Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурная организация и эволюция рибосомной ДНК чешуйчатых рептилий подотряда Sauria

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Структурная организация и эволюция рибосомной ДНК чешуйчатых рептилий подотряда Sauria"

На правах рукописи УДК 576.316.577.1

иил448ЭЗ1

ВОРОНОВ АЛЕКСАНДР СЕРГЕЕВИЧ

СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ЭВОЛЮЦИЯ РИБОСОМНОЙ ДНК ЧЕШУЙЧАТЫХ РЕПТИЛИЙ ПОДОТРЯДА вАиША

Специальность 03 00 26 - «молекулярная генетика»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель кандидат биологических наук Куприянова Н С

1 6 окт

Москва 2008

003448931

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН, лаборатории организации генома

Научный руководитель'

Кандидат биологических наук Куприянова Н С

Официальные оппоненты

Доктор медицинских наук, профессор Альтштейн А Д

Доктор биологических наук, профессор Носиков В В

Ведущая организация Учреждение Российской академии наук Институт биологии развития им Н К. Кольцова РАН

Защита диссертации состоится "22" октября 2008 года в 12 часов на заседании Диссертационного совета Д 002 037.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН по адресу 119334, Москва, ул Вавилова 34/5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Институте молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН по адресу 119991, Москва В-334, ул Вавилова 32

Автореферат разослан " .. "........ 2008 года

Ученый секретарь Диссертационного совета канд фарм наук Рраб°вская Л С

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В настоящее время в молекулярном биологии быстрыми темпами идет накопление экспериментального материала по первичной структуре геномной и митохондриальной ДНК различных организмов. Одним из важнейших современных направлении в молекулярной биологии и генетике является изучение изменчивости генетического материала и поиск эволюционных связей между организмами Однако интенсивные усилия, направленные на установление структуры и корней эукариотического древа путем филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей, пока не привели к построению общепринятого варианта такого древа [Апзие е! а1, 2005] Нет окончательной ясности и в вопросе филогении рептилий

Интерес к структурно-функциональной организации кластера рибосомных генов обусловлен центральной ролью рибосомной РНК в ряде важнейших клеточных процессов, а также особенностями строения рибосомной ДНК (рДНК) Для рДНК характерно чередование консервативных и вариабельных участков, которые удобно использовать для филогенетических исследований и поиска функционально значимых участков у организмов различной степени родства

Для изучения эволюционных связей часто используется участок рибосомного оперона, включающий внутренние транскрибируемые спейсеры ВТС1 и ВТС2 предшественников рибосомной РНК В настоящее время в вепВапк депонировано более 100 ООО последовательностей ВТС2, подавляющее большинство этих видоспецифических последовательностей принадлежит беспозвоночным Их интенсивно и успешно использовали для филогении и эволюционных сравнений растений, протестов и некоторых беспозвоночных Очевидно, что ВТС2 можно использовать для филогении и эволюционных сравнений таксонов более высокого уровня, благодаря наличию высоко консервативных (консенсусных) последовательностей, обеспечивающих

консервативность вторичной структуры соответствующего участка пре-рРНК [Joseph, 1999, Coleman, 2007]

Цель и задачи исследования. Целью данного исследования являлось изучение структурной организации кластеров и эволюционной изменчивости отдельных участков рДНК у чешуйчатых рептилий подотряда Sauria.

В работе были поставлены следующие задачи.

1 Методом блот-гибридизационного анализа картировать и определить размер мономерного звена рДНК у ряда представителей подотряда Sauria.

2 Определить степень представленности повторов рДНК в геномах различных представителей подотряда Sauna

3 Клонировать, секвенировать и провести сравнительный анализ первичных и вторичных структур ВТС2 ящериц между собой и с представителями других позвоночных

Научная новизна и практическая ценность работы. В данной работе впервые определены особенности организации кластеров рДНК представителей отряда Squamata. Показано, что повторяющаяся единица рДНК ящериц одна из самых коротких среди всех позвоночных (10 - 15 т п.н ) Установлена степень повторности мономеров рДНК у ряда представителей рептилий, показано что у ряда ящериц она значительно меньше, чем у всех ранее исследованных позвоночных Показано, что у Uta stansburiana (Iguamdae) рДНК локализована на одной хромосоме Впервые у 15 представителей отряда Squamata определена полная нуклеотидная последовательность ВТС2. Сравнительный анализ полученных последовательностей между собой выявил различия в размерах и характерные особенности организации этого элемента рДНК у представителей инфраотряда Iguania и семейства Lacertidae. Показано, что увеличение размеров ВТС2 у исследованных рептилий является следствием коротких инсерций и локальных дупликаций

Результаты исследования имеют ценность для выявления закономерностей эволюции рДНК и их взаимосвязи с эволюцией биологических видов. Данные,

представленной диссертационной работы, являются новым научным материалом, необходимым для восполнения общего объема информации, на основании которой могут быть сделаны выводы о механизмах эволюции рДНК

Рибосомная ДНК рептилий, имеющая, как выяснилось, наименьший размер повторяющегося звена при наименьшей степени повторности, представляет интересную модель для изучения механизмов поддержания необходимого уровня экспрессии генов рРНК Полученные результаты могут найти применение в изучении возможных вариаций в способах регуляции транскрипции генов рРНК, необходимый уровень присутствия которой при абсолютной точности процессинга жизненно важен для любой клетки

Таким образом, наша работа, кроме результатов по молекулярной структуре и эволюционной изменчивости рДНК рептилий, содержит информацию, имеющую важное прикладное значение в области общей биологии как способствующая разработке систематики рептилий на основе филогенетически значимых молекулярных маркеров

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на 12-ом Международном герпетологическом конгрессе (С - Петербург, 1216 августа 2003 г), на III съезде ВОГИС, (Москва, б- 12 июня 2004 г), на Международной конференции «Вычислительная филогенетика и геносистематика» (Москва, 16-19 ноября 2007 г) и на межлабораторном семинаре ИБГ РАН (2008 г)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ Структура и объем работы. Диссертация изложена на 97 страницах, включает 15 рисунков, 4 таблицы и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 149 источников

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1 Структурная организация рДНК ящериц

1 1 Рестрикционное картирование рДНК ящериц

В рДНК позвоночных эндонуклеаза рестрикции ЕсоШ дает два константных

разрыва за 220 п н до 3' конца 18S рДНК и за 585 п н до 3' конца 28S рДНК (Рис. 1) В

случае отсутствия дополнительных EcoRI сайтов при гидролизе образуется два

фрагмента, один из которых содержит 3' конец 18S рДНК, внутренний транскрибируемый

спейсер! (ВТС1), 5,8S рДНК, внутренний транскрибируемый спейсер 2 (ВТС2) и

основную часть 28S рДНК (внутренний фрагмент) Второй, внешний фрагмент, содержит

рибосомный межгенный спейсер (рМГС), несущий на 5' конце остаток 28S рДНК, а на 3'

конце - практически полноразмерную 18S рДНК. На основании нуклеотидных

последовательностей, прилежащих с обеих сторон к консервативным £coRI сайтам,

изготовлялись маркерные олигонуклеотидные пробы RI - RIV таким образом, что RI и

RIII могли служить маркерами для внутреннего фрагмента рДНК, a RII и RIV - для

внешнего (Рис. 1)

EcoRI

EcoRI

EcoRI

28S

рМГС

Нг

18S

5.8S i_□_i

28S

RI RIV

RU RUy

ВТС1 ВТС2

RI RTV

Рис. 1 Схема организации повтора рДНК позвоночных Вертикальными линиями показаны консевативные сайты рестрикции ЕсоЮ, синими квадратами - положение гибридизационных зондов RI-RIV

Результаты блот-гибридизационного анализа геномной ДНК £>. гаййег и £> аппетаса (рис 2) позволяют заключить, что размер повторяющейся единицы рДНК у этой ящерицы составляет примерно 15 тпн, тк. расщепление геномной ДНК под

действием трех рестриктаз (ВатHI, BglU и Крп\) из четырех приводит к образованию единственного, одинакового по размеру фрагмента, гибридизующегося как с пробой RII (Рис. 2а), так и с пробами Rl, RIII и R1V (данные не приведены)- Совместная обработка ДНК D. raddei рестриктазой ЕсоКХ в сочетании с любой из рестриктаз, перечисленных в скобках (Л/1 , S'n/GI, АссI, Sg/II, £coRV, Not] и Xhol) и последовательная гибридизация с мечеными маркерами (RI-RIV) показывает, что сумма всех гибридизующихся фрагментов в каждой из дорожек составляет 15 т.п.п. (Рис. 2б-д).

Рис. 2. Блот-гибридизационный анализ ДНК Darevskia raddei.

а) Гидролиз эндонуклеазами рестрикции BamW I (1), BglU (2), ЕсоШ (3), Крп\ (4), гибридизация с меченым олигонуклеотидным зондом RII; б-д) Гидролиз эндонуклеазой рестрикции ЕсоШ (1) совместно с Л/1 (2), SalGl (3), Лее! (4), ßg/Il (5), £coRV (6), Noll (7), Xho\ (8), гибридизация с мечеными олигонуклеотидными зондами RI (б), RIII (в), RII (г), RIV (д).

Аналогичная серия гибридизаций была проведена для представителя инфраотряда Iguania - Laudakia caucasia. Расщепление геномной ДНК четырьмя рестриктазами (BglU, BamWl, Kpril или Hindill) из шести приводит к образованию единственного фрагмента размером около 10 т.п.н., гибридизующегося как с пробой RII (Рис. За), так и с пробами RI, RIII и RIV (данные не приведены). Совместная обработка ДНК D. raddei рестриктазой EcoRl в сочетании с любой из рестриктаз, перечисленных в скобках (PstI, Sa/Gl, Accl,

Bglll, EcoRV, Noll и Xhol) и последовательная гибридизация с мечеными маркерами (RI-R1V) показывает, что сумма всех гибридизующихся фрагментов в каждой из дорожек составляет 10 т.п.н. (Рис. 3 б-д).

Рис. 3. Блот-гибридизационный анализ ДНК Laudakïa caucasia.

а) Гидролиз эндонуклеазами рестрикции ßccRI (1), Bgl II (2), Ват HI (3), PvitW (4), Kpnl

(5), Hindïïl (6), гибридизация с меченым олигонуклеотидным зондом RII; б-д) Гидролиз эндонуклеазой рестрикции £coRI (1) совместно с PstI (2), SalGl (3), Accl (4), Bglll (5), Eco RV (6), Not\ (7), Xho\ (8), гибридизация с мечеными олигонуклеотидными зондами R1

(6). Rill (в), RI1 (г), R1V(ä).

Сходные размеры мономера рДНК были получены еще для восьми видов рептилий отряда Squamata (табл.1). Рестрикционный анализ показал, что рДНК исследованных рептилий содержит два консервативных EcoR I сайта рестрикции, типичных для всех позвоночных.

