Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурная организация и полиморфизм повторяющихся единиц рибосомной ДНК человека: выявление внутригеномных различий и участков повышенной нестабильности в межгенном спейсере

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурная организация и полиморфизм повторяющихся единиц рибосомной ДНК человека: выявление внутригеномных различий и участков повышенной нестабильности в межгенном спейсере"

/V А

'Х' На права-: рукописи

> УДК 579. 88:577.113.5.012.6

КИРИЛЕНКО Павел Миронович

СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ПОЛИМОРФИЗМ ПОВТОРЯЮЩИХСЯ ЕДИНИЦ РИБОСОМНОЙ ДНК ЧЕЛОВЕКА: ВЫЯВЛЕНИЕ ВНУТРИГЕНОМНЫХ РАЗЛИЧИЙ И УЧАСТКОВ ПОВЫШЕННОЙ НЕСТАБИЛЬНОСТИ В МЕЖГЕННОМ СПЕЙСЕРЕ.

специальность 03.00.03 - "молекулярная биология"

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -1997

-Работа выполнена в лаборатории организации генома Института биологии гена РАН, г.Москва.

Научные руководители:

'член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, проф. А.П.Рысков кандидат биологических наук Н.С.Куприянова

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук, проф. Л.И.Корочкин доктор биологических наук, проф. В.В.Носиков

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН

Защита состоится " ¿^ " д^/^^У 1997г. в // час. ■ на заседании Диссертационного совета Д.200.30.01 при Институте биологии гена РАН по адресу: Москва, ул.Вавилова, 34/5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН

Автореферат разослан " 2-3 " &/uZTo. 1997г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

канд. фарм. наук (^^^^^-^¿з^^Грабовская Л. С.

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуадьность задачи.Бурное развитие методов молекулярного клонирования и секвенироЕакия ДНК сделало возможным исследование протяженных участков генома и генов, в том числе тех. которые обеспечивают основные клеточные функции. Среди них наиболее изученными являются гены рибосомных РНК. Оки относятся к повторяющимся генам, присутствуют у человека в количестве около 400 копий и формируют 10 ядрьшковых организаторов (ЯОР), расположенных на 5 парах акроцентрическпх хромосом.

Тот факт, что большие количества рибосомксй РНК необходимы -практически во всех клетках организма, делает актуальным изучение механизмов транскрипции рибосомных генов и выявление особенностей организации тех участков рДНК, которые отвечают за регуляцию этого процесса. Известно, что эффективность экспрессии генов рРНК у эукариот определяется, помимо промотора, взаимодействием ряда цис- и транс-факторов в предпромоторной области. Организация этих регуляторных участков носит видоспецифлчный характер в отличие от универсального характера организации транскрибируемой области. Из пяти типов контрольных элементов, присутствующих в предпромоторной области нетранскрибпруемого спейсерз крысы, у человека определена локализация только двух, несмотря на то, что первичная структура генов рРНК человека к настоящему времени полностью установлена.Общепринятая концепция согласованной эволюции генов рибосомной РНК не дает ответа на вопрос о том, как в этой части генома могут закрепляться эволюционные изменения и что является ведущим фактором в этом прсцессе.Осгается нерешенным вопрос о локализации точек начала и конца репликации в кластерах рДНК; данные на эту тему носят противоречивый характер.Известно, что отдельные области рДНК, будучи включены в другие районы генома, повышают в них частоту рекомбинации. Следует отметить тот факт, что данные цитологических, молекулярных и функциональных исследований ЯОР-образующих участков генома в большинстве случаев носят разобщённый характер и друг с другом не сопоставляются. Б этой связи, необходимы дальнейшие исследования структурно-функциональной организации к полиморфизма генсЕ рРНК.

Цель и задачи исследования.Настоящая работа посвящена характеристике индивидуальных повторяющихся единиц рДНК 15-ой хро-

мссо.мы человека, клонированных в космидные вектора, в составе двух независимо полученных библиотек. Это позволило охарактеризовать внутри- и межгеномный полиморфизм отдельных мономеров. Основной упор в нашем исследовании делался на изучении полиморфизма , определяемого кластерными повторами в рДНК, а также на. поиск и характеристику других участков рДНК с повышенной нестабильностью. Б работе были поставлены следующие задачи:

1) отбор космид, содержащих рДНК, из космидных библиотек 15-й хромосомы человека;

2) анализ отобранных космид с помощью рестрикции и гибридизации по Саузеряу, используя набор олпгонукяэотидных зондов, специфичных к консервативным и вариабельны),! участкам рДНК;

3) секвенирование концов космидных вставок и их локализация на карте рДНК;

4) определение нуклеотидных последовательностей некоторых дефектны;-: рДНК-кланов.

Научная новизна и практическое значение работы. Разработан рестрикционнс-гибридизационный подход, позволяющий выявлять структурные различия мелщу клонированными повторами единиц рДНК. Обнаружен внугригеномньш полиморфизм рДНК, проявляющийся в разном содержании и распределении гипервариабельных мини- и микросателлитов и в различиях по сайтам рестрикции у мономеров рДНК 13-ой хромосомы человека. Обнаружены районы повышенной нестабильности рДНК. Показана гиперчувсгвитедьность 5аиЗА-сайтов в области, предшествующей началу репликации рДНК. Обнаружены случаи делеций в клонах рДНК по места),I скопления микросателлитных кластеров. Определен полиморфизм предпромоторной области генов рРНК человека.

Полученные данные могут быть использованы для анализа геномного полиморфизма человека з медико-генетических, популяцион-ных и экологических исследованиях.

Апробация результатов. Результаты настоящей работы были представлены на 3-ей международной конференции по ДНК-фингерприн-тингу (Индия, 1994), 5-ой конференции "Геном человека" (Россия ,1996), международной конференции по биотехнологии (Турция, 1996), международной конференции "Геном человека" (ФРГ, 1956.) и меалабораторном семинаре в Институте биологии гена (1997).

