Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Автоматизация моделирования полиферментных систем с использованием банка данных по ферментам и метаболическим путям

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Автоматизация моделирования полиферментных систем с использованием банка данных по ферментам и метаболическим путям"

рГ Б "од

^ о М1Р 1995

На правах рукописи

УДК 577.151.01,02,62

ГОРЯНИН ИГОРЬ ИГОРЕВИЧ

Автоматизация моделирования полиферментных систем с использованием банка данных по ферментам и метаболическим путям

03.00.02 - Биофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Пущин о 1995

Работа выполнена в лаборатории математического моделирования полиферментных систем Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН.

Научный руководитель : доктор физико — математических наук,

профессор Е.Е.Сельков

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук Б.Н.Гольдштейн

кандидат физико-математических наук П.Б.Стаценко

Ведущая организация: Кафедра биофизики Биологического

факультета Московского Государственного Университета

У"

Защита диссертации состоится " «Р 1995 г. в ^ часов

на заседании Диссертационного совета Д 200.22.01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу, г. Пущино, ИТЭБ РАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ РАН

Автореферат разослан " /с"__1995 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат биологических наук ' П.А.Нелипович

Си 1с

и

Общая характеристика работы Актуальность проблемы

Тема диссертационной работы относится к проблеме автоматизации математического моделирования поведения сложных метаболических систем, их временной организации.

Скорость секвенирования быстро возрастает, в настоящее время она достигает нескольких бактериальных геномов в год. Ожидается увеличение этой скорости на порядок в 1996 году, что приведет к секвенированию полного генома человека в течение ближайших нескольких лет и секвенированию десятков бактериальных геномов ежегодно. В тоже время экспериментальное исследование метаболизма секвенируемых организмов прогрессивно отстает от накапливаемой генетической информации. Это порождает проблему, не существовавшую ранее: необходимость теоретической реконструкции метаболизмов и их регуляторных свойств на основе генетической информации.

Такая реконструкция осуществима только при условии полной автоматизации построения моделей сложных биохимических систем, их качественного и количественного анализа, приведения моделей в соответствие к полученным биохимическим экспериментальным данным.

Цель работы

Разработать технологию автоматизированного моделирования отдельных ферментативных реакций, метаболических путей и программный пакет ее реализующий.

Для проверки этой технологии и работы пакета программ провести теоретическое исследование сложного кинетического и динамического поведения ферментов на основе ферментных каскадов циклической ковалентной модификации и ряда эквивалентных моделей.

Научная новизна

Разработанная технология и программные средства являются оригинальными, хотя и опираются на существующие численные методы анализа.

Аналитические и модельные результаты, полученные при использовании разработанной технологии также являются оригинальными.

Практическая ценность

Результаты работы могут быть использованы для реконструкции метаболических систем и предсказания их свойств на основе быстро растущей информации о секвенированных геномах и информации содержащейся в банке данных по ферментам и метаболическим путям ЕМР

Программное обеспечение может быть также использовано для учебных целей в современных компьютеризованных курсах по биохимии университетов и в экспериментальных работах для оценки кинетических параметров

ферментативных реакций.

Апробация работы и публикации

Результаты диссертационной работы докладывались на Всесоюзномрабочем совещании "Клеточный цикл бактерий" ( Пущино,1986 ),Всесоюзном рабочем совещании " Молекулярная биология и биофизика клеточных часов" (Пущино, 1986), Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы и регуляция энергетического обмена" ( Пущино, 1986), на различных конференциях и семинарах молодых ученых (Пущино, 1987—1989). Simposium CronoBiology und Chronomedizin (Halle, 1986), 1 Ith International CODATA Conference (Karlsruhe, 1988),

IMACS Symposium on MATHEMATICAL MODELLING. (Vienna, 1994), Международное рабочее совещание по фактографическим банкам данных в биологии. (Пухцино, 1994).

По теме диссертации опубликовано 11 работ, список которых помещен в конце автореферата.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы и трех глав. Рукопись содержит 98 страниц, 20 рисунков, и 119 литературных ссылок.

Основное содержание диссертации

Во введении обсуждается общая постановка задач исследования, дается краткое описание структуры диссертации.

Общий обзор литературы посвящен теме развития методов автоматизации математического моделирования. При этом основное внимание уделено развитию технологии и программного обеспечения для математического моделирования отдельных ферментативных реакций и полиферментных систем. Рассмотрено развитие фактографических банков данных по ферментам и метаболическим путям, по нуклеотидным последовательностям. Проанализированы способы классификации ферментативных реакций, методы, используемые для расчета кинетических, элементарных констант ферментативных реакций и определения типов ингибирования. Также обсуждается развитие сильно нелинейных моделей аллостерических ферментов и каскадов ковалентной модификации, объясняющих сложное регуляторное поведение ферментов и автоколебательные режимы временной организации полиферментных систем.

