Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Надмолекулярная организация метаболической системы на примере цикла трикарбоновых кислот

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Надмолекулярная организация метаболической системы на примере цикла трикарбоновых кислот"

-РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А.Н.БАХА

На правах рукописи

ЛЮБАРЕВ" АРКАДИИ ЕФИМОВИЧ

' УЗВ 577-121.4.012.5

НАДМОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ НА ПРИМЕРЕ ЦИКЛА ТРЙКАРБОНОВЫХ КШЮТ

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1992

Работа выполнена б Научно-производственном объединении "Витамины"

Научный руководитель: , доктор химических наук, профессор КУРГАНОВ 5.И.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор НАГРАДОВА H.H.

доктор биологических наук, профессор ЗВЯГШГЬСКАЯ P.A.

Ведущая организация - Институт теоретической и

экспериментальной биофизики РАН

Защита диссертации состоится 199-? года в

на заседании специализированного совета к 002.96.01 в Институте биохшявг им. А.Н.Баха РАН по адресу: 117071, Москва, Ленинский просп., 33

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической

литературы РАН по адресу: Москва, Ленинский просп., 33

j

Автореферат разослан 992 года

Ученый секретарь ,

специализированного совета г А Л

доктор биологических наук u-iskJ? МОЛЧАНОВ М.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние года одной из основных тенденций развития биохимии является переход от изучения отдельных метаболических реакций и изолированных биомолекул к исследованию сложных внутриклеточных систем. Становится очевидным, что ферменты в клетке находятся в условия, сильно отличающихся от разбавленных растворов, в которых она обычно изучаются in vitro (Фридрих, 1986). В частности, многие экспериментальные данные свидетельствуют о том, что ферменты, функционально объединенные в едином метаболическом пути, способны образовывать упорядоченные мультиферментные ансамбли, называемые метаболонами (Srere, 1985,1987).

Характерными чертами метаболонов являются яг тесная ассоциация с субклеточными структурами, а также высокая степень лабильности, что препятствует их обнаружению и шделению. Поэтому важную роль в изучении надмолекулярной организации метаболических систем может сыграть теоретический подход, заключающийся в создании пространственных моделей метаболонов (Курганов, Сугро-бова, Мильман, 1986). Такие теоретические построения нацеливают экспериментаторов на исследования в определенных направлениях, они позволяют лучше понять природу, механизмы сборки, функционирования и регуляции мультиферментных ансамблей.

Одним из метаболических путей, для которнх получено множество данных, свидетельствующих в пользу существования метаболонов, является ЦТК1. Этот путь занимает центральное место в

1 Принятые сокращения: ААТ - аспартатаминотрансфераза, Ак - ако-нитаза, ГАМК-Т - ГАМК-трансаминаза, ДЯПА - дегадрогеназа янтарного полуальдегида, ИЦДГ - изоцитратдегидрогеназа (ЫАБ-зависимая), КГДГ - а-кетоглутаратдегидрогеназа, КГДГК -а-кетоглутаратдегидрогеназвдй комплекс, ЛАДГ - липоамиддегидро-геназа, ВДГ - малатдегидрогеназа, НДЩ - нуклеозиддифосфаткина-за, 1ЩГК - пируватдегидрогеназный комплекс, СДГ - сукцинатдеги-дрогеназа, СТК - сукцинаттиокиназа, ТС - трзнссукщшилаза, ФЕПКК - фосфоенолпируваткарбоксикиназа, Фум - фумараза, ЦС -цитратсинтаза, DTK - цикл трикарбоновых кислот

метаболизме .большинства живых организмов, интегрируя пути биосинтеза и распада аминокислот, липидов, углеводов и других биомолекул и непосредственно связывая их с процессами преобразования энергии в митохондриях. Изучение регуляции ЦГК и энергетического метаболизма в целом является одной из важнейших задач биохимии, поскольку дает ключ к решению большого числа проблем медицины, сельского хозяйства и биотехнологии.

Целью работы явилось теоретическое исследование надмолекулярной организации ЩК.

В задачи работ входило:

1. Дать общую характеристику понятия "метаболой" и определить общие принциш сборки метаболонов.

. 2. Построить пространственную модель комплекса ферментов ЦГК.

3. На основе анализа этой модели и литературных данных дать анализ принципов функционирования и регуляции метаболона.