Публикации. По материалы диссертации опубликовано 9 научных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация наложена на ■JO6 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводое и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 11 рисунками.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1.Рестрикционно-гибридизационное картирование

рДНК-содержащих космид.

Для анализа первоначально была отобрана группа из 12 кос-мидных клонов, гибридизущихся одновременно с (GACA)4, (CAC)s, (ТСС)5 , а также с некоторыми другими мс и мкс и зондами к рДНК. На рис..1а приведена схема организации и ЕсоР.1 рестриктная карта нормального рибосомного повтора генома человека, в котором присутствуют четыре фрагмента, обозначенные А,В, С и D /'Sylvester et а1.,198б/. Из рисунка видно, что использованные нами синтетические олигонуклеотидные зонды г1 и гШ являются идентификаторами фрагмента А, гП- фрагмента В, а rIV-фрагмента D. Проведя последовательную гибридизацию EcoRl и Hindi II рестриктных переваров ДНК 12 космид с каждым из этих зондов, мы смогли картировать кос-мидные вставки, несущие гены рРНК и выявить присущие им особенности. Полученные данные приводятся на рис. 2 и 3.

Рестриктные карты космидных ДНК выявляют как идентичные участки, так и элементы полиморфизма индивидуальных генов рРНК. Три из рассмотренных нами клонов, 2А10, 9D12 и 40С12 содержат все фрагменты, типичные для перевара рДНК человека: дсрожки 7 и 8 на рис.2 и дорожка 11 на рис.З. Идентификация фрагментов по молекулярной массе подтверждена гибридизацией со специфическими рпбо-сомными зондами, рис.2 (C,D,E) и рис!3 (D,E,F). Остальные клонированные рДНК не обнаруживают одного или нескольких характерны;-: фрагментов.

Все исследованные клоны за исключением 26Б11 (рис.З, 13) содержат полноразмеркып фрагмент А или его части. Например, б двух кленах 44Н6 и 44Н2 фрагмент А редуцирован, хотя он идентифицируется гибридизацией с зондом г1 (рис.З, 6 и S, D). В клоке ЗЗСГ1 (рис.З, 15),по-видимому, имеется полиморфный EcoRI сайт во фрагменте А, т.к. в гидролизате вместо фрагмента А обнаруживается

лишь его часть, дакпрл гибридизацию с г III зондом (рис.3, 15, F).C другими зондами эта космида не гибридизуется. Фрагменты С и D не поддаются такой строгой идентификации,т.к. для фрагмента С специфический зонд отсутствовал, а в случае фрагмента D, общая длина которого около 19 т.п.н., зонд гIV выявляет лишь 3'-конец этого фрагмента. При отсутствии полноразмерных фрагментов С или D EcoRI перевары космидных ДНК часто содержали фрагменты, нестандартных размеров , которые трудно было однозначно идентифицировать. Их принадлежность косвенно подтверждается способностью активно гибридизоваться с мс и мкс, что характерно для полноразмерных вариантов этих фрагментов. Исходя из вышеупомянутых критериев, можно сделать вывод, что все клоны содержат фрагмент D или его более короткие участки.

Ранее в литературе /Sylvester et al.,1985/ указывалось на существование в рМГС человека трех HindiII сайтов (рис.1). По данным проведенного рестрикционно-гибрвдизаыионного анализа все тестированные клоны содержат еще один Hindi II сайт в 18S рДНК. Анализ Hindi II фрагментов указал на возможное существование в клоне 5С1 дополнительного Hindi II сайта в области, примыкающей к точке инициации транскрипции (рис.2, 10), а также полиморфного HindiII-сайта во фрагменте А клона 10Е8.

ДНК части клонов, приведенных на рис.3, подвергали более подробному картированию. Для этого проводили гидролиз ДНК EcoRI одновременно с другими рестрикгазами, такими как Hindll I, SalGl и Dral. Целью этого опыта бьша проверка консервативности первичной структуры в спейсерных областях рДНК, прилегающих к 3*-концу 28S рДНК и к области, предшествующей точке инициации транскрипции. Гибридизация с rIV, который является идентификатором фрагмента D, дает положительный результат для образцов 47Н2, 47А11, 44Н6, 44HS и 36G11. В пробах 47Н2 и 44Н2 (иллюстрация не приводится) имеются, по-видимому, полиморфные EcoRI сайты в терминальной области, предшествующие HindiII сайту (для клона 47Н2) и расположенные за Hindi II сайтом (для клона 44Н2). В пробах 47А11, 44Н6 и 44Н2 детектируются ранее описанные Hind III и SalGl сайты в рМГС. В пробах 47А11 и 40С12 во внешнем транскрибируемом спейсере присутствует канонический SalGl сзйт.

Гибридизация с различными мкс и мс показала, что подзвля-юшее большинство соответствующих мотиеоз присутствует в области

МГС (фрагменты С и D). В константных фрагментах А и В мкс и мс, использованные нами для гибридизации, встречаются редко: во внешнем транскрибируемом спеисере и IBS рДНК (фрагмент В) они не детектируются, за исключением М13-мс и К25 в клоне 9D12. Ео внутреннем транскрибируемом спеисере и 2SS рДНК (фрагмент А) они обнаруживаются преимущественно в клонах, нуклеотидные последовательности которых наиболее отличаются от нормы, что проявляется в отсутствии типичных фрагментов и нестандартном характере гибридизации с г-зондами. Характер гибридизации различных участков рДНК с мс и мкс указывает на высокую степень полиморфизма по этому признакуj что выра^кается в наличии или отсутствии определенного типа повторов, в их распределении в пределах рибосомного гена, а также в интенсивности гибридизации, которая, по всей видимости отражает размер кластеров и степень дивергенции повторов.