Основные главы диссертации предваряются краткими введениями и обзорами литературы по конкретным вопросам.

В первой главе представлены численные методы и алгоритмы для автоматизации моделирования ферментативных реакций и метаболический путей. Рассматривается преимущества и недостатки существующих технологий. Подробно описываются алгоритмы, которые включены в программный пакет DBsolv. Для автоматизации вывода и компьютерного анализа полиферментной системы и отдельных ферментативных реакций необходим механизм формализации представления данных, описывающих систему, и однозначно её определяющих. Далее, для краткости изложения, отдельные ферментативные реакции и полиферментные системы, в случаях, где разница не существенна мы будем называть метаболическими системами.

Прежде всего необходимо привести уравнения метаболической системы к матричному виду. Благодаря этому появляется возможность выделять линейно независимые реакции и комбинации концентраций, что в дальнейшем обеспечит анализ и интегрирование системы дифференциальных уравнений, описывающих изменение концентраций субстратов, продуктов и фермент—субстратных комплексов.

Каждая метаболическая система может быть представлена в виде стехиометрической матрицы. Сгехиометрическая матрица —это матрица, -элементами—которой являются стехиОметрйческйе коэффициенты веществ, участвующих в реакциях. Строки этой матрицы соответствуют реакциям, а

столбцы веществам. Элемент этой матрицы cct — целое число, стехиометрический

коэффициент, определяющий количество молекул метаболита Д,, участвующего в стехиометрическом уравнении j—ой реакции. СС>0, если метаболит — продукт, СС <0, если метаболит — субстрат. Если метаболит не участвует в реакции, то 01 = 0. Стехиометрическая матрица имеет размерность (N1.N2), где N1— число реакций,

N2 — число реагентов. Стехиометрические уравнения сложной реакции можно представить в виде: X А = 0 (1)

где X — стехиометрическая матрица, А — столбец реагирующихвеществ. Среди уравнений (1) могут иметься такие, которые относятся к комбинации двух или более реакций (составляются из уравнений этих реакций). Очевидно, такие уравнения не дают дополнительной информации о реакционной системе по сравнению с теми уравнениями, которые их образуют. Линейно независимыми комбинациями концентраций называются суммы:

1-I

произведений некоторых чисел на величину концентраций ^веществ Aj■ Линейно независимые комбинации в соединении с линейно независимыми уравнениями реакций позволяют однозначно описать процесс минимальным количеством биохимических реакций с максимальной простотой кинетических

зависимостей. .

Для составления правых частей системы дифференциальных уравнений используется закон действующих масс. В основе его лежит то очевидное предположение, что реагируют только те молекулы, которые сталкиваются. Следовательно, величина скорости реакции зависит от числа столкновений реагирующих молекул в единицу времени с частотой, пропорциональной произведению концентраций реагирующих веществ.

Системы обыкновенных дифференциальных уравнений (ОДУ), описывающие метаболические системы в общем случае записываются в виде:

о,),

/ = 1 а< / <Ъ

где X — начальные концентрации веществ принимающие участие в реакциях;

/,(х) —правые части, составленные исходя из закона действующих масс(либо полученные другим способом), / —время, п — количество веществ . Хотя решение некоторых задач Коши ОДУ может быть найдено аналитически, во многих случаях, в том числе для большинства задач, ферментативной кинетики, такой путь оказывается невозможным. Существуют способы построения приближенного решения задачи Коши с помощью численных методов, в частности конечно — разностных методов.

Из экспериментальных данных (ЕМР) видно, что константы скоростей отдельных стадий ферментативных реакций и концентрации реагентов сильно различаются. Учет этих факторов при построении моделей неизбежно приводит к явлению жесткости и описывающим его жестким системам. Сущность этого явления определяется необходимостью одновременного привлечения для описания процессов в любой точке отрезка наблюдения бысгроубывающих функций с большими производными и функций с малыми производными. Пренебрежение разного рода "малыми величинами" при математическом моделировании реальных

процессов можно существенно исказить истинную картину явлений. Поэтому в системах уравнений, описывающих еще неизученный процесс, необходимо учитывать большое количество на первый взгляд второстепенных факторов. Следствием этого является с одной стороны высокий порядок системы, с другой — ее жесткость. При дальнейшем изучении процесса степень жесткости и порядок системы обычно понижаются, но существует и ряд важных задач, где жесткость присутствует по самой сути вещей. В частности в случае с релаксационным осциллятором, описанном ниже, не учет жесткости приводит к катастрофической ошибке при решении задачи Коши. В случае понижения порядка система дифференциальных уравнений трансформируется в смешанную систему алгебро — дифференциальных уравнений, что тоже требует использования специальных методов.