Научная новизна. Впервые дана развернутая характеристика понятия метаболой как специфического уровня материальной организации биологических систем. Сформулированы общие принципы сборки метаболонов. Разработан метод компьютерного моделирования мультиферментниг ансамблей.

Впервые построена пространственная модель комплекса ферментов ЦГК. Показана возможность вхоадения в метаболой ЦГК ферментов, катализирущп сопряженные с ЦГК реакции: ААТ, ШШ, ФЕПКК, ГАМК-Т И ДЯПА.

Практическое' значение работы. Настоящее исследование может служить теоретической базой для разработки новых подходов поиска лекарственных средств метаболической терапии. Предложенный в данной работе метод может Сыть использована при построении моделей метаболонов для различных метаболических систем.

Результаты предложенной работы используются при преподавании биохимии в Одесском государственном университете и Нижегородском медицински институте, включены в учебник А.Я.Розанова "Механизмы регуляцви оиокатализа" для биологических специальностей вузов.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на IV конференции молодых ученых и специалистов ВНИВИ (Москва, 1986), XI рабочем совещании по биомолекулярной электронике

'(Пущино, 19В6), Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы и регуляция энергетического обмена" (Пущино, 1966), 7 Всесоюзном рабочем совещании "Жидкокристаллическое состояние в биологических системах и их моделях" (Пущино, 1986), v Всесоюзной научной конференции "Проблемы и перспективы ферментативного катализа" (Москва, 1987), Международном симпозиуме "Molecular organization of biological structures" (Москва, 1939).

Объем работы. Диссертация изложена на 133 страницах машинописного текста и состоит из введения, пяти глав (первая глава -литературный обзор), заключения, выводов и приложений. Список литературы содержит 250 источников .(66 - отечественные и 134 -зарубежные). Работа иллюстрирована 2 таблицами и 13 рисунками.

МЕТАБОЛОЙ КАК УРОВЕНЬ МАТЕРИАЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ

В первой главе обсуждаются литературные данные о пространственно-временной организации клеточного метаболизма. Отмечается высокая степень внутриклеточной организации. Приводятся многочисленные данные об адсорбции ферментов клеточными структурами и о фермент-ферментных взаимодействиях. При обсуждении временной организации клеточного метаболизма особое внимание уделено регуляторному аспекту. Отмечено, что внутриклеточная регуляция организована в пространстве и времени.

Отдельный раздел посвящен анализу литературных данных о пространственно-временной организации ЦТК. Эти данные свидетельствуют о существовании в митохондриях сердца и других органов млекопитающих надмолекулярного комплекса, объединяющего ферменты цикла.

Обсувдаются теоретические представления о пространственно-временной организации клеточного метаболизма. Изложена развивающаяся с конца 70~х гг. концепция структурно организованных мультиферментных систем. В рамках этой концепции Srere в 1985 г. ввел термин "метаболой", которым он обозначил "надмолекулярный комплекс ферментов, катализирующих последовательные стадии метаболического путл, и структурных элементов клетки". Этот термин используется при дальнейшем изложении.

Во второй главе дается характеристика понятия "метаболой". Определено место метаболона в структурной и функциональной ие-

рархии. биологических систем: метаболой относится к уровню надмолекулярных структур, который расположен мевду уровнями биомакромолекул и клеточных органоидов. Функция метаболона состоит в реализации определенного метаболического процесса, состоящего из совокупности метаболических реакций. Такие.совокупности принято называть метаболическими системами. Таким образом, метаболой - это структура, объединяющая ферменты метаболической системы.

Важным свойством метаболона, отраженном и в его определении, является то. что метаболоны ассоциированы с клеточными структурами. Якорше белки, ответственные за ассоциацию метаболона со структура!,сами могут входить в состав метаболона, как например, СДГ в состав метаболона ЦГК.

принципы сборки мтвшшов

•

Общие принципе. Метаболоны формируются на биологических подложках, в роди которых могут выступать биологические мембраны, цитоскелет, структурные белки мышц и т.п. Подложка содержит белок, который вшюлняет якорные функции, при этом якорный белок и "заякореннир* комплекс образуют единую систему.

Одаой из важйвшх характеристик метаболона является его сишетрия, которая должна соответствовать снметрии той структуры, на которой метаболой формируется. На основании анализа данных по струкпре интегральных мембранных белков мы пришли к выводу, что преобмдапцша среди метаболонов должны быть структуры с осью симметрии третьего порядка.

