Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структура, эволюция и филогенетическое значение сателлитной ДНК на примере ящериц родов Darevskia и Lacerta s.str.

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структура, эволюция и филогенетическое значение сателлитной ДНК на примере ящериц родов Darevskia и Lacerta s.str."

На правах рукописи

Чобану Дойна Григорьевна

Структура, эволюция и филогенетическое значение сателлитной ДНК на примере ящериц родов Darevskia и Lacerta s. str. (Sauria:

Lacertidae)

Специальность 03.00.03- молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2003

Работа выполнена в лаборатории эволюции эукариотических геномов Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор В.В. Гречко Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор В.В. Носиков Доктор биологических наук, профессор Г.Е. Сулимова

Ведущая организация: Институт биологии гена РАН

Защита диссертации состоится «. _2003 года в_ часов

на заседании Диссертационного совета Д 002.235.01 при Институте молекулярной биологии

им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Автореферат разослан

2003 года

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук

1W

Актуальность работы , v, ,

Сатешштная ДНК (сатДНК) относится к классу ДНК, содержащих тандемно повторяющиеся некодарующие последовательности. Значительное содержание сатДНК в геноме эука-риот и преимущественно центромерная локализация позволили предполагать, что сатДНК играет важную роль в эволюции видов. Однако вопрос о конкретной роли сатДНК в геноме эукариот остается до сих пор открытым. Прямолинейные представления о том, что эта роль определяется их локализацией, были скомпрометированы рядом противоречивых работ и привели к возникновению другой крайней гипотезы о том, что подобные структуры являются «мусорными». Тем не менее, из дальнейших исследований становится очевидным, что сатДНК является молекулярной структурой, обладающей регуляторной активностью, в частности, благодаря воздействию на пространственную организацию хроматина. Кроме того, все большее число работ свидетельствуют о взаимосвязи дивергенции сатДНК и дивергенции биологических видов. Существующие эволюционные модели сатДНК, призванные объяснить подобную корреляцию, рассматривают взаимодействие целого ряда молекулярных механизмов как с точки зрения воздействия естественного отбора, так и вне его действия.

Возможность использования сатДНК, по крайней мере, в качестве молекулярного маркера для изучения филогении биологических видов, привлекает все больше внимания. Особенно важны и актуальны конкретные исследования взаимосвязи эволюции таксонов и сатДНК с привлечением возможно большего набора элементарных единиц эволюции. Такие работы предпринимались для некоторых таксонов животного мира, однако в литературе практически отсутствуют данные о структуре, эволюции и взаимосвязи с видообразованием такого огромного, но слабо изученного таксона как рептилии, и, в частности, отряда чешуйчатых рептилий - ящериц (Sauna) (обзор Capriglione, 2000). Наша работа посвещена изучению сатДНК широкого набора видов яптериц двух родов сем. Lacertidae (Sauna).

Цель и задачи исследования

Цель этого исследования заключалась в детальном анализе структуры и эволюции семейства тандемных некодирующих повторов (CLsat), ранее обнаруженных у ящериц «комплекса Lacerta saxícola» (ныне род Darevskia), и также другого семейства (Agil60) характерного для ящериц рода Lacerta s. str. того же сем. Lacertidae. Предстояло оценить, имеется ли видоспецифичная корреляция эволюции сатДНК и биологических видов. Были сформулированы следующие задачи: 1) клонировать и секвенировать повторяющиеся единицы тандемных повторов указанных сатДНК. 2) провести сравнительный внутри-и межвидовой анализ структуры мономеров; 3) определить степень специфичности повторов

на внутривидовом, межвидовом и родовом уровне исследуаМЦШ iCMlHumu виптппий; .4) с

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ I

НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА

помощью сравнительного анализа сатДНК двух разных родов ящериц, имеющих разную историю развитая, определить степень корреляции эволюцией сатДНК и биологических видов; 5) выявить особенности структуры, которые позволяют судить о молекулярных механизмах эволюции исследуемой сатДНК, их влияние на темпы и видоспецифичную корреляцию с эволюцией исследуемых организмов.

Научная новизна и практическая ценность работы

Впервые были выделены и охарактеризованы два семейства тандемных повторов (сател-литной) ДНК рептилий. Проведен сравнительный анализ эволюции сатДНК на примере комплекса «молодых» видов рода Darevskia, дивергенция которых происходит последние 15 тыс. лет, и комплекса видов рода Lacerta s. str., дивергировавших более 5 млн. лет назад. Благодаря возможности изучать быстро эволюционирующие биологические виды рода Darevskia, впервые была исследована динамика эволюции сателлитной ДНК в рамках короткого эволюционного периода. Показаны видоспецифичность (апоморфные свойства) и одновременно родоспецифичность (синапоморфные свойства) развития двух разных семейств сатДНК, независимо от того, какой возраст имеет эволюция биологических видов, содержащих ее. Наши данные позволяют предположить, что эволюция исследованной нами сатДНК подвержена воздействию естественного отбора. Обнаружено сходство между двумя разными родоспецифичными семействами сатДНК, дивергировавшими, вероятно, не менее 25 млн. лет назад. На основании анализа предложены пути и механизмы эволюции исследованной сатДНК, приводящие к ее видоспецифичности.

Результаты исследования имеют ценность для выявления закономерностей эволюции сатДНК и их взаимосвязи с эволюцией биологических видов, что позволяет, в свою очередь, оценить информативность сатДНК в качестве молекулярного маркера для исследования филогении видов. Данные представленной диссертационной работы являются новым научным-материалом, необходимым для восполнения общего объема информации, на основании которой могут быть сделаны выводы о значении сатДНК. Приведенные здесь выводы, могут быть использованы для системного изучения любых других таксонов. Таким образом, наша работа, кроме результатов по молекулярной структуре и эволюции сатДНК рептилий, содержит информацию, имеющую важное прикладное значение в области общей биологии как способствующая разработке систематики рептилий на основе филогенетически значимых молекулярных маркеров.

Апробация работы

Материалы работы были представлены на следующих международных конференциях: Международный Симпозиум «Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология» (Москва, 18-21 ноября 2001; Минск, 22-24 ноября 2001); 3-й Международный Симпозиум «Эволюция, генетика, экология и биоразнообразие» (Владивосток, 24-30 сентября 2001), 12-й Международный герпетологический конгресс (Ст. Петербург, 12-16 августа 2003)

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на /^страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы ^"/наименований). Диссертация содержите^/ рисунков и /«^таблиц.

Результаты и их обсуждение I. Структура и эволюция сателлитной ДНК семейства CLsat ящериц рода Darevskia. 1. Структура мономера CLsat

Семейство тандемных повторов ДНК, CLsat, ящериц рода Darevskia (ранее «комплекс Lacería saxícola») было впервые выделено из геномной ДНК вида D. saxícola в нашей лаборатории (Гречко и соавт., 1998; Рудых и соавт., 1999). В представленной работе определена и проанализирована структура последовательностей мономеров этого семейства ДНК у 21 вида этого рода, в том числе у нескольких партеновидов (табл. 1).

Мономеры семейства CLsat обладают одинаковой длиной и сходной «внутренней структурой» повторяющейся единицы, а также составом и распределением А+Т и G+C (рис. 1). Наряду с этим, вариабельность нуклеотидной последовательности мономеров внутри сател-литного семейства достаточно высока, достигая 30%. На основании 60 диагностических позиций, образовавшихся в результате однонуклеотидных замен, можно выделить, по крайней мере, четыре подсемейства CLsat-повторэ (CLsatl, П, Ш, IV) (рис. 1). Это подтверждает и кладограмма консенсусных последовательностей CLsat (рис. 2). Каждое из подсемейств CLsat отличается разными темпами эволюционирования и уровнем внутривидовой гомогенизации. Однако наличие упомянутых выше высококонсервативных черт мономеров CLsat, и ряда консервативных участков длиной от 20 до 50 п.н. с более высоким уровнем сходства (82-95%) между разными подсемействами, указывают на общее происхождение мономеров CLsat (рис. 1). Это находит подтверждение и при сравнении косенсуов каждого подсемейства

с общим консенсусом семейства и позволяет объединить их в одно семейство (табл. 2), несмотря на отсутствие перекрестной гибридизации (рис.3 в диссертации).

Таблица 1. Исследование виды ящериц и место сбора представителей вида. П - парте-иовиды._

Аббре- № дота // Названия видов Место сбора

виатура № лунки Род Darevskia

alp D alpina Россия, Кабардино-Балкария, Баксанское ущелье, п. Азау

агш D. armeniaca - П Армения, Тэж

D. armeniaca Армения, оз. Севан

ben D. bendimachiensis-H Турция, Мурадие

cau D caucasica Россия, Кабардино-Балкария, Голубые озера, ущ р.Черек

сЫ D. chlorogaster Азербайджан, окр. Дашдадьюк, лес

cía D. clarkorum Турция, Магден

dag D daghestanica Россия, Дагестан, с. Кварчи

dah D. dahll- П Армения, Дилижан; Шагали

der D derjugini derjugini Грузия, Ахалдаба

D derjugini abhazica (baranfí) Грузия, Аджария, Батуми

diy D dryada Грузия, Аджария, Гиргами

lm D lindholml Украина, Крым, Ялта

mix D mixta Грузия, Ахалдаба

nai D nairensis Армения, Лчап

par D. parvula Грузия, Аджария, Батуми

D. parvula Грузия, Ахалдаба

por D. portschinskii Армения, Гош

pra D. praticola pontica Россия, Сочи

D. praticola praticola Россия, Кабардино-Балкария, Голубые озера

rad | D raddei Армения, Гош

D. raddei Юго-Восток Азербаджана, Окрестности Доб-ачач

ros D. rostombekovi- П Армения, Гош

rud D. rudis obscura Грузия, Ахалдаба

sap D. sapphirina — П Турция, Патнос

dar D. saxícola darevskia Россия, Сочи

szc D. saxícola szaerbatí Украина, Крым, Анапа

uní D. unisexualis- П Армения, Лчап

uzz D. uzzeli - П Турция, Хорасон

val D valentim Армения, Лчашен

Род Lacerta s. str.

vir vir 1 // 1-3 L viridis viridis Украина, Днепропетровск

med 2 // 4 L media Армения, Аранлер

str 3 II 5,6 L strigata Армения, оз. Севан

str 3 // 7 L strigata Россия, Дагестан, Махач-кала

a che А II % L agilis chersonensis Белорусия, окр. Минска

a che А II 9 L agilis chersonensis Россия, окр. Ст.-Петербурга

a agí 5 // 10 L agilis agilis Германия, Дармштадт

a exi А // 11 L agilis exigua Россия, Липецкая обл.

a exi А // 12 L. agilis exigua Россия, Астрахань, село Соленое

a exi А // 13 L agilis exigua Россия, Кабардино-Балкария, Нальчик

a. bre 6 // 14 L agilis brevicaudata Армения, Арагац, Кучак

a boe 7 // 15,16 i agilis boemica Россия, Кабардино-Балкария, Нальчик - 2 экземпляра

a gru 8 // — L. agilis grusmica Россия, Адлер

Род Podareis

11 P táurica taunca Украина, Крым, Ялта

12 P campestris Италия, Пескичи

13 P. tiliguerta Италия, Сардиния, пров. Нуоро, Мокге-Альбо

14 P. muralis brugeri Италия, Тоскана, Рустичи

15 P. muralis nigriventris Италия, Волтерра

Род Zootoca

16 Z. vivípara Россия, окр. Ст.-Петербурга; Белорусия, Гродно

и«111>ви№1ишшаимс|<Ш1|«сЕ'Н»>с>

1М > м •

«ШИчиитмвмцитиш^

Рис. 1. Структура мономера СЫ(. Прямое выравнивание последовательностей видовых консенсусов четырех подсемейств С1лл(.