Из рис.lb следует, что в то время как практически все клоны содержат фрагмент А или хотя бы часть его, фрагмент Е обнаруживается лишь в половине исследованных образцов. Можно сказать, что все вставки, имеющие в составе фрагмент В, имеют и фрагмент А, тогда как по крайней мере в половине вставок, содержащих А, фрагмент В не детектируется ни в полном, ни в укороченном виде. Можно также отметить, что ни один из образцов рДНК человека, картина рестрикции которого сильно отличается от нормальной, не содержит фрагмента В. Помимо рассматриваемых здесь 12 клонов, мы менее подробно исследовали еще 5 клонов, для которых наблюдалась аналогичная картина (данные не приводятся). Это может свидетельствовать о том, что различные районы рДНК обладзют неодинаковой генетической стабильностью. В ранее опубликованных работах имеются указания на то ,что в геноме человека область, предшествующая точке инициации транскрипции в генах pFHK, отличается повышенной вариабельностью;, в этой части гена рядом авторов был отмечен полиморфизм EcoRI и Smal сайтов рестрикции /Kuhn,1987; Sehmickel et al.,1980; Wilson et al., 1982; Sylvester et al.,1986; Arnheim et al.,1980/. Другое интересное наблюдение состоит в том. что в фрагментах А и В, соответствующих транскрибируемой части гена, мкс и мс встречаются редко. Во фрагменте В они вообще не обнаружены за исключением одного клона 9D12, в котором фрагмент В гиб-ридизуется с М13 и К25 пробами. Б случае фрагмента А мс и особенно мкс присутствуют в клонах, не гибридизующихся с г11 зондом и

- о

В 18а А 2Л*

Р

С в

...... -Иг—

Н1'* *К111 И1* • Я! V

Ъ С

1 1 1 1 2 » )

) * Я 1 1 * X « 1

!»!«!» 1 5 1 1 1 * ¥ *

1 1 —5~

1 1 4 II" 1 4 * 1

—г-ГПИ1 1 ■ 1 « * * .1

40О2 ] 1Л10

гао

1СГ

иш

I г 1_

..

Цд<и

"«С11

ЛИП! >

1- (САСА)4

2- (сАС), ТСС), М13 К25

3 4-

Т ЕООИ Г

^ ШЮ 111

0-

2

• Рис. 1. а- Организация генов рРНК человека. Транскрибируемая область очерчена утолщенной линией. Для транскрибируемых и межгенных спейсеров приведены их обозначения, принятые в иностранной литературе. Положение ЕсоИ и НпкШ1 сайтов рестрикции отмечены стрелками. Точками указаны консервативные районы рДНК, к которым синтезированы комплементарные олигонукдеотиды для идентификации фрагментов А, Б, С и 0 (г!, гП, гШ, г1У).

б- Картирование космидных вставок на основании блот-гнбридизационного анализа. Полноразмерные фрагменты А,В,С и Б обозначены прямоугольниками. Укороченные варианты фрагментов показаны треугольниками. Масштаб выдержан только для полноразмерных фрагментов.

> M I t « ) I I I« к.

th* w cg§g f

0 --е^Р

e ®

■V----I-. а

Ж

■ 1 < • t f I I > I) ^ 111«» • >•!■• I» • n I I < ■ • ,'»»•» II t '

Л n-t

"I •

I » I * l »'»»ни III!» » t 1 f l| II ( I t I I I I 1 I-

•cQ°o **

«СЭО

Г ^

filial •»••I»"; . # -

I

SJ

D

F

G

Рис.2. Сравнительный рестрикционный анализ рекомбинантных космидных клонов 13-ой хромосомы человека. ДНК отдельных клонов подвергали расщеплению EcoRl или Hindi 11, а затем электрофорезу в 0.8% агарозном геле, гибридизации и радиоавтографии. Слева вверху приведена картина рестрикции в УФ, а ниже- радиоавтографы геля с различными мечеными зондами; (БАСА)4 - A; (CAC)s - В; М13 - С: rl- D; rll- Е; rill- F; К25- G. Дорожка 6- продукты рестрикции ДНК фага лямбда рестриктазой HindiII. ДНК отдельных космид: 2А10 (1,7); 9D12 (2,6);2С10 (3,9); 1С5 (4,10); 10В8 (5,11).Продукты обработки рестриктазамл Hindi 11 (на дорожках 1-5) и EcoRl (на дорожках 7-11),

-в -

и ней *"»

- ®°а - - С - 8

С

О

О

Л

f •

'hi • » и и

- -Т-тпгп »

* - 9

- -Н-.0"

г -

41Tli « < ( . «u~ uúmuV " "<"'.

.....M

lb' _. I * - — .

Рис.3. Блот-гибридизационный анализ другого набора космид. Вверху картина в УФ, внизу- радиоавтографы одного и того же геля с мечеными зондами: (GACA) - А;(САС) - В; (ТСС) -С; rl- D; rll- Е; rlIIF; М13- G; К25- H. Дорожки 3, 10 и 13 - продукты рестрикции ДНК фага лямбда Hindi11. Продукты перевара ДНК отдельных космид рестриктазами EcoRl и Hindi II находятся на соседних дорожках: 47Н2 (1,2); 47А11 (4,5); 44Н6 (6,7); 44Н2 (8,9); 40С12 (11,12); 36G11 (14,15); ЗЗС11 (16,17).

имеющих нетипичную карту рестрикции по EcoRI (клоны 44Н2, 32С11, 10В8).

Мы провели поиск разных типов повторов в опубликованных первичных структурах различных областей рибосомного оперона человека /Gonzalez fir Sylvester,1995/. Оказалось,что в известных вариантах первичной структуры спейсерных областей рДНК мкс значительно менее представлены, чем в исследованных нами клонах. Из тестированных мкс только (ТСС)п-кластер детектируется во фрагменте D. Присутствие (САС)П и (GACA)n ни в одном из ранее секвенироЕанных спейсерных участков не отмечено.

Таким образом, полученные данные говорят о возникновении в некоторых ситуациях повышенного внутригеномкого полиморфизма рДНК, одним из отражений которого является экспансия и увеличение числа кластеров мс и мкс. Дальнейшая структурная характеристика наиболее вариабельных областей полученной коллекции полиморфных рибосомных генов представляет интерес, т.к. это позволило бы очертить эпицентры повышенной нестабильности рДНК и способствовало бы выяснению механизмов, причин и следствий их возникновения.