Фермент, который связывается с якорным белком подложки, образует -ядро" метаболона и играет ключевую роль в формировании комплекса. Для этого фермента мы' сформулировали следующие требования.

а) Молекула (ермента должна иметь наибольшие размеры среди ферментов метаболической системы, то есть иметь наибольшую поверхность. ; . •

б) Фермент должен быть способен адсорбироваться на мембране, сохраняя при этом каталитическую активность.

в) Фермент должен иметь ось симметрии третьего порядка или собираться в триеры в адсорбированном состоянии.

г) Фермент должен проявлять способность к самоассоциации. Эта способность означает наличие у фермента "липких концов", которые в условиях in vivo могут насыщаться путем взаимодействия с якорным белком подложки и с другими ферментами метаболической системы.

д) Фермент должен быть чувствителен к действию "вторых' посредников", так как он образует вместе с якорным белком подложки центр управления метаболона.

Для определения взаимного расположения ферментов в метабо-лоне нами предложены следующие принципы, соблюдение которых обеспечивает конвейерную передачу метаболитов от одного фермента к другому.

1. Ферменты, которые катализируют реакции, следующие одна за другой в метаболическом аута, должны заншать соседние позиции в комплексе.

2. Ферменты, использующие и регенерирущие Nad, at?, СоА и другие коферменты, должны находиться в контакте друг с другом. В ряде случаев целесообразно, чтобы все феркенты, использующие один кофармент, были расположены рядом.

3. Ферменты, активность которых регулируется интермедиатами данной метаболической системы, должны располагаться в метаболона таким образом, чтобы обеспечить возможность реализации этого регуляторного механизма.

При построении модели должны учитываться также экспериментальные данные о взаимодействии ферментов, не связанных общими метаболитами. Не менее информативны, очевидао, и данные об отсутствии контактов между определенными ферментами.

Особенности сборки метаболона цикла трккарбоновых кислот. ЦГК связан со множеством метаболических процессов. Наиболее тесно с ЦГК ассоциированы реакции, катализируемые ААТ, НДФК, ФЗПКК и фермента.® ГАМК-зунта. В отличие о? ЦГК эти метаболические- процессы характеризуются органной, тканевой и видовой специфичностью. Анализ литературных данных показывает, что для митохондрий сердца характерно сопряжение меаду гуанилат-завкси-иой СТК к НДФК. Для митохондрий печени целесообразно предполагать наличие сопряжения мезду СТК и ОТР-занюимоЯ ФЕПКК. В митохондриях мозга преобладает, по-Ездимому, аденилат-зависимая СТК,' в то же врямя ферменты ЦГК сопряжена в них с ГАМК-Т и

ЛЯПА. '

Таким образом, метаболоны НТК в разных органах должны иметь различия. В соответствии с этим мы предприняли попытку предложить три варианта гипотетической структуры метаболона ЦПС, которые отличаются друг от друга лишь включением различных дополнительных ферментов: во всех вариантах в состав комплекса входят все ферменты 1ГЕК и ААТ, в первом варианте комплекс включает дополнительно ЩЩ, во втором - ФЕПКК и в третьем - ГАМК-Т и ДЯПА.

Ядром метаболона НТК служит КГДГК, сердцевину которого составляют 24 субъеданиш ТС, образующие структуру куба. Поскольку, длина диагонали куба (20 нм, Тапака еЪ а1., 1972) соответствует среднему расстоянию между внутренними поверхностями внутренней мембраны' митохондрий сердца (15-30 нм по данным Згеге, 1985), мы пришли к вывода, что ТС располагается так, что две противоположные вершины куса касаются противоположных поверхностей мембраны; при этом ось симметрии третьего порядка перпендикулярна этим поверхностям. Шесть молекул ЛАДГ расположены на гранях куба и также касаются одной из поверхностей мембраны, а шесть молекул КГЗ' прикреплены к тем ребрам куба, которые не касаются мембраны. Таким образом, КГДГК имеет симметрию, относящуюся к точечгой группе Ьу Вокруг этой структуры и должны располагаться другие ферменты, входящие в метаболой ЩЖ.