Наиболее известными алгоритмами для решения жестких систем ОДУ являются программные реализации Гира DFASUB (G.W.Gear 1971,1973) для интегрирования жестких систем и DASSL ( LR.Petzold 1983) для работы со смешанными системами. Для решения специфических задач, возникающих при моделировании метаболических систем необходимо объединение алгоритмов для интегрирования как жестких, так и смешанных систем в один.

Для решения таких проблем нами был разработан и реализован в приложении DBsolv оригинальный неявный метод 3—го порядка точности, использующий обратное дифференцирование с уточнением точки на каждом интервале интегрирования. В основе метода лежит идея метода Калахана( программа DEQAS, разработанная в ИМПБ РАН). Реализованный алгоритм позволяет пользователю менять жесткость и количество уравнений в смешанной жесткой системе алгебро—дифференциальных уравнений практически на каждом шаге. Для автоматического составления уравнений скоростей реакций, используются методы, широко описанные в литературе и применяемые в различных программных комплексах, таких как METAMOD( J.S.Hofmeyr and K.J. van del Meiwe 1986 ), GEPASI (Pedro Mendes, 1993). Dbsolv использует стехиометрические матрицы и константы скоростей элементарных стадий содержащиеся в банке данных по ферментам и метаболическим путям ЕМР. Программа определяет комбинации линейно независимых реакций и пулы концентраций. Для этого использован алгоритм прямого исключения Гаусса с частичным упорядочиванием. Важной особенностью Dbsolv является возможность выражения линейно зависимых комбинаций концентраций веществ через линейно независимые и наоборот. Это необходимо для выделения не только внутренних пулов концентраций системы, но и наперед заданных пулов определяющих биохимические свойства системы. Такие операции представляются важными для объединения различных участков метаболизма в один для совместного моделирования.

Нахождение стационарных состояний систем ОДУ и их параметрический анализ является одной из основных частей математического моделирования биологических систем и метаболических путей в частности.

Во —первых для исследования стабилизирующих регуляций в полиферментных системах, нахождения областей параметрической стабильности для обеспечения клеточного гомеостаза.

Во — вторых для анализа критических ситуаций_в_долифермен1ных г-игтрмду, ~ частности при выяснении роли периодической временной организации в регулировании биологических процессов.

Для параметрического бифуркационного анализа разработано несколько пакетов программ. ШСВЩА.И.Хибник и др. ИМПБ РАН 1984-1994), включающий нахождение бифуркаций стационарных состояний до коразмерности 3 и предельных циклов, использует процедуру движения по кривой. AUTO(E.Doedel 1986—1993), позволяющий вычислять все ветви периодических и стационарных решений системы использует методы, при которых система обыкновенных

дифференциальных уравнений рассматривается как краевая задача с дополнительным интегральным условием.

В пакете DBsolv реализована задача поиска и продолжения по параметру стационарных состояний. Используется метод, подобный реализованному в LOCBIF. Основными отличиями от последнего являются: улучшенное нахождение начальной точки и независимость работы программы от нормировки, что позволяет работать с системами без искусственного обезразмеривания. Также Dbsolv использует большинство процедур AUTO, включая графическое представление полученных результатов.

Основным преимуществом Dbsolv перед существующими программами является использование библиотек времени выполнения Windows DLL библиотек на всех этапах работы, что позволяет интерактивно вычислять полученные или заданные пользователем правые части дифференциальных уравнений.

Для приведения теоретически полученных моделей метаболических систем в соответствие с экспериментальными данными исследователи используют различные численные методы. Начиная с простой линейной регрессии для линеаризованных уравнений Михаэлиса Excel(Microsoft, 1994), гиперболической и других видов нелинейной регрессии HYPER(J. S. Easterby , 1992 ) до безусловной минимизации наименьших квадратов методом Марквардта — Левенберга (Marquard, 1963), Enzfitter (SIGMA, 1991) и WinFit( Scientific Tools, 1994)

Основу применяемого в Dbsolv алгоритма составляют методы непараметрической статистики, сходные с методом Корниш—Боудена и Эйзанталя( Корниш — Боуден, 1980) и далее безусловной минимизации методом нулевого порядка Хука и Дживса( Spendley W. , 1962).

Вычислительные эксперименты показали, что такой подход позволяет значительно сократить время оптимизации и избавиться от нереалистичных экспериментальных данных.

Во второй главе дм проверки эффективности работы программного комплекса Dbsolv теоретически выведены и проанализированы модели релаксационных биохимических автогенераторов, основанных на ковалентной модификации фермента.