2.Определение делений в клонах 36G11 и 47Н2.

На следующем этапе была поставлена задача более детальной характеристики, на уровне первичной структуры, двух кленов рДНК, имеющих аномалии в своей организации. Для работы были отбраны два из охарактеризованных выше космидных клона, а именно клоны 36G11 и 47Н2.

На первом этапе проводили переклонирование субфрагментов вставок отобранных клонов в вектор, пригодный для секвенирования (pBluescript SK).

Из рекомбинантных субклонов, содержащих микросателлигные кластеры, три были отобраны нз секвенирование: из субклонов ре-комбинантной касмиды 36G11- фрагмент Мт.п.н., клонированный по EcoRl-SalGl, гибридизующийся с (CAC)s, (еАСА)4, (ТТ6С)4 и М13; из субклонов рекомбинантной космиды 47Н2- фрагмент -2 т.п.н., клонированный по Sau3A и гибридизующийся с (TTGC)4. Для локализации клонированных фрагментов нз карте рДНК человека, была определена

ь-iïS-H т

с5 I А I D

j-:-m

745 2 3 1 <

DEL

■л

Рис.4. Картирование делеции в.клоне 36RS. Вертикальными стрелками указаны EcoRI-сайты. A,B,C,D- EcoRl-фрагменты мономера рДНК. Т- точки, инициации транскрипции. Черные прямоугольники- гены 18S и 28S pPHK. DEL- делегированный участок.

первичная структура концов вставок с использованием t3 или t? праймеров.

• ' EcoRl-SalGl фрагмент, размером "4т. п.-н. из космиды 36G11, был частично секвенирован, с помощью метода получения однонаправленных делеций с использованием экзонукяеазы 111. Клоны со вставками подходящих размеров отбирали, выделяли из них плазмидную ДНК и секвенировали по Сэнгеру.. Полученные "последовательности сравнивали с первичной структурой полноразмерного рДНК-повтора человека /Gonzalez & Sylvester,1995/.

На рис.4' схематически представлены полученные результаты (сиквенсы приведены в диссергзцил). 5'-конец вставки картировался у SalGI-сайта, замыкающего SalG16oKc (15231нукл.) в притермина-торной области гена рРНК. Дальнейшая последовательность практически повторяла опубликованную, за исключением небольшого (менее 10%) числа отдельных замен нуклеотидов, вплоть до нуклеотида 18552. После этого гомология полностью пропадала, а продолжение последовательности картировалось между 30092 и 30551 нуклеотида-ми. ' Такиим обрззом, на участке.рМРС, в интервале ог 18552 до 30092 п.н. определена делеция разменом 11440 п.н.Обращает на себя внимание тот факт, что разрывы при делеции произошли в обоих случаях в гонах гипервариабельных мкс,(ТС)п, причём, с 5'-конца в клонированный участок вошло (TC)ie. За точкой разрыва в нативном варианте следует (ТС)б, а далее последовательность резко меняет свой характер и переходит в другой тип мкс, а именно: GCAC3-

т т

•BAD DEL С I » I

Ш11 мД|1, --J-в*

П П ^

Рис.5. Картирование кондов вставки клона 47S. Вертикаль-нши стрелками указаны EcoRI-сайты. A,B,C,D- EccRI-фрагменты мономера рДНК. Т- точки инициации транскрипции. Чёрные прямоугольники - гены 18S и 2SS pPHK. DEL- делегированный участок.

*

_CGCACGCGCGC(АС)в• С З'-конца делеция произошла в области, где точке разрыва предшествует полипиримидиновая последовательность с редкими вкраплениями гуанина и кончается кластером (ТС)g,в котором и локализуется разрыв. С другой стороны за этим кластером последовательность также резко меняет характер и переходит в кластер, сформированный мкс другого типа, а именно; ТСТС/(ТС)4TGTG5(TG)qTA(TG)12. Повышенная нестабильность в районе стыковки протяжённых блоков (ТС)п и (TG)n отмечалась ранее в рМГС крысы, где они находятся в предпромоторной области /Javachev et al.,1986; Kuehn & Arnheim,1983/. (TC)n был также обнаружен в точке перекреста сопряжённых сестринских хроматид у мыши, где неравный обмен- произошёл на границе (ТС)П и (TG)n кластеров. /Katzen-berg1 et al.,1989/. В секвенированном нами фрагменте обнаружены кластеры мкс повторов, выявленные предварительно блот-гибридизацией. Локализация этих повторов (без учёта делеции в 11,5т.'п.о.) соответствует той, которая была приведена в литературных данных.

Помимо этого фрагмента, мы также проиели частичное концевое секвенирование и локализацию на карте .рДНК SauSA-субфрагмента, полученного из космиды 47Н2. Субфрагмент клона 47Н2 картировался одним концам в ESS рДНК (за 37 нуклеогидоЕ до конца), а другим концом - в предпромоторной части, в Alu-элементе, находящемся за 3130 нуклеотидов до стартовой точки транскрипции (рис.5). Такая локализация говорит о том, что е клонированном БаиЗА-субфрагменте клона 47Н2 делегирован практически весь рМГС

(-26т.п.н.). Собственно стыковочный участок нами определен не был, но из размера фрагмента можно предположить, что он также локализован в районе (ТС)п"кластеров рМГС.

Таким образом, анализ первичных структур показал, что в двух космидных клонах содержатся редуцированные варианты мономеров рДНК. В одном случае получены достаточно убедительные доказа-телььства, что делеция ограничена с обеих сторон гипервариабель-ными микросателлитами. В другом случае участие мкс в делегировании протяжённого участка рМГС лишь предполагается. По видимому, эти примеры свидетельствуют о том, что икс, в частности, (ТС)п-кластеры являются гонами повышенной нестабильности рДНК. Отражают ли описанные делеции ситуацию in vivo остаётся неясным. Ответы могут быть получены лишь при анализе неклонированных рДНК.

3.Выявление участков рДНК, обладающих повышенной чувствительностью к действию рестриктазы Sau3A.