При построен!* структурной модели метаболона ЩК мы приняли, что симметрия метаболона относится, как и симметрия адсорбированного КГДГК, к точечной группе Г)^. Следовательно, комплекс должен включать по шесть, молекул каждого фермента. На основании экспериментальных данных о фермент-мембранных взаимодействиях мы постулировали, что большинство ферментов комплекса располагается в примембранном. слое. Лишь для ААТ и ГАМК-Т не был предусмотрен контакт с мембраной.

Для обеспечения конвейерной передачи интермедиатов и. кофер-ментов были предусмотрены контакты между ферментами, занимающими соседние позиции в метаболических цепочках. Помшло этого, учитывались экспгриментальные данные о взаимодействии ЦС с Фум (Вееоктзаз & Каяагек, 1981) и об отсутствии взаимодействия между ААТ И Фум (Веескшапз & Капагек, 1981), а также между ЦС И КГДГК (Рограсгу еЪ а1., 1933).

. КОМПЬЮТЕРНАЯ ПРОГРАММА ПОСТРОЕНИЯ МОДЕЛИ МЕТАБОЛОНА ЦИКЛА ТРИКАРБОНОВЫХ КИСЛЯ

Как отмечалось в предыдущей главе, мы сочли возможным предложить три варианта метаболона ЦТК. Поскольку эти варианты отличаются лишь одним-двумя ферментами, а расположение остальных не должно меняться, целесообразно было создать единую программу построения всех вариантов.

Для каждого варианта программа должна била решить следующие задачи:

1. Определить расположение всех ферментов в комплексе.

2. Определить все фермент-ферментные контакты в комплексе.

3. Иметь возможность вывода на экран дисплея и принтер различных проекций комплекса.

В качестве исходных данных взяты: Состав комплекса:

а) основная часть, общая для всех вариантов - 24 молекулы ТС и по 6 молекул ЦС, Ак, 1ЩГ, КГДГ, ЛАДГ, СТК,-фум, МДГ, ААТ;

б) вариант 1 (сердце) - дополнительно 6 модгкул НДФК;

в) вариант 2 (печень) - дополнительно 6 молекул ФЕПКК;

г) вариант 3 (мозг) - дополнительно по б молекул ГАМК-Т и ДЯПА.

Симметрия комплекса - точечная группа ь^ (одна ось симметрии третьего порядка 2 и три оси симметрии второго порядка).

Высота комплекса вдоль оси г ограничена двумя поверхностями мембраны,-перпендикулярными этой оси.

Фермент-ферментные и фермент-мембранные контакты приняты на основании принципов сборки метаболона и литературных данных.

Поскольку геометрия большей части ферментов, входящих в комплекс, остается неизвестной, для удобства и простоты было принято, что большинство ферментов представляют сферические частицы. Радиус сфер был определен исходя из молекулярных масс ферментов на основании данных о корреляции между молекулярной массой и радиусом белковых глобул (?г1£оп et а1., 1983). Пять ферментов (КГДГ. ААТ, ЩЩ, ГАМК-Т, а также дамеры ТС) представлены в виде овалоидов вращения (ограничении двумя полусферами и цюпшдричефсой поверхностью), объем которих равен объему сферы, вычисленной исходя из молекулярной массе фермента.

Мы приняли следующую последовательность построения комплек-

са. Вначале строится кубическая сердцевина, образуемая 24 молекулами (12 димерами) ТС. Затем размещаются два других компонента КГДГК - КГДР и ЛАДГ. Далее присоединяются другие ферменты НТК в следующем порядке: ИЦЦГ, GTK, Фум, ЗДГ, ЦС, Ак, после них присоединяется ААТ. Далее, в зависимости от варианта присоединяется либо НЯ9Е. либо ФЕПКК, либо ДЯПА и ГАМК-Т.

Программа написана нами на языке Бейсик (расширенная версия) для компьютера Правец-16 (Болгария), совместимого с компьютерами IBM PC (использованный язык совместим с языком Basic фирмы Microsoft). Программа состоит из общей части и трех блоков: блока определения расположения молекул, блока определения контактов между ферментами и блока вывода проекций комплекса.-"Листинг програшв приведен в Приложении 1.

Блок вывода проекций комплекса обеспечивает вывод на экран дисплея проекций сконструированной модели комплекса как на плоскость, перпендикулярную оси z (горизонтальная проекция), так и на любую плоскость, параллельную оси z (фронтальная или профильная проекции), а также вывод трех проекций одновременно в виде эпюра. При необходимости выведенное на экран изображение может быть скопировано на принтере с помощью клавиши Prtsc (пример такого изображения приведен в Приложении г).