Полученные результаты указывают на стандартную организацию рДНК ящериц

при необычно малой для позвоночных (-10 - 15 т.п.н.) длине мономера рДНК. У человека

эта величина составляет около 43 т.п.н. при степени повторности 200-300 [Gonzalez et

al.,1995], у Xenopus /aevis - 20-25 т.п.н. при степени повторности 600 [Long et al.,1980],

костистой рыбы вьюн (Mixgiinis fossilis L.) имеется два типа мономеров рДНК - длинный

- 20-25 т.п.н. с числом повторов 250 и короткий - 15 т.п.н., составляющий около 10% от

6

основного [Куприянова и др., 1981], а у дрожжей 51. cerevisiae эта величина составляет около 11 т.п.н при повторности 140 [Long ct al., 1980].

Таблица 1. Размер мономеров рДНК у разных видов ящериц.

класс отряд подотряд инфраотряд семейство вид Размер мономера в т.п.н.

я J3 CL Darevskia armeniaca -15

Dnrevskia r add ei -15

О Е Lacertidae Darevskia valentini -15

с Lacerta agilis -12

'и Zootoca vivípara -12

я Scincidae Eulamprus murrayi -12

а. г я 'С = я я о тз

СЙ сг (л сг с 1= я Ьв я > Varanidae Varan us exant - 11

к Iguanidae Iguana iguana -11

я ¡3 Uta stansburiana -15

Agamidae Lauilakia caucasia -10

1.2 Определение количества мономеров в кластерах рДНК

Скрининг фильтров, содержащих упорядоченные колонии 2х ВАС-библиотеки

ящерицы Uta stansburiana, выявил 12 клонов-кандидатов: из них четыре колонии, давали

интенсивный сигнал и восемь - слабый сигнал (Рис. 4).

- ■ «,

J Рис. 4. Гибридизация одного из 12

* /

* " * j * ' н 2 _ « фильтров геномной библиотеки Uta

Stansburiana с олигонуклеотидным зондом RII. Стрелками и цифрами обозначены клоны дающие интенсивный сигнал (1), клоны дающие слабый позитивный сигнал (2).

Методом блот-гибридизационного анализа показано, что только восемь клонов из 12 содержат рДНК. Четыре клона дают интенсивную гибридизацию со всеми четырьмя олигонуклеотидными зондами (рис. 5 б-д, дорожки 1-4), а еще четыре - слабую гибридизацию только с олигонуклеотидным зондом R1II (Рис. 5 г, дорожки 6, 8, 11 и 12). Эти результаты показывают, что клоны 1-4 содержат центральные области кластеров рДНК, а в клонах 6, 8, 11 и 12, по-видимому, присутствуют сегменты, имеющие гомологию с 3' - концевым участком 18S рДНК. Зная среднюю длину вставки в ВАС клоне (120 т.п.н.) и длину мономера рДНК (15 т.п.н.), определенную с помощью блот-гибридизационного анализа (рис. 5б-д), можно предположить, что каждый из четырех клонов (1-4) содержит не более восьми мономеров рДНК. Поскольку работа проводилась с двукратной библиотекой диплоидного организма полученные результаты позволяют предположить, что в гаплоидном геноме ящерицы Uta stansburiana присутствует не более 8 мономеров рДНК, расположенных на одной хромосоме. Гибридизация с мечеными пробами RII и R1V выявила наличие внутригеномного полиморфизма в коллинеарно расположенных повторах рДНК (Рис. 5 г-д). Положение проб RII и RIV на карте рДНК с большой степенью вероятности указывает на то, что полиморфные участки локализуются

Рис. 5. Рестрикционно-гибридизационная характеристика клонов, содержащих рДНК, из ВАС библиотеки Uta stansburiana. а) УФ-визуализация рестрикционных фрагментов; б-д) Блот-гибридизация фрагментов, полученных в результате обработки ВАС-клонов, содержащих рДНК, эндонуклеазой рестрикции EcoR\. Меченные

олигонуклеотидные пробы R1 (б), RII (в), R111 (г), RIV (д). Звездочками обозначено местоположение слабогибридизующихся фрагментов (дорожки б, 8, 11 и 12).

Оценку содержания повторов рДНК в геномах шести представителей отряда Squamata проводили методом ПЦР в реальном времени В качестве контрольного образца использовали геномную ДНК человека (размер генома 3x10'J п н , число копий рДНК на гаплоидный геном - 200-300) [www genomesize сот]. Пробы ДНК, взятые у трех индивидов (по 100 нг), достигали С(Т) к 18,5к|у±0,3 циклу Образцы, содержащие аналогичное количество (100 нг) геномной ДНК разных видов ящериц, достигали С(Т) к 17му-20му циклам (Табл 2)

На основании данных о размерах геномов [www genomesize com], о числе повторов рДНК в контрольном геноме и полученных значений С(Т), можно приблизительно рассчитать количество повторов рДНК в геномах исследуемых рептилий Например, С(Т) L сак отстает от С(Т) H sap на полтора цикла, следовательно количество субстрата, участвующее в ПЦР, у L. саи в 21'5, т е в 3 раза больше, чем у человека При этом размер генома L саи - в 1,6 раза меньше размера генома человека. Следовательно, количество повторов рДНК в геноме L саи приблизительно в 5 раз меньше, чем в геноме человека (Табл 2)

Таблица 2 Оценка количества мономеров рДНК в геномах ящериц методом ПЦР в реальном времени

Объект C(T) Размер генома (п н ) Кол-во рДНК повторов на гаплоидный геном

H sap -18,5 3 xlO' 200-300

L.val -19 -2x10"* 80-120

L agi -19 1,6-2,1 xlO* 80-120

E mur -18 ~2xlO'J* 120-200

L cau -20 1,9x10" 40-60

I igu -20 -2x10"* 40-60

V exa -17 1,7-2,4x10'' 200-300

"■среднее по семейству [www genomesize com]

Таким образом, полученные нами данные указывают на необычно малый для позвоночных размер повторяющейся единицы рДНК (-10- 15 тпн) у исследованных видов ящериц, при этом количество копий рДНК в их геномах достаточно сильно варьирует, от -10 у U stansbunana до 300 у V exant в расчете на гаплоидный геном, оставаясь, тем не менее, близким в пределах отдельных подсемейств 2. Структурная организация и изменчивость ВТС2 чешуйчатых рептилий 2 1 Сравнительный анализ первичной структуры

Нами проведено клонирование, секвенирование и сравнительное исследование рибосомного внутреннего транскрибируемого спейсера 2 (ВТС2) у 15 видов ящериц, принадлежащих к трем инфраотрядам Scmcomorpha, Varanoidea и Iguania Анализ последовательности ВТС2 показал, размер исследуемых последовательностей варьирует от 301 у ¡gitana iguana до 713 у Lacerta strigata (таб. 3)

Анализ первичной структуры ВТС2 показал, что во всех нуклеотидных последовательностях ВТС2 ящериц различные основания представлены неравномерно, содержание GC составляет 78-80%, что характерно для других позвоночных, и содержат пять консервативных участков, аналогичных тем, которые были выявлены при построении обобщенной консенсусной вторичной структуры ВТС-2 позвоночных [Joseph et al, 1999]. В ходе сравнительного анализа было обнаружено, что у ящериц с «длинными» ВТС2 консервативные элементы расположенные в 3'- половине проявляют некоторое сходство с нуклеотидными блоками 5'- половины Мы провели выравнивание «коротких» ВТС2 двух ящериц инфраотряда Iguania L cancana, 1 iguama и амфибии X. laevis с 5'- и 3'- половинами «длинных» ВТС2 ряда других ящериц Был выявлен ряд регулярно чередующихся нуклеотидных блоков (столбцов) с высокой (65-80%) степенью сходства(рис 6)

Таблица 3 Размеры ВТС2 чешуйчатых рептилий

отряд подотряд инфраотряд семейство вид сокращенное обозначение IT.II. Acc. N

Darevskm armeniaca D.arm 683 AY696809

Darevskia nairensis D.nai 701 DQ184944

Darevskia valentwi D.val 680 DQ184945

я Darevskia rostombekovi D.ros 686 DQ184946

с. U о £ Darevskia porischmskti D por 696 DQ184947

Lacertidae Darevskia mixta D.mi\ 700 DQ343131

О с Lacerta media L.med 711 DQ343129

173 Lacerta agihs L agí 709 DQ343130

Я « Lacerta slrigata L.str 713 AY646810

я Callona sp. G.sp 550 DQ18494J

Е « 3 С" С/3 'С 3 Scincidae Eulamprus murrayi E.mur 469 DQ184940

я с/з Varanoidea Varanidae Varan us exant V.exa 569 DQ184942

[guania Iguana iguana I.igu 301 DQ184939

Iguanidac Uta stansburiana U.sta 357 DQ184941

Agamidae Laudakia caucasia L.cau 337 AY643402

I igu i GH-CGGTCMTOCCCCC----40-СЕССССТЮЖС-—St-TCCC«BCIXCC-'

-86-пггжг.п" ♦ececcGMGCGCTirawcc

£ nur

E rnir lexa V exa G gal С gal D mix S mix L med L.med

1 GJla*GGTC]UlTCGCCa:-212 Gg*CGG*CHR*CGCgCC-1 GHa*GGTCMTCGCCn:-330 (.A 111 -

1 GAa*GGTCWlTCa*CCC-323 GgcCGGTCfl*ggGtt(X-

l сплчхжттсс*са:-

399 CllaCGC»CggTgGCtgs-i a *gg ic й а т re -416 GHggGGTg»»CG*gCC-

---42-CGCGGCTGGGGG---57—2 3 2-CGCGG*TGGaGG—238-

---44 -CGCGGCTGGGGG---63-

--349-CGCGGCTGtctG—400-— 65 -CGCGGCgacGGG- -110-—346-CGCGGCTGtctG--386-

---92-CGCGGCTGCCGG—132-

—444-CGCGGCTGtGtG- ^480-—116 -CGCaGCTGGGCG- -152- -I ( 7-CGCGGCTGtctG—504-

■TCGCUGGCGC—

-ICGC«1GGCGC-■TCGC****CcC~ Ti ii'T.r,m.c-ТСССсЛса*сС-TCGC-aGcCat-TCCg*nc^rGC-TCGC«HGGCtC" ■TCGC ***tCcC —

-10 0 -CCTeCG*-t cCCCCC *WffigcC**IlQlcCC -307-tCTcCGcctcCCC*****GCcC**gGcgCC -l?9 rrttrf.«4 tcrcrr -OT.G -a-gcwaicrr -443-CCTcC»*»tcCtIXtc!c«G€c*ao*cc;TCC -148-CCTBCG**acCCCCC*3aGtcC**aiaicCC -443-CgTcC»«*tcCCCtCt«*Cag<»*aiTCg -20d-gCMCMl**cCCCec»jmGtt»»clSt3icCC -53 7-CgToC *«»t cCCCtCG"«GttggttGgTtC -222-CCTSCGA**cCCCCC**jftGtGC*"*AGReCC -55 8-CgTcC »««tcCCCtCt «*GtG*»gtctTCC