Как отмечалось выше, полноразмерная повторяющаяся единица рДНК человека составляет 43-45т.п.н., тогда как оптимальный размер космидной вставки равен 35-40т.п.н. Это означает, что 5-10%. рДНК неизбежно будет утеряно в каждой вставке в ходе клонирования. Очевидно, эти нехватки должны носить статистический характер, если не существовало избирательных факторов при клонировании рДНК, например, различной чувствительности к действию рестриктазы Sau3A (которая использовалась при приготовлении библиотеки) отдельных участков рДНК. Мы решили проверить, нет ли участков рДНК, которые бы предпочтительно элиминировались в ходе приготовления библиотеки и сравнить по этому параметру ряд клонов из двух, независимо полученных космидных библиотек хромосомы 13 человека.

1)Блот-гииридизационный анализ клонированных рДНК.

Для скриннинга новых рДНК+ гагонов использовали космидные библиотеки ICRF Lawrist 4С108 (DHL4/HS13), приготовленную Г.Лера-хом (L1) и LA13NC01, приготовленную в Лос-Аламосской лаборатории (L2). Используя поочерёдно олигонуклеотидные пробы, специфичные к консервативным областям рДНК, как это описано в разделе 1, мы могли делать заключения о полноразмерной или частичной представленности фрагментов А,В,С и D в продуктах EcoRl-гидролиза образцов' ДШ. Для гибридизации с фрагментом С, который не содержит транскрибируемой части гена, мы использовали олигонуклеотид

(TTGC)4 (rV), который, как было показано нами независимо, высокоспецифичен к рМГС человекз. Результаты последовательной блот-гибридизации продуктов EcoRl рестрикции ДНК ряда космидных клонов с зондами, комплементарными к каждому из четырех фрагментов, приведены на рис.В. Всего было изучено 17 клонов(7 и 30 клонов из библиотек L1 и L2 соответственно). Сравнение блот-гибриди-ззционных картин А,В,С и F нз рис.6 серии клонов L1 (дорожки 1-7) показывает, что имеется прямэя корреляция между размерами EcoRl-фрагментов и частотой Sau3A-разрывов, которые нарушают их нзтивные рэзмеры. Хотя точнзя локализация 5аиЗА-сайтов в энк экспериментах не определяется, можно говорить о статистически равномерном гидролизе и клонировании исходной ДНК в библиотеке L1.

Принципиально иная ситуация обнаружилась при анализе клонов L2. При сравнении EcoRl-фрагментов А,В и D (дор,8-17, карт.А,В,F) также обнаруживается пропорциональность между их размерами и числом их укороченных вариантов. В то же время, согласно данным , приведенным на карт.С (дор. 8-17), лишь один из 10 EcoRl -фрагментов С сохраняет свою нативнссть, а другие представлены укороченными вариантами. Это может свидетельствовать о неодинаковой чувствительности отдельных областей рДНК к рестриктззе SauSA. В частности, хотя фрагмент С по размеру меньше, чем фрагмент D, в серии клоков L2 он содержит больше разрывов по- сайтам SauSA.

Для уточнения локализации в рДНК БзиЗА сайтов, по которым произошло клонирование, нами были применены два дополнительных олигонуклеотидных зонда rVI и rVII, синтезированных в соответствии с ранее опубликованной первичной структурой рДНК человекз /Gonzalez & Sylvester,1995/. Обе последовательности локализуются во фрагменте С и более удалены от точки инициации транскрипции, чем rV. Как видно из данных, приведённых на рис.6, Д и Е, проба rVI дзет картину гибридизации, неотличимую от rV, а при гибридизации с пробой rVII гибридизационный сигнал исчезает в ДНК клонов 14Е10 и 11G10 (дорожки 14 и 16 на рис.6). Этот результат указывает на то, что соответствующий Sau3A сайт в этих двух проба;-: находится между участками маркерных олигонуклеотидов rVI и rVII, т.е. между 38036 и 39092 нукдеотидами, согласно нумерации Гонзалес и Сильвестра /там же/.

12 3 4 5 6 7 8 10 12 14 17

1 2 3 4 5 6 7 8 10 12 14 17

л

'-Л/

Рис.6. Последовательная гибридизация агарозного геля, несущего Есой1-рестрикты 17 космидных клонов с меченными зондами: (А) г1, (В) Ш, (С) гУ, (Ю) гУ1, (Е) гУП, (Г) г1У. 1-7 - клоны из библиотеки Ь1, 8-17 - клоны из библиотеки 12.

I

2).Секвенирование и картирование концое вставок рДНК

Для точной локализации БаиЗА сайтов, подвергшихся расщеплению в каждом из клонов, мы определяли первичную структуру 5'- и З'-концов (по 200-300 нуклеотидов) в 10 космидных вставках, для которых обнаружены изменения С-фрагмента. Результаты этого эксперимента схематически показаны на рис.7 (сиквенсы приведены в диссертации). Видно, что во фрагменте С межгенного спейсера обнаруживаются две области повышенной чувствительности к БаиЗА. Они картируются концевыми участками вставок на расстоянии 5,0-5,5 и 8,5-9,0 т.п.н. от точки инициации транскрипции.

Таким образом, для серии из 10 клонов Ь2 достоверно показано, что в рДНК, во фрагменте С, имеются участки повышенной чувствительности к БаиЗА, ■ и это приводит к выщеплению и утрате части фрагмента С при клонировании ДНК. Эти данные не согласуются с результатами блот-гибридизационного анализа клонов Ы, для которых не обнаружена повышенная частота укороченных С-фрагментов, хотя собственно картирования концов С-фрагментов для них не проводилось. Причины такого расхождения покз не ясны. Возможно, это связано с недостаточно большой выборкой исследованых клонов. Помимо этого, можно предположть, что различия обусловлены индивидуальными особенностями исходных образцов ДНК, приготовленных для клонирования, или свойствами космидных библиотек. Например, повышенный уровень реорганизации геномной ДНК космидксй библиотеки Ы может нивелировзть специфические характеристики, полученные для клонов библиотеки Ь.2. Собственно механизм предпочтительного расщепления рестриктазой определённых участков ДНК остаётся неясным. В качестве общего объяснения, предполагается, что существенными факторами могут быть локальные особенности структуры и ближайшего окружения сайтов узнавания рестриктаз. В любом случае, феномен неслучайной потери определённых участков генома следует учитывать при работе с библиотеками ДНК. Другой вывод состоит в том, что использованный нами подход не только выявил конкретные участки гиперчувствительности к рестриктазе в клонированной рДНК, но и дал примеры возможных вариантов нестабильности в рДНК.