В последние годы механизмы циклической ковалентной модификации ферментов привлекают к себе особое внимание. Дело в том, что активности ферментов, занимающих стратегические позиции в клеточном метаболизме, как правило, контролируются именно при участии таких механизмом, а не простым равновесным связыванием аллостерических лигандов с ферментами MHineMMH[Pilkis S.J.,1983], Это объясняется тем что цикл ковалентной модификации благодаря затрате энергии на рециркуляцию способен обеспечивать значительно большее усиление сигнала чем механизм равновесного связывания [Goldbeter А., 1984]. Именно поэтому, по — видимому, усиление слабых сигналов, воспринимаемых из окружающей среды рецепторами клеточных мембран, осуществляется каскадами ковалентной модификации [Chock Р.В., 1984]. Можно думать, что функция усиления слабых сигналов, воспринимаемых рецепторами, и циркулирующих в петлях отрицательных обратных связей, обеспечивающих клеточный гомеостаз, не является единственной в клеточной организации. В теоретических работах [Е.Е. Сельков , 1976, Е.Е. Сельков, 1986] были рассмотрены различные варианты моделей, описывающих динамику систем, содержащих циклы ковалентной модификации ферментов. Показано, что в таких системах могут возникать колебания и триггерные явления. Поскольку подобны? нелинейные явления наблюдаются в системах и без участия циклов ковалетной модификации, представляется интересным выяснить, какие преимущества приобретает биохимическая система при переходе от прямой аллостерической регуляции к гомологичной регуляции, опосредованной ковалентной модификацией. Ковалентная модификация ферментов является значительно более эффективной формой управления активностью ферментов по сравнению с управлением,

б

основанным на равновесных конформационных переходах. По — видимому, именно этим объясняется тот факт, что наиболее важные ключевые реакции клеточного метаболизма регулируется на основе ковалентной модификации ферментов. В работе [Е.Е.Сельков, 1986] была исследована математическая модель проточной

реакции —> ^ —^ -^катализируемой ферментом Е(А,В), подвергающемуся ковалентной модификации при участии ферментов Ел и Ев ■ в соответствии со схемой (1):

На схеме (1): А — активная форма, В — неактивная форма фермента Е(А,В); & , & — субстрат и продукт реакции —> & ~У & —У являющиеся одновременно ингибиторами фермента модификатора Еа ■ инактивирующего активную форму Д' Ев — активирующий фермент—модификатор;

Анализ математической модели системы (I) показал, что эта система при определенных условиях может быть почти идеальным генератором релаксационных колебаний, период и амплитуда которых могут быть вычислены аналитически. Возможность аналитического вычисления параметров колебательного режима в системах типа (1) открывает широкие возможности для теоретического анализа механизмов временной организации клеточного метаболизма, который до сих пор опирался исключительно на очень трудоемкие численные расчеты . Вывод асимптотической математической модели системы (1), позволяющей производить аналитический расчет ее колебательного режима, был основан на ряде упрощающих допущений и использовании феноменологических

-выраженийтуш-скоростей-реакций катализируемых-ферментами Е(А,В)гЕ^Ег^-

Однако условия, позволяющие вывести такие уравнения скоростей исходя из молекулярных взаимодействий между ферментами и их лигандами остались не изученными. На эти недостатки было указано в работе [Б.Н.Гольдштейн 1988]. Отмеченные недостатки проанализированы [ИИ Горянин 1992], где описывается кинетическая- модель системы (1), учитывающая существование всех возможных фермент—лигандных комплексов, и формулируются условия, при которых

математическая модель системы (1) сводится к ранее описанной феноменологической модели. На примере эквивалентной зеркальной модели [К.Г.БеМуик, 1994] анализируется модель автогенератора основанного на ковалентной модификации фермента при субстратном и продуктном угнетении фермента —активатора Ев (1*)-

8, V,

(1*)

Для системы (Г) построена кинетическая и математическая модель, учитывающая все фермент—лигандные комплекы и проведено сравнение результатов между аналитическими формулами и численным интегрированием. Кинетические модели для каждой системы выписаны отдельно. В разделах содежащих математическую модель и аналитические формулы для периода и амлитуды релаксационных колебаний исследование двух систем (1, 1*) проводится параллельно. При выводе кинетической модели релаксационного биохимического автогенератора принималось во внимание ,что полная схема всех возможных вазаимодействий лигандов с тремя ферментами Е(А,В), Ел и Ев в системах(1, Г) очень сложна и ее анализ может быть осуществлен только численно. Однако при определенных допущениях о механизмах взаимодействия лигандов с ферментами и при использовании сильных различий в концентрациях веществ и скоростях элементарных стадий, обычно наблюдаемых в реальных биохимических системах, математическое описание системы (1) сильно упрощается и допускает, при определенных условиях, аналитическое исследование. При выводе математической модели системы (1) использовались следующие упрощающие допущения о механизмах действия ферментов Е(А,В), Еа и Ев и о характере взаимодействия лигандов с этики ферментами. Принималось, что фермент Е(А,В) имеет два различных центра связывания: каталитический центр, к которому присоединяется субстрат , и аллостерический центр, модификация которого ферментами — модификаторами Ел и Ев приводит к циклическому взаимопревращению двух форм А В. События б каталитическом центре форм А и В не зависят от