Вывод проекций может быть осуществлен в двух вариантах. В одном случае проекции молекул ферментов изображаются в виде окрашенных кругов или овалов/ В другом варианте очерчиваются с помощью соответствующих линий лишь 1фая кругов и овалов, которые должны быть Ьидны на проекции.

Работа программы организована в форме диалога компьютера с пользователем. Dpi ее запуске вначале работает головная- программа блока определения расположения молекул, рассчитывая координаты молекул ферментов, общих для трех вариантов комплекса. Затем пользователю задается вопрос: какой из трех вариантов он бы хотел рассчитать? После ответа рассчитываются координаты молекул ферментов, специфичных для данного варианта.

После окончания расчета пользователю предлагается на выбор: определение контактов одного из ферментов, определение контактов всех ферментов, вывод изображения комплекса. Если пользователь выбирает вывод изображения, то далее предлагаются варианты: в окрашенном или неокрашенном виде, затем - три проекции

или одна, в последнем случае - горизонтальная кли профильная проекции.

После выполнения каждой операции пользователь имеет возможность вернуться к одному из предыдущих меню"и заказать другой вариант изображения или рассчитать другой вариант комплекса._

ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА КОМПЛЕКСА ®РШГОВ ЦИКЛА ТРИКДРВОНОВЫХ КИСЛОТ

Анализ структуры. Предложенную нами структуру комплекса ферментов ЦТК можно представить в виде гексамера из шести идентичных асимметричных субъединиц. Каждая асимметричная субъединица содержит четыре мономера ТС, два мономера хгдг, по одной молекуле всех остальных ферментов и якорный беле®.

. Три варианта .асимметричной суъединицы метабожна изображены на рис. 1 - 3." Общий вид одного' из вариантов комплекса показан

Внутренняя

Юнм

мембрана

У

Рис. 1. Асимметричная субъединица комплекса ферментов ЦТК, первый вариант (три проекции). 1 - ЦС, 2 - Ак, 3 - ИЦДГ, 4а - КГДГ, 40 -ТС. 45 - ЛАДГ, 5 - СТК, 7 - Фум, 8 - МДГ, 9 - ААТ, Ю - ЩЩ. г -ось симметрии третьего порядка, у, у' и у" - оси симметрии второго порядка.

на рис. 4. Комплекс "закат" между противоположными поверхностями внутренней макЗраны, при этом мембраны касаются все ферменты, за исключение* КГДГ, ААТ и ГАМК-Т. В качестве якорных белков, ответственнвх за; сборку комплекса ферментов ЩК на мембране, выступают интегральные белки внутренней мембраны митохондрий, в том числе СДГ. Высота комплекса вдоль оси симметрии третьего порядка составляет 20 нм, диаметр комплекса 50 нм. Молекулярная масса (без учета СДГ) составляет 8-1 о6 Да.

Расчет показивает, что концентрация белка в объеме, занимаемом комплексом, равна 45*. По данным Эгеге (1935) средняя концентрация белка в матриксе митохоедрий.составляет примерно 40%. Таким образом, метаболой должен иметь белковое окружение с такой же плотность», как и внутри комплекса. И в этом, видимо, причина того, что комплекс не ; виден на электронно-микроскопических снимках.

Внутренняя | мембрана

10 нм

I-(

Рис. г. Асимметричная субъединица комплекса ферментов ЦГК, второй вариант (три проекции). 11 -ФЕПКК. Остальные обозначения см. рис. 1.

Экспериментальные данные в пользу предложенной модели. Одним из главных свидетельств в пользу существования метаболонов являются экспериментальные данные о белок-белковых взаимодействиях между ферментами одной метаболической системы. Однако, такая информация получена преимущественно для пар ферментов, занимающих соседние позиции в' метаболическом пути и связанных общими метаболитами. Возможности взаимодействия между ферментами, которые не связаны общими метаболитами, почти не изучались. Единственное исключение - работа Веесктапз & Капагек (1981), в которой было показано взаимодействие ЦС с Фум и отсутствие такого взаимодействия между Фум и ААТ..

Упоминаемые экспериментальные данные были использованы при построении модели метаболона ЦГК. с другой стороны, тот факт, что сконструированная модель согласуется с этими данными, говорит в пользу реальности модели. Следует также отметить, что не-

г

Ьиутреиияя) мембрана /А ' ...........