1 cau 1 Gl»CGMtWtTCG»CCe-----39-СШа»аЯсе---18-ТС£С*»есебС-

-14 d -сстссс^т ccecесшаетсс^чкшгсс

E mur E imir V.exa V exa G gal G gal D mix 0 mix L med 1. med

1 G»a«GGTCMTCGCCCC-212 Gg"CGG*CJUl*CGCgCC-

i епа^сЕгаттссессг-

330 GHi4«;"9gl>eOGttCC-1 GSa*GGlCMlCa«CCC-323 GgcCGGTCn*ggGttCC-1 Ии^ТСМИСС^ССЕ-399 GRaCGG*CggTgGCtgg-1 GBa*GGTCMTCG*CCC-416 СйддССТдПД*СС*дСС-

---42-CCCGGCTGGGGC---57

- -2 32-CGCGG*TGGaGG- -238 ---44-CCCGGCTGCGGG- —63

- -349-CGCGGCTGtctG- -«00---65-CGCGGCgacGGG—110-

--346-CGCGGCTGtctG--386-

---92-CECGGCTGGGGG—132-

—444-CGCGCTTGtGtG—480 —116-CGCaGCTGGGCG--15 2—4 6 7-CGCGGCTGtctG—504-

■TCGCmGGCGC--TgC**lCGCag-■TCCC-41GGCGC--TCGC»*«*CcC~ ■TCGCUGGCGC— ■TCGCcSca«cC-•TClX*.1GcCat-

-1Л0--307-129-443--14S--443-200-

■TCCg«Hc*CGC----537'

TCGC~RGGCtC-----222'

■TCGC ***tCcC-----558

•0;TCCG**TCCCCCC4HlGgCC--«M3lCCC tCTCCGccT CCCC**«<gccCC*ggcgCCC ■DCTtCG*-TCCttrCiaGgCg*c!lGllCCC txta'-t CCt;.Xtoo««gCC* -grcCtC

сстасс""асссссс*ям;тсс*'*1мяссс

CgTCC «*«Т CCCCtCttl*cag***Olt Cg "СГССГГ -1WCTC *'с]И31ГГС ■CgTCC ***TCCCCtCG**GTtggttGgt t С 'CCTaCGa**CCCCCC**JtGTgC"**3*GftCCC ■CgTCC **TCCCCtCt**GTg**gtcfctCC

X lae 1 ГДТКТСГВТЯХСГС-----42-CGCCGCTGGGGC-— 5«-tCOt*5lGGGGC-

-76-стти'г.-п ггпг|:-!втесг"бгаггс

E Imir 1 Gfta*GglC*aftTCCCC£C-----42-CGCGQCTGGGGG---57-

Em 212 Gg"CGg«CaA«tECgCC----232-CGCGG*TGGaGG--238-

V exa 1 C.S.if»jTrar,Ttt:CCa:-----44-CGCGGCTGGGGG---63-

V.exa 330 GJU4Gg"BgJlgCGttai----349-CGCGGCTGtctG—400-

G gal 1 Gfla"GgTCaflTCa*CCC-----65-CGCGa:g^GGG--110-

C gal 323 CgcCGgTCa*ggGttCC----346-CGCGGCTGtctG—386-

II mix 1 GSa"Ggm:aMOE«CCC-----92-CGCGSCTfiOXG--132-

D mix 399 GaaCGgfggTgCCtgg----444-CGCGGCTGtGtG-^i80-

t med 1 Gna*GglCaJlTCG*CCC----116-CGCaGCTGGGGG- -15 21 med 416 GHggGtfTgai*a;*gCC----467-CGCGGCTGtctG--504-

■TCCC*SGGCGC-----100

Tgt«*JlGGGag-----307

■TCtr-UGOCGC-----129

■TCGC***"CcC-----443-

■TCGCUCGCGC-----148-

■TCGCcMca*cC-----443-

■TCGCKGoCat" - - - 20 0 •

•TCGg*Bc*GCC-----537

■TCCC*»GGCtC-----222-

■TCGC»**tCcC-----558

■CCTCCG*TCCC(XC*ailGCCC**10tCCC ti.TOCGccTGCCC****gcCCC*ggcgCCC

■ос11сс<-«та;ессс«1В1йесд*скассс

ССТСС «*"Т CCta:tciJ»»GCC»*gcCCte ■CCTflCG**aCCCCCC*aftGTCC"JiGRCCC ■CgTCC CCCCtCttft*Ca^*''*G&TCg ■дСТЯСЕЯ««СССОСС*Юи;ТС**,сЖ»ССС ■CgTCC ***TCeCCtCG-«*GTtggttGgTtC ■CCTHCGn**CCCCCC**7iGTGC**3lGftCCC CgT CC***TCrCCtCt "тл r, ct ТС С

Рис 6 Сравнительный анализ «коротких» ITS2 X. laev/s и представителей инфраотряда Iguama с 5'- и 3'- частями «длинных» ITS2 других ящериц 2 2 Сравнительный анализ предполагаемых вторичных структур

ВТС2 всех позвоночных складывается из 3-5 высоко термодинамически устойчивых шпилек, разделенных относительно короткими однонитевыми участками Длина шпилек может заметно различаться у разных организмов, причем наиболее консервативные последовательности локализуются между шпильками и вблизи их основания [Joseph et al, 1999, Michot et al, 1999] Основываясь на данной схеме, мы

провели коррекцию выравнивания ВТС2, полученного с помощью пакета программ GeneBee Service и Multalin, в результате чего удалось совместить консеисусные последовательности В результате было показано, что несмотря на достаточно большие различия в длине ВТС2, расположение шпилек и консенсусных последовательностей у всех исследуемых ящериц соответствует схеме предложенной Джозефом [Joseph et al, 1999] (рис 7)

Рис 7 Схема потенциальной вторичной структуры ITS2 позвоночных [Joseph et al, 1999,] А, В, С, D - двуспиральные домены; DI - DIV - вариабельные участки двуспиральных доменов, а, Ы, Ь2, с, d -консервативные участки

Изучение вторичной структуры ВТС-2, показало, что размер первой шпильки (D I) незначительно варьирует у представителей амфибий, рептилий и млекопитающих от 30 п н. у X. laevis до 45 п н у R nor, за одним исключением - семейство Lacertidae, где шпилька D I имеет размер почти втрое больше (82-107 п н.).

Размер шпильки D II более вариабелен от 30 п н у X laevis до 126 п н у G. Gallus Самый большой размер шпильки DII среди исследованных ящериц имеют так же представители семейства Lacertidae (109-115 п н ) Интересно отметить, что у последних в консенсусном участке, входящем в правую половину шпильки DII, пара gt, консервативная у всех других сравниваемых организмов, замещена на ga (рис. 8). Эта специфичная для лацертид замена является компенсаторной и усиливает потенциальную способность к образованию вторичной структуры в основании DII Значительные размеры D II у представителей семейства Lacertidae обусловлены дополнительными

вставками на 5'-конце Большинство этих вставок обладают внутренней комплементарностью и могут быть сложены в стабильные шпильки D.II', которые являются характерной особенностью этого семейства (рис. 9)

Нуклеотидная последовательность между шпильками D II и D III является одной из наиболее важных консенсусных областей в ВТС2 позвоночных Она образована 20-24 п н , и в ней локализуется сайт процессинга для 8S предшественника 5 8S рРНК. Шпилька DIII отсутствует у представителей инфраотряда Iguama, как и у всех известных на сегодняшний день представителей птиц и амфибий Небольшая (60-76 п н ) шпилька DIII обнаружена у всех остальных исследованных ящериц У млекопитающих, напротив, она весьма велика, например, у мыши в D III содержится 418 п н (рис 10)

Шпильки D IV самые протяженные и наиболее вариабельные у всех позвоночных, а для образуемых ими потенциальных вторичных структур характерна высокая степень ветвления В этой области ВТС-2 можно выделить консервативные элементы У мыши внутри последовательности (5'-CGTCCGATGCGCCGA-3') в шпильке D IV находится сайт процессинга, который обеспечивает образование предшественника 12S для 5 8S рРНК [Michot et al, 1999] Аналогичный участок с помощью компьютерного моделирования был определен для рыб, амфибий, птиц и млекопитающих У всех исследованных организмов этот сайт находится в центральной части D.IV [Joseph et al., 1999] В ходе сравнительного анализа шпильки D IV у всех ящериц был обнаружен аналогичный консервативный участок d (рис 12)

D I(llt)

D II(Dt)

D.III(nt)

D IV(nt)

D V(nt)

l.D arn

2 D.nai

3 D val

4.D.ros

5.D.por

6.D.mix

7.L.med

8.L.agi 3.L.str

GAAGGTCAATCG 80

----------rr 33

CGCGGCTGGGGC^AGCCGGTCCGGTCCGCCCGGCCGGCGTTCGCAG 63 CTACGaCCCCCC*AAGTCC*AGACCCG*CGCCCC 63 CTACGGGGCCGTGGTCGGTC

10 G gal -----------A 74

11 V •еха ------------35

12 Е mur ------------32

13 I igu --C---------33

14 L eau --C---------2Э

15. .0 sta --C---------36

16. .X lae —C-*—С----52

17 R nig ТСС---GC---10

.8. .а nor --C-A-------41

j.3 и mus

20. . в sap -COA-------28

77 --------------------------

----------__ 73

**-CC-G--* *-CC-G---T-C

"СОТ*------53

-CT---------57

CG--T-----*G-

26 -C

.c —*------- g —T—T------С---G- -

>****.------ЮЗ --T------—G*—G—

' * * -С------- 13 —С—r-r-~*G-----1

■**-с-------сэ —c--T-T-rr*G-----т

.T--C-------15 —С—T-----*T----G-

------CCTT--G- 0

С---Gi-GGCGG-G 300

----GTGTG-G-GG 430

227 232 229

229 232

' 228 225

230

.—Тс---A-T — * ** *

-GC-C-CC--CCC*-G--GC -CT-----»--C-CG---C-

0 -GC-C-----CC—С---CG

0 —*-----GTCCCCCTCCG-

13C 171 164 98 113 239 104 176 323 52C 897

•G—C* GGG-A 'GC — *

G-G-*--

121 3' 130 137 142 145 34 140 124 135

117

118

43 2& 13 189

16 34

Ы

b2

Рис.8. Сравнительный анализ ВТС2 позвоночных. Цифрами указано число нуклеотидов вариабельных участков - Зеленым цветом выделены нуклеотиды формирующие характерную левостороннюю шпильку ОН', а, Ы, Ь2, с, ё - консервативные участки. Синим цветом выделены первые нуклеотиды в основаниях шпилек и ЭН.