Названия видовых консенсусов даны в левом столбце в виде аббревиатуры, расшифровка в табл.1. Желтым, зеленым, голубым и лиловым указаны соответственно СЬваИ и диагностические позиции. Консервативные участки между мономерами разных подсемейств

обозначены лиловой рамкой и оттенками серого] обозначены красным в верхнем консенсусе. Производные |

обозначены сиреневым в нижнем консенсусе. Черными рамками обведены сайты специфичной эндонуклеазы

м.

93j >unila

¡-Р-хМ

L >nail jaajxupi j >szcl ' >darl

CLsatI

JM_

CLsatXV

Щ 21

30 28 41

>derl >Unl

>mixl >dal >dryl

>rudl

>yM (TiTi >arml W

>dahl CD®

>Г081фф

>radl >porl

CLsatXXI

97

54

54

-6SJ i >dry3

'>mix3 ->lin3

- >der31

- >der32

_SSJ

CLsatII

,„„ I->cau2

>cla22 2Ч>щ|Ж2 >dah2 >arm2

— >ros3 ®®

- >рагЗ

42

- >dag2

>cla21

- >pra2

- >)in4

Рис. 2 Кладограмма видовых консенсусных последовательностей четырех подсемейств CLsat. Расчеты производили с помощью программы Тгеесоп, использовали метод ближайшего соседа и алгоритмы Jin and Nei (1990) и Kimura (1980). Партеновиды указаны с помощью знака®®.

Таблица 2. Уровень сходства, в %, между консенсусами подсемейств и общим консенсусом СЬваЬ- семейства.

CLsatI CLsatll CLsatlll CLsatIV

CLsat 86 82 86 78

делеции 0 1 1 2

CLsatI 80 77 77

делеции 0 2 2

CLsatll 78 73

делеции 2 2

CLsatlll 79

делеции 2

ПРИМЕЧАНИЕ: Значения сходства и делеций не учитывают отсутствие участка в 30 п.н. у lin4 = CLsatTV.

б

Единица СЬва! насыщена многочисленными короткими палиндромами, которые образуют 26 рестрикиионных сайтов (Рудых и соавт., 1999, 2002). Тем не менее, только два из них (Нтсйи и ТацУ) выделяют мономеры длиной 145-146 п.н., с лестницеобразным паттерном димеров, тримеров, и т.д., даже после исчерпывающего гидролиза (рис. 3). Сайты узнавания этих двух рестриктаз являются консервативным признаком для семейства СЬва^ несмотря на то, что высокомолекулярные и олигомерные полосы образуются, вероятно, из-за утраты ре-стрикционного сайта в результате единичных замен. Характерно, что при потенциальном наличии двух Нм<ЛП и двух Тац\ маркирующих рестрикционных сайтов в одном мономере, три из них непременно деградированы в случае подсемейств С1,за<1 и СЬэаШ. Однако у некоторых мономеров сателлита СЬваШГ могут присутствовать одновременно по одному не мутированому НгпсШ- и Таф.- сайту (рис. 1, рис. 3).

2. Организация семейства повторов ДНК СЬваЬ

Рестрикционный анализ показал, что мономеры первого и второго семейства СГ^ выделяются специфично Taq\ и НтсПП, соответственно (рис. 3,1). Мономеры СЬзШ1 могут быть выделены и НтШ\- и Тад1- рестриктазой, а мономеры СЬэМУ - 7Ъ</1-рестриктазой. Замечено, что при Саузсрн-гибридизации, после расщепления «специфичной» рестриктазой, содержание большого количества определенного подсемейства СЬва! в геноме сопровождается присутствием лестницы ярких полос от мономеров до гексамеров, а содержание высокомолекулярных кластеров невелико (рис. 3). При этом «неспецифичная» рестриктаза выделяет в основном димеры и большое количество высокомолекулярных кластеров. В то же время подсемейства, представленные небольшим количеством копий, при расщеплении «специфичной» рестриктазой более не образуют олигомерной лестницы, будучи представленными высокомолекулярными кластерами. Следует заметить, что процесс «деградации» ассоциирован с утратой «специфичного» сайта рестрикции и более низким темпом гомогенизации для определенного подсемейства сателлитной ДНК и, наоборот - в случае доминирующего подсемейства. Таким образом, межвидовой анализ организации семейства СЬва! и его подсемейств на основании рестрикционных паттернов позволяет заключить, что СЬва1 повторы претерпевают ступенчатую форму эволюции, характеризующуюся чередованием процессов накопления мутаций и амплификации в определенные временные периоды эволюции сателлитной ДНК.

3. Молекулярные механизмы, участвующие в эволюции ДНК семейства СЬ$а(

Механизмы возникновения и эволюции сателлитной ДНК неоднократно обсуждались в литературе (обзор О1аг1ез\У0гЙ1 е1 а1., 1994). Анализ структуры сателлитной ДНК разных таксонов, как правило, выявляет существование подструктур и надструктур в организации

Hindi II

f-Vt

»

Ш

- ISO n.H.

(dcpmidpvir umdd I d I d ps cdcpmadpvnrurraddldps t dcpni dp vn r u r rid d 1dpi laartraoaaanouleal a t г а с laariraoaaanoulealrac laariraoaaanoulealrac aguaxmbrlldlsdprrn г n у r z l(«I iMhr I I d t Idpr r ifri aguaxmhrlldisdprrnyrz

TaqI

•»

-150 пл.

Рис. 3. Саузерн-гибридизация ДНК ящериц йагеузЫа с зондами сатДНК СЬм!. Гибридизация при 65°С, отмывка 55°С. Названия видов даны вертикально (между верхним и нижним рядами паттернов) в сокращенном виде. Полное название видов дано в табл. 1.

56,6%

ям

Рис. 4. Внутренние повторы мономера СЬ$а1, локализация и уровень сходства. Под нуклеотидной последовательностью мономера буквами выделены гомополимерные А- и Т-мотивы, в основном, фланкированные С/С-основаниями. Линиями одинаковой интенсив-ности и размера обозначены более длинные прямые внутренние повторы. Степень сходства указана в процентах.

тандемных семейств (Kapitonov et al., 1998; Borovkov AY et al., 1993; сМотри для обзора приложение в диссертации). Зачастую ныне зафиксированная повторяющая единица состоит из субъединиц, кратных другим внутренним повторам, в разной степени вырожденным, коро-вую последовательность которых чаще всего составляют гомополимерные тракты (Horz and Altenburger 1981; Stephan 1989). Наиболее логичной и обоснованной является гипотеза, что при возникновении повторов, а также в процессе их дивергенции задействованы дупликации коротких фрагментов и скользящая репликация (Schlotterer,Tautz 1992).

Таким образом, существование коротких гомополимерных трактов наряду с более длинными, в разной степени деградированными, внутренними повторами мономеров CLsat, может свидетельствовать о первоначальной роли скользящей репликации в возникновении этого семейства сателлитной ДНК (рис. 4). Возрастающий уровень дивергенции более длинных внутренних повторов свидетельствует о том, что однонуклеотидные замены и инсер-ции/делеции играют значительную роль в дивергенции и эволюции повторяющихся единиц семейства CLsat. Следовательно, однонуклеотидные замены, - индели, - случайно возникающие в мономере, в дальнейшем, благодаря механизмам гомогенизации, фиксируются в виде новых вариантов повтора, образуя подсемейства существующего семейства. Это хорошо согласуется с моделью концертной эволюции (Dover 1982), предполагающей динамическое взаимодействие нескольких молекулярных механизмов в процессе эволюции тандемных повторов ДНК. Суммарная направляющая эволюционного вектора зависи i от частоты воздействия того или иного молекулярного механизма, и соотношения этих частот. Повышенный темп накопления мутаций и низкий уровень гомогенизации приводят к повышению внутривидовой вариабельности и снижению видоспецифичности повторов, а повышенный темп накопления мутаций, наряду с высокой частотой генной конверсии и амплификации, могут привести к «замене» одного варианта повтора на другой. В случае CLsat-повторов наблюдается достаточно высокий темп накопления мутаций в сочетании с высоким темпом гомогенизации, о чем косвенно свидетельствует образование четырех подсемейств CLsat и ви-доспецифичность этих повторов внутри каждого из подсемейств.

Более детальный анализ мономеров CLsat, с помощью моделей Смита и Стефана (Smith 1976; Stephan 1989) также свидетельствует в пользу представления о взаимодействии нескольких молекулярных механизмов в эволюции этого сателлитного семейства. Модель Стефана показывает, что формирование более длинных повторяющихся единиц пропорционально снижению частоты рекомбинационных событий. Он также обнаружил, что длина гомополимерных трактов, встречаемых в составе субъединиц повторов, никогда не превышает длину гомологичной последовательности, необходимой для рекомбинации. Мономер CLsat изобилует подобными гомополимерными трактами. Соотношение длины и уровня диверген-

ции существующего ряда внутренних повторов CLsat иллюстрирует преобладающую роль событий накопления мутаций над событиями рекомбинации. Таким образом, снижение частоты рекомбинации мономеров CLsat может быть связано либо с их локализацией в зонах, препятствующих этому событию, таких как перицентромерный, центромерный и теломер-ный гетерохроматин, либо является следствием высокого темпа накопления мутаций, что не исключает одновременого воздействия этих факторов.