тп

745 2 3

■Ц 5СЛ

■ ICIO ЗВ10 OAS

Н I3C8

—i mcii -1 »с*

' ----—41IGI0

Рис.7. Маркирование концов вставок космидных клонов'Серии L2 на карте рДНК. Вертикальными стрелками указаны EcoRI-сайты. A,B,C,D- EcoRI-фрагменты мономера рДНК. Т-точки инициации транскрипции. Чёрные прямоугольники- гены 18S и 28S рРНК. 1-7 - маркерные участки, гомологичные, соответственно, зондам rl-rVII. Горизонтальными линиями указана локализация вставок соответствующих клонов.

■i тип

СП I

3).Выявление гиперчувствительных участков к рестриктазе БаиЗА в геномной неклонировзнной ДНК.

В связи со сказанным выше, существенным является вопрос, могут ли подобные гиперчувствительные к рестриктазе участки выявляться в геномной неклонированной ДНК. Для анализа были взяты несколько образцов суммарной ДНК неродственных индивидуумов. Использовали подход, разработанный для анализа С-фрагмента клонированных рДНК, с определёнными модификациями. Он включал мягкий гидролиз суммарной ДНК рестриктазой ЗаиЗА с последующи},! полны),1 гидролизом ЕсоК1, электрофорез в геле и гибридизацию с олигонук-леотидным зондом (ИБС) 4 (гУ), который выявляет полноразмерный С-фрагмент, а также его укороченные варианты, включающие его правый ЕсоЕ1-конец (согласно схеме на рис.7). На рис.8 представлены падучэнные результаты. Видно, что наряду с лолнорагыерным (11,5т.п.н.) С-фрагментом во всех образцах ДНК (картинка а) обнаруживаются также и два укороченных фрагмента (6,0-8,5 и 5,5-6,0 т.п.н.). Поскольку в геномной ДНК человека присутствует около 400 копий генов рРНК (и, следовательно, Офрагменгов), то можно гс-Еорть о предпочтительном гидролизе и выявлении определённых упорядоченных ЕсоИ-БаиЗА вариантов фрагмента С. На картинке б представлены данные по кинетике гидролиза С-фрагмента с помощью ЗаиЗА. Они подтверждают выше приведенные результаты и позволяют видеть процесс накопления более мелких фрагментов. Интересно, что при обратном порядке гидролиза ДНК (как это показано на дор.5, картинка б), когда сначала выщепляется целый С-фрагмент, а затем он гидролизуется ЭаиЗА (в тех же условиях, как на дор.4 и 6), кинетика накопления коротких С-фрагментов меняется значительно. Это также можно связать со структурными особенностями рДНК и взаимным конформационным влиянием её отдельных областей.

Основной результат этих экспериментов состоит в выявлении гиперчувствительных ЗаиЗА-участкоз в некловированной рДНК, чтс находится в соответствии с данными предыдущего раздела. Конечно, разная чувствительность к нуклеззам в клеточной ДНК может определяться и рядом дополнительных факторов, таких как избирательное метилирование, ковалектно связанные белки и прсч.

Рис.8. Определение гиперчувствительных сайтов БаиЗА в геномной неклонированной рДНК. Проводили недорестрикцию геномной ДНК человека рёстриктазой БаиЗА с последующим полным расщеплением ЕсоР! и гибридизацией с аондом гУ.

(a) ДНК из крови 7 неродственных индивидов (по 10 мкг) обрабатывали рёстриктазой БаиЗА (по О,бед. на пробу, в объёме ЮОмкя) в течении 1минуты при 37°С. Затем пробы инкубировали 10 мин. при 70°С, дважды депротеинизировали, осаждали этанолом, промывали 70% этанолом, высушивали, растворяли, обрабатывали по 20ед. ЕсоК1 в течение 2 час., проводили электрофорез в 0,8% агарозном геле и гибридизовали с гУ.

(b) Геномную ДНК обрабатывали рёстриктазой БаиЗА в том же соотношении ДНК/фермент что и в (а) в течение 1 млн. (1); 3 мин. (2); 5 мин. (3-5). Проба 4 первоначально была обработана ЕсоР.1, а затем БзиЗА, как в экспериментах 3 и 5.

После электрофореза гели высушивали и гибридизовали с зондом гУ.

4.Характеристика некоторых консервативная и вариабельных участков рДНК по данным сравнительного анализа нуклеотидкых последовательностей.

1).Полиморфизм предпромоторного участка межгенного

спейсера рДНК.

При сравнении последовательностей ДНК, полученных в результате секвенирования концевых участков космидных вставок с опубликованным вариантом рДНК, мы, как правило, обнаруживали между ними высокий уровень гомологии, что следовало также и из данных блот-гибридизационного анализа. Исключением является фрагмент ДНК клона ЭС9,соответствующего предпромоторному участку рДНК, отстоящему от стартовой точки транскрипции на -1т.п.н. Для этого участка число различающихся нуклеотидоЕ достигало 40%. Согласно литературным данным, эта область рДНК не проявляет внутрнгеномно-го полиморфизма. Так, при сравнении нескольких клонов, содержащих этот участок, выделенных из одной и тай же библиотеки ДНК человека (т.е. соответствующих одному геному), они были еысоко консервативны /Gonzalez S- Sylvester,1995/. С другой стороны, в более . ранних работах, с использованием ВДРФ-анализа, был показан высокий уровень межгеномного полиморфизма предпромоторной области рДНК человека и других организмов /Arnheim et al.,1980;Sylvester et al.,1986/. Тагам образом, наша последовательность является новым вариантом этого участка и позволяет оценить уровень межгеномных различий у человека, а также объясняет обнаруженный ранее ПДРФ этой области.