ам

Х.1ае ?

; иди

\ / и.5:а 1 : Ь.саи } : Е.тиг 1 У.еха \ : М'тиз ? ! к-пог ' : н-эаР

4 0.Н' ¿§--0.40

3- 5-

0.1

0.1Г

д0=-7,50 0 у Р.1

И.II" л0--9.90

3' 5'

0.1

Р-Н 0.11'

Р1 Р.«" лС—14.9

0.Н р;1 с.||-.0* лв=-1е,40

дС=-10,30 о.||

/

О.«;:-

1_.тес1

5' 3'

I О.ггмх

5" У

5" 3"

Рис. 9. Потенциальная вторичная структура А и В доменов ВТС2 ящериц и некоторых позвоночных. В прямоугольнике выделена шпилька 011' характерная для истинных ящериц.

» t tmO ÏÏ "

i

i

V

. i

. Ь ,.•■< .»-'-*

i К 'РЧ 1

з i. ;

гР^'Я c:V>

y -

<; >

10

A

r 11 к

■A

i2

. JÎ 1 }

.V

( >

«

6 H

д

O-

■B = -M.J0H

13

14

\

-174.70 0. I ПК.ног

H ,

4/ \

15

y

so-

rt

L I

Рис. 10. Потенциальная вторичная структура С доменов ВТС2 ящериц и некоторых позвоночных. I - Е. murayi, 2- V. exant, 3 - G. gallotia, 4 - D. portschinskii, 5 - D. armeniaca, 6 - D. mixta, 1 - D. nairensis, 8 - D. rostombekovi. 9 - D. valentine, 10 - agilis, 11 - L. strigata, 12 - ¿. média, 13-/?. norvégiens, 14 - M. musculus, 15-//. sapiens.

d

X «р*"

%

10

11

12

14 : 1

ц ;

18 K""

V d

16 Г Yl% Wa

? v

Л

L

Рис. 11. Потенциальная вторичная структура D доменов ВТС2 ящериц и некоторых позвоночных. 1 - Е. murayi, 2 - V. exant, 3 - G. gallotia, 4 - D. portschinskii, 5 - D. armeniaca, 6 - D. mixla, 1 - D. nairensis, 8 - D. rostombekovi, 9 - D. va/entine, 10 - ¿. caitcasia. 11-1. Iguana, 12 - U. stansburiana, 13 - L. agilis, 14 — L. strigata, 15 — L. média. 16 — Л. norvégiens, 17 — M musculus, 18 — //. sapiens.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Ранее было показано, что нуклеотидные последовательности ВТС2 всех изученных эукариот содержат пять консервативных (консенсусных) элементов и обладают потенциальной способностью свертываться в три-пять шпилек различной длины (D I - D V), исходящих из центральной петли [Joseph et al, 1999, Coleman, 2005] Нами детально охарактеризованы аналогичные шпильки для ВТС2 рептилий Проведенное сравнение новых последовательностей с ортологичными участками амфибий и млекопитающих показало, что размеры отдельных шпилек D 1 - D V и всего ВТС2 в целом, значительно варьируют между разными таксонами

Из всех организмов, участвующих в сравнении, самыми короткими вариабельными доменами D I и DII в ВТС2 ядерной рДНК обладают амфибия X. laevis, ящерицы инфраотряда Iguama и млекопитающие (Рис 9) Домен D II у всех чешуйчатых рептилий имеет близкие размеры Наиболее короткие и наиболее длинные домены DII обнаруживаются у амфибий, демонстрируя удивительно высокий разброс по длине (от 8 пн у X. laevis до 108 и н у Rana mgramaticidata) Этот результат, по-видимому, отражает чрезвычайно высокую степень дивергенции ВТС2 в геномах амфибий Очень короток домен D II в ВТС2 млекопитающих, крысы, мыши и человека (15-29 пн) У истинных ящериц (Lacertidae) D II содержит заметные левосторонние шпильки (D 1Г), позиции которых совпадают с позицией короткой не спаренной области (4-8 н) в D II других позвоночных (Рис 8 и Рис 9) [Joseph et al, 1999, Воронов и др, 2006] В ходе сравнительного анализа первичных структур у ящериц с «длинными» ВТС2 в 3'-половине спенсера был обнаружен ряд консервативных сегментов, проявляющих высокую степень сходства с консенсусами Джозефа, и перемежающимися с менее гомологичными областями (Рис. 6)

Возникает вопрос, какие механизмы лежат в основе увеличения размера ВТС2 В настоящее время полагают, что гомогенизация в мультигенных семействах происходит в

процессах репликации и репарации ДНК Недавние генетические исследования показали, что в согласованной эволюции может играть существенную роль генная конверсия [Liao, 2000, Hashimoto et al, 2003] В то же время, приблизительно двукратное эволюционное увеличение ВТС2 у истинных ящериц по сравнению с Iguania, а также обнаружение в его З'-половине цепи сегментов ДНК, гомологичных консенсусным, указывает на возможность дупликации 5'-половины ВТС2, скорее всего за счет рекомбинации. В то же время, большой вклад в дивергенцию ортологичных участков ВТС2 позвоночных вносят инсерции/делеции коротких нуклеотидных последовательностей Известно, что сам ВТС2 впервые появился как интрон, некогда внедрившийся в 28S рДНК прокариотической клетки и отделивший 5 8S рДНК, прежде являвшуюся началом гена, от остальной его части [Jacq, 1981, Nazar, 1980] Поэтому нельзя исключить возможность повторного внедрения в него по механизму ретропозиции и более протяженных элементов ВТС2

На рисунке 12 приводится сравнение расширенных вариантов консенсусных последовательностей ВТС2 (a, end) у представителей различных классов позвоночных Известно, что участки ВТС2, представленные в боксах а, с и d участвуют (в составе пре-рРНК) в связывании с РНК-шейперонами и/или нуклеазами процессинга Сравнение характера замещений нуклеотидов в пределах консенсусов и сравнение типов замещений у представителей различных таксонов позволяет выявить интересные закономерности

Например, в положении 3 бокса а обнаруживается два варианта оснований «С» или «А» Наличие основания «С» в этом положении объединяет такие далекие (если судить по их современным представителям) таксоны, как амфибии, млекопитающие и представителей инфраотряда Iguania В то же время, у всех исследованных представителей инфраотряда Scincomorpha и у Varanus exant в данной позиции присутствует «А» В качестве другого примера можно привести наличие основания «А» в позиции 5 а-бокса, которое неожиданно оказывается общим для млекопитающих, птиц и

аллигатора, тогда как у всех включенных в сравнение ящериц, относящихся к

ннфраотрядам ^иаша, ЗсшсотогрЬа и Уагапок1еа, данную позицию занимает «в» Приведенные различия, возможно, маркируют этапы расхождения древних организмов на группы, каждая из которых впоследствии дала начало большому числу современных таксонов

Рис 12. Сравнение нуклеотидных последовательностей консервативных (консесусных) областей ВТС2 ответственных за: связывание с ШРНК (а), процессннг 85 предшественника 5 88 рРНК (с), процессннг предшественника 28Б рРНК у представителей различных классов позвоночных (11)

Результаты сравнительного анализа консенсусных последовательностей (Рис 12) позволяют предположить, что эволюция по отдельным консенсусам происходила с различной скоростью для разных таксонов Например, у грызунов (мыши и крысы) в боксе с нуклеотиды в позициях 4, 9, 16 и 17 выбиваются из ряда всех сравниваемых в этом столбце последовательностей, тогда как в боксах а и (1 специфические для грызунов вариации отсутствуют

а с

с!

Х.1ае дасд*ЪссаЪсд ссс*ааддсс*адассс

Н.зар дссдаЪсаа^д сссЪаадсдс*адассс

М.тив дасдаЪсааЬсд сссдаадЬЬс*адасдЪ

Н.пог дасда^ааЬсд сс*даад!;1;с*адас^

в.да1 дсс*аЪсааЬсд ссс^аадЬдс*адаЬсс

А.П118 дасдаЪсааЪсд ссс^аадЪдс*адасас

1Лди дасдд^ааЬсд сс*даадсдс*адаЬсс

и.вЬа gacggtcaatcg ссс*аадсдс*адассс

Ь.саи дасддЪсааЪсд cccgaagtcc*agaccc

С.сйа gacggtcaatcg ссс*аад'ссз*адассс

Е.тиг gaaggtcaatcg ссс*ааддсс*адассс

V. еха дааддЪсаа^д ссс*ааддсссадассс

й.вр дааддЪсаа^д ccc*aagtcc*agaccc

1>.лих дааддЬсааЬсд coc*aagtco*agaccc

И.агт gaaggtcaatcg ссс*аадЬсс*адассс

Ь.ад1 gaaggtcaatcg ссс*аадЬсс*адассс

с*сддсддсЪдЪсЬдЬд ддссдсддс*д*ссддд сдосдсддс*дЬссдЬд сдссдсддс*дЬссдЬд ддс*дсддсЬдссддЬд сдс*дсддс^д(:сЬдЬд cgc*gcggctgtctgtg cgc*gcggctgtctgtg сдс*дсддсЬд1:с^дЬд cgc*gcggctgtctgtg сдс*дсддсЪд1:сЬдЪд сдс*дсддсЪдЬсЬдЪд cgc*gcggctgtctgtg сдс*дсддсЪдЪсЪдЬд с9с*9с99сЬ9':сЬдЬд cgc*gcggctgtctgtg

Обращает на себя внимание высокая скорость эволюции в сравниваемых областях ВТС2 у высших приматов. У человека (высших приматов с идентичной последовательностью ВТС2) имеются характерные замены оснований во всех трех боксах, особенно в боксе d по позициям 1, 11 и 15. Интересно, что в каждом из боксов имеется по одной общей вариации, характерной только для человека (приматов) и кур (птиц) Это позиции 2 в боксе а, 4 - в боксе с и 1 - в боксе d Нуклеотиды в позициях 14-17 бокса с также практически идентичны у человека и кур (АССС/АТСС), но сильно отличаются от ортологичных нуклеотидов у мыши и крысы (ACGT)

У всех чешуйчатых рептилий, включая крокодила, полностью идентичны ортологичные последовательности из блока d Следы эволюционных ветвлений рептилий отмечаются в блоке а, где в позиции 5 присутствует «G» у всех рептилий, кроме крокодила, которого объединяет с группами птиц и млекопитающих наличие «А» в данной позиции Вариабельность по позиции 3 в боксе а, а именно замена «С» на «А» у группы рептилий, по-видимому, сопутствует формированию ветви истинных ящериц Для бокса с характерно присутствие замен, специфических для таксонов современных рептилий Например, в положении 8-10 у всех представителей семейства Lacertidae - ТСС, I iguana и U. Stansburiana - CGC, L caucasia - ТСС, Е murrayi - GCC, V. exant - GCG.