3. Темпы эволюции сателлитной ДНК семейства CLsat

С целью выяснения темпов эволюционирования CLsat-ДНК, мы провели анализ вариабельности 270 последовательностей мономеров CLsat у 21 вида ящериц. Как уже указано, вся масса последовательностей может быть разделена как минимум на четыре подгруппы (подсемейства), обладающие как объединяющими, так и различающими их признаками. На рис. 5 представлены выровненные консенсусные последовательности мономеров четырех CLsat подсемейств, полученные на основании 4-15 мономеров для каждого подсемейства у каждого вида ящериц. Внутривидовая вариабельность нуклеотидных последовательностей каждого подсемейства CLsat в среднем составляет 0-5%. Дивергенция последовательностей видовых консенсусов внутри одного подсемейства CLsat достигает 5-15%, в то время как между подсемействами достигает 25%, в ряде случаев - 30%. Соотношение внутри- и межвидовой дивергенции внутри одного подсемейства, в подавляющем большинстве случаев ниже единицы. При этом уровень вариабельности видовых консенсусов внутри одного подсемейства CLsat прямо пропорционален уровню внутривидовой дивергенции повторов. Так, в подсемействе CLsatll обнаруживается самый низкий уровень вариабельности повторов. Подсемейство CLsatI характеризуется более высоким уровнем гетерогенности повторов и склонностью к образованию групп более сходных мономеров. Подсемейству CLsatHI свойственен самый высокий уровень дивергенции мономеров, отчасти из-за длинных делеций и инсерций. Отметим, что подсемейство CLsatlV обнаружено пока всего лишь у одного вида этого рода - D. hndholmi, являющегося эндемиком Крымского полуострова и занимающего, таким образом, отделенный Черным морем от кавказских видов ареал. Оно охарактеризовано на основании 11 мономеров.

Как свидетельствуют данные литературы, темпы эволюционирования разных семейств сателлитной ДНК варьируют, и как предполагает модель концертной эволюции, также зависят от динамики взаимодействия механизмов реорганизации ДНК (Dover, 1982; Ohta and Dover, 1984). Если принять, что скорость накопления мутаций у всех подсемейств CLsat одинакова, то разный уровень вариабельности повторов трех подсемейств свидетельствует о разных темпах гомогенизации и/или о разном времени их возникновения. Образование и

Ю

СХваЯ

ГОЯ1

ГВ41 йаН1 акт уа11

* к«

гтооаишмтсслтасг

..........т........-.д. М(

....................а. 14«

..........Т.........С. 14С

. .«.......Ь.........V. м<

. .......Т..........14«

..9.......Т...........Ш

. -а.......ь...........х«с

..........Ь..........14«

......................М(

......................мс

......................зле

......ст...........-е. мз

......о.............9.14«

......с.............е. и«

...................С..146

. .Л...............С. .Х4в

. -А................С. .14*

..Я................С..МС

............ .т........мс

«щи

ЙШ1

■ гс1 сЫ.1

с1*Х ■1x1 . Лес!

СЬзаШ

.а:.....

.с. .с.е..

.ЗМб

.яля

. 14 О .148

20 * 40 * 80 '00 * 100 220

СХв^Щ^стхсАТгтпвсхб^театсАСТгтвсмтс сзктьмыылвстстеттгг аш^мс^сьтдгвшбттст тсвтв хетте спроса тгсыза .........тс...................сг..............ст....т. С....в ЛС...А..............................егт.т .-...

.............хл....

.т...........с.с л.т

.Агсилссггьт.

.Т.. .АС ..Л.. €0

ЗЛО * 160 •

бсс^ммм1ги'те0тгд8бма<итт»тутгттат

. А....С.-147

........-14«

Т.Т.....-159

......Т132

.......-14в

Тв ......-146

..С . .6-154

. Акт-. ,т.....б

. Шд..

.121 .121 .119 .ив .ш .ив .118 .на .118 .118 .103

Рне. 5. Межвидовая вариабельность консенсусных мономеров внутри каждого подсемейства. Консенсус каждого подсемейства расположен над выровненными последовательностями мономеров. Идентичные нуклеотиды даны в виде точек, вариабельные сайты обозначены буквами, делении указаны штрихом.

И

консервация трех мажорных видоспецифичных вариантов сателлита за относительно короткий срок дивергенции видов (предположительно за 10-15 тыс. лет) указывает на крайне высокий темп эволюционирования СЬва^ДНК. Анализ внутри и межвидового уровня дивергенции последовательностей СЬэаг всех трех подсемейств, свидетельствует в пользу представлений о концертной эволюции этого семейства сателлитной ДНК.

5. Динамика количественного распределения повтора СХва1 у видов рода ОагемЫа

Наряду с высокой нуклеотидной гетерогенностью семейства СЬва^ приведшей к образованию подсемейств повтора, обнаружено, что по паттерну содержания и количества мажорных вариантов С!^ в геноме виды существено различаются (рис. 6).

chl alp sTC dar tad njd nal por val ün dnj cla mix dag cau der pra par

Рис. 6. Содержание CLsatI, CLsatlI и CLsatlII в геноме двуполых видов рода Darevskia.

Черным, белым и темно-серым столбцами указано содержание первого, второго и третьего подсемейства CLsat в геноме каждого вида. Названия видов даны в виде абревиатур ниже диаграммы. Абсцисса указывает значения условных процентах единиц, полученных из расчета количества светоточек после сканирования радиоактивного сигнала с помощью устройства Phosphoimager и обработки данных с помощью программы OptiQuant.

Модели, призванные объяснить динамику флуктуаций содержания определенного варианта повтора, зачастую оперируют такими молекулярными механизмами, как неравный и равный кроссинговер. Авторы Стефан и Чо (Stephan and Cho, 1994) одной из таких моделей использовали компьютерное моделирование для исследования вариации копийности аллелей, межповторной вариабельности и длины мономера в зависимости от коэффициента рекомбинации. В свете этой модели уровень сходства в 70-75% между подсемействами CLsat достаточно низок, чтобы предотвращать частые рекомбинационные процессы и, таким образом, это не препятствует накоплению определенного варианта. В то же время существование участков длиной 50 п.н. с 85-95% сходством и 20 п.н. с 90-95% сходством между мономерами разных подсемейств в геноме одного вида ящериц может привести к обменным процессам между разными вариантами повторов. Присутствие в геноме одного вида ящериц нескольких вариантов повтора CLsat в разной пропорции свидетельствует или о «блокировании» рекомбинационных событий, или о том, что эти события происходят редко, что в итоге

влияет на процесс фиксации определенного варианта или его исчезновения.

На основании полученных данных, представленных здесь в виде гистограммы, отражающих содержание повторов CLsat в геноме одного вида в условных процентах единицах, была предложена гипотеза филогении видов рода Darevskia и филогении повторов CLsat. В системе двуполых была вьивлена корреляция наследования определенного подсемейства CLsat и историко-географического распространения популяций этого рода с последующим видообразованием Так, мы предполагаем, что существующая группа видов с преобладающим содержанием CLsatI, скорее всего, ведет свое происхождение от вероятно наиболее древнего вида D. chlorogaster, обитающего в реликтовых лесах долины Ленкорань; другая группа, в геноме которых содержатся все три подсемейства в разных соотношениях, родственна другому реликтовому виду, D. dryada, обитающему в Колхиде, который обладает всеми тремя подсемействами последовательностей. Так данные количественного распределения CLsat, кладограм CLsat, отражающих филогенетическое родство видов Darevskia и историко-географические сведения позволили построить гипотезу филогении видов этого рода, представленную в диссертации.

6. Сетчатая эволюция партеногенетических видов рода Darevskia на примере CLsat са-теллитной ДНК

Сравнение двуполых и однополых видов рода на основании данных по последовательности и количественному содержанию повторов CLsat в геноме подтверждает сетчатый путь эволюции партеновидов, предложенный ранее Даревским и Аззеллом (Darevsky, Uzzell, 1975), на примере двух партеновидов - D. armeniaca и D. dahli. Нами показано методом ДНК-гибридизации, что оба партеновида, так же как и некоторые двуполые, содержат все три подсемейства повторов (рис. 7). При сравнении последовательностей CLsat, индивидуальные мономеры и видовой консенсус CLsatI D. armeniaca практически не отличаются от консенсуса D. valentim, a CLsatll - от D. mixta (рис. 8). Видовой консенсус CLsatI D. dahli идентичен консенсусу D. portschinskii, a CLsatll - D. mixta. Следует отметить, что мономеры CLsatI близкородственных D. raddei и D. rudis также весьма сходны с CLsatI обоих партеновидов, отличаясь от них всего на 1-2 замены. По структуре CLsatll также близки родственные D. dryada и D. clarcorum, отличающиеся от партеновидов на 1-3 замены. В геноме партеновида D. unisexualis содержится в большом количестве (2*105 копий/гаплоидный геном) преимущественно подсемейство CLsatI (рис. 7). Часть последовательностей мономеров CLsatI D. unisexualis высокосходны с D. chlorogaster и D. nairensis, другая часть с D. rudis (рис. 8). В геноме остальных четырех партеновидов обнаружены в преобладающем количестве подсемейства CLsatI и CLsatlll, как это характерно для двуполых D. valentim и D. portschinskii. Однако

из них только у партеновида D. rostombekovi определена последовательность CLsatl, которая сходна с последовательностями близкородственных -D. raddei, D. portschinskii и D. valentini. При филогенетическом анализе мономеры CLsat партеногенетиков и перечисленных двуполых видов образуют конспецифические кластеры на кладограммах (рис. 2).

180

Рис. 7. Содержание CLsatl, CLsatlI и CLsatlII в геноме партеновидов и вероятных родительских двуполых видов рода Darevskia. Названия партеновидов выделены серым фоном, далее смотри подписи к рис. 6.

ferl ■acl . *>rl .

гш .

. с... с.......с........

.. Б.С ...С ... .

, СЕ е.. С . С

. т .я ».с*.. ..

Рис. 8. Сравнительный анализ консенсусных мономеров CLsat партеновидов и двуполых видов Darevskia. Последовательности консенсусов партеновидов расположены между консенсусами двуполых видов и обозначены жирным шрифтом заглавными буквами. Идентичные нуклеотиды по отношению к консенсусу партеновида даны в виде точек, вариабельные сайты указаны буквами.