Ч

10 им

I-1

Рис. э. Асимметричная субъедаши-ца комплекса ферментов ЦТК, третий вариант (три проекции). 12 -ГАМК-Т, 14 - ЛЯПА. Остальные обозначения см. рис. 1.

10 нм

Рис. 4. Гипотетическая структура комплекса ферментов НТК, третий вариант (три проекции). Обозначения см. рис. 1, з.

которые из упоминаемых сведений о фермент-ферментных взаимодействиях (Туавка еЪ а!., 1986; Рограсгу а!., 1987; Кайгтаз et а1., 1991) были опубликованы ухе после того, как был создан первый вариант нашей модели. В то ке время, возможность контактов для большинства пар ферментов рассматриваемой метаболической системы не проверялась. Такие исследования были бы весьма полезны для проверки предложенной модели.

В таблице 1 суммирована теоретическая и экспериментальная информация о парных контактах обсуждаемых ферментов. Знаком "+" помечены пары, для которых модель предусматривает контакт, зна- . ком - пары, для которых контакт не предусматривается. Пары со знаком "+" можно разделить на три категории. Первая - пары.

для которых наличие бйюк-белкового взаимодействия подтверждено экспериментальнсг. Вторая - пары, для которых наличие контакта экспериментально не подтверждаю, но такой контакт предсказывается на основании ■ представлений о конвейерном (или "эстафетном") механизме передачи метаболитов. Третья категория - пары ферментов, контакт между которыми предсказывается на основании построенной модели метаболона ЦТК. Б этом случае белок-белковое взаимодействие не обусловлено необходимостью прямой передачи метаболита от одаого активного центра к другому, а выполняет структурную роль, стабилизируя комплекс. Проверка воз--можности таких контактов была бы наиболее интересна, и положительный результат мог бы быть наилучшим свидетельством в пользу верности предложенной модели.

Таблица 1

Белок-белковые контакты в метаболоке ЦТК

№ 1 2 3 4а 46 4В 5 7 8 9 10 11 12 14

1 цс - (+) - (-) (-) (-) - (+) ( + ) (+) - - - -

2 Ак - - - - - - - + - - - -

3 ИЦДГ - - - + + - - + + - _

4а кгдг (-) - - (+) (-) - + - - - - +

46 тс (-) - - (+) (+) (+) (+)

4В ЛАДГ (-) - + (-) (+) - - - + - - - - -

5 стк - - + - (+) - - + - - (+) С+) - -

7 Фум (+) - - + - - + - (-) + + - +

8 мдг (+) - - - - + - (+) (+) - - - -

9 ААТ (+) + + - - - (-) (+) - - - - -

10 НДФЙ - - + - - (+) +

11 ФЕПКК {+} + - - - - - -

12 ГАМК-Т - - - - - - - - - - - -

14 ДЯПА - - - + - - - + - - - _ (О -

Знак "+" означает наличие контакта между ферментами; "(+)" -наличие контакта доказано экспериментально; "{+}" - контакт предсказывается на основании представлений о конвейерном механизме, передачи метаболитов; - отсутствие контакта; ••(-)" -возможность контактирования ферментов изучалась, и получен отрицательный результат.

Другое перспективное направление иссследований связано с .изучением, препаратов, полученных путем щадящей деструкции митохондрий ультразвуком. Впервые такиепрепарата поручили Robinson & srere (1985). Им удалось показать, что в результату воздействия митоховдрии становятся проницаемы для крупных белков, но при этом в них сохраняется активность ферментов НТК. Это означает, что ферменты 'НТК в таких препаратах адсорбированы на поверхности мембраны, и можно предположить, что метаболой НТК в этом случае сохраняет свою нативную структуру.