2).Чужеродные вставки в составе рДНК.

При секвенировании концевых участков рДНК-содержащих космидных Есгавок,' для одной из них (клон 14Е10) были получены неожиданные результаты. Оказалось, что на обоих концах этой рДНК находится нерибосомная ДНК. Было проведено сравнение этих последовательностей с базой данных EMEL, используя программу поиска BLAST, и обнаружено, что фланкирующие ДНК имеют гомологии с большим числом участков генома человека и других организмов.

Одновременное присутствие нерпбосомных ДНК на обои;-: флангах рДНК-мономера делает маловероятной возможность случайного ли-гировання их при получении библиотеки.Скорее можно предполагать, что такое встраивание предшествовало процедуре клонирования. Е частности, такая организация может соответствовать внеклэстерному

;рфокному мономеру рДНК. Следует отметить, что согласно последним данным /Gonzalez &■ Sylvester,1995/,различные гомологии, интерпретируемые как чужеродные вставки, детектированы и в составе кластера рДНК. 5то- псевдоген cdc27 (в районе 33673-36005н.) и фрагмент р52 (в районе ~39500н.). Интересно, что чужеродная последовательность нашего клона, согласно данным рестрикционно-гибриди-зационного анализа, локализуется в районе 3S0G0-39000H. рДНК, а течки гиперчувствптельностп к SauSA обнаружены нами в интервале 36500-370С0н. и около 33500н. Таким образом, можно предположить, что существуют определенные механизмы встраивания чужеродной ДНК именно в установленные нами районы повышенной нестабильности РДНК.

'3).Стабильность и вариабельность некоторых микроса-теллитнш: локусов рДНК.

Б разделе 2, при анализе случая делецип в рДНК клона 36RS, уже говорилось о том, что концы делегированного участка картируются в районах, обогащенных микросателлитзми (7С/БА)п и отстоящих на карте рДНК на расстоянии более 11т.п.н. Секвенирова-нне дефектного клона не только определило место стыковки при де-лэдии, но и позволило охарактеризовать прилежащие участки. В частности, оказалось, что по первичной структуре они практически полностью совпадают с опубликованными недавно /Gonzalez &■ Sylvester, 1995/', т.е. являются высококонсервативными. Консерватизм этого ранена сохраняется на протяжении ещё около 400 нуклеотодов от места стыковки. Как и районы, по которым прошла деления, она характеризуется скоплением нескольких родственных типов микросател-литое(ОАСА/СТБТ)п, (GA/CT)ni (CA/GT)n Интересно, что в организации этой последовательности прослеживается определённая закономерность. Это- чередование кластеров GA-типа, затем GACA-типа и затем CA-типа, которые разделены участками со сходными мотивами. В принципе, такая картина типична для скоплений микросателлитов, и ока отражает либо процесс собирания, либо вырождения более сложно организованного микросателлита. Сравнение этого участка с опубликованным вариантом показало высокий уровень совпадений по всей его длине (более 90*). Различия, связанные с вариацией числа повторяющихся звеньев, были обнаружены лишь для нескольких млкро-сателлитных кластеров. Они соответствуют известному типу межге-аемвого полиморфизма микро- и минисателлитов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе был разработан ресгрикцисннс-гибриди-зационный подход, позволяющий выявлять структурные различия между индивидуальными мономерами рДНК. Подход включает стандартный гидролиз рДНК-содержащих космид рестриктазами, электрофорез в ага-розном геле и гелевую гибридизацию с наберем олигокуклеотпдных зондов, специфичных к каждому из фрагментов рестрикции и, одновременно, тестирующих консервативные участки генов рРНК и гпперва-риабельные последовательности, распределенные по рДНК. Интерпретация получаемых результатов основана на следующих положениях: 1) основная часть рДНК представлена тандемно повторяющимися мономерами размером 43-45т.п.н.; 2) средний размер космиднсй, вставки (35-40т.п.н.) лишь немного меньше мономера рДКК, таг: что космид-ные вставки представлены целиком мономерами рДНК со случайными утратами небольших концевых участков по БаиЗА-сайтам (недорест-рикция по БаиЗА использована при получении- библиотек ДНК); 3) рестрикция космидных вставок по ЕсоК1 дает стандартный набор фрагментов, определяемый регулярно повторяющейся структурой рДНК; 4) структурные различия между мономерами рДНК определяются по изменению размеров стандартных фрагментов рестрикции и по изменен::® характера чередования и содержания характерпст;пескп;-: маркеров, выявляемых олигонуклеогвдяыми гибридизаыиоккши зекдамп.

С помощью этого подхода с различной степенью полноты (с разным числом рестриктаз и гибридизационных зондов) было исследовано около 30 космид из двух независимых библиотек хромосомы 13 человека. Полученные результаты свидетельствуют о налшии внутрп-геномного полиморфизма рДКК, который проявляется в разном содержании и распределении некоторых гипервариабелькых ДНК у мономерев рДНК, а также в различиях по сайтам узнавания ряда рестриктаз (прежде всего ШпсИП). Аномалии для ряда кленов, выраженные в нарушениях чередования или сочетания маркерных зондов, ягплпсь причиной их последующего, более детального изучения. Е результате, для двух из них было предположено существование внутренних протяжённых делешй. Структурный анализ одного такого клена (35Е11), включавший переклонирование и секвестрование отдельна: частей, пезволг^л опрсделпть делегированный учнгтек ::

зовать места стыковки при делеции. Ими оказались микросателлиты (ТС)п, отстоящие на карте рДНК на расстоянии более 11т.п.н. в рМГС. Таким образом, показано, что гипервариабельные микросателлиты не только определяют известный тип полиморфизма по числу копии элементарного звена, но и могут быть местами повышенной нестабильности и геномной реорганизации в рДНК.