Вероятно, вариабельность по этим позициям не влияет на точность процессинга пре-рРНК, и поэтому носит мозаичный характер Обращают на себя внимание одинаковые замены нуклеотидов, часто встречающиеся в сравниваемых боксах у приматов, кур и крокодила Это, по-видимому, свидетельствует в пользу схемы, согласно которой птицы и рептилии произошли от общего эволюционного корня, а также указывает на существование в прошлом общего предка у класса Aves и отряда Crocodilian к моменту, когда ящерицы уже образовали свою эволюционную ветвь Очень неожиданной оказывается идентичность замещений нуклеотидов (пять позиций) у приматов и птиц на

фоне замещении, специфических только для грызунов Возможно, в ходе эволюции могли возникать предковые формы не только внутри таксонов, но и между близкими таксонами

Опытным путем установлено, что филогенетические деревья, построенные на основе различных сегментов генома, могут отличаться друг от друга, поскольку в ранней эволюции хордовых имели место частые геномные дупликации [McLysagt et al, 2002] Избыточные гены, образовавшиеся в процессе полиплоидизации, затем могли быть подвергнуты элиминации, гомогенизации их нуклеотндных последовательностей, внедрению повторов и эпигенетическим изменениям [Blanc and Wolfe, 2004] Предпринятые попытки построить филогенетические деревья на основании последовательностей отдельно взятых боксов (а, с н d) также не привели к получению однозначных результатов. Однако основываясь на наиболее консервативном консенсусе d все последовательности можно разделить на четыре группы, соответствующие четырем классам - амфибии, рептилии, птицы и млекопитающие По консенсусу а ящерицы кластеризуются на две группы Iguania н Scmcomorpha в соответствии с морфологической классификацией Таким образом, данные участки можно использовать для поиска эволюционных взаимосвязей только в комплексе и при наличии значительной выборки

Результаты полноразмерного секвенирования новых геномов, принадлежащих разным представителям животного царства, позволяют подробно и последовательно изучать эволюционные связи между организмами Недавно проведен сравнительный анализ нуклеотндных последовательностей генов, кодирующих надсемейство белков серпинов, у рыб Danto reno, Takifugu ribnpes и Tetraodon nigroviridis, амфибии Xenopus tropicalis, птицы Callus gallus, и млекопитающих Cams Famdians, Rattus norvégiens, Mus nmsculiis, Pan troglodytes и Homo sapiens Исследование показало, что ген Serpinbl2, содержащий дополнительный экзон 8 и обнаруженный в геномах представителей всех классов позвоночных, среди рыб присутствует только у Danio rerio [Kaiserman and Bird, 2005] Особенности организации генов серпина у различных позвоночных позволяют

предположить существование общих эволюционных корней у млекопитающих и отдельных видов рыб

Внутренняя митохондриальная мембрана млекопитающих содержит белок UCP1, от наличия которого полностью зависит поддержание постоянной температуры тела Удивительно, что ген UCP1 присутствует в геномах рыб, амфибий и млекопитающих, но отсутствует в геномах птиц и ящериц [Mezentseva et a!, 2008] Возможным объяснением является отсутствие на сегодняшний день данных о геномах рыб, лишенных гена UCP!, которые могли сформироваться в результате дивергенции их общего предка с некоторыми пресмыкающимися и птицами

Полученные нами данные о необычно маленьком размере повторяющейся единицы рДНК у ящериц (-10- 15 тпн), подтверждают данное предположение, поскольку аналогичный размер мономера встречается только у рыб При этом количество копий рДНК в их геномах достаточно сильно варьирует от -10 у U. stansburiana до 300 у V exant, в расчете на гаплоидный геном, оставаясь, тем не менее, близким в пределах отдельных подсемейств Вероятно, дупликации рДНК в различных классах позвоночных происходили независимо

В настоящее время завершается расшифровка нуклеотидной последовательности генома хордового sea squirt (Сюпа intestinalis) Исследователи прочли пока около 95% генома этой актинии. Геном имеет размер около 450 млн пар оснований и содержит примерно 18 000 белок-кодирующих генов, что вполне сопоставимо с геномами другими животными Одним из следствий расшифровки является следующий неожиданный факт геном человека оказался в целом гораздо более похожим на геном актинии, чем геномы мухи и червя Сходство затрагивает не только набор генов, но и порядок их расположения в хромосомах [Putnam et al, 2007; Dunn et al, 2008]

В свете новых данных более правдоподобным кажется предположение, согласно которому для отдельных классов, а возможно и отрядов современных организмов

существовали свои одинаково древние предковые формы, на уровне полиплоидных хордовых. Из всего выше сказанного видно, насколько сложна и далека от завершения проблема поиска эволюционных связей между позвоночными и их связей с более древними организмами Эта проблема может быть разрешена только путем сравнения нуклеотидных последовательностей ортологичпых областей все новых и новых геномов Одним из удачных подходов к изучению эволюционных связей является сравнительное исследование первичных и вторичных структур внутренних транскрибируемых спейсеров генов рибосомной РНК

выводы

1 Впервые определены размеры мономеров, образующих кластеры рибосомной ДНК в геномах 10 видов чешуйчатых рептилий, которые варьировали от 10 до 15 т п н

2 Установлена степень повторности мономеров рДНК у ряда представителей рептилий, показано, что у ряда ящериц она значительно меньше, чем у всех ранее исследованных позвоночных

3 Показано, что у Uta stansburiana (Iguania) рДНК локализована на одной хромосоме

4 Сравнение нуклеотидных последовательностей ВТС2 15 представителей отряда Squamata между собой выявило различия в размерах и характерные особенности организации этого элемента рДНК у представителей семейства Iguania и Lacertidae

5 Показано, что увеличение размеров ВТС2 у исследованных рептилий является следствием коротких инсерций и локальных дупликаций

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Воронов АС., Шибалев ДВ, Рысков АП, Куприянова НС Эволюционная изменчивость внутреннего транскрибируемого спейсера (ВТС-2) рибосомной ДНК у ящериц Молекулярная биология 2006, 40(1). 45-51

2. Voronov A S , Voronova G А , Kupriyanova N S , Ryskov А Р Molecular-genetic characteristics of lizard ribosomal DNA Herpetologica Petropohtana Proc of the I2th Ord Gen Meeting Soc Eur Herpetol, August 12-16, 2003, Ananjeva N and TsmenkoO (eds), St Petersburg 2005, 105-108

3 Воронов А С, Шибалев Д В, Куприянова Н С Особенности организации кластеров рибосомной ДНК у чешуйчатых рептилий Генетика, 2008, том 44, №11,

4 Voronov A S , Voronova G А , Kupriyanova N S , Ryskov А Р Molecular-Genetic characteristics of lizard ribosomal DNA ,12th Ordinary General Meeting of SocietasEuropaea Herpetologica, St Petersburg, Russia (12-16 August 2003) Abstracts, p 170

5. Воронов А С , Воронова Г A , Шибалев Д В , Куприянова Н С Генно-инженерное получение и характеристика рибосомной ДНК ящериц Генетика в XXI веке современное состояние и перспективы развития III съезд ВОГИС, Москва, Россия (6- 12 июня 2004 г.) Тезисы, стр. 325.

6 АС Воронов, Д.В Шибалев, Н С Куприянова. Эволюционная дивергенция рибосомного межгенного сейсера 2 (ВТС2) рептилий в контексте общей эволюционной изменчивости ВТС2 позвоночных Вычислительная филогенетика и геносистематика Москва, Россия (16-19 ноября 2007 г ) Тезисы, стр 44-51

с 1-6

Заказ № 168/09/08 Подписано в печать 18 09 2008 Тираж 150 экз Уел пл 1,75

ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 www.cfr.rn; е-таИ:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Воронов, Александр Сергеевич

• ВВЕДЕНИЕ

• ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Организация и локализация рибосомной ДНК(рДНК) в геномах эукариот.

2. Строение мономерных единиц рДНК.

3. Экспрессия и процессинг рибосомной РНК (рРНК).

4. Специфические особенности и возможные механизмы эволюции рДНК.

5. Современные концепции эволюции рептилий.

• МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Выделение ДНК

2. Блот-гибридизационный анализ '

3. ПЦР-амплификация

4. Получение рекомбинантных колоний

5. Секвенирование ДНК методом амплификации с терминаторами

6. Автоматическое секвенирование

• РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Структурная организация рДНК ящериц

1.1 Рестрикционное картирование рДНК ящериц

1.2 Определение количества мономеров в кластерах рДНК

1.2.1 Анализ геномной ВАС- библиотеки Uta Stansburiana

1.2.2 Определение количества мономеров рДНК методом ПЦР в реальном времени

2. Структурная организация и изменчивость ВТС2 чешуйчатых рептилий

2.1 Сравнительный анализ первичной структуры

2.2 Сравнительный анализ предполагаемых вторичных структур

• ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

• ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурная организация и эволюция рибосомной ДНК чешуйчатых рептилий подотряда Sauria"

В настоящее время в молекулярной биологии быстрыми темпами идет накопление экспериментального материала по первичной структуре геномной и митохондриальной ДНК различных организмов. Получаемая информация позволяет переводить на молекулярный уровень такие дисциплины как этногеномика, палеогеномика, медицинская геномика, систематика и т.д. Одним из важнейших современных направлений в молекулярной биологии и генетике является изучение изменчивости генетического материала в процессе эволюции.

Первые позвоночные на Земле появились в результате эволюции хордовых, для которых были характерны частые геномные дупликации [McLysagt et al., 2004]. Избыточные гены, образовавшиеся вследствие полиплоидизации, со временем изменялись, приобретая иногда новые функции, подвергались элиминации, гомогенизации нуклеотидных последовательностей, внедрению повторов и эпигенетическим изменениям [Blanc and Wolfe, 2004]. В течение долгого времени считалось, что амфибии произошли от рыб, рептилии - от амфибий, а млекопитающие -от рептилий. Однако за последние полвека накопилось много данных, полученных при изучении останков ископаемых организмов, и эти данные поставили под сомнение традиционную схему.

Одной из основных не решенных проблем является загадка возникновения и эволюции тетрапод. Под тетраподами имеются в виду древние (стволовые) организмы с четырьмя конечностями, не обладающие характерными чертами своих потомков, современных амфибий, рептилий и млекопитающих. Сегодня древних тетрапод представляют как рыбообразных животных с конечностями, снабженными пальцами. Ближайшими родственниками тетрапод из ныне живущих организмов являются двоякодышащие рыбы, например, Tetraodon nigriviridis — пресноводная рыба с самым маленьким из всех известных геномов позвоночных. Сравнительный анализ геномов

Tetraodon и человека привел к идентификации ключевых генов, которые ранее считались отсутствующими у рыб. Эти и другие результаты позволяют предположить, что уже в глубокой древности образовались две основные ветви позвоночных, эволюционное развитие одной из которых привело к формированию класса рыб, а другой - к формированию классов амфибий, рептилий и млекопитающих [Smith and Vos, 2007]. Мало изученным оставался в течение долгого времени процесс формирования ветви рептилий на эволюционном древе. Последние исследования позволяют думать, что класс рептилий занимает заметно обособленную позицию и по многим важным признакам отличается от других таксонов позвоночных. Наиболее известное эволюционное древо рептилий, построенное на основании морфологических признаков, требует пересмотра в свете новых данных, полученных на молекулярном уровне [Hedges and Poling, 1999]. Анализ, проведенный на основании нуклеотидных последовательностей ДНК девяти кодирующих генов, C-mos, RAG1, RAG2, R3S, НОХА13, Jun, альфа-энолазы, амелогенина и MAFB [Vidal and Hedges, 2005], для альфа-, и бета- глобиновых последовательностей [Gorr et al., 1998], и т.д. для таксонов, представляющих главные ветви рептилий, дал результаты, сильно отличающиеся от ранее существующей морфологической классификации.