присоединения ферментов Ел и Ев. хотя сами формы отличаются друг от друга сродством к Si и каталитической эффективностью.

Принималось также (1), что субстрат Si и продукт Ss основной реакции —> Si ~^ S2 являются аллостерическими ингибиторами фермента —

модификатора Ел. конкурентными по отношению друг к другу и неконкурентными по отношению к молекулам А и Si А, присоединяемым к каталитическому центру ЕлА в системе (Г) предполагалось, что субстрат Si и продукт S2 основной реакции —> Si —^ Si —^ являются аллостерическими ингибиторами фермента — модификатора Ев> конкурентными по отношению друг к другу и неконкурентными по отношению к молекулам В и S В, присоединяемым к каталитическому центру Ев-

При выводе математических моделей предполагалось, что реакции протекают в среде идеального перемешивания, термо— и рН — статирования. Также учитывалось существование иерархии концентраций, определяемой условиями:

S..S. ->'> Ео » ЕаоэЕво-

Как показал анализ обширного экспериментального материала, проведенного с помощью банка данных по ферментам и метаболическим путям ЕМР , подобная иерархия типична для клеток ш vivo. Действительно, из данных ЕМР следует, что средняя концентрация интермедиатов клеточного обмена, определенная как среднее значение логарифмов констант Михаэлиса для интермедиатов, равна — . 1, а среднее значение логарифмов концентраций ферментов и ферментов — модификаторов различного сорта равны — 7.4Í1.3 и —8+0.8 соответственно. Малость концентраций ферментов Е(А,В), Ел и Ев по отношению к Si и S2 позволяет существенно упростить анализ — в этом случае концентрации Si и S2 изменяются много медленнее, чем концентрации всех ферментных форм. Благодаря этому в системах быстро устанавливается квазистационарное состояние, в котором выполняются условия стационарности для всех ферментных молекул, но не для Si и S2- Б этом состоянии взаимосвязь между квазистационарными концентрациями ферментных молекул (всего 16. разных видов) определяется четырьмя линейными графами и одним нелинейным.

С учетом приведенных выше допущений и обезразмеривания математическая

-модель—(1^—описывается-следующей-системой—уравнений—материального-баланса-

(размерные выражения опускаются из —за их громоздкости):

da dt

; v,™ - Kx a + v,

doi

&-~r - V~ KiGi + Vi dt

где

V = co+co,

Oi / or ч

fi> =-—(а+л--),

к. + (Я к, + о.

к. + а

к.+Р

п а Pi

Кл + а кЛр

-г-

а

к, + Р (к. + еф+а+а)

= 0.

Здесь Oi, СБ. ОС,и Р~ безразмерные концентрации SijSzjAiB; V — безразмерная скорость превращения Si ~^ S2 . катализируемого ферментом Е(А,В); СО vi (О — аналогичные скорости для форм А и В ; Vi* и у2т — максимальные скорости притока Si > S2~ константы скорости обмена Si > Si Km, К-, Кл < К и ~ безразмерные константы Михаэлнса для А, В Ea.EbI относительная активность формы В; £А, £в относительные концентрации ферментов — модификаторов Ел Ев; £1 ~ относительная константа угнетения Еа посредством Sj-

Если в модели (2) учесть, что относительные концентрации ферментов Ел и Ев пренебрежимо малы ( £А,£В ~> 0), то она принимает вид для системы) 1):

da

— — vi» — xi а + dt

do,

= V - Ki Oi + V2„

dt

где

V = —«+ (1- а),

к„ + а ' + а

1-а

— г-

а

Кв + 1-а 0, + а)(1+ а+ а)

Для системы (Г):

= 0.

13]

с1а

£г—Г = Уы - Кх а + V,

л

Л

= V - К, <Ъ + У2»

V = ■

а

к. +а

-а+ е-

<л

*:.+ а

-(1-а),

1-а

а

= 0.