Сравнение паттерна количественного содержания и сходства мономеров двуполых видов по отношению к партеновидам указывает на возможность участия предшест веников современных наиболее близкородственных двуполых видов в образовании одного партеновида. На основании анализа этих данных построена следующая схема сетчатой эволюции однополых видов Darevskm: Партеновиды Двуполые виды

D armemaca = D valentini х D. mixta (D. clarkorum, D. dryada) D. dahli = D. portschinskil (D. valentini) x D. mata (D. dryada, D clarkorum)

D. unisexuahs - D nairensis (D. chlorogaiter) x D. rudis D. rostombekovi ~ D. raddei x D portschinskii(D. valentini)

D. uzzelli ~ 1идизации

Таким образом, на уровне сравнения структуры их сатДНК, нами показана принципиальная возможность происхождения партеновидов путем межвидовой гибридизации двуполых видов, однако детальное исследование родительских пар требует дальнейшего изучения.

II. Сателлитная ДНК семейства Agil60 ящериц рода Lacerta sensu stricto 1. Общая характеристика Agí 160-семейства

Другое семейство сатДНК, Agí 160, обнаружено также с помощью таксонопринтного анализа (Гречко и соавт.,1998) и далее выделено и исследовано у ящериц рода Lacerta s. str. (Чобану и соавт., 2003), недавно объединявшихся в один род Lacerta с видами Darevskia. Сейчас род Lacerta s. str. (иначе «комплекс L. agilis») включает, по крайней мере, пять видов: L. agilis, L. strigata, L. viridis, L. trilineata (media), L. shreiberi (Harris et al, 1998, 1999). С помощью гибриди {анионного анализа показана тандемная структура Agil 60 ДНК (рис. 106), а также определено его содержание в геноме четырех видов этого рода, однако в геноме близкородственных ящериц родов Darevskia, Podareis, Zootoca и в ряде видов более отдаленных родов, несмотря на мягкие условия гибридизации (58°С), Agil60 не обнаружено (рис. 10а). Структура нуклеотидной последовательности мономеров Agil60 исследована у двух видов рода: L. agilis (exigua и boemica) и L. strigata. Эти данные позволили выявить некоторые закономерности структуры и эволюции этого семейства повторов, которые оказались сходными с таковыми для семейства CLsat. Так, длина мономеров составляет 138-164 п.н., варьируя за счет разного числа 10 п.н. повтора (рис. 11). Нуклеотидный состав последовательностей Agil60 слегка обогащен AT (60 %), направленность нуклеотидных замен также приводит к преобладанию трансверсий над транзициями с наиболее частыми С/Т-транзициями. Анализ

D. sapphyrina D. bendimachiensis

внутренней структуры мономера выявил многочисленные короткие А- и Т-гомополимерные треки и более длинные вырожденные «повторы» (рис. 116).

Agiieo CLsafcl

Hg Q.Ol 91 I Г I« Ida 10Ш О п Ml й-1 I Г II W IM t

'42'c |*Ц

т—г—J—з—5—i ri—

9 10 II II 13 14 IS It

i' Ii

*

S7'C

9 Iff ti 12 I) IJ К I« I? te 19 20 2» 22 21 24 15 I* 27 2» 24 XI» «I Э2

J*_»♦

* 4M*

Ь X ^rA m

I 2 3 4 5 4 7 8 9 10 II 12 13 14 15 t(>

- S3'c

.-320 bp --160 bp

60'C

"41* ■ •

Рис. 10. Гибридизационный анализ Agil 6ft- семейства, а. Дот-гибридизация (при 58°С) 32 видов сем. Lacertidae: Lacerta s. str. (1-8), Podareis (11-15), Zootoca (16) и Darevskia (9,10, 1732), названия даны в табл. 1. В левой части представлена гибридизация с Agil60-cax4HK, в правой части с CLsatI-ДНК. Раститрованная специфичная ДНК представлена на фильтрах в рядах А и В. А: геномная ДНК L. agilis exigua. Р- Плазмида (1 нг) содержащая последовательность Agil60-MOHOMepa. В: геномная ДНК D. saxícola darevskii. Р - Плазмида (1 нг) содержащая последовательность CLsatI-мономера. б. Саузерн-гибридизация (65°С) Agil60 с ЯшсЯП-расщспленной ДНК видов Lacerta s. str. Каждая лунка содержит 1000 нг ДНК. Полное название видов дано в табл. 1.

Для мономеров A gil 60 тоже характерно присутствие ТО-богатого участка, сходного с мик-росателлитным участком некоторых организмов, и в целом обогащение мономера производными TG-повторов (рис. 11а). Соотношение внутри- и межвидовой вариабельности выявляет видоспецифичную кластеризацию на кладограмме и кластеризацию на две группы - Agi 160 (3 подгруппы) и Agi 180 (рис. 12). Особенностью структуры мономера Agi 160 является зона коротких прямых повторов с 90% сходством и следующая за ней А- богатая зона повышенной вариабельности (рис. 11).

Рис. 12. Кладограмма мономеров Agil60(180). Использованы последовательности, представленные на рис. 11. Кладограмма построена методом Байеса с применением генерации реплик параметров с помощью Марковых цепей (МСМС, Markov chain Monte Carlo). Цифры над ветвью обозначают байесовские апостериорные вероятности (в процентах), величины под ветвью обозначают процентное значение бут-стрепа для методов максимального правдо-2 А ¡180 —"еЛ ~' подобия и ближайшего соседа

L strigata

L. agilis

2. Вариабельность и организация Agil60 последовательностей

Малая доля вариабельности длины мономеров (помимо различий в числе копий 10 п.н. внутреннего повтора) принадлежит коротким (1-2 н.) инсерциям/делециям (обозначенные дефисом в позициях 15-16; 19-20; 25; 121; 122; 136; 146; 150; 165). Прямое выравнивание (рис. 11) всех 12 мономеров выявило, в целом, 90-95% сходство между последовательностями Agi 160 и 70% сходство между Agi 160 и Agi 180. Как было отмечено выше, такой уровень дивергенции, как правило, характерен для разных семейств сателлитной ДНК. Большая часть дивергенции мономеров Agil60 и Agil80 основана на 3'- 60 п.н. фрагменте Agil80, полностью отличающегося от 3' конца Agi 160 при прямом выравнивании последовательностей (рис. 11а). Однако, обнаруженная 90% гомология между 123 п.н. (5')-участками мономеров Agi 160 и Agi 180 свидетельствует об их близком родстве, и, вероятно, недавнем происхождении Agi 180, позволяя рассматривать его в качестве варианта Agi 160 сателлитной ДНК.

Анализ распределения нуклеотидных замен Agi 160 и Agi 180 последовательностей выявил чередование высокомутабельных зон с более консервативными мотивами (рис. 11), представленными на рисунке серым и черным фоном. Большая зона 100%-ной идентичности между всеми мономерами расположена на 5'- конце последовательности. За ней следует вариабельная зона с 95-100% сходством с "GT"- богатой микросателлитной (мс) последовательностью Salmo salar (AF257039.1), Coffea arabica (AJ308835.1; AJ308786.1; AJ308750.1; AJ308749.1), и ядерного матрикса Drosophila melanogaster (АЕ003669; АЕ003746). За ней последовательно расположены: 1) высококонсервативная зона, содержащая другой GT -богатый мотив; 2) зона 10-нуклеотидных прямых повторов с вариабельным числом копий и консервативным нуклеотидным составом; 3) ААА(А) - богатая зона с повышенной нуклео-тидной вариабельностью. Следует отметить, что в этой области расположены четыре САА(АА)С-повтора, один из двух существующих GAAA(A)C, и один GAAAT-повтор. При этом поли(Т)-треки, расположенные в предыдущей части мономера, обрамлены, в основном (пять из девяти) основанием G, имея структуру GTTT(T)G, а остальные четыре -(G)CTTTTTG, GTTTC, ATTTG , СТТТС (рис. 11а). Из этою следует, что комплементарная цепь Agi 160 в этой части богата САА(АА)С-повторами. Изобилие (GTTT(T)G = comp САА(АА)С) может указывать на значимость этого мотива для структуры мономера Agi 160. Ранее высказана гипотеза и показано в ряде случаев, что поли(А)-треки ассоциированы с ядерным матриксом (Lobov et al., 2001). Более того, последовательности, богатые (А)з^-мотивами, могут участвовать в процессе компактизации хроматина и регуляции генов путем пространственной фиксации некоторых последовательностей (Plohl et al.,1998; Gottesfeld et al., 2001; Trifonov, 2000) и, таким образом, могут быть подвержены действию естественного отбора.

TC-reach IMS} regia*

10Ь» lBt$ ._

-*-»-f3

the Agil80 3' - 60 bp tail

JbAtCTTMTC&TtTtCTTTTTGTCCtTTTG&CC CTCAAÀAChtCTt fcTTBfrCCTbCCTTTCt CTTTCCTAC GCTUfiTTTTKCTXItïTTTTCCTTAVXTTTtCTTAATTT&C UAhCK&CCCACTTTCAACTCMAA&CTCCAMCTMïTMAATUkftCATWXftC

67%

90% 90% 90% 90%

Рис. 11. Структура сатДНК Agil60 и Agil 80. а.-Прямое выравнивание мономеров Agil60 и Agil80 видов Lacerta slrigata (st), Lacerta agttis exigua (ae) и Lacerta agilis boemica (ab). Мономеры Agi 180 обведены рамкой. Косенеус расположен над выровненными последовательностями мономеров. Идентичные нуклеотиды даны в виде точек, вариабельные сайты обозначены буквами, делении указаны дефисом. Консервативные зоны окрашены черным, вариабельные - серым или белым. ТТТ/ААА-повторы выделены между косенсусом и выровнены-ми мономерами. Над косенсусом обозначены пурин-пиримвдиновые треки РизРуз-sî короткие прямые и обратные повторы обозначены стрелками; TG-обогащеные мотивы выделены курсивом прописными буквами. б.-«Внутренняя структура» мономера Agil60. Локализация и уровень сходства внутренних повторов обозначены одинаковыми стрелками и процентам значением сходства.

Помимо Т- и А-кластеризации, несколько повторов GGG и ССС приводят, совместно с Т- и А-повторами, к образованию двух (Ру)з(Ри)3(Ру)3(Ри)3 мотивов (рис. 11а). Анализ внутренней структуры мономера обнаружил еще несколько коротких прямых и инвертированных повторов (рис. 11а). Однако, множественное выравнивание последовательностей мономеров выявило и более длинные повторы разной степени дивергенции (рис. 116). Подобная структура, называемая «скрытая простота» (Tautz et al., 1986), свойственна также другим сатДНК (Plohl et al., 1994), включая CLsat (Ciobanu et al., 2001). «Скрытая простота», как полагают, является результатом совместного действия скользящей репликации, единичных замен и механизмов генной конверсии, и неравного кроссинговера. Динамика этого взаимодействия и ее влияние на степень дивергенции внутренних повторов обсуждалась ранее.