В эксперимента;'; по секвенированию концеЕых участков кос-мидных встзбок рДНК ставилзсь задача маркирования их на карге рДНК для определения ЗаиЗА-сайтов, предпочтительна использующихся при клонировании. Эта проблема логически возникла при накоплении данных по рестрикционно-гибридизационному картированию клонов рДНК, свидетельствующих о несоответствиях в относительном содержании отдельных участков рДНК. В результате было показано, что большинство концов вставок рДНК локализовано в двух районах меж-геннсго спейсерз, что приводит к предпочтительному выщеплению и потере района, предшествующего началу репликации в рДНК. Предположено, что дачный феномен связан с повышенной чувствительностью к ферменту определённых сайтоЕ БаиЗА в рДНК. Эксперименты по определению таких гиперчувствительных сайтов узнавания БаиЗА в клеточной некяонировакной рДНК поэеолили сделать те же выводы. Интересно. что при изучении клона рДНК, содержащего нерибосомные фланкирующие участки, оказалось, что включение чужеродной ДНК б мономер рДНК произошло в тех же районах повышенной чувствительности к БаиЗА. Расшифровка первичной структуры ряда участков рДНК, проделанная в настоящей работе, позволила провести сравнительный анализ этих ДКК с уже опубликованными вариантами и сделать заключение о их консервативности, определить" типы полиморфизма. В совокупности результаты свидетельствуют о существовании внутригеномного полиморфизма рДНК и районов повышенной нестабильности е области рМГС. Дальнейшее их изучение представляется важным для решения проблем функционирования и эволюции генов рРНК.

- _

выводы

1.Анализ структурной организации клонированных генов ри-босомных РНК 12-ой хромосомы человека обнаружил новые варианты внутригеномного полшорфизма рДНК. В частности, выявлены различия по содержанию и распределении ряда тандемно организованных мпкро-сателлитных повторов.

2.Обнаружены случаи крупных делеций в пределах рибосомно-го межгенного спейсера в клонах рДНК: показано, что точки разрыва находятся в районах микросателлитных кластеров, в частности, (ТС)пповторов. Результаты свидетельствуют о том, что тандемные повторы могут определять области повышенной несгзвильности рДНК..

3.Впервые продемонстрирована гиперчувствительнссть БаиЗА-сайтов в области, предшествующей началу репликации, по сравнению с другими областями рДНК.

4.Для'одного из клонов рДНК обнаружены нерибосомные фланкирующие последовательности, имеющие гомологии с рядом белковых доменов человека и животных. Определено, что включение чужеродной ДНК произошло в области рМГС, содержащей гиперчувствительные БаиЗА-сайты рестрикции.

5.Определение первичней структуры одного из клонированных вариантов рДНК в предпромоторной области обнаружило высокий уровень нуклеотидных различии по сравнению с ранее опубликованной последовательностью ДНК, что свидетельствует о полиморфизме этого района гена и находится в соответствии с данными ВДРФ-аналига.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1.A.P.Ryskov, N.S.Kupriyanova, K.K.Metchvolcdov, P.M.Ki-rilenko, M.I.Prosnyak, and S.A.Limborska (1994).New polymorphic DNA probes revealed from human genomic libraries. 3-rd international conference on DNA fingerprinting1. December 13-15,1994 Hyderabad, India. Abstracts, p.76.

2.Н.С.Куприянова, К.К.НечволодоЕ. U.M.Кириленко, Б.И.Ка-

панацее, H.К.Янковский, А.П.Рысков (1996). Енутригеномный полиморфизм генов рибосомной РНК хромосомы 13 человека. Мол.биол., т.30, Е.1. с. 51-60.

3.A.P.Ryskov, N. S.Kupriyanova, K.K.Nechvolodov, P.M.Kirilenko, I.K.Smirnav, M.I.Prosnyak, S.A.Limborska (1996). Hypervariable Muitilocus Markers and Fingerprinting'. Karadeniz J. Med. Soi., v.9, N 6, pp.72-79.

4.N.S.Kupriyanova, К.K.Netchvolodov, P.M.Kirilenko, A.P.Ryskov (1996).Preferential cleavage sites for Sau3A restriction endonuclease in human rDNA repeating' units. HUGO's Human Genome Meeting. 22-24 March 1996, Heidelberg:, Germany. Abstracts, p. 54.

5.A.P.Ryskov, N.S.Kupriyanova, K.K.Netchvolodov, P.M.Ki-rilenko (1996).Hypervariable sequences and intragenomic polymorphism of human ribosomal RNA g-enes. HUGO's Human Genome Meeting-. 22-24 March 1996, Heidelberg-, Germany. Abstracts, p.86.

e.N.S.Kupriyanova, P.M.Kirilenko, K.K.Netchvolodov,

V.V.Polkanova, and A.P.Ryskov (1996). Human intergenic ribosomal spacer: new types ofintragenomic variability. ASHG 46th Annual Meeting October 29-November 2, 1996, San Francisco, USA. Am. J. Hum. Genet., v.59, p.405.

7.A.P.Ryskov, M.1.Prosnyak, N.S.Kupriyanova, K.K.Nechvolodov, P.M.Kirilenko (1996). Hypervariable Sequences of Human Genome: Structural Organization, Distribution and Genetic Variability. Brazilian J. of Genetics, v.19, No 2, p.222.

e.N.S.Kupriyanova, K.K.Nechvolodov, P.M.Kirilenko,

A.P.Ryskov.(1996). Preferential Cleavage Sites for Sau3A Restriction Endonuclease in Human rDNA Repeating Units. Brazilian J. of Genetics, v.19, No 2, p.222.

9.P.M.Kirilenko, K.K.Nechvolodov, N.S.Kupriyanova, and A.P.Ryskov. (1997) Detection of the sites hypersensitive to the SauSa restriction endonuclease action in the human rDNA spacer. HUGO's Human Genome Meeting'97. March 6-8, 1997. Toronto, Canada. Abstracts, p.83.