Гены, кодирующие рибосомные РНК (рРНК), являются необходимым компонентом эукариотической клетки. Информация по размеру повторяющихся единиц рДНК и их представленности в геноме была в основном получена в 70-е - 80-е годы XX века [Dawid, 1980], и с тех пор редко пополнялась. Информация данного типа для геномов рептилий до сегодняшнего дня отсутствует. Нуклеотидные последовательности рДНК являются одним из перспективных объектов для изучения путей эволюции генома. Для рДНК характерно чередование консервативных и вариабельных участков, которые удобно использовать для эволюционных исследований на различных таксономических уровнях.

Для изучения эволюционных связей часто используется участок рибосомного оперона, включающий внутренние транскрибируемые спейсеры предшественников рибосомной РНК, ВТС1 и ВТС2, в особенности ВТС2, содержащий много сайтов процессинга, важных для точного формирования зрелых 18S, 5.8S и 28S рРНК. Более, чем 100 ООО последовательностей ВТС2 депонировано в настоящее время в GenBank. Подавляющее большинство этих видоспецифических последовательностей принадлежит беспозвоночным. Их интенсивно и успешно использовали для филогении и эволюционных сравнений растений, протистов и некоторых беспозвоночных. Не смотря на первое впечатление, что ВТС2 слишком вариабелен, с его помощью можно получать ценную информацию и для таксонов более высокого уровня, благодаря наличию высоко консервативных (консенсусных) последовательностей, обеспечивающих консервативность вторичной структуры соответствующего участка пре-рРНК [Joseph, 1999; Coleman, 2007]. Использование ВТС2 для изучения эволюционных связей позвоночных является сложной задачей в силу их значительной дивергенции по нуклеотидной последовательности и по длине. Однако существование консенсусных сегментов и усовершенствование программ получения потенциальных вторичных структур для протяженных нуклеотидных последовательностей делает решение этой задачи возможным. Для получения более надежных и обоснованных результатов необходимо наращивание информационной базы. На основании вышеизложенного, представляется весьма актуальным получение новых данных по молекулярной организации рДНК рептилий и эволюционной изменчивости ее различных компонентов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Воронов, Александр Сергеевич

выводы

1. Впервые определены размеры мономеров, образующих кластеры рибосомной ДНК в геномах 10 видов чешуйчатых рептилий, которые варьировали от 10 до 15 т.п.н.

2. Установлена степень повторности мономеров рДНК у ряда представителей рептилий, показано что у ряда ящериц она значительно меньше, чем у всех ранее исследованных позвоночных.

3. Показано, что у Uta stansburiana рДНК (Iguania) локализована на одной хромосоме.

4. Сравнение нуклеотидных последовательностей ВТС2 15 представителей отряда Squamata между собой выявило различия в размерах и характерные особенности организации этого элемента рДНК у представителей семейства Iguania и Lacertidae

5. Показано, что увеличение размеров ВТС2 у исследованных рептилий является следствием коротких инсерций и локальных дупликаций.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Воронов, Александр Сергеевич, Москва

1. Вейко H.H., Ляпунова H.A., Богуш A.B., Цветкова Т.Г., Громова Э.В. Определение количества рибосомных генов в индивидуальных геномах человека. Сравнение результатов молекулярного и цитологического анализа. Молекулярная биология, 1996. Т.ЗО, С. 1076-1086.

2. Воронов A.C., Шибалев Д.В., Рысков А.П., Куприянова Н.С. Эволюционная дивергенция рибосомного внутреннего транскрибируемого спейсера 2 (ВТС2) у ящериц. Молекуляр. Биология. 2006. Т. 40. № 1. С. 45-51.

3. Гвоздев В.А. Изменчивость гетерохроматических районов генома эукариот в связи с их возможной биолгической ролью (на примере Drosophila melanogaster).MoneKynflpHafl биология,Т.27, вып.6, С.1205-1217. 1993.

4. Грабовская И.Л., Глухова Л.А., Цветкова Т.Г., Кравец И.А., Мамаева С.Е., Кущ A.A. Использование гибридизации ДНК in situ для идентификации хромосомных перестроек при кариотипировании клеточных линий. Цитология, 1992. Т. 34(7). С. 41-46.

5. Куприянова Н.С., Нечволодов К.К., Кириленко П.М., Капанадзе Б.И., Янковский Н.К., Рысков А.П. Внутригеномный полиморфизм генов рибосомной РНК хромосомы 13 человека. Молек. Биол, 1996. Т. 30(1). С. 51-60.

6. Маниатис Т., ФричЭ., Самбрук Дж., Молекулярное клонирование. М.: Мир 1984.

7. Медников Б.М., Банников A.JL, Ломов А.А., Мельникова М.Н., Шубина Е.А. Рестриктный анализ повторяющейся ядерной ДНК, критерий вида и механизм видообразования. Генетика, 1995. Т. 31, С. 1237-1239.

8. Моргунов СЛ., Гоголевская И.К., Куприянова Н.С., Тимофеева М.Я. Полиморфизм длин рестриктных фрагментов 5'-области спейсера рибосомного повтора быка. Молекулярная биология, 1992.Т. 26, С. 115-129.

9. Нейфах А.А., Тимофеева М.Я. Проблемы регуляции в молекулярной биологии развития.- М.: Наука, 1978. С. 58-70.

10. Носиков В.В., Брага Э.А. 1982. Гены рибосомных РНК. Итоги науки и техники, серия молекулярная биология. 1995. Т. 18, С. 110-215.

11. Рысков А.П., Куприянова Н.С., Капанадзе Б.И., Нечволодов К.К., Позмогова Г.Е., Просняк М.И., Янковский Н.К. Генетика, 1993. Т. 29(10). С. 1750-1754.

12. Сингер М., Берг П. Гены и геномы. М.: Мир, 1998. Т. 2, С.25-39

13. Яровая О.В., Разин С.В. Новые подходы к изучению структурно-функциональной организации эукариотического генома. Молекулярная биология, 1998. Т. 32, С.47-56

14. Яровая О.В., Хенкок Р., Разин С.Р. Доменная организация кластера рибосомных генов млекопитающих. Докл. РАН, 1993. Т.330, С. 120-122.

15. Ahlberg РЕ, Clack JA, Luksevics Е, Blom Н, Zupiijs I.Ventastega curonica and the origin of tetrapod morphology. Nature, 2008. 53(7199): p.l 199-204.

16. Albert F.M., San Mauro D., Garcia-Paris M., Ruber L., Zardoya R. Effect of taxon sampling on recovering the phylogeny of squamate reptiles based on complete mitochondrial genome and nuclear gene sequence data. Gene, 2008. Epub ahead of print.

17. Aleshin V, Vladychenskaya N, Kedrova O, Miliutina I, Petrov N. Secondary structure of hairpin 17 of the lower multicellular animal Rhopalura ophiocomae (Metazoa:

18. Orthonectida) as an example of "punctuated equilibrium" in the evolution of 18S ribosomal RNA. Molecularnaya biologiya, 1999. 33: 319-329.

19. Amemiya CT, Ohta Y, Litman RT, Rast JP, Haire RN, Litman GW.VH gene organization in a relict species, the coelacanth Latimeria chalumnae: evolutionary implications.Proc Natl Acad Sci USA, 1993. 90(14): p.6661-5.

20. Andrea Feller and Blair Hedges. Molecular evidence for the early history of the living amphibians. Molecular Phylogenetics and Evolution 1998. 9: p.509-516.

21. Arisue N, Hasegawa M, Hashimoto T.Root of the Eukaryota tree as inferred from combined maximum likelihood analyses of multiple molecular sequence data.Mol Biol Evol., 2005. 22(3): p.409-20.

22. Arnheim N.,Krystal M.,Schmickel R.,Wilson G.,Ryder 0.,and Zimmer E. Molecular evidence for exchanges among ribosomal genes on non-homologous chromosomes in man and apes. Pros.Natl.Acad.Sci., 1980. 77: p.7323-7327.

23. Battail B, Surkov M V Mammal-like reptiles from Russia. In: Benton M J, Shishkin M A, Unvin D.M., Kurochkin E. N. The Age of Dinosaurs in Russia and Mongolia-Cambridge University Press, Cambridge, 2000: pp 86-119.

24. Benton M.J, Tverdokhlebov VP, Surkov MV (. Ecosystem remodeling among vertebrates at the Permian-Triassic boundary in Russia. Nature, 2004. 432: p.97-100.

25. Benton MJ. Stems, nodes, crown clades, and rank-free lists: is Linnaeus dead? Biol Rev Camb Philos Soc., 2000. 75(4): p.633-48.

26. Blanc G, Wolfe KFunctional divergence of duplicated genes formed by polyploidy during Arabidopsis evolution. Plant Cell, 2004. 16: p. 1647-1649.

27. Bohme M.U., Fritzsch G., Tippman A., Schlegel M., Berendonk T.U. The complete mitochondrial genome of the green lizard Lacerta viridis viridis (Reptilia: Lacertidae) and its phylogenetic position within squamate reptiles. Gene., 2007. 394(1-2): p.69-77

28. Borggrefe T., Wabl M., Akhmedov A.T., Jessberger R. A B cell specific DNA recombination complex. J. Biol. Chem., 1998. 273: p. 17025-17035.

29. Boroviagin A, Gerbi S U3 small nucleolar RNA is essential for cleavage at sites 1,2 and 3 in pre rRNA and determines which rRNA processing pathway is taken in Xenopus oocytes. J. Mol. Biol., 1999. 286: p.1347-1363.

30. Borovjagin AV, Gerbi SA. An evolutionary intra-molecular shift in the preferred U3 snoRNA binding site on pre-ribosomal RNA. Nucleic Acids Res., 2005. 33(15): p.4995-5005.

31. Brock G. J.R. and Bird A. Mosaic methylation of the repeat unit of the human ribosomal RNA genes. Hum. Mol. Genet., 1997. 6: p.451-456.