Особенности структуры мономеров Agi 160 и Agi 180 прямо указывают на роль дупликации коротких мотивов и событий скользящей репликации в образовании этого семейства тандемных повторов. Более того, те же механизмы вовлечены в процесс дивергенции Agil60 и Agil80 ДНК. К примеру, вариабельность длины Agil60 из-за делеции/дупликации 10 п н. участка, может быть результатом скользящей репликации. «Мс»-мотив TTGGTGTG(T)nTGT GTCG(T)3(G)3 может быть результатом взаимодействия дупликации, скользящей репликации фрагмента TTGGTG, а также единичных замен (рис. И). В том числе, замещение TTG в мономере st2 сайт14-16, деления 2 п.н. в том же месте в мономерах st9 и stlO, делеция 2 п.н. следующая за этим сайтом в мономере st4, и последовательность TT(G)3N3GG(T)3(G)](T)3 в сайте 48-67, вероятно, образовались в результате действия скользящей репликации (рис. 11).

Следует отметить, что мономеры Agil80 обладают теми же структурными особенностями, что и мономеры Agi 160, за исключением «А»-богатой зоны, расположенной на 3'- конце единицы Agi 160. Эта зона в мономере Agil80 заменена, большей частью, З'-бО п.н. сильно дивергировавшим фрагментом.

Agil60 «консервативная зона» «вариабельная юна»

[' (T)n(G)n - богатая зава { »кг пряж по ло; .f (А)п- богатая зона 1

1— (Т)п- богатая зот — 1

Agil80

1 (T)n(G)n - богатая зона | яха1фянпопо;.| «чужеродная вставка» i>

1— (Т)п - богатая зона -1

CLsat

[ <T)m(G)ii- Йогатаязона | и равномерно распределенные (Т)п, (А)п-траси 1

Рис. 13. Схематическое изображение структуры мономеров Agilб0, Agil80 и СЬ$а1.

Часть мономера, соответствующая «консервативной зоне», окрашена серым, «вариабельной зоне» - белым.

Таким образом, мономер Agil60 можно разделить на три части (рис. 13): первая состоит, в основном, из повторов (Т)„(0)п разной степени дивергенции, далее следует зона 10 п.н.

прямых повторов, коровая часть которых имеет структуру GTTT(T)G, будучи, вероятно, того же, что и TG-MC, происхождения, обрамленную последовательностью GCTTA. Третья часть, в основном, состоит из повторов С(А)„С.

2. Гибридизационный анализ Agil60 семейства сателлитной ДНК

В опытах по дот-гибридизации (58°С) показана динамика между интенсивностью гибри-дизационного сигнала и повышением температуры отмывки, что отражает степень дивергенции AgilöO-noBTopa у разных видов и, соответственно, позволяет делать выводы о количественном содержании высокогомологичной Agí 160 сателлитной ДНК (рис. 10). Отмеченная четкая видоспецифичная корреляция количества и степени дивергенции повтора Agil60 среди видов Lacerta s. str. согласуется с данными о дивергенции видов, основанными на анализе как биогеографии и морфо-физиологических признаков (Арнольд 1973, 1989, Яблоков 1976, 1981; Рикена 1991), так и молекулярных (альбумин, Майер, 1994). Таким образом, схема соотношения между содержанием высокосходной последовательности Agil60 и степенью родства видов выглядит так: (L. media « (L. viridis < (L. agilis<L. strígata))).

Анализ Саузерн-гибридизации (65°C) в ряду видов Lacerta s. str., после полного HindlII-расщепления геномной ДНК, выявляет лестницеобразную картину (рис. 10). Такой паттерн образован яркими мономерными полосами, расположенными в районе 160 п.н., а также ди-мерами и мультимерами, вероятно, как следствие утраты рестриктазного сайта. Единственным исключением является геномная ДНК L. media, которая не гибридизуется при 65°С. Эти данные подтверждают данные дот-гибридизации, на основании которых можно говорить о присутствии у L. media существенно дивергировавшего повтора, родственного Agil60, что также коррелирует с существующим представлением о дивергенции этих видов (см. выше). Саузерн-гибридизация также указывает на видоспецифичную корреляцию количественного содержания и паттерна рестрикции сателлитной ДНК (рис. 10). Это позволяет заключить, что гибридизационный паттерн гидролизованной сателлитной ДНК видов Lacerta s. str. обладает видоспецифичностью и, вероятно, разрешающей способность на уровне достаточно хорошо дивергировавших подвидов.

3. Сравнительный анализ сателлитной ДНК ящериц семейства Lacertidae

Помимо представленных в этой работе, известно еще три (pLCS, pLHS, pGPS) семейства сатДНК ящериц рода Podareis сем. Lacertidae (Capriglione, 2000). Все эти сатДНК характеризуются родоспецифичностью, за исключением семейства pGPS, вероятно, более древнего происхождения, судя по его присутствию в геномах филогенетически отдаленных видов. Сравнительный анализ сателлитных ДНК лацертид выявил несколько общих черт организа-

правление нуклеотидных замен), гомополимерные (3-4)п-треки. Эти черты являются типичными не только для сателлитной ДНК рептилий, но и для целого ряда других сатДНК. Тем не менее, три указанных семейства сатДНК р. Podareis не обладают более никаким сходством с CLsat и Agí 160 (Agil80). В то же время, мономеры Agil60 и CLsat характеризуются сходным распределением А- и Т-треков, сходной «внутренней структурой» (серией внутренних повторов разной степени дивергенции) и сходным обогащением производными TG-повторов.

При детальном сравнении нуклеогидной последовательности мономеров CLsat и Agil60 обнаружено сходство, свидетельствующее об их общем происхождении. Так, наиболее сходными являются «консервативный» участок Agil60 мономера, предшествующий зоне 10 нуклеотидных прямых повторов, и одна половина CLsat мономера (рис. 14). Этот участок содержит «ТС-мс»-фрагмент, также характерный для CLsat (рис. 11 и 1). Уровень сходства другой части, так называемой «вариабельной» (объединяющей в случае мономеров Agil60 зону 10 п.н.-прямых повторов и A-богатую зону, у CLsat - представленные равномерно распределенными ТТТ, ААА треками), варьирует для разных мономеров Agil60 и CLsat в пределах 58-62%

Анализ соотношения внутренней структуры мономеров CLsat и Agil60 и распределения наиболее сходных участков между ними позволил предложить вероятные пути возникновения и дивергенции этих двух семейств сателлитной ДНК. Следует отметить, что локализация -60 п.н. фрагментов с ~74% и ~62% сходством соответствует локализации двух самых длинных, но сильно дивергировавших внутренних повторов Agil60 и CLsat. Соответствующие внутренние повторы CLsat длиннее (70 п.н.) и разделяют мономер на две половины (рис. 14).

40%

■ I ■ ----

_ . . ,0 . „ . м . ю ■ 10« - lio - но « 1*0

CLtttt ммт wiwbTCTOTTTKTawATTieafctctafcWMgeTAgncwtTCiftCWBCTtytici медгдт «частя •чттктктгтаекпмаястсшегкмсяист.................тгв*»вкм«£ыс1сшм

В 74*С "Ж* Ш

r « го • «в w 1« • «о • 1» • 149 • МО

■ ' - - - • , , *

•-----,'■„..•.,,--i i i «I

" '—---------

Рис. 14. Соотношение сходства мономеров CLsat и Agil 60 (AY184833) с их внутренней структурой. Последовательности мономеров представлены двумя рядами заглавных букв. Стрелками обозначены самые длинные «внутренние повторы» мономера. Линиями между мономерами указаны два участка разного сходства («консервативный» - А и «вариабельный» - А') мономеров CLsat и Agil 60. Значения сходства указаны в процентах.

Это наблюдение указывает на то, что ныне существующие мономеры Agil 60 и CLsat могли быть образованы в результате дупликационного события, произошедшего, вероятно, до того как произошла дивергенция общей предковой последовательности (рис. 15). Выяв-

ленная гомология указывает также на то, что одна «половина» мономера, содержащая «Тй-

мс»-участок, возможно, подвержена воздействию естественного отбора, в силу повышенной консервативности нуклеотидной последовательности. Этот же «ТО-мс»-участок обладает повышенной консервативностью среди мономеров СЬяа1.

Рис. 15. Общая схема молекулярной эволюции сателлитной ДНК CLsat и Agil60. Черными жирными сегментами обозначены участки-предшественики «консервативной» - А и «вариабельной» - А' зон. «Вариабельная» - А' зона в мономере-предшественнике CLsat и Agil60 (Пре-CLsat и Пре-AgilöO) обозначена серьм, как наиболее дивергировавшая зона.

III. Филогенетическое значение сателлитной ДНК для семейства Lacertidae.

Как показали таксонопринтный анализ, саузерн-гибридизация, поиск по банку данных GenBank и молекулярный анализ структуры и эволюции тандемных повторов CLsat у 21 вида Darevskia, CLsat-ДНК относится к семейству видоспецифичных повторов, характерного для видов одного рода. Благодаря быстрому темпу эволюционирования, тандемные повторы ДНК обычно образуют высокогомогенные семейства внутри одного вида. Подобная черта сатДНК, по-видимому, является результатом действия концертной эволюции, описанной на примере мультигенных семейств (Dover, 1982). На основании анализа, принимая во внимание молодой возраст процесса видообразования большинства видов рода Darevskia и не очень высокий уровень межвидовой дивергенции повторов по сравнению с внутривидовой, мы пришли к выводу, что прослеживается четкая корреляция между филогенией видов рептилий и сатДНК. Логично предположить, что дивергенция трех подсемейств CLsat произошла в начале процесса дивергенции видов Darevskia и шла сопряженно с видообразованием, претерпевая чередующиеся события амплификации и диминуции в геноме определенного вида. Отметим, что молекулярный анализ четвертого подсемейства указывает на более позднее его возникновение по сравнению, по крайней мере, с одним из остальных трех подсемейств. Эти данные, совместно с данными таксонопринтого анализа, указывают на то, что возникновение CLsatlV сопутствовало образованию вида D. lindholmi, о чем свидетельствуют дендрограммы консенсусных последовательностей.

На основании данных гибридизационного анализа и выявленной видоспецифичной дивергенции нуклеотидных последовательностей мономеров Agil60, можно заключить, что это семейство сатДНК также является видоспецифичным и характерным для группы видов, объединенных в один род Lacerta s. str. Таким образом, использование Agil 60 в качестве филогенетического маркера представляется перспективнм для дальнейшей оценки неразрешен-

Пре-CLat

A¿160 (138 он., 150 п.», 160ILH.)...