(3*)

(кЛ а*%\ +аА сь) Кв +а

Рассмотрим модель(З) в условиях, при которых малы параметры Кт>Кл>Кв: &■ В этих условиях эта модель может генерировать почти идеальные релаксационные колебания переменной а (Глава 4 Рис.1). Используя предельный переход £г —> 0, можно свести модель (3) к вырожденной модели первого порядка с разрывной правой частью:

= У1»-'М о;

(4)

В которой У(ся) — квазистационарное значение скорости реакции ¡$1 —^ ¡Зг-В важном частном случае необратимого источника и, в котором К ~ 0, при малых Кл. АГв.и Вг и в пределе КЛ,КВ, К^ —> 0

- аппроксимация предельного цикла приводит к формуле периода в безразмерном виде:

т. = -

1

(5)

Форма входных и выходных характеристик автогенератора близка к идеальной гистерезисной нелинейности, используемой в нелинейных схемах для генерации

» %

релаксационных колебаний и создания триггерных режимов. Столь высокое качество схем (1) и (1*) совершенно не достижимо для гомологичного механизма прямой аллостерической активации фермента продуктом. Теоретически оно может быть получено только при числе активирующих центров порядка 500.

Проведенное сравнение ассимптотически вычисленных величин с <7л , т0с соответствующими величинами, полученными прямым интегрированием модели (Глава 3) показывают высокую точность асимптотических формул. Это обстоятельство позволяет заменить трудоемкую операцию прямого интегрирования вычислениями параметров колебательного режима по асимптотическим формулам. Такая замена оказывается исключительно важной при анализе поведения релаксационных биохимических автогенераторов в сложной системе многоконтурного регулирования, существующего в реальных биохимических системах — таких как углеводный энергетический обмен [Е.Ь.5Ьеуе1еу ,1992].

Система регуляторных связей, показанных на схеме (1), до сих пор не была экспериментально обнаружена. Следует, однако, заметить, что система реакций (1) качественно эквивалентна одной ферментативной реакции.

Эквивалентный фермент которой Ев кооперативно активируется субстратом и продуктом s, . Действительно, зависимость скорости превращения —> Si ~^ Si в (1) от концентраций Si cons4 и Sj = c°nst) имеет сигмоидальный

характер. Подобная кинетика характерна для ферментов —олигомеров, аллостерически активируемых продуктом и субстратом .

Анализ, опубликованной до сих пор экспериментальной информации, с помощью банка данных по ферментам и метаболическим путям ЕМР показывает, что существует более десятка различных ферментов— олигомеров, которые контролируются связями типа (6). Среди таких ферментов хорошо изучений ключевой фермент гликолитической системы животных тканей фосфофруктокиназа (ЕС 2.7.1.11), активируемый субстратом D — фруктозо — 6 — фосфатом и продуктом D —фруктозо—1,6 —бисфосфатом [К. Tornheim ,1976]. К таким ферментам относится и митохондриальный фермент печени крысы глутаминаза (ЕС.3.5.1.2), который кооперативно активируется субстратом L—

глутамином и продуктом [Szweda LI. ,1990].

NH"

Регуляции вида (6), по —видимому, играют ключевую роль в генерации автоколебаний, необходимых для временной организации метаболизма, в частности, для подавления паразитной рециркуляции субстратов в футильных циклах [Е.Е. Selkov Е.Е. ,1980] [A. Boiteux , В. Hess , Е.Е. Selkov Е.Е. ,1980]. К таким футильным циклам относятся циклы, катализируемые ферментами — антагонистами фосфофруктокиназой совместно с фруктозобисфосфотазой (ЕС 3.1.3.11) и глутамин синтетазой (ЕС 6.3.1.2) совместно с глутаминазой [Е.Л. Шевелев , Е.Е. Сельков 1987].

Теоретический анализ роли реакций типа (6) во временной организации клеточного метаболизма связан с очень трудоемким численным исследованием сложных математических моделей, представляющих собой системы нелинейных дифференциальных уравнений. Эквивалентность реакций [6] изученной системе (1) и возможность аналитического вычисления параметров колебательного режима позволяет использовать систему (1) в качестве феноменологической модели реакций вида (6), катализируемых олигомерными ферментами. Такая подмена простой реакции (6) существенно более сложной системой (1), представляющаяся на первый взгляд абсурдной, позволяет заменить численное исследование соответствующих моделей аналитическим, что радикально упрощает задачу. Следует заметить, что кроме реакций типа (1) и (6) к которым могут быть применены введенные ассимптотические формулы, существует большое разнообразие эквивалентных реакций, многие из которых часто встречаются в метаболизме различных организмов. Поэтому асимптотические формулы могут найти широкое применение при теоретическом анализе механизмов временной организации полиферментных систем.