32. Butler RJ, Goswami A.Body size evolution in Mesozoic birds: little evidence for Cope's rule.J Evol Biol. 2008. Epub ahead of print.

33. Chen T., Zhou M., Walker B. Structural and functional analogs of the novel mammalian neuropeptide, neuromedin S (NmS), in the dermal venoms of Eurasian bombinid toads. Biochem. et Biophys. Res. Comm., 2006. 345: p.377-384.

34. Cheung S.W., Sun L., Featherstone T. (). Visualization of NORs in relation to the precise chromosomal localization of ribosomal RNA genes. Cytogenet. Cell Genet., 1989. 50 (23): p. 93-97.

35. Clack J. Gaining ground: the origin and evolution of Tetrapodes. Indiana University Press, Bloomington, 2002.

36. Clark C.G., Tague B.W., Ware V.C., Gerbi S.A. Xenopus laevis 28S ribosomal RNA: a secondary structure model and its evolutionary and functinal implications.Nucleic Acids Res., 1984.12: p.6197-6220.

37. Coleman AW ITS2 is a double-edged tool for eukaryote evolutionary comparisons. Trends Genet., 2003. 19: p.370-375.

38. Cote C, Greer C., Peculis B Dynamic conformation model for the role of ITS-2 in pre-rRNA processing in yeast. RNA, 2002. 8: p. 786-797.

39. Dudov KP, Dabeva MD, Hadjiolov AA, Todorov BN. Processing and migration of ribosomal ribonculeic acids in the nucleolus and nucleoplasm of rat liver nuclei. Biochem J., 1978 171(2): p.375-83.

40. Estes, R., K. de Queiroz and J. Gauthier. Phylogenetic relationships within Squamata. In: R. Estes and G. Pregill, eds. The Phylogenetic Relationships of the Lizard Families. Stanford University Press, Palo Alto., 1988 . p.l 19-281.

41. Fara E, Benton M.J. The Fossil Record of Cretaceous Tetrapods. PALAIOS; 2000. 2: p. 161-165;

42. Garkavtsev I.V., Tsvetkova T.G., Yegolina N.A., Gudkov A.V. (). Variability of human rRNA genes inheritance and nonrandom chromosomal distribution of structural variants of nontranscribed spacer sequences. Hum. Genet, 1988. 81: p.31-37.

43. Garner P. The fossil record of 'early' tetrapodes: evidence of a major evolutionary transition? TJ Archive, 2003. 17(2): p.l 11-117.

44. Georgiev O.I., Nosikov V.V., Braga E.A., Hadjiolov A.A. Sequence heterogeneity in the internal transcribed spacers of two rat ribosomal DNA clones. Biochem.Int., 1984. 8(2): p. 225-229.

45. Ginisty H, Amalric F, Bouvet P. Nucleolin functions in the first step of ribosomal RNA processing. EMBO J., 1998. 17: p.1476-86.

46. Gonzales I.L., Sylvester J.E. Beyong ribosomal DNA: on towards the telomere. Chromosoma, 1997. 105: p.431-437.

47. Gonzales I.L., Sylvester J.E. Complete sequence of the 43-kb human ribosomal DNA repeat: analysis of the intergenic spacer. Genomics., 1995. 27: p.320-328.

48. Gonzalez I. L., Petersen R., and Sylvester J.E. Independent insertion of Alu elements in the human ribosomal spacer and their concerted evolution. Mol. Biol. Evol., 1989. 6: p.413423. "^

49. Gonzalez I.L., Chambers C., Gorsky J.L., Stambolian D., Schmickel R.D. Sylvester J.E. 0- Sequence and structure correlation of human ribosomal transcribed spacers. J. Mol. Biol., 1990. 212(1): p. 27-35.

50. Gonzalez I.L., Sylvester J.E. Human rDNA: Evolutionary patterns within the genes and tandem arrays derived from multiple chromosomes. Genomics, 2001. 73: p.255-263.

51. Good L, Intine RV, Nazar RN. Interdependence in the processing of ribosomal RNAs in Schizosaccharomyces pombe. J Mol Biol., 1997. 273(4): p.782-8.

52. Gorr T, Mable B, Kleinschmidt T Phylogenetic analysis of reptilian hemoglobins: trees, rates, and divergences. J. Mol. Evol., 1998. 47: p.471-485.

53. Gower D.J. and Weber E. The braincase of Euparkeria, and the evolutionary relationships of birds and crocodilians. Cambridge University Press, Biological Reviews, 1998. 73: p.367-411

54. Grigoryev SA, Bednar J, Woodcock CL. MENT, a heterochromatin protein that mediates higher order chromatin folding, is a new serpin family member.J Biol Chem., 1999. 274(9): p.5626-36.

55. Grummt I, Kuhn A, Bartsch I, Rosenbauer H. A transcription terminator located upstream of the mouse rDNA initiation site affects rRNA synthesis. Cell, 1986. 47(6): p.901-11.

56. Grummt I, Rosenbauer H, Niedermeyer I, Maier U, Ohrlein A. A repeated 18 bp sequence motif in the mouse rDNA spacer mediates binding of a nuclear factor and transcription termination. Cell, 1986. 45(6): p.837-46.

57. Grummt I.Different epigenetic layers engage in complex crosstalk to define the epigenetic state of mammalian rRNA genes.Hum Mol Genet., 2007.16 Spec No l:R21-7. Review.

58. Hanakahi L.A., Dempsey L.A., Li M.-J., Maizels N. Nucleolin is one component of the B cell -specific transcription factor and switch region binding protein, LR1. Proc Natl. Acad. Sei., 1997. 94: p.3605-3610.

59. Hannon GJ, Maroney PA, Branch A, Benenfield BJ, Robertson HD, Nilsen TW. Accurate processing of human pre-rRNA in vitro. Mol Cell Biol., 1989. 9(10): p.4422-31.

60. Hay E.D. and Gurdon J.B. Fine structure of the nucleolus in normal and mutant Xenopus embryos. J. Cell Sei., 1967.2(2): p.151-162.

61. Hedges S.B., Moberg K.D., Maxon L.R. Tetrapod phylogeny inferred from 18S and 28S ribosomal RNA sequences and a review of the evidence for Amniote relationships. Mol. Biol. Evol., 1990. 7: p.607-633.

62. Henderson S, Sollner-Webb B. A transcriptional terminator is a novel element of the promoter of the mouse ribosomal RNA gene. Cell., 1986.47(6): p.891-900.

63. Htun H. and Dahlberg J.E. Topology and and formation of triple-stranded H-DNA. Science., 1989. .243: p.1571-1576.

64. Hughes JM, Ares M Jr. Depletion of U3 small nucleolar RNA inhibits cleavage in the 5' external transcribed spacer of yeast pre-ribosomal RNA and impairs formation of 18S ribosomal RNA. EMBO J., 1991. 10(13): p.4231-9.

65. Jacob S.T. Regulation of ribosomal gene trnscription. Biochem J., 1995. 306: p.617-626

66. Jaillon 0., Aury J.-M., Brunet F. et al. Genome duplication in the teleost fish Tetraodon nigriviridis reveals the early veretebrate proto-karyotype. Nature, 2004. 431: p.946-957.

67. Jiang C, Liao D.Striking bimodal methylation of the repeat unit of the tandem array encoding human U2 snRNA (the RNU2 locus).Genomics,1999. 62(3): p.508-18.

68. Jiang YH, Bressler J, Beaudet AL.Epigenetics and human disease.Annu Rev Genomics Hum Genet., 2004. 5: p. 479-510. Review.

69. Joseph N, Krauskopf E, Vera M., Michot B. Ribosomal internal transcribed spacer 2 (ITS2) exhibits a common core of secondary structure in vertebrates and yeast. Nucleic Acids Res., 1999. 27: p.4533-455.

70. Kaiserman D, Bird PI. Analysis of vertebrate genomes suggests a new model for clade B serpin evolution BMC Genomics., 2005.6: pl57-167.

71. Kaplan F.S., Murray J., Sylvester J.E., Gonzalez I.L., O'Connor P., Doering J.L., Muenke M., Emanuel B.S., Zasloff M.A. The topographic organization of repetitive DNA in the human nucleolus. Genomics, 1993. 15: p.123-132.

72. Kass S, Craig N, Sollner-Webb B. Primary processing of mammalian rRNA involves two adjacent cleavages and is not species specific. Mol Cell Biol., 1987. 7(8): p.2891-8

73. Katzenberg D.R., Tilley S.A., Birshtein B.K. Nucleotide sequence of unequal sister ch romatid exchange site in a mouse myeloma cell line. Mol. Cell Biol., 1989. 9: p. 13241326.

74. Kawai A, Ishijima J, Nishida C, Kosaka A, Ota H, Kohno SI, Matsuda Y.The ZW sex chromosomes of Gekko hokouensis (Gekkonidae, Squamata) represent highly conserved homology with those of avian species.Chromosoma. 2008. Epub ahead of print.

75. Kosushkin SA, Borodulina OR, Grechko YV, Kramerov DA. A new family of intersperced repeats from Squamate reptiles. Molecular Biology, 2006. 40: p.333-336.

76. Krystal M., D'Eustachio, Ruddle F.H., Arnheim N. (). Human nucleolus organizers on homologous chromosomes can share the same ribosomal gene variants. Proc. Natl. Acad. Sci., 1981. 78: p.5744-5748.

77. Kuhn A, Normann A, Bartsch I, Grummt I. The mouse ribosomal gene terminator consists of three functionally separable sequence elements. EMBO J., 1988. 7(5): p. 1497-502.

78. Kupriyanova N., Popenko V., Eisner G., Yengerov Ju., Timofeeva M., Tikhonenko A., Skryabin K.& Bayev A. Organization of loach ribosomal genes (Misgurnus fossilis L.). Molec. Biol. Rep., 1982. 8: p.143-148.

79. La Volpe A., Simeone A., D'Esposito M., Scotto L., Fidanza V.,De alco A., and Boncinelli E. Molecular analysis of heterogeneity region of the human ribosomal spaser. Mol. Biol., 1985. 183: p.213-223.

80. Labella T., Schlessinger D. Complete human rDNA repeat units isolated in yeast artifical chromosomes. Genomics, 1989. 5: p.752-760.

81. Labhart P, Reeder RH. Characterization of three sites of RNA 3' end formation in the Xenopus ribosomal gene spacer. Cell, 1986. 45(3): p.431-43.

82. Lawrence RJ, Pikaard CS.Chromatin turn ons and turn offs of ribosomal RNA genes.Cell Cycle, 2004.3(7): p.880-3.

83. Lindahl L, Archer RH, Zengel JM. Alternate pathways for processing in the internal transcribed spacer 1 in pre-rRNA of Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res., 1994. 22(24): p.5399-407.

84. Long JA, Young GC, Holland T, Senden TJ, Fitzgerald EM.An exceptional Devonian fish from Australia sheds light on tetrapod origins/Nature, 2006. 444(7116): p. 199-202.