ных филогенетических связей видов и подвидов Lacerta s. str. и генотипирования видовой сегрегации популяций L. agilis и L. strígata. Обнаруженное сходство между мономерами Agil60 и CLsat, указывающее на общее происхождение этих семейств, позволяет предположить, что предковая последовательность существовала в геноме прародителя Lacerta s. str. и Darevskia до того, как произошла дивергенция этих родов. Эти данные, рассмотренные в свете существующих представлений о филогении и таксономии видов сем. Lacertidae, позволяют сделать дополнительные выводы об эволюции сатДНК и корреляции этого процесса с видообразованием. По данным иммунологических маркеров, морфологии, палеонтологии и эколого-исторических данных дивергенция ящериц Lacerta s. str. и Darevskia произошла не менее 25 млн. лет назад, в то же время дивергенция видов внутри рода Lacerta s. str. произошла около 5 млн. лет назад, тогда как большинство видов Darevskia дивергировапи 15 тыс. лет назад. Если соотнести величины процентов дивергенции «консервативного», кон-цертно устоявшегося участка CLsat и Agil60, и трех подсемейств CLsat со временем дивер-генци родов, можно предположить, что подсемейства CLsatI, П, П1 начали дивергировать не менее 20 млн. лет назад (рис. 16). То есть это событие предшествовало последнему постледниковому образованию видов, о чем косвенно также свидетельствует присутствие трех подсемейств в «реликтовом» виде. Рассмотренные выше данные о количественом распределении трех подсемейств CLsat и предложенные рассуждения свидетельствуют в пользу того, что видообразование ящериц Darevskia коррелирует с диминуцией/амплификацией определенного подсемейства CLsat.

виды

Рис. 16. Филогения Darevskia и Lacerta s. str. - взаимосвязь с филогенией повторов CLsat и Agil 60.

Таким образом, можно предположить, что присутствие гомологичной сатДНК в геноме видов разных родов, скорее, указывает на монофилетическое происхождение этих родов, нежели на спонтанное возникновение двух сателлитных семейств независимо друг от друга после дивергенции родов. Полученные данные свидетельствуют о том, что использование

сатДНК в качестве молекулярного маркера позволяет рассматривать остающиеся спорные моменты степени родства подвидов и видов внутри рода.

ВЫВОДЫ:

1. Определены последовательности около 270-ти мономеров семейства сатДНК CLsat, специфичных для всех видов ящериц рода Darevsha (сем. Lacertidae), и степень их вариабельности. По ряду диагностических позиций выделено, как минимум, четыре подсемейства CLsat, три из которых присутствуют у большинства видов рода. Степень различий между ними достигает 25%.

2. Каждый из видов рода Darevskia обладает тем или иным подсемейством (или их сочетанием) в разных количествах, в то время как в других родах лацертид (Lacerta s. str., Podareis, Zootoca, Eremias, Ophisops, Gallotia) этот сателлит методом гибридизации не выявляется.

3. Сравнительный анализ внутри- и межвидовой вариабельности повторов в пределах одного подсемейства коррелирует со степенью родства видов Darevskia, обнаруживая видос-пецифичный паттерн эволюции для «хороших» видов. Характер видоизменения структур и мутационной изменчивости мономеров подсемейств CLsat свидетельствует в пользу представлений о «концертной» эволюции повторов.

4. На основании сравнения видовых консенсусов последовательностей мономеров предложены филогенетические деревья. Кластеризация видов по CLsat, в основном, соответствует кластеризации, намечаемой по морфологическим признакам. На основании комплексного анализа молекулярной структуры и количественного распределения подсемейств CLsat между разными видами, предложена гипотеза видообразования в роде Darevskia.

5. Детальное сравнение структуры, содержания и сходства мономеров подсемейств CLsat в двуполых и однополых видах Darevskia подтверждает гипотезу о происхождении партено-видов в результате межвидовой гибридизации двуполых видов. Определен круг современных видов, предшественники которых могли участвовать в этом процессе.

6. Определены последовательности мономеров ортологичного CLsat семейства сатДНК AgilöO, специфичного для рода Lacerta s. Str.. Этот повтор методом гибридизации обнаружен в четырех видах это! о рода (L. agilis, L. strigata, L. viridis, L. media). У других видов сем. Lacertidae он не обнаружен. Степень различия интенсивности гибридизации позволяет сделать вывод, что наибольшим родством обладают L. agilis и L. strigata, более отдален от них L. viridis и еще более - L. media, что соответствует представлениям систематиков.

7. Ряд консервативных признаков CLsat и AgilöO свидетельствует об их монофилетиче-ском происхождении. На основании обнаруженного сходства предложены пути эволюции этих двух семейств сатДНК. Вместе с тем, степень дивергенции CLsat и Agil 60 существенно

больше, чем степень расхождения между повторами CLsat, что соответствует родовому статусу Darevskia и Lacerta s. str., еще недавно объединявшихся в один род Lacerta.

8. Комплекс представленных данных свидетельствует о том, что свойства и распределение сатДНК взаимосвязаны с филогенией и видообразованием и что сами они являются важными и информативными молекулярными маркерами эволюции биологических видов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Чобану Д., Рудых И.А., Рябинина H.JI., Гречко В.В., Крамеров ДА., Даревский И.С. Сетчатая эволюция партеновидов скальных ящериц сем. Lacertidae: наследование тандемного повтора Clsat и анонимных маркеров метода RAPD (РАПИД) // Молек. биол. 2002. Т.Зб. № 2. С. 296-306.

2. Рудых И А., Чобану Д.Г., Гречко В.В., Крамеров Д.А., Даревский И.С. Вариабельность сайтов рестрикции сателлитной ДНК как молекулярная основа метода таксонопринта (на примере скальных ящериц Кавказа) // Генетика. 2002. Т. 38. № 8. С. 1110-1114.

3. Ryabinina N.L., Bannikova А.А., Kosushkin S.G., Ciobanu D.G., Mil'to K.D., Tuniev B.S., Grechko V.V. and Darevsky I.S. The approach to segregation of population and subspecies status by means of some genomic DNA markers (on example of Caucasian rock lizards of the genus Darevskia, Lacertidae) // Russian Journal of Herpetology. 2002. V. 9. № 3. P. 185-194.

4. Чобану Д., Гречко B.B., Даревский И.С. Молекулярная эволюция сателлитной ДНК CLsat ящериц Darevskia (Sauria: Lacertidae): корреляция с видовым разнообразием. Генетика. 2003. Г. 39. №11. С.1545-1559.

5. Чобану Д., Гречко В.В., Крамеров Д.А., Даревский И.С. Новое подсемейство сателлитной ДНК, CLsatlV, ящерицы Darevskia lindholmi (Sauria: Lacertidae): структура и эволюция. // ДАН. 2003. Т. 392. № 3. С.1-5.

6. Чобану Д., Рудых И.А., Гречко В.В., Крамеров Д.А. Молекулярные механизмы эволюции сателлитной ДНК на примере группы близкородственных видов скальных ящериц Кавказа // Межд. конф. Мол. мех. генет. проц. биотех.. Москва: 2001. С. 181-182.

7. D.Ciobanu, I.A.Roudykh, V.V. Grechko, D.A. Kramerov. Reticulate evolution evidenced by satellite DNA in the group of closely related rock lizards species. // The 3rd International Symposium "Evolution, Genetics, Ecology and Biodiversity". Vladivostok. 2001. September 24-30.

8. D.Ciobanu, V.V. Grechko, D.A. Kramerov. Satellite DNA evolution: correlation with the evolution of lizard species from the genus Darevskia (Sauria, Lacertidae). // 12А Ordinary General Meeting (Societas Europea Herpetologica). Saint-Petersburg. 2003. August 12-16. P. 51.

Пор? - Д " Г8166 " Р18166

Отпечатано в копицентре «Учебная полиграфия» Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус. www.stprint.ru e-mail: zakaz@stprint.ru тел 939-3338 Заказ № 402 тираж 100 экз. Подписано в печать 27.10.2003 г.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Чобану, Дойна Григорьевна

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Повторы эукариот и сателлитная ДНК (сатДНК)

1.2. Структура сатДНК

1.3. Роль сатДНК в геноме эукариот

1.3.1. Особенности структуры сатДНК и их функциональное значение

1.4. Эволюция сатДНК

1.4.1. Модели эволюции повторов

1.4.2. Молекулярные механизмы эволюции сатДНК

1.4.3. Эволюционная динамика сатДНК

1.5. Молекулярные маркеры в филогенетических исследованиях

1.5.1. Филогенетическое значение сатДНК

1.6. Сетчатая эволюция. Ее значение для видообразования в животном царстве

4 1.6.1. Сетчатое видообразование у позвоночных

1.6.2. Исследования сетчатого видообразования у пресмыкающихся

1.7. Систематика сем. Lacertidae

1.7.1.Филогеография и филогения семейства Lacertidae

1.7.2. Происхождение и филогения группы видов «комплекса L. agilis» = род Lacerta s. str., Linneus,

1.7.3. Происхождение и филогения Кавказких скальных ящериц рода Darevskia, Arribas 1999 = «комплекс Lacerta saxicola», (Lacertidae)

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Биологический материал.

2.2. Выделение геномной ДНК.

2.3. Клонирование мономеров сатДНК в плазмидном векторе.

2.4. Секвенирование.

2.5. Гибридизация геномной ДНК с зондами сатДНК.

2.6. Компьютерная обработка данных. 47 * 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 СатДНК ящериц рода DAREVSKIA, Arribas 1999 (Sauria: Lacertidae)

3.1.1. Характеристика семейства CLsat сатДНК

3.1.2. Организация повторяющейся единицы CLsat: внутренняя структура и консервативные элементы нуклеотидной последовательности

3.1.3. Молекулярные механизмы, участвующие в эволюции семейства CLsat

3.1.4. Сравнительный анализ вариабельности нуклеотидной последовательности мономеров четырех подсемейств CLsat и скорость их эволюции.

3.1.5. Организация семейства повторов CLsat

3.1.5.1. Динамика видоизменения организации повторов семейства CLsat

3.1.5.2. Динамика количественного распределения трех подсемейств CLsat у видов рода Darevskia

3.1.6. Корреляция филогении сатДНК CLsat и филогении видов Darevskia.

3.1.7. Сетчатая эволюция партеногенетических видов рода Darevskia на примере CLsat-ДНК

3.2. СатДНК видов «комплекса L. AGILIS»= LACERTA S. STR, Linneaus

1758 (Sauria: Lacertidae)

3.2.1. Характеристика Agi 160 семейства сатДНК

3.2.2. Вариабельность и организация Agi 160 последовательностей

3.2.3. Анализ структуры семейства повторов Agi 160 сатДНК с помощью гибридизаци

3.3. Сравнительный анализ сатДНК ящериц двух родов семейства Lacertidae 106 3.3.1. Сравнение повторов CLsat и Agil60 и вероятный путь происхождения сатДНК ящериц родов Darevskia и Lacerta s. str.