Группой исследователей из Одесского государственного университета и Одесского медицинского института (В.А.Розанов, Фан Ван Тьи, Г.Р.Герасимяк, А.Я.Розанов) совместно с нами была проверена возможность вхождения ААТ и ГАМК-Т в метаболой НТК. Эксперименты показали, что в митохондриях," обработанных ультразвуком, активность названных аминотрансфераз частично сохраняется, но в меньшей степени, чем активность де'гидрогеназ (СДГ, КГДГК и ЦЦГК). Это означает, что ААТ и ГАМК-Т связаны с митохондриаль-ной мембраной. То, что эта связь более слабая, чем у дегидроге-наз, может означать, что трансаминазы связаны с мембраной не непосредственно, а через другие ферменты, входящие в метаболой. В пользу того, что ГАМК-Т входит именно в метаболой ЦТК свидетельствуют данные о соосаждении ГАМК-Т и КГДГК при очистке не-синалтических митохондрий мозга крыс (Rozanov, 1989). Фан Ван Тьи (1990), выделяя из гомогената головного мозга крыс КГДГК и ЦЦГК, получил препарат, содержащий, помимо этих комплексов, также ААТ, ГАМК-Т и, по-видимому, другие ферменты. Полученные препараты эффективно катаболизировали меченую ГАМК-до С02, что свидетельствует о "сопряжении ГАМК-Т и ЛЯПА с ферментами ЦГК. Таким образом, полученные данные служат косвенным подтверждением предложенной модели.

Возможные механизмы функционирования метаболона. Построение гипотетической структуры метаболона позволяет сделать предположения относительно возможного механизма его функционирования. Сборка метаболона приводит к образованию микрокомпартмента, в котором метаболический процесс может протекать изолированно", без выхода интермедиатов в объем. Взаимодействия ферментов, входящих в состав метаболона, приводят к тому, что комплекс выступает как единая, кооперативно функционирупцая система. Мы

'предполагаем, что все реакции осуществляются синхронно на активных центрах соответствующих ферментов, а затем интермедиаты' согласованно перемещаются в микрокомгтартменте от одного активного центра к другому. При этом оказывается возможной "рекуперация энергии" на уровне целого метаболона, то есть использование энергии экзергонических стадий для осуществления эндергонических реакций, и активного транспорта метаболитов в микрокомпартменте. ' ,

Важно отметить, что одновременное и согласованное функционирование компонентов метаболона' необходимо для сохранения симметрии структуры метаболона в процессе работы. Согласно подходу, использованному в работе Гольдштейна и Корнилова (1988), "симметрия управляет динамикой комплекса". Используя этот принцип, обсудим режим работы метаболона ЦГК, обладающего осью симметрии третьего порядка. .

Для того, чтобы никл замкнулся, необходимо, чтобы оксало-ацетзт вернулся на первый фермент цикла - ЦС. Следовательно, структура метаболона должна быть замкнутой. Однако, из рисунков 1 - 3 видно, что асимметричная субъединица комплекса не замкнута, поскольку МДГ не контактирует с ЦС в этой субъединице. Это означает, что после однократного прохождения метаболического цикла оксалоацетат попадает на молекулу ЦС соседней субъединиц». Для того, чтобы субстрат вернулся на молекулу ЦС исходной субьедшшцы, сн должен пройти полный круг по каналу одного "этажа" микронсшартиента. Можно полагать, что перемещение субстратов происходит синхронно во всех трех субъединицах одного "этажа". Такой режим работы метаболона мы предложили назвать режимом работы по типу "карусели".

Одним из главных физиологических преимуществ образования метаболона является то, что клетка получает возможность управлять структурно организованным и кооперативно функционирующим комплексом как единым целым. Согласно представлениям,-развиваемым Кургановым (1986), метаболой как управляемая система должен иметь пространственно разделенные рабочие центры и центры управления. В роли рабочего центра метаболона выступает, очевидно, микрокомпартмент, в котором происходит химическая трансформация поступающих в него субстратов. Роль центра управления отводится якорному белку подложки, участвующему в сборке комплек-

са. Контроль функционирования комплекса как целого осуществляется при помощи внешних факторов, по-видимому, вторых посредников, с помощью которых обеспечивается оптимальное функционирование метаболона в рамках системы более высокого уровня сложности, то есть в клетке.

Метаболой, очевидно, является мобильной структурой и находится в равновесии со свободными ферментами. Одним из наиболее важных факторов, определявдих формирование метаболона, являются уровни концентраций определенных метаболитов. В еще большей степени равновесие между метаболоном и свободными ферментами должно зависеть от функционального состояния митохондрий. Известно, что объем матрикса претерпевает значительные изменения при переходе митохондрий от конденсированной конформации к ортодоксальной (Згеге, 1985). Этот процесс, контролируемый'энергетическим состоянием митохондрий, должен оказывать влияние на равновесие между комплексом ферментов НТК и свободными ферментами. Высокая концентрация бежа в матриксе в конденсированной конформации должка способствовать образованию метаболона. При набухании матрикса возможен частичный обратимый распад комплекса на свободные ферменты.