В третьей главе приведены примеры использования DBsolv для автоматизации математического моделирования метаболических систем

Рассматривается использование Dbsolv для численного анализа модели(1) и системы (3).

Для этого согласно кинетической модели необходимо выписать все элементарные стадии модели (1) предварительно пронумеровав все участвующие в реакции вещества.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Si A SA s, В Ел АЕ. &Ае» S,B Ев ВЕ, S.BE, E.S. Ae.SS, SAE.S, Ae.S, E,S,

1.-&- А + 5,А = 0;

2.+& + А-8,А = 0, З-^А + А + в, =0; 4 -Б, -В+ 8. В. =0; 5+8, + В-Э.В, = 0; б-З.В + В + Б, =0;

7.-А-Е.+АЕ. =0;

8.+А + Е, - АЕ„ =0,

9.-АЕ+Е.+В = 0;

16.-S.B- Е, + 3,ВЕв = 0; П.+Б.В + Е, -S.BE, =0;

18.-81ВЕ, + Е,+А = 0;

19.-8,-Е, = 0;

20.+Б, + ЕЛ-ЕЛ8, = 0;

21.-5,-Ел +Е.8, =0;

22.+Э, + ЕЛ-Е.8,=0;

23.-8,— АЕЛ + АЕа5, =0,

24.+3, +АЕЛ - АЕ.Э, =0;

10.-S.A-E. +5.АЕ. =0, 25.-8. -Б.АЕ. +8,АЕЛ8, =0;

11.+8, А + Е„ -Б.АЕ. = 0; 26 +Б, +8,АЕЛ - в.АЕ^, = 0;

12.-S.AE, +Е, +8,В = 0; 27.-8, - АЕ„ + АЕ.Э, = 0;

13.-В-Е,+ВЕ, = 0; 28 +Э, + АЕа - АЕ.Б, = 0;

14.+В + Е, -ВЕ, =0, 29.-8,-в, АЕЛ +5,АЕл8, =0;

15.-ВЕ, + Е, + А = 0; 30.+ в, АЕЛ - в, АЕД = 0;

Здесь, для простоты, каждая элементарная стадия реакции (1) записана в виде уравнения. Знаки —I- перед наименованием интермедиатов соответствуют элементам стехиометрической матрицы.

В результате получается стехиометрическая матрица размером 30x17 (30 — элементарных стадий, 17 интермедиатов реакции).

Задаются начальные концентрации и константы скоростей элементарных стадий, приток субстрата и отток продукта. Этого достаточно для того, чтобы полностью описать систему (1).

ОВ$о№ проведёт исследования на линейную независимость реакций и комбинаций концентраций, выделит пулы концентраций, составит систему дифференциальных уравнений, проинтегрирует и сделает ее параметрический анализ. В Таб.1 приведены экстремальные значения переменной о; ( сЯш^ и СЯ^) и значения периода автоколебаний Г0У,вычисленные прямым интегрированием модели (3) при различных значениях параметра Л*2. В этой же таблице для сравнения приведены значения аналогичных величин (С7"1а, та), вычисленных по

ассимптотическим

данных

показывает, что «1

формулам Сравнение з ассимптотические формулы позволяют при £, Е ,Кщ,К , КБ <<■ 1 определять параметры автоколебательного режима в системе (3) с очень низкой погрешностью (порядка нескольких процентов).

и •

Рис. 1 Автоколебания безразмерной концентрации субстрата а в системе (3). Таблица 1

Сравнение экстремальных значений переменной СЯи периода автоколебаний в модели (3) полученых численно и аналитически.

Значение параметра

Ччсленное интегрирование модели (5)

Вычисление по асснмп готическим формулам Относительная погрет

К1 01 пых а- о;. О". г. %

1.1 1.081 0.174 3.637 1.080 0.187 3.606 0.8

1.2 1.158 0.326 3.342 1.156 0.339 3.404 1.1

1.3 1.224 0.454 3.093 1.221 0.467 3.049 1.4

1.4 1.280 0.563 2.880 1.276 0.576 2.831 1.7

1.5 1.328 0.658 2.695 1.324 0.671 2.641 2.0

1.6 1.371 0.741 2.535 1.366 0.574 2.475 2.4

1.7 1.409 0.815 2.393 1.403 0.828 2.329 2.7

1.8 1.442 0.880 2.268 1.436 0.893 2.199 3.1

1.9 1.472 0.938 2.156 1.465 0.951 2.083 3.4

В банке моделей ферментативных реакций содержится стехиометрическая матрица однозначно определяющая граф реакции, уравнение начальной скорости выраженное как через константы элементарных стадий, так и через кинетические константы. В качестве примеров для каждого из механизмов представлены кинетические константы наиболее изученных и широко представленных в ЕМР ферментов. Пользователь имеет возможность выбрать механизм, по которому работает фермент и определить все кинетические и элементарные константы подгонкой к экспериментальным данным.