85. Mathew C.G. P. Methods in Molecular Biology. Ed. Walker J.M.:N.Y.: Human Press.,1984. 2: p. 31-34.

86. Maxwell ES, Fournier MJ. The small nucleolar RNAs. Annu Rev Biochem, 1995. 64: p. 897-934.

87. Mayer C, Schmitz KM, Li J, Grummt I, Santoro R.Intergenic transcripts regulate the epigenetic state of rRNA genes.Mol Cell, 2006. 22(3): p. 351-61.

88. McKenzie P, Chadalavada SC, Bohrer J, Adams JC. Phylogenomic analysis of vertebrate thrombospondins reveals fish-specific paralogues, ancestral gene relationships and a tetrapod innovation.BMC Evol Biol., 2006. 18: p. 6-33

89. McLysaght A, Hokamp K, Wolfe K. Extensive genomic duplication during early chordate evolution. Nat. Genet., 2002. 31: p. 200-204.

90. McStay B.Nucleolar dominance: a model for rRNA gene silencing.Genes Dev., 2006. 20(10): p. 1207-14.

91. Mezentseva NV, Kumaratilake JS, Newman SA.The brown adipocyte differentiation pathway in birds: an evolutionary road not taken.BMC Biol., 2008. 6: p. 17.

92. Miller D. A., Tantrayahi R., Dev V.G., Miller O.J. Frequency of satellite association of human chromosomes is correlated with amount of Ag-staining of the nucleolus organizer region. Amer. J. Hum. Genet., 1977. 29: p. 490-502.

93. Miller KG, Sollner-Webb B. Transcription of mouse rRNA genes by RNA polymerase I: in vitro and in vivo initiation and processing sites. Cell, 1981. 27(1 Pt 2): p. 165-74.

94. Modisakeng K.W., Amemiya C.T., Dorrington R.A., Blatch G.L. Molecular biology studies on the coelacanth: a review. South African Journal of Sci., 2006.102: p. 479-485.

95. Monk M., Boubelik M., Lehnert S. Temporal and regional changes in DNA methylation in the embryonic, extra-embryonic and germ cell lineages during mouse embryo development. Development, 1987. 99: p. 371-382.

96. Moyzis R.K., Torney D.C., Meyne J., Buckingham J.M., Wu J.-R., Burks C., Sirotkin K.M., Goad W.B. The distribution of interspersed repetitive DNA sequences in the humangenome. Genomics, 1989. 4: p. 273-289.

97. Mukha D.V., Sidorenko A.P., Lazebnaya I.V., Wiegmann B.M. Analysis of intraspecies polymorphism in the ribosomal cluster of the cockroach Blatella germanica. Insect Mol. Biol., 2000. 9: p. 217-222.

98. Nanda I., Zischler H., Epplen C., Gutlenbach M., Schmid M. Chromosomal organization of simple repeated DNA sequences used for DNA fingerprinting. Electrophoresis, 1991. 12: p. 193-203.

99. Naylor S.L., Sakaguchi A.Y., Schmickel R.D., Woodworth-Gutal M., Shows T.B. Organization of rDNA spacer fragment variants among human acrocentric chromosomes in somatic cell hybrids. J. Mol. Appl. Genet, 1983. 2: p. 137-146.

100. Netchvolodov KK, Boiko AV, Ryskov AP, Kupriyanova NS. Evolutionary divergence of the pre-promotor region of ribosomal DNA in the great apes. DNA Seq., 2006.17(5): p. 378-91.

101. Oakes CC, Smiraglia DJ, Plass C, Trasler JM, Robaire B.Aging results in hypermethylation of ribosomal DNA in sperm and liver of male rats.Proc Natl Acad Sci U S A., 2003.100(4): p. 1775-80.

102. Olmo E Different genomic evolutionary rates in the various reptile lineages. Gene, 2002. 295: p. 317-321.

103. Patel VS, Cooper SJ, Deakin JE, Fulton B, Graves T, Warren WC, Wilson RK, Graves JA.Platypus globin genes and flanking loci suggest a new insertional model for beta-globin evolution in birds and mammals.BMC Biol., 2008. 6(l):p.34

104. Pavelitz T, Bailey AD, Elco CP, Weiner AM.Human U2 snRNA genes exhibit a persistently open transcriptional state and promoter disassembly at metaphase.Mol Cell Biol., 2008. 28(11): p. 3573-88.

105. Pedrazzini E. and Slavutsky I.R. Ag-NOR staining and satellite association in bone marrow cells from patients with mycosis fungoides. Hereditas 1991. 123(1): p. 9-15.

106. Planta RJ, Raue HA. Control of ribosome biogenesis in yeast. Trends Genet., 1988. 4(3): p. 64-8.

107. Ragg H, Lokot T, Kamp PB, Atchley WR, Dress A.Vertebrate serpins: construction of a conflict-free phylogeny by combining exon-intron and diagnostic site analyses.Mol Biol Evol., 2001. 18(4): p. 577-84.

108. Ranzani G.N., Bernini L.F., Crippa M. Inheritance of rDNA spacer length variants in man. Mol. Gen. Genet, 1984. 196: p. 141-145.

109. Reddy R, Rothblum LI, Subrahmanyam CS, Liu MH, Henning D, Cassidy B, Busch H. The nucleotide sequence of 8 S RNA bound to preribosomal RNA of Novikoff hepatoma. The 5'-end of 8 S RNA is 5.8 S RNA. J Biol Chem.,1986. 258(1): p. 584-9.

110. Reimers K., Abu Qarn M., Almeling C. et al. Identification of the non-specific cytotoxic cell receptor protein 1 (NCCRP1) in regenerating axolotl limbs. J.Comp.Physiol., 2006.176: p. 599-605.

111. Roesner A, Fuchs C, Hankeln T, Burmester T. A globin gene of ancient evolutionary origin in lower vertebrates: evidence for two distinct globin families in animals. Mol Biol Evol., 2005. 22(1): p. 12-20.

112. Rose K.M., Szopa J., Han F.S., Cheng Y.C., Richter A., Scheer U. Association of DNAtopoisomerase I and RNA polymerase I: A possible role for topoisomerase I in ribosomal gene transcription. Chromosoma, 1988. 96: p. 411-416.

113. Santoro R.The silence of the ribosomal RNA genes.Cell Mol Life Sci., 2005. 62(18): p. 2067-79.

114. Savino R, Gerbi SA. Preribosomal RNA processing in Xenopus oocytes does not include cleavage within the external transcribed spacer as an early step. Biochimie, 1991. 73(6): p. 805-12.

115. Savino R, Gerbi SA.In vivo disruption of Xenopus U3 snRNA affects ribosomal RNA processing.EMBO J., 1990. 9(7): p. 2299-308.

116. Schilders G, Raijmakers R, Raats JM, Pruijn GJ. MPP6 is an exosome-associated RNA-binding protein involved in 5.8S rRNA maturation.Nucleic Acids Res., 2005. 33(21): p. 6795-804.

117. Schlotterer C, Tautz D.Chromosomal homogeneity of Drosophila ribosomal DNA arrays suggests intrachromosomal exchanges drive concerted evolution.Curr Biol., 1994. 4(9): p. 777-83.

118. Schmickel R.D., Gonzalez I.L., Erickson J.M., Nucleolus organizing genes on chromosome 21: recombination and nondisjunction. Ann. N Y Acad.Sci., 1985. 450: p. 121-131.

119. Seperack P., Slatkin M., Arnheim N., Linkage disequilibrium in human ribosomal genes: Implications of multigene family evolution. Genetics, 1988. 119: p. 943-949.

120. Shiraishi M, Sekiguchi A, Chuu YH, Sekiya T. Alteration of mosaic methylation of the repeat unit of the human ribosomal RNA genes in lung cancer.Biol Chem., 1999 380(1): p. 81-4.

121. Smith J.J. & Voss S.R. Gene order data from a model amphibian (Ambystoma): new perspectives of vertebrate genome structure and evolution. BMC Genomics, 2006. 7: p. 219-231.

122. Sylvester J., Petersen R., Schmickel R. Human ribosomal DNA: Novel sequence organization in 4,5 kilobases upstream of the promoter. Gene, 1989. 84: p. 193-196.

123. Thyagarajan B, Lundberg R, Rafferty M, Campbell C.Nucleolin promotes homologous DNA pairing in vitro.Somat Cell Mol Genet, 1998. 24(5): p. 263-72.

124. Tomlinson ML, Field RA, Wheeler GN. A leap forward for chemical genetics. Mol. Biosyst., 2005. 1: p. 223-228.

125. Torchet C, Hermann-Le Denmat S. Bypassing the rRNA processing endonucleolytic cleavage at site A2 in Saccharomyces cerevisiae. RNA, 2000. 6(11): p. 1498-508.

126. Townsend T., Larson A., Louis E., Macey J.R.Molecular phylogenetics of squamata: the position of snakes, amphisbaenians, and dibamids, and the root of the squamate tree. Syst Biol., 2004. 53(5): p. 735-57.

127. Townsend TM, Alegre RE, Kelley ST, Wiens JJ, Reeder TW. Rapid development of multiple nuclear loci for phylogenetic analysis using genomic resources: an example from squamate reptiles. Mol Phylogenet Evol., 2008. 47(1): p. 129-42.

128. Trinchella F, Riggio M, Filosa S, Parisi E, Scudiero R.Molecular cloning and sequencing of metallothionein in squamates: New insights into the evolution of the metallothionein genes in vertebrates.Gene, 2008. Epub ahead of print.

129. Vance VB, Thompson EA, Bowman LH. Transfection of mouse ribosomal DNA into rat cells: faithful transcription and processing. Nucleic Acids Res., 1985. 13(20): p. 7499-513.

130. Vandepoele K, De Vos W, Taylor JS, Meyer A, Van de Peer Y. Major events in the genome evolution of vertebrates: paranome age and size differ considerably between ray-finned fishes and land vertebrates. Proc Natl Acad Sei USA, 2004. 101(6): p. 1638-43.

131. Wahls WP, Wallace LJ, Moore PD.Hypervariable minisatellite DNA is a hotspot for homologous recombination in human cells.Cell, 1990. 60(1): p. 95-103.

132. Yue G.H., Liew W.C., Orban L. The complete mitochondrial genome of a basal teleost, the Asian arowana (Scleropages formosus, Osteoglossidae). BMC Genomics., 2006. 7: p. 242.

133. Zardoya R, Meyer A Complete mitochondrial genome suggests diapsid affinities of turtles. Proc. Natl. Acad. Sei., 1998. 95: p. 1114226-14231.

134. Zhang H, Wang JC, Liu LF.Involvement of DNA topoisomerase I in transcription of human ribosomal RNA genes.Proc Natl Acad Sei USA, 1988. 85(4): p. 1060-4.

135. Zuker M. On finding all suboptimal foldings of an RNA molecule. Science, 1989. 244: p. 48-55.