ВЫВОДЫ •

1. Развито представление о метаболоне как о специфическом уровне материальной организации-биологических систем, характеризующемся определенными размерами, структурными особенностями, функцией и законами регуляции. Сформулированы принципы сборки метаболонов, включающие ассоциацию с -биологическими структурами, симметрию, обеспечение конвейерной передачи метаболитов.

2. Создана компьютерная программа построения модели метаболона цикла трикарбоновых кислот, позволяющая установить расположение ферментов в модели, определить фермент-ферментные кон--такты и вывести на экран различные изображения модели.

3. Впервые построена пространственная модель метаболона цикла трикарбоновых кислот. На основании предложенной модели сделано предсказание о существовании парных контактов между определенными ферментами цикла.

СПИСОК .РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИЙ

1. Любарев А.Е., Курганов Б.И. Надмолекулярная организация ферментов цикла трикарбоновых кислот // Тез. докл. Всес. симп. "Молекулярные механизмы и регуляция энергетического обмена". Пущино, 1986. С. 13.

2. Любарев А.Е., Курганов Б.и. Надмолекулярная организация ферментов цикла трикарбоновых кислот // Материалы Бсес. симп. "Молекулярные механизмы и регуляция энергетического обмена". Пущино, 1987. С. 55-66.

3. Курганов Б.И., Любарев А.Е. Сборка мультиферментных комплексов как путь создания управляемых систем // Биомолекулярная электроника и проблемы самосборки надмолекулярных структур. Пущино, 1991. С. 83-89.

4. Любарев А.Е., Курганов Б.И. Надмолекулярная организация ферментов цикла трикарбоновых кислот // Молекуляр. биология. 1987. Т. 21. № 5. С. 1286-1296.

5. Любарев А.Е., Курганов Б.И. Моделирование надмолекулярных Оиоструктур с помощью компьютера // Тез. докл. Всес. науч-но-техн. совещ. "Автоматизация и компьютеризация научных исследований, технологических процессов и проектных работ". М., 1988. С. 29.

6. Kurganov B.I., Lyubarev А.Е. Enzyme and multienzyme complexes as controllable systems // Soviet Scientific Reviews. Sec. D. Physicocheraical Biology Reviews / id. Slculachev 7.P. V. 8. Glasgow: Harwood Acad. Publ., 1988. P. 111-147.

7. Kurganov B.I., Lyubarev a.E. Multienzyme complexes (metabolons) as controllable systems // Abstr. 14.th, Intern. Congr. Biochemistry. Prague, 1988. 7. 4. P. 348. Kurganov B.I., Lyubarev A.E. Multienzyme complexes

(metabolons) as controllable systems // Highlights oi Modern Biochemistry / Ed. Eotyk A. V. 1. Utrecht: YSP, 1989. P. 183-191.

9. byubarev A.E., Kurganov B.I. Supramolecular organization oi tricarboxylic acid cycle enzymes // BioSystems. 1989- V. 22. № 2. P. 91-Ю2.

10. Kurganov B.I.,' Lyubarev A.E. Assembly and control of

functioning oí metabolons // Abstr. Intern- Symp. "Molecular organization oí biological structures". Moscow,

1989. V. 1. P. 137.

11. Курганов Б.И., Любарев А.Е. Принципы организации и функционирования микрокогоартмента метаболона // Биохимия. 1989. Т. 54. Jé 5- С.'716-718.

12. Любарев А.'Е., Курганов Б.И. Принципы пространственно-временной организации клеточного метаболизма // Усп. совр. биол. 1989. Т. 108. Вып. 1(4). С. 19-3513. Розанов В.А., Фан Ван Тьи,- Герасимяк Г.Р., Любарев А.Е.,

Курганов Б.И., Розанов А.Я. Надмолекулярная организация аминотрансфераз и ■дегидрогеназ а-кетокислот' митохондрий головного мозга крыс // У1ф. биохим. курн. 1991. Т. 63. &

2. С. 66-71.

Отпечатано на ротапринте в Производственном комбинате Литературного фонда

Подписано к печати

f6 ноября 1992 г.

Формат бумаги 30x42/4

Объем 1,0 п.л.

Зак. ¿у/ Тираж юо экз.