3.4. Филогенетическое значение сатДНК для семейства Lacertidae 114 ВЫВОДЫ 117 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структура, эволюция и филогенетическое значение сателлитной ДНК на примере ящериц родов Darevskia и Lacerta s.str."

За время, прошедшее с момента открытия повторяющихся регионов ДНК, накопилась огромная литература, посвященная изучению их структуры и свойства в разных таксонах, однако интерес к проблеме в последние годы только возрастает (1-3 Kidwell, 2002; Boot-Handford, Tuckwell, 2003; Korochkin, Ryskov, 2003). Стало очевидным, что повторяемость участков генома есть общее и значимое явление, в той или иной степени свойственное многим структурным, кодирующим белки, генам и генам рибосомных и транспортных РНК (4-6 Sidow, 1996; Gogarten, Olendzenski, 1999; Taylor et al., 2001). Это явление играет важную роль в эволюции функциональных возможностей эукариот и, тем самым, в развитии их адаптивного потенциала (1,6-8 Wajcman, Kiger, 2002; Pires-daSilva, Sommer, 2003).

Однако наиболее поразительный и до сих пор неразгаданный феномен, характеризующий геномную ДНК, - это наличие в ней некодирующих повторяющихся участков, разнообразие которых по последовательности, размерам и локализации поистине неисчерпаемо, а функция остается непонятой и прямо не доказанной (9 Гречко, 2002). К повторам такого рода относят так называемые сателлитные ДНК (сатДНК), открытые в виде дополнительных пиков при изучении плавучей плотности ДНК в градиенте солей цезия (10 Sueoka,Cheng, 1961; Kit, 1961). Сейчас этот термин используется для всех высокоповторяющихся тандемных повторов, независимо от их плавучей плотности (11,12 Charlesworth, 1994; Ugarkovic, Plohl,

2002). Эти фракции содержат непрерывные ряды (тандемные кластеры) одинаковых или сходных по структуре мономерных единиц размером от нескольких единиц до тысяч нуклео-тидов, число которых в ряду может достигать сотен тысяч (9,11 - 13 Beridze, 1986). К повторам относят также рассеяные по геному в виде единичных копий участки ДНК (SINE, LINE, транспозоны) значение и функция которых также активно обсуждается (14 Shedlock, Okada, 2000).

Эволюционная направленность и функциональная значимость тандемных повторов ДНК интенсивно изучаются, в частности, у беспозвоночных и млекопитающих, но в гораздо меньшей степени у других таксонов. При этом, данные об эволюции и структуре повторяющейся ДНК у столь широкого класса позвоночных как рептилии представлены весьма небольшим числом работ (16 Capriglione, 2000). В основном, это работы по исследованию диспергированных повторов у змей, черепах, тандемных повторов саламандр и сатДНК лацер-тидных ящериц (16, 15, 17 обзор Capriglione, 2000; Гречко и соавт., 1998; Ciobanu et al.,

2003). В частности группой Гречко В.В. был предпринят таксонопринтный анализ повторяющейся ДНК нескольких родов сем. Lacertidae (15 Гречко и соавт., 1998). Полученные авторами результаты одними из первых указали на филогенетическую значимость повторяющейся ДНК для этого семейства животных и стали основой для дальнейшего изучения эволюции и структуры сатДНК лацертид.

В диссертационной работе эти представления развиты и продолжены при исследовании структуры и эволюции сатДНК практически всех видов p. Darevskia. Комплексный анализ результатов позволил подойти к важным, на наш взгляд, выводам о корреляции молекулярной и морфологической эволюции на видовом и родовом уровне конкретного и весьма слабо изученного таксона позвоночных.

В настоящем обзоре основное внимание уделено рассмотрению литературы, посвященной изучению структурных свойств и возможных путей молекулярной эволюции тандемных повторов ДНК животных, поскольку полученные нами экспериментальные данные и их анализ являются частью этой проблемы. Исследованные в этой работе сатДНК рептилий отр. Sauna, сем. Lacertidae, открыты в нашей лаборатории (15 Гречко и соавт., 1998) и до сих пор с этих позиций не изучались. Таким образом, представляет особый интерес сопоставить наши выводы с имеющимися данными по другим таксонам эукариот.

Мы уделяем внимание также литературе посвященной изучению возникновения и эволюции однополых популяций, зачастую претерпевющих сетчатый путь развития. Для нас эта проблема представляет интерес отчасти потому, что среди двуполых видов p. Darevskia были обнаружены семь партеногенетических (однополых) видов, предположительно возникших в результате гибридизации некоторых двуполых этого рода (см. обзор в статье 18 Чобану и соавт., 2002). Полученные в данной работе результаты могут рассматриваться в пользу гипотезы о гибридогенном происхождении этих партеновидов.

Кроме этой литературы, рассмотрены работы, затрагивающие проблему значения использования сатДНК в качестве молекулярных маркеров общей эволюции и видообразования у эукариот, поскольку наши данные, на наш взгляд, вносят существенный вклад в ее рассмотрение. Возможность использования сатДНК в качестве молекулярного маркера для изучения филогенетического родства близкородственных видов стала очевидной по мере накопления данных, свидетельствующих о том, что темпы эволюции повторяющейся ДНК пропорциональны темпам дивергенции видов (16, 9 Capriglione, 2000; Гречко, 2002). В связи с этим представлена краткая характеристика исследуемых нами таксонов сем. Lacertidae -ящериц p. Darevskia и Lacerta s. str., что необходимо для понимания приводимого нами сопоставления морфологической и молекулярной филогении этой группы животных.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Чобану, Дойна Григорьевна

ВЫВОДЫ:

1. Определены последовательности около 270-ти мономеров семейства тандемных повторов CLsat, специфичных для всех видов ящериц рода Darevskia (сем. Lacertidae), и степень их вариабельности. По ряду диагностических позиций нами выделено, как минимум, четыре подсемейства CLsat, три из которых присутствуют у большинства видов рода. Степень различий между ними достигает 25%.

2. Каждый из видов рода Darevskia обладает тем или иным подсемейством (или их сочетанием) в разных количествах, в то время как в других родах лацертидах разной степени родства (Lacerta s. str., Podarcis, Zootoca, Eremias, Ophisops, Gallotia) этот сателлит методом гибридизации не выявляется.

3. Сравнительный анализ внутри- и межвидовой вариабельности повторов в пределах одного подсемейства коррелирует со степенью родства видов Darevskia, обнаруживая ви-доспецифичный паттерн эволюции для <осороших» видов. Характер видоизменения структур и мутационной изменчивости мономеров подсемейств CLsat свидетельствует в пользу представлений о «концертной» эволюции повторов.

4. На основании сравнения видовых консенсусов последовательностей мономеров предложены филогенетические деревья исследуемого рода. Кластеризация видов по свойствам CLsat, в основном, соответствует кластеризации, намечаемой по морфологическим признакам, но в некоторых случаях не соответствует им. На основании комплексного анализа молекулярной структуры и количественного распределения подсемейств CLsat между разными видами, предложена гипотеза видообразования в роде Darevskia.

5. Детальное сравнение структуры, содержания и сходства мономеров подсемейств CLsat в двуполых и однополых видах Darevskia подтверждает гипотезу о происхождении партеновидов в результате межвидовой гибридизации двуполых видов. Определен круг современных видов, предшественники которых могли участвовать в этом процессе.

6. Определены последовательности мономеров ортологичного CLsat семейства тандемных повторов Agi 160, специфичного для рот. Lacerta s. str. Этот повтор обнаружен в четырех видах этого рода (L. agilis, L. strigata, L. viridis, L. media) методом гибридизации. У других видов сем. Lacertidae он не обнаружен. Степень различия интенсивности гибридизации позволяет сделать вывод, что наибольшим родством обладают L. agilis и L. strigata, более отдален от них L. viridis и еще более — L. media, что соответствует представлениям систематиков.

7. Ряд консервативных признаков CLsat и Agi 160 свидетельствует об их монофилетиче-ском происхождении. На основании обнаруженного сходства предложены пути эволюции этих двух семейств сателлитной ДНК. Вместе с тем, степень дивергенции CLsat и Agi 160 существенно больше, чем степень расхождения между повторами CLsat, что соответствует родовому статусу Darevskia и Lacerta s. str., еще недавно объединявшихся в один род Lacerta.

8. Комплекс представленных данных свидетельствует о том, что свойства и распределение тандемных повторов взаимосвязаны с филогенией и видообразованием и что сами они являются важными и информативными молекулярными маркерами эволюции биологических видов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чобану, Дойна Григорьевна, Москва

1. Kidwell MG. Transposable elements and the evolution of genome size in eukaryotes. Ge-netica. 2002, 115(l):49-63. Review.

2. Boot-Handford RP, Tuckwell DS. Fibrillar collagen: the key to vertebrate evolution? A tale of molecular incest. Bioessays. 2003,25(2):142-151. Review.

3. Korochkin LI, Ryskov AP. Was August Weismann right?. Genetika. 2003,39(2): 15763. [Article in Russian] Review.

4. Sidow A. Gen(om)e duplications in the evolution of early vertebrates. Current Opinion in Genetics & Development 1996, 6:715-722. Review.

5. Gogarten JP, Olendzenski L. Orthologs, paralogs and genome comparisons. Current Opinion in Genetics & Development. 1999, 9:630-636 Review.

6. Taylor JS, Van de Peer Y, MeyerA. Genome duplication, divergent resolution and speci-ation. TRENDS in Genetics 2001, 17 (6):

7. Wajcman H, Kiger L. Hemoglobin, from microorganisms to man: a single structural motif, multiple functions. С R Biol. 2002,325(12):1159-74. Review.

8. Pires-daSilva A, Sommer RJ. The evolution of signalling pathways in animal development. Nat Rev Genet. 2003,4(l):39-49. Review.

9. Гречко ВВ. Молекулярные маркеры ДНК в изучении филогении и систематики. Генетика. 2002, 38(8): 1-20. Review.

10. Sueoka, Cheng, 1961; Kit, 1961

11. Charlesworth В, Sniegowski P, Stephan W. The evolutionary dynamics of repetitive DNA in eukaryotes. Nature. 1994, 371(6494): 215-20. Review.