«

-1.1Q-D.58-0.070.15 0.96 1.48 1.99 2.51 3.02 3.54 -Ü.BO-ir.210.37 O.SB,1.54 2.13 2.72 3.30 3.89 4.47 1/[A] Substrate Concentration 1/| [¿([Substrate] 10 0

Рис. 2 Примеры интерфейса пользователя DBsolv Выводы

1) С целью автоматизации математического моделирования клеточного метаболизма разработан программный пакет Dbsolv (ОН-), работающий в операционной среде Windows. Пакет позволяет автоматизировать процесс моделирования стационарной кинетики и динамического поведения отдельных ферментативных реакций. Пакет также дает возможность автоматизировать моделирование стационарного и динамического поведения сложных полиферментных систем.

2) С помощью Dbsolv и обобщеной номенклатуры Клиланда создан банк данных по механизмам ферментативных реакций, содержащихся в банке данных по ферментам и метаболическим путям ЕМР. Использование банка существенно облегчает идентификацию механизма и кинетических параметров ферментативных реакций.

3) Для проверки возможностей пакета программ ОЬ8о1у выведена и проанализирована математическая модель, описывающая генерацию

релаксационных автоколебаний в открытой реакции, в которой фермент подвергается ковалентной модификации при участии модифицирующих ферментов. Выведены асимптотические уравнения для квазистационарной скорости реакции в модели, учитывающей все фермент лигандные комплексы реакции и асимптотические выражения для периода и амплитуд релаксационных колебаний. -

4) Для этой модели продемонстрировано хорошее качественное и количественное согласие аналитически определенных значений периода колебаний со значениями, полученными с помощью численного моделирования . Показано, что изученная модель может использоваться для автоматизации моделирования широкого класса колебательных и триггерных реакций, катализируемых олигомерными ферментами.

Публикации по теме диссертации.

1. Е.Е. Сельков , И.И. Горянин Почти идеальный биохимический релаксационный автогенератор, основанный на ковалентной модификации фермента// Молекулярная биология. — т.20, 1986.— С. 1550-1561

2. Е.Е. Sel'kov , I.I. Goryanin Zur théorie der

temperaturkompensation der Zelluhr// In: Abstracts III DDR—UdSSr Symposium Cronobiologi und Chronomedizin, Halle, 1986 p.6

3. И.И. Горянин Влияние отрицательных обратных связей на чувствительность клеточных часов к температуре. Математическая модель// Тезисы докладов на Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы и регуляция клеточного обмена". — Пущино, 1986. — С. 97

4. Е.Е. Sel'kov, I.I. Goryanin, N.P. Kaimachnikov,

E.L. Shevelev, I.A. Yunus Data and knoledge banks on enzymes and metabolic pathways// In: Additonal Abstracts for the 11th international CODATA conference.- 1988, P.3

5. E.E. Sel'kov, I.I. Goryanin, N.P. Kaimachnikov,

E.L. Shevelev, I.A. Yunus The format of a data bank on enzymes and metabolic and knoledge banks on enzymes and metabolic pathways// In: Additonal Abstracts for the 11th international CODATA conference.— 1988, P.3

6. E E. Sel'kov I.I. Goryanin , N.P. Kaimachnikov ,

E.L. Shevelev , I.A. Yunus Factographic data bank on enzymes and metabolic pathways// Studia Biophisica. Vol. 129, 1989,- p. 155-164

7. I.I. Goryanin, E.L. Shevelev, I.A. Yunus

Software for data bank on enzymes and metabolic pathways and metabolic pathways// Studia Biophisica. Vol. 129, 1989,- p. 165-170

8. H.B. Авсеенко, И.И. Горянин, Е.Е.Сельков

Циркадные автоколебания в обобщенной модели клеточного '

углеводного метаболизма// Биофизика т.34. — 1989 — С. 792 — 796

9. И.И. Горянин, Е.Е.Сельков, К.И. Сердюк---

Уточненная математическая модель почти идеального биохимического релаксационного осциллятора, основанного на ковалентной модификации фермента. . // Молекулярная биология. — т.26, 1992. —С. 404 — 417

10. I.I. Goryanin, K.I. Serdyuk

Automation of Modelling of Multienzyme Systems Using Databanks on Enzyme and Metabolic pathways (EMP). // In Proceedings of the IMACS Symposium on Mathematical Modelling. Austria—1994, p. 332-336

11. K.I. Serdyuk, I.I. Goryanin, E.E.Selkov