубленную разработку теоретических

редставлений о свойствах регуляции шлиферментных- систем, находящихся в

азличных состояниях (стационарное состояние, автоколебания, вынужденные

олебания, переходный процесс). Установление количественных показателей

егуляции и, в частности, определение вкладов различных ферментов в

правление основными метаболическими потоками, является основой для

ешения целого ряда прикладных проблем, таких как диагностика и

становление причин многих клеточных патологий, разработка методов их

армакологической коррекции, управление ростом и продуктивностью клеток

родуцентов и целенаправленное изменение их метаболизма методами генной Ч

акенирии в задачах биотехнологии.

Делью диссертационной работы является: I) определение основных

принципов структурной организации полиферлентных метаболических. систем; находящихся в стационарном состоянии; и) разработка количественно! теории регуляции метаболизма для .колебательных биохимических систем; ш) создание адекватного математического описания процессов сопряжение окислительного фо сформирования в митохондриях 'с транспорто! высокоэнергетических фосфатов. \

Для достижения этих целей были поставлены следу нище основнш задачи:

1) Исследовать организации связей "в неразветвленных метаболически цепях сочетащих высокое качество стабилизации конечного продукта I высокой скоростью переходных процессов.

2) Выяснить принципы структурной организации'' произвольно] полиферментной системы, в которой могут быть разветвления и циклы обладающей достаточно высокой скоростью переходных процессов.

3) Определить системные и локальные регуляторные показатели : получить связыващую их полную систему уравнений для метаболически систем находящихся в вынукденном-установившемся периодическом режиме.

4) Построить математические модели, описывающие процессы сопряяени окислительного фэ сформирования в митохондриях с транспорте высокоэнергетичвских фосфатов.

Научная новизна. Впервые, для метаболических цепей произвольно геометрии показано, что организация сильных связей допускающая отличву от нуля степень устойчивости тесно . связана со стехиометрие рассматриваемой системы.

Для полиферыентных метаболических систем, находящихся в вынузденнс установившемся периодическом режима определены системные и локальнь регуляторные показатели и получена полная система уравнений, позволяли выразить все коэффициенты управления через скорости реакций козф$ициенты эластичности.

На основе созданной стационарной математической модели установлен что ни диффузия через шБмеыбранно^ пространство, ни диЖ/г-ш скво:

поры внешней митохондриальной мембраны не лимитирует поток высокоэнерг.етических фосфатов из матрикса митохондрии в цитоплазму.

Адпробация работы. Результаты работы докладывались на vi Международной конференции по БиоТермоКинетике, Инсбрук, 1994, и на международной конференции ;International Workshop on Design and. Evolution of Metaboiism", Tenerife, 1995. Работа также была апробирована на семинарах по биоэнергетике ИФХБ им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ. Структура работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав, выводов и приложения. Список литературы содержит 72 источников. Работа иллюстрирована 22 рисунком.

х. Основное содержание работы. В 1-ой главе содержится обзор литературы и краткий очерк развития количественной теории регуляции метабожзма. Здесь мы приведем определения основных понятий, необходимые для дальнейшего изложения.

.Рассмотрим .произвольную, метаболическую, систему, включающую, m -метаболитов и ц ферментативных реакций. Динамическое поведение системы задается уравнениями:

dx/dt = N*v (1)

Здесь х = [х1(... ,хт]т - вектор концентраций метаболитов, n = . NN. .11^?-.....™ - матрица стехиометрических коэффициентов, v -

J.J J— X, ... ,п

[v1#...,v ]т - вектор скоростей ферментативных реакций. Если ранг, г

матрицы н меньше m, го концентрации xir i=i.....га, связаны m-r линейными

уравнениями - законами сохранения:

Д*х « М, ц-N = 0, (2) т

где м = iMi-- • •-Mm.r3 - вектор величин . сохранявшихся пулов

интермедиатов, а ц Пд„, I lf=î" " • Пусть х = х° - есть

К» S1 Д. —J-f • • ./lu

стационарное состояние системы (1). Если скорость ^ ï-ой реакции зависит от xj, то будем говорить, что в цепи реализуется связь (i,j). Величину |k.. 1,

3v.

к. . = - I i=l,...,m; j-1,...,n,

•LJ ах^ J x -x

будем называть силой, связи. Если к^ > о, то связь (i,j) является положительной, если к^ < о - отрицательной.

В дальнейшем,, мы. .будем рассматривать регуляторные- свойства полиферментных метаболических систем, которые либо находятся в

__N ~

стационарном состоянии, либо осуществляют вынужденные колебания в окрестности- некоторого асимптотически устойчивого стационарного состояния. Количественные показатели,- характеризующие регуляторные свойства этих систем, можно разделить на два класса: локальные и системные. Локальные показатели описывают кинетические свойства "изолированных" функциональных звеньев системы: ферментативных реакций, а системные показатели характеризуют вклады отдельных ферментов и внешних параметров в управление системными переменными: метаболическими потоками и концентрациями.

Сейчас мы не даем, точных определений регуляторных показателей. Это делается последовательно по мере изложения материала..

Ii. Организация связей в голиферментных метаболических системах.