12. Ugarkovic D, Plohl M. Variation in satellite DNA profiles causes and effects. EMBO J. 2002,21(22): 5955-9. Review.

13. Beridze T. Satellite DNA. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, Tokio, 1986.

14. Shedlock AM, Okada N. SINE insertions: powerful tools for molecular systematics. Bio-essays. 2000, 22(2): 148-60. Review.

15. Capriglione Т. Repetitive DNA as a tool to study the phylogeny of cold-blooded vertebrates. Chromos. Today. 2000, 13: 183-194. Review.

16. Ciobanu D, Grechko W, Darevsky IS, Kramerov DA. New satellite DNA in Lacerta s. str. lizards (Sauria: Lacertidae): evolutionary pathways and phylogenetic impact. Gene. 2003. представлено в печать.

17. Чобану Д, Рудых ИА, Рябинина HJI, Гречко ВВ, Крамеров ДА, Даревский ИС. Сетчатая эволюция партеновидов скальных ящериц сем. Lacertidae: наследование тандемного повтора CLsat и анонимных маркеров метода RAPD (РАПИД). Мол. Биол. 2002, 36(2): 296-306.

18. Elder JF Jr, Turner BJ. Concerted evolution of repetitive DNA sequences in eukaryotes. Q Rev Biol. 1995 Sep; 70(3):297-320. Review.

19. Schmid, C.W. Does SINE evolution preclude Alu function? Nucleic Acids Res. 1998, 26(20):4541-50. Review.

20. Schlotterer C. Evolutionary dynamics of microsatellite DNA. Chromosoma. 2000, 109(6):365-71.

21. Weissenbach J. A second generation linkage map of the human genome based on highly informative microsatellite loci. Gene. 1993, 135(l-2):275-8.

22. Fanning TG. Origin and evolution of a major feline satellite DNA. J. Mol. Biol. 1987, 197: 627-634.

23. Fanning TG, Modi WS, Wayne RK, O'Brien SJ. Evolution of heterochromatin-associated satellite DNA loci in felids and canids (Carnivora). Cytogenet Cell Genet. 1988; 48(4):214-9.

24. Fanning TG. Molecular evolution of centromere-associated nucleotide sequences in two species of canids. Gene. 1989 Dec 28; 85(2):559-63.

25. Di Rienzo A, Peterson AC, Garza JC, Valdes AM, Slatkin M, Freimer NB. Mutational processes of simple-sequence repeat loci in human populations. Proc Natl Acad Sci USA. 1994,91(8): 3166-70.

26. Richard GF, Paques F. Mini- and microsatellite expansions: the recombination connection. EMBO Rep. 2000, 1(2): 122-126.

27. Wevrick R, Willard HF. Long-range organization of tandem arrays of alpha satellite DNA at the centromeres of human chromosomes: high-frequency array-length polymorphism and meiotic stability. Proc Natl Acad Sci USA. 1989, 86(23): 9394-8.

28. Willard HF, Wevrick R, Warburton PE. Human centromere structure: organization and potential role of alpha satellite DNA. Prog Clin Biol Res. 1989,318: 9-18. Review.

29. Malik HS, Henikoff S. Conflict begets complexity: the evolution of centromeres. Сип-Орт Genet Dev. 2002, 12(6): 711-8. Review.

30. Tyler-Smith C, Willard HF. Mammalian chromosome structure. Curr Opin Genet Dev. 1993, 3(3): 390-7. Review.

31. Yamada K, Nishida-Umehara C, Matsuda Y. Characterization and chromosomal distribution of novel satellite DNA sequences of the lesser rhea (Pterocnemia pennata) and the greater rhea {Rhea americana). Chromosome Res. 2002; 10(6): 513-23.

32. Miklos GLG. Localized highly repetitive DNA sequences in vertebrate and invertebrate genomes in: Molecular Evolutionary Genetics (ed. Maclntyre RJ) Plenum Press. New York. 1985,241-322.

33. Jobse C, Buntjer JB, Haagsma N, Breukelman HJ, Beintema JJ, Lenstra JA. Evolution and recombination of bovine DNA repeats. J Mol Evol. 1995,41(3): 277-83.

34. Markova NG, Markov GG. Complex organization of a cryptic satellite DNA in the genome of the marine invertebrate Rapana thomasiana Grosse (Gastropoda). Biochim Bio-phys Acta. 1983, 741(1): 7-14.

35. Borovkov AY, McClean PE. A tandemly repeated sequence from the Plasmopara halste-dii genome. Gene. 1993,124(1): 127-130.

36. Olmo E. Genome variations in the transition from amphibians to reptiles. J. Mol.Evol. 1991. 33,68-75.

37. Olmo E, Odierna G, Capriglione T. Genome evolution in reptiles. Symposium on the evolution of terrestrial vertebrates. G. Ghiara et al. (eds). Selected symposia and Monographs U.Z.I., Mucchi, Modena, 1991,4: 255-267.

38. Levinson G, Gutman GA. Slipped-strand mispairing: a major mechanism for DNA sequence evolution. Mol Biol Evol. 1987,4(3):203-221.

39. Stephan W, Cho S. Possible role of natural selection in the formation of tandem-repetitive noncoding DNA.Genetics. 1994,136(1): 333-41.

40. Plohl M, Mestrovic N, Bruvo B, Ugarkovic D. Similarity of structural features and evolution of satellite DNAs from palorus subdepressus (Coleoptera) and related species. J Mol Evol. 1998,46(2): 234-9.

41. Ugarkovic DL, Plohl M, Lucijanic-Justic V, Borstnik B. Detection of satellite DNA in Palorus ratzeburgii: analysis of curvature profiles and comparison with Tenebrio molitor satellite DNA. Biochimie 1992, 74(12): 1075-82.

42. Kapitonov W, Holmquist GP, and Jurka J. LI repeat is a basic unit of heterochromatin satellites in cetaceans. Mol. Biol. Evol. 1998,15: 611-612.

43. McAllister BF, Werren JH. Evolution of tandemly repeated sequences: what happens at the end of an array? J. Mol. Evol. 1999,48: 469-481.

44. Wilke K, Jung M, Chen Y, Geldermann H. Porcine (GT)n sequences: structure and association with dispersed and tandem repeats. Genomics. 1994,21: 63-70.

45. Zhang H, Nasuda S, Endo TR. Identification of AFLP markers on the satellite region of chromosome IBS in wheat. Genome. 2000, 43(5):729-735.

46. Lakrua ME, Oparina NIu, Mashkova TD. Segment duplications in the human genome. Mol Biol (Mosk). 2003, 37(2): 212-220. Review.

47. Ivanov SV, Modi WS. Molecular characterization of the complex sex-chromosome het-erochromatin in the rodent Microtus chrotorrhinus. Cytogenet Cell Genet. 1996,75(1): 4956.

48. Cohen AK, Huh TY, Helleiner CW. Transcription of satellite DNA in mouse L-cells. Can J Biochem. 1973,51(5): 529-532. No abstract available.

49. Varley JM, Macgregor HC, Erba HP. Satellite DNA is transcribed on lampbrush chromosomes. Nature. 1980,283(5748): 686-688.

50. Sealy L, Hartley J, Donelson J, Chalkley R, Hutchison N, Hamkalo B. Characterization of a highly repetitive sequence DNA family in rat. J Mol Biol. 1981,145(2): 291-318.

51. Gondo Y, Okada T, Matsuyama N, Saitoh Y, Yanagisawa Y, Ikeda JE. Human megasatellite DNA RS447: copy-number polymorphisms and interspecies conservation. Genomics. 1998,54(1): 39-49.

52. Saitoh K, Ueda T, Arai R, Wu HL, Jeon SR. Highly repetitive elements from Chinese bitterlings (genus Rhodeus, Cyprinidae). Genes Genet Syst. 2000, 75(6): 349-355.

53. Rojas AA, Vazquez-Tello A, Ferbeyre G, Venanzetti F, Bachmann L, Paquin B, Sbordoni V, Cedergren R. Hammerhead-mediated processing of satellite pDo500 family transcripts from Dolichopoda cave crickets. Nucleic Acids Res. 2000,28(20): 4037-4043.

54. Epstein LM, Gall JG. Self-cleaving transcripts of satellite DNA from the newt.Cell. 1987, 48(3): 535-543.

55. Denti MA, Martinez de Alba AE, Sagesser R, Tsagris M, Tabler M. A novel RNA-binding protein from Triturus carnifex identified by RNA-ligand screening with the newt hammerhead ribozyme. Nucleic Acids Res. 2000,28(5): 1045-1052.

56. Ferbeyre G, Smith JM. and Cedergren R. Schistosome satellite DNA encodes active hammerhead ribozymes. Mol Cell Biol. 1998, 18(7): 3880-3888.

57. Rouleux-Bonnin F, Renault S, Bigot Y, Periquet G. Transcription of four satellite DNA subfamilies in Diprion pini (Hymenoptera, Symphyta, Diprionidae). Eur J Biochem. 1996, 238(3): 752-759.

58. Luzi E, Eckstein F. and Barsacchi G. The newt ribozyme is part of a riboprotein com-plex.Proc Natl Acad Sci USA. 1997,94(18): 9711-9716.

59. Yunis JJ, Yasmineh WG. Heterochromatin, satellite DNA, and cell function. Structural DNA of eucaryotes may support and protect genes and aid in speciation. Science. 1971, 174(15): 1200-1209. Review.

60. Brutlag D, Appels R, Dennis ES, Peacock WJ. Highly repeated DNA in Drosophila melanogaster. J Mol Biol. 1977,112(1): 31-47.

61. Corneo G. Satellite DNAs in eukaryotes: a non-adaptive mechanism of speciation which originated with sexual reproduction? Experientia. 1978, 34(9): 1141-1142.

62. Miklos GL, Nankivell RN. Telomeric satellite DNA functions in regulating recombination. Chromosoma. 1976,56(2): 143-167.

63. John B, Miklos GL. Functional aspects of satellite DNA and heterochromatin. Int Rev Cy-tol. 1979,58: 1-114. Review.

64. Miklos GL, John B. Heterochromatin and satellite DNA in man: properties and prospects. Am J Hum Genet. 1979, 31(3): 264-280. Review.

65. Bostock CJ, Clark EM. Satellite DNA in large marker chromosomes of methotrexate-resistant mouse cells. Cell. 1980,19(3): 709-715.

66. Torok T, Gorjanacz M, Bryant PJ, Kiss I. Prod is a novel DNA-binding protein that binds to the 1.686 g/cm310 bp satellite repeat of Drosophila melanogaster Nucleic Acids Research, 2000,28(18): 3551-3557.

67. Straka C, Horz W. A functional role for nucleosomes in the repression of a yeast promoter. The EMBO Journal. 1991, 10: 361-368.67.