Важным - показателем, характеризупцим регуляторные свойства метаболических систем, находящихся в устойчивом стационарном состоянии, является скорость переходных процессов, зависящая от степени устойчивости, р. которая, в свою очередь, определяется как расстояние до мнимой оси ближайшего к ней корня характеристического уравнения:

р - min IRe (3)

Чем больше степень устойчивости, тем выше скорость переходных процессов. Однако, довольно часто, требование от метаболической системы определенных регуляторных свойств (например высокого качества стабилизации концентраций ключевых метаболитов) приводит к сниженвд скорости переходных процессов, а зачастуз и к потере устойчивости (см. например-Холоденко Б.Н., 'Биофизика, 1983, т.28, с.674-681). Очевидно, что такое взаимоисключение важных рагуляторааг свойств происходит не

всегда и, зависит от структур! связей, реализующейся в данной метаболической системе. Выяснению организации связей позволяющей сочетать важные 'регуляторные свойства и посвящена глава и диссертации.

Везде ниже- мы будем рассматривать метаболические цепи, все связи которых условно можно разделить на сильные и слабые. Будет исследоваться асимптотическое поведение системы, когда отношение сил слабой и сильной связей стремится к нулю при росте силы сильной связи к бесконечности. Это предположение является естественным обобщением того, что в метаболических цепях обычно существуют связи, силы которых различаются на несколько порядков.

Принципы организации связей в неразветвлекных лвтабохических цепях, сочетающих высокое качество стабилизации конечного продукта с высокой скоростью переходных процессов.

Рассмотрим неразветвленную метаболическую цепь. Ее динамическое поведение определяется системой (1) с очень простой стехиометрической матрицей:'

сЪс./с^ = v. .-v. - Ь., 1.*1,...,п-1

1 • - (л) '

Здесь кк- скорость оттока 1-ого метаболита из цепи, а эффективная константа этой скорости:

аь.

Эх.

д.

X =х°

В неразветвленной метаболической цепи связь и,л может быть либо опережающей О < а) либо обратной и > связью длины Ц-Л. Ясно, что обратимость реакции эквивалентна обратной связи длина единица.

Коэффициент стабилизации - (о) конечного продукта определяется крутизной (м) регуляторной характеристики, то есть зависмостью стационарной скорости синтеза продукта и) от его концентрации <хп):

.в

а 1п лх_

а 1п х

о

х =х п п

лх:

Й<хе'

м = -

ах

п п

G

где знак минус в выражении для м учитывает, что стационарная скорос синтеза продукта обычно падает с ростом его. концентрации физиологическом диапазоне концентраций.

Рассмотрим сначала метаболические цепи без сильных связей, конечн продукт которых стабилизирован (то. есть м * о). Для описания организац связей введем понятие системы связанных метаболитов^. Определение.

Множество {х. ,...,х. } называется системой связанных метаболии Jl 3m .

(ССМ), начинащейся с х. , если выполняются следующие условия:

1) в цепи реализуются связи с,j±), i = i,...,m-i;

2) p. « 0, i - l,...,m-l;

Ji

3) jm определяется одним из условий: a) jm = о,- б) j * о, /з. » о,-

m

jm * о, (3. = О, ДЛЯ любого i, i * jm, k^ - 0; г) jm* 0, 0. -m Jm m

существует i e {i,...,m-i} такое, что jm - и для любого t « {о,..

имеем ktj = 0;

ш ...

Из этого определения видно, что, в зависимости от организации цепи окрестности метаболита х. , может быть четыре типа ССМ.

Утверждение i. м * о тогда и только тогда, когда хотя бы одна CCI начинающаяся с хп, ^заканчивается либо "оттоком, либо начальной реакцией Перейдем теперь к проблеме устойчивости стационарного состояния рассматриваемых метаболических системах. '

Утверждение 2. В неразветвленной метаболической цепи с люб организацией связей и оттоков и любыми значениями сил и эффективн констант скоростей оттоков существует набор аффективных конста скоростей реакций, kt, i-i,...,n, который обеспечивает асимптотическ устойчивость стационарного состояния.

Рассмотрим метаболические цепи с единственной сильной связь Теорема i.

Стационарное состояние произвольней цепи с лвЗша сеязями

оками и единственной сильной обратной связью (е,р) будет заведомо стойчивым при |к |—>+», если ) при р = э+1, кзз+1 >0,

) при р > е+И выполняется хотя бы одно из следующих соотношений:

кр,з+1" кр-1.з+1 * кр3 + кр-1,в)квр 5 0 (б).

=1 (7)

Цусть в рассматриваемой.нами произвольной цепи длина единственной ьной связи больше единицы, р > 5+1 и |к |->+». Пусть выполнены

эр

авенства, противоположные по знаку неравенствам (е) и (7). Тогда, э если стационарное состояние устойчиво, степень устойчивости цепи

змится к нулю с ростом силы связи (э.р), р->0, |к I->+».

Если потеря устойчивости связана с изменением знака в неравенстве , то она сопровождается возникновением колебательного режима йуркация Хопфа). Если же потеря устойчивости связана с изменением ка в неравенстве (6), то она имеет характер возникновения гомерного седла. ... ... . ,

Для произвольной метаболической цепи с сильной обратной связью ?), длина которой больше двух, неравенства (6), (7) означают, что Зходимым услонием устойчивости является присутствие хотя бы одной из цупцих опережающих связей: (р.э+и, (р-1,Б+ц, (р,э), (р-1,э) рис. 1.

Рис.1. Метаболическая цепь .с сильной обратной связью (а,р) и опережащими связями (р,в+1), (р-1,з+ц, (р,з), (р-1,з). Пусть р = 8+1, кзд+1 < о. Если стационарное состояние цепи

)йчиво, то степень4 .устойчивости (р) при достаточно больших 1к I

. бр

¡т определяться цепью, длины (п-и, полученной из исходной удалением эболита хв+1, то есть заменой пары реакций хе—>х8+1—>хв+2 на

реакции хз—>х3+2- Скорость этой (новой) реакции зависит от

МетабОЛИТОВ ^.....х3'х3+2.....хп ТаК' ЧТ0: Еа1"кз+1:1* (в

модифиI тированной цепи исчезают также все связи от метаболита х , и все связи к з-ой реакции).

Рассмотрим теперь- метаболическую цепь единственная сильная связь (э,р) которой является опережающей, то есть э > р.^ Будем говорить, что два участка- цепи граничат по метаболиту хг, если последней реакцией в первом из-них является реакция хг1—>хг, а первой реакцией второго участка является реакция хг—>хг+1.

Утверждение з. Если метаболическую цепь с единственной сильной опережающей связью (э,р) можно разделить на два граничащих по некоторому метаболиту хг, р < г а з, участка, которые не связаны обратными связями, то степень устойчивости такой цепи не зависит от силы |квр| сильной опережающей связи и определяется только внутренними связями каждого из участков.

Таким образом, можно утверждать, что класс метаболических цепей с единственной сальной- связью, имеющих ненулевую - степень- устойчивости состоит из цепей, единственная сильная связь которых является либо отрицательной обратной связью единичной длины, либо опережающей связью.

Следующий этап изучения метаболических цепей, которые (в зависимости от значений кинетических параметров) могут иметь достаточно высокую скорость переходных процессов, будет заключаться в том, чтобы в зависимости от типа и расположения единственной сильной связи исследовать возможность роста крутизны регуляторной характеристики к бесконечности.

Утверждение 4. Пусть в неразветвленной метаболической цепи с единственной екдмгой связью (з,р) скорость переходных процессов достаточно высока. Тогда, для существования организации слабых связе! позволяющей 1м|->+» при ->+« необходимо я достаточно, чтобь

эр

одновременно выполнялись следующие условия:

8 • О/ р - а ♦ 1. кза+1 < О,

Иными словами, только в метаболических цепях с единственной сильной рицательной обратной связью единичной длины, идущей не на начальную ¡акцию, возможно высокое качество стабилизации конечного продукта. Но ¡кая не организация слабых связей обеспечивает это?

Рассмотрим метаболическую цепь с сильной отрицательной связью 1-1, п) .

Утверждение 5. В метаболической цепи с сильной отрицательной связью

-1,п), I м I->+» при 1к^_1п1->+« тогда и только тогда., когда

ществует хотя бы одна ССМ, начинающаяся с хп1, которая заканчивается :бо оттоком либо начальной реакцией.

Таким образом, с помощью полученных выше результатов мы можем ределить, когда |м|—>+» при ь—>+«, когда величина |м| ограничена, когда м - о. Однако, высокое качество стабилизации конечного продукта едполагает, что м > о и достаточно велико. Следовательно, встает прос о знаке крутизны регуляторной характеристики. Так как чершвзлцеё решение этой задачи весьма затруднительно, то мы приведем пь . достаточные • условия положительности-м. в метаболической цепи,-с льной отрицательной связью (п-1,п).

Утверждение 6. Пусть организация слабых связей метаболической цепи с льной отрицательной связью (п-1,п) силы

эвлетворяет следующим условиям:

I) в цепи есть отток (п-1)-ого метаболита * о);

г) любая ССМ, начжнапцаяся с хп_х, не содержит хп2 и, за исключением

1_1}, удовлетворяет условиям пункта в) или г) определения системы

тзанных метаболитов;

О никакой из (отличных от метаболитов, входящих в ССМ,

шнагщиеся с хп1, не. влияет на (п-1)-ув реакцию, 'да м—>+» при ь—>+».

Предположим, что силы двух каких-либо связей в неразветвленной цепи шзвольной структуры намного превосходят силы остальных связей и

являются величинами одного порядка. Характер стационарного состояния поведение степени устойчивости такой цепи при неограниченном росте а этих двух связей описываются следующей теоремой. Теорема 2.

Пусть имеется произвольная цепь (с любыми связями и оттоками), которой есть две сильные связи (з,р) и (г, тГл причем силы их одна

N

порядка (ТО. есть |кзр| а Ь, в ь, ь->+») .

1. Если р=з+1, га=г+1, з*г, к33+1с0' кгг+1<0' 10 степень УСТОЙЧИВОС' рассматриваемой цепи при росте сил связей ь—>+. определяется цеп | длины <п-2) без сильных связей, полученной из исходной удалени

метаболитов хз+1 и хг+1. то есть заменой пар реакций хд—>хв+1—>х8+ хг—>хг+1—>*г+2 на реакции хз—>хв+2 и хг—>хг+2 соответствекн Скорости тг3 и зависят от метаболит

х1,...,хз,х3+2,----*г'хг+2.....ха таК* 410 Ез1 " кз+11 И Кг1 " кг+И'

* з+1, г+1, соответственно (в модифицированной цепи исчезают также в 1 связи от метаболитов хв+1. хг+1 и все связи к э-ой и г-ой реакциям).

. .2. Если, р-г-а+1, ш-а, .кз+1з>о, к38+1<0' степень устойчивое определяется цепью длины (п-2) без сильных связей, полученной I исходной удалением метаболитов ' ха и хз+1 (заменой реакц

хз-1—>ха—>хз+1~>ха+2 на Реакцию >хз+2к Скорость завис

от метаболитов х^ ..--хв_£.хв+2' • • • ,зсп так- что: К8-И " ка-И' (в модифицированной цепи исчезают также все связи от метаболитов хд хе+1 и все связи к з-ой и (э+1) -ой реакциям).

з .* Если р-з+1-а, кза+1<о, то степень устойчивости определяется цел длины (п-1) без сильных связей, полученной из исходной удалени | метаболита х3+1 (заменой пары реакций ха—>хв+1—>хз+2 на Р63^

х —>х _). Скорости V и V . зависят от метаболш

Э 8+2-. X В;

^.....Х3'Х3+2' "'ХП 1ак» ЧТ0: Ег1 - кг1 + 819п(кгз+1) Скз1 " кз+1л

(в модифицированной цепи исчезают также все связи метаболита х3+1 и все связи к з-ой реакции)-4. Если р » 5+1, г = в, к < то степень устойчивое

определяется цепью длины (п-1) без сильных связей, полученной из исходной . удалением метаболита хе+1 (заменой пары реакций Х3->Х3+1—>ха+2 . на РеаКВДЛ хв->хз+2>- Скорости v., 1=1,...,в,в+2, .Г. ,,п,' зависят от метаболитов .--'хд'х3+2'4 • чхп так"

что: = 5=1.....т-1,ш+1, ... ,5,54-2,.,п, Евт - кд+1т -К

зхдп(квт).[кв+1 - ка+1а + рв - Эз+1); К.. = к.., 1-е.

^1,.„,т-1,пна.....8,3+2....... £.т - к1т + Е1дп(кБт)-[к1д+1 - к^ +

9е1-(эв - Эа+1>1. где - о, если в я 1, ед- 1, 'если з > о. (в

модифицированной цепи исчезают также все связи от метаболита х£.+1 и все связи к з-ой реакции).

5. Если р = е + 1, кзэ+1 < о и выполнено одно из следующих условий : а) г<Б«р<т, к^=0, з+1з1гп-1, б) з<р<ш<г, т+1-:1-п, 1*в; б) т<г<з<р, к^.=0, т+^зп, ;]*а+1; 2) тоср^г ИЛИ тгз<р<г, ДЛЯ некоторого И, ш5Ьгг-1, Ь*э, ОахзЬ, 5*з+1;

то степень устойчивости может быть отлична от нуля и определяется исходной цепью, зз которой удалены ешьте связя. .

6. Если цепь с двумя сильными опережающими связями (з,р) и (г,ш) э > р, г > т можно разбить на три не связанных обратными связями участка, граничащих по метаболитам хь, р<Ь5Б,т«^зг (если ь = t, то один участок имеет нулевую длину), то степень устойчивости может быть отлична от нуля и определяться исходной цепью, из которой удалены: сильные связи.

7. Если организация сильных связей цепи не удовлетворяет ни одному из указанных выше шести пунктов, то, либо стационарное состояние неустойчиво, либо р—»о при ь—>+».

Исследуем теперь поведение крутизны регуляторной характеристики в метаболических цепях с двумя сильными связями; скорость переходных процессов в которых достаточно высока. Нас интересует, как должна быть организована цепь, чтобы, величина м могла быть сколь угодно большой. Кроме того, в связи с тем, что в рассматриваемых цепях есть две сильные связи, нам предстоит выяснить: может ли крутизна регуляторной

_ 2

характеристики расти как ь при ь—>-ь».

Прежде всего выясним, какая организация сильных связ! удовлетворящая условиям теоремы 2, не позволяет крутизне регулятор характеристике достигать сколь угодно больших значений.

Утверждение 7. Если в цепи с ненулевой степенью устойчивости структ;

двух сильных связей (в,р) и (г,т) удовлетворяет одному из условий: 1

>

> р, г > ш;. 2) 3 = г « 0, р - з + 1; 3) э = 0, р = т = 1; 4) в - 0, ] 1, г - 1, т - 2; 5) р - г - в + 1, т - 8, кЕ+1з > 0, к33+1 < 0'' и этой цеш не существует такой организации слабых связей и оттою которая позволяла бы |м|->+« при |к „|->+», |к |->+».

зр ГШ

Следовательно, если в цепи реализуется одна из приведенных теореме 2 структур сильных связей, которая не удовлетворяет ни одному условий Утверждения 7, то всегда найдется организация слабых cвязeí оттоков, которая обеспечит сколь угодно большое значение 1М1 ]

ь->+«. Что касается знака крутизны регуляторной характеристика, :

как и в случае метаболических цепей с единственной сильной связью, получили лишь достаточные условия положительности м.

Рассмотрим метаболическую цепь с двумя сильными отрицательнз СВЯЗЯМИ (П-1.П) и (п-2,11-1) .

Утверждение 8. Пусть цепь с двумя сильными отрицательными связ; <п-1,п), (п-2,11-1) организована так, что существует невырожденная С( содержащая хп2, которая заканчивается либо оттоком (но не метабол

, либо начальной реакцией. Тогда, если выполнено хотя бы одно условий:

1) в цепи отсутствуют связи, идущие от метаболитов х1(...,хп2 (п-1)-ой реакции;

2) в цепи отсутствует отток метаболита хп_2 и связи, идущие метаболитов *!»• • •.хп_4,хп_2 к (п-з)-ей и (п-и-ой реакциям и ] полняется следующее неравенство:

кп-3 " кп-1,п-3:

то м->+■» цри ь-

Поясним, что под невырожденной ССМ, понимается ССМ, содержащая более одного метаболита. Кроме того, следует отметить, что, если при выполнении второй группы условий заменить неравенство к > к г на

противоположное-кп_3'< кп1 п_3, то получим м->-» при ь->+», Смысл

этого явления 'заключается в том, что малым изменением параметра (например кп_1 п 3) можно от высокого качества стабилизации конечного

продукта (м->+«) перейти к сильной активации его синтеза величиной

собственной концентрации (м->-«).

Проиллюстрируем полученные результаты на следующем примере. Рассмотрим метаболическую цепь, в которой кроме двух сильных отрицательных связей (п-1,п) и (п-2,п-1) есть следующие слабые связи (о,п), (о,п-2), (п-1,п-з) (рис. 2). Очевидно, что организация этой цепи: удовлетворяет

Рис.2. Метаболическая .цепь-с двумя сильными-отрицательными связями (п-1,п) И (п-2,11-1) И .ТреМЯ СЛабЫШ СВЯЗЯМИ (0,п), (0,п-2), (п-1,11-3).

условиям Утверждения 8. . Следовательно, при ь->+« крутизна

регуляторной характеристики должна быть сколь угодно большой, если к > к п_3 (в частности, (п-1,п-з) есть отрицательная опережающая связь). Действительно, при ь—>+» получаем

ип- кп'3

кп-3 " кп-1,п-3

Легко показать, что ■ устойчивость стационарного состояния рассматриваемой цепи не зависит от параметра кп1п_3. Действительно, в соответствии с теоремой 2, степень устойчивости определяется следующим характеристическим уравнением модифицированной цепи:

Х-рЧ. ♦ Л) - ПА-к0п-2 - 0 1=1 1-1

Отсюда следует, что малым изменением кп_х п 3, мы мотам перейти от

стабилизации конечного продукта к активации его синтеза собственной концентрацией, не изменяя степень устойчивости. Кроме того, на примере этой цепи мы можем проиллюстрировать существование организации связей допускающей автономную (то есть независимую) регуляцию качества стабилизации конечного продукта и скорости . переходных процессов. Действительно, из вышеприведенных формул следует, что при ь—>+« и фиксированных значениях эффективных констант скоростей реакций степень устойчивости определяется силой связи (о,п-2), а 1футизна регуляторной характеристики зависит лишь от величины п.3-

Теперь, из класса цепей с двумя сильными связями, сочетающих высокое качество стабилизации конечного продукта с достаточно большой скоростью переходных процессов, выделим подкласс, кавдзя цепь которого характеризуется тем, что цри определенной организации слабых связей и оттоков крутизна регуляторной характеристики растет как l2 при l->+».

Утверждение э. Среди цепей с ненулевой степенью устойчивости только в цепях со следующей структурой двух сильных связей (s,p) и (r,m):

p«s+l, m»r+l, ser, s*0, m*n, k .<0, k_< 0;

r ' . ss+1 rr+1

может существовать организация слабых' связей и оттоков, которая определяет следувдее поведение крутизны регуляторной характеристики при lk I = L->+«, Ik^l - L->+»: IMI « L2.

Организация связей в метаболических систелах произвольной геолетрии дапускахжиря достаточно высокую скорость переходных процессов. рассмотрим метаболическую цепь произвольной геометрйи, то есть с разветвлениями и сохраняющимися пулами интермедиатов. Если все связи этой цепи . являются слабыми, то ' справедливо утверждение: Утверждение ю. В метаболической системе с произвольной структурой и организацией связей всегда существуют значения эффективных констант скоростей реакций и сил связей, которые обеспечивают ненулевую степень устойчивости.

Если же в рассматриваемой метаболической системе имеются сильные связи, то имеют место следующие результаты

Теорема з.

Пусть в. произвольной метаболической цепи, состоящей из ш метаболитов, связанных ' п реакциями, имеется m-r независимых сохраняющихся пулов интермедиатов. Пусть в этой цепи реализуется t сильных связей (pi,si), i=i,...,t, причем з1 з з2 а ... s st. Пусть - это число метаболитов от которых идут сильные связи, - число реакций на которые идут сильные связи и с = min(c1,c2) - максимальное число сильных связей, идущих от различных метаболитов на различные реакции. Тогда, для того чтобы степень устойчивости (р) рассматриваемой цепи полностью определялась организацией слабых связей и при любой их структуре могла быть либо отличной от нуля либо стремиться к нулю с ростом сил сильных связей необходимо- и достаточно, чтобы min(5,г)" собственных значений матрицы g,

G - "sigaHCp^J-N И1'!"1.....С (8)

имели отрицательные действительные части.

Следует отметить, что, если с - это максимальное число сильных связей, идущих от различных метаболитов на различные реакции, то. матрица g имеет ранг min(e.r). Следовательно, так как ранг матрицы g не может превосходить ранга матрица стехиометрических коэффициентов n, то есть г, то t-min(£,r) собственных значений матрицы g являются нулями, а остальные min(£,r), в соответствии с теоремой з, имеют отрицательные действительные части.

in ■ Обобщенный метод возмущения стационарного состояния и его геометрическая интерпретация.

В главе ш диссертации мы обобщили метод возмущения стационарного состояния, развитый в работах Кэкчера и Бернса, Холоденко и Вестерхофа, на метаболические системы, в которых один и тот же фермент может катализировать более чем одну реакцию. Для этого на гиперплоскости l, определенной в пространстве изменения, вектора [х1#..•»xra/V1,....vnlT соотношениями

Д-Х = м, - о,

мы построили многообразие м5 размерности 8 (б (= п) - число ферментов системы), которое задавалось с помощью отображения множества всех возможных значений концентраций ферментов, я, на гиперплоскость п.. Далее, рассматривая касательное пространство к этому многообразии в точке соответствующей исследуемому стационарному состоянию как подпространство пространства мы для любого касательного, вектора получили соотношения связывающие его координаты в пространстве и. с его координатами в касательном пространстве." Затем, используя эту связь, ш получили полную систему соотношений, определяющую системные регуляторные показатели через локальные регуляторные показатели.

ху. Регуляция штоков и концентраций метаболитов в биохимических колебательных системах.

Рассмотрим "классическую" метаболическую цепь состоящую из т метаболитов и п реакций, которая находится в периодическом режиме. Это значит, что концентрации промежуточных метаболитов и потоки есть периодические .функции времени. Могут существовать два типа периодических режимов: вынужденные установившиеся колебания и автокоде баш я. В главе IV мы исследовали вопрос о том как меняются потоки и концентрации метаболитов систем, находящихся в этих периодических режимах, при изменении концентраций ферментов.

Пусть ареГ(1:(е) - <1: ,хрег (С,е),е) +...+ (Ь ,хРег («:, е), е)

- поток по цепи, а х?ег(и,е), 1=1,...,т, - концентрации интермедиатов метаболической системы, находящейся в периодическом режиме. Рассматривая изменение периодического режима, вызванное изменением концентрации какого - либо фермента, определим временные коэффициенты управления концентрациями интермедиатов и потоками следующим образом:

К^1 (С) = ах?ег(С,е)/а1пе3, К?ю = й7рег(1:,е 1/(111^ (9)

Временные коэффициенты управления (9) определяются • как формальные производные периодического решения системы уравнений (И, (2) по

параметру е... Это соответствует сравнении двух периодических решений (замкнутых траекторий), которые отличаются лишь в значении параметра е^ на бесконечномалую величину де^.

Кроме коэффициентов управления'(9), которые характеризуют изменение периодического режима при бесконечномалом изменении какого • - либо фермента, мы также определили переходные коэффициенты управления, которые характеризуют регуляторные свойства переходных процессов от одного периодического режима к другому. Но прежде чем дать их определение заметим, что, если в некоторый момент времени t* начальные условия (х*) принадлежат замкнутой траектории, которая соответствует периодическому режиму системы (i), (2), то вектор концентраций метаболитов который мы будем обозначать как xper(t,e,-t*,x*) будет.всегда принадлежать этой траектории. Теперь рассмотрим наряду с периодическим решением системы (1), (2), хРег(ь,ея:*,х*), другое ее решение, xtr(t,e+üe,-t*,x*), которое осуществляется после возмущения параметра е.. на Де^ в момент времени t*. Функция xtr(t,e+Ae,-t*,x*) описывает переходный процесс от. периодического решения, соответствующего начальному значению параметра е^ к периодическому решению, соответствующему возмущенному значению ej+Aej. в начальный момент времени (t*) оба решения системы (1), (2) (периодическое и переходное) совпадают. Рассматривая разность этих двух решений в каждый момент времени t = t*. определим переходные коэффициенты управления следующим образом:

tr х. x?r(t,e.+Де.;t*,x*) - х?еГ(t,е.;t*,x*) :

К. (t) = е.- lim —-3-з-1-1-,

^ Э де —>0 Де.

J tr. * nnr * *.

t5. т J Ct,е. +Де .;t ,х ) - Jper(t,e.;t ,х )

crjrf{t) = е.- lim -3-3-1- (Ю)

^ J Aej—>0 Ае^

Рассмотрим все введенные выше коэффициенты управления (см. формулы (э) и (ю)) в случае автоколебательной системы. Оказывается, из-за того что даже бесконечномалое возмущение концентраций ферментов в автоколебательных системах приводит к заметному отличия в фазах

соответствующих колебательных режимов, коэффициенты управления, определенные формулой (э), и переходные коэф&зценты управления (см. формулу (ю)) стремятся к бесконечности с ростом времени. Это значит, что в случае автоколебательных систем системные регуляторные показатели, определенные формулами (э), (ю), не могут оценить то управление, - которое оказывается со стороны ферментов системы на концентрации и потоки. _

Рассмотрим теперь метаболическую систему, в которой в некоторой окрестности асимптотически устойчивого стационарного состояния осуществляются вынужденные установившееся колебания. В этом случае из-за того, что частота колебаний не зависит от концентраций ферментов и задается только вынуждавдей силой, коэффициенты управления, определенные формулой (э) являются периодическими функциями времени (в дальнейшем мы будем называть их периодическими коэффициентами управления). Мы доказали, что в таких системах переходные коэффициенты управления стремятся с ростом времени к периодическим коэффицентам управления:

X. •

lim (trK.x'(t) - 4<t)) =.0, lim (^rK?(t> „- K?(.t) -= 0 (11-). t—>» J J t—>• 3 3

Кроме того, мы установили, что как периодические так и переходные

коэффиценты уцравления концентрациями интермедиатов удовлетворяют одному

и тому же уравнению в вариациях:

dz/dt = N-Ov/ex)-z + N- (ev/alne^) (12)

Однако, периодические коэффиценты управления z = к* определяются как

j

единственное периодическое решение этого уравнения, а переходные

коэффициенты управления z = trK* удовлетворяют нулевым начальным

j

условиям. Ниже, мы рассмотрим только случай вынужденных установившихся . .колебаний. -

Пешая сиапела уравнений для выражения системах показателей

регуляции через локальные. Предположим, что в результате действия периодического возмущения

(например электромагнитного поля) величины некоторых кинетических констант меняются периодически с периодом т » 2тт/о. в этом случае, динамическое поведение рассматриваемой метаболической цепи определяется системой уравнений (1), (2), где скорости реакций задаются формулами: .

^(Ь,х,е) = е..-!^ (Ь,х) , у^+Т.х.е) = ^ и,х,е) , (13)

Предположим, что система (1), (2), из) имеет устойчивое периодическое решение (вынужденное колебание)

х. - хРег(С,е), 1-1,...,п (14)

Для того чтобы оценить регуляторные' свойства отдельной реакции метаболической системы введем локальные регуляторные показатели:

Эч . Вч.

—1(Ь) - —1| „г , 1-1-----га, j-l.....п, (15)

эх1 Зх^(ь,е)

Формулы (15) представляют собой ненормированные коэффициенты

эластичности рассмотренные на вынуаденном установившемся периодическом

режиме. Очевидно, что так введенные локальные регуляторные показатели

являются периодическими (периода т) функциями времени.

Для . того .чтобы .определить регуляторные -механизмы, • которые' имеют место в той или иной метаболической системе, знания одних только системных регуляторных показателей недостаточно. Необходимо понять каким образом ответ системы на ' какое - либо возмущение, представляемый системными регуляторными показателями, определяется ответами ее составных частей, то есть отдельными ферментативными реакциями. В разделе 2 главы IV получены уравнения, которые позволяют выразить временные коэффициенты управления через временные коэффициенты эластичности. Для их вывода был использован обобщенный метод возмущения стационарного состояния, основные щм штили и геометрическая интерпретация которого изложены в главе ш. Здесь мы приведем только матричный вид системы уравнений для определения периодических коэффициентов управления потоком (см. формулу (9)). Эта система состоит из п-г уравнений, которые являются аналогами стационарных "теорем суммирования":

ß.suV<t> - i^umvVMc1" - (i//i)-jG{c)-H.su,4,'(c) de},

0

v=l,...,n-r, ' (16)

и г уравнений, которые являются аналогами стационарных "теорем связности":

p.coV<t) = - KjU).<VV1-(I//t).{*'0-C2p + jG(e>-N-conrP<e)de), .

о

p=l,..,,r (17)

Здесь ß = [ß,____,ß],. KJ(t) - [K?(t),...,K?(t).l, •= i//tJ—(t)dt,

1 ' n 0 Sx .

3v dv.

—(t) = 11—2-(c) 1-----v(t) = liv. (t)-ä..||. . , v° =

sx 0Xi 31.....a 3 13 1,3-1.....

1 T j—• q T 3v

1// T-JV(t)dt, G(t) = t// T-*u + S- (?) de,

0 t ax

вектора clw< C2p. v=i,...,n-r, p=i,...,r, являются линейно

независимыми решениями следующих систем линейных уравнений:

1 2 N-C1 = 0, д-с - о,

.а вектор - функции , conr?(t} определяются через матрицу ненор-

мированных козффщентов эластичности (is) и диагональную матрицу v{t) скоростей реакций на вынужденном установившемся периодическом решении.

Система уравнений (16), (17) дает возможность определить временные коэффициенты управления потоком через характеристики отдельных ферментативных реакций системы. Цри этом, очевидно, что величины K?(t), j=i,...,n, будут зависеть как от характера периодического воздействия, так и от того каким образом оно действует (то есть какие параметры системы становятся периодическими функциями времени). В этой ситуации возникает естественная задача: сравнить (на уровне коэффициентов управления) регуляторные свойства метаболической системы осуществляющей вынужденные колебания с регуляторными свойствами той же системы, но находящейся в стационарном состянии, вблизи которого эти колебания осуществляются. Для того чтобы это сравнение было достаточно наглядным были определены коэффициенты управления средним за период т штоком:

С? - Э1пЗУЭ1пе., 5 -3 3 о

(1В)

В разделе з" главы IV было показано, что коэффициенты управления средним за период потоком- совпадают со -стационарными коэффициентами

управления штоком .д

с. -

Э1п|Л/Э1п е..,

Ле,р,М) /З^^-лг® +...+

тогда и только тогда, когда скорости реакций метаболической системы есть линейные функции от концентраций метаболитов и периодическая сила действует аддитивным образом,' что соответствует периодическому изменению одного или нескольких субстратов или продуктов, которые потребляются или образуются в реакциях первого порядка и в стационарном состоянии не изменяются, то есть являются параметрами системы, у. Математическое моделирование процессов сопряжения окислительного фосфоршшрования в митохондриях с транспортом высокоэнергетических фосфатов.

В этой главе диссертации мы построили ряд стационарных математических моделей сопряжения окислительного фосфэрилирования в митохондриях с креатинкиназным челноком.

Для того чтобы определить лимитирует ли диффузия через межмембранное пространство поток высокоэнергетических фосфатов из митохондриального матрикса в цитоплазму в разделе 2 главы V была построена четырехкомпартментная модель, описывающая совокупность превращений изображенных на рисунке з. Используя эту модель мы

.АТР

х—"Л

АТР»

'о^с^СоРИ

) ле*ле«БРлн«о£ пространство

Рис.з. Схематическое изображение четырехкошарткштной модели.

показам, что диффузионные потоки адениннухлеотдов через-медаембраннс пространство практически совпадают со скоростью окислительно! фо сформирования, в то время как потоки через креатинкиназные реакщ близки к нулю. Отсюда можно заключить, что диффузия м>р, атр мевд митохоццриальннми мембранами не лимитирует поток высокоэнергетичегаа

фосфатов. •

Учитывая результаты о гомогешости мезшембранного пространства да адениннуклеотвдов, мы построили трехкомпартментную модель, описывавэд совокупность реакций, изобраиещга на рисунке 4. Из этой модели мы

АРР^ Э =ГАРР

©

6ИПРЕННЯЯ МЕМБРАН*

МЕЖПЕМБРАННаЕ ПРОСТРАНСТВО

^^ вньшняя

ВНЕл)ИТ01вЙвРИАЛЬМ0Е ПРОСТРАНСТ1 «ЕМБРЛНА (5)

Рис.4, схематическое изображение трехкомпартментной модели, получили, что разность концентраций мр мевду внемитохондриальнь (компартмент з) и межмембранным (компартмент 2) пространствами равЕ 22.93 нмоль на грамм штохондаиального белка. Это значение соответствуе акспершентальным данным. Кроме того, было показано, что скорое! окислительного £о сформирования практически совпадает с диффузионны потоком через внешнюю митохондриальную мембрану, тогда кака поток чере креатинкинззную реакцию близок к нулю. Это значит, что диффузия чере внешнюю мембрану не лимитирует поток высокоэнергетических фосфатов в матохондриального матрикса в цитоплазму.

Далее, используя последнюю модель в интерпретации экспериментальны данных, было показано, что основную , роль, в компартментализаци адениннуклеотидов в межмембранном пространстве митохондрий играе барьерная функция внешней мембраны, а эффект динамического тунелировани мевду креатинкиназой и адениннуклеотвдтранслокатором незначителен;

23

Выгоды.

1) Конечный продукт неразветвленяой метаболической цепи стабилизирован в том и только в том случае, когда существует хотя бы одна начинающаяся с него ССМ (структура связанных метаболитов),-которая заканчивается либо оттоком, либо начальной реакцией.

2) В неразветвленных метаболических цепях с единственной сильной связью только сильная отрицательная обратная связь единичной длины позволяет сочетать высокое качество стабилизации конечного продукта с высокой скоростью переходных процессов. В неразветвленных цепях с двумя сильными связями любая структура сильных связей, позволяющая сочетать эти свойства обязательно содержит в себе отрицательную обратную связь единичной длины.

3) в цепях с сильными связями наряду с организациями слабых связей, допускающими независимую (автономную) регуляцию скорости переходных процессов' и качества стабилизации конечного продукта, существуют организации слабых связей, которые позволяют при малых изменениях параметров перейти без 'изменения степени устойчивости от высокого качества стабилизации конечного продукта к сильной активации его синтеза величиной собственной концентрации.

4) Структуры сильных связей в метаболических цепях с произвольной геометрией потоков, степень устойчивости которых стремится к бесконечности или зависит только от организации- слабых - связей, определяются исключительно стехнометрической матрицей.

5) Для полиферментных метаболических систем, находящихся в вынужденном установившемся периодическом режиме, определены системные, и локальные регуляторные показатели, количественно оценивающие рзгуляторные .свойства.. Получена полная система уравнений, позволяющая вычислить периодические коэффициенты управления через коэффициенты эластичности и скорости ферментативных реакций.

6) Если кинетика реакций полпферментной системы линейна и оказываемое на нее периодическое воздействие входит в выражения

скоростей реакций аддитивным образом, то коэффициенты управле] средними (за период) потоками и концентрациями метаболитов совпадаю] коэффициентами управления, вычисленными в стационарном состоянии оке которого осуществляются вынужденные колебания.

7) Шток высокоэнергетических фосфатов из .матрикса митохондрии цитоплазму не лимитируется диффузией ни через межмембранное пространен ни через поры внешней митохондриальной мембраны.

8) В стационарном состоянии основную роль в компартментализаг адениннуклеотидов в межмембранном пространстве митохондрий игра барьерная функция внешней мембраны.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1) Демин О.В., Холоденко Б.Н., Организация связей в метаболических цепях, сочетающих высокое качество стабилизации конечного ■ продукта с высокой скоростью переходных процессов. Биохимия,

1993, Т. 58, ВЫП. 7, СТР. 997 - 1008.

2) Холоденко Б.Н., Демин О.В., Стабилизация продукта и динамическая устойчивость в неразветвленных метаболических цепях. .Какие структуры оптимальны? Биохимия, 1993, т. 58, вып.

3, стр. 424 - 437. Т . ,

3) Kholodenko B.N., Detain O.V., Westerhoff H.V., "Channelled" pathways can be more sensitive to specific regulatory signals. FEBS Letters., 1993, vol. 320, p. 75-78.

4) Kholodenko B.H.,. Cascante M., Molenaar. D.Dentin O..V,, Van - Der Gugten A.A., Westerhoff H.V. , Control theory of cell

metabolism: towads more realistic "non-ideal" systems. Journal of Biological Systems, 1995, vol. 3, No. 1, p. 145 - .154.

5) Derain O.V., Kholodenko B.N., Mildaziene v., Nicolay K., Gellerich F.N., Westerhoff H.V., IN Modern Trends in BioThermoKinetics (Gnaiger E., Gellerich F.N., Wyss M., eds.,)

1994, p. 201-202, Innsbruck University Press, Insbruck. Energy flow around the outer mitochondrial membrane.

6) Kholodenko B.N., Detain O.V., Westerhoff H.V., Control of (steady-state) periodic phenomena in metabolic systems. - J. Theor. Biol., in press.

7) Demin O.V., Westerhoff H.V., Kholodenko B.N., Control of (steady-state) forced oscillations. - J. Theor. Biol., in